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CN102105524A - 由多糖基体和金属纳米颗粒组成的三维纳米复合物材料以及其制备和用途 - Google Patents

由多糖基体和金属纳米颗粒组成的三维纳米复合物材料以及其制备和用途 Download PDF

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CN102105524A
CN102105524A CN2009801287025A CN200980128702A CN102105524A CN 102105524 A CN102105524 A CN 102105524A CN 2009801287025 A CN2009801287025 A CN 2009801287025A CN 200980128702 A CN200980128702 A CN 200980128702A CN 102105524 A CN102105524 A CN 102105524A
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manometer composite
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伊万·多纳蒂
伊莲诺·马斯奇
安德烈·特拉万
塞乔·保莱蒂
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Universita degli Studi di Trieste
Original Assignee
Universita degli Studi di Trieste
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Abstract

本发明中描述了以三维结构的形式的纳米复合物材料，所述纳米复合物材料由聚合物基体和支链阳离子多糖形成，所述聚合物基体由中性多糖或阴离子多糖的多糖组合物组成，金属纳米颗粒被均匀地分散和稳定于支链阳离子多糖中。使用合适的凝胶化技术或借助于合适的脱水，纳米复合物材料是以作为水凝胶的水合形式或以非水合形式的具有不同形状的三维基体。这些纳米复合物材料具有广谱的强杀菌活性，但是不显示任何细胞毒性。与金属颗粒纳米尺度相关联的特定的抗菌性质和生物学信号在聚合物链上的存在以及没有细胞毒性，可以在开发新一代具有抗微生物性质的生物材料上得到利用，以及用于生物医学、药学和食品领域中的许多其他应用。

Description

由多糖基体和金属纳米颗粒组成的三维纳米复合物材料以及其制备和用途
发明领域
本发明涉及三维纳米复合物材料，所述三维纳米复合物材料包含由中性多糖或阴离子多糖的多糖组合物组成的复合聚合物基体以及支链阳离子多糖，金属纳米颗粒被均匀地分散和稳定于支链阳离子多糖中，所述支链阳离子多糖由此形成金属基纳米复合物。本发明还涉及所述三维纳米复合物材料的制备以及在生物医学、药学和食品领域中的用途。
技术现状
天然多糖已经被广泛认为是生物相容的聚合物；因此，由于在生物医学领域中的长期的应用，例如作为用于组织工程的生物活性化合物或细胞的载体，它们是被广泛研究的所利用的材料。作为药学和食品行业两者中最多使用的物质之一，藻酸盐和壳聚糖可以因为它们的丰富、相对低的成本、高生物相容性以及具有在合适的条件产生以具有高水含量的水凝胶的形式的三维基体的能力而被提及。然而，壳聚糖展现出某些应用限制，这些限制与其水溶性对pH的巨大依赖性、其在具有阴离子多糖例如藻酸盐的水溶液中的不可混性(在此其产生不可用于应用目的例如组织工程的团聚体)有关。壳聚糖和藻酸盐共有的进一步的限制是，由于壳聚糖不携带任何细胞特异性信号，因此缺乏生物活性。由于这些原因，可以克服上文所述的限制的壳聚糖衍生物目前正在被研究和开发。
近些年，借助于聚合物链的化学改性，获得了不同的壳聚糖衍生物。对于这些改性，广泛使用了涉及D-葡萄糖胺单元的氨基残基的、形成线性壳聚糖链的反应。特别地，引入糖单元(单糖和寡糖)作为N连接的侧链，允许获得水溶性的壳聚糖衍生物，而不需要将pH降低至酸性值，以这种方式还避免了可能产生的由水溶液的酸性导致的聚合物的降解的问题。
在US 4,424,346(Hall，L.D.和Yalpani，M.)中，第一次描述了这些衍生物的合成以及其在非酸性的水性介质中的水溶性。特别地，US 4,424,346公开了带有乳糖的壳聚糖衍生物在以高于3-5％的浓度的水溶液中产生刚性凝胶，但是其在盐或酸混合物(特别对于Ca氯化物、Cr氯化物、Zn氯化物、K铬酸盐、硼酸)和其组合中既不凝胶化也不沉淀。此外，上述专利提到以下事实，即使用另一种寡糖(其是纤维二糖)衍生的壳聚糖自身在水溶液中不形成凝胶，然而其在与藻酸盐混合时形成刚性凝胶。这种凝胶形成是由于正的聚阳离子电荷和负的聚阴离子电荷之间的强相互作用导致的，这导致系统团聚，系统团聚是在其他方面对其用途的限制的过程，例如为了诸如细胞的生物材料的微囊化。
专利申请WO2007/135116(Paoletti S.等人)描述了用于制备含有阴离子多糖和阳离子多糖的混合物的聚合物溶液以克服团聚问题的方法以及其在生物医学领域中的用途。
此外，专利申请WO2007/135114(Paoletti S.等人)描述了水合的或非水合的三维结构以及由用合适的胶凝剂凝胶化的上述的阴离子多糖和阳离子多糖的聚合物混合物制备所述三维结构的方法，这些可用于封装药学上活性的分子和细胞的目的。
与纳米技术有关并且特别局部关注多糖的另一个显著受关注的研究领域是多糖在制备特别是包括金属纳米颗粒的纳米复合物材料上的可能的用途。事实上，为了稳定纳米颗粒，可以有利地使用允许获得纳米复合物系统的多糖溶液，所述纳米复合物系统中金属颗粒由于与聚合物链的相互作用而被均匀地分散。因此，通过预期开发它们的特定的性质的可能性，多糖的作用与金属纳米颗粒的形成和稳定有关；事实上，已知金属纳米颗粒具有特定的光学、催化和抗微生物性质。实际上，金属例如银、金、铜、锌和镍在抗微生物材料领域中的使用很大地影响市场，尤其对于治疗皮肤创伤来说。诸如Johnson&Johnson
Figure BPA00001306625700021
and Convatec
Figure BPA00001306625700022
的公司最近已经使基于银纳米颗粒的抗菌性质的药物商品化。在合适的基于多糖的纳米复合物材料中可以发现相似的应用，以利用这些金属的熟知的抗菌活性，例如用于纱布、绷带、贴剂的开发。后一类产品可以被赋予广谱的(broad-spectrum)抗菌活性或具有杀菌活性的高水含量凝胶。事实上，仍然能感到对于用于治疗皮肤或粘膜损伤例如烧伤和溃疡的新型治疗辅助的需要。这些损伤对目前采用的抗生素疗法经常有很高的抵抗性；此外，它们还需要用于组织修复的进一步的生物效应，例如增强细胞增殖和/或合适的组织水合。三维水凝胶结构尤其对于后一方面可以是特别有利的，能够确保细胞复制的合适的环境而不干扰细胞表型。
此外，获得三维水合结构的可能性还是组织工程应用特别感兴趣的，在组织工程应用中将多糖的典型的生物活性性质与抗菌活性结合是期望的。
在组织工程领域中，正在作出在待植入人体中的生物材料上产生抗微生物涂层的巨大努力；在这种情况下，主要的风险因素与抗微生物剂自身的可能的细胞毒性有关。例如，在矫形外科领域中，假体的关节替换手术和未暴露的骨折的骨缝合术代表了相对于手术感染的清洁手术的类型(Tucci G.等人，Giornale Italiano di Ortopedia e Traumatologia，2005；31：121-129)。然而，将生物材料植入宿主组织内可以促进感染的发作和存在，甚至在某种程度上低的细菌接种量(bacterial load)的情况下也是如此。虽然有手术期间预防方面的进步，但是细菌和真菌的感染仍然是非常普遍的；这是由这些微生物向整形外科装置的附着的随时间增加的风险导致的(Zimmerli W.等人，New England J.Med.，2004；351(16)：1645-54)。这些数据支持了开发将与新一代生物材料相关联的可选择的抗微生物剂的重要性。
US 7255881(Gillis等人)提供了对上文所述的问题的可能的解决方案。实际上，该专利公开了用于抗微生物应用的通过诸如从蒸汽相的化学和物理沉积(“化学气相沉积”CVD、“物理气相沉积”PVD)的技术以及在液相中在各种类型的基材上形成的基于银的涂层。对于在其上沉积银的多糖基材来说，提到了壳聚糖、藻酸盐和透明质酸。注意到，这些技术不涉及均匀地分散在合适的基体内的金属纳米颗粒的形成，但是解决了连续的表面银(纳米晶的、多晶的或无定形的)层的形成。此外，这些沉积技术所需要的温度和压力条件与多糖的稳定性不相容也与可以期望是支架的一部分的生物活性的生物分子(例如肽或蛋白)的稳定性不相容，还因而也与涉及活细胞的组织工程应用不相容。
概述
本发明的第一个目的是提供三维纳米复合物系统，其中被控制大小的金属纳米颗粒均匀地分散入多糖基体中，所述基体以凝胶形式或以固体形式，并且三维纳米复合物系统的性质特别适合于生物医学领域中的生物应用。
进一步的目的是，这样的三维纳米复合物可通过简便的和经济上方便的化学途径获得，并且特别地但是不排他地通过产生生物相容和生物活性的水凝胶和脱水水凝胶获得。
进一步的目的是通过以下来改进这些系统：采用容易商购获得的多糖且不使这些多糖经受化学处理以及不需要对这些系统的复杂的制备处理。
为了满足上文所述的目的，发明人开发了合适的多糖系统，多糖系统基于包括优选来源于植物的或细菌的来源的中性多糖或阴离子多糖和支链阳离子多糖的至少二元组合物，允许支链阳离子多糖捕集金属纳米颗粒，并且中性多糖或阴离子多糖能够形成水合的或非水合的三维固体基体(例如具有各种形式的水凝胶、微球、支架、纤维状基体)和/或高表面积/体积比的基体(湿的或脱水的膜(membrane)和膜(film))。以这种方式，由均匀地捕集金属纳米颗粒的支链阳离子多糖形成的系统自身是纳米复合物。
因此，在第一方面，本发明的目的由包含聚合物基体和金属基纳米复合物的三维纳米复合物材料组成，聚合物基体由至少一种中性的或阴离子的(感胶离子性的、热致性的或热感胶离子性的)多糖组成，金属基纳米复合物由至少一种支链阳离子多糖组成，支链阳离子多糖中金属纳米颗粒被均匀地分散和稳定，其中中性多糖或阴离子多糖借助于合适的物理或化学胶凝剂被凝胶化，这取决于中性多糖或阴离子多糖自身的类型。
可以混合含有金属纳米颗粒的阳离子支链多糖的溶液与中性多糖或阴离子多糖溶液，并且以合适的pH值和离子强度工作，以便不导致团聚体的形成。通过利用中性的或酸性的多糖的形成亲离子的(ionotropic)或热致性的凝胶的能力，借助于合适的胶凝剂，然后可以获得水合的或非水合的三维基体，所述三维基体由这些中性多糖或阴离子多糖和支链碱性多糖(basic polysaccharide)的混合物组成，通过支链碱性多糖自身捕集被均匀地分散和稳定的这些后一类金属纳米颗粒。
因此，在第二方面，本发明的目的是一种制备三维纳米复合物材料的方法，所述三维纳米复合物材料包含聚合物基体和金属基纳米复合物，所述聚合物基体由至少一种感胶离子性的、热致性的或热感胶离子性的中性多糖或阴离子多糖组成，所述金属基纳米复合物由至少一种支链阳离子多糖组成，支链阳离子多糖中金属纳米颗粒被均匀地分散和稳定，其特征在于，所述三维纳米复合物材料可从至少一种感胶离子性的、热致性的或热感胶离子性的中性多糖或阴离子多糖的水溶液以及由捕集金属纳米颗粒的至少一种支链阳离子多糖组成的金属基纳米复合物的水溶液获得，其中这些水溶液具有至少50mM并且不高于350mM的离子强度以及至少7的pH，并且其中这些水溶液用能够导致感胶离子性的、热致性的或热感胶离子性的中性多糖或阴离子多糖的凝胶化的物理或化学胶凝剂处理。这些水溶液优选具有被包括在250mM至300mM的范围内的同渗浓度。
因此，可用这样的制备方法获得的三维纳米复合物材料也是本发明的目的。
此外，根据本发明的三维纳米复合物材料显示具有强的广谱抗菌活性并且无细胞毒性效应。
因此，本发明的进一步的目的是这些三维纳米复合物材料在生物医学领域中的用途，特别是对于抗微生物应用的用途。事实上，本发明的三维复合物材料对象有作为皮肤病学的(例如血管代谢性皮肤溃疡)和整形外科的(例如骨假体包覆)、牙科的(牙周病原体感染的治疗)、心脏病学的、泌尿科学的(支架包覆)和普通外科疗法领域中的生物材料的有用应用的前景。
附图简述
图1：该图示出了以水凝胶的形式的三维纳米复合物材料(AC-nAg凝胶)，三维纳米复合物材料包括由在藻酸盐(A)基体中的基于与乳糖的壳聚糖衍生物(C：以下称为Chitlac：CAS注册号85941-43-1)的银纳米颗粒(nAg)形成的金属基纳米复合物。组成是：0.2％(w/v)Chitlac、1.5％(w/v)藻酸盐、0.5mM AgNO3、0.25mM C6H8O6、10mM Hepes缓冲液、30mM CaCO3、60mM GDL(D-葡萄糖酸-δ-内酯)。水凝胶的制备在实施例8中描述。
图2：该图示出了以水凝胶的形式的三维纳米复合物材料(AC-nAu凝胶)，三维纳米复合物材料包括由在藻酸盐基体中的基于Chitlac的金纳米颗粒(nAu)形成的金属基纳米复合物。组成是：0.2％(w/v)Chitlac、1.5％(w/v)藻酸盐、0.5mM HAuCl4、10mM Hepes缓冲液、30mM CaCO3、60mM GDL。制备在实施例9中描述。
图3：该图示出了三维纳米复合物材料AC-nAg凝胶微球(0.2％(w/v)Chitlac、1.5％(w/v)藻酸盐、0.5mM AgNO3、0.25mM C6H8O6、10mM Hepes缓冲液、30mM CaCO3、60mM GDL)。制备在实施例13中描述。
图4：该图示出了大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 25922在以藻酸盐-Chitlac水凝胶(AC凝胶，实施例6，在左侧)的形式的三维纳米复合物材料和作为比较的以藻酸盐-Chitlac-nAg水凝胶(AC-nAg凝胶，实施例8，在右侧)的形式的三维纳米复合物材料上的细菌生长测试。
图5：该图示出了与含有三维纳米复合物材料AC-nAg微球的悬浮液接触240分钟的大肠杆菌ATCC 25922的细菌菌落计数测试。微球制备在实施例13中描述。对照由在20％ Mueller-Hinton培养基中的生长(T0和240分钟)代表。
图6：该图示出了大肠杆菌ATCC 25922在三维纳米复合物材料藻酸盐-Chitlac水凝胶(AC凝胶，实施例6，在左侧)和作为比较的三维纳米复合物材料藻酸盐-Chitlac-nAu水凝胶(AC-nAg凝胶，实施例9，在右侧)上的细菌生长测试。
图7：该图示出了根据LDH(乳酸脱氢酶)释放评价，通过接触的三维纳米复合物材料AC-nAg凝胶(实施例8，对角线)以及相关的提取物在37℃培养基中24小时和72小时之后对成纤维细胞系(NIH-3T3)的细胞毒性测试。对照由以下代表：i )粘附细胞(对照，小方格线)、ii)与没有银纳米颗粒的藻酸盐-Chitlac凝胶接触的细胞(AC凝胶，实施例6，水平线)、iii)与被保持与来自没有银纳米颗粒的藻酸盐-Chitlac凝胶的材料(以下称为″提取物″)接触给定时间(24小时)的液体培养基接触的细胞(AC凝胶提取物，斜网格)。
图8：该图示出了根据LDH(乳酸脱氢酶)释放评价，通过接触的三维纳米复合物材料AC-nAu凝胶(实施例9，AC-nAu接触)以及相关的提取物(AC-nAu提取物)在37℃培养基中24小时和72小时之后对成骨细胞细胞系(MG63)的细胞毒性测试。对照由以下代表：粘附细胞(粘附)、与没有金属纳米颗粒的藻酸盐-Chitlac凝胶接触的细胞(实施例6，AC接触)、来自没有金属纳米颗粒的藻酸盐-Chitlac凝胶的提取物(AC提取物)、与聚苯乙烯圆盘接触的细胞(PS，接触系统的阴性对照)、与具有ZnDBC的聚氨酯圆盘接触的细胞(PU，根据ISO 10993-5，接触系统的阳性对照)、与三硝基甲苯的溶液在一起的细胞(提取物的阳性对照)。
发明详述
定义
三维结构：为了本申请的目的，该定义表示能够在不经受形变时保持形状和大小的水合的或非水合的的结构。
本发明公开的三维结构是下文详细描述的由中性多糖或阴离子多糖基体形成的纳米复合物材料，纳米复合物材料包含由均匀地和永久地分散于多阳离子支链多糖中的金属纳米颗粒形成的材料。因此，在第一种情况中，定义“三维纳米复合物”用于表示本发明的纳米复合物材料。
水凝胶：通常，术语“水凝胶”表示能够在不经受形变时保持形状和大小的高度水合的三维半固体结构。它们可以从合适地交联的多糖的半稀溶液(semi-dilute solution)获得。
在以下的描述中，“纳米复合物水凝胶”还可以用于表示被水合时的如上文定义的本发明的三维纳米复合物结构。
纳米复合物：通常，术语“纳米复合物”表示由在宏观材料(基体)中的具有纳米尺度大小的颗粒(填料)组成的系统。作为本发明，三维纳米复合物来源于被包含在中性的或阴离子多糖基体中的纳米复合物材料(例如均匀地和永久地分散于支链阳离子多糖中的金属纳米颗粒)，这后一类材料在本文中主要被称为“金属基纳米复合物”。特别地，金属基纳米复合物由金属纳米颗粒组成，所述金属纳米颗粒通过金属离子被壳聚糖的糖醇性的(alditolic)或糖醛性的(aldonic)多糖衍生物还原或在壳聚糖的糖醇性的或糖醛性的多糖衍生物中还原而形成。因此，在以下的描述中，除“金属基纳米复合物”之外，“基于金属纳米颗粒的纳米复合物”也用于指代这种材料。
胶体溶液(或胶体)：其中具有1nm至1,000nm的大小的颗粒被分散于连续的溶剂介质中的系统。
“原位”凝胶化：其中存在胶凝剂(例如，用于藻酸盐的离子Ca2+)的受控释放的凝胶化方法。这通过使用胶凝剂(例如CaCO3)的非活化形式实现，然后胶凝剂的非活化形式在加入第二组分(例如葡萄糖酸-δ-内酯，GDL)时被释放。
本发明中描述的三维纳米复合物材料的目的和优势将从以下的详细描述得到更好的理解，在以下的详细描述中，作为本发明的非限制性的例子，将描述制备三维纳米复合物以及它们用于评估抗菌活性和细胞毒性的生物表征的一些例子。
描述
为了期望的目的，已经阐述了与基于多糖的纳米复合物系统的制备和表征有关的方面，在所述系统中利用了与金属纳米颗粒的纳米尺度有关的性质。
根据本发明，三维纳米复合物材料由聚合物基体和金属基纳米复合物形成，聚合物基体由至少一种感胶离子性的、热致性的或热感胶离子性的中性多糖或阴离子多糖的组合物组成，金属基纳米复合物由至少一种支链阳离子多糖组成，支链阳离子多糖捕集被均匀地分散和稳定于这样的支链阳离子多糖中的金属纳米颗粒。支链阳离子多糖在根据本发明的三维纳米复合物材料中具有双重功能：i)主要地，在一方面，适当地捕集和稳定金属纳米颗粒，以及ii)此外，在另一方面，参与形成实质上是多糖的组合物(例如至少一种感胶离子性的、热致性的或热感胶离子性的中性多糖或阴离子多糖以及至少一种支链阳离子多糖)的基体，这是因为三维基体主要是由中性多糖或阴离子多糖与合适的胶凝剂形成凝胶的能力导致的。因此，多糖的这样的组合物在可能的实施方案中是二元的并且由中性的或酸性的多糖以及支链阳离子多糖形成。
可用于本发明的目的的中性的或酸性的多糖是：a)能够形成感胶离子性的凝胶的酸性的多糖，其选自由藻酸盐、果胶酸盐、水溶性果胶酸盐(pectinate)组成的组；b)能够产生热致性的凝胶的中性的多糖，并且在这种情况下它们优选地选自由琼脂糖、硬葡聚糖、裂殖菌素、凝胶多糖组成的组；c)能够产生热感胶离子性的凝胶的酸性的多糖，并且在这种情况下优选地选自由琼脂糖硫酸盐(agarose sulfate)、ι-角叉菜胶和κ-角叉菜胶、硫酸纤维素、结冷胶、鼠李聚糖胶、韦兰胶(whelan gum)(也被称为文莱胶(welan gum))、黄原胶组成的组。
中性的或酸性的多糖的平均分子量(MW)可以高至2,000kDa并且优选地是100kDa至1,000kDa，并且更优选地使用200kDa的平均分子量。
如熟知的，这些中性多糖或阴离子多糖具有在合适的条件下形成三维结构(凝胶状或在水合时的水凝胶)的特征。事实上，与水凝胶形成有关的方面基本上与这些中性的或酸性的多糖的在接触感胶离子性的多糖的离子溶液或热致性的多糖的冷却过的溶液时立即形成水凝胶的能力有关。在酸性的热感胶离子性多糖的情况，胶凝剂可以是物理的和/或化学的并且因此是离子或合适的温度或它们二者。
相反地，与形成和携带金属纳米颗粒有关的方面基本上与第二多糖组分，即支链阳离子多糖有关。为了本发明的目的，这些是壳聚糖的糖醇性的或糖醛性的支链衍生物，其中形成线性壳聚糖链的D-葡萄糖胺单元借助于碳原子C2上的-NH-官能团而连接(bind)由通式(I)代表的彼此相同或不同的单糖的或寡糖的糖醇性的或糖醛性的多元醇残基，
Figure BPA00001306625700101
其中：
R是-CH2-或-CO-；
R1是氢、单糖或寡糖；
R2是-OH或-NHCOCH3。
为了代表性的目的，用壳聚糖支链衍生物中的单糖的或寡糖的糖醇性的或糖醛性的多元醇残基取代的D-葡萄糖胺单元由通式(II)代表，其中“n”是指构成线性壳聚糖链的D-葡萄糖胺单元的总数目：
Figure BPA00001306625700102
为了本发明的目的，在壳聚糖的优选的支链衍生物中，当R1是单糖时，所述单糖选自由半乳糖、葡萄糖、甘露糖、N-乙酰基葡萄糖胺和N-乙酰基半乳糖胺组成的组，并且当R1是寡糖时，所述寡糖可以包括2个糖苷单元。
通式(I)的糖醇性的或糖醛性的单糖的或寡糖的残基优选是包含1至3个糖苷单元的单糖或寡糖，并且根据更优选的方面，这些糖醇性的或糖醛性的多元醇残基是包含2至3个糖苷单元的寡糖的残基，并且更优选选自由乳糖、纤维二糖、纤维三糖、麦芽糖、麦芽三糖、壳二糖、壳三糖、甘露二糖组成的寡糖残基的组以及选自它们的相应的醛糖酸。为了本发明的目的，壳聚糖的最优选的寡糖衍生物是与乳糖的衍生物(Chitlac；CAS注册号85941-43-1)。此外，为了均匀地分散和稳定金属纳米颗粒，壳聚糖胺基团与这些通式(I)的单糖或寡糖的化学取代度必须是至少40％。壳聚糖胺基团与所述单糖或寡糖的取代度优选被包括在50％至80％的范围内并且更优选是70％。
可用于获得所提到的寡糖衍生物的壳聚糖的平均分子量(以下称为MW)高至1,500kDa并且优选被包括在400kDa至700kDa的范围内。
被包含在由壳聚糖的这些单糖的或寡糖的支链衍生物组成的聚合物基体中的金属纳米颗粒由优选选自银、金、铂、钯、铜、锌、镍和其混合物的金属制造。
被包含在由壳聚糖的单糖的或寡糖的支链衍生物组成的聚合物基体中的纳米颗粒具有在5nm至150nm的范围内的大小，并且特别地具有在30nm至50nm之间的受控的平均金属纳米颗粒大小。
这些纳米颗粒的基本特征是，这些纳米颗粒主要是以它们的还原形式的金属，此外不排除由具有离子特征的少数原子形成的簇的剩余物存在，并且在它们在多糖基体中分散/稳定时，涉及与壳聚糖自身的胺基团靠近的单糖的或寡糖的侧链。
不受到这些束缚，虽然阳离子多糖基体与金属的优选的比率涉及以胶体溶液的形式的金属基纳米复合物，但是所述金属基纳米复合物材料也可以以脱水膜或粉末的形式，以及甚至被渗析以从材料自身的制备除去剩余的反离子。在以胶体水溶液的形式的金属基纳米复合物中，多糖浓度(以％w/v表示)相对于起始的金属盐的浓度(以摩尔浓度表示)的比是0.0025至20并且优选是0.2。
因此，以mg每克阳离子多糖表示的可以被包含的金属质量可以是3,000mg/g至0.3mg/g并且优选是50mg被包含的金属每克多糖。
根据本发明的三维纳米复合物材料的这样的组分可以在合适的条件下使用碱性多糖的水溶液在外源的还原剂的存在或不存在下被制备。
制备根据本发明的三维纳米复合物材料的这种组分的方法包括至少以下步骤：
a)制备以高至2％(w/v)的浓度的支链阳离子多糖的水溶液；
b)制备以0.1mM至20mM的浓度的金属盐的水溶液；
c)将这些盐溶液加入多糖的溶液中并且混合，直到获得其中金属纳米颗粒均匀地分散的胶体溶液。
还原剂可选择地被加入所获得的胶体溶液中。
金属纳米颗粒的在支链阳离子多糖的存在下的形成产生了特别良好地分散和稳定的金属纳米颗粒系统，避免了预形成的金属纳米颗粒在溶液中形成大结块簇的熟知趋向，这种趋向通常导致损失与纳米尺度有关的益处。
在其一般特征中，制备金属基纳米复合物的方法如下：制备以不同的浓度(高至2％(w/v)，优选在0.05％(w/v)至1％(w/v)的范围内并且更优选是0.2％)的带有单糖或寡糖的这些壳聚糖支链衍生物的水溶液。然后，将多糖溶液与选自银、金、铂、钯、铜、锌、镍并且优选选自氯化物、高氯酸盐和硝酸盐的金属盐(例如AgNO3、HAuCl4、CuSO4、ZnCl2、NiCl2)的溶液混合，以获得0.1mM至20mM、更优选1mM至14mM并且还更优选1mM的这些金属的最终浓度。优选选自抗坏血酸、柠檬酸钠、硼氢化钠和氰基硼氢化钠的合适的已知的还原剂可以可选择地被加入溶液中以获得金属态纳米颗粒。还原剂以0.05mM至10mM的浓度被加入，并且优选地浓度是0.5mM。
然而，发现，在其他方面，对于其他聚合物系统，由带有单糖或寡糖的壳聚糖支链衍生物和金属纳米颗粒形成的金属基纳米复合物还可以在不存在还原剂的情况下被制备，这是因为侧边的单糖的或寡糖的链自身作为金属离子的还原剂，并且允许原位地形成被分散于聚合物基体中的纳米颗粒。在这种情况下，金属纳米颗粒可通过简单地混合以合适的浓度的壳聚糖衍生物溶液与所选择的金属的盐溶液来获得。并且在这种情况下，多糖和金属盐浓度是如上文报导的。
然而，在这两种情况下，由于在壳聚糖的单糖的或寡糖的支链衍生物上存在的氮原子和侧取代基的化学性质和物理化学性质，金属离子借助于配位相互作用(coordination interaction)与大分子发生相互作用，而单糖或寡糖例如乳糖的侧链的存在提供了有效的位阻，以阻碍纳米颗粒聚集的自然趋势。后续的离子还原，无论是由外源的还原剂导致的还是由壳聚糖的支链衍生物的单糖或寡糖链导致的，都导致由多糖链稳定的纳米颗粒的形成。
在这两种情况下，以mg每克报导的可以被包含的银的质量与多糖的质量的比率是如上文报导的。非预期地，发现，在水溶液混合由上文提到的中性的或酸性的多糖组成的聚合物组分和特别地是藻酸盐以及在本质上已经是纳米复合物材料(例如金属基纳米复合物)的包含金属纳米颗粒的碱性多糖聚合物组分(其是带有通式(I)的糖醇性的或糖醛性的多元醇的壳聚糖的支链衍生物)，所获得的纳米复合物材料是三维基体或稳定的水凝胶，并且它们在本质上不是聚集体，虽然存在金属纳米颗粒，并且纳米颗粒保持均匀地分散于壳聚糖的支链衍生物中。
事实上，根据本发明的水凝胶或三维基体形成可通过在具有合适的特征的水溶液中混合两种组分(例如中性的或酸性的多糖以及金属基纳米复合物)，借助于使用能够凝胶化阴离子的或中性的多糖的合适的剂对其进行后续的处理来获得。
特别地，包含由至少一种中性的或阴离子的感胶离子性的、热致性的或热感胶离子性多糖组成的聚合物基体以及由捕集被均匀地分散和稳定的金属纳米颗粒的至少一种支链阳离子多糖组成的金属基纳米复合物的三维纳米复合物材料，可由具有至少50mM并且不高于350mM的溶液离子强度以及至少7的pH的两种组分水溶液并且通过使用能够凝胶化中性的或阴离子的感胶离子性的、热致性的或热感胶离子性多糖的化学的或物理的胶凝剂处理这些溶液来获得。
由这两种组分获得三维基体或水凝胶的优选的条件(基本上是浓度、pH、离子强度)通常是具有在生理范围内的并且特别地在7至8之间的pH并且更优选是7.4的pH、以及250mM至300mM的同渗浓度、以及50mM至350mM且优选为150mM的离子强度的水溶液，该水溶液优选通过加入以0.05M至0.35M并且更优选为0.15M的浓度的NaCl来获得。
胶凝剂可以取决于感胶离子性阴离子多糖的类型而选自合适的一价离子、二价离子或三价离子以及对于热致性的多糖来说不高于50℃或不低于10℃的之间温度。如已知的，对于热感胶离子性多糖来说，胶凝剂可以是化学剂例如离子和物理剂例如温度。这两种类型的胶凝剂之间的选择基本上如本领域所熟知的取决于待凝胶化的酸性的热感胶离子性多糖。
对于多糖例如藻酸盐和果胶酸盐来说，这些离子是碱土离子(不包括镁)和过渡金属，并且优选选自由钙、钡、锶、铅、铜、锰和其混合物组成的组，或它们是稀土离子并且优选选自由钆、铽、铕和其混合物组成的组。
适合于凝胶化的这些离子的水溶液的浓度高于10mM并且优选10mM至100mM并且更优选50mM。凝胶化溶液优选含有50mM的CaCl2浓度以及0.15M的离子强度。
在角叉菜胶的情况，可以使用优选选自由钾、铷和铯组成的组的以不低于50mM并且优选50mM至200mM并且更优选0.1M的浓度的碱离子。
在导致热致性的水凝胶例如琼脂糖的多糖溶液的情况，水凝胶制备通过冷却至低于凝胶形成温度来进行。多糖溶液在高于发生由热致性的多糖导致的水凝胶形成的温度的温度被制备。在该温度，热致性的多糖不形成水凝胶。制备多糖溶液的温度优选在50℃至30℃的范围内并且更优选是37℃。水凝胶形成通过将多糖溶液滴入被冷却至低于凝胶形成温度的温度的凝胶化槽中发生。该温度优选在10℃至40℃的范围内并且更优选是20℃。
为了本发明的目的，中性多糖或阴离子多糖和包含金属纳米颗粒的支链碱性多糖的至少二元混合物具有中性多糖或阴离子多糖的高至4％(w/v)的总聚合物浓度(polymeric concentration)。这些总聚合物浓度优选在1.5％至3％(w/v)的范围内并且更优选是2％(w/v)。
为了本发明的目的，酸性的多糖和其中金属纳米颗粒被捕集的阳离子多糖的重量比是8∶1至1∶1(中性多糖或阴离子多糖∶阳离子多糖)，并且优选8∶1至5∶1，并且更优选7.5∶1。因此，本发明的三维纳米复合物材料可根据包括至少以下步骤的制备方法获得：
i.制备至少一种中性的或阴离子的感胶离子性的、热致性的或热感胶离子性的多糖和由捕集金属纳米颗粒(如上文提到的被制备)的壳聚糖的至少一种单糖的或寡糖的衍生物组成的金属基纳米复合物的混合物的水溶液，所述水溶液具有至少50mM并且不高于350mM的离子强度以及至少7的pH；
ii.通过借助于合适的化学胶凝剂或物理胶凝剂处理在以前的步骤制备的混合物的水溶液，来凝胶化中性的或阴离子的感胶离子性的、热致性的或热感胶离子性多糖。
特别地，该后一步骤可以通过将针浸入含有用于感胶离子性阴离子多糖的交联离子的溶液中或浸入用于热致性的多糖的在合适的温度的溶液中或通过“原位”凝胶化来实现。对于热感胶离子性多糖来说，可以采用离子溶液和用于凝胶化过程的在合适的温度的溶液二者。
使用上文描述的方法，获得了纳米复合物材料，其中由多糖制备的聚合物基体是三维的并且在经受后续的脱水过程时以水凝胶或非水合的形式。此外，这些基体可以采取各种形式，例如圆柱体、微球、圆盘、干燥膜、粉末，或可以被挤出以生产纤维。
在藻酸盐的情况，圆柱体可以通过将以非活化的形式的交联离子例如CaCO3或Ca-EDTA络合物加入多糖溶液中来制备。然后加入缓慢水解的物质，例如GDL(D-葡萄糖酸-δ-内酯)。例如，这些悬浮液被转移至圆柱形的或圆盘形的容器内并且被保持在该处24h。多糖溶液的凝胶圆柱体然后被从容器取出。圆柱体的原位形成是由于钙离子的释放。
为了测试本发明的三维纳米复合物的抗菌活性，进行在半固体载体上的细菌生长测试以及在三维纳米复合物凝胶的微球的存在下的细菌菌落的计数测试；已经显示，因为金属纳米颗粒的存在，所以细菌既不在这样的凝胶表面上生长也不在被放置为与三维纳米复合物凝胶微球接触的悬浮液中生长，由此支持了强抗菌活性。
在不同的真核细胞系上进行的细胞毒性测试表明，这些三维纳米复合物凝胶不是细胞毒性的，甚至保持有效的杀菌效果。
为了阐述性的而非限制性的目的，下文描述了根据本发明的水凝胶或非水合三维基体制备以及抗微生物类型的生物活性。
从一种阴离子多糖和由壳聚糖的一种寡糖衍生物与金属纳米颗粒组成的 金属基纳米复合物的溶液制备三维纳米复合物水凝胶
实施例1：用乳糖合成壳聚糖衍生物(下文称为“Chitlac”)
将壳聚糖(1.5g，乙酰化度11％)溶解于110mL的甲醇溶液(55mL)和pH 4.5的1％乙酸缓冲液(55mL)中。加入含有乳糖(2.2g)和氰基硼氢化钠(900mg)的60mL的甲醇溶液(30mL)和pH 4.5的1％乙酸缓冲液(30mL)。将混合物搅拌24小时，转移至渗析管(截留分子量12,000Da)并且用NaCl 0.1M渗析(更换2次)并且用去离子水渗析，直到实现在4℃的4μS的电导率。最后，将溶液在Millipore 0.45mm过滤器上过滤并且冷冻干燥。
实施例2：用纤维二糖合成壳聚糖衍生物(下文称为“Chitcell”)
将壳聚糖(1.5g，乙酰化度11％)溶解于110mL的甲醇溶液(55mL)和pH 4.5的1％乙酸缓冲液(55mL)中。加入含有纤维二糖(2.2g)和氰基硼氢化钠(900mg)的60mL的甲醇溶液(30mL)和pH 4.5的1％乙酸缓冲液(30mL)。将混合物搅拌24小时，转移至渗析管(截留分子量12,000Da)并且用NaCl 0.1M渗析(更换2次)并且用去离子水渗析，直到实现在4℃的4μS的电导率。最后，将溶液在Millipore 0.45mm过滤器上过滤并且冷冻干燥。
实施例3：具有在Chitlac中的银纳米颗粒的金属基纳米复合物的制备。
根据以下程序，在使用Chitlac溶液中的抗坏血酸还原金属离子后，获得纳米颗粒：制备以0.4％(w/v)的浓度的Chitlac水溶液。然后将Chitlac溶液与硝酸银溶液混合，从而获得AgNO3的1mM的最终浓度。然后加入抗坏血酸的溶液，从而获得0.5mM的最终浓度。
实施例4：具有在Chitcel中的银纳米颗粒的金属基纳米复合物的制备。
根据以下程序，在使用Chitcel溶液中的抗坏血酸还原金属离子后，获得纳米颗粒：制备以0.4％(w/v)的浓度的Chitcel水溶液。然后将Chitcel溶液与硝酸银溶液混合，从而获得AgNO3的1mM的最终浓度。然后加入抗坏血酸的溶液，从而获得等于0.5mM的最终浓度。
实施例5：具有在Chitlac中的金纳米颗粒的金属基纳米复合物的制备。
根据以下程序，在使用多糖Chitlac还原金属离子后，获得纳米颗粒：制备以0.4％(w/v)的浓度的Chitlac水溶液。然后将Chitlac溶液与四氯金酸混合，从而获得HAuCl4的1mM的最终浓度。
实施例6：借助于“原位”凝胶化制备基于藻酸盐-Chitlac的圆柱形水凝胶
在NaCl和Hepes缓冲液的存在下将藻酸盐溶液加入Chitlac溶液中，从而获得以下的最终浓度：1.5％(w/v)藻酸盐、0.2％(w/v)Chitlac、0.15M NaCl、0.01M Hepes缓冲液、pH 7.4。然后，加入CaCO3的溶液(浓度30mM)，并且然后加入D-葡萄糖酸-δ-内酯(GDL)([GDL]/[Ca2+]＝2)，以允许缓慢凝胶化。为了抗菌测试，加入20％ Mueller-Hinton培养基(4.2g/L)。将最终溶液转移至根据期望被制造大小(例如
Figure BPA00001306625700171
)的塑料圆筒，并且在黑暗中凝胶化24小时。
实施例7：借助于“原位”凝胶化制备基于藻酸盐-Chitlac和金属纳米颗粒的三维纳米复合物水凝胶
在CaCO3(最终浓度高至40mM并且优选15mM至30mM)的存在下，将根据实施例3制备的具有金属纳米颗粒的Chitlac溶液加入藻酸盐溶液(最终藻酸盐浓度高至4％(w/v)并且优选在1％(w/v)至2％(w/v)的范围内)中，并且然后加入D-葡萄糖酸-δ-内酯(GDL)([GDL]/[Ca2+]＝2)以允许缓慢凝胶化。为了抗菌测试，加入最终的20％ Mueller-Hinton培养基(4.2g/L)。
实施例8：借助于“原位”凝胶化制备基于藻酸盐-Chitlac和银纳米颗粒的圆柱形三维纳米复合物水凝胶
在NaCl和Hepes缓冲液的存在下将藻酸盐溶液加入根据实施例3制备的具有银纳米颗粒的Chitlac溶液中，从而获得以下的最终浓度：1.5％(w/v)藻酸盐、0.2％(w/v)Chitlac、0.5mM AgNO3、0.25mM C6H8O6、0.15M NaCl、0.01M Hepes缓冲液、pH 7.4。然后，加入CaCO3的溶液(浓度30mM)，并且然后加入D-葡萄糖酸-δ-内酯([GDL]/[Ca2+]＝2)，以允许缓慢凝胶化。为了抗菌测试，加入20％ Mueller-Hinton培养基(4.2g/L)。将最终溶液转移至根据期望被制造大小(例如
Figure BPA00001306625700181
)的塑料圆筒，并且在黑暗中凝胶化24小时。
值得强调的是，在凝胶化期间和之后都不存在颗粒聚集或聚合物相分离。如图1所见，所获得的三维纳米复合物材料是黄色-橙色水凝胶(颜色取决于银浓度而变化)。
实施例9：借助于“原位”凝胶化制备基于藻酸盐-Chitlac和金纳米颗粒的圆柱形三维水凝胶
在NaCl和Hepes缓冲液的存在下将藻酸盐溶液加入根据实施例5制备的具有金纳米颗粒的Chitlac溶液中，从而获得以下的最终浓度：1.5％(w/v)藻酸盐、0.2％(w/v)Chitlac、0.5mM HAuCl4、0.15M NaCl、0.01M Hepes缓冲液、pH 7.4。然后，加入CaCO3的溶液(浓度30mM)，并且然后加入D-葡萄糖酸-δ-内酯(GDL)([GDL]/[Ca2+]＝2)，以允许缓慢凝胶化。为了抗菌测试，加入20％ Mueller-Hinton培养基(4.2g/L)。将最终溶液转移至根据期望被制造大小(例如
Figure BPA00001306625700182
)的塑料圆筒，并且在黑暗中凝胶化24小时。
图2示出了所获得的三维纳米复合物水凝胶样品。
实施例10：借助于注射器由具有银纳米颗粒的藻酸盐-Chitlac溶液(在甘露醇中)制备三维纳米复合物球。
制备具有以下的最终浓度的多糖溶液。1.5％(w/v)藻酸盐、0.2％(w/v)Chitlac、0.5mM AgNO3、0.25mM C6H8O6、0.15M NaCl、0.01M Hepes缓冲液、pH 7.4。使用设置有23G针的注射器，在借助于磁棒的搅拌下，将溶液滴入含有50mM CaCl2和0.15M甘露醇、10mM Hepes缓冲液(pH 7.4)的溶液中。将球在凝胶化槽中在搅拌下保持10分钟，然后移除并且使用去离子水洗涤。
实施例11：借助于注射器由具有银纳米颗粒的藻酸盐-Chitlac溶液(在NaCl中)制备三维纳米复合物球。
制备具有以下的最终浓度的多糖溶液。1.5％(w/v)藻酸盐、0.2％(w/v)Chitlac、0.5mM AgNO3、0.25mM C6H8O6、0.15M NaCl、0.01M Hepes缓冲液、pH 7.4。使用设置有23G针的注射器，在借助于磁棒的搅拌下，将溶液滴入含有50mM CaCl2和0.15M甘露醇、10mM Hepes缓冲液(pH 7.4)的溶液中。将球在凝胶化槽中在搅拌下保持10分钟，然后移除并且使用去离子水洗涤。
实施例12：借助于注射器由具有金纳米颗粒的藻酸盐-Chitlac溶液制备三维纳米复合物球。
制备具有以下的最终浓度的多糖溶液。1.5％(w/v)藻酸盐、0.2％(w/v)Chitlac、0.5mM HAuCl4、0.15M NaCl、0.01M Hepes缓冲液、pH 7.4。使用设置有23G针的注射器，在借助于磁棒的搅拌下，将溶液滴入含有50mM CaCl2和0.15M甘露醇的溶液(凝胶化槽)中。将球在凝胶化槽中在搅拌下保持10分钟，然后移除并且使用去离子水洗涤。
实施例13：借助于静电珠发生器(electrostatic bead generator)由具有银纳米颗粒的藻酸盐-Chitlac溶液制备三维纳米复合物微球。
制备具有以下的最终浓度的多糖溶液。1.5％(w/v)藻酸盐、0.2％(w/v)Chitlac、0.5mM AgNO3、0.25mM C6H8O6、0.15M NaCl、0.01M Hepes缓冲液、pH 7.4。在借助于磁棒的搅拌下，将溶液滴入含有50mM CaCl2和0.15nm甘露醇的凝胶化槽中。通过使用静电发生器来控制微球大小，静电发生器允许作用于滴的表面张力，从而减小其大小。通常采用的条件是：电压5kV、针内径0.7mM、凝胶化槽和针之间的距离4cm、二元聚合物溶液流速10mL/分钟。将微球留在凝胶化溶液中搅拌10分钟，然后移除并且使用去离子水洗涤。
图3示出了所获得的三维纳米复合物微球样品。
实施例14：借助于静电珠发生器由具有金纳米颗粒的藻酸盐-Chitlac溶液制备三维纳米复合物微球。
制备具有以下的最终浓度的多糖溶液：1.5％(w/v)藻酸盐、0.2％(w/v)Chitlac、0.5mM HAuCl4、0.15M NaCl、0.01M Hepes缓冲液、pH 7.4。在借助于磁棒的搅拌下，将溶液滴入含有50mM CaCl2和0.15nm甘露醇的凝胶化槽中。通过使用静电珠发生器来控制微球大小，静电珠发生器允许作用于滴的表面张力，从而减小其大小。通常采用的条件是：电压5kV、针内径0.7mM、凝胶化槽和针之间的距离4cm、二元聚合物溶液流速10mL/分钟。将微球留在凝胶化溶液中搅拌10分钟，然后移除并且使用去离子水洗涤。
实施例15：借助于“原位”凝胶化制备基于藻酸盐-Chitlac和银纳米颗粒的具有高表面/体积比的三维纳米复合物水凝胶。
在NaCl和Hepes缓冲液的存在下将藻酸盐溶液加入根据实施例3制备的具有银纳米颗粒的Chitlac溶液中，从而获得以下的最终浓度：1.5％(w/v)藻酸盐、0.2％(w/v)Chitlac、0.5mM AgNO3、0.25mM C6H8O6、0.15M NaCl、0.01M Hepes缓冲液、pH 7.4。然后，加入CaCO3的溶液(浓度30mM)，并且然后加入D-葡萄糖酸-δ-内酯(GDL)([GDL]/[Ca2+]＝2)，以允许缓慢凝胶化。为了抗菌测试，加入20％最终的Mueller-Hinton培养基(4.2g/L)。将最终溶液倾倒至平滑表面(载玻片、陪替氏培养皿等等)上并且放在黑暗中凝胶化24小时。
实施例16：借助于“原位”凝胶化制备基于藻酸盐-Chitlac和银纳米颗粒的三维纳米复合物脱水膜
在NaCl和Hepes缓冲液的存在下将藻酸盐溶液加入根据实施例3制备的具有银纳米颗粒的Chitlac溶液中，从而获得以下的最终浓度：1.5％(w/v)藻酸盐、0.2％(w/v)Chitlac、0.5mM AgNO3、0.25mM C6H8O6、0.15M NaCl、0.01M Hepes缓冲液、pH 7.4。然后，加入CaCO3的溶液(浓度30mM)，并且然后加入D-葡萄糖酸-δ-内酯(GDL)([GDL]/[Ca2+]＝2)，以允许缓慢凝胶化。为了抗菌测试，加入20％最终的Mueller-Hinton培养基(4.2g/L)。将最终溶液倾倒至平滑表面(载玻片、陪替氏培养皿等等)上并且放在黑暗中凝胶化24小时。然后，空气干燥三维纳米复合物凝胶，从而获得三维纳米复合物固体脱水膜。
实施例17：借助于“原位”凝胶化制备基于藻酸盐-Chitlac和金纳米颗粒的具有高表面/体积比的三维纳米复合物水凝胶。
在NaCl和Hepes缓冲液的存在下将藻酸盐溶液加入根据实施例5制备的具有金纳米颗粒的Chitlac溶液中，从而获得以下的最终浓度：1.5％(w/v)藻酸盐、0.2％(w/v)Chitlac、0.5mM HAuCl4、0.15M NaCl、0.01M Hepes缓冲液、pH 7.4。然后，加入CaCO3的溶液(浓度30mM)，并且然后加入D-葡萄糖酸-δ-内酯(GDL)([GDL]/[Ca2+]＝2)，以允许缓慢凝胶化。为了抗菌测试，加入20％最终的Mueller-Hinton培养基(4.2g/L)。将最终溶液倾倒至平滑表面(载玻片、陪替氏培养皿等等)上并且放在黑暗中凝胶化24小时。
实施例18：借助于“原位”凝胶化制备基于藻酸盐-Chitlac和金纳米颗粒的三维纳米复合物膜
在NaCl和Hepes缓冲液的存在下将藻酸盐溶液加入根据实施例5制备的具有金纳米颗粒的Chitlac溶液中，从而获得以下的最终浓度：1.5％(w/v)藻酸盐、0.2％(w/v)Chitlac、0.5mM HAuCl4、0.15M NaCl、0.01M Hepes缓冲液、pH 7.4。然后，加入CaCO3的溶液(浓度30mM)，并且然后加入D-葡萄糖酸-δ-内酯(GDL)([GDL]/[Ca2+]＝2)，以允许缓慢凝胶化。为了抗菌测试，加入20％最终的Mueller-Hinton培养基(4.2g/L)。将最终溶液倾倒至平滑表面(载玻片、陪替氏培养皿等等)上并且放在黑暗中凝胶化24小时。然后，空气干燥三维纳米复合物凝胶，从而获得三维纳米复合物固体膜。
实施例19：微球的制备
根据已知的方法并且特别地通过以下制备上文报导的具体实施例13和14的微球：a)使用注射器将一种阴离子多糖的溶液和由壳聚糖的单糖的或寡糖的衍生物与金属纳米颗粒组成的一种金属基纳米复合物的溶液手动地滴入合适的凝胶化槽中，b)使用由Trondheim(挪威)的NTNU大学的生物技术学院的Gudmund
Figure BPA00001306625700221
教授开发的并且由Strand等人，2002，J.of Microencapsulation 19，615-630描述的一种静电珠发生器。这样的装置由具有借助于合适的开关可调的电压(高至10kV)的静电珠发生器组成，静电珠发生器连接于被容纳在由有机玻璃(Plexiglas)制造的安全架中的耐高压加热的(autoclavable)针支持物。
借助于在该架外部的、由通过泵调节并且连接于由栅格制造的具有1mm的内径的管的注射器组成的系统，将起始溶液滴入其中插入了电极的容纳凝胶化溶液的结晶器(在该架内)。仪器产生在针尖和凝胶化溶液的自由表面之间的恒定的电势差，电势差可以被调节并且范围在0至10kV。电势差导致聚合物滴(带负电的)从针尖的突然分离并且因此允许具有甚至具有小的大小(＜200mm)的胶囊。胶囊大小可以通过甚至改变其他因素来调节，因素例如针内径、针距凝胶化溶液表面的距离、聚合物流速。
实施例20：圆柱体的制备
通过将含有多糖和金属基纳米复合物的溶液倾倒入圆柱形容器中来制备上文报导的具体实施例6、8和9的凝胶圆柱体和圆盘。圆柱形水凝胶的大小取决于圆柱形容器的大小。圆柱形的容器尺寸通常是高度18mm和内径16mm，而圆盘形的容器的尺寸是高度8mm和内径16mm，即使不同的大小(高度和内径)也是完全可允许的。
实施例21：生物学表征
A.抗菌活性
为了测试三维纳米复合物凝胶的抗菌活性，在凝胶表面上涂抹以各种浓度的不同的菌株。测试革兰氏阴性菌株(大肠杆菌、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa))和革兰氏阳性菌株(金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis))二者。对照由琼脂凝胶和没有纳米颗粒的藻酸盐-Chitlac凝胶(AC凝胶)代表。在“过夜”温育之后，细菌菌落明显地存在于对照上，但是在含有纳米颗粒的凝胶(AC-nAg凝胶)上完全不存在(图4)，因此证明了由这些材料表现的杀菌作用效力。
此外，含有银纳米颗粒的纳米复合物凝胶微球(AC-nAg)被制备并且与细菌溶液(大肠杆菌)接触；对照由藻酸盐-Chitlac凝胶微球(没有银纳米颗粒)代表。结果表明，细菌菌落的浓度在对照中增加，但是在具有银纳米颗粒的微球的情况，下降了大于三个对数单位。
甚至根据实施例13获得的纳米复合物微球和根据实施例6和9获得的纳米复合物水凝胶也被证明能够实施有效的抗菌行为，如图5和图6分别所示的。
B.细胞毒性
进行在真核细胞系例如成骨细胞(MG63)、肝细胞(HEPG2)和成纤维细胞(3T3)上评价凝胶细胞毒性的测试。在该测试中，测量和评价细胞的乳酸脱氢酶(LDH)的释放，其与细胞损伤和死亡有关。LDH测试表明，这些三维纳米复合物凝胶对受测试细胞不导致细胞毒性效应，如可以在图7中看到的，例如在成纤维细胞的情况。事实上，在24和72小时之后，在用AC-nAg处理的细胞和对照(即用藻酸盐-Chitlac凝胶处理的细胞和未处理的细胞)之间在乳酸脱氢酶(LDH)的释放上未发现显著性差异。
在相似的含有金纳米颗粒的三维纳米复合物的基于藻酸盐-Chitlac的凝胶(AC-nAu凝胶)的情况，报导了可比较的结果；如在图8中看到的，这种类型的凝胶对于真核细胞来说也不是细胞毒性的。
这些结果的组合允许推断出，根据本发明的三维纳米复合物例如含有被形成和稳定于Chitlac中的纳米颗粒的基于藻酸盐-Chitlac的水凝胶，具有均质结构，在均质结构中纳米颗粒不聚集并且具有强杀菌活性，并且对真核细胞没有毒性。
这些新的三维纳米复合物系统提供以下的优势：
集成系统的开发，所述集成系统结合了壳聚糖的支链衍生物的形成和稳定具有杀菌活性的金属纳米颗粒的能力以及这样的壳聚糖衍生物的寡糖侧链的已经被表明的细胞刺激的生物学性质(Marsich等人，“Alginate/lactose-modified chitosan hydrogels：A bioactive biomaterial for chondrocyte encapsulation(藻酸盐/乳糖改性的壳聚糖水凝胶：一种用于软骨细胞包封的生物活性的生物材料)”，Journal of biomedical materials research-Part A，2008年2月；84(2)：364-76)。这种新的“糖纳米技术”方法将提供用于设计材料的新仪器，该新仪器利用由“糖生物学(glycobiological)”组分提供的生物活性和纳米颗粒的特殊性质；
制备具有以下混合组成的三维凝胶的可能性：i)中性多糖或阴离子多糖和ii)捕集金属纳米颗粒的壳聚糖的阳离子支链单糖的或寡糖的衍生物，这是通过利用在合适的条件下分别属于两种类型i)和ii)中的一种的两种聚合物之间的总互混性，虽然它们具有相反的电荷(对于类型i的聚阴离子)并且尽管存在金属纳米颗粒。在另一方面，如已知的，在使用其他非寡糖支链的阳离子型聚合物例如壳聚糖时，发生阴离子多糖并且特别是具有藻酸盐时的凝聚现象；
发现，所获得的纳米复合物凝胶对于真核细胞来说不是毒性的，即使它们具有强杀菌活性；
所使用的凝胶化方法允许获得具有可以适合于不同的应用需要的形状和大小的材料(例如干膜和湿膜、支架、微球、纤维等等)。

Claims (38)

1.一种三维纳米复合物材料，其包括聚合物基体和金属基纳米复合物，所述聚合物基体由至少一种感胶离子性的、热致性的或热感胶离子性的中性多糖或阴离子多糖组成，所述金属基纳米复合物由均匀地捕集金属纳米颗粒的至少一种阳离子支链多糖组成，其中所述中性多糖或阴离子多糖借助于合适的化学或物理胶凝剂来凝胶化。
2.根据权利要求1所述的三维纳米复合物材料，其中所述感胶离子性的阴离子多糖选自由藻酸盐、果胶酸盐、水溶性果胶酸盐组成的组。
3.根据权利要求1所述的三维纳米复合物材料，其中所述热致性的中性多糖选自由琼脂糖、硬葡聚糖、裂殖菌素、凝胶多糖组成的组。
4.根据权利要求1所述的三维纳米复合物材料，其中所述热感胶离子性的阴离子多糖选自由琼脂糖硫酸盐、ι-角叉菜胶和κ-角叉菜胶、硫酸纤维素、结冷胶、鼠李聚糖胶、韦兰胶、黄原胶组成的组。
5.根据权利要求1-4所述的三维纳米复合物材料，其中所述中性多糖或所述阴离子多糖具有高至2,000kDa的平均分子量(MW)。
6.根据权利要求5所述的三维纳米复合物材料，其中所述中性多糖或所述阴离子多糖具有被包括在100kDa至1,000kDa的范围内的平均分子量(MW)。
7.根据权利要求1所述的三维纳米复合物材料，其中所述阳离子支链多糖是壳聚糖的支链衍生物，其中形成所述壳聚糖直链的D-葡萄糖胺单元借助于碳原子C2上的官能团-NH-而连接由通式(I)代表的彼此相同或不同的糖醇性的或糖醛性的多元醇残基，
Figure FPA00001306625600021
其中：
R是-CH2-或-CO-；
R1是氢、单糖或寡糖；
R2是-OH或-NHCOCH3。
8.根据权利要求7所述的三维纳米复合物材料，其中所述糖醇性的或糖醛性的多元醇残基是包括1至3个糖苷单元的单糖或寡糖的残基。
9.根据权利要求7所述的三维纳米复合物材料，其中当R1是单糖时，所述单糖选自由半乳糖、葡萄糖、甘露糖、N-乙酰基葡萄糖胺和N-乙酰基半乳糖胺组成的组。
10.根据权利要求7所述的三维纳米复合物材料，其中所述糖醇性的或糖醛性的多元醇残基选自由乳糖、纤维二糖、纤维三糖、麦芽糖、麦芽三糖、壳二糖、壳三糖、甘露二糖和其醛糖酸的残基组成的组。
11.根据权利要求7所述的三维纳米复合物材料，其中所述壳聚糖的支链衍生物具有高于40％的D-葡萄糖胺单元胺基团的化学取代度。
12.根据权利要求11所述的三维纳米复合物材料，其中所述取代度被包括在50％至80％的范围内。
13.根据权利要求7所述的三维纳米复合物材料，其中所述壳聚糖具有高至1,500kDa的平均分子量。
14.根据权利要求13所述的三维纳米复合物材料，其中所述壳聚糖具有被包括在400kDa至700kDa的范围内的平均分子量(MW)。
15.根据权利要求1所述的三维纳米复合物材料，其中被包含在具有阳离子支链多糖的所述金属基纳米复合物中的所述金属纳米颗粒具有选自由银、金、铂、钯、铜、锌、镍和其混合物组成的组的金属。
16.根据权利要求1所述的三维纳米复合物材料，其中所述纳米颗粒具有被包括在5nm至150nm的范围内的平均粒度。
17.根据权利要求1所述的三维纳米复合物材料，其中以mg每g阳离子多糖计的金属质量被包括在3,000mg/g至0.3mg/g的范围内。
18.根据权利要求17所述的三维纳米复合物材料，其中以mg每g所述阳离子多糖计的金属质量是50mg/g。
19.根据权利要求1所述的三维纳米复合物材料，其中中性多糖或阴离子多糖与包含所述金属纳米颗粒的阳离子支链多糖的重量比被包括在8∶1至1∶1(中性多糖或阴离子多糖∶阳离子多糖)的范围内。
20.根据权利要求19所述的三维纳米复合物材料，其中所述中性多糖或阴离子多糖与包含所述金属纳米颗粒的阳离子支链多糖的重量比被包括在8∶1至5∶1的范围内。
21.根据权利要求1-20中的一项所述的三维纳米复合物材料，其作为抗微生物剂的用途。
22.一种用于制备根据权利要求1-20所述的三维纳米复合物材料的方法，其特征在于，所述三维纳米复合物材料可通过以下步骤来获得：制备至少一种感胶离子性的、热致性的或热感胶离子性的中性多糖或阴离子多糖以及由均匀地捕集金属纳米颗粒的至少一种阳离子支链多糖组成的金属基纳米复合物的混合物的水溶液，其中所述水溶液具有至少50mM并且不高于350mM的离子强度以及至少7的pH；以及通过用能够凝胶化所述感胶离子性的、热致性的或热感胶离子性的中性多糖或阴离子多糖的化学剂或物理剂处理所述水溶液。
23.根据权利要求22所述的用于制备三维纳米复合物材料的方法，其中所述水溶液具有被包括在250mM至300mM的范围内的同渗浓度。
24.根据权利要求22所述的用于制备三维纳米复合物材料的方法，其中所述离子强度通过加入以被包括在0.05M至0.35M的范围内的浓度的NaCl来获得。
25.根据权利要求22所述的用于制备三维纳米复合物材料的方法，其中用于感胶离子性多糖或热感胶离子性多糖的所述胶凝剂是具有选自一价离子、二价离子或三价离子的离子的盐的水溶液。
26.根据权利要求25所述的用于制备三维纳米复合物材料的方法，其中所述水溶液盐浓度高于10mM。
27.根据权利要求26所述的用于制备三维纳米复合物材料的方法，其中所述水溶液盐浓度被包括在10mM至100mM的范围内。
28.根据权利要求22所述的用于制备三维纳米复合物材料的方法，其中用于热致性多糖或热感胶离子性多糖的所述胶凝剂的温度被包括在10℃至40℃的范围内。
29.根据权利要求28所述的用于制备三维纳米复合物材料的方法，其中所述温度是20℃。
30.根据权利要求22所述的用于制备三维纳米复合物材料的方法，其中中性多糖或阴离子多糖的聚合物浓度高至4％(w/v)。
31.根据权利要求30所述的用于制备三维纳米复合物材料的方法，其中所述聚合物浓度被包括在1.5％至3％(w/v)的范围内。
32.一种三维纳米复合物材料，其是用根据权利要求22至31中的一项所述的制备方法可获得的。
33.根据权利要求32所述的三维纳米复合物材料，其中所述聚合物基体是水凝胶或非水合的基体。
34.根据权利要求32所述的三维纳米复合物材料，其中所述聚合物基体以选自圆柱体形状、微球、支架、凝胶平板、膜和纤维的不同的形式存在。
35.根据权利要求1-20和32-34中的一项所述的三维纳米复合物材料作为抗微生物剂的用途。
36.根据权利要求35所述的三维纳米复合物材料的用途，其用于创伤愈合。
37.根据权利要求35所述的三维纳米复合物材料的用途，其用于外科应用。
38.根据权利要求35所述的三维纳米复合物材料的用途，其用于农业和食品应用。
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