CN102066566A

CN102066566A - 转基因植物中的棉铃虫昆虫抗性管理

Info

Publication number: CN102066566A
Application number: CN2009801221653A
Authority: CN
Inventors: C·S·赫尔南德茨; A·范弗里埃特; J·范里; J·F·曼扎纳罗
Original assignee: Bayer CropScience NV
Current assignee: Bayer CropScience NV
Priority date: 2008-06-13
Filing date: 2009-04-16
Publication date: 2011-05-18
Also published as: BRPI0914615A2; CA2727637A1; EP2300618A1; WO2009149787A1

Abstract

本发明涉及在昆虫抗性管理计划中组合应用不同的对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的蛋白质，其中所述蛋白质为：a)Cry2A蛋白，例如Cry2Aa、Cry2Ab或Cry2Ae和b)Cry1A、Cry1F或VIP3A蛋白，特别是其中所述蛋白质可饱和地结合谷实夜蛾或棉铃实夜蛾的昆虫中肠膜；还涉及表达此类蛋白质组合的植物和种子，其用于延缓或防止此类昆虫物种群体中的抗性发展。

Description

转基因植物中的棉铃虫昆虫抗性管理

发明领域

本发明涉及植物病虫害防治领域，特别是昆虫的防治。本发明涉及在昆虫抗性管理计划中使用转基因植物细胞和植物，其中所述细胞和植物的基因组(或更典型地，前驱(predecessor)植物细胞或植物)已被提供了至少两个基因，每个基因编码对谷实夜蛾(Helicoverpa zea)或棉铃实夜蛾(Helicoverpa armigera)具有杀虫性的不同蛋白质，其中这些蛋白质可饱和地结合此类昆虫物种的刷状缘膜，所述蛋白质为：a)Cry2A蛋白和b)Cry1A、Cry1F或VIP3A蛋白，例如VIP3A、Cry1Ac、Cry1Ab或Cry1A.105蛋白。在一个实施方案中，此类植物用于延缓或防止棉铃虫(cotton bollworm)群体出现对农作物的抗性。

另外，本发明提供了同时或相继使用Cry2A蛋白和VIP3A、Cry1A或Cry1F蛋白或表达此类Cry2A蛋白和VIP3A、Cry1A或Cry1F蛋白的植物，以延缓或防止棉铃虫，特别是谷实夜蛾或棉铃实夜蛾，的抗性出现。

此类转化的植物比用单个杀虫蛋白基因转化的植物或用Cry1F-和Cry1A-编码基因转化的植物具有优势，尤其是在延缓或防止棉铃虫群体出现针对此类植物所表达的杀昆虫蛋白的抗性方面。

本发明还涉及用于生产转基因植物、特别是玉米、棉花、稻、大豆、高粱、番茄、向日葵和甘蔗的方法，所述转基因植物包括至少两个不同的杀昆虫Cry蛋白，这些蛋白显示对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾幼虫中肠刷状缘中的结合位点无竞争结合。在植物中同时表达编码Cry2A蛋白和VIP3A、Cry1F或Cry1A蛋白、特别是VIP3Aa、Cry1Ab或Cry1Ac蛋白的嵌合基因，在防止或延缓棉铃虫群体对此类植物中表达的杀昆虫蛋白出现抗性方面特别有用。

本发明进一步涉及用于防止或延缓谷实夜蛾或棉铃实夜蛾群体对表达VIP3或Cry1A和/或Cry1F蛋白的转基因植物出现抗性的方法，其包括提供还具有表达Cry2A蛋白的基因的此类植物。由于Cry2A蛋白和Cry1A或VIP3或Cry1F蛋白对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾幼虫的中肠刷状缘中的特异性结合位点无竞争，所以这些组合可以用于获得对抗所述幼虫的长期保护作用。

本发明还涉及在谷实夜蛾或棉铃实夜蛾昆虫物种群体已对含有VIP3、Cry1F和/或Cry1A蛋白的植物产生抗性的地区中控制谷实夜蛾或棉铃实夜蛾昆虫的方法，所述方法包括步骤：在所述地区中播种、种植或生长含有至少一个编码Cry2A蛋白的基因的种子或植物。在本发明的一个实施方案中，所述植物还可包含(除编码Cry2A蛋白的基因之外)编码另一种在谷实夜蛾或棉铃实夜蛾中与Cry2A、VIP3、Cry1F或Cry1A蛋白不共享结合位点的杀昆虫蛋白的基因。

发明背景

昆虫害虫使全世界农作物生产遭受着巨大的经济损失，并且农民每年都会面临由于虫害造成产量损失的威胁。农作物中的昆虫抗性基因工程已经成为降低与农作物管理和化学防治实践相关的成本的一个具有吸引力的方法。基于在植物中表达源自革兰氏阳性土壤细菌苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)(在本文中缩写成“Bt”)的杀昆虫蛋白，自1996年以来，第一代昆虫抗性农作物已投放市场。

与昆虫对某些合成杀昆虫剂快速出现抗性相比，尽管已应用了很多年，但是迄今仍未报导昆虫对掺入杀昆虫蛋白例如苏云金芽孢杆菌蛋白的植物出现抗性。这可能归因于正在用于此类转基因植物的昆虫抗性管理程序，例如表达高剂量水平的针对主要目标昆虫的蛋白质、和使用含有无此类杀昆虫蛋白的植物的避难所(refuge area)(天然避难所或结构避难所)。

为了赋予植物抗昆虫抗性而在植物中表达苏云金芽孢杆菌或其它杀昆虫蛋白基因的方法是本领域众所周知的，并且提供了农业昆虫防治的新方法，该方法同时也是安全的、在环境方面具有吸引力且有成本效益的。该方法持续成功的一个重要决定因素是是否(或什么时候)昆虫能够出现对转基因植物中表达的杀昆虫蛋白的抗性。与叶敷(foliar application)(之后杀昆虫蛋白通常快速降解)相比，转基因植物将对昆虫施加持续的选择压力。从实验室选择试验中可清楚看出，持续的选择压力可在昆虫中产生对杀昆虫蛋白例如苏云金芽孢杆菌Cry蛋白的适应性。

谷实夜蛾和棉铃实夜蛾分别是新旧世界中最重要的多寄主性鳞翅目昆虫害虫物种。这些昆虫有相当快速地对杀昆虫剂发展出抗性的历史，并且它们通常对很多Bt衍生的杀昆虫蛋白的敏感性不如重要的其它鳞翅目昆虫害虫。因此，这些昆虫物种是对Bt植物例如Bt棉花或Bt玉米植物出现抗性的最有可能的候选物。

使用最广泛的为控制鳞翅目昆虫而导入植物中的蛋白质包括Cry1A、Cry1F和VIP3A蛋白。基于竞争结合试验，已提出，在谷实夜蛾和棉铃实夜蛾中Cry1F蛋白与Cry1Ac竞争相同的中肠结合位点。而且，未发现证据表明这些昆虫物种中Cry1F有任何未被共享的位点(Hernandez和Ferre，2005)。因此，这两种蛋白在同一植物中的组合不是适用于谷实夜蛾或棉铃实夜蛾昆虫的抗性管理的方法。已经发现Cry1Fa对Cry1Ac结合位点具有仅低亲和力，这种低亲和力有可能反映所观察到的这些昆虫物种中Cry1F蛋白的低毒性(Liao等人，2002)。

有这样一个普遍认可的见解：Cry2毒素的作用方式是独特的，且不同于其它3个结构域的Cry毒素，这是因为它们非特异性地和/或不可饱和地与不受限数目的结合位点结合(English等人，1994；Lee等人，2006)。自English等人(1994)的出版物以来，该出版物中所描述的Cry2A蛋白的该结合特征已被明显地重申，且几位作者还提及该文献中描述的用于制备Cry2A蛋白进行结合试验的方法(例如，Luo等人，2007)。此外，EPA生物性杀虫剂资料单006487(2002)陈述了：Cry2Ab蛋白，以及一般地Cry2蛋白，产生高度有效的离子通道以补偿与自身或与大量非特异性结合位点的结合。(www.epa.gov/opp00001/biopesticides/ingredients/factsheets/factsheet_006487.htm)。此外，English等人(1994)和Karim等人(2000b)报导了在谷实夜蛾中Cry1A和Cry2A蛋白至少部分地竞争或共享共同的结合位点。此外，USDA-APHIS非管制状态申请06-298-01p(2006)中陈述：Cry1A和Cry2A蛋白共享很多共有结合位点(www.aphis.usda.gov/brs/aphisdocs/06 29801p.pdf)。

尚无根据直接可饱和性试验证实Cry2A蛋白的可饱和结合的报告，在该测定试验中使用固定浓度的结合位点(即BBMV)，向所述结合位点加入浓度渐增的标记蛋白。与本领域的报告和发现不同，本发明人最终在本文证明Cry2A毒素可以以特异的且可饱和的方式结合敏感昆虫中的受体，并且Cry2A毒素在棉铃虫(谷实夜蛾和棉铃实夜蛾)中与Cry1A毒素不共享(或竞争)结合位点。本文件包含了显示在直接可饱和性试验中Cry2A蛋白可饱和地结合敏感昆虫的中肠刷状缘膜的首次报道，并且还包含分析不同Cry2A蛋白之间的结合竞争性的首次报告。

发明概述

本文提供在转基因植物中控制谷实夜蛾或棉铃实夜蛾侵扰同时获得谷实夜蛾或棉铃实夜蛾昆虫对所述植物的抗性发展的较慢积累的方法，其包括在所述植物中表达a)对所述昆虫物种有杀昆虫性的Cry2Ae蛋白和b)对所述昆虫物种具有杀昆虫性的Cry1A、Cry1F或VIP3A蛋白的组合。

本文还提供用于在昆虫物种谷实夜蛾或棉铃实夜蛾群体中防止或延缓针对表达杀昆虫蛋白的转基因植物的昆虫抗性发展以控制所述虫害的方法，其包括在所述植物中表达对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry2Ae蛋白以及对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry1A、Cry1F或VIP3A蛋白的组合。

在本发明的一个实施方案中，提供了在昆虫物种谷实夜蛾或棉铃实夜蛾群体已对表达VIP3A、Cry1A或Cry1F蛋白的植物产生抗性的地区中控制谷实夜蛾或棉铃实夜蛾的方法，其包括在所述地区中播种或种植表达至少一种对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry2Ae蛋白的植物的步骤。

本文还提供，在谷实夜蛾或棉铃实夜蛾群体已对表达Cry2Ae蛋白的植物产生抗性的地区中控制谷实夜蛾或棉铃实夜蛾的方法，其包括在所述地区中播种或种植表达对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry1F、VIP3或Cry1A蛋白的植物的步骤。

依照本发明还提供，用于获得包含编码至少两种不同的杀昆虫蛋白的嵌合基因的植物的方法，其中如在使用谷实夜蛾或棉铃实夜蛾昆虫幼虫的刷状缘膜小泡的竞争结合实验中测定的，所述蛋白质在谷实夜蛾或棉铃实夜蛾物种的幼虫中不具有共享的结合位点，所述方法包括以下步骤：获得包含编码对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry2Ae蛋白的可植物表达嵌合基因和编码对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry1A、VIP3或Cry1F蛋白的可植物表达嵌合基因的植物。本文进一步提供了这样的方法，其中所述植物通过如下方式获得：用所述编码Cry2Ae和Cry1A、VIP3或Cry1F蛋白的可植物表达的嵌合基因转化植物，并获得包含所述嵌合基因的所述植物的种子和后代植物；或将包含所述编码Cry2Ae的嵌合基因的亲本植物与包含所述编码Cry1A、VIP3或Cry1F的嵌合基因的亲本植物杂交，并获得包含所述嵌合基因的后代植物和种子；或在包含编码对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry2Ae蛋白的可植物表达的嵌合基因的植物中转化编码对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry1A、VIP3或Cry1F蛋白的第二可植物表达的嵌合基因，并获得包含该至少两个嵌合基因的后代植物和种子。

在本发明的另一个实施方案中，提供了用于获得表达至少两种不同的杀昆虫蛋白的植物的方法，其中如可以在使用谷实夜蛾或棉铃实夜蛾幼虫的刷状缘膜小泡的竞争结合实验中测定的，所述蛋白质在物种谷实夜蛾或棉铃实夜蛾的幼虫中不具有共享的中肠结合位点，且其中所述蛋白质为：a)对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry2Ae蛋白和b)对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry1A、VIP3或Cry1F蛋白、特别是对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的VIP3或Cry1A蛋白。

本文还提供播种、种植或生长植物的方法，其中所述植物被保护而可以对抗棉铃虫，所述植物包含表达至少两种不同的杀昆虫蛋白的嵌合基因，其中如在使用谷实夜蛾或棉铃实夜蛾幼虫的刷状缘膜小泡的竞争结合实验中测定的，所述蛋白质在物种谷实夜蛾或棉铃实夜蛾的幼虫中不具有共享的结合位点，所述方法包括以下步骤：播种、种植或生长包含编码对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry2Ae蛋白的嵌合基因和编码对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry1A、VIP3或Cry1F蛋白、优选对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的VIP3或Cry1A蛋白的嵌合基因的植物。

本文还提供：至少两种不同的杀昆虫蛋白在转基因植物中的用途，用于防止或延缓谷实夜蛾或棉铃实夜蛾群体中的昆虫抗性发展，其中如可通过竞争结合实验测定的，所述蛋白质在所述昆虫物种的昆虫中肠中不具有共享的结合位点，所述应用包括在所述转基因植物中表达对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry2Ae蛋白和对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry1F、VIP3或Cry1A蛋白；和编码对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry2Ae蛋白的嵌合基因和编码对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry1F、VIP3或Cry1A蛋白的嵌合基因，特别是编码对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry2Ae蛋白的嵌合基因和编码对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的VIP3或Cry1A蛋白的嵌合基因，的用途，用于防止或延缓昆虫物种谷实夜蛾或棉铃实夜蛾群体中对表达杀昆虫蛋白的转基因植物的昆虫抗性发展，以控制所述虫害。

在本文的一个实施方案中，提供了对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry2Ae蛋白与对所述物种昆虫具有杀昆虫性的Cry1A、VIP3或Cry1F蛋白的组合的用途，用于防止或延缓所述物种昆虫对表达异源性杀昆虫毒素的转基因植物的抗性发展，特别是当所述用途通过在植物中表达所述蛋白组合而实现时。

本文还提供：包含对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry2Ae蛋白的植物在如下地区中的应用，在所述地区所述昆虫物种的群体已对包含Cry1F、VIP3和/或Cry1A蛋白的植物产生了抗性，其中所述应用可以包括在所述地区中播种、种植或生长包含对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry2Ae蛋白的植物；和包含对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry1F、VIP3和/或Cry1A蛋白的植物在如下地区中的应用，在所述地区所述昆虫物种的群体已对包含Cry2Ae蛋白的植物产生了抗性，其中所述应用可以包括在所述地区中播种、种植或生长包含对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry1F、VIP3和/或Cry1A蛋白的植物。

本文还提供：编码对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry2Ae蛋白的嵌合基因和编码对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry1A、VIP3或Cry1F蛋白的嵌合基因、特别是编码对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry2Ae蛋白的嵌合基因和编码对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry1A或VIP3蛋白的嵌合基因在用于获得能够表达至少两种不同的杀昆虫蛋白的植物的方法中的应用，其中如可在竞争结合实验(例如通过使用所述昆虫幼虫的刷状缘膜小泡)中测定的，所述杀昆虫蛋白在物种谷实夜蛾或棉铃实夜蛾的幼虫中不具有共享的结合位点。

在本发明的一个实施方案中，提供了编码对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry2Ae蛋白的嵌合基因的用途，用于获得包含至少两种不同的杀昆虫蛋白的植物，其中如可在例如通过使用所述昆虫幼虫的刷状缘膜小泡的竞争结合实验中测定的，所述杀昆虫蛋白在物种谷实夜蛾或棉铃实夜蛾的幼虫中不具有共享的中肠结合位点，其中所述Cry2Ae嵌合基因存在于还包含编码对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry1A、VIP3或Cry1F蛋白的嵌合基因的植物中。

在一个实施方案中，上述应用包括步骤：通过用编码所述Cry2Ae和Cry1A、VIP3或Cry1F蛋白的嵌合基因转化植物而获得包含此类不同杀昆虫蛋白的植物，和通过将包含编码所述Cry2Ae蛋白的嵌合基因的植物与包含编码所述Cry1A、VIP3或Cry1F蛋白的嵌合基因的植物杂交而获得包含此类不同杀昆虫蛋白的植物，和获得包含所述嵌合基因的所述植物的种子和后代植物。

本发明还提供了这样的应用：用不含有对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry2、Cry1或VIP3蛋白的植物播种、种植或生长避难所(refuge area)，例如通过在包含本文所述的Cry2Ae、VIP3和Cry1蛋白的植物的相同种植区或附近播种、种植或生长此类植物。

本文还提供上述应用或方法，其中植物以对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾而言的高剂量表达Cry2Ae、VIP3、Cry1F或Cry1A蛋白。

本文还提供：生长、播种或种植表达Cry蛋白或VIP3蛋白的植物以控制棉铃实夜蛾或谷实夜蛾昆虫的方法，其包括步骤：在该种植区中或在该种植区附近种植、播种或生长小于20％、小于15％或小于10％种植区的喷洒过杀虫剂的结构避难所、或小于5％种植区的未喷洒过杀虫剂的结构避难所，或在种植区中不种植、播种或生长避难所，其中所述避难所位于相同的种植区内，或者位于种植区的2英里内、1英里内或0.5英里内，且含有不包含该Cry或VIP3蛋白的植物，其中所述表达Cry蛋白或VIP3蛋白的植物表达对所述昆虫物种具有杀昆虫性的Cry2Ae蛋白和对所述昆虫物种具有杀昆虫性的Cry1A、Cry1F或VIP3A蛋白、特别是Cry2Ae和Cry1Ab或Cry1Ac或VIP3A蛋白、优选Cry2Ae和Cry1Ab和VIP3蛋白的组合。本文还提供植物、特别是玉米或棉花植物的种植区(field)，其包含小于20％、小于15％、小于10％或小于5％的结构避难所或不包含结构避难所，其中所述种植区种植有表达对棉铃实夜蛾或谷实夜蛾昆虫具有杀昆虫性的Cry2Ae或Cry2Ab蛋白和对所述昆虫物种之一具有杀昆虫性的Cry1A、Cry1F或VIP3A蛋白、特别是Cry2Ae和Cry1Ab、Cry1Ac或VIP3A蛋白、优选Cry2Ae和Cry1Ab和VIP3蛋白的组合的植物。

在本发明的一个实施方案中，还提供了特异地且可饱和地结合谷实夜蛾幼虫中肠中的结合位点的至少2种杀昆虫蛋白的用途，用于延缓或防止该昆虫物种对表达杀昆虫蛋白的植物的抗性发展，其中在所述植物中所述蛋白质之一是对该昆虫物种具有杀昆虫性的Cry2A蛋白，例如Cry2Ab蛋白，而另一种蛋白质是对该昆虫物种具有杀昆虫性的Cry1A、Cry1F或VIP3蛋白，其中在可饱和性试验中确定所述的可饱和结合，所述试验使用固定浓度的结合位点(即BBMV)，并向所述结合位点加入浓度渐增的标记蛋白。特别地，在此用途中，Cry1A蛋白选自下组：Cry1Ac、Cry1Ab、Cry1A.105或Cry1Ac或Cry1Ab杂合蛋白，例如由任何一种本文提及的cry1A编码区编码的蛋白质。在谷实夜蛾昆虫幼虫的中肠中该Cry2Ab和Cry1A蛋白对它们的(可饱和且特异的)结合位点不存在竞争，如可在BBMV竞争结合试验中测量的。

本文使用的Cry2Ae蛋白是指：杀昆虫Cry2Ae蛋白，例如WO2002/057664的SEQ ID No.2的全长Cry2Ae蛋白(Cry2Ae1，SEQ ID No.1)；Cry2Ae毒性片段或包含Cry2Ae毒性片段的蛋白质(如WO2002/057664中所述)，例如Cry2Ae蛋白片段与叶绿体转运肽或对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的另一肽序列的融合蛋白；或是包含如下氨基酸序列的对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的蛋白质，所述氨基酸序列与本文SEQ ID No.1的氨基酸序列或与WO 2002/057664的SEQ IDNo.2具有至少95、97或99％序列同一性，特别是在对应于最小毒性片段的部分中；或是由包含在棉花事件EE-GH6(在要求欧洲专利申请号07075460或07075485(未公开)的优先权的PCT专利申请中描述)中的Cry2Ae嵌合基因的Cry2Ae编码区部分编码的蛋白质，特别是包含所述Cry2Ae蛋白之任一的最小毒性片段的任何蛋白质，或对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾保留毒性的具有1-5个氨基酸不同的所述Cry2Ae蛋白之任一的变体。

本文使用的Cry2Ab蛋白是指：Crickmore等人(1998)或www.1ifesci.susx.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/中对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的任何一种Cry2Ab蛋白，例如全长Cry2Ab蛋白、Cry2Ab毒性片段、Cry2Ab2蛋白(本文为SEQ ID No.2)、或包含Cry2Ab毒性片段的蛋白，例如Cry2Ab2蛋白片段与叶绿体转运肽或对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾保留毒性的另一肽序列的融合蛋白；或是包含如下氨基酸序列的对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的蛋白质，所述氨基酸序列与本文SEQID No.2或与NCBI登录CAA39075的氨基酸序列(Dankocsik等人，1990)具有至少95、97或99％序列同一性，特别是在对应于最小毒性片段的部分中；或是由包含在棉花事件15985(在USDA-APHIS非管制状态申请00-342-01p中描述)中的Cry2Ab嵌合基因的Cry2Ab2编码区部分编码的蛋白质、由包含在玉米事件MON89034(在USDA-APHIS非管制状态申请06-298-01p中描述)中的Cry2Ab嵌合基因的Cry2Ab2编码区部分编码的蛋白质、特别是包含所述Cry2Ab蛋白之任一的最小毒性片段的任何蛋白、或者对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾保留毒性且具有1-5个氨基酸不同的所述Cry2Ab蛋白之任一的变体。

本文使用的Cry1F蛋白包括：包含对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾保留毒性的Cry1F蛋白氨基酸序列的最小毒性片段的任何蛋白质，例如NCBI登录号AAA22347(US 2005049410的SEQ ID No.10)的蛋白或Cry1Fa1蛋白(SEQ ID No.3)。此定义还包括SEQ ID No.3或NCBI登录号AAA22347的氨基酸序列的变体，例如与SEQ ID No.3或与NCBI登录号AAA22347的Cry1F蛋白具有至少90％序列同一性的氨基酸序列(如利用GCGWisconsin软件包的GAP程序(Madison，Wisconsin，USA，10.2版)，使用成对比对确定)，特别是在对应于最小毒性片段的部分中具有此同一性。本文使用的Cry1F蛋白包括由Cry1F棉花事件281-24-236(WO2005/103266，参见USDA APHIS非管制状态申请03-036-01p)中或玉米事件TC1507或TC-2675(US 7,288,643、WO 2004/099447、USDAAPHIS非管制状态申请00-136-01p和03-181-01p)中的Cry1F基因编码的蛋白质，特别是包含所述Cry1F蛋白之任一的最小毒性片段的任何蛋白质，或对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有毒性的具有1-5个氨基酸不同的所述Cry1F蛋白之任一的变体。

在本发明的一个实施方案中，VIP3蛋白是对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾幼虫具有杀昆虫性的蛋白质，其是Crickmore等人(2008)中列出的任何一种VIP3蛋白，或包含这些蛋白质之任一的最小毒性片段的任何蛋白质。所用的VIP3蛋白可以是对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的VIP3A蛋白，例如SEQ ID No.4的VIP3Aa1蛋白、SEQ ID No.5的VIP3Af1蛋白、本文所述的VIP3Aa19(NCBI登录号ABG20428，EPA实验应用许可手册(EPA experimental use permit factsheet)006499(2007)，本文SEQ ID No.6)或VIP3Aa20蛋白(本文SEQ ID No.7)，以及包含其杀昆虫片段或功能结构域的任何蛋白；以及与NCBI登录号AAC37036(Estruch等人，1996)或SEQ ID No.4的VIP3Aa1蛋白(特别是与其最小毒性片段)、或与NCBI登录号CAI43275的VIP3Af1蛋白(本文SEQ ID No.5，WO03/080656中的SEQ ID No.4)(特别是与其最小毒性片段)具有至少70％序列同一性(如使利用GCG Wisconsin软件包的GAP程序、使用成对比对测定)的、对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的任何蛋白；以及选自如下的对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的VIP3A蛋白：VIP3Ab、VIP3Ac、VIP3Ad、VIP3Ae、VIP3Af、VIP3Ag或VIP3Ah，特别是VIP3Af1、VIP3Ad1或VIP3Ae1蛋白(分别为NCBI登录号CAI43275(ISP3a，WO 03/080656中的SEQ ID No.4)、CAI43276(ISP3b，WO 03/080656中的SEQ ID No.6)、和CAI43277(ISP3C，WO 03/080656中的SEQ ID No.2))，及其杀昆虫片段、杂种或变体。在一个实施方案中，VIP3蛋白是导入棉花植物中(例如包含事件COT102的植物，在WO 2004/039986或USDA APHIS非管制状态申请03-155-01p中描述)的VIP3Aa19蛋白(NCBI登录号ABG20428，SEQ IDNo.6)，或导入玉米植物中(例如事件MIR162，USDA APHIS非管制状态申请07-253-01p)的VIP3Aa20蛋白(NCBI登录号ABG20429，WO2007/142840中的SEQ ID NO：2，本文为SEQ ID No.7)、或在棉花事件COT202或COT203(分别见WO 2005/054479和WO 2005/054480)中产生的VIP3A蛋白，或具有1-5个氨基酸不同且对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾保留毒性的任何一种上述VIP3蛋白的变体。

本文使用的Cry1A蛋白是指Cry1Ac1(SEQ ID No.8)、Cry1A.105(SEQID No.9)或Cry1Ab1(SEQ ID No.10)蛋白，且包括包含对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾保留毒性的Cry1Ac、Cry1A.105或Cry1Ab蛋白氨基酸序列的最小毒性片段的任何蛋白，例如包含SEQ ID No.8或NCBI登录号AAA22331(Cry1Ac；Adang等人，1985)中的蛋白质、SEQ ID No.10或NCBI登录号AAA22330(Wabiko等人，1986(Cry1Ab))中的蛋白质、或由玉米事件MON89034(USDA APHIS非管制状态申请06-298-01p、WO2007/140256，WO 2007/027777中的SEQ ID NO：2或4)中的Cry1A转基因编码的本文SEQ ID No.9的Cry1A.105蛋白、或由棉花事件COT67B(USDA APHIS不解除管制状态申请07-108-01p、WO 2006/128573)中的cry1Ab编码区编码的Cry1Ab蛋白的最小毒性片段的任何蛋白。此定义还包括NCBI登录号AAA22331(Cry1Ac1)、NCBI登录号AAA22330(Cry1Ab，Wabiko等人，1986)中的氨基酸序列、或USDA APHIS非管制状态申请06-298-01p中所述的Cry1A.105蛋白的氨基酸序列的变体，例如与该Cry1Ac、Cry1A.105或Cry1Ab蛋白，特别是SEQ ID Nos.8、9或10的蛋白，更特别是在对应于最小毒性片段的部分中，具有至少90％氨基酸序列同一性(如利用GCG Wisconsin软件包的GAP程序(Madison，Wisconsin，USA，10.2版)、使用配对比对确定)、具有Cry1A蛋白的最小毒性片段的蛋白质。

Cry1A蛋白在本文中包括由US 6,114,608的SEQ ID NO：3编码的Cry1Ab蛋白、特别是由玉米事件MON810(US 6,713,259，USDA APHIS不解除管制状态(non-deregulated status)申请96-017-01p及其补充)中的cry1Ab编码区编码的Cry1Ab蛋白、由玉米事件Bt11(USDA APHIS不解除管制状态申请95-195-01p，US专利6,114,608)中的cry1Ab编码区编码的Cry1Ab蛋白、由棉花事件3006-210-23(US 7,179,965、WO 2005/103266、USDA APHIS不解除管制状态申请03-036-02p)中的转基因编码的Cry1Ac蛋白、由棉花事件COT67B(USDA APHIS不解除管制状态申请07-108-01p、WO 2006/128573)中的cry1Ab编码区、包含在PCT专利申请PCT/EP2008/002667(未公开)所述的棉花事件EE-GH5中的Cry1Ab编码区、美国专利7,049,491的SEQ ID No.2的Cry1Ab编码区编码的Cry1Ab蛋白、由玉米事件MON89034(USDA APHIS非管制状态申请06-298-01p、WO 2007/140256、WO 2007/027777中的SEQ ID NO：2或4)中的Cry1A转基因编码的Cry1A.105蛋白、由棉花事件15985或棉花事件531，757或1076(USDA APHIS非管制状态申请94-308-01p，WO 2002/100163的cry1A棉花事件编码的嵌合Cry1Ac蛋白)中的杂种cry1Ac编码区编码的Cry1Ac样蛋白、由分别述于WO 2006/128568、WO 2006/128569、WO 2006/128570、WO 2006/128571或WO 2006/128572的棉花事件T342-142、1143-14A、1143-51B、CE44-69D或CE46-02A中的cry1Ab编码区编码的cry1Ab蛋白(即由WO 2006/128568、WO 2006/128569、WO 2006/128571或WO2006/128572中的SEQ ID No.7的DNA或由WO 2006/128570中的SEQ IDNo.5的DNA编码的蛋白)、或包含上述Cry1A蛋白之任一的最小毒性片段的蛋白质、或具有1-5个氨基酸不同但保留对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾的毒性的上述Cry1A蛋白之任一的变体。

本文还提供包含至少2个转基因的植物或种子，其中每个转基因各编码不同的对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的蛋白质，所述蛋白质可饱和地且特异性地结合此类昆虫中肠中的结合位点，其中所述蛋白在此类昆虫中不竞争相同结合位点，且其中所述蛋白质为i)Cry2A蛋白和ii)Cry1A、Cry1F或VIP3蛋白。在一个实施方案中，所述植物包含编码下述蛋白的转基因：i)Cry2Aa、Cry2Ab或Cry2Ae、和ii)Cry1Ab、Cry1Ac、CryIFa或VIP3A、特别是Cry2Ae蛋白和Cry1Ab和/或VIP3A蛋白。在另一个实施方案中，所述植物或种子是包含编码Cry1A、Cry1F或VIP3蛋白的嵌合基因和编码Cry2A蛋白、特别是Cry2Ae蛋白的嵌合基因的玉米或棉花植物或种子，其中所述植物或种子包含选自下组的转化事件：玉米事件MON89034、玉米事件MIR162、包含编码Cry2Ae蛋白的转基因的玉米事件、玉米事件TC1507、玉米事件Bt11、玉米事件MON810、棉花事件EE-GH6、棉花事件COT102、棉花事件COT202、棉花事件COT203、棉花事件T342-142、棉花事件1143-14A、棉花事件1143-51B、棉花事件CE44-69D、棉花事件CE46-02A、棉花事件COT67B、棉花事件15985、棉花事件3006-210-23、棉花事件531、棉花事件EE-GH5、棉花事件281-24-236，所有事件如本文进一步的定义。

本文还提供包含至少3个转基因的植物，其中每个转基因编码不同的对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的蛋白质，所述蛋白质可饱和且特异性地结合此类昆虫中肠中的结合位点，其中所述蛋白在此类昆虫中不竞争相同结合位点，且其中所述植物包含编码Cry1A或Cry1F蛋白的嵌合基因、编码Cry2A蛋白的嵌合基因和编码VIP3A蛋白的嵌合基因，且其中这些事件选自如上文段落所述的组。

在本发明的一个实施方案中，在本发明的用途、方法或植物中，Cry2Ae、Cry2Ab、VIP3、Cry1F或Cry1A嵌合基因是包含在上述玉米或棉花事件之任一中的嵌合基因。依照本发明，还包括：其中的术语Cry2Ae被术语Cry2Aa或Cry2Ab替代的本文所述的任何用途、方法、植物或种子；以及涉及Cry2Ae、Cry2Aa或Cry2Ab蛋白的任何上述用途、方法、植物或种子，其中该Cry2A蛋白与谷实夜蛾或棉铃实夜蛾的中肠BBMV的结合是特异性的且可饱和的，特别是当在直接可饱和性结合试验中确定可饱和结合时；优选这样的用途、方法、植物或种子，其中在本文所述的标准竞争结合试验中，在棉铃实夜蛾或谷实夜蛾中任何所述Cry2A蛋白和Cry1A、Cry1F或VIP3蛋白的特异性结合之间均没有生物学显著的竞争。

在本发明的上述植物、种子、用途或方法中，优选的植物，例如对于将不同的嵌合基因通过杂交而堆叠或组合在同一植物中而言，是包含任何一个上述玉米事件或任何一个上述棉花事件的植物，以及其包含编码所述Cry2A、和所述VIP3和/或Cry1蛋白的嵌合基因的后代或子代。

本文使用的植物或种子包括会显著受到棉铃虫破坏的任何植物物种的植物或种子，但特别包括玉米、棉花、稻、大豆、高粱、番茄、向日葵和甘蔗。

本文还提供：用于使表达对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的蛋白质的植物的种植或商品化获得解除管制或获得监管部门批准的方法；或用于减少含有不产生对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的任何蛋白质的植物的结构避难所的方法；或用于种植不具有结构避难所的种植区的方法，所述方法包括以下步骤：引用、提交或依赖昆虫试验结合数据，其中所述数据显示Cry2A蛋白特异性且可饱和地结合所述昆虫的昆虫中肠膜、并且所述Cry2A蛋白在所述昆虫中不竞争Cry1A、Cry1F或VIP3蛋白的结合位点，例如本文所公开的数据或在其它文件中报导的类似数据。在一个实施方案中，Cry2A蛋白是Cry2Aa、Cry2Ab或Cry2Ae蛋白，且Cry1A蛋白是Cry1Ac、Cry1Ab或Cry1A-105蛋白，且VIP3蛋白是VIP3Aa蛋白。

本文还提供：种植有含有杀昆虫蛋白的植物的种植区(field)，其中所述蛋白保护所述植物免受棉铃实夜蛾或谷实夜蛾昆虫的损害，其中所述种植区具有小于20％的结构避难所、或小于5％的结构避难所、或在所述种植区中没有结构避难所，且其中所述植物表达a)对所述昆虫物种具有杀昆虫性的Cry2Ae蛋白和b)对所述昆虫物种具有杀昆虫性的Cry1A、Cry1F或VIP3A蛋白的组合。所述植物优选为玉米或棉花植物。

本发明还包括上述方法或植物，其中除Cry或VIP3蛋白之外，Bt毒素增强蛋白也在所述植物中表达，其中所述Bt毒素增强蛋白是蛋白质或其片段，即，昆虫中Bt毒素受体的一部分，优选包含或对应于结合结构域的部分，例如钙粘着蛋白样蛋白的片段。这些Bt毒素增强蛋白与一种或多种Bt杀昆虫毒素例如Cry蛋白一起被饲喂给目标昆虫。这些Bt毒素增强蛋白可以增强Bt杀昆虫蛋白对该受体的来源昆虫物种以及对其它昆虫物种的毒素活性。在一个实施方案中，所述Bt毒素增强蛋白是谷实夜蛾或棉铃实夜蛾昆虫的中肠细胞Bt毒素受体的一部分。

发明详述

由于包含导入的杀昆虫蛋白例如Bt Cry或VIP3蛋白的植物的成功和此类植物数目的增加，现在抗性管理比过去甚至更为重要。

尽管源自Bt或其它细菌的不同杀昆虫蛋白例如Cry或VIP蛋白的杀虫谱可能不同，但是其发挥毒性作用的主要途径是共同的。所有用于转基因植物的Bt源杀昆虫蛋白(已经在至少一种目标昆虫中研究过其作用机理)(例如Cry1和VIP3毒素)，在昆虫肠中被蛋白水解激活，并与敏感物种的中肠上皮相互作用，引起上皮细胞的裂解。在Cry蛋白和VIP蛋白的毒性作用途径中，毒素与这些细胞的刷状缘膜上的受体位点的特异性结合是关键性质(Hofmann等人，1988；Lee等人，2003)。结合位点通常被称为受体，因为这种结合是可饱和的且具有高亲和力。

当两种不同的杀昆虫蛋白在昆虫中共享受体结合位点时，它们不能够提供用于昆虫抗性管理目的的良好组合。实际上，对杀昆虫蛋白例如Bt Cry蛋白产生抗性的最有可能的机制——以及迄今在田间出现的抗Bt喷雾剂的昆虫抗性中发现的唯一主要机制——是受体结合的修饰。氨基酸序列高度类似的蛋白通常共享受体位点(例如Cry1Ab和Cry1Ac蛋白)。但是，甚至具有十分不同的氨基酸序列的两个不同蛋白也可能在昆虫物种中以高亲和力结合共同的结合位点(例如，Cry1Ab和Cry1F蛋白在菜蛾(Plutella xylostella)中)。而且，已发现在一个昆虫物种中不具有共享的结合位点的两种蛋白可以在另一个昆虫物种中享有共同的结合位点(例如，Fiuza等人(1996)发现Cry1Ac和Cry1Ba蛋白在二化螟(Chilo suppressalis)中共享结合位点，而Ballester等人(1999)发现它们在菜蛾中结合不同的结合位点)。

本发明涉及在谷实夜蛾或棉铃实夜蛾中对Cry1F、VIP3或Cry1A受体不显示竞争的Cry2A蛋白，这使得最为有意义的是在相同植物中组合至少Cry2Ae、Cry2Aa或Cry2Ab蛋白和VIP3、Cry1F或Cry1A蛋白(优选至少Cry2Ae蛋白和Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1A.105或VIP3A蛋白)，以防止或延缓谷实夜蛾或棉铃实夜蛾的昆虫抗性发展。此方法有利地应该是用于昆虫抗性管理的全局策略的一个部分，所述策略，如有需要或必要，包括结构避难所和以针对目标昆虫的高剂量表达蛋白质。

本文所提及的结合位点仅指对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的蛋白(例如Cry2Ae、Cry2Ab、VIP3A、Cry1Ac或Cry1Ab蛋白)的特异性结合位点。这些是特异性结合蛋白质的结合位点，即，对于这些结合位点而言，标记配体(例如Cry2Ae或VIP3A蛋白)与其结合位点的结合可以被过量的未标记的同源配体(分别为Cry2Ae或VIP3A蛋白)置换(或竞争)。术语结合位点或受体在本文可互换使用，且是等同的。在一个实施方案中，如在直接可饱和性试验中测量的，与此类特异性结合位点的结合是可饱和的。本文使用的“直接可饱和性试验”是指这样的试验，其中用渐增量的标记配体孵育固定量的受体(在本案中为BBMV)。在可饱和结合的情况下，当将结合数据作图时(Y轴为结合％，X轴为标记配体的浓度)，平台(plateau)——或至少自线性的偏离——将是明显的，而在不可饱和结合的情况下，将明显无平台——或自线性的偏离，而是随着标记配体浓度增加，结合％保持线性地增加。平台是在实验条件下可以获得的最大结合，因为所有可用的特异性结合位点均已被标记配体占据。

当为了延缓或减少目标昆虫物种的昆虫抗性发展而在植物中组合不同杀昆虫蛋白时，重要的是在目标昆虫物种中实验性(即通过实施结合试验)检查所提议组合的不同杀昆虫蛋白是否在目标昆虫的中肠中共享结合位点。在本发明中，当两种不同的杀昆虫蛋白之间对单个结合位点存在竞争时(意味着，当对来自竞争结合实验的结合数据作图时，两种蛋白在竞争曲线的底部达到相同平台)，从昆虫抗性管理角度来看，这些蛋白质在植物中不是有用的组合。如本文使用，当两种不同的杀昆虫蛋白结合两个不同的结合位点时，从昆虫抗性管理角度来看，这些蛋白质是有用的。如本文使用，对于与不同结合位点结合的蛋白，一种蛋白对另一种蛋白的结合位点的竞争不被认为是生物学显著的(或者，换句话说，被认为是生物学非显著的竞争)，如果该竞争仅在该异源性竞争剂的非常高浓度下发生时(例如，如果，通过对结合数据作图(结合％对未标记配体浓度)来测定，100nM(或更多)未标记的该异源性竞争剂仅置换很少量结合的标记配体(例如约25％或更少的标记配体的特异性结合))。如果蛋白X仅以低亲和力(例如，如果，通过对结合数据作图(结合％对未标记配体浓度)来测定，100nM(或更多)未标记的该异源性竞争剂仅置换很少量结合的标记配体(例如约25％或更少的标记配体的特异性结合))结合标记蛋白Y的结合位点，但是在使用标记蛋白X的对等(reciprocal)结合试验中不存在任何不同结合位点的证据，则两种蛋白有效地结合相同的结合位点，因此不适于组合用于抗性管理目的。

在本发明中，因为变性蛋白的(结合)特征可不同于非变性蛋白，故使用变性BBMV蛋白通过配体印迹测量Cry或VIP3蛋白的结合，不被认为是对存在于中肠中或BBMV制备物中的实际特异性结合位点的可靠量度(其可以在使用放射性标记的或生物素化的蛋白质的BBMV结合试验中测量，因此在此测定试验中结合是针对非变性BBMV蛋白的)。

用于测试一对不同杀昆虫蛋白对昆虫幼虫中的结合位点的共享的方法和技术，在本领域是众所周知的(参见例如，Van Rie等人，1989，Ferré等人，1991)。首先，确定对目标昆虫(此处为谷实夜蛾或棉铃实夜蛾)均具有杀虫活性的一对杀昆虫蛋白。由谷实夜蛾或棉铃实夜蛾中肠，使用已知方法(参见例如，Wolfersberger等人1987)，制备刷状缘膜小泡(BBMV)，并分析经纯化的标记蛋白(例如Cry2Ae、Cry2Ab、VIP3或Cry1蛋白)与此BBMV的特异性结合。进行同源竞争测定试验以确定是否结合是特异性的(在此，过量的未标记的相同蛋白用作标记配体的竞争剂)，并进行异源竞争测定试验以确定在这些BBMV中另一种蛋白质是否竞争相同结合位点(在此，过量的未标记的不同蛋白用作标记配体的竞争剂)。

在此类异源竞争测定试验中，当使用标记蛋白X和未标记蛋白Y作为竞争剂而未发现竞争时，还使用标记蛋白Y和未标记蛋白X作为竞争剂进行对等实验，以确认不存在竞争。在同源竞争测定试验中，如果标记蛋白的显著一部分的结合被未标记蛋白(即同源竞争剂)竞争(或置换)，那么该结合是特异性的——未被同源配体置换或竞争的结合部分被认为是非特异性结合。可通过众所周知的生物素标记、荧光标记技术、或通过放射性标记例如通过使用Na¹²⁵I(使用已知方法，例如氯胺-T方法)，对用于本发明的蛋白(例如Cry2Ae、Cry2Ab、VIP3或Cry1蛋白)进行标记。

依照本发明，“核酸序列”是指单链或双链形式的DNA或RNA分子、优选编码任何用于本发明的蛋白质的DNA或RNA、特别是DNA。本文使用的“分离的核酸序列”是指不再存在于其所分离自的天然环境中的核酸序列，例如在其它细菌宿主或植物细胞核基因组中的核酸序列。

如本文使用，“异源”蛋白，例如当提及在植物中使用异源杀昆虫蛋白时，是指天然不存在于该生物体(例如植物)中的蛋白质，特别是由导入植物基因组中的转基因编码的蛋白质，其中此蛋白质源自细菌蛋白。

依照本发明，术语“蛋白质”或“多肽”可互换地用于指，由氨基酸链组成的分子，而不涉及任何具体的作用模式、大小、三维结构或来源。因此，用于本发明的蛋白质的片段或部分在本文仍称为“蛋白质”。本文使用的“分离的蛋白质”是指，不再存在于其天然环境中的蛋白质。蛋白质的天然环境是指当编码其的核苷酸序列在其天然环境中(即在核苷酸序列分离自的环境中)表达和翻译时可以发现该蛋白质的环境。例如，分离的蛋白质可存在于体外、或其它细菌宿主中或植物细胞中，或其可以自其它细菌宿主或自植物细胞分泌。

本文使用的“杀昆虫蛋白”应被理解为指，具有杀昆虫活性、特别是对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾幼虫具有杀昆虫活性的、完整蛋白质或其部分。这可以是天然存在的蛋白质或包含不同杀昆虫蛋白的部分的嵌合蛋白或杂合蛋白(例如，通过利用基因改组，混合来自不同蛋白的结构域，或混合不同蛋白的部分)，或可以是基本上具有细菌蛋白的氨基酸序列但某些氨基酸被修饰的变体。在这点上，杀昆虫蛋白可以是源自Bt或其它细菌菌株的VIP或Cry蛋白，或由突变基因或重组基因(可通过基因改组、诱变等由编码Bt杀昆虫蛋白例如Cry或VIP蛋白的基因获得)编码的蛋白质。

本文使用的“原毒素”应理解为指，在中肠中发生任何断裂之前编码杀昆虫蛋白的全长基因的最初翻译产物。通常，VIP3原毒素具有约88kD的分子量，Cry1F或Cry1A原毒素具有约130-140kD的分子量，而Cry2A原毒素具有约60-70kD的分子量。

本文使用的“毒素”或“最小毒性片段”应理解为杀昆虫蛋白例如Cry2A、VIP3或Cry1F或Cry1A蛋白的部分，其可以通过胰蛋白酶消化或通过在(目标昆虫，例如谷实夜蛾或棉铃实夜蛾)中肠液中蛋白水解而获得、且仍具有杀昆虫活性。通常，在SDS-PAGE凝胶上，VIP3或Cry1毒素具有约60-65kD的分子量，Cry2A毒素具有约50-58kD的分子量。

本文使用的“VIP3蛋白”或“VIP3”是指对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾幼虫具有杀昆虫性的蛋白质，其是在Crickmore等人(2008，见表3)中在VIP命名网站www.lifesci.susx.ac.uk/home/Neil Crickmore/Bt/VIP.html上列出的任何一种VIP3蛋白，或包含这些蛋白质之任一的最小毒性片段的任何蛋白质。在一个实施方案中，这是对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的VIP3A蛋白，例如VIP3Aa1(NCBI登录号AAC37036)、VIP3Af1(NCBI登录号CAI43275)、VIP3Aa19(NCBI登录号ABG20428)或VIP3Aa20蛋白(NCBI登录号ABG20429)，以及其任何杀昆虫片段；或在氨基酸序列水平上与NCBI登录号AAC37036的VIP3Aa1蛋白、或NCBI登录号CAI43275(ISP3A，WO 03/080656的SEQ ID No.4)的VIP3Af1蛋白、特别是与它们的最小毒性片段，具有至少70％、特别是至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性(如利用GCG Wisconsin软件包的GAP程序(Madison，Wisconsin，USA，10.2版)、使用成对比对来测定)的蛋白质。GAP程序使用下面参数用于氨基酸序列比较：‘blosum62’评分矩阵，8的‘空位生成罚分’(或‘空位权重’)和2的‘空位延伸罚分’(或‘长度权重’)。在一个实施方案中，本文使用的VIP3蛋白是VIP3A蛋白例如Estruch等人(1996，NCBI登录号AAC37036)所述的VIP3Aa1蛋白，和选自下组的对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的VIP3A蛋白：VIP3Ab、VIP3Ac、VIP3Ad、VIP3Ae、VIP3Af、VIP3Ag或VIP3Ah、特别是VIP3Af1、VIP3Ad1或VIP3Ae1蛋白(分别为NCBI登录号CAI43275(ISP3a，WO 03/080656的SEQ ID No.4)、CAI43276(ISP3b，WO 03/080656中的SEQ ID No.6)和CAI43277(ISP3C，WO 03/080656的SEQ ID No.2))及其杀昆虫片段。当然，除天然存在的VIP3蛋白和包含其杀昆虫片段的蛋白之外，本文还包括由对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾保留杀昆虫活性的VIP3蛋白制成的杂合蛋白或嵌合蛋白，例如Fang等人(2007)所述的嵌合VIP3AcAa蛋白，和某些氨基酸不同但保留亲本分子的大多数或全部谷实夜蛾或棉铃实夜蛾毒性的VIP3蛋白突变体或等效物；例如，具有一些、优选5-10个、特别是小于5个的添加、置换或缺失的氨基酸(优选在对应于最小毒性片段的部分中)且蛋白质的谷实夜蛾或棉铃实夜蛾杀昆虫活性没有明显改变的VIP3蛋白变体，例如导入棉花植物(例如WO2004/039986或USDAAPHIS非管制状态申请03-155-01p中所述的包含事件COT102的植物)中的VIP3Aa19蛋白(NCBI登录号ABG20428，EPA实验应用许可手册006499(2007))、或导入玉米植物(例如事件MIR162，USDAAPHIS非管制状态申请07-253-01p)中的VIP3Aa20蛋白(NCBI登录号ABG20429，WO 2007/142840中的SEQ ID NO：2)、或在棉花事件COT202或COT203(分别为WO 2005/054479和WO 2005/054480)中产生的VIP3A蛋白、或包含这些VIP3蛋白之任一的最小毒性片段的蛋白质、或具有1-5个氨基酸不同且对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾保留毒性的这些VIP3蛋白之任一的变体。

此外，在本发明的一个实施方案中，在本发明的VIP3蛋白中，任何推定的天然(细菌)分泌信号肽都可以缺失或可以被Met氨基酸或Met-Ala二肽或被合适的信号肽例如叶绿体转运肽置换。可以使用基于计算机的分析、利用程序例如信号肽搜索程序(SignalP V1.1或2.0)、使用用于原核生物革兰氏阳性菌的矩阵和小于0.5的阈值分数、尤其是0.25或更小的阈值分数，检测推定的信号肽(Von Heijne，Gunnar，1986和Nielsen等人，1996)。

本文使用的“Cry1F蛋白”或“Cry1F”包括包含对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾保留毒性的Cry1F蛋白的氨基酸序列的最小毒性片段的任何蛋白质，例如NCBI登录号AAA22347的蛋白质(US 2005049410的SEQ ID No.10)、或Cry1Fa蛋白。这也包括包含Cry1F蛋白的最小毒性片段、或至少一个结构域、优选3个结构域中的至少2个、的杂合蛋白或嵌合蛋白，例如源自WO 1999/024581中的Cry1F的杂合蛋白。此定义还包括NCBI登录号AAA22347的氨基酸序列的变体，例如与NCBI登录号AAA22347(US2005049410的SEQ ID No.10)的Cry1F蛋白具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，其中利用GCG Wisconsin软件包的GAP程序(Madison，Wisconsin，USA，10.2版)、使用成对比对来测量序列同一性，特别是此同一性针对对应于最小毒性片段的部分。GAP程序使用下面参数用于氨基酸序列比较：‘blosum62’评分矩阵，8的‘空位生成罚分’(或‘空位权重’)和2的‘空位延伸罚分’(或‘长度权重’)。优选地，此定义包括具有一些、优选5-10个、特别是小于5个添加、置换或缺失的氨基酸而不明显降低该蛋白质的谷实夜蛾或棉铃实夜蛾杀昆虫活性的蛋白质，例如为了克隆目的具有一个或多个保守性氨基酸置换的Cry1F蛋白。本文使用的Cry1F蛋白包括由Cry1F棉花事件281-24-236(WO2005/103266，参见USDA APHIS非管制状态申请03-036-01p)中、或玉米事件TC1507或TC-2675(US 7,288,643、WO 2004/099447、USDA APHIS非管制状态申请00-136-01p和03-181-01p)中的Cry1F基因编码的蛋白质，特别是包含这些Cry1F蛋白之任一的最小毒性片段的蛋白质、或具有1-5个氨基酸不同且对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾保留毒性的这些Cry1F蛋白之任一的变体。

本文使用的“Cry2Ae”蛋白是指杀昆虫Cry2Ae蛋白，例如WO2002/057664的SEQ ID No.2的全长Cry2Ae蛋白、Cry2Ae毒性片段或包含Cry2Ae毒性片段的蛋白质(如WO 2002/057664中所述)，例如Cry2Ae蛋白片段与叶绿体转运肽或对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的另一肽序列的融合蛋白；或是包含如下氨基酸序列的对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的蛋白质，所述氨基酸序列与WO 2002/057664的SEQ ID No.2的氨基酸序列、特别是在对应于最小毒性片段的部分中，具有至少95、97或99％序列同一性；或是由包含在棉花事件EE-GH6(见要求欧洲专利申请号07075460或07075485(未公开)的优先权的PCT专利申请)中的Cry2Ae基因编码的蛋白质、或包含这些Cry2Ae蛋白之任一的最小毒性片段的蛋白质、或具有1-5个氨基酸不同且对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾保留毒性的这些Cry2Ae蛋白之任一的变体。

本文使用的“Cry2Ab”蛋白是指Crickmore等人(1998，2008)或www.lifesci.susx.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/中对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的任何一种Cry2Ab蛋白，例如全长Cry2Ab蛋白、Cry2Ab毒性片段、或包含Cry2Ab毒性片段的蛋白质，例如Cry2Ab2蛋白片段与叶绿体转运肽或对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾保留毒性的另一肽序列的融合蛋白；或是包含如下氨基酸序列的对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的蛋白质，所述氨基酸序列与NCBI登录号CAA39075(Dankocsik等人，1990)的编码区、特别是在对应于最小毒性片段的部分中，具有至少95、97或99％序列同一性；或是由包含在棉花事件15985(见USDAAPHIS非管制状态申请00-342-01p)中的Cry2Ab2基因编码的蛋白质、由包含在玉米事件MON89034(见USDAAPHIS非管制状态申请06-298-01p)中的Cry2Ab2基因编码的蛋白质，或包含所述Cry2Ab蛋白之任一的最小毒性片段的任何蛋白、或者具有1-5个氨基酸不同且对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾保留毒性的所述Cry2Ab蛋白之任一的变体。

本文使用的“Cry1A”蛋白是指Cry1Ac、Cry1A.105或Cry1Ab蛋白，且包括包含对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾保留毒性的Cry1Ac、Cry1A.105或Cry1Ab蛋白氨基酸序列的最小毒性片段的任何蛋白质，例如NCBI登录号AAA22331的蛋白(Cry1Ac；Adang等人，1985)、NCBI登录号AAA22330的蛋白(Wabiko等人，1986(Cry1Ab)、或由玉米事件MON89034(USDAAPHIS非管制状态申请06-298-01p、WO 2007/140256、WO 2007/027777中的SEQ ID NO：2或4)中的Cry1A转基因编码的Cry1A.105蛋白、或由棉花事件COT67B(USDA APHIS不解除管制状态申请07-108-01p、WO2006/128573)中的cry1Ab编码区编码的Cry1Ab蛋白的最小毒性片段。这包括包含Cry1A蛋白例如Cry1Ab或Cry1Ac的最小毒性片段、或至少一个结构域、优选3个结构域中的至少2个、的杂合蛋白或嵌合蛋白，例如棉铃虫活性增加的嵌合或杂合Cry1A蛋白(如US 6,962,705或US 7,070,982中所述)。此定义还包括NCBI登录号AAA22331(Cry1Ac1)、NCBI登录号AAA22330(Cry1Ab、Wabiko等人，1986)中的氨基酸序列、或USDA APHIS非管制状态申请06-298-01p中所述的Cry1A.105蛋白的氨基酸序列的变体，例如在氨基酸序列水平上与所述Cry1Ac、Cry1A.105或Cry1Ab蛋白(特别是在对应于最小毒性片段的部分中)具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％氨基酸序列同一性(如利用GCG Wisconsin软件包的GAP程序(Madison，Wisconsin，USA，10.2版)、使用成对比对来测量)、具有Cry1A蛋白的最小毒性片段的蛋白质。GAP程序使用下面参数用于氨基酸序列比较：‘blosum62’评分矩阵，8的‘空位生成罚分’(或‘空位权重’)和2的‘空位延伸罚分’(或‘长度权重’)。优选地，此定义包括具有一些、优选5-10个、特别是小于5个添加、置换或缺失的氨基酸而不明显改变该蛋白质的谷实夜蛾或棉铃实夜蛾杀昆虫活性的蛋白质，例如(为了例如克隆目的)具有一个或多个保守性氨基酸置换的Cry1A蛋白。

用于本发明的Cry1A蛋白的实例包括由US 6,114,608的SEQ IDNO：3编码的Cry1Ab蛋白、特别是由玉米事件MON810(US 6,713,259，USDA APHIS不解除管制状态申请96-017-01p及其补充)中的cry1Ab编码区编码的Cry1Ab蛋白、由玉米事件Bt11(USDA APHIS不解除管制状态申请95-195-01p、US专利6,114,608)中的cry1Ab编码区编码的Cry1Ab蛋白、由棉花事件3006-210-23(US 7,179,965、WO 2005/103266、USDAAPHIS不解除管制状态申请03-036-02p)中的转基因编码的Cry1Ac蛋白、由棉花事件COT67B(USDA APHIS不解除管制状态申请07-108-01p、WO2006/128573)中的cry1Ab编码区、包含在棉花事件EE-GH5(PCT专利申请PCT/EP2008/002667(未公布)中描述)中的Cry1Ab编码区、US专利7,049,491的SEQ ID No.2的Cry1Ab编码区编码的Cry1Ab蛋白、由玉米事件MON89034(USDA APHIS非管制状态申请06-298-01p、WO2007/140256、WO 2007/027777中的SEQ ID NO：2或4)中的Cry1A转基因编码的Cry1A.105蛋白、由棉花事件15985或棉花事件531、757或1076(USDA APHIS非管制状态申请94-308-01p、WO 2002/100163的cry1A棉花事件编码的嵌合Cry1Ac蛋白)中的杂合cry1Ac编码区编码的Cry1Ac样蛋白、由棉花事件T342-142、1143-14A、1143-51B、CE44-69D或CE46-02A(分别见WO 2006/128568、WO 2006/128569、WO 2006/128570、WO 2006/128571或WO 2006/128572)中的cry1Ab编码区编码的cry1Ab蛋白(即由WO 2006/128568、WO 2006/128569、WO 2006/128571或WO2006/128572中的SEQ ID No.7的DNA或由WO 2006/128570中的SEQID No.5的DNA编码的蛋白质)。在本发明的一个实施方案中，使用来自上列的Cry1Ab或Cry1A.105蛋白或包含其最小毒性片段的蛋白质、或包含这些Cry1A蛋白之任一的最小毒性片段的蛋白质、或具有1-5个氨基酸不同且对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾保留毒性的这些Cry1A蛋白之任一的变体。

在本发明中，已发现：在棉铃实夜蛾中Cry2Ae和Cry2Aa蛋白与Cry2Ab蛋白竞争相同的结合位点，且在谷实夜蛾和棉铃实夜蛾中该结合位点不同于(即不共享)Cry1Ac的结合位点。此外，在这些昆虫物种中Cry1Ac对Cry2Ab的结合也不产生竞争。而且，早已报导在谷实夜蛾或棉铃实夜蛾中Cry1F与Cry1Ac、以及Cry1Ac与Cry1Ab共享结合位点(例如，Hernandez和Ferre，2005，Karim等人，2000b；Estela等人，2004)。因此，在谷实夜蛾或棉铃实夜蛾中Cry1Ab、Cry1F和Cry1Ac结合不同于Cry2Ae或Cry2Aa的结合位点的结合位点。另外，已报导VIP3A蛋白与Cry2Ab结合不同的结合位点(Lee等人，2006)。由于Cry2Aa和Cry2Ae与Cry2Ab共享共同的结合位点，所以在谷实夜蛾和棉铃实夜蛾中Cry2Ae或Cry2Aa蛋白与VIP3A蛋白结合不同的结合位点。尽管与所测试的Cry1A、VIP3A或Cry2A蛋白相比，通常Cry1F蛋白对这些昆虫物种具有较低的活性，但是它们属于在植物中使用最广泛的Cry1蛋白，且由于它们与Cry2A蛋白不具有共享的结合位点，所以当然地如果植物可以提供足够高水平的Cry1F蛋白表达，那么它们也可以用于昆虫抗性管理。一些Cry1F源蛋白对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有较高的内在活性，且这些是本发明中更优选的Cry1F蛋白。当在Cry1F与Cry1A蛋白之间进行选择以与Cry2A蛋白在给定植物物种中组合时，考虑到Cry1A蛋白例如Cry1Ab或Cry1A.105蛋白对于谷实夜蛾和棉铃实夜蛾昆虫物种具有更高的内在毒性，对于延缓或防止谷实夜蛾或棉铃实夜蛾的抗性发展而言，Cry1A蛋白将是更好的选择。

Bt Cry蛋白例如Cry1F、Cry2A和Cry1A蛋白在其天然宿主细胞(苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis))中以原毒素形式表达，它们在昆虫肠中通过蛋白水解而转化成毒素形式。本文使用的Cry1F、Cry2A或Cry1A蛋白是指全长原毒素或毒素，或任何具有杀昆虫活性的中间体形式。在一个实施方案中，Cry1F蛋白包括包含NCBI登录号AAA22347的氨基酸位置29至氨基酸位置604的氨基酸序列的蛋白质，Cry1A蛋白包括包含NCBI登录号AAA22331(Cry1Ac1；Adang等人，1985)的氨基酸位置29至607的氨基酸序列、包含NCBI登录号AAA22330(Cry1Ab、Wabiko等人，1986)的氨基酸位置29至氨基酸位置607的氨基酸序列、或包含USDAAPHIS非管制状态申请06-298-01p中图IV-1的氨基酸位置29至氨基酸位置607的氨基酸序列的蛋白质。本文使用的Cry2A蛋白包括包含US专利7,265,269的SEQ ID No.2的氨基酸位置50至625的氨基酸序列的蛋白质、包含USDAAPHIS非管制状态申请06-298-01p中图IV-2的氨基酸位置81至746的氨基酸序列的蛋白质、或包含NCBI登录号CAA39075的氨基酸位置50至氨基酸位置626的氨基酸序列的蛋白质。

本文使用的“Cry1”蛋白是指如上所定义的Cry1F或Cry1A蛋白。本文使用的“Cry2A”蛋白不仅指如上所定义的Cry2Ae或Cry2Ab蛋白，而且也可以指Crickmore等人(2008)中的任何对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry2A蛋白，例如Cry2Aa蛋白。本文使用的VIP3或cry1“基因”或“DNA”是指编码本发明VIP3或Cry1蛋白的DNA。基因可以全部或部分是天然存在的、人工的(修饰的)或合成的。

本文使用的术语“事件”(event)是指：在植物基因组中的特定位置特异性整合一个或多个转基因，其可被认为是包含所插入的序列和侧翼植物序列的DNA的部分。事件可通过杂交而进入相同物种的很多其它植物中或不同物种的植物中，从而允许通过育种技术(包括技术例如胚胎拯救)与包含事件的植物杂交。

本文使用的“包含”应被解释为指存在提及的所述特征、整数、步骤或组分，但不排除一个或多个其它特征、整数、步骤或组分或其组的存在或添加。因此，本文使用的术语“包含序列或区域X的DNA/蛋白质”是指该DNA或蛋白质至少包括或含有序列或区域X，由此在5’(或N末端)和/或3’(或C末端)末端可以包括其它核苷酸或氨基酸序列，例如转运肽(的核苷酸序列)、和/或5′或3′前导序列。

本文使用的编码VIP3或Cry蛋白的“嵌合基因“是指这样的编码VIP3或Cry的DNA(或编码区)，其5′和/或3′调控序列，至少5’调控序列或启动子，不同于在该VIP3或Cry蛋白的天然宿主细胞中驱动该VIP3或Cry蛋白表达的天然细菌5′和/或3′调控序列，例如与可植物表达的启动子可操作连接的VIP3或cry DNA，由此所述嵌合基因可在含有其的植物中表达。嵌合基因无需在所有时间或在植物的每个细胞中都表达，例如，使用创伤诱导型启动子，表达可以被昆虫的啃食或伤害所诱导，或者表达可局限于主要被昆虫例如谷实夜蛾或棉铃实夜蛾幼虫攻击的那些植物部分，特别是那些对种植者或农民最具价值的部分，例如玉米植物的叶和穗，或棉花植物的叶和棉铃、或大豆植物的叶和豆荚。因此，表达本文使用的VIP3、Cry2A、Cry1F或Cry1A蛋白的植物是指，包含必要的编码此类蛋白的可植物表达嵌合基因的植物，由此该蛋白在相关组织中或在相关的时间期限表达，其无需在所有植物组织中表达或无需在所有时间表达。

为本发明的目的，表述为百分比的两个相关核苷酸或氨基酸序列的“序列同一性”是指，在最佳比对的这两个序列内具有相同残基的位置的数目除以所比较的位置数(×100)。将空位(即，在比对中，在该位置处，在一个序列中存在残基而在另一个序列中不存在残基)视作具有不同残基的位置。为计算根据本发明的两个序列之间的序列同一性，可以利用使用Needleman和Wunsch算法(1970)且由the Wisconsin Package，10.2版，GeneticsComputer Group(GCG)，575Science Drive，Madison，Wisconsin 53711，USA提供的GAP程序。所用的GAP参数为空位生成罚分＝50(核苷酸)/8(氨基酸)、空位延伸罚分＝3(核苷酸)/2(氨基酸)和评分矩阵“nwsgapdna”(核苷酸)或“blosum62”(氨基酸)。

GAP使用Needleman和Wunsch全局比对算法在序列全长上进行两个序列的比对，使匹配数目最大并使空位数目最小。默认参数为空位生成罚分＝50(核苷酸)/8(蛋白)和空位延伸罚分＝3(核苷酸)/2(蛋白)。对于核苷酸，使用的默认评分矩阵是“nwsgapdna”，对于蛋白质，默认评分矩阵为“blosum62”(Henikoff & Henikoff，1992)。

在本文中VIP3或Cry DNA包括：那些编码VIP3或Cry蛋白的DNA、或其变体或杂合体，其中所述变体或杂合体对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性且在严格杂交条件下与可编码VIP3或Cry蛋白的DNA杂交。本文使用的“严格杂交条件”特别是指以下条件：在滤膜上固定相关DNA，并且在42℃、在50％甲酰胺、5％SSPE、2x Denhardt试剂和0.1％SDS中预杂交滤膜1至2小时，或者在68℃、在6x SSC、2x Denhardt试剂和0.1％SDS中预杂交滤膜1至2小时。然后将变性(地高辛配基-或放射-)标记探针直接加入预杂交液中，在上述的适当温度孵育16至24小时。孵育后，在室温、在2x SSC、0.1％SDS中洗涤滤膜30分钟，接着在68℃、0.5x SSC和0.1％SDS中进行各30分钟的2次洗涤。通过在-70℃用增感屏使滤膜曝光于X射线胶片(Kodak XAR-2或等效物)24至48小时，完成放射自显影成像。[20x SSC＝3M NaCl和0.3M柠檬酸钠；100x Denhart试剂＝2％(w/v)牛血清白蛋白，2％(w/v)FicollTM和2％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮；SDS＝十二烷基硫酸钠；20x SSPE＝3.6M NaCl、0.2M磷酸钠和0.02MEDTA pH7.7]。当然，在该方法中可以使用等同的条件和参数，同时仍保留期望的严格杂交条件。

本文使用的蛋白质的“杀昆虫活性”指，当喂食昆虫此蛋白质时——优选通过在重组宿主例如植物中表达此蛋白质来实现——该蛋白质能够杀死昆虫的能力。应理解，如果蛋白质在昆虫的至少一个发育阶段、优选地幼虫阶段具有杀死昆虫的能力，那么该蛋白质具有杀昆虫活性。

如本文使用的，昆虫物种群体对表达杀昆虫蛋白的植物(该植物以前控制或杀死所述昆虫群体)“已经产生抗性”或“已成为抗性的”是指，与首次引入该植物时由相同昆虫物种造成的该植物的产量损失水平相比，在该植物中检测到由该昆虫群体造成的重复的且显著不可接受的产量损失。必须对此进行验证，以检查植物实际上正在产生杀昆虫蛋白(即它们不是非转基因植物)，和此昆虫群体的成员实际上需要更高量的杀昆虫蛋白来控制或杀死。换句话说，昆虫群体已对其产生抗性的植物不再产生昆虫控制量(如本文所定义)或者不再对该昆虫物种群体具有杀昆虫性。因此，本文中，“昆虫抗性发展”导致检测到增加的植物损害。在一个实施方案中，如果来自昆虫物种群体的昆虫可在植物上完成它们的生命周期并继续损害植物，而不是因为此植物中产生的杀昆虫蛋白而造成它们的生长和进食习性被抑制(在昆虫抗性的一个极端形式中，在昆虫攻击下，该植物可受到像具有相同遗传背景的常规非转基因植物一样的损害)，则该昆虫物种群体的昆虫抗性是容易被观察到的。在一个实施方案中，可以在(标准)竞争结合试验中使用谷实夜蛾或棉铃实夜蛾BBMV分析Cry或VIP3蛋白与抗性昆虫的结合，以确认该抗性归因于结合位点修饰。

本文还包括上述方法、用途、植物或植物细胞，其中除了Cry或VIP3蛋白之外，Bt毒素增强蛋白也在所述植物中表达，其中所述Bt毒素增强蛋白是蛋白质或其片段，即，昆虫中Bt毒素受体的一部分，优选包含或对应于结合结构域的部分，例如钙粘着蛋白样蛋白的片段。此类蛋白质记载于公开的US专利申请20090018075中。可以将这些Bt毒素增强蛋白与一种或多种Bt杀昆虫毒素例如Cry蛋白一起饲喂给目标昆虫。这些Bt毒素增强蛋白可增强Bt杀昆虫蛋白抵抗该受体的来源昆虫物种以及抵抗其它昆虫物种的毒素活性。在一个实施方案中，所述Bt毒素增强蛋白是谷实夜蛾或棉铃实夜蛾昆虫的中肠细胞Bt毒素受体的一部分。

本文使用的“谷实夜蛾”(H.zea)是指谷实夜蛾(Helicoverpa zea，Boddie)，一种重要的鳞翅目害虫，也称为(美洲)棉铃虫、玉米穗虫(corn earworm)或番茄果虫(tomato fruitworm)、高粱穗虫(sorghum headworm)或巢菜虫(vetchworm)。此昆虫是玉米、棉花和番茄中重要的害虫，而且攻击例如下述的植物：朝鲜蓟(artichoke)、芦笋、卷心菜、网纹甜瓜(cantaloupe)、羽衣甘蓝、豇豆、黄瓜、茄子、莴苣、利马豆(lima bean)、甜瓜、秋葵、豌豆、胡椒、马铃薯、南瓜、食荚菜豆(snap bean)、菠菜、西葫芦(squash)、甘薯(sweet potato)、西瓜、紫花苜蓿、苜蓿(clover)、亚麻、燕麦、粟(millet)、稻、高粱、大豆、甘蔗、向日葵、烟草、巢菜(vetch)和小麦。

本文使用的“棉铃实夜蛾”(H.armigera)是指棉铃实夜蛾(Helicoberpa armigera，Hiibner)，一种重要的鳞翅目害虫，其也称为(非洲)棉铃虫、番茄蛴螬(tomato grubworm)、番茄蚜虫(tobacco budworm)、玉米穗虫(corn earworm)、旧世界棉铃虫或scarce bordered straw，其是具有强迁移性的最为多寄主性的害虫之一。此昆虫是玉米和棉花中重要的害虫，但是它还攻击植物，例如烟草、向日葵、亚麻子、大豆、苜蓿(Lucerne)、豌豆例如木豆或鹰嘴豆、红辣椒(chili)、秋葵、康乃馨、天竺葵和其它观赏植物或花卉作物、水果、蔬菜例如卷心菜、茄子(aubergine)、辣椒、番茄和黄瓜。

本文中以一般意义使用的“棉铃虫”(cotton bollworm/bollworm)是指谷实夜蛾和/或棉铃实夜蛾。

本文使用的蛋白质的“昆虫控制量”是指足以将以植物为食的昆虫(例如昆虫幼虫)在该植物上造成的损害限制到商业可接受水平的蛋白量，例如通过杀死昆虫或通过抑制昆虫发育、繁殖力或生长，使昆虫对植物的损害变小并且使植物产量不受到显著不利影响。

在本发明的一个实施方案中，本发明的VIP3和/或Cry蛋白以高剂量在用于本发明的植物中表达。当提及用于本发明的植物时，本文使用的表述“高剂量”是指，杀昆虫蛋白在植物中的浓度(通过ELISA测定为总可溶性蛋白质的百分比，其中在标准提取缓冲液中提取可溶性蛋白质后，使用Bradford分析(Bio-Rad，Richmond，CA；Bradford，1976)测定该总可溶性蛋白质)，所述浓度可以杀死至少95％的出于目标昆虫的如下发育阶段中的昆虫，在该发育阶段的昆虫对杀昆虫蛋白的敏感性与该昆虫的1龄幼虫期(first larval stage)相比显著更低，优选低至少25倍(可在标准杀昆虫蛋白生物测定试验中分析)，并因此预期该浓度可以确保对目标昆虫物种的完全控制。

本文使用的“结构避难所(structured refuge)”是指，种植者或农民的种植Bt植物的种植区或田地中的一部分，该部分未种植Bt植物，而是种植了不含Bt转基因的植物(相对地，围绕农民的种植区的杂草或其它非Bt植物用作天然避难所)。

用于评价和开发至少两种杀昆虫基因用于在目标昆虫中防止针对表达这些基因的转基因植物的抗性发展的一般程序，可见于公开的欧洲专利申请EP408403。用于受体结合分析领域的定义可以见于www.unmc.edu/ Pharmacology/receptortutorial/definitions/definitions.htm。

依照本发明，已研究了Cry蛋白与谷实夜蛾或棉铃实夜蛾昆虫幼虫的中肠细胞刷状缘膜的结合。刷状缘膜是VIP3或Cry蛋白的主要靶点，并且膜小泡，优选源自昆虫中肠刷状缘膜(对于刷状缘膜小泡，本文称为BBMV)，可以根据本领域已知的方法例如Wolfersberger等人(1987)获得。

本发明涉及在转基因植物中组合表达至少两种杀昆虫蛋白基因以延缓或防止目标昆虫谷实夜蛾或棉铃实夜蛾群体中的抗性发展。所述基因插入到植物细胞基因组中，优选插入到其细胞核基因组中，使得所插入的基因位于启动子的下游并且与启动子可操作地连接，其中所述启动子可指导基因在植物细胞中表达。

在本发明的一个实施方案中，提供了对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有持久抗性的植物，所述植物包含编码对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry2A蛋白例如Cry2Ab或Cry2Ae蛋白的嵌合基因、和编码对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry1A、VIP3和/或Cry1F蛋白、优选如上定义的Cry1Ab、VIP3A或Cry1A.105蛋白的嵌合基因。

本文还提供了：在转基因植物中控制谷实夜蛾或棉铃实夜蛾侵扰同时获得谷实夜蛾或棉铃实夜蛾昆虫对所述植物的抗性发展的较慢积累的方法，其包括在所述植物中表达a)对所述昆虫物种有杀昆虫性的Cry2Ae蛋白和b)对所述昆虫物种具有杀昆虫性的Cry1A、Cry1F或VIP3A蛋白的组合；和用于防止或延缓昆虫物种谷实夜蛾或棉铃实夜蛾群体中针对表达杀昆虫蛋白的转基因植物的昆虫抗性发展以控制所述昆虫害的方法，其包括在所述植物中表达对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry2Ae蛋白与对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry1A、Cry1F或VIP3A蛋白的组合。

在本发明的一个实施方案中，提供了在谷实夜蛾或棉铃实夜蛾昆虫群体已对表达VIP3A、Cry1F和/或Cry1A蛋白的植物产生抗性的地区中控制所述昆虫物种的方法，其包括在所述地区中播种或种植至少表达对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry2Ae蛋白的植物的步骤。本文还提供，在谷实夜蛾或棉铃实夜蛾群体已对表达Cry2Ae蛋白的植物产生抗性的地区中控制所述昆虫的方法，其包括在所述地区中播种或种植表达对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry1F、VIP3或Cry1A蛋白的植物的步骤。

依照本发明还提供，用于获得包含编码至少两种不同的杀昆虫蛋白的嵌合基因的植物的方法，其中如在使用物种谷实夜蛾或棉铃实夜蛾昆虫幼虫的刷状缘膜小泡的竞争结合试验中测定的，所述蛋白质在所述昆虫幼虫中不具有共享的结合位点，所述方法包括以下步骤：获得包含编码对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry2Ae蛋白的可植物表达嵌合基因和编码对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry1A、VIP3或Cry1F蛋白的可植物表达嵌合基因的植物。

此处还提供：播种、种植或生长植物的方法，所述植物被保护而免受棉铃虫损害，其包含表达至少两种不同的杀昆虫蛋白的嵌合基因，其中如在使用谷实夜蛾或棉铃实夜蛾幼虫刷状缘膜小泡的竞争结合实验中测定的，所述蛋白在所述昆虫物种的幼虫中不具有共享的结合位点，所述方法包括以下步骤：播种、种植或生长包含编码对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry2Ae蛋白的嵌合基因和编码对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry1A、VIP3或Cry1F蛋白、优选对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的VIP3或Cry1A蛋白的嵌合基因的植物。

本文还提供：至少两种不同的杀昆虫蛋白在转基因植物中用于防止或延缓谷实夜蛾或棉铃实夜蛾群体中的昆虫抗性发展的用途，其中如可通过竞争结合实验测定的，所述蛋白在所述昆虫物种的昆虫中肠中不具有共享的结合位点，所述应用包括：在所述转基因植物中表达对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry2Ae蛋白和对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry1F、VIP3或Cry1A蛋白；和编码对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry2Ae蛋白的嵌合基因和编码对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry1F、VIP3或Cry1A蛋白的嵌合基因、特别是编码对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry2Ae蛋白的嵌合基因和编码对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的VIP3或Cry1A蛋白的嵌合基因的用途，用于防止或延缓昆虫物种谷实夜蛾或棉铃实夜蛾群体中对表达杀昆虫蛋白的转基因植物的昆虫抗性发展以控制所述昆虫害。

在本文的一个实施方案中提供：对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry2Ae蛋白和对所述物种昆虫具有杀昆虫性的Cry1A、VIP3或Cry1F蛋白的组合的用途，用于防止或延缓所述物种昆虫对表达异源性杀昆虫毒素的转基因植物的抗性发展，特别是当所述应用通过在植物中表达所述蛋白组合而进行时。

本文还提供：包含对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry2Ae蛋白的植物在所述昆虫物种的群体已对包含Cry1F、VIP3和/或Cry1A蛋白的植物产生抗性的地区中的应用，其中所述应用可包括在所述地区中播种、种植或生长包含对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry2Ae蛋白的植物；和包含对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry1F、VIP3和/或Cry1A蛋白的植物在所述昆虫物种的群体已对包含Cry2Ae蛋白的植物产生抗性的地区中的应用，其中所述应用可包括在所述地区中播种、种植或生长包含对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry1F、VIP3和/或Cry1A蛋白的植物。

本发明还提供这样的应用，其中播种、种植或生长具有不包含对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry2、Cry1或VIP3蛋白的植物的避难所，例如通过将此植物播种、种植或生长在包含本文所述的Cry2Ae、VIP3和Cry1蛋白的植物的相同种植区或附近。

本文还提供上述用途或方法，其中植物以针对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾的高剂量表达Cry2Ae、VIP3、Cry1F或Cry1A蛋白，其中所述高剂量如本文中所定义。

本文还提供：生长、播种或种植表达Cry蛋白或VIP3蛋白的植物以控制棉铃实夜蛾或谷实夜蛾昆虫的方法，其包括步骤：在该种植区中或在该种植区附近种植、播种或生长小于20％种植区的喷洒过杀虫剂的结构避难所、或小于5％种植区的未喷洒过杀虫剂的结构避难所，或在种植区中不种植、播种或生长避难所，其中所述结构避难所位于相同的种植区内，或者位于种植区的2英里内、1英里内或0.5英里内，且含有不包含该Cry或VIP3蛋白的植物，其中所述表达Cry蛋白或VIP3蛋白的植物表达对所述昆虫物种具有杀昆虫性的Cry2Ae蛋白和对所述昆虫物种具有杀昆虫性的Cry1A、Cry1F或VIP3A蛋白、特别是Cry2Ae和Cry1Ab或Cry1Ac或VIP3A蛋白、优选Cry2Ae和Cry1Ab和VIP3蛋白的组合。

在本发明的一个实施方案中，还提供了特异地且可饱和地结合谷实夜蛾幼虫中肠中的结合位点的至少2种杀昆虫蛋白的用途，用于延缓或防止该昆虫物种对表达杀昆虫蛋白的植物的抗性发展，其中在所述植物中所述蛋白质之一是对该昆虫物种具有杀昆虫性的Cry2A蛋白，例如Cry2Ab蛋白，而另一种蛋白质是对该昆虫物种具有杀昆虫性的Cry1A、Cry1F或VIP3蛋白，其中在可饱和性试验中确定所述的可饱和结合，所述试验使用固定浓度的结合位点(即BBMV)，并向所述结合位点加入浓度渐增的标记蛋白。特别地，在此用途中，Cry1A蛋白选自下组：Cry1Ac、Cry1Ab、Cry1A.105、或Cry1Ac或Cry1Ab杂合蛋白，例如由任何一种本文提及的cry1A编码区编码的蛋白质。在谷实夜蛾昆虫幼虫的中肠中该Cry2Ab和Cry1A蛋白不存在对它们的(可饱和且特异的)结合位点的竞争，如可在BBMV竞争结合试验中测量的。

本文还提供包含至少2个转基因的植物或种子，其中每个转基因各编码不同的对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的蛋白质，所述蛋白质可饱和地且特异性地结合此类昆虫中肠中的结合位点，其中所述蛋白在此类昆虫中不竞争相同结合位点，且其中所述蛋白质为i)Cry2A蛋白和ii)Cry1A、Cry1F或VIP3蛋白。在一个实施方案中，所述植物包含编码下述蛋白的转基因：i)Cry2Aa、Cry2Ab或Cry2Ae、和ii)Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Fa或VIP3A、特别是Cry2Ae蛋白和Cry1Ab和/或VIP3A蛋白。在另一个实施方案中，所述植物或种子是包含编码Cry1A、Cry1F或VIP3蛋白的嵌合基因和编码Cry2A蛋白、特别是Cry2Ae蛋白的嵌合基因的玉米或棉花植物或种子，其中所述植物或种子包含选自下组的转化事件：玉米事件MON89034、玉米事件MIR162、包含编码Cry2Ae蛋白的转基因的玉米事件、玉米事件TC1507、玉米事件Bt11、玉米事件MON810、棉花事件EE-GH6、棉花事件COT102、棉花事件COT202、棉花事件COT203、棉花事件T342-142、棉花事件1143-14A、棉花事件1143-51B、棉花事件CE44-69D、棉花事件CE46-02A、棉花事件COT67B、棉花事件15985、棉花事件3006-210-23、棉花事件531、棉花事件EE-GH5、棉花事件281-24-236，所有事件如本文进一步的定义。

在本发明的一个实施方案中，在本发明的用途、方法或植物中，Cry2Ae、Cry2Ab、VIP3、Cry1F或Cry1A嵌合基因是包含在上述特定玉米或棉花事件之任一中的嵌合基因。依照本发明，还包括：其中的术语Cry2Ae被术语Cry2Aa或Cry2Ab替代的本文所述的任何用途、方法、植物或种子；以及涉及Cry2Ae、Cry2Aa或Cry2Ab蛋白的任何上述用途、方法、植物或种子，其中该Cry2A蛋白与谷实夜蛾或棉铃实夜蛾的中肠BBMV的结合是特异性的且可饱和的，特别是当在直接可饱和性结合试验中确定可饱和结合时；优选这样的用途、方法、植物或种子，其中在本文所述的标准竞争结合试验中，在棉铃实夜蛾或谷实夜蛾中任何所述Cry2A蛋白和Cry1A、Cry1F或VIP3蛋白的特异性结合之间均没有生物学显著的竞争。

本文还提供：用于使表达对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的蛋白质的植物的种植或商品化获得解除管制或获得监管部门批准的方法；或用于减少含有不产生对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的任何蛋白质的植物的结构避难所的方法；或用于种植不具有结构避难所的种植区的方法，所述方法包括以下步骤：引用、提交或依赖昆虫试验结合数据，其中所述数据显示Cry2A蛋白特异性且可饱和地结合所述昆虫的昆虫中肠膜、并且所述Cry2A蛋白在所述昆虫中不竞争Cry1A、Cry1F或VIP3蛋白的结合位点，例如本文所公开的数据或在其它文件中报导的类似数据。在一个实施方案中，Cry2A蛋白是Cry2Aa、Cry2Ab或Cry2Ae蛋白，且Cry1A蛋白是Cry1Ac、Cry1Ab或Cry1A.105蛋白，且VIP3蛋白是VIP3Aa蛋白。

为了在大肠杆菌、其它Bt菌株和植物中表达编码Cry2A、VIP3或Cry1蛋白的全长DNA序列或其杀昆虫有效部分，可以在该DNA序列的侧翼导入适当的限制酶切位点。这可以使用众所周知的方法通过定点诱变来进行(Stanssens等人，1989；White等人，1989)。为了在植物中获得增强的表达，可以依照PCT公布WO 91/16432与WO 93/09218和公布EP 0 385 962、EP 0 359 472和US 5,689,052，对本发明的基因或杀昆虫有效基因部分的密码子使用进行修饰以形成等效的、修饰的或人工的基因或基因部分，或可以将该基因或基因部分插入质体、线粒体或叶绿体的基因组中，并使用合适的启动子在该处进行表达(例如，Mc Bride等人，1995；US专利5,693,507、WO 2004/053133)。

由于遗传密码子的简并性，可以将一些氨基酸密码子置换为其他氨基酸密码子而不改变蛋白质的氨基酸序列，而且，一些氨基酸可以被其它等同氨基酸置换，而不显著改变，优选不改变，蛋白质的杀昆虫活性，至少不以负向的方式改变蛋白质的杀昆虫活性。例如，只要不明显降低蛋白质的杀昆虫活性，在碱性(例如Arg、His、Lys)、酸性(例如Asp、Glu)、非极性(例如Ala、Val、Gly、Leu、Ile、Met)或极性(例如Ser、Thr、Cys、Asn、Gln)类别内的保守性氨基酸置换落入本发明的范围内。此外，只要不明显降低蛋白质的杀昆虫活性，非保守性氨基酸置换也落入本发明的范围内。本发明的DNA序列的变体或等同物包括与用于本发明的Cry2A、VIP3、Cry1F或Cry1A蛋白的天然基因相比具有不同的密码子使用，但是编码具有相同杀昆虫活性和基本上相同(优选相同)的氨基酸序列的蛋白质的DNA序列。利用可获得的密码子使用表，通过将密码子使用适应性修改为植物基因中最优选的密码子使用，特别是原产于目的植物属或物种的基因的密码子使用(Bennetzen & Hall，1982；Itakura等人，1977)，可以对DNA序列进行密码子优化(例如使其更适应于在玉米、棉花、稻、大豆、高粱、番茄、向日葵或甘蔗中表达)。用于各种植物物种的密码子使用表由例如Ikemura(1993)和Nakamura等人(2000)公开。

为了在单子叶植物例如玉米、甘蔗或稻中获得增强的表达，也可以将内含子、优选单子叶内含子加到嵌合基因中。例如，已显示插入玉米Adh1基因的内含子到5′调控区，可以增强在玉米中的表达(Callis等人，1987)。同样地，可以使用US 5,859,347中描述的HSP70内含子以增强表达。可以以翻译中性方式，通过内含子定点插入和/或通过在密码子使用中导入改变(例如将密码子使用调整至植物(优选具体的相关目标植物物种/属)的最优选密码子使用(Murray等人，1989)而不明显改变(优选不改变)所编码的氨基酸序列)，进一步改变杀昆虫蛋白基因或其杀昆虫部分的DNA序列，以修饰存在于该基因部分中的可能的抑制性DNA序列。

在本发明的一个实施方案中，使对VIP3、Cry2A、Cry1F或Cry1A蛋白敏感的棉铃虫(谷实夜蛾或棉铃实夜蛾)与昆虫控制量的、优选杀昆虫量的这些蛋白质的组合接触，例如可以通过在这些粘虫的靶植物中表达这些蛋白质或通过转化植物以使这些植物及其后代包含编码这些蛋白的嵌合基因，来实现所述接触。在一个实施方案中，这些粘虫的靶植物是玉米、棉花、稻、大豆、高粱、番茄、向日葵或甘蔗植物，特别是在北美、中美和南美州国家。本文使用的术语植物包括全株植物和植物的部分，例如叶、茎、花或种子。在一个实施方案中，在此类靶植物中组合本发明的至少3种在谷实夜蛾或棉铃实夜蛾中结合不同结合位点的不同蛋白质，所述组合通过如下方式进行：向靶植物提供编码这些蛋白的必需嵌合基因、所述蛋白为例如Cry或VIP3蛋白的任何一种下述组合：Cry2Ab、Cry1Ab和VIP3A蛋白；Cry2Ab、Cry1Ac和VIP3A蛋白；Cry2Ab、Cry1F和VIP3A蛋白；Cry2Ab、Cry1A.105和VIP3A蛋白；Cry2Ae、Cry1Ab和VIP3A蛋白；Cry2Ae、Cry1A.105和VIP3A蛋白；Cry2Ae、Cry1Ac和VIP3A蛋白；或Cry2Ae、Cry1F和VIP3A蛋白。

可以将编码Cry2A、VIP3、Cry1F或Cry1A蛋白的杀昆虫有效部分的杀昆虫有效基因、优选嵌合基因以常规方式稳定地插入到单个植物细胞的细胞核基因组中，并且可以以常规方式使用由此转化的植物细胞以产生具有昆虫抗性的转化植物。在这点上，可以使用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)中的包含杀昆虫有效基因的T-DNA载体转化植物细胞，此后可以使用例如在EP 0 116 718、EP 0 270 822、PCT公布WO 84/02913和公开的欧洲专利申请EP0 242 246和Gould等人(1991)中所述的方法，从转化的植物细胞再生转化的植物。用于农杆菌介导的植物转化的T-DNA载体的构建是本领域众所周知的。T-DNA载体可以是如EP 0 120 561和EP 0 120 515中所述的双元载体，或者如EP 0 116 718中所述的可通过同源重组整合到农杆菌Ti-质粒中的共整合载体。优选的T-DNA载体均包含位于T-DNA边界序列之间、或至少位于右边界序列的左侧的、与杀昆虫有效基因可操作连接的启动子。边界序列描述于Gielen等人(1984)中。当然，可以使用其它载体类型，利用下述方法来转化植物细胞：例如直接基因转移(例如在EP 0223247中描述)、花粉介导的转化(例如在EP 0270356和WO 85/01856中描述)、原生质体转化(例如在US 4,684,611中描述)、植物RNA病毒介导的转化(例如在EP 0 067 553和US 4,407,956中描述)、脂质体介导的转化(例如在US 4,536,475中描述)和其它方法，例如最近描述的用于转化某些玉米株系(例如，US 6,140,553；Fromm等人，1990；Gordon-Kamm等人，1990)和稻株系(Shimamoto等人，1989；Datta等人1990)的方法和一般性用于转化单子叶植物的方法(PCT出版物WO92/09696)。对于棉花转化，尤其优选PCT专利公开WO 00/71733中所述的方法。对于稻转化，参考WO 92/09696、WO 94/00977和WO 95/06722中所述的方法。

Cry2A和VIP3、Cry1F或Cry1A蛋白的组合表达在被棉铃虫靶向(或损害)的植物中是最有用的，所述植物包括玉米(饲料用玉米和甜玉米)、棉花、番茄、朝鲜蓟、芦笋、茄子(aubergiens)、卷心菜、网纹甜瓜、羽衣甘蓝、豇豆、黄瓜、茄子(eggplant)、莴苣、利马豆、甜瓜、秋葵、豌豆、胡椒、马铃薯、南瓜、食荚菜豆、菠菜、西葫芦、甘薯、西瓜、紫花苜蓿、苜蓿、亚麻、燕麦、粟、稻、高粱、大豆、甘蔗、向日葵、烟草、巢菜、小麦、烟草、亚麻子、豌豆例如木豆或鹰嘴豆、红辣椒、秋葵、以及康乃馨、天竺葵和其它观赏植物或花卉作物、或水果作物；优选玉米、棉花、稻、大豆、向日葵、番茄或甘蔗植物。因此，优选在这些植物之任何一种中，依照本发明组合使用Cry2A蛋白和VIP3、Cry1F或Cry1A蛋白以延缓或防止棉铃虫的抗性发展。本文所用的术语“玉米”是指玉蜀黍(Zeamays)。本文所用的“棉花”是指棉属物种(Gossypium spp.)、特别是陆地棉(G.hirsutum)和海岛棉(G.barbadense)。术语“稻”是指稻属物种(Oryza spp.)、特别是稻(O.sativa)。“大豆”是指大豆属物种(Glycine spp)、特别是大豆(G.max)。甘蔗在本文用于指甘蔗属(Saccharum)植物，一种高大的多年生禾本科草，原产于温带至热带区，可用于提取糖。本文使用的向日葵是指向日葵(Helianthus annuus)。

转化的植物可用于常规的植物育种方案中，以产生具有相同特征的更多转化植物或以将杀昆虫有效基因部分引入到相同或亲缘植物物种的其它品种中。获自转化植物的种子包含作为稳定基因组插入物的杀昆虫有效基因。可以以常规方式对转化植物的细胞进行培养以产生Cry2A、VIP3或Cry1毒素或蛋白质的杀昆虫有效部分，然后可将其回收以用在抗鳞翅目昆虫的常规杀昆虫组合物中。

将杀昆虫有效基因插入植物细胞基因组中，以使所插入基因位于可指导该基因部分在植物细胞中表达的启动子(可植物表达启动子)的下游(即3′)，并在该启动子的控制下。这优选通过在植物细胞基因组中、特别是在细胞核或质体(例如叶绿体)基因组中插入嵌合基因而完成。

可用于本发明的可植物表达启动子包括但不限于：花椰菜花叶病毒(CaMV)分离物CM 1841(Gardner等人，1981)、CabbB-S(Franck等人，1980)和CabbB-JI(Hull和Howell，1987)的强组成型35S启动子(“35S启动子”)；由Odell等人(1985)所述的35S启动子、来自泛素家族的启动子(例如，Christensen等人1992，EP 0 342 926的玉米泛素启动子，还参见Cornejo等人，1993)、gos2启动子(de Pater等人，1992)、emu启动子(Last等人，1990)、拟南芥属(Arabidopsis)肌动蛋白启动子例如由An等人(1996)所述的启动子、稻肌动蛋白启动子例如由Zhang等人(1991)所述的启动子和US 5,641,876中所述的启动子；木薯脉花叶病毒启动子(WO 97/48819，Verdaguer等人(1998))、来自地下三叶草矮化病毒(Subterranean Clover Stunt Virus)的pPLEX系列启动子(WO 96/06932、特别是S7启动子)、醇脱氢酶启动子例如pAdh1S(GenBank登录号号X04049、X00581)、和分别驱动T-DNA的1′和2′基因表达(Velten等人，1984)的TR1′启动子与TR2′启动子(分别为“TR1’启动子”和“TR2′启动子”)。或者，可以利用非组成型的、但对植物的一种或多种组织或器官(例如叶和/或根)具有特异性的启动子，由此所插入基因部分仅在该特定组织或器官的细胞中表达。例如，可以通过将杀昆虫有效基因部分置于光诱导型启动子的控制下，在植物(例如玉米、棉花、稻、大豆)的叶中选择性地表达杀昆虫有效基因，所述光诱导型启动子可以是例如植物本身或另一种植物，例如豌豆的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚基基因的启动子，见US 5,254,799中的公开。例如，可以选择启动子使得本发明的基因仅在靶昆虫害虫啃食的那些组织或细胞中表达，以便与不表达该基因的植物相比，敏感性靶昆虫的进食对该宿主植物引起减少的昆虫损害。另一种备选方案是使用可诱导表达的启动子，例如由Cordera等人(1994)所述的MPI启动子，其通过创伤(例如由昆虫的进食造成的创伤)来诱导，或化学品诱导型启动子，例如由Aoyama和Chua(1997)所述的地塞米松诱导型启动子，或温度诱导型启动子，例如US5,447,858中所述的热休克启动子，或可由其它外界刺激诱导的启动子。

可以将杀昆虫有效基因插入到植物基因组中，使得所插入基因位于合适的3′末端转录调节信号(即转录物形成和聚腺苷酸化信号)的上游(即5′)。这优选通过在植物细胞基因组中插入嵌合基因而完成。聚腺苷酸化和转录物形成信号的类型不是关键的，可包括CaMV 35S基因、胭脂碱合酶基因(Depicker等人，1982)、章鱼碱合酶基因(Gielen等人，1984)或T-DNA基因7(Velten和Schell，1985)的那些，其在转化植物细胞中作为3′-非翻译DNA序列起作用。

用于本发明嵌合基因的标记基因的选择也不是关键的，且可以使用任何编码如下蛋白质或多肽的常规DNA序列，所述蛋白质或多肽使表达该DNA序列的植物细胞容易地与不表达该DNA序列的植物细胞区分开(EP0344029)。该标记基因可处于其自身启动子的控制下，且具有其自身的3′非翻译DNA序列(如上公开)，条件是该标记基因处于在其鉴别的基因的基因座附近的基因座中。标记基因可以例如是：除草剂抗性基因例如sfr或sfrv基因(EPA 87400141)；编码经修饰的除草剂目标酶的基因，所述修饰的目标酶对该除草剂的亲和力比天然(非经修饰)目标酶低，例如作为草甘膦靶点的经修饰5-EPSP(美国专利号4,535,060；EP 0218571)或作为谷氨酰胺合成酶抑制剂靶点的经修饰谷氨酰胺合成酶(EP 0240972)；或抗生素抗性基因，例如neo基因(PCT公布WO 84/02913；EP 0193259)。

可以遵照不同的常规方法以获得至少两个杀昆虫蛋白基因在转基因植物中的组合表达，见EP 408403(并入本文作为参考)中的总结。这些方法包括：在不同植物中转化单基因并杂交这些植物、使已分别导入了不同所需基因的植物杂交、在已转化了一个基因的植物中再转化第二基因、使用不同质粒共转化植物、用在一个转化DNA上的至少两个基因转化以使得这些基因插在相同的基因座上、使用翻译融合基因用于转化(参见例如，Ho等人(2006))等。

所得的转基因植物可用于进一步的植物育种方案。可将所转化的植物自交以获得对所插入基因而言的纯合植物。如果该植物是近交系，那么该纯合植物可用于直接产生种子或作为亲本系用于产生杂种品种。还可使用常规植物育种方法，将该基因杂交入自由授粉群体或相同植物的其它近交系中。

由于目前已经令人信服地证实，Cry2A蛋白特异地且可饱和地结合敏感目标昆虫害虫的昆虫中肠，所以可以通过本领域已知方法分离被Cry2A蛋白特异性结合的受体分子。因此，本发明还包括用于分离Cry2A蛋白受体、特别是用作Cry2Ab受体的蛋白质的方法，以及此类经分离的受体蛋白可以具有的多种用途。此类经分离的受体分子可用于筛选试验，以发现结合不同受体的蛋白质，以发现对受体具有提高的结合的蛋白质等。此外，此类Cry2A受体的DNA序列可提供有用的筛选工具，用于筛选此类DNA中的变化(可以指示导致抗性发展的该蛋白质的变化)。可以使用标准DNA检测工具例如PCR，自田间收集的昆虫中，快速地进行这种筛选。

序列表：

SEQ ID No.1：Cry2Ae1蛋白

SEQ ID No.2：Cry2Ab2蛋白

SEQ ID No.3：Cry1Fa1蛋白

SEQ ID No.4：VIP3Aa1蛋白

SEQ ID No.5：VIP3Af1蛋白

SEQ ID No.6：VIP3Aa19蛋白

SEQ ID No.7：VIP3Aa20蛋白

SEQ ID No.8：Cry1Ac1蛋白

SEQ ID No.9：Cry1A.105蛋白

SEQ ID No.10：Cry1Ab1蛋白

下面的实施例示例了本发明，但是不旨在对本发明或其保护范围构成限制。

除了在实施例中另有说明之外，根据Sambrook和Russell(2001)《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY；Ausubel等人(1994)《现代分子生物学技术，现代技术》(Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols)，USA的第1卷和第2卷；Brown(1998)《植物分子生物学Labfax》(Molecular Biology LabFax)，第2版，Academic Press(UK)的卷I和卷II中描述的标准方法，进行所有重组DNA技术。用于植物分子生物学工作的标准材料和方法描述于R.D.D.Croy所著的《植物分子生物学Labfax》(Plant Molecular Biology Labfax(1993))(由BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications，UK联合出版)中。用于聚合酶链式反应的标准材料和方法可见于Dieffenbach和Dveksler(1995)《PCR引物：实验室手册》(PCR Primer：A Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory Press和McPherson等人(2000)PCR-Basics：From Background to Bench，第一版，Springer Verlag，Germany中。

实施例

实施例1

1.1.材料与方法

毒素纯化和毒素的活化

于28.5℃在连续摇动和补充空气下、将来自Bacillus Genetic Stock Collection(Columbus，OH)的表达Cry1Ac的苏云金芽孢杆菌菌株HD73在CCY培养基(Stewart等人，1981)中生长48小时。将沉淀的不溶部分用1M NaCl、10mM EDTA洗涤两次，用10mM KCl洗涤1次。将Cry1Ac晶体溶于新制备的碳酸盐缓冲液(50mM Na2CO3/NaHCO3，10mM DTT；pH 10.5)中，在以150rpm摇动下于室温孵育2.5小时。通过于4℃以25000×g离心10分钟，弃去不溶残渣。通过于37℃用胰蛋白酶(SigmaT-8642)以1∶10(w∶w)的胰蛋白酶∶蛋白质比率孵育2小时，活化溶解的Cry1Ac原毒素。于4℃以25000×g离心10分钟后，将上清液在缓冲液A(20mM Tris-HCl，pH 8.65)中透析，过滤，然后在MonoQ 5/5柱中使用色谱法系统(GE Healthcare，UK)进行阴离子交换纯化。使用至60％的缓冲液B(20mM Tris-HCl，1M NaCl，pH 8.65)的连续梯度洗脱活化的Cry1Ac毒素。

除了在NEE缓冲液(50mM Na₂CO₃，5mM EDTA，10mM EGTA；pH12.1)中进行溶解外，如Cry1Ac一样地，对来自Bacillus Genetic Stock Collection(Columbus，OH)的表达Cry2Aa的菌株ECE126进行生长和活化。

于28℃在80rpm摇动下、将表达Cry2Ab2的重组苏云金芽孢杆菌菌株BtIPS78/11在含有6μg/ml氯霉素的C2培养基(Donovan等人，1988)中生长47小时。在加入了250mM NaCl的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(8mMNa₂HPO₄，2mM KH₂PO₄，150mM NaCl；pH 7.4)中进行两个洗涤步骤后，将细胞沉淀溶解于NEE缓冲液。加入取自新制备的25mg胰蛋白酶/ml的胰蛋白酶至0.3mg/ml最终浓度，将混合物于37℃孵育75分钟，离心。用硫酸铵沉淀Cry2Ab毒素溶液，将所得沉淀溶解于TEE缓冲液(50mMTris-HCl，5mM EDTA，10mM EGTA；pH 8.6)中。

于28℃在80rpm摇动下、将含有表达Cry2Ae的质粒pGA32的重组苏云金芽孢杆菌berliner变种1715cry-菌株在含有20μg/ml红霉素的C2培养基中生长144小时。在PBS+250mM NaCl中进行两个洗涤步骤后，将细胞沉淀溶解于碱性缓冲液(0.1M CAPS，10mM EGTA，5mM EDTA，pH 12.0)，于37℃孵育1小时。从新制备的7.5mg胰蛋白酶/ml中加入胰蛋白酶(以3∶1比率，w/w)。将混合物于37℃孵育过夜，离心。用PBS透析Cry2Ae毒素溶液。

生物测定试验

测试了每种活化的Cry蛋白的各7个不同浓度，针对每个浓度使用16条新生棉铃实夜蛾幼虫。将50μl体积的样品稀释液施加到分配到多空板中的人工饲料的表面。每个孔中放入一条幼虫。在65±5％的相对湿度和16:8(光照:黑暗)的光周期下、于25±2℃孵育板。7天后评价死亡率。使用POLO-PC概率值分析程序(LeOra Software，Berkeley，CA)对毒性数据进行分析。

中肠分离和BBMV制备

将棉铃实夜蛾(ANGR菌株，CSIRO Entomology，Australia)和谷实夜蛾(USDA-ARS，MS)的末龄幼虫进行解剖，将中肠保藏于-80℃直到需要时为止。通过差示镁沉淀法(Wolfersberger等人，1987)制备BBMV，冷冻于液氮中，在-80℃贮存。使用牛血清白蛋白作为标准通过Bradford法(1976)测定BBMV制备物中的蛋白质浓度。

Cry毒素的放射性标记

使用氯胺T方法对Cry1Ac和Cry2Ab毒素进行标记。在存在1/3v的18mM氯胺T(PBS中)下将Na¹²⁵I(0.5mCi)(PerkinElmer，Boston，MA)加至25微克Cry毒素中。孵育45秒后，通过加入1/4v的23mM偏亚硫酸氢钾(于H₂O中)终止反应。最后，加入1/4v的1M NaI，将混合物装载到用缓冲液柱(20mM Tris-HCl，150mM NaCl，0.1％BSA)平衡过的PD10脱盐柱(GE HealthCare，UK)上。通过SDS-PAGE、进一步将干凝胶对X射线胶片曝光，分析洗脱级分，以检查标记蛋白的纯度。根据投入的毒素、蛋白质峰中洗脱的放射性、和由SDS-PAGE(图1)揭示的毒素条带中的放射性相对于次要条带中的放射性的百分比，计算标记毒素的比活性。经估计，125I-Cry1Ac和125I-Cry2Ab毒素的比活性分别为3mCi/mg和2.4mCi/mg。

¹²⁵I-标记的Cry1Ac和Cry2Ab的结合试验

使用前，将BBMV以16000×g离心10分钟，再悬浮于结合缓冲液(8mMNa₂HPO₄，2mM KH₂PO₄，150mM NaCl；pH 7.4；0.1％牛血清白蛋白)。通过于25℃在结合缓冲液中用渐增量的¹²⁵I-Cry2Ab将20微克来自棉铃实夜蛾的BBMV孵育1小时，进行饱和实验。孵育后，将样品以16000×g离心10分钟，将沉淀用500微升冷结合缓冲液洗涤两次。在LKB 1282Compugamma CSγ计数器中测量保留在沉淀中的放射性。通过将过量的未标记Cry2Ab(1微摩尔)加至反应中，测定非特异性结合。通过将非特异性结合从总结合中减去，计算特异性结合。

为了测定BBMV用于竞争实验的最佳浓度，于25℃在终体积为0.1ml的结合缓冲液中分别使0.4nM和1.2nM标记的Cry1Ac和Cry2Ab与渐增量的BBMV孵育1小时。使用过量的未标记毒素来计算非特异性结合。

于25℃在存在渐增量的未标记毒素下、将20微克BBMV和1nM¹²⁵I-Cry2Ab或5微克BBMV和0.6nM¹²⁵I-Cry1Ac孵育1小时，进行竞争实验。对于定量测定，在γ计数器中测定结合BBMV的标记毒素的级分。使用LIGAND程序(Munson和Rodbard，1980)，计算结合位点的浓度和解离常数。对于定性测定，将沉淀在加样缓冲液(Laemmli，1970)中煮沸10分钟，然后在SDS-PAGE中跑胶。曝光1周后，通过放射自显影术检测保留在沉淀中的标记毒素。

1.2.结果

活化的Cry蛋白对棉铃实夜蛾的毒性

测试了Cry1Ac和Cry2Ab制备物的毒性。活化的Cry1Ac和Cry2Ab蛋白对棉铃实夜蛾幼虫具有毒性，LC₅₀值示于表2中。而且，活化的Cry2Ae蛋白显示对棉铃实夜蛾具有明显的杀昆虫活性。

¹²⁵I-Cry2Ab与棉铃实夜蛾BBMV的特异性结合

作为第一方法，通过用放射性标记的Cry2Ab孵育来自棉铃实夜蛾的BBMV，测试Cry2Ab的特异性结合(图1)。尽管于¹²⁵I-Cry2Ab制备物中存在其它标记的污染物，但是仅仅相应于Cry2Ab的条带结合BBMV。过量的未标记Cry2Ab急剧减少¹²⁵I-Cry2Ab的结合，表明大多数这种结合是特异性的。相比之下，过量的未标记Cry1Ac不降低标记Cry2Ab的结合，表明Cry1Ac不识别Cry2Ab结合位点。

¹²⁵I-Cry2Ab与棉铃实夜蛾BBMV的结合的饱和

通过用渐增浓度的标记Cry2Ab孵育棉铃实夜蛾BBMV，证实了Cry2Ab的结合是可饱和的。在使用的条件(0.2mg BBMV蛋白/ml)下，曲线约在5nM¹²⁵I-Cry2Ab处开始偏离线性，在约20nM时达到最大值(图2)。

应用棉铃实夜蛾BBMV的竞争实验

为发现BBMV用于竞争结合实验的最佳浓度，用渐增浓度的棉铃实夜蛾BBMV孵育固定浓度的¹²⁵I-Cry2Ab。如预料的一样，减去非特异性结合后，观察到特异性结合的增加，相应于结合位点的增加(图3A)。选择0.2mg/ml浓度的BBMV进行竞争结合实验。用¹²⁵I-Cry1Ac进行了类似实验，表明用于竞争实验的最佳BBMV浓度为0.05mg/ml(数据未显示)。

在同源竞争试验中用未标记Cry2Ab蛋白观察到的¹²⁵I-Cry2Ab置换证实，Cry2Ab在此昆虫中的结合是特异性且可饱和的(图3B)。在我们的实验条件下，也观察到一些非特异性结合。使用Cry2Aa和Cry2Ae作为异源竞争剂的竞争结合试验显示，这些Cry蛋白很容易地与¹²⁵I-Cry2Ab竞争(图3B)。相比之下，在所测试的浓度范围中未标记的Cry1Ac不能竞争¹²⁵I-Cry2Ab的结合(比示于图3B中的浓度更高浓度的Cry1Ac引起了¹²⁵I-Cry2Ab的沉淀)。这些结果表明，Cry2Ab结合位点被其它两种Cry2毒素共享，但不被Cry1Ac共享。

使用Cry1Ac、Cry2Ab、Cry2Aa和Cry2Ae作为竞争剂，也进行了¹²⁵I-Cry1Ac的竞争试验(图3C)。没有一个Cry2A蛋白与¹²⁵I-Cry1Ac竞争结合，证实Cry1Ac和这些Cry2A蛋白存在不同的结合位点。

根据同源竞争曲线，计算了Cry2Ab和Cry1Ac的结合参数，解离常数(Kd)和结合位点浓度(Rt)(表1)。在这两种情况下，同源竞争数据拟合单位点模型方程。如示于表1，在棉铃实夜蛾中Cry2Ab具有比Cry1Ac略多的特异性结合位点，但是对于它们的各自结合位点，Cry2Ab的亲和力低于Cry1Ac的亲和力。

Cry2Ab和Cry1Ac的放射性标记独立地进行了两次，并用新制备的第二个放射性标记的Cry1Ac和Cry2Ab制备物，重复上文所述的所有实验。用该第二组放射性标记的毒素获得的结果类似于上述的那些结果。

在使用¹²⁵I-Cry2Ab的竞争试验中，对于VIP3Aa和Cry1Fa蛋白，也没有在棉铃实夜蛾BBMV中看到对Cry2Ab结合位点的竞争。

Cry2Ab与谷实夜蛾BBMV的特异性结合

为证实从棉铃实夜蛾的实验中获得的结合位点模型，也在谷实夜蛾中进行了结合试验。在这种昆虫中，当将渐增量的BBMV与¹²⁵I-Cry2Ab孵育时，也观察到了特异性结合。当使用相同的BBMV浓度范围时，谷实夜蛾中结合的毒素的百分比低于棉铃实夜蛾中结合的毒素的百分比(比较图4A和3A)。

使用¹²⁵I-Cry2Ab在谷实夜蛾中进行同源和异源竞争试验。如在棉铃实夜蛾中一样，未标记Cry2Ab竞争¹²⁵I-Cry2Ab的结合位点(图4B)。同源竞争间接地表明在这种昆虫中Cry2Ab的可饱和结合，因为在未标记竞争剂的浓度范围中曲线反映了有限数量的结合位点。异源竞争试验表明Cry1Ac不与¹²⁵I-Cry2Ab竞争。

¹²⁵I-Cry1Ac的实验表明Cry2Ab不竞争Cry1Ac的结合位点(图4C)，由此证明了Cry2Ab和Cry1Ac在谷实夜蛾中也存在不同的结合位点。

可以在直接可饱和性试验中在谷实夜蛾的BBMV上获得与在棉铃实夜蛾BBMV上所观察到的类似的Cry2Ab蛋白的可饱和结合。而且，在谷实夜蛾中，Cry2Aa、Cry2Ab和Cry2Ae蛋白也结合共同受体。此外，在Cry2Ab与Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Fa或VIP3Aa蛋白之任何一个蛋白之间也不存在对结合位点的竞争。

1.3.结果分析

用Cry2Ab进行的饱和结合实验已表明，在敏感昆虫中肠细胞的膜中存在有限数量的特异性受体。用标记Cry1Ac进行的类似饱和试验揭示，在相同浓度的BBMV下，使用比在Cry2Ab试验中少四倍的毒素，实现了结合位点的饱和(数据未显示)。我们的结果与来自Cry2Aa饱和结合试验的先前结果是不同的，先前结果的结论是Cry2Aa蛋白质的结合是不可饱和的(English等人，1994，Jurat-Fuentes等人，2003；EPA生物农药手册006487(2002))。对于在那些Cry2Aa饱和实验中观察到的或多或少线性的曲线，有很多可能的解释。首先，这些作者使用了标记的Cry2Aa原毒素而不是活化的毒素。而且，在一项研究中用变性Cry2Aa蛋白进行标记，而并未核实在所用的条件下Cry2Aa可以耐受变性和复性的循环(English等人，1994)。其次，在Cry2A原毒素不可溶的pH值下使用缓冲液(Staples等人，2001)。在饱和实验中，低溶解度和Cry2A蛋白聚集的趋势(Perlak等人，2001)可能导致由沉淀引起的回收的放射性的线性增加。第三，用于饱和实验的Cry2Aa蛋白的浓度范围可能不足以饱和结合位点。所用范围与用于Cry1Ac毒素的范围相同，但由于Cry2A蛋白的较低亲和力，可能需要较高浓度的Cry2Aa蛋白来显示结合位点的饱和。第四，所用的BBMV浓度可能不足以区别特异性结合。如果结合位点浓度不足够高，那么Cry2A蛋白(与小泡组分和/或小瓶或过滤器)的高水平非特异性结合可能掩盖特异性结合。

在用¹²⁵I-Cry2A毒素进行的某些研究中，BBMV结合能力试验(即固定浓度的标记毒素和渐增量的BBMV)被表现为¹²⁵I-Cry2A饱和试验(即固定的BBMV浓度和渐增量的标记毒素)(Karim和Dean，2000，Karim等人，2000b，Luo等人，2007)。当实验中结合位点的浓度一直在变化时，结合位点的可饱和性是不能被确定的。因此，在这些研究中，基于了错误类型的实验来将Cry2A结合分类为可饱和的(Luo等人，2007)或不可饱和的(Karim和Dean，2000，Karim等人，2000b)。本研究是基于正确的饱和实验描述Cry2毒素的可饱和结合的第一份报告。

在本研究中，棉铃实夜蛾和谷实夜蛾中Cry2Ab的同源竞争试验证实，存在有限数量的结合位点。实际上，如果Cry2A结合是不可饱和的，那么将存在基本上无限数量的可用于结合的结合位点，并且未标记毒素与标记毒素对于这些位点的竞争将几乎是不可能的。在本实验中，一定百分比的Cry2Ab结合似乎是非特异性的。但非常有可能的是，归类为非特异性结合的放射性中的大多数实际上是来自于沉淀的标记Cry2Ab的放射性。

对来自同源竞争试验的结合参数进行的分析得出，在本文所分析的两个Helicoverpa物种中，Cry2Ab毒素的解离常数(Kd)的值比Cry1Ac的值高约35倍，这表明Cry2Ab的结合亲和力较低。然而，就结合位点的浓度而言，两毒素之间的差异低得多(约3倍)。由竞争试验计算得出的Cry2Ab和Cry1Ac的kd值与由棉铃实夜蛾中的饱和实验计算得出的值相似(数据未显示)。Mandal等人(2007)提出，某些作者所报导的Cry2A毒素的低受体结合亲和力归因于在该毒素中额外N末端区域的存在。

就我们所知，这是关于Cry2A蛋白之间的结合竞争试验的第一份报告。标记Cry2Ab和未标记Cry2Aa和Cry2Ae毒素的异源竞争实验显示，这些蛋白共享共同的结合位点。

总的来说，我们的结果清楚地表明，Cry2A蛋白以高亲和力可饱和地结合棉铃实夜蛾和谷实夜蛾BBMV中的特异性位点。此外，Cry2Aa、Cry2Ab与Cry2Ae共享该高亲和力结合位点，但不与Cry1Ac、VIP3或Cry1F共享。此外，对于Cry1Aa、Cry1Ab和Cry1Ac，已报导在所测试的所有昆虫物种中至少一个共同的高亲和力结合位点。证实Cry2A蛋白具有可饱和的高亲和力结合位点且该结合位点不同于Cry1A蛋白的结合位点，对昆虫抗性管理具有重要的意义：它对Cry1A与Cry2A蛋白之间的抗性转移(Cross-resistance)为什么那么罕见给出了生物化学解释，并且为在同一农作物中组合cry1A和cry2A基因以靶向棉铃实夜蛾或谷实夜蛾的抗性管理策略提供了可靠的支持。

实施例2

几种方法可以预期用于在转基因植物例如玉米或棉花植物中获得至少两个杀昆虫蛋白基因例如Cry2Ae和Cry1Ab基因的组合表达。

第一种方法基于相继的转化步骤，其中对已转化了第一嵌合基因的植物进行再转化，以引入第二基因。该相继转化优选使用两个不同的选择标记基因，例如卡那霉素抗性基因和赋予对草铵膦除草剂的抗性的膦丝菌素乙酰转移酶基因(例如，众所周知的pat或bar基因)。在De Block等人(1987)中已描述了这两种选择标记的应用。

第二种方法基于在单个步骤中共转化在不同质粒上编码不同杀昆虫蛋白的两个嵌合基因。可以通过利用与各自基因连接的选择标记，选择两个基因的整合。

此外，可以在独立的转化事件中，将两个杀昆虫蛋白基因各自单独地转移至不同植物的细胞核基因组中，随后可以通过杂交将其组合在单个植物中，并且可以使用DNA标记技术来选择包含这些不同基因的植物。

将包含MIR162事件(WO 2007/142840，USDA APHIS非管制状态申请07-253-01p)的玉米植物与包含含有WO 2002/057664的SEQ ID No.9的编码区的嵌合基因的玉米植物杂交，产生表达VIP3A和Cry2Ae昆虫控制蛋白的玉米植物。或者，将包含事件Bt11(USDA APHIS非管制状态申请95-195-01p)的玉米植物或包含事件MON810(USDA APHIS请愿书96-017-01p)的玉米植物与含有包含WO 2002/057664的SEQ ID No.9的编码区的嵌合基因的玉米植物杂交，产生表达Cry1Ab和Cry2Ae昆虫控制蛋白的玉米植物。

将包含如要求欧洲专利申请号07075460或07075485的优先权的PCT专利申请(未公开)中所述的事件EE-GH6的棉花植物与包含PCT专利申请PCT/EP2008/002667中所述的事件EE-GH5的棉花植物杂交，以获得表达Cry2A和Cry1A蛋白的棉花植物，该植物具有对谷实夜蛾和棉铃实夜蛾的内在昆虫抗性管理。

此外，将包含USDA APHIS申请03-155-01p(WO 2004/039986)的COT102事件的棉花植物与上述2基因棉花植物、或与含有包含WO2002/057664的SEQ ID N.7的编码区的嵌合基因和包含US专利7,049,491的SEQ ID No.2的Cry1Ab编码区的嵌合基因的棉花植物杂交，以获得表达VIP3A、Cry1Ab和Cry2Ae蛋白的棉花植物。

可以通过昆虫毒性测试和通过本领域已知的生物化学方法，评价至少两个杀昆虫蛋白基因在单个转化体中的共表达。特异性探针允许转录物水平的定量分析；与相应基因产物交叉反应的单克隆抗体允许在ELISA试验中定量分析相应基因产物；特异性DNA探针允许表征转化体中转基因的基因组整合。

当然，除了用于棉铃虫昆虫抗性管理的Cry2A、VIP3和Cry1基因的上述组合之外，这些植物还可包含其它转基因，例如赋予对抗其它鳞翅目昆虫物种或对抗来自其它昆虫目的昆虫物种例如鞘翅目(Coleopteran)或同翅目(Homopteran)昆虫物种的保护作用的基因，或赋予除草剂耐受性的基因等。

本文提及或引用的所有专利、专利申请和出版物或公众公开(包括互联网出版物和非管制状态申请)在与本说明书的明确教导相抵触的程度上以其全文并入作为参考。本文任何文件的引用都不意味着该文件形成本领域公知常识的部分。

引用的参考文献

An等人(1996)Plant J.10，107

Adang等人(1985)Gene 36，289-300

Aranda等人(1996)J.Invertebr.Pathol.68，203-212

Aoyama和Chua(1997)Plant Journal 11，605-612

Ballester等人(1999)Appl.Environm.Microbiol.65，1413-1419

Bennetzen & Hall(1982)J.Biol.Chem.257，3026-3031

Bradford(1976)Anal Biochem 72，248-254

Callis等人(1987)Genes Developm.1，1183-1200

Chalfant(1975)J.Georgia Entomol.Soc.10，32-33

Christensen等人(1992)Plant Mol.Biol.18，675-689

Cordera等人(1994)The Plant Journal 6，141

Cornejo等人(1993)Plant Mol.Biol.23，567-581

Crickmore等人(1998)Microbiol.Molecul.Biol.Revs.62，807-813

Crickmore等人(2008)“苏云金芽孢杆菌毒素命名法(Bacillus thuringiensis toxin nomenclature)”，www.lifesci.sussex.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/

Dankocsik等人(1990)Mol.Microbiol.4，2087-2094

Datta等人(1990)Bio/Technology 8，736-740

De Block等人(1987)EMBO J.6，2513-2518

De Pater等人(1992)Plant J.2，834-844

Depicker等人(1982)J.Molec.Appl.Genetics 1，561-573

Donovan等人(1988)J.Biol.Chem.263：561-567

English等人(1994)Insect Biochem.Molec.Biol.24，1025-1035

EPA生物农药手册006487(2002)。苏云金芽孢杆菌Cry2Ab2蛋白和在棉花中生产其所需的遗传物质(006487)，FactSheet(Environmental Protection Agency，USA(www.epa.gov)

EPA实验应用许可手册006499(2007)苏云金芽孢杆菌Vip3Aa19蛋白和在事件COT102棉花植物中产生其所需的遗传物质(载体pCOT1)(006499)实验应用许可手册(Environmental Protection Agency，USA，www.epa.gov)

Estela等人(2004)Appl.Environ.Microbiol.70：1378-1384

Estruch等人(1996)Proc Natl Acad Sci U S A.93，5389-94

Fang等人(2007)Appl.Environm.Microbiol.73，956-961

Ferré等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，5119-5123

Fiuza等人(1996)Appl.Environm.Microbiol.62，1544-1549

Franck等人(1980)Cell 21，285-294

Fromm等人(1990)Bio/Technology 8，833-839

Gardner等人(1981)Nucleic Acids Research 9，2871-2887

Gielen等人(1984)EMBO J 3，835-845

Gordon-Kamm等人(1990)The Plant Cell 2，603-618

Gould等人(1991)Plant Physiol.95，426-434

Hanahan(1983)J.Mol.Biol.166，557-580

Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Academy Science 89，915-919

Hernandez和Ferre(2005)Appl.Environm.Microbiol.71，5627-5629

Ho等人(2006)Crop Sci 46，781-789

Hofmann等人(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85，7844-7848

Hull and Howell(1987)Virology 86，482-493

Ikemura，1993，“Plant Molecular Biology Labfax”，Croy编辑，Bios Scientific Publishers Ltd.

Itakura等人(1977)Science 198，1056-1063

Jurat-Fuentes等人(2003)Appl Environ Microbiol.69(10)：5898-906

Karim和Dean(2000)Curr Microbiol.41(4)：276-83

Karim等人(2000a)Curr Microbiol.41(3)：214-9

Karim等人(2000b)Pesticide Biochem.Phisiol.67：198-216

Laemmli等人(1970)Nature 227，680-685

Last等人(1990)Theor.Appl.Genet.81，581-588

Lee等人(2003)Appl.Environm.Microbiol.69，4648-4657

Lee等人(2006)Biochem.Biophys.Res.Comm.339，1043-1047

Liao等人(2002)J.Invertebr.Pathol.80：55

Luo等人(1999)Appl.Environm.Microbiol.65，457-464

Luo等人(2007)J Econ Entomol.100(3)：909-15

Mandal等人(2007)蛋白Eng Des Sel.20(12)：599-606

McBride等人(1995)Bio/Technology 13，362

Munson & Rodbard(1980)Anal.Biochem.107，220-239

Murray等人(1989)Nucleic Acids Research 17，477-498

Nakamura等人(2000)Nucl.Acids Res.28，292

Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48，443-453

Nielsen等人(1996)Int.J.Neur.Sys.，8，581-599，1997

Odeu等人(1985)Nature 313，810-812

Perlak等人(2001)Plant J.27(6)：489-501

Rang等人(2004)Curr.Microbiol.49，22-27

Robertson & Preisler(1992)CRC Press，Boca Raton，Florida，USA，第127页

Sayyed等人(2000)Appl.Environm.Microb.66，1509-1516

Shimamoto等人(1989)Nature 338，274-276

Stanssens等人(1989)Nucleic Acids Research 12，4441-4454

Staples等人(2001)Curr Microbiol.42(6)：388-92

Stewart等人(1981)Biochem.J.198，101-106

玉米事件MON 89034的USDA APHIS非管制状态申请06-298-01p(2006)，参见于2007年12月13日在US联邦公报中公开的通告(72 FR70817-70819；档案号APHIS-2007-0030)

Van Rie等人(1989)Eur.J.Biochem.186，239-247

Velten等人(1984)EMBO J 3，2723-2730

Velten和Schell(1985)，Nucleic Acids Research 13，6981-6998

Verdaguer等人(1998)，Plant Mol.Biol.37，1055-1067

Von Heijne，Gunnar(1986)Nucl.Acids Res.14：11，4683-4690

Wabiko等人(1986)DNA 5，305-314

Wolfersberger等人(1987)，Comp.Biochem.Physiol.86，301-308

White等人(1989)Trends in Genet.5，185-189

Zhang等人(1991)The Plant Cell 3，1155-1165

表1.棉铃实夜蛾和谷实夜蛾中的结合参数

^aK_d值表示平衡解离常数，其根据同源竞争试验计算，且以纳摩尔浓度表示。

^bR_t值表示结合位点浓度，且以皮摩尔/毫克BBMV蛋白表示。

^c值是两个重复的平均值。

^d值是至少四个重复的平均值。

e平均值±SEM。

表2.Cry1Ac和Cry2Ab活化蛋白对棉铃实夜蛾新生幼虫的毒性(7天后测量)。

^a置信限在95％水平。

表3.VIP3蛋白列表

(www.lifesci.susx.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html)

附图说明

图1.结合来自棉铃实夜蛾的BBMV的125I-Cry2Ab的放射自显影

在缺少或存在过量竞争剂下、¹²⁵I-Cry2Ab与BBMV孵育，然后将经离心结合反应混合物而得的沉淀进行SDS-PAGE，对X射线胶片曝光1周。泳道1：¹²⁵I-Cry2Ab毒素；泳道2：在缺少竞争剂下与BBMV孵育的¹²⁵I-Cry2Ab；泳道3：同源竞争(过量的未标记Cry2Ab)；泳道4：与Cry1Ac的异源竞争。

图2.125I-Cry2Ab对棉铃实夜蛾BBMV的特异性结合的饱和

渐增量的¹²⁵I-Cry2Ab与固定量的BBMV(20微克小泡蛋白)孵育1小时。通过离心终止结合反应，测量保留在沉淀中的放射性。通过用过量的未标记Cry2Ab孵育来计算非特异性结合，并从总结合中减去。

图3.¹²⁵I-Cry2Ab与棉铃实夜蛾BBMV的结合

(A)¹²⁵I-Cry2Ab与渐增浓度的BBMV的特异性结合。在存在过量的未标记Cry2Ab下计算非特异性结合。数据点相当于使用两批独立的¹²⁵I-Cry2Ab的5个重复的平均值。(B)使用¹²⁵I-Cry2Ab的竞争实验。(C)使用¹²⁵I-Cry1Ac的竞争实验。在竞争试验中，每个数据点表示至少两个独立重复的平均值。

图4.¹²⁵I-Cry2Ab与谷实夜蛾BBMV的结合

(A)¹²⁵I-Cry2Ab与渐增浓度的BBMV的特异性结合。在存在过量的未标记Cry2Ab下计算非特异性结合。(B)使用¹²⁵I-Cry2Ab的竞争实验。(C)使用¹²⁵I-Cry1Ac的竞争实验。每个数据点表示至少两个独立重复的平均值。

Claims

1.用于防止或延缓昆虫物种谷实夜蛾或棉铃实夜蛾群体中对表达杀昆虫蛋白的转基因植物的昆虫抗性发展以控制所述昆虫害的方法，其包括在所述植物中组合表达对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry2Ae、Cry2Aa或Cry2Ab蛋白与对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的VIP3、Cry1F或Cry1A蛋白。

2.在谷实夜蛾或棉铃实夜蛾昆虫的群体已对包含VIP3、Cry1F或Cry1A蛋白的植物产生抗性的地区中控制谷实夜蛾或棉铃实夜蛾的方法，其包括步骤：在所述地区中播种或种植包含对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry2Aa、Cry2Ab或Cry2Ae蛋白的植物。

3.在谷实夜蛾或棉铃实夜蛾昆虫的群体已对包含Cry2Aa、Cry2Ab或Cry2Ae蛋白的植物产生抗性的地区中控制谷实夜蛾或棉铃实夜蛾的方法，其包括步骤：在所述地区中播种或种植包含对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的VIP3、Cry1F或Cry1A蛋白的植物。

4.用于获得包含至少两种不同的杀昆虫蛋白的植物的方法，其中如在使用谷实夜蛾或棉铃实夜蛾昆虫幼虫的刷状缘膜小泡的竞争结合试验中测定的，所述蛋白质可饱和且特异性地结合物种谷实夜蛾或棉铃实夜蛾幼虫中的结合位点、并且所述蛋白质不共享结合位点，所述方法包括以下步骤：获得包含编码对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry2Aa、Cry2Ab或Cry2Ae蛋白的可植物表达嵌合基因和编码对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的VIP3、Cry1A或Cry1F蛋白的可植物表达嵌合基因的植物。

5.权利要求4的方法，其中所述植物通过如下方式获得：用编码所述Cry2Aa、Cry2Ab或Cry2Ae蛋白和所述VIP3、Cry1A或Cry1F蛋白的嵌合基因转化植物，和获得包含所述嵌合基因的所述植物的种子和后代植物；或将包含编码Cry2Ae、Cry2Aa或Cry2Ab的嵌合基因的亲本植物与包含编码VIP3、Cry1A或Cry1F的嵌合基因的亲本植物杂交，和获得包含所述组合的嵌合基因的后代植物和种子。

6.播种、种植或生长植物的方法，所述植物通过表达至少两种不同的杀昆虫蛋白而被保护免受谷实夜蛾或棉铃实夜蛾的损害，其中如在使用刷状缘膜小泡的竞争结合实验中测定的，所述蛋白质可饱和且特异性地结合所述昆虫物种的幼虫中肠中的结合位点、并且所述蛋白质不共享结合位点，所述方法包括以下步骤：播种、种植或生长包含编码对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的Cry2Ab、Cry2Aa或Cry2Ae蛋白的嵌合基因和编码对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的VIP3、Cry1A或Cry1F蛋白的嵌合基因的植物。

7.权利要求2～6中任一项的方法，其中包含编码杀昆虫VIP3蛋白的嵌合基因的所述植物选自下组：包含编码VIP3Aa1、VIP3Aa19、VIP3Aa20或VIP3Af1蛋白、或与任何所述VIP3A蛋白具有至少70％序列同一性的杀昆虫蛋白的嵌合基因的植物、包含WO 2007/142840中所述USDAAPHIS申请07-253-01p的MIR162事件的玉米植物、包含WO2004/039986中所述USDA APHIS申请03-155-01p的COT102事件的棉花植物、包含WO 2005/054479中所述的COT202事件的棉花植物、和包含WO 2005/054480中所述的COT203事件的棉花植物。

8.权利要求2～7中任一项的方法，其中包含Cry1A基因的所述植物选自下组：包含编码Cry1Ac、Cry1Ab或Cry1A.105蛋白、或与任何所述Cry1A蛋白具有至少90％序列同一性的杀昆虫蛋白的嵌合基因的植物、包含US专利6713259中所述USDAAPHIS申请96-017-01p的MON810事件的玉米植物、包含US专利6,114,608中所述USDA APHIS申请95-195-01p的Bt11事件的玉米植物、包含WO 2006/128573中所述USDAAPHIS申请07-108-01p的COT67B事件的棉花植物、包含WO2005/103266中所述USDAAPHIS申请03-036-02p的3006-210-23事件的棉花植物、包含WO 2002/100163中所述的Cry1A基因事件，即，USDAAPHIS申请94-308-01p的事件531的棉花植物、包含WO2006/128568-128572中所述的事件T342-142、1143-14A、1143-51B、CE44-69D或CE46-02A中的任何一个事件的棉花植物、包含PCT专利申请PCT/EP2008/002667中所述的事件EE-GH5的棉花植物、和包含WO2007/140256中所述的含Cry1A基因的事件，即，USDA APHIS申请06-298-01p的MON89034事件的玉米植物。

9.权利要求2～8中任一项的方法，其中包含Cry1F基因的所述植物选自下组：包含编码Cry1Fa蛋白或与所述Cry1Fa蛋白具有至少90％序列同一性的杀昆虫蛋白的嵌合基因的植物、包含USDA APHIS申请00-136-01p(WO/2004/099447)的TC1507事件的玉米植物、包含USDAAPHIS申请03-181-01p的TC-2675事件的玉米植物、包含USDA APHIS申请03-036-01p的281-24-236事件(WO 2005/103266的含Cry1F基因的事件)的棉花植物。

10.权利要求2～9中任一项的方法，其中包含Cry2Ae基因的所述植物选自下组：包含编码Cry2Ae蛋白或与所述Cry2Ae蛋白具有至少95％序列同一性的杀昆虫蛋白的嵌合基因的植物、包含含有WO 2002/057664的SEQ ID No.7或9的编码序列的嵌合基因的植物、包含要求欧洲专利申请号07075460的优先权的PCT专利申请中描述的事件EE-GH6的棉花植物。

11.权利要求2～10中任一项的方法，其中包含Cry2Ab基因的所述植物选自下组：包含编码Cry2Ab蛋白或与所述Cry2Ab蛋白具有至少95％序列同一性的杀昆虫蛋白的嵌合基因的植物、包含USDA APHIS非管制状态申请00-342-01p中所述的Cry2Ab事件15985的棉花植物、包含USDAAPHIS非管制状态申请06-298-01p中所述的Cry2Ab事件MON89034的玉米植物。

12.权利要求2～6中任一项的方法，其中所述嵌合Cry或VIP基因包含Cry2Ae、Cry2Ab、VIP3A、Cry1A或Cry1F编码区，选自包含于权利要求8～12中所述的任一个棉花或玉米事件中的任何一个Cry2Ae、Cry2Ab、VIP3A、Cry1A或Cry1F编码区，或其中所述Cry2Ab、Cry2Ae、VIP3、Cry1A或Cry1F嵌合基因是包含在任何一个所述棉花或玉米事件中的任何一个Cry2Ae、VIP3、Cry1F或Cry1A嵌合基因。

13.权利要求1～12中任一项的方法，其中所述植物选自下组：玉米、棉花、稻、大豆、番茄、向日葵和甘蔗。

14.权利要求1～13中任一项的方法，其中所述方法还包括种植具有不包含编码Cry或VIP蛋白的嵌合基因的植物的避难所。

15.权利要求1～14中任一项的方法，其中所述植物提供针对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾的高剂量的Cry2、Cry1或VIP3蛋白。

16.权利要求1～15中任一项的方法，其中所述Cry2A蛋白是Cry2Ab蛋白，且所述结合是可饱和且特异性的。

17.包含至少Cry2A和Cry1或VIP3转基因的植物或种子，其中每个转基因编码不同的、对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的、可饱和且特异性地结合所述昆虫中肠中的结合位点的蛋白质，其中所述蛋白质在该昆虫中不竞争相同的结合位点，且其中所述Cry2A蛋白是包含Cry2Aa或Cry2Ae蛋白的最小毒性片段的蛋白质，且所述Cry1或VIP3蛋白是包含Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Fa或VIP3A蛋白的最小毒性片段的蛋白。

18.权利要求17的植物或种子，其是包含至少2个选自下组的转化事件的组合的玉米或棉花植物或种子：玉米事件MON89034、玉米事件MIR162、包含编码Cry2Ae蛋白的转基因的玉米事件、玉米事件TC1507、玉米事件Bt11、玉米事件MON810、棉花事件EE-GH6、棉花事件COT102、棉花事件COT202、棉花事件COT203、棉花事件T342-142、棉花事件1143-14A、棉花事件1143-51B、棉花事件CE44-69D、棉花事件CE46-02A、棉花事件COT67B、棉花事件15985、棉花事件3006-210-23、棉花事件531、棉花事件EE-GH5和棉花事件281-24-236。

19.权利要求18的植物或种子，其中所述玉米或棉花植物或种子包含至少3个选自下组的转化事件的组合：玉米事件MON89034、玉米事件MIR162、含有编码包含Cry2Ae蛋白的最小毒性片段的蛋白质的转基因的玉米事件、玉米事件TC1507、玉米事件Bt11、玉米事件MON810、棉花事件EE-GH6、棉花事件COT102、棉花事件COT202、棉花事件COT203、棉花事件T342-142、棉花事件1143-14A、棉花事件1143-51B、棉花事件CE44-69D、棉花事件CE46-02A、棉花事件COT67B、棉花事件15985、棉花事件3006-210-23、棉花事件531、棉花事件EE-GH5和棉花事件281-24-236。

20.用于获得种植或商品化表达对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的蛋白质的植物的监管部门批准的方法，其包括以下步骤：引用、提交或依赖显示Cry2A蛋白在该昆虫中不竞争Cry1A、Cry1F或VIP3蛋白的结合位点的昆虫试验结合数据。

21.用于减少种植区中含有不产生对谷实夜蛾或棉铃实夜蛾具有杀昆虫性的任何蛋白质的植物的结构避难所的方法，该方法包括以下步骤：引用、提交或依赖显示Cry2A蛋白在该昆虫中不竞争Cry1A、Cry1F或VIP3蛋白的结合位点的昆虫试验结合数据。

22.权利要求20或21的方法，其还包括以下步骤：引用、提交或依赖显示Cry2A蛋白可饱和地结合谷实夜蛾或棉铃实夜蛾中肠中的结合位点的直接可饱和性试验。

23.权利要求20～22中任一项的方法，其中所述Cry2A蛋白是包含Cry2Ae蛋白的最小毒性片段的蛋白质，且其中所述Cry1A、Cry1F或VIP3蛋白是权利要求7～9中所定义的任何一种该蛋白质。

24.控制谷实夜蛾或棉铃实夜蛾昆虫的昆虫抗性转基因植物的种植区，其中所述种植区具有小于20％、小于15％、小于10％或小于5％的结构避难所，或不具有结构避难所，其中所述植物组合表达对棉铃实夜蛾或谷实夜蛾昆虫具有杀昆虫性的Cry2Ae或Cry2Ab蛋白和对棉铃实夜蛾或谷实夜蛾昆虫具有杀昆虫性的Cry1A、Cry1F或VIP3A蛋白，特别是对棉铃实夜蛾或谷实夜蛾昆虫具有杀昆虫性的Cry2Ae和Cry1Ab、Cry1Ac或VIP3A蛋白，优选对棉铃实夜蛾或谷实夜蛾昆虫具有杀昆虫性的Cry2Ae、Cry1Ab和VIP3蛋白。