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CN102066422A - 溶酶体靶向肽及其应用 - Google Patents

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CN102066422A CN2009801231566A CN200980123156A CN102066422A CN 102066422 A CN102066422 A CN 102066422A CN 2009801231566 A CN2009801231566 A CN 2009801231566A CN 200980123156 A CN200980123156 A CN 200980123156A CN 102066422 A CN102066422 A CN 102066422A
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Abstract

本发明提供了基于GILT技术的用于有效溶酶体靶向的进一步改善的组合物和方法。尤其是，本发明提供了使用抗弗林蛋白酶的溶酶体靶向肽用于将溶酶体酶靶向溶酶体的方法和组合物。本发明还提供了使用对胰岛素受体具有降低或减小的结合亲和力的溶酶体靶向肽用于将溶酶体酶靶向溶酶体的方法和组合物。

Description

溶酶体靶向肽及其应用
相关申请的引用
本专利申请要求于2008年5月7日提交的美国临时专利申请号61/051,336和2009年1月12日提交的美国临时专利申请号61/144,106的权益，将其各自的内容以其整体作为参考并入本文。
背景技术
通常，在细胞溶质中合成了哺乳动物的溶酶体酶并且溶酶体酶穿过ER，在此它们被N-连接的高甘露糖型碳水化合物糖基化。在高尔基体中，通过添加将溶酶体蛋白靶向溶酶体的甘露糖-6-磷酸(M6P)修饰了这些蛋白上的高甘露糖碳水化合物。通过与两个M6P受体中任一个的相互作用将M6P-修饰的蛋白输送到溶酶体中。最好的修饰形式是将两个M6P添加到高甘露糖碳水化合物上。
超过四十种溶酶体贮积病(LSD)是直接或间接地由缺少溶酶体中的一种或多种溶酶体酶所造成的。正在积极进行LSD的酶替代疗法。疗法通常要求以M6P依赖的方式将LSD蛋白吸收并运输到各种细胞类型的溶酶体中。一种可能的方法包括纯化LSD蛋白并对其进行修饰以加入具有M6P的碳水化合物部分。由于与细胞表面上M6P受体的相互作用，因此与未修饰的LSD蛋白相比，这种修饰材料可以更有效地被细胞吸收。
本申请的发明人先前已开发了基于肽的靶向技术，该技术使得能够更有效地将治疗性酶运输到溶酶体中。由于用肽标记替代M6P作为靶向溶酶体的部分，因此这种专有技术称为不依赖于糖基化作用的溶酶体靶向(Glycosylation Independent Lysosomal Targeting)(GILT)。在美国中请公开号2003-0082176、2004-0006008、2003-0072761、2005-0281805、2005-0244400以及国际公开WO 03/032913、WO 03/032727、WO02/087510、WO 03/102583、WO 2005/078077中说明了GILT技术的详细内容，将其全部披露内容作为参考并入本文。
发明内容
本发明提供了基于GILT技术的用于有效溶酶体靶向的进一步改善的组合物和方法。尤其是，本发明提供了使用抗弗林蛋白酶(furin-resistant)的溶酶体靶向肽用于将溶酶体酶靶向溶酶体的方法和组合物。本发明还提供了使用对胰岛素受体具有降低或减小的结合亲和力的溶酶体靶向肽用于将溶酶体酶靶向溶酶体的方法和组合物。本发明包含以下意外发现：根据本发明的抗弗林蛋白酶的溶酶体靶向肽对胰岛素受体具有降低的结合亲和力。
在一些实施方式中，本发明提供了抗弗林蛋白酶的IGF-II突变蛋白。在一些实施方式中，本发明提供了抗弗林蛋白酶的IGF-II突变蛋白，其具有与成熟人IGF-II(SEQ ID NO：1)至少70％相同的氨基酸序列以及消除了至少一个弗林蛋白酶切割(裂解)位点的突变。
在一些实施方式中，本发明提供了IGF-II突变蛋白，其包含与成熟人IGF-II(SEQ ID NO：1)相比至少70％相同的氨基酸序列以及与野生型人IGF-II相比降低或减小了对胰岛素受体的结合亲和力的突变。
在一些实施方式中，相对于天然存在的人IGF-II对IGF-I受体的亲和力，抗弗林蛋白酶的IGF-II突变蛋白对IGF-I受体具有减小的结合亲和力。
在一些实施方式中，本发明提供了靶向的治疗性融合蛋白，其包含溶酶体酶；和具有与成熟人IGF-II(SEQ ID NO：1)至少70％相同的氨基酸序列的IGF-II突变蛋白，其中所述IGF-II突变蛋白抗弗林蛋白酶的切割并且以不依赖于甘露糖-6-磷酸的方式与人的非阳离子依赖型(阳离子非依赖型，cation-independent)甘露糖-6-磷酸受体结合。
在一些实施方式中，本发明提供了靶向的治疗性融合蛋白，其包含溶酶体酶；和IGF-II突变蛋白，所述IGF-II突变蛋白具有与成熟人IGF-II(SEQ ID NO：1)至少70％相同的氨基酸序列，并且相对于天然存在的人IGF-II对胰岛素受体的亲和力，所述IGF-II突变蛋白对胰岛素受体具有减小的结合亲和力；其中所述IGF-II突变蛋白以不依赖于甘露糖-6-磷酸的方式与人的非阳离子依赖型甘露糖-6-磷酸受体结合。
在一些实施方式中，本发明提供了靶向的治疗性融合蛋白，其包含溶酶体酶；和IGF-II突变蛋白，所述IGF-II突变蛋白具有与成熟人IGF-II(SEQ ID NO：1)至少70％相同的氨基酸序列，并且相对于天然存在的人IGF-II对胰岛素受体的亲和力，所述IGF-II突变蛋白对胰岛素受体具有减小的结合亲和力；其中所述IGF-II突变蛋白抗弗林蛋白酶的切割并且以不依赖于甘露糖-6-磷酸的方式与人的非阳离子依赖型甘露糖-6-磷酸受体结合。
在一些实施方式中，适合于本发明的IGF-II突变蛋白包含在对应于SEQ ID NO：1的氨基酸30-40的区域内的突变。在一些实施方式中，适合于本发明的IGF-II突变蛋白包含在对应于SEQ ID NO：1的氨基酸34-40的区域内的突变使得所述突变消除了至少一个弗林蛋白酶切割位点。在一些实施方式中，适合的突变为氨基酸取代、缺失和/或插入。在一些实施方式中，所述突变为在对应于SEQ ID NO：1的Arg37或Arg40的位置处的氨基酸取代。在一些实施方式中，所述氨基酸取代为Lys或Ala取代。
在一些实施方式中，适合的突变为对应于下列位置的氨基酸残基的缺失或替代，所述位置选自由SEQ ID NO：1的31-40、32-40、33-40、34-40、30-39、31-39、32-39、34-37、32-39、33-39、34-39、35-39、36-39、37-40、34-40、以及它们的组合组成的组。
在一些实施方式中，根据本发明的IGF-II突变蛋白进一步包含对应于SEQ ID NO：1的位置2-7的氨基酸的缺失或替代。在一些实施方式中，根据本发明的IGF-II突变蛋白进一步包含对应于SEQ ID NO：1的位置1-7的氨基酸的缺失或替代。在一些实施方式中，根据本发明的IGF-II突变蛋白进一步包含对应于SEQ ID NO：1的位置62-67的氨基酸的缺失或替代。在一些实施方式中，根据本发明的IGF-II突变蛋白进一步包含对应于SEQID NO：1的Tyr27、Leu43或Ser26的位置处的氨基酸取代。在一些实施方式中，根据本发明的IGF-II突变蛋白至少包含选自由Tyr27Leu、Leu43Val、Ser26Phe以及它们的组合组成的组中的氨基酸取代。在一些实施方式中，根据本发明的IGF-II突变蛋白包含对应于SEQ ID NO：1的位置48-55的氨基酸。在一些实施方式中，根据本发明的IGF-II突变蛋白包含选自由对应于SEQ ID NO：1的位置8、48、49、50、54和55的氨基酸组成的组中的至少三种氨基酸。在一些实施方式中，本发明的IGF-II突变蛋白包含在对应于SEQ ID NO：1的位置54和55的位置处的氨基酸，每个所述氨基酸在pH 7.4下不带电或带负电。在一些实施方式中，相对于天然存在的人IGF-II对IGF-I受体的亲和力，所述IGF-II突变蛋白对IGF-I受体具有减小的结合亲和力。
在一些实施方式中，适合于本发明的溶酶体酶为人酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)、或其功能性变体。在一些实施方式中，适合于本发明的溶酶体酶包含人GAA的氨基酸70-952。
在一些实施方式中，本发明的靶向的治疗性融合蛋白进一步包含在溶酶体酶与抗弗林蛋白酶的IGF-II突变蛋白之间的间隔区。在一些实施方式中，所述间隔区包含氨基酸序列Gly-Ala-Pro。
本发明还提供了编码如以上各个实施方式中所描述的IGF-II突变蛋白或靶向的治疗性融合蛋白的核酸。本发明进一步提供了包含本发明的核酸的各种细胞。
本发明提供了适合于治疗溶酶体贮积病的药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的本发明的靶向的治疗性融合蛋白。本发明进一步提供了治疗溶酶体贮积病的方法，该方法包括向需要治疗的受试者给予根据本发明的靶向的治疗性融合蛋白。在一些实施方式中，溶酶体贮积病为蓬珀病(全身性糖原病，Pompe Disease)。在一些实施方式中，溶酶体贮积病为法布里病(Fabry Disease)。在一些实施方式中，溶酶体贮积病为高歇病(Gaucher Disease)。
在另一个方面，本发明提供了一种生产靶向的治疗性融合蛋白的方法，该方法包括以下步骤：在细胞培养基中培养哺乳动物细胞，其中哺乳动物细胞具有本发明的核酸，具体地，如本文中各个实施方式所述的；和在允许靶向的治疗性融合蛋白表达的条件下进行所述培养。
在又一个方面，本发明提供了一种生产靶向的治疗性融合蛋白的方法，该方法包括以下步骤：在细胞培养基中培养弗林蛋白酶缺陷型细胞(例如，弗林蛋白酶缺陷型哺乳动物细胞)，其中弗林蛋白酶缺陷型细胞具有编码包含溶酶体酶和IGF-II突变蛋白的融合蛋白的核酸，所述IGF-II突变蛋白具有与成熟人IGF-II(SEQ ID NO：1)至少70％相同的氨基酸序列，其中IGF-II突变蛋白以不依赖于甘露糖-6-磷酸的方式与人的非阳离子依赖型甘露糖-6-磷酸受体结合；并且其中所述培养是在允许靶向的治疗性融合蛋白表达的条件下进行的。
在随后的详细说明中，本发明的其它特征、目的和优势将是显而易见的。然而，应当理解，在说明本发明实施方式的同时，详细描述仅通过示例的方式给出，而不进行限制。根据详细说明，本发明范围内的各种变化和改变对本领域的技术人员来说会是显而易见的。
附图说明
附图仅是出于说明的目的，而不是为了限制。
图1示出了ZC-701的N末端的图。方框中的两个氨基酸残基是切割事件的位点。第一个是信号肽切割位点，第二个是弗林蛋白酶切割位点。
图2示出了用肽N-糖苷酶F(N-糖酰胺酶F，肽-N-聚糖酶F，PNGaseF)处理后的ZC-701的示例性SDS-PAGE分析。右侧的泳道已另外用弗林蛋白酶处理。
图3左侧：修饰了弗林蛋白酶切割位点的示例性ZC-701突变体的示意图。中间：细胞培养3-7天后，用肽N-糖苷酶处理的突变体的示例性SDS-PAGE分析。右侧：用弗林蛋白酶处理的肽N-糖苷酶处理过的突变体的示例性SDS-PAGE分析。
图4示出了示例性的竞争性IGF-II受体结合结果。
图5示出了另外的示例性的竞争性IGF-II受体结合结果。
图6示出了示例性胰岛素受体竞争测定结果。
图7示出了示例性IGF-I受体竞争测定结果。
图8示出了某种胰岛素受体结合测定的示例性结果。
图9示出了某种胰岛素受体结合测定的示例性结果。
图10示出了从瞬时转染中部分纯化的GILT-标记的GAA的示例性分析。用构件(构建体，构建物，construct)1479、1487或ZC-701转染HEK293细胞。收获后，用疏水作用层析(HIC)部分纯化培养上清液。在进行电泳前，用肽N-糖苷酶处理所有样品。左侧部分：部分纯化蛋白的SDS-PAGE。将纯化的ZC-701B12显示为对照。右侧部分：部分纯化蛋白的免疫印迹分析。使用了所指明的第一抗体。底侧部分另外用外源弗林蛋白酶处理。构件1487所编码的蛋白在序列上与构件1461(R37A)所编码的相同。构件1479所编码的蛋白与构件1459(R37K)所编码的相同。
图11示出了示例性抗弗林蛋白酶的GILT-标记的GAA吸收至大鼠L6成肌细胞中的示例性吸收结果。蛋白1479、1487、ZC-701和纯化的ZC-701的K吸收分别为4.5nM、4.4nM、5.0nM和2.6nM。构件1487所编码的蛋白在序列上与图3中构件1461所编码的(R37A)相同。构件1479所编码的蛋白与图3中构件1459所编码的(R37K)相同。
定义
转佳：如本文所使用的，术语“转佳”表示受试者状况的预防、减轻或缓和或者受试者状况的改善。转佳包括，但不要求疾病病况的完全恢复或完全预防。在一些实施方式中，转佳包括相关疾病组织的溶酶体内部所累积的材料的减少。
抗弗林蛋白酶的IGF-II突变蛋白：如本文所使用的，术语“抗弗林蛋白酶的IGF-II突变蛋白”是指基于IGF-II的肽，该基于IGF-II的肽包含这样的改变的氨基酸序列，该改变的氨基酸序列消除了至少一个天然弗林蛋白酶切割位点或改变了接近于或邻近于天然弗林蛋白酶切割位点的序列的使得与野生型人IGF-II肽相比，防止、抑制、降低或减慢了弗林蛋白酶的切割。如本文所使用的，抗弗林蛋白酶的IGF-II突变蛋白还称为对弗林蛋白酶耐受的IGF-II突变蛋白。
弗林蛋白酶切割位点：如本文所使用的，术语“弗林蛋白酶切割位点”(还称为“弗林蛋白酶切割位点”或“弗林蛋白酶切割序列”)是指用作弗林蛋白酶或类弗林蛋白酶的酶促蛋白酶切割的识别序列的肽或蛋白质的氨基酸序列。通常，弗林蛋白酶切割位点具有共有序列Arg-X-X-Arg(SEQ IDNO：2)，X为任何氨基酸。所述切割位点位于所述序列中羧基末端的精氨酸(Arg)残基之后。在一些实施方式中，弗林蛋白酶切割位点可以具有共有序列Lys/Arg-X-X-X-Lys/Arg-Arg(SEQ ID NO：3)，X为任何氨基酸。所述切割位点位于所述序列中羧基末端的精氨酸(Arg)残基之后。
弗林蛋白酶如本文所使用的，术语“弗林蛋白酶”是指可以识别并切割如本文所定义的弗林蛋白酶切割位点的任何蛋白酶，包括弗林蛋白酶或类弗林蛋白酶。弗林蛋白酶还称为成对碱性氨基酸切割酶(PACE)。弗林蛋白酶属于类枯草杆菌蛋白酶前蛋白转化酶家族。编码弗林蛋白酶的基因被称为FUR(FES上游区)。
弗林蛋白酶缺陷型细胞：如本文所使用的，术语“弗林蛋白酶缺陷型细胞”是指弗林蛋白酶活性被抑制、降低或消除的任何细胞。弗林蛋白酶缺陷型细胞包括不产生弗林蛋白酶或产生降低量的弗林蛋白酶或缺陷型弗林蛋白酶的哺乳动物和非哺乳动物细胞。
不依赖于糖基化作用的溶酶体靶向：如本文所使用的，术语“不依赖于糖基化作用的溶酶体靶向”(还称作“GILT”)是指不依赖于甘露糖-6-磷酸的溶酶体靶向。
人酸性α-葡萄糖苷酶：如本文所使用的，术语“人酸性α-葡萄糖苷酶”(还称为“GAA”)是指能够降低哺乳动物溶酶体中糖原水平或者能够挽救一种或多种蓬珀病症状或使其转佳的人GAA的前体野生型或功能性变体。
改善、提高或降低：如本文所使用的，术语“改善”、“提高”或“降低”或语法上等价的表达表示相对于基线测量(如，在开始本文所述的治疗前在相同个体中的测量)或相对于未使用本文所述治疗的对照个体(或多个对照个体)中的测量的值。“对照个体”是被与所治疗个体相同形式的溶酶体贮积病(例如，蓬珀病)困扰的个体，其与所治疗的个体年龄大致相同(以确保治疗个体和对照个体中的疾病阶段是可比较的)。
个体、受试者、患者：如本文所使用的，术语“受试者”、“个体”或“患者”是指人或非人哺乳动物受试者。所治疗的个体(还称为“患者”或“受试者”)是患有溶酶体贮积病(例如，蓬珀病(即婴儿、少年或成年发病的蓬珀病))或具有发展溶酶体贮积病(例如，蓬珀病)的可能的个体(胎儿、婴儿、儿童、青少年或成年的人)。
溶酶体贮积病：如本文所使用的，“溶酶体贮积病”是指由缺乏在溶酶体中将大分子分解成肽、氨基酸、单糖、核酸和脂肪酸所需要的至少一种酶(例如，酸性水解酶)所引起的一组遗传疾病。因此，患有溶酶体贮积病的个体在溶酶体中具有积累的材料。表1中列出了示例性的溶酶体贮积病。
溶酶体酶：如本文所使用的，术语“溶酶体酶”是指能够减少哺乳动物溶酶体中积累的材料或者能够挽救一种或多种溶酶体贮积病症状或使其转佳的任何酶。适合于本发明的溶酶体酶包括野生型或修饰的溶酶体酶并且能够使用重组和合成方法产生或者可以从天然来源纯化。表1中列出了示例性的溶酶体酶。
间隔区：如本文所使用的，术语“间隔区”(还称为“接头”)是指融合蛋白中两个蛋白部分之间的肽序列。间隔区通常设计为柔性的或设计为插入至两个蛋白部分之间的如α-螺旋的结构中。间隔区可以相对较短，如序列Gly-Ala-Pro(SEQ ID NO：4)或Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro(SEQ ID NO：5)，或者能够更长，如，例如，长度为10-25个氨基酸。
治疗有效量：如本文所使用的，术语“治疗有效量”是指以适用于任何医学治疗的合理获益/风险比对所治疗的受试者起治疗效果的靶向的治疗性融合蛋白的量。治疗效果可以是客观的(即，通过一些测试或标志物测量)或者可以是主观的(即，受试者给出效果说明或感受效果)。具体地，“治疗有效量”是指对治疗、转佳或预防所需疾病或病况有效，或表现出可检测的治疗或预防效果的治疗性融合蛋白或组合物的量，如通过转佳与所述疾病有关的症状、预防或延缓所述疾病的发病和/或还减轻了所述疾病症状的严重程度或频率。通常以可以包含多个单位剂量的剂量方案给予治疗有效量。对于任何特定的治疗性融合白质，可以例如根据给药途径、与其它药剂的组合来改变治疗有效量(和/或有效剂量方案内的适当单位剂量)。同样，对于任何特定患者的具体治疗有效量(和/或单位剂量)可以取决于各种因素，包括：正在治疗的病症和该病症的严重程度；所使用的具体药剂的活性；所使用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康情况、性别和饮食；所使用的具体融合蛋白的给药时间、给药途径和/或分泌或代谢速率；治疗持续时间；以及医学领域中众所周知的类似因素。
治疗：如本文所使用的，术语“治疗(treatment)”(还为“治疗(treat)”或“正治疗(treating)”)是指部分或完全减轻、转佳、缓解、抑制、延缓特定疾病、病症和/或病况的一种或多种症状或特征的发生、减轻它们的严重程度和/或降低它们的发病率的治疗性融合蛋白的任何给药。这种治疗可以是对未表现出相关疾病、病症和/或病况迹象的受试者，和/或仅表现出所述疾病、病症和/或病况的早期迹象的受试者。可替换地或另外，这种治疗可以是对表现出相关疾病、病症和/或病况的一种或多种已确立迹象的受试者。例如，治疗可以是指改善了心脏状态(例如，提高舒张末期和/或收缩末期容量，或者减轻、转佳或预防通常在蓬珀病中所发现的进行性心肌病)或肺功能(例如，相对于基线量提高了哭喊肺活量、和/或使哭喊期间的氧减饱和正常)；改善了神经发育和/或运动技能(例如，提高AIMS得分)；降低患有所述疾病个体的组织中的糖原水平；或这些效果的任何组合。在一些实施方式中，治疗包括糖原清除的改善，特别是在与蓬珀病有关的心肌病的减轻或预防中。
如本申请中所使用的，术语“约”和“大约”等同使用。在本申请中使用的有或没有用约/大约修饰的任何数字均表示覆盖了相关领域的普通技术人员所理解的任何正常波动。
具体实施方式
本发明提供了基于不依赖于糖基化作用的溶酶体靶向(GILT)技术的用于靶向溶酶体酶的改善的方法和组合物。尤其是，本发明提供了抗弗林蛋白酶和/或对胰岛素受体具有降低或减少的结合亲和力的IGF-II突变蛋白并且提供了包含本发明的IGF-II突变蛋白的靶向的治疗性融合蛋白。本发明还提供了制备和使用其的方法。
将在随后的部分中详细地描述本发明的各个方面。以下部分的使用不意味着对本发明的限制。每个部分可以适用于本发明的任何方面。在本申请中，除非另有说明，否则使用“或”表示“和/或”。
溶酶体酶
适合于本发明的溶酶体酶包括能够降低哺乳动物溶酶体中所积累的材料或者能够挽救或转佳一种或多种溶酶体贮积病症状的任何酶。适合的溶酶体酶包括野生型或修饰的溶酶体酶并且能够使用重组或合成方法产生或者能够从天然来源纯化。表1中列出了示例性的溶酶体酶。
表1.溶酶体贮积病和相关的酶缺陷
Figure BDA0000039488110000101
在一些实施方式中，适合于本发明的溶酶体酶包括多肽序列，所述多肽序列具有与表1中所示的人酶的天然存在的多核苷酸序列50-100％的序列同一性，包括50、55、60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和100％的序列同一性，同时所述多肽序列仍编码能够降低哺乳动物溶酶体中所积累的材料或者能够挽救或转佳一种或多种溶酶体贮积病症状的蛋白。
就溶酶体酶序列来说，将“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在进行序列比对并且(在必要时)引入空隙以达到最大百分比序列同一性并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分后，与天然存在的人酶序列中的氨基酸残基相同的候选序列中的氨基酸残基的百分比。可以以在本领域技术之内的各种方式来实现用于确定百分比氨基酸序列同一性的比对，例如，使用公开可用的计算机软件，如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能够确定用于测量比对的适当参数，包括在要比较序列的全长范围内实现最大比对所需的任何算法。优选地，使用WU-BLAST-2软件来确定氨基酸序列同一性(Altschul等人，Methods in Enzymology 266，460-480(1996)；http://blast.wustl/edu/blast/README.html)。WU-BLAST-2使用了几种搜索参数，它们中的大部分设置为缺省值(系统设定值)。将可调参数设置为下列值：重叠长度＝1、重叠分数＝0.125、通用阈值(world threshold)(T)＝11。HSP得分(S)和HSP S2参数是动态值并且是由程序本身根据特定序列的组成所确定的，然而，可以调节最小值并且将其如上所述进行设置。
蓬珀病
一种示例性溶酶体贮积病为蓬珀病。蓬珀病是由分解糖原(用于提供能量的糖的储存形式)所需的酶酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)的缺乏所造成的罕见遗传性病症。蓬珀病还称为糖原贮积病II型、GSD II、II型糖原贮积病、糖原病II型、酸性麦芽糖酶缺乏症、α-1，4-葡萄糖苷酶缺乏症、弥漫性糖原性心肥大(cardiomegalia glycogenic diffusa)和心脏形式的全身糖原病。糖原的积累导致整个身体的进行性肌无力(肌病)并且影响各个身体组织，特别是在心脏、骨骼肌、肝、呼吸和神经系统中。
根据疾病发病的年龄和残余GAA的活力，蓬珀病所表现出的临床症状可以广泛不同。残余GAA活力与糖原累积的量和组织分布以及疾病的严重程度相关。婴儿发病的蓬珀病(低于正常GAA活力的1％)是最严重的形式，其特征在于张力减退、全身肌无力和肥厚型心肌病以及心脏和其它肌肉组织中的大量糖原累积。通常在出生后一年内，由于心肺衰竭而发生死亡。Hirschhorn et al.(2001)“Glycogen Storage Disease Type II：AcidAlpha-glucosidase(Acid Maltase)Deficiency”in Scriver et al.，eds.，The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease，8th Ed.，New York：McGraw-Hill，3389-3420。少年发病(正常GAA活力的1-10％)和成年发病(正常GAA活力的10-40％)的蓬珀病在临床上是更加不相同的，其在发病年龄、临床表现和疾病进展方面显著不同。少年和成年发病的蓬珀病的特征一般在于缺少严重的心脏参与(cardiac involvement)、发病年龄推迟和疾病进展减慢，但是最终的呼吸或四肢肌肉参与导致了显著的病态和死亡率。尽管期望寿命可以不同，但是通常由于呼吸衰竭而发生死亡。Hirschhorn et al.(2001)“Glycogen Storage Disease Type II：AcidAlpha-glucosidase(Acid Maltase)Deficiency，”in Scriver et al.，eds.，The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease，8th Ed.，New York：McGraw-Hill，3389-3420。
适合于治疗蓬珀病的GAA酶包括野生型人GAA或保留了切割直链寡糖中α1-4键的能力的所述野生型人GAA的片段或序列变体。
酶替代疗法
酶替代疗法(ERT)是通过将缺失的酶注入到血流中以纠正酶缺乏的治疗策略。当血液灌注患者组织时，细胞吸收了酶并将其运输到溶酶体中，在溶酶体中所述酶起作用以消除由于酶缺乏而在溶酶体中积累的材料。为了使溶酶体酶替代疗法有效，必须将治疗性酶运输到贮积缺陷明显的组织中的适当细胞中的溶酶体中。使用天然连接到蛋白质上的碳水化合物与靶细胞表面上的特异受体结合以提供常规溶酶体酶替代疗法。由于在大多数细胞类型的表面上存在CI-MPR，因此对于靶向替代溶酶体酶来说，一种受体，非阳离子依赖型M6P受体(CI-MPR)是特别有用的。
术语“非阳离子依赖型甘露糖-6-磷酸受体(CI-MPR)”、“M6P/IGF-II受体”、“CI-MPR/IGF-II受体”、“IGF-II受体”或“IGF2受体”或它们的缩写在本文中替换使用，表示与M6P和IGF-II结合的细胞受体。
不依赖于糖基化作用的溶酶体靶向
我们已经开发了不依赖于糖基化作用的溶酶体靶向(GILT)技术以将治疗性酶靶向溶酶体。具体地，GILT技术使用肽标记来代替M6P以与CI-MPR结合用于溶酶体靶向。通常，GILT标记是以不依赖于甘露糖-6-磷酸的方式与CI-MPR结合的蛋白质、肽或其它部分。有利地，该技术模拟了用于吸收溶酶体酶的正常生物机制，但是它以不依赖于甘露糖-6-磷酸的方式进行。
优选的GILT标记来源于人胰岛素样生长因子II(IGF-II)。人IGF-II是对CI-MPR具有高亲和力的配基，它还称为IGF-II受体。GILT标记的治疗性酶与M6P/IGF-II受体的结合将蛋白通过内吞途径靶向溶酶体。由于一旦分离了蛋白，则不需要进行进一步修饰，因此相对于涉及糖基化作用的方法，该方法具有包括简单和成本有效性在内的多种优势。
可以在美国公开号20030082176、20040006008、20040005309和20050281805中找到GILT技术和GILT标记的详细说明，将其全部教导内容以其整体作为参考并入本文。
抗弗林蛋白酶的GILT标记
在开发用于治疗溶酶体贮积病的GILT标记的溶酶体酶的过程中，变得显而易见的是在哺乳动物细胞中产生时IGF-II来源的GILT标记可以经受被弗林蛋白酶的溶蛋白性裂解(参见实施例部分)。弗林蛋白酶通常识别并切割具有共有序列Arg-X-X-Arg(SEQ ID NO：2)的切割位点，X为任何氨基酸。切割位点位于所述序列中羧基末端的精氨酸(Arg)残基之后。在一些实施方式中，弗林蛋白酶切割位点具有共有序列Lys/Arg-X-X-X-Lys/Arg-Arg(SEQ ID NO：3)，X为任何氨基酸。切割位点位于所述序列中羧基末端的精氨酸(Arg)残基之后。如本文所使用的，术语“弗林蛋白酶”是指可以识别并切割如本文所定义的弗林蛋白酶切割位点的任何蛋白酶，其包括弗林蛋白酶或类弗林蛋白酶。弗林蛋白酶还被称为成对碱性氨基酸切割酶(PACE)。弗林蛋白酶属于包含PC3的类枯草杆菌蛋白酶前蛋白转化酶家族，它是负责胰岛细胞中胰岛素原成熟的蛋白酶。编码弗林蛋白酶的基因被称为FUR(FES上游区)。
以下显示了成熟人IGF-II的肽序列。
AYRPSETLCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPAS
Figure BDA0000039488110000131
IVEECCFRSCDLALLETYCATPAKSE(SEQ ID NO：1)
可以看出，成熟人IGF-II在残基34-40(加粗并加下划线)之间包含两个可能的重叠弗林蛋白酶切割位点。箭头指向两个可能的弗林蛋白酶切割位置。
我们已经开发了修饰的GILT标记，该GILT标记抗弗林蛋白酶切割并且仍保留了以不依赖于甘露糖-6-磷酸的方式与CI-MPR结合的能力。具体地，可以通过在一个或多个弗林蛋白酶切割位点处使氨基酸序列突变来设计抗弗林蛋白酶的GILT标记，使得所述突变消除了至少一个弗林蛋白酶切割位点。因此，在一些实施方式中，抗弗林蛋白酶的GILT标记是抗弗林蛋白酶的IGF-II突变蛋白，其包含消除了至少一个弗林蛋白酶切割位点或改变了邻近于弗林蛋白酶切割位点的序列的突变使得与野生型IGF-II肽(例如，野生型人成熟IGF-II)相比，防止、抑制、降低或减慢了弗林蛋白酶的切割。通常，适合的突变不影响抗弗林蛋白酶的GILT标记与人的非阳离子依赖型甘露糖-6-磷酸受体结合的能力。尤其是，适合于本发明的抗弗林蛋白酶的IGF-II突变蛋白以不依赖于甘露糖-6-磷酸的方式与人的非阳离子依赖型甘露糖-6-磷酸受体结合，其在pH 7.4下的离解常数为10-7M或更小(例如，10-8、10-9、10-10、10-11或更小)。在一些实施方式中，抗弗林蛋白酶的IGF-II突变蛋白包含在对应于SEQ ID NO：1的氨基酸30-40(例如，31-40、32-40、33-40、34-40、30-39、31-39、32-39、34-37、32-39、33-39、34-39、35-39、36-39、37-40、34-40)的区域内的突变。在一些实施方式中，适合的突变消除了至少一个弗林蛋白酶切割位点。突变可以是氨基酸取代、缺失、插入。例如，可以使用任何其它氨基酸取代在对应于SEQ ID NO：1的残基30-40(例如，31-40、32-40、33-40、34-40、30-39、31-39、32-39、34-37、32-39、33-39、34-39、35-39、36-39、37-40、34-40)的区域内的任何一个氨基酸或者可以使其缺失。例如，在位置34处的取代可能影响弗林蛋白酶对所述第一切割位点的识别。在每个识别位点内插入一个或多个另外的氨基酸可能会消除一个或两个弗林蛋白酶切割位点。退化位置中的一个或多个残基的缺失也可能会消除两个弗林蛋白酶切割位点。
在一些实施方式中，抗弗林蛋白酶的IGF-II突变蛋白包含在对应于SEQ ID NO：1的Arg37或Arg40的位置处的氨基酸取代。在一些实施方式中，抗弗林蛋白酶的IGF-II突变蛋白包含在位置Arg37或Arg40处的Lys或Ala取代。其它取代也是可能的，包括在两个位置37和40处的Lys和/或Ala突变的组合，或者除了Lys或Ala以外的氨基酸的取代。
在一些实施方式中，适合于本发明的抗弗林蛋白酶的IGF-II突变蛋白可以包含另外的突变。例如，可以改变多达30％或更多的SEQ ID NO：1的残基(例如，可以改变多达1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％或更多的残基)。因此，适合于本发明的抗弗林蛋白酶的IGF-II突变蛋白可以具有与SEQ ID NO：1至少70％(包括至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％)相同的氨基酸序列。
在一些实施方式中，将适合于本发明的抗弗林蛋白酶的IGF-II突变蛋白特异地靶向CI-MPR。IGF-II多肽中的突变是特别有用的，所述突变产生了与CI-MPR具有高亲和力地结合(例如，在pH 7.4下离解常数为10-7M或更小)的蛋白，而相对于天然IGF-II，所述蛋白与已知与IGF-II结合的其它受体结合的亲和力降低。例如，可以修饰适合于本发明的抗弗林蛋白酶的IGF-II突变蛋白，从而相对于天然存在的人IGF-II对IGF-I受体的亲和力，所述IGF-II突变蛋白对IGF-I受体具有减小的结合亲和力。例如，用Leu取代IGF-II残基Tyr27、用Val取代Leu43或者用Phe取代Ser26，分别将IGF-II对IGF-I受体的亲和力减小了94、56和4倍(Torres等人，(1995)J.Mol.Biol.248(2)：385-401)。人IGF-II的残基1-7的缺失导致对人IGF-I受体的亲和力降低了30倍，并且同时使对大鼠IGF-II受体的亲和力提高了12倍(Hashimoto等人，(1995)J.Biol.Chem.270(30)：18013-8)。IGF-II的NMR结构显示Thr7位于残基48Phe和50Ser的附近以及靠近9Cys-47Cys的二硫桥键。据认为，Thr7与这些残基的相互作用可以稳定IGF-I受体结合所需的柔性N-末端六肽(Terasawa等人，(1994)EMBO J.13(23)5590-7)。同时，这种相互作用可以调整对IGF-II受体的结合。IGF-II的C末端截短(残基62-67)似乎还将IGF-II对IGF-I受体的亲和力降低了5倍(Roth等人，(1991)Biochem.Biophys.Res. Commun.181(2)：907-14)。
IGF-I和非阳离子依赖型M6P受体的结合表面位于IGF-II的不同的面上。基于结构和突变数据，可以构建明显小于人IGF-II的功能性非阳离子依赖型M6P结合域。例如，氨基末端的氨基酸(例如，1-7或2-7)和/或羧基末端残基62-67可以缺失或被替代。另外，有可能可以消除或替代氨基酸29-40而不改变其余多肽的折叠或与非阳离子依赖型M6P受体的结合。因此，可以构建包含氨基酸8-28和41-61的靶向部分。这些氨基酸拉伸可能可以直接连接或通过接头隔开。可替换地，可以在不同的多肽链上设置氨基酸8-28和41-61。与IGF-II同源并且具有与IGF-II的结构密切相关的三级结构的胰岛素的可比较域具有足够的结构信息以允许正确重折叠为适当的三级结构，即使是存在于不同的多肽链中时(Wang等人，(1991)Trends Biochem.Sci.279-281)。因此，例如，可以将氨基酸8-28或其保守取代变体融合到溶酶体酶中；所得到的融合蛋白可以与氨基酸41-61或其保守取代变体混合并且可以给予患者。
还可以修饰IGF-II以使得与血清IGF结合蛋白的结合减到最少(Baxter(2000)Am.J.Physiol Endocrinol Metab.278(6)：967-76)从而避免了IGF-II/GILT构件的隔绝(sequestration)。多项研究已经定位了结合IGF结合蛋白所必需的IGF-II中的残基。可以就保留了与M6P/IGF-II受体结合的高亲和力以及就对IGF结合蛋白的亲和力降低对在这些残基处具有突变的构件进行筛选。例如，据报道用Ser替代IGF-II的Phe26降低了IGF-II对IGFBP-1和-6的亲和力并且对与M6P/IGF-II受体的结合没有影响(Bach等人，(1993)J.Biol.Chem.268(13)：9246-54)。如用Lys替代Glu 9的其它取代也可以是有利的。在对IGF-II高度保守的IGF-I的区域中，单独或组合的类似突变导致IGF-BP结合的大幅降低(Magee等人，(1999)Biochemistry 38(48)：15863-70)。
可替换的方法是为了鉴别可以与M6P/IGF-II受体高具有亲和力结合的IGF-II的最小区域。参与IGF-II与M6P/IGF-II受体结合的残基主要聚集在IGF-II的一面(Terasawa等人，(1994)EMBO J.13(23)：5590-7)。尽管通常通过三个分子内二硫键来保持IGF-II的三级结构，但是可以设计加入了IGF-II的M6P/IGF-II受体结合表面上的氨基酸序列的肽以正确折叠并且具有结合活力。这种最小的结合肽是高度优选的溶酶体靶向域。例如，优选的溶酶体靶向域是人IGF-II的氨基酸8-67。与M6P/IGF-II受体结合的基于氨基酸48-55周围区域所设计的肽也是所期望的溶酶体靶向域。可替换地，可以通过酵母双杂交测定或通过噬菌体显示型测定就与M6P/IGF-II受体结合的能力对随机肽库进行筛选。
对胰岛素受体的结合亲和力
本申请的发明人出乎意料地发现本文所述的多种抗弗林蛋白酶的IGF-II突变蛋白对胰岛素受体具有降低或减小的结合亲和力。因此，在一些实施方式中，相对于天然存在的人IGF-II对胰岛素受体的亲和力，适合于本发明的肽标记对胰岛素受体具有降低或减小的结合亲和力。在一些实施方式中，适合于本发明的对胰岛素受体具有降低或减小的结合亲和力的肽标记包括对胰岛素受体的结合亲和力比野生型成熟人IGF-II的亲和力低大于1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、12倍、14倍、16倍、18倍、20倍、50倍、100倍的肽标记。可以使用本领域已知的各种体外和体内测定来测量对胰岛素受体的结合亲和力。在实施例部分描述了示例性的结合测定。
诱变
可以通过将适当的核苷酸变化引入到IGF-II DNA中或通过合成所期望的IGF-II多肽来制备IGF-II突变蛋白。例如，可以使用例如在美国专利号5,364,934中所陈述的用于保守和非保守突变的任何技术和准则来进行IGF-II序列的变化。变化可以是编码IGF-II的一个或多个密码子的取代、缺失或插入，与天然存在的成熟人IGF-II序列相比，其导致IGF-II的氨基酸序列发生变化。氨基酸取代可以是用具有类似结构和/或化学性质的另一种氨基酸替代一种氨基酸的结果，如用丝氨酸替代亮氨酸，即，保守的氨基酸替代。氨基酸取代还可以是用具有不相似的结构和/或化学性质的另一种氨基酸替代一种氨基酸的结果，即，非保守的氨基酸替代。插入或缺失可以任选地在1-5个氨基酸的范围内。可以通过在所述序列中系统地进行氨基酸的插入、缺失或取代并且以本领域已知的体内或体外测定(如，对CI-MPR的结合测定或弗林蛋白酶切割测定)测试所产生的变体的活力来确定所允许的变化。
还可以使用扫描氨基酸分析来沿着连续序列鉴别一个或多个氨基酸。在优选的扫描中，氨基酸为相对较小的中性氨基酸。这样的氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸。由于丙氨酸消除了除了β碳以外的侧链并且几乎不可能改变变体的主链构象，因此丙氨酸通常是在该组中优选的扫描氨基酸。还由于丙氨酸是最常见的氨基酸，因此丙氨酸通常也是优选的。此外，它经常在埋藏和暴露的位置中找到[Creighton，The Proteins，(W.H.Freeman & Co.，N.Y.)；Chothia，J.Mol.Biol.，150：1(1976)]。如果丙氨酸取代不能产生足够量的变体，则可以使用等排(isoteric)氨基酸。
可以使用本领域已知的方法进行所述改变，如寡核苷酸介导的(位点定向)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变。可以对克隆DNA实施位点定向诱变[Carter等人，Nucl.Acids Res.，13：4331(1986)；Zoller等人，Nucl.Acids Res.，10：6487(1987)]、盒式诱变[Wells等人，Gene， 34：315(1985)]、限制选择诱变(restriction selection mutagenesis)[Wells等人，Philos.Trans.R.Soc.London SerA，317：415(1986)]或其它已知技术来产生IGF-II突变蛋白。
间隔区
可以将抗弗林蛋白酶的GILT标记融合到编码溶酶体酶的多肽的N-末端或C-末端。可以将GILT标记直接融合到溶酶体酶多肽或者可以通过接头或间隔区与溶酶体酶多肽分开。通常将氨基酸接头或间隔区设计为柔性的或者设计为插入到两个蛋白质部分之间的如α-螺旋的结构中。接头或间隔区可以相对较短，如序列Gly-Ala-Pro(SEQ ID NO：4)或Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro(SEQ ID NO：5)，或者可以更长，如，例如，长度为10-25个氨基酸。应当小心选择融合连接的位点以促进正确的折叠和提高两个融合配偶体(部分，partner)的活力并防止肽标记与GAA多肽的过早分离。在一个优选的实施方式中，所述接头序列为Gly-Ala-Pro(SEQID NO：4)。
在美国公开号20050244400中详细说明了可以在本发明的方法和组合物中使用的GILT标记的GAA蛋白的其它构件，将其全部公开内容作为参考并入本文。
细胞
根据本发明可以使用对细胞培养和多肽表达敏感的任何哺乳动物细胞或细胞类型，如，例如，人胚肾(HEK)293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、猴肾(COS)细胞、HT1080、C10、HeLa、幼仓鼠肾(BHK)细胞、3T3、C127、CV-1、HaK、NS/O和L-929细胞。可以根据本发明使用的哺乳动物细胞的非限制性实例包括，但不限于，BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系(NSO/1，ECACC No：85110503)；人成视网膜细胞(PER.C6(CruCell，Leiden，The Netherlands))；SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚肾系(亚克隆的用于在悬浮培养物中生长的293或293细胞，Graham等人，J.Gen Virol.，36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)；中国仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216(1980))；小鼠塞尔托利细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.，23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1 587)；人宫颈癌细胞(HeLa，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCCCRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.，383：44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌系(Hep G2)。在一些实施方式中，从CHO细胞系产生了本发明的融合蛋白。
还可以在多种非哺乳动物宿主细胞中表达本发明的融合蛋白，所述非哺乳动物宿主细胞如，例如，昆虫(例如，Sf-9、Sf-21、Hi5)、植物(例如，豆科(Leguminosa)、谷类或烟草)、酵母(例如，酿酒酵母(S.cerivisae)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris))、原核生物(例如，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和其它杆菌属(Bacillus spp.)、假单胞菌属(Pseudomonasspp.)、链霉菌属(Streptomyces spp.))或真菌。
在一些实施方式中，可以在弗林蛋白酶缺陷型细胞中生产具有或不具有抗弗林蛋白酶的GILT标记的融合蛋白。如本文所使用的，术语“弗林蛋白酶缺陷型细胞”是指其弗林蛋白酶活力被抑制、降低或消除的任何细胞。弗林蛋白酶缺陷型细胞包括不产生弗林蛋白酶或产生降低的量或产生缺陷型弗林蛋白酶的哺乳动物和非哺乳动物细胞。技术人员已知并且可用的示例性弗林蛋白酶缺陷型细胞包括，但不限于，FD11细胞(Gordon等人，(1997)Infection and Immunity，65(8)：3370-3375)，以及在Moebring和Moehring(1983)Infection and Immunity，41(3)：998-1009中描述的那些突变体细胞。可替换地，可以通过以下步骤获得弗林蛋白酶缺陷型细胞：将上述哺乳动物和非哺乳动物细胞暴露于诱变处理，例如，辐照、溴化乙锭、溴化尿苷(BrdU)等，优选化学诱变，并且更优选甲磺酸乙酯诱变；回收在该处理中存活的细胞并且选择发现对假单胞菌外毒素A的毒性耐受的那些细胞(参见Moehring和Moehrin，(1983)Infection and Immunity，41(3)：998-1009)。
低糖基化(Underglycosylation)
本发明的靶向的治疗性蛋白可以是低糖基化的，即优选省略、除去、修饰或掩蔽了通常存在于天然存在的人蛋白质上的一个或多个碳水化合物结构。不希望受任何理论的约束，考虑了低糖基化的蛋白质可以延长哺乳动物中所述蛋白质的半衰期。可以以多种方式实现低糖基化。在一些实施方式中，可以使用分泌型信号肽来生产本发明的靶向的融合蛋白以便于所述融合蛋白的分泌。例如，可以使用IGF-II信号肽产生融合蛋白。一般说来，与野生型酶相比，使用IGF-II信号肽所生产的融合蛋白在蛋白表面上具有降低的甘露糖-6-磷酸(M6P)水平。在一些实施方式中，蛋白质可以是完全低糖基化的(如在大肠杆菌中合成时)，部分低糖基化的(如在通过位点定向诱变破坏了一个或多个糖基化位点后在哺乳动物系统中合成时)，或者可以具有非哺乳动物的糖基化模式。例如，可以通过定向诱变来修饰、取代或消除一个或多个糖基化位点从而产生低糖基化的融合蛋白。例如，野生型GAA通常具有与N连接糖基化作用的标准识别序列相匹配的七个位点，Asn-Xaa-Thr/Ser(SEQ ID NO：7)(Xaa可以是Pro以外的任何残基)，即Asn-140、-233、-390、-470、-652、-882和-925(Hoefsloot等人，1988；Martiniuk等人，1990b)。可以改变或消除上述位置处的一个或多个Asn以产生低糖基化的GAA。在一些实施方式中，可以将Asn改变为Gln。
在一些实施方式中，可以在合成之后使治疗性融合蛋白去糖基化。例如，可以通过化学或酶处理进行去糖基化，并且所述去糖基化可以导致完全去糖基化，或者如果只除去了一部分碳水化合物结构，则可以导致部分去糖基化。
在一些实施方式中，例如通过氧化和还原修饰了溶酶体酶的糖基化，从而降低了治疗性蛋白从血液中的清除。例如，可以通过高碘酸盐处理使溶酶体酶去糖基化。尤其是，使用高碘酸盐和如硼氢化钠的还原剂的处理对大部分糖蛋白的碳水化合物结构的修饰是有效的。高碘酸盐处理使邻位二醇(vicinal diol)氧化，从而断裂了碳-碳键并且用醛基替代了羟基；硼氢化物将所述的醛还原为羟基。例如，在1mM的浓度下，高碘酸盐专门氧化唾液酸基团，而在10mM或以上，所有可用的邻位二醇均被转化为醛(Hermanson，G.T.1996，Bioconjugate techniques.Academic press)。一旦形成，则醛基是高度反应性的并且可以与蛋白质中的伯胺基基团形成席夫碱键导致分子内交联。因此，所形成的醛基应当被还原为醇基。通常使用的还原剂为NaBH4并且该反应最好在碱性条件下进行。因此，通过这种处理使包括邻位二醇的多个糖残基断裂。然而，尽管这种处理将环状碳水化合物转变为直链碳水化合物，但是它不能完全除去所述的碳水化合物，从而使可能暴露蛋白酶敏感位点或抗原性多肽位点的风险降到最小。
Grubb，J.H.等人(Grubb等人，2008，PNAS 105：2616)报道了用偏高碘酸钠处理人β-葡糖醛酸糖苷酶并接着用硼氢化钠还原。修饰的β-葡糖醛酸糖苷酶保留了90％的活力，但是损失了甘露糖和甘露糖-6-磷酸依赖型受体吸收活力。由于如Grubb等人所描述的硼氢化钠试剂，所以在还原中使用的碱性pH条件不适合于所有溶酶体酶，其中多种溶酶体酶在碱性条件下不稳定。
因此，在一些实施方式中，将氰基硼氢化钠用作还原剂。尽管氰基硼氢化物对醛的还原速率在中性pH或以上是可以忽略的，但是反应速度在酸件pH下变快(Borch等人，1971，JACS 93：2897)。例如，使用偏高碘酸钠和氰基硼氢化物的方案可以在pH 3.5-4下使用。
例如，在pH 5.6下用高碘酸盐和氰基硼氢化物处理分别在蓬珀病和法布里病中缺乏酶的GAA或α半乳糖苷酶A，得到了良好的酶活力恢复。将酶与相等体积的在0.1M乙酸钠(pH 5.6)中的包含20mM偏高碘酸钠和40mM氰基硼氢化钠的混合物在冰上培育60分钟。用甘油(10％的最终浓度)使未反应的高碘酸盐在冰上淬火15分钟。使用Amicon离心过滤器装置通过渗滤将蛋白质最终交换到pH 6.2的磷酸盐缓冲盐水中。其它还原剂(例如，二甲胺硼烷)也可以用于在酸性条件下还原由糖蛋白(如GAA)的偏高碘酸钠氧化所产生的醛。
因此，在一些实施方式中，偏高碘酸钠处理的GAA的还原包括在从pH.0到pH 6的酸性pH下使用氰基硼氢化钠。可以通过使用两种测定容易地确定化学修饰的最佳条件，所述两种测定为与ConA琼脂糖结合的损失和J774E巨噬细胞吸收的减少。
例如，将高碘酸盐/硼氢化物修饰的β-葡糖醛酸糖苷酶对ConA琼脂糖的结合能力与未处理的β-葡糖醛酸糖苷酶进行比较。在室温下，将酶在20mM的Tris-HCl，pH 6.8，0.5M NaCl中与50μL的ConA珠一同培育15分钟。对珠以最大速度离心15秒。小心地取出上清液(流过)，对其进行GUS活力测定并用SDS/PAGE分析。当我们完全按照Grubb等人的报道处理GUS时，损失了60％的ConA结合活力并且未结合的GUS仅存在于高碘酸盐处理的并随后用硼氢化钠还原的样品的流过液中。
治疗性蛋白的给药
根据本发明，通常将本发明的治疗性蛋白单独给予个体，或以包含治疗性蛋白的组合物或药剂(例如，在用于治疗疾病的药剂制备中)给予个体，如本文所述的。可以将组合物与生理可用的载体或赋形剂一起配制以制备药物组合物。载体和组合物可以是无菌的。剂型应当与给药模式相适合。
适合的药用载体包括，但不限于，水、盐溶液(例如，NaCl)、盐水、缓冲盐水、醇类、甘油、乙醇、阿拉伯胶、植物油、苯甲醇、聚乙二醇、明胶、如乳糖的碳水化合物、直链淀粉或淀粉、如甘露醇、蔗糖等的糖、葡萄糖、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮等，以及它们的组合。如果需要，药物制剂可以与不会不利地与活性化合物反应或干扰它们活性的助剂(例如，润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳香族物质等)混合。在优选的实施方式中，使用了适合于静脉给药的水溶性载体。
如果需要，组合物或药剂还可以包含少量的润湿或乳化剂或pH缓冲剂。组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳浊液、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂或散剂。还可以将组合物与常规粘结剂和如甘油三酯的载体一起配制为栓剂。口服制剂可以包含标准载体，如药品级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯基吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
可以根据常规方法将组合物或药剂配制成适合于给予人类的药物组合物。例如，在一个优选的实施方式中，用于静脉给药的组合物通常是在无菌、等渗的水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可以包含增溶剂和局部麻醉剂以减轻注射部位的疼痛。通常，以单位剂量形式将成分单独或混合在一起提供，例如，作为在密封地密闭容器(如指示活力剂的量的安瓿或小袋)中的冻干粉末或无水浓缩物。在通过输注给予组合物的情况下，可以使用包含无菌的药品级水、盐水或葡萄糖/水的输液瓶进行分配。在通过注射给予组合物的情况下，可以提供灭菌注射水或盐水的安瓿使得所述成分可以在给药之前进行混合。
可以将治疗性蛋白配制为中性或盐的形成。药用盐包括与自由氨基基团所形成的那些盐，如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些盐，和与自由羧基基团所形成的那些盐，如来源于氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些盐。
通过任何适当的途径给予治疗性蛋白(或包含治疗性蛋白的组合物或药剂)。在一个优选实施方式中，静脉给以治疗性蛋白。在其它实施方式中，通过直接向靶组织给药而给予治疗性蛋白，所述靶组织如心脏或肌肉(例如，肌内)或神经系统(例如，直接注射到脑中；心室内；鞘内)。可替换地，可以肠胃外、经皮或经粘膜(例如，口或鼻)给予治疗性蛋白(或包含治疗性蛋白的组合物或药剂)。如果需要，可以同时使用多于一种的途径。
可以单独或与其它药剂结合给予治疗性蛋白(或包含治疗性蛋白的组合物或药剂)，所述其它药剂如抗组胺剂(例如，苯海拉明)或免疫抑制剂或抑制抗GILT标记的溶酶体酶抗体的其它免疫治疗剂。术语“结合”表示在治疗性蛋白(或包含治疗性蛋白的组合物或药剂)之前，大致同时或之后给予药剂。例如，可以将药剂混入到含有治疗性蛋白的组合物中，并借此与治疗性蛋白同时给予；可替换地，可以同时给予药剂而不混合(例如，通过还给予治疗性蛋白的静脉注射管来“借道”输送药剂，或反之亦然)。在另一个实例中，可以分别给予药剂(例如，不混合)，但是在给予治疗性蛋白的较短时间段内(例如，24小时内)。
以治疗有效量(即，当以一定时间间隔给药时，足以治疗疾病的剂量，如通过转佳与疾病有关的症状、预防或延缓疾病的发病和/或还减轻疾病症状的严重程度或频率，如上所述的)给予治疗性蛋白(或包含治疗性蛋白的组合物或药剂)。对于疾病的治疗将是治疗有效的剂量将取决于疾病影响的性质和程度，并且可以通过标准临床技术确定。另外，使用本领域已知的方法，可以任选地使用体外或体内测定以帮助鉴别最佳剂量范围。要使用的精确剂量还将取决于给药途径和疾病的严重性，并且应当根据医师的判断和每个患者的情况来决定。可以通过从体外或动物模型测试系统获得的剂量反应曲线来外推有效剂量。治疗有效剂量可以是，例如，约0.1-1mg/kg、约1-5mg/kg、约5-20mg/kg、约20-50mg/kg或20-100mg/kg。根据个体的需要，特定个体的有效剂量可以随时间变化(例如，增加或减少)。例如，在身体性疾病或压力的情况下，或者如果疾病症状恶化，则可以提高剂量。
根据疾病影响的性质和程度，并且根据进行的基础，以一定的时间间隔给予治疗有效量的治疗性蛋白(或包含治疗性蛋白的组合物或药剂)。如本文所使用的，以“时间间隔”给药表示治疗有效量是周期给予的(与一次性剂量不同)。可以通过标准临床技术来确定时间间隔。在一些实施方式中，治疗性蛋白为每两月给予一次、每月给予一次、每月给予两次、每三周给予一次、每两周给予一次、每周给予一次、每周给予两次、每周给予三次或每天给予一次。对于单一个体，给药时间间隔不需要是固定的时间间隔，并且取决于个体的需要可以随时间进行改变。例如，在身体性疾病或压力的情况下，或者如果疾病症状恶化，则可以缩短剂量之间的时间间隔。
如本文所使用的，术语“每两月一次”表示每两个月给药一次(即，每两个月一次)；术语“每月一次”表示每个月给药一次；术语“每三周一次”表示每三周给药一次(即，每三周一次)；术语“每两周一次”表示每两周给药一次(即，每两周一次)；术语“每周一次”表示每周给药一次；以及术语“每天一次”表示每天给药一次。
本发明另外涉及在具有标签的容器(例如，小瓶、瓶、用于静脉给药的袋、注射器等)中包含如本文所描述的治疗性蛋白的药物组合物，该标签包含了用于给予所述组合物治疗蓬珀病(如通过本文所描述的方法)的说明。
将通过下列实施例进一步并且更具体地描述本发明。然而，所包括的实施例出于说明目的而不是限制。
实施例
实施例1：弗林蛋白酶切割基于GILT标记的IGF-II
已开发了ZC-701用于治疗蓬珀病。ZC-701是嵌合蛋白，该嵌合蛋白包含通过三个氨基酸的间隔区融合到人酸性α-葡萄糖苷酶(hGAA)的残基70-952上的基于GILT标记的N末端IGF-II。具体地，ZC-701包含人IGF-II的氨基酸1和8-67(即，成熟人IGF-II的Δ2-7)，间隔区序列Gly-Ala-Pro和人GAA的氨基酸70-952。以下显示了全长的氨基酸序列。间隔区序列被加粗。序列N末端至间隔区序列表现为人IGF-II的氨基酸1和8-67，而序列C末端至间隔区序列表现为人GAA的氨基酸70-952。在IGF-II标记序列内的两个可能的重叠弗林蛋白酶切割位点被加粗并加下划线。箭头指向两个可能的弗林蛋白酶切割位置。
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Figure BDA0000039488110000221
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在开发ZC-701的过程中，变得显而易见的是，在CHO细胞中在生产时一部分ZC-701分子上的IGF-II来源的GILT标记经受被弗林蛋白酶的溶蛋白性裂解。批次10-2-F45-54的ZC-701的N末端分析表明了存在两个n-末端序列。一个符合ZC-701的预测的n-末端，其指示存在所预测的ZC-701蛋白。将另一个n-末端序列与ZC-701的标记部分内的序列进行比对，其表明存在与ZC-701的氨基酸残基34处的内溶蛋白性裂解一致的ZC-701衍生物。基于两个n-末端估计的摩尔比，发现这批ZC-701具有约1∶1比率的完整和切割的物质。
一旦获得该结果，就对其它批次中的每批的ZC-701进行n-末端测序。所有批次均显示出相同的两个n-末端，其中所切割的物质在总化合物的20-50％的范围内。先前表现出具有较低吸收活力的一个批次显示出指示另外的蛋白水解(蛋白酶解)的一组n-末端。我们得到以下结论：在所有ZC-701批次中用于产生第二物质的蛋白水解事件是通过弗林蛋白酶或类弗林蛋白酶造成的。
图1显示了ZC-701的氨基末端的图。两个加框的氨基酸残基为在所有ZC-701批次中出现的n-末端位点。第一N-末端为信号肽切割位点，其产生了所预测的ZC-701的n-末端。而第二加框的残基是不期望的溶蛋白性裂解事件的位点。邻近于切割位点的氨基酸序列为Arg-Arg-Ser-Arg(SEQ ID NO：9)。这与CHO细胞中存在的称为弗林蛋白酶的蛋白酶的标准切割位点相匹配，其在Arg-X-X-Arg(SEQ ID NO：10)之后切割。弗林蛋白酶是包含PC3的激素原转化酶家族的成员，负责胰岛细胞中胰岛素原成熟的蛋白酶。事实上，胰岛素原中的PC3切割位点是保守的并且与弗林蛋白酶切割IGF-II标记的位点相同。
弗林蛋白酶切割的ZC-701在分子量上与完整ZC-701相差约3000道尔顿，这表示在分子量方面相差低于3％。由于蛋白质中寡糖的异质性，所以，先前通过SDS-PAGE未检测到存在切割的ZC-701。然而，如果首先通过使用肽N-糖苷酶F(PNGase F)的处理使ZC-701去糖基化，那么就可以通过SDS-PAGE将切割的蛋白质与完整ZC-701分辨开。
如图2中所示，SDS-PAGE凝胶中的泳道1显示了去糖基化的纯化的ZC-701的电泳图。明显有两条条带。认为上方的条带是完整的ZC-701，而认为下方条带是弗林蛋白酶切割的ZC-701。为了证明下方条带的确是弗林蛋白酶切割的ZC-701，首先用弗林蛋白酶处理与加载到泳道1中相同的蛋白质，然后再加载到泳道2中。如图2所示，泳道2中的所有蛋白与泳道1中的下方条带共迁移，这表明下方条带确实是弗林蛋白酶切割的ZC-701。
我们已通过量化SDS-PAGE中的条带强度并且通过量化N末端测序实验中释放的氨基酸估计了多个批次的ZC-701中被弗林蛋白酶切割的ZC-701的比例。如以上所讨论的，不同批次中切割的ZC-701的分数在20％至50％的范围内。
实施例2.包含基于GILT标记的抗弗林蛋白酶的IGF-II的靶向的融合蛋 白
我们可以通过改变IGF-II的氨基酸序列围绕弗林蛋白酶切割的问题进行设计使得氨基酸的改变消除了至少一个弗林蛋白酶切割位点。产生了一系列的ZC-701突变体形式，并且对抗弗林蛋白酶切割进行测定。如下所述，产生了ZC-701的示例性突变体形式。
ZC-701
使用所述盒的Asp718和NotI位点以及载体pCEP4克隆了以下的GILTΔ2-7-GAA70-952盒以产生pCEP-GILTΔ2-7-GAA70-952(质粒p701)。用于克隆的限制位点为小写加粗的。间隔区氨基酸序列Gly、Ala、Pro(加下划线的序列)将GAA基因与GILTΔ2-7标记(大写的序列)分开。该间隔区和标记位于GAA残基Ala70的上游。
Figure BDA0000039488110000241
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Figure BDA0000039488110000251
(SEQ ID NO：11)
构件1459
使用所述盒的Asp718和NotI位点以及载体pCEP4克隆了以下的GILTΔ2-7/K37-GAA70-952盒以产生pCEP-GILTΔ2-7/K37-GAA70-952(质粒p1459)。用于克隆的限制位点为小写加粗的。间隔区氨基酸序列Gly、Ala、Pro(加下划线的序列)将GAA基因与GILTΔ2-7/K37标记(大写的序列)分开。该间隔区和标记位于GAA残基Ala70的上游。GILTΔ2-7/K37盒含有人IGF-II序列的氨基酸37处(大写加粗)的Lys对Arg的取代。
Figure BDA0000039488110000252
agctgctagcaagctaattcacaccaATGGGAATCCCAATGGGGAAGTCGATGCTGGTGCTTCTCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTCTGTGCGGCGGGGAGCTGGTGGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCCGCAAGCCGTGTGAGC
Figure BDA0000039488110000253
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Figure BDA0000039488110000261
(SEQ ID NO：12)
构件1460
使用所述盒的Asp718和NotI位点以及载体pCEP4克隆了以下的GILTΔ2-7/K40-GAA70-952盒以产生pCEP-GILTΔ2-7/K40-GAA70-952(质粒p1460)。用于克隆的限制位点为小写加粗的。间隔区氨基酸序列Gly、Ala、Pro(加下划线的序列)将GAA基因与GILTΔ2-7/K40标记(大写的序列)分开。该间隔区和标记位于GAA残基Ala70的上游。GILTΔ2-7/K40盒含有人IGF-II序列的氨基酸40处(大写加粗)的Lys对Arg的取代。
Figure BDA0000039488110000262
agctgctagcaagctaattcacaccaATGGGAATCCCAATGGGGAAGTCGATGCTGGTGCTTCTCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTCTGTGCGGCGGGGAGCTGGTGGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCCGCAAGCCGTGTGAGCCGTCGCAGC
Figure BDA0000039488110000263
GGCATCGTTGAGGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGTGACCTGGCCCTCCTGGAGACGTACTGTGCTACCCCCGCCAAGTCCGAGGGC GCGCCGgcacaccccggccgtcccagagcagtgcccacacagtgcgacgtcccccccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcacccaggaacagtgcgaggcccgcggctgctgctacatccctgcaaagcaggggctgcagggagcccagatggggcagccctggtgcttcttcccacccagctaccccagctacaagctggagaacctgagctcctctgaaatgggctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttcttccccaaggacatcctgaccctgcggctggacgtgatgatggagactgagaaccgcctccacttcacgatcaaagatccagctaacaggcgctacgaggtgcccttggagaccccgcgtgtccacagccgggcaccgtccccactctacagcgtggagttctctgaggagcccttcggggtgatcgtgcaccggcagctggacggccgcgtgctgctgaacacgacggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacctcgctgccctcgcagtatatcacaggcctcgccgagcacctcagtcccctgatgctcagcaccagctggaccaggatcaccctgtggaaccgggaccttgcgcccacgcccggtgcgaacctctacgggtctcaccctttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtgttcctgctaaacagcaatgccatggatgtggtcctgcagccgagccctgcccttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctacatcttcctgggcccagagcccaagagcgtggtgcagcagtacctggacgttgtgggatacccgttcatgccgccatactggggcctgggcttccacctgtgccgctggggctactcctccaccgctatcacccgccaggtggtggagaacatgaccagggcccacttccccctggacgtccaatggaacgacctggactacatggactcccggagggacttcacgttcaacaaggatggcttccgggacttcccggccatggtgcaggagctgcaccagggcggccggcgctacatgatgatcgtggatcctgccatcagcagctcgggccctgccgggagctacaggccctacgacgagggtctgcggaggggggttttcatcaccaacgagaccggccagccgctgattgggaaggtatggcccgggtccactgccttccccgacttcaccaaccccacagccctggcctggtgggaggacatggtggctgagttccatgaccaggtgcccttcgacggcatgtggattgacatgaacgagccttccaacttcatcaggggctctgaggacggctgccccaacaatgagctggagaacccaccctacgtgcctggggtggttggggggaccctccaggcggcaaccatctgtgcctccagccaccagtttctctccacacactacaacctgcacaacctctacggcctgaccgaagccatcgcctcccacagggcgctggtgaaggctcgggggacacgcccatttgtgatctcccgctcgacctttgctggccacggccgatacgccggccactggacgggggacgtgtggagctcctgggagcagctcgcctcctccgtgccagaaatcctgcagtttaacctgctgggggtgcctctggtcggggccgacgtctgcggcttcctgggcaacacctcagaggagctgtgtgtgcgctggacccagctgggggccttctaccccttcatgcggaaccacaacagcctgctcagtctgccccaggagccgtacagcttcagcgagccggcccagcaggccatgaggaaggccctcaccctgcgctacgcactcctcccccacctctacacgctgttccaccaggcccacgtcgcgggggagaccgtggcccggcccctcttcctggagttccccaaggactctagcacctggactgtggaccaccagctcctgtggggggaggccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaaggccgaagtgactggctacttccccttgggcacatggtacgacctgcagacggtgccaatagaggcccttggcagcctcccacccccacctgcagctccccgtgagccagccatccacagcgaggggcagtgggtgacgctgccggcccccctggacaccatcaacgtccacctccgggctgggtacatcatccccctgcagggccctggcctcacaaccacagagtcccgccagcagcccatggccctggctgtggccctgaccaagggtggagaggcccgaggggagctgttctgggacgatggagagagcctggaagtgctggagcgaggggcctacacacaggtcatcttcctggccaggaataacacgatcgtgaatgagctggtacgtgtgaccagtgagggagctggcctgcagctgcagaaggtgactgtcctgggcgtggccacggcgccccagcaggtcctctccaacggtgtccctgtctccaacttcacctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtctcgctgttgatgggagagcagtttctcgtcagctggtgttagtctagagcttgcta(SEQ ID NO：13)
构件1461
使用所述盒的Asp718和NotI位点以及载体pCEP4克隆了以下的GILTΔ2-7/A37-GAA70-952盒以产生pCEP-GILTΔ2-7/A37-GAA70-952(质粒p1461)。用于克隆的限制位点为小写加粗的。间隔区氨基酸序列Gly、Ala、Pro(加下划线的序列)将GAA基因与GILTΔ2-7/A37标记(大写的序列)分开。该间隔区和标记位于GAA残基Ala70的上游。GILTΔ2-7/A37盒含有人IGF-II序列的氨基酸37处(大写加粗)的Ala对Arg的取代。
Figure BDA0000039488110000281
agctgctagcaagctaattcacaccaATGGGAATCCCAATGGGGAAGTCGATGCTGGTGCTTCTCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTCTGTGCGGCGGGGAGCTGGTGGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCCGCAAGCCGTGTGAGCCGCAGCCGTGGCATCGTTGAGGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGTGACCTGGCCCTCCTGGAGACGTACTGTGCTACCCCCGCCAAGTCCGAGGGC GCGCCGgcacaccccggccgtcccagagcagtgcccacacagtgcgacgtcccccccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcacccaggaacagtgcgaggcccgcggctgctgctacatccctgcaaagcaggggctgcagggagcccagatggggcagccctggtgcttcttcccacccagctaccccagctacaagctggagaacctgagctcctctgaaatgggctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttcttccccaaggacatcctgaccctgcggctggacgtgatgatggagactgagaaccgcctccacttcacgatcaaagatccagctaacaggcgctacgaggtgcccttggagaccccgcgtgtccacagccgggcaccgtccccactctacagcgtggagttctctgaggagcccttcggggtgatcgtgcaccggcagctggacggccgcgtgctgctgaacacgacggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacctcgctgccctcgcagtatatcacaggcctcgccgagcacctcagtcccctgatgctcagcaccagctggaccaggatcaccctgtggaaccgggaccttgcgcccacgcccggtgcgaacctctacgggtctcaccctttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtgttcctgctaaacagcaatgccatggatgtggtcctgcagccgagccctgcccttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctacatcttcctgggcccagagcccaagagcgtggtgcagcagtacctggacgttgtgggatacccgttcatgccgccatactggggcctgggcttccacctgtgccgctggggctactcctccaccgctatcacccgccaggtggtggagaacatgaccagggcccacttccccctggacgtccaatggaacgacctggactacatggactcccggagggacttcacgttcaacaaggatggcttccgggacttcccggccatggtgcaggagctgcaccagggcggccggcgctacatgatgatcgtggatcctgccatcagcagctcgggccctgccgggagctacaggccctacgacgagggtctgcggaggggggttttcatcaccaacgagaccggccagccgctgattgggaaggtatggcccgggtccactgccttccccgacttcaccaaccccacagccctggcctggtgggaggacatggtggctgagttccatgaccaggtgcccttcgacggcatgtggattgacatgaacgagccttccaacttcatcaggggctctgaggacggctgccccaacaatgagctggagaacccaccctacgtgcctggggtggttggggggaccctccaggcggcaaccatctgtgcctccagccaccagtttctctccacacactacaacctgcacaacctctacggcctgaccgaagccatcgcctcccacagggcgctggtgaaggctcgggggacacgcccatttgtgatctcccgctcgacctttgctggccacggccgatacgccggccactggacgggggacgtgtggagctcctgggagcagctcgcctcctccgtgccagaaatcctgcagtttaacctgctgggggtgcctctggtcggggccgacgtctgcggcttcctgggcaacacctcagaggagctgtgtgtgcgctggacccagctgggggccttctaccccttcatgcggaaccacaacagcctgctcagtctgccccaggagccgtacagcttcagcgagccggcccagcaggccatgaggaaggccctcaccctgcgctacgcactcctcccccacctctacacgctgttccaccaggcccacgtcgcgggggagaccgtggcccggcccctcttcctggagttccccaaggactctagcacctggactgtggaccaccagctcctgtggggggaggccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaaggccgaagtgactggctacttccccttgggcacatggtacgacctgcagacggtgccaatagaggcccttggcagcctcccacccccacctgcagctccccgtgagccagccatccacagcgaggggcagtgggtgacgctgccggcccccctggacaccatcaacgtccacctccgggctgggtacatcatccccctgcagggccctggcctcacaaccacagagtcccgccagcagcccatggccctggctgtggccctgaccaagggtggagaggcccgaggggagctgttctgggacgatggagagagcctggaagtgctggagcgaggggcctacacacaggtcatcttcctggccaggaataacacgatcgtgaatgagctggtacgtgtgaccagtgagggagctggcctgcagctgcagaaggtgactgtcctgggcgtggccacggcgccccagcaggtcctctccaacggtgtccctgtctccaacttcacctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtctcgctgttgatgggagagcagtttctcgtcagctggtgttagtctagagcttgcta
Figure BDA0000039488110000291
(SEQ ID NO：14)
构件1463
使用所述盒的Asp718和NotI位点以及载体pCEP4克隆了以下的GILTΔ2-7/A40-GAA70-952盒以产生pCEP-GILTΔ2-7/A40-GAA70-952(质粒p1463)。用于克隆的限制位点为小写加粗的。间隔区氨基酸序列Gly、Ala、Pro(加下划线的序列)将GAA基因与GILTΔ2-7/A40标记(大写的序列)分开。该间隔区和标记位于GAA残基Ala70的上游。GILTΔ2-7/A40盒含有人IGF2序列的氨基酸40处(大写加粗)的Ala对Arg的取代。
Figure BDA0000039488110000292
agctgctagcaagctaattcacaccaATGGGAATCCCAATGGGGAAGTCGATGCTGGTGCTTCTCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTCTGTGCGGCGGGGAGCTGGTGGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCCGCAAGCCGTGTGAGCCGTCGCAGC
Figure BDA0000039488110000293
GGCATCGTTGAGGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGTGACCTGGCCCTCCTGGAGACGTACTGTGCTACCCCCGCCAAGTCCGAGGGC GCGCCGgcacaccccggccgtcccagagcagtgcccacacagtgcgacgtcccccccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcacccaggaacagtgcgaggcccgcggctgctgctacatccctgcaaagcaggggctgcagggagcccagatggggcagccctggtgcttcttcccacccagctaccccagctacaagctggagaacctgagctcctctgaaatgggctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttcttccccaaggacatcctgaccctgcggctggacgtgatgatggagactgagaaccgcctccacttcacgatcaaagatccagctaacaggcgctacgaggtgcccttggagaccccgcgtgtccacagccgggcaccgtccccactctacagcgtggagttctctgaggagcccttcggggtgatcgtgcaccggcagctggacggccgcgtgctgctgaacacgacggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacctcgctgccctcgcagtatatcacaggcctcgccgagcacctcagtcccctgatgctcagcaccagctggaccaggatcaccctgtggaaccgggaccttgcgcccacgcccggtgcgaacctctacgggtctcaccctttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtgttcctgctaaacagcaatgccatggatgtggtcctgcagccgagccctgcccttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctacatcttcctgggcccagagcccaagagcgtggtgcagcagtacctggacgttgtgggatacccgttcatgccgccatactggggcctgggcttccacctgtgccgctggggctactcctccaccgctatcacccgccaggtggtggagaacatgaccagggcccacttccccctggacgtccaatggaacgacctggactacatggactcccggagggacttcacgttcaacaaggatggcttccgggacttcccggccatggtgcaggagctgcaccagggcggccggcgctacatgatgatcgtggatcctgccatcagcagctcgggccctgccgggagctacaggccctacgacgagggtctgcggaggggggttttcatcaccaacgagaccggccagccgctgattgggaaggtatggcccgggtccactgccttccccgacttcaccaaccccacagccctggcctggtgggaggacatggtggctgagttccatgaccaggtgcccttcgacggcatgtggattgacatgaacgagccttccaacttcatcaggggctctgaggacggctgccccaacaatgagctggagaacccaccctacgtgcctggggtggttggggggaccctccaggcggcaaccatctgtgcctccagccaccagtttctctccacacactacaacctgcacaacctctacggcctgaccgaagccatcgcctcccacagggcgctggtgaaggctcgggggacacgcccatttgtgatctcccgctcgacctttgctggccacggccgatacgccggccactggacgggggacgtgtggagctcctgggagcagctcgcctcctccgtgccagaaatcctgcagtttaacctgctgggggtgcctctggtcggggccgacgtctgcggcttcctgggcaacacctcagaggagctgtgtgtgcgctggacccagctgggggccttctaccccttcatgcggaaccacaacagcctgctcagtctgccccaggagccgtacagcttcagcgagccggcccagcaggccatgaggaaggccctcaccctgcgctacgcactcctcccccacctctacacgctgttccaccaggcccacgtcgcgggggagaccgtggcccggcccctcttcctggagttccccaaggactctagcacctggactgtggaccaccagctcctgtggggggaggccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaaggccgaagtgactggctacttccccttgggcacatggtacgacctgcagacggtgccaatagaggcccttggcagcctcccacccccacctgcagctccccgtgagccagccatccacagcgaggggcagtgggtgacgctgccggcccccctggacaccatcaacgtccacctccgggctgggtacatcatccccctgcagggccctggcctcacaaccacagagtcccgccagcagcccatggccctggctgtggccctgaccaagggtggagaggcccgaggggagctgttctgggacgatggagagagcctggaagtgctggagcgaggggcctacacacaggtcatcttcctggccaggaataacacgatcgtgaatgagctggtacgtgtgaccagtgagggagctggcctgcagctgcagaaggtgactgtcctgggcgtggccacggcgccccagcaggtcctctccaacggtgtccctgtctccaacttcacctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtctcgctgttgatgggagagcagtttctcgtcagctggtgttagtctagagcttgcta
Figure BDA0000039488110000301
(SEQ ID NO：15)
构件1479
使用所述盒的Asp718和NotI位点以及载体pCEP4克隆了以下的GILTΔ2-7M1/K37-GAA70-952盒以产生pCEP-GILTΔ2-7M1/K37-GAA70-952(质粒p1479)。用于克隆的限制位点为小写加粗的。间隔区氨基酸序列Gly、Ala、Pro(加下划线的序列)将GAA基因与GILTΔ2-7M1/K37标记(大写的序列)分开。该间隔区和标记位于GAA残基Ala70的上游。GILTΔ2-7M1/K37盒含有人IGF-II序列的氨基酸37处(大写加粗)的Lys对Arg的取代。
Figure BDA0000039488110000302
aagcttgccATGGGAATCCCAATGGGCAAGTCGATGCTGGTGCTGCTCACCTTCTTGGCCTTTGCCTCGTGCTGCATTGCCGCTCTGTGCGGCGGGGAACTGGTGGACACCCTCCAATTCGTCTGTGGGGACCGGGGCTTCTACTTCAGCAGACCCGCAAGCCGTGTGAGT
Figure BDA0000039488110000303
CGCAGCCGTGGCATTGTTGAGGAGTGCTGTTTTCGCAGCTGTGACCTGGCTCTCCTGGAGACGTACTGCGCTACCCCCGCCAAGTCTGAGGGCGCGCCGgcacaccccggccgtcccagagcagtgcccacacagtgcgacgtcccccccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcacccaggaacagtgcgaggcccgcggctgctgctacatccctgcaaagcaggggctgcagggagcccagatggggcagccctggtgcttcttcccacccagctaccccagctacaagctggagaacctgagctcctctgaaatgggctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttcttccccaaggacatcctgaccctgcggctggacgtgatgatggagactgagaaccgcctccacttcacgatcaaagatccagctaacaggcgctacgaggtgcccttggagaccccgcgtgtccacagccgggcaccgtccccactctacagcgtggagttctctgaggagcccttcggggtgatcgtgcaccggcagctggacggccgcgtgctgctgaacacgacggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacctcgctgccctcgcagtatatcacaggcctcgccgagcacctcagtcccctgatgctcagcaccagctggaccaggatcaccctgtggaaccgggaccttgcgcccacgcccggtgcgaacctctacgggtctcaccctttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtgttcctgctaaacagcaatgccatggatgtggtcctgcagccgagccctgcccttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctacatcttcctgggcccagagcccaagagcgtggtgcagcagtacctggacgttgtgggatacccgttcatgccgccatactggggcctgggcttccacctgtgccgctggggctactcctccaccgctatcacccgccaggtggtggagaacatgaccagggcccacttccccctggacgtccaatggaacgacctggactacatggactcccggagggacttcacgttcaacaaggatggcttccgggacttcccggccatggtgcaggagctgcaccagggcggccggcgctacatgatgatcgtggatcctgccatcagcagctcgggccctgccgggagctacaggccctacgacgagggtctgcggaggggggttttcatcaccaacgagaccggccagccgctgattgggaaggtatggcccgggtccactgccttccccgacttcaccaaccccacagccctggcctggtgggaggacatggtggctgagttccatgaccaggtgcccttcgacggcatgtggattgacatgaacgagccttccaacttcatcaggggctctgaggacggctgccccaacaatgagctggagaacccaccctacgtgcctggggtggttggggggaccctccaggcggcaaccatctgtgcctccagccaccagtttctctccacacactacaacctgcacaacctctacggcctgaccgaagccatcgcctcccacagggcgctggtgaaggctcgggggacacgcccatttgtgatctcccgctcgacctttgctggccacggccgatacgccggccactggacgggggacgtgtggagctcctgggagcagctcgcctcctccgtgccagaaatcctgcagtttaacctgctgggggtgcctctggtcggggccgacgtctgcggcttcctgggcaacacctcagaggagctgtgtgtgcgctggacccagctgggggccttctaccccttcatgcggaaccacaacagcctgctcagtctgccccaggagccgtacagcttcagcgagccggcccagcaggccatgaggaaggccctcaccctgcgctacgcactcctcccccacctctacacgctgttccaccaggcccacgtcgcgggggagaccgtggcccggcccctcttcctggagttccccaaggactctagcacctggactgtggaccaccagctcctgtggggggaggccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaaggccgaagtgactggctacttccccttgggcacatggtacgacctgcagacggtgccaatagaggcccttggcagcctcccacccccacctgcagctccccgtgagccagccatccacagcgaggggcagtgggtgacgctgccggcccccctggacaccatcaacgtccacctccgggctgggtacatcatccccctgcagggccctggcctcacaaccacagagtcccgccagcagcccatggccctggctgtggccctgaccaagggtggagaggcccgaggggagctgttctgggacgatggagagagcctggaagtgctggagcgaggggcctacacacaggtcatcttcctggccaggaataacacgatcgtgaatgagctggtacgtgtgaccagtgagggagctggcctgcagctgcagaaggtgactgtcctgggcgtggccacggcgccccagcaggtcctctccaacggtgtccctgtctccaacttcacctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtctcgctgttgatgggagagcagtttctcgtcagctggtgttagtctagagcttgcta
Figure BDA0000039488110000311
(SEQ ID NO：16)
构件1487
使用所述盒的Asp718和NotI位点以及载体pCEP4克隆了以下的GILTΔ2-7M1/A37-GAA70-952盒以产生pCEP-GILTΔ2-7M1/A37-GAA70-952(质粒p1487)。用于克隆的限制位点为小写加粗的。间隔区氨基酸序列Gly、Ala、Pro(加下划线的序列)将GAA基因与GILTΔ2-7M1/A37标记(大写的序列)分开。该间隔区和标记位于GAA残基Ala70的上游。GILTΔ2-7M1/A37盒含有人IGF-II序列的氨基酸37处(大写加粗)的Ala对Arg的取代。
Figure BDA0000039488110000312
aagcttgccATGGGAATCCCAATGGGCAAGTCGATGCTGGTGCTGCTCACCTTCTTGGCCTTTGCCTCGTGCTGCATTGCCGCTCTGTGCGGCGGGGAACTGGTGGACACCCTCCAATTCGTCTGTGGGGACCGGGGCTTCTACTTCAGCAGACCCGCAAGCCGTGTGAGTCGCAGCCGTGGCATTGTTGAGGAGTGCTGTTTTCGCAGCTGTGACCTGGCTCTCCTGGAGACGTACTGCGCTACCCCCGCCAAGTCTGAGGGCGCGCCGgcacaccccggccgtcccagagcagtgcccacacagtgcgacgtcccccccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcacccaggaacagtgcgaggcccgcggctgctgctacatccctgcaaagcaggggctgcagggagcccagatggggcagccctggtgcttcttcccacccagctaccccagctacaagctggagaacctgagctcctctgaaatgggctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttcttccccaaggacatcctgaccctgcggctggacgtgatgatggagactgagaaccgcctccacttcacgatcaaagatccagctaacaggcgctacgaggtgcccttggagaccccgcgtgtccacagccgggcaccgtccccactctacagcgtggagttctctgaggagcccttcggggtgatcgtgcaccggcagctggacggccgcgtgctgctgaacacgacggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacctcgctgccctcgcagtatatcacaggcctcgccgagcacctcagtcccctgatgctcagcaccagctggaccaggatcaccctgtggaaccgggaccttgcgcccacgcccggtgcgaacctctacgggtctcaccctttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtgttcctgctaaacagcaatgccatggatgtggtcctgcagccgagccctgcccttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctacatcttcctgggcccagagcccaagagcgtggtgcagcagtacctggacgttgtgggatacccgttcatgccgccatactggggcctgggcttccacctgtgccgctggggctactcctccaccgctatcacccgccaggtggtggagaacatgaccagggcccacttccccctggacgtccaatggaacgacctggactacatggactcccggagggacttcacgttcaacaaggatggcttccgggacttcccggccatggtgcaggagctgcaccagggcggccggcgctacatgatgatcgtggatcctgccatcagcagctcgggccctgccgggagctacaggccctacgacgagggtctgcggaggggggttttcatcaccaacgagaccggccagccgctgattgggaaggtatggcccgggtccactgccttccccgacttcaccaaccccacagccctggcctggtgggaggacatggtggctgagttccatgaccaggtgcccttcgacggcatgtggattgacatgaacgagccttccaacttcatcaggggctctgaggacggctgccccaacaatgagctggagaacccaccctacgtgcctggggtggttggggggaccctccaggcggcaaccatctgtgcctccagccaccagtttctctccacacactacaacctgcacaacctctacggcctgaccgaagccatcgcctcccacagggcgctggtgaaggctcgggggacacgcccatttgtgatctcccgctcgacctttgctggccacggccgatacgccggccactggacgggggacgtgtggagctcctgggagcagctcgcctcctccgtgccagaaatcctgcagtttaacctgctgggggtgcctctggtcggggccgacgtctgcggcttcctgggcaacacctcagaggagctgtgtgtgcgctggacccagctgggggccttctaccccttcatgcggaaccacaacagcctgctcagtctgccccaggagccgtacagcttcagcgagccggcccagcaggccatgaggaaggccctcaccctgcgctacgcactcctcccccacctctacacgctgttccaccaggcccacgtcgcgggggagaccgtggcccggcccctcttcctggagttccccaaggactctagcacctggactgtggaccaccagctcctgtggggggaggccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaaggccgaagtgactggctacttccccttgggcacatggtacgacctgcagacggtgccaatagaggcccttggcagcctcccacccccacctgcagctccccgtgagccagccatccacagcgaggggcagtgggtgacgctgccggcccccctggacaccatcaacgtccacctccgggctgggtacatcatccccctgcagggccctggcctcacaaccacagagtcccgccagcagcccatggccctggctgtggccctgaccaagggtggagaggcccgaggggagctgttctgggacgatggagagagcctggaagtgctggagcgaggggcctacacacaggtcatcttcctggccaggaataacacgatcgtgaatgagctggtacgtgtgaccagtgagggagctggcctgcagctgcagaaggtgactgtcctgggcgtggccacggcgccccagcaggtcctctccaacggtgtccctgtctccaacttcacctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtctcgctgttgatgggagagcagtttctcgtcagctggtgttagtctagagcttgcta
Figure BDA0000039488110000321
(SEQ ID NO：17)
如图3中所示，表达了其中用丙氨酸或赖氨酸取代一个标准精氨酸残基的三种示例性突变(即，构件1459、1460和1461)，而未检测到弗林蛋白酶的切割。图3中还显示(右侧部分)，含有R37A取代的构件1461另外耐受外源弗林蛋白酶的加入。
构件1726
使用所述盒的Asp718和NotI位点以及载体pCEP4克隆了以下的GILTΔ2-7Δ30-39-GAA70-952盒以产生pCEP-GILTΔ2-7Δ30-39-GAA70-952(质粒1726)。用于克隆的限制位点为小写加粗的。间隔区氨基酸序列Gly、Ala、Pro(加下划线的序列)将GAA基因与GILTΔ2-7Δ30-39标记(大写的序列)分开。该间隔区和标记位于GAA残基Ala70的上游。GILTΔ2-7Δ30-39盒含有从人IGF-II序列中氨基酸残基30-39(Arg-Pro-Ala-Ser-Arg-Val-Ser-Arg-Arg-Ser)的缺失。
Figure BDA0000039488110000331
agctgctagcaagctaattcacaccaATGGGAATCCCAATGGGGAAGTCGATGCTGGTGCTTCTCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTCTGTGCGGCGGGGAGCTGGTGGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCCGTGGCATCGTTGAGGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGTGACCTGGCCCTCCTGGAGACGTACTGTGCTACCCCCGCCAAGTCCGAGGGCGCGCCGgcacaccccggccgtcccagagcagtgcccacacagtgcgacgtcccccccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcacccaggaacagtgcgaggcccgcggctgctgctacatccctgcaaagcaggggctgcagggagcccagatggggcagccctggtgcttcttcccacccagctaccccagctacaagctggagaacctgagctcctctgaaatgggctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttcttccccaaggacatcctgaccctgcggctggacgtgatgatggagactgagaaccgcctccacttcacgatcaaagatccagctaacaggcgctacgaggtgcccttggagaccccgcgtgtccacagccgggcaccgtccccactctacagcgtggagttctctgaggagcccttcggggtgatcgtgcaccggcagctggacggccgcgtgctgctgaacacgacggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacctcgctgccctcgcagtatatcacaggcctcgccgagcacctcagtcccctgatgctcagcaccagctggaccaggatcaccctgtggaaccgggaccttgcgcccacgcccggtgcgaacctctacgggtctcaccctttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtgttcctgctaaacagcaatgccatggatgtggtcctgcagccgagccctgcccttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctacatcttcctgggcccagagcccaagagcgtggtgcagcagtacctggacgttgtgggatacccgttcatgccgccatactggggcctgggcttccacctgtgccgctggggctactcctccaccgctatcacccgccaggtggtggagaacatgaccagggcccacttccccctggacgtccaatggaacgacctggactacatggactcccggagggacttcacgttcaacaaggatggcttccgggacttcccggccatggtgcaggagctgcaccagggcggccggcgctacatgatgatcgtggatcctgccatcagcagctcgggccctgccgggagctacaggccctacgacgagggtctgcggaggggggttttcatcaccaacgagaccggccagccgctgattgggaaggtatggcccgggtccactgccttccccgacttcaccaaccccacagccctggcctggtgggaggacatggtggctgagttccatgaccaggtgcccttcgacggcatgtggattgacatgaacgagccttccaacttcatcaggggctctgaggacggctgccccaacaatgagctggagaacccaccctacgtgcctggggtggttggggggaccctccaggcggcaaccatctgtgcctccagccaccagtttctctccacacactacaacctgcacaacctctacggcctgaccgaagccatcgcctcccacagggcgctggtgaaggctcgggggacacgcccatttgtgatctcccgctcgacctttgctggccacggccgatacgccggccactggacgggggacgtgtggagctcctgggagcagctcgcctcctccgtgccagaaatcctgcagtttaacctgctgggggtgcctctggtcggggccgacgtctgcggcttcctgggcaacacctcagaggagctgtgtgtgcgctggacccagctgggggccttctaccccttcatgcggaaccacaacagcctgctcagtctgccccaggagccgtacagcttcagcgagccggcccagcaggccatgaggaaggccctcaccctgcgctacgcactcctcccccacctctacacgctgttccaccaggcccacgtcgcgggggagaccgtggcccggcccctcttcctggagttccccaaggactctagcacctggactgtggaccaccagctcctgtggggggaggccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaaggccgaagtgactggctacttccccttgggcacatggtacgacctgcagacggtgccaatagaggcccttggcagcctcccacccccacctgcagctccccgtgagccagccatccacagcgaggggcagtgggtgacgctgccggcccccctggacaccatcaacgtccacctccgggctgggtacatcatccccctgcagggccctggcctcacaaccacagagtcccgccagcagcccatggccctggctgtggccctgaccaagggtggagaggcccgaggggagctgttctgggacgatggagagagcctggaagtgctggagcgaggggcctacacacaggtcatcttcctggccaggaataacacgatcgtgaatgagctggtacgtgtgaccagtgagggagctggcctgcagctgcagaaggtgactgtcctgggcgtggccacggcgccccagcaggtcctctccaacggtgtccctgtctccaacttcacctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtctcgctgttgatgggagagcagtttctcgtcagctggtgttagtctagagcttgcta
Figure BDA0000039488110000341
(SEQ ID NO：18)
构件1749
使用所述盒的Asp718和NotI位点以及载体pCEP4克隆了以下的GILTΔ2-7Δ31-39-GAA70-952盆以产生pCEP-GILTΔ2-7Δ31-39-GAA70-952(质粒1749)。用于克隆的限制位点为小写加粗的。间隔区氨基酸序列Gly、Ala、Pro(加下划线的序列)将GAA基因与GILTΔ2-7Δ31-39标记(大写的序列)分开。该间隔区和标记位于GAA残基Ala70的上游。GILTΔ2-7Δ31-39盒含有从人IGF-II序列中氨基酸残基31-39(Pro-Ala-Ser-Arg-Val-Ser-Arg-Arg-Ser)的缺失。
Figure BDA0000039488110000342
agctgctagcaagctaattcacaccaATGGGAATCCCAATGGGGAAGTCGATGCTGGTGCTTCTCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTCTGTGCGGCGGGGAGCTGGTGGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCGTGGCATCGTTGAGGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGTGACCTGGCCCTCCTGGAGACGTACTGTGCTACCCCCGCCAAGTCCGAGGGCGCGCCGgcacaccccggccgtcccagagcagtgcccacacagtgcgacgtcccccccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcacccaggaacagtgcgaggcccgcggctgctgctacatccctgcaaagcaggggctgcagggagcccagatggggcagccctggtgcttcttcccacccagctaccccagctacaagctggagaacctgagctcctctgaaatgggctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttcttccccaaggacatcctgaccctgcggctggacgtgatgatggagactgagaaccgcctccacttcacgatcaaagatccagctaacaggcgctacgaggtgcccttggagaccccgcgtgtccacagccgggcaccgtccccactctacagcgtggagttctctgaggagcccttcggggtgatcgtgcaccggcagctggacggccgcgtgctgctgaacacgacggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacctcgctgccctcgcagtatatcacaggcctcgccgagcacctcagtcccctgatgctcagcaccagctggaccaggatcaccctgtggaaccgggaccttgcgcccacgcccggtgcgaacctctacgggtctcaccctttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtgttcctgctaaacagcaatgccatggatgtggtcctgcagccgagccctgcccttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctacatcttcctgggcccagagcccaagagcgtggtgcagcagtacctggacgttgtgggatacccgttcatgccgccatactggggcctgggcttccacctgtgccgctggggctactcctccaccgctatcacccgccaggtggtggagaacatgaccagggcccacttccccctggacgtccaatggaacgacctggactacatggactcccggagggacttcacgttcaacaaggatggcttccgggacttcccggccatggtgcaggagctgcaccagggcggccggcgctacatgatgatcgtggatcctgccatcagcagctcgggccctgccgggagctacaggccctacgacgagggtctgcggaggggggttttcatcaccaacgagaccggccagccgctgattgggaaggtatggcccgggtccactgccttccccgacttcaccaaccccacagccctggcctggtgggaggacatggtggctgagttccatgaccaggtgcccttcgacggcatgtggattgacatgaacgagccttccaacttcatcaggggctctgaggacggctgccccaacaatgagctggagaacccaccctacgtgcctggggtggttggggggaccctccaggcggcaaccatctgtgcctccagccaccagtttctctccacacactacaacctgcacaacctctacggcctgaccgaagccatcgcctcccacagggcgctggtgaaggctcgggggacacgcccatttgtgatctcccgctcgacctttgctggccacggccgatacgccggccactggacgggggacgtgtggagctcctgggagcagctcgcctcctccgtgccagaaatcctgcagtttaacctgctgggggtgcctctggtcggggccgacgtctgcggcttcctgggcaacacctcagaggagctgtgtgtgcgctggacccagctgggggccttctaccccttcatgcggaaccacaacagcctgctcagtctgccccaggagccgtacagcttcagcgagccggcccagcaggccatgaggaaggccctcaccctgcgctacgcactcctcccccacctctacacgctgttccaccaggcccacgtcgcgggggagaccgtggcccggcccctcttcctggagttccccaaggactctagcacctggactgtggaccaccagctcctgtggggggaggccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaaggccgaagtgactggctacttccccttgggcacatggtacgacctgcagacggtgccaatagaggcccttggcagcctcccacccccacctgcagctccccgtgagccagccatccacagcgaggggcagtgggtgacgctgccggcccccctggacaccatcaacgtccacctccgggctgggtacatcatccccctgcagggccctggcctcacaaccacagagtcccgccagcagcccatggccctggctgtggccctgaccaagggtggagaggcccgaggggagctgttctgggacgatggagagagcctggaagtgctggagcgaggggcctacacacaggtcatcttcctggccaggaataacacgatcgtgaatgagctggtacgtgtgaccagtgagggagctggcctgcagctgcagaaggtgactgtcctgggcgtggccacggcgccccagcaggtcctctccaacggtgtccctgtctccaacttcacctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtctcgctgttgatgggagagcagtttctcgtcagctggtgttagtctagagcttgcta
Figure BDA0000039488110000351
Figure BDA0000039488110000352
(SEQ ID NO：19)
构件1746
使用所述盒的Asp718和NotI位点以及载体pCEP4克隆了以下的GILTΔ2-7Δ32-39-GAA70-952盒以产生pCEP-GILTΔ2-7Δ32-39-GAA70-952(质粒1746)。用于克隆的限制位点为小写加粗的。间隔区氨基酸序列Gly、Ala、Pro(加下划线的序列)将GAA基因与GILTΔ2-7Δ32-39标记(大写的序列)分开。该间隔区和标记位于GAA残基Ala70的上游。GILTΔ2-7Δ32-39盒含有从人IGF-II序列中氨基酸残基32-39(Ala-Ser-Arg-Val-Ser-Arg-Arg-Ser)的缺失。
Figure BDA0000039488110000353
agctgctagcaagctaattcacaccaATGGGAATCCCAATGGGGAAGTCGATGCTGGTGCTTCTCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTCTGTGCGGCGGGGAGCTGGTGGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCCCGTGGCATCGTTGAGGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGTGACCTGGCCCTCCTGGAGACGTACTGTGCTACCCCCGCCAAGTCCGAGGGCGCGCCGgcacaccccggccgtcccagagcagtgcccacacagtgcgacgtcccccccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcacccaggaacagtgcgaggcccgcggctgctgctacatccctgcaaagcaggggctgcagggagcccagatggggcagccctggtgcttcttcccacccagctaccccagctacaagctggagaacctgagctcctctgaaatgggctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttcttccccaaggacatcctgaccctgcggctggacgtgatgatggagactgagaaccgcctccacttcacgatcaaagatccagctaacaggcgctacgaggtgcccttggagaccccgcgtgtccacagccgggcaccgtccccactctacagcgtggagttctctgaggagcccttcggggtgatcgtgcaccggcagctggacggccgcgtgctgctgaacacgacggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacctcgctgccctcgcagtatatcacaggcctcgccgagcacctcagtcccctgatgctcagcaccagctggaccaggatcaccctgtggaaccgggaccttgcgcccacgcccggtgcgaacctctacgggtctcaccctttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtgttcctgctaaacagcaatgccatggatgtggtcctgcagccgagccctgcccttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctacatcttcctgggcccagagcccaagagcgtggtgcagcagtacctggacgttgtgggatacccgttcatgccgccatactggggcctgggcttccacctgtgccgctggggctactcctccaccgctatcacccgccaggtggtggagaacatgaccagggcccacttccccctggacgtccaatggaacgacctggactacatggactcccggagggacttcacgttcaacaaggatggcttccgggacttcccggccatggtgcaggagctgcaccagggcggccggcgctacatgatgatcgtggatcctgccatcagcagctcgggccctgccgggagctacaggccctacgacgagggtctgcggaggggggttttcatcaccaacgagaccggccagccgctgattgggaaggtatggcccgggtccactgccttccccgacttcaccaaccccacagccctggcctggtgggaggacatggtggctgagttccatgaccaggtgcccttcgacggcatgtggattgacatgaacgagccttccaacttcatcaggggctctgaggacggctgccccaacaatgagctggagaacccaccctacgtgcctggggtggttggggggaccctccaggcggcaaccatctgtgcctccagccaccagtttctctccacacactacaacctgcacaacctctacggcctgaccgaagccatcgcctcccacagggcgctggtgaaggctcgggggacacgcccatttgtgatctcccgctcgacctttgctggccacggccgatacgccggccactggacgggggacgtgtggagctcctgggagcagctcgcctcctccgtgccagaaatcctgcagtttaacctgctgggggtgcctctggtcggggccgacgtctgcggcttcctgggcaacacctcagaggagctgtgtgtgcgctggacccagctgggggccttctaccccttcatgcggaaccacaacagcctgctcagtctgccccaggagccgtacagcttcagcgagccggcccagcaggccatgaggaaggccctcaccctgcgctacgcactcctcccccacctctacacgctgttccaccaggcccacgtcgcgggggagaccgtggcccggcccctcttcctggagttccccaaggactctagcacctggactgtggaccaccagctcctgtggggggaggccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaaggccgaagtgactggctacttccccttgggcacatggtacgacctgcagacggtgccaatagaggcccttggcagcctcccacccccacctgcagctccccgtgagccagccatccacagcgaggggcagtgggtgacgctgccggcccccctggacaccatcaacgtccacctccgggctgggtacatcatccccctgcagggccctggcctcacaaccacagagtcccgccagcagcccatggccctggctgtggccctgaccaagggtggagaggcccgaggggagctgttctgggacgatggagagagcctggaagtgctggagcgaggggcctacacacaggtcatcttcctggccaggaataacacgatcgtgaatgagctggtacgtgtgaccagtgagggagctggcctgcagctgcagaaggtgactgtcctgggcgtggccacggcgccccagcaggtcctctccaacggtgtccctgtctccaacttcacctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtctcgctgttgatgggagagcagtttctcgtcagctggtgttagtctagagcttgcta
Figure BDA0000039488110000361
(SEQ ID NO：20)
构件1747
使用所述盒的Asp718和NotI位点以及载体pCEP4克隆了以下的GILTΔ2-7Δ33-39-GAA70-952盒以产生pCEP-GILTΔ2-7Δ33-39-GAA70-952(质粒1747)。用于克隆的限制位点为小写加粗的。间隔区氨基酸序列Gly、Ala、Pro(加下划线的序列)将GAA基因与GILTΔ2-7Δ33-39标记(大写的序列)分开。该间隔区和标记位于GAA残基Ala70的上游。GILTΔ2-7Δ33-39盒含有从人IGF-II序列中氨基酸残基33-39(Ser-Arg-Val-Ser-Arg-Arg-Ser)的缺失。
Figure BDA0000039488110000362
gctgctagcaagctaattcacaccaATGGGAATCCCAATGGGGAAGTCGATGCTGGTGCTTCTCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTCTGTGCGGCGGGGAGCTGGTGGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCCGCACGTGGCATCGTTGAGGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGTGACCTGGCCCTCCTGGAGACGTACTGTGCTACCCCCGCCAAGTCCGAGGGCGCGCCGgcacaccccggccgtcccagagcagtgcccacacagtgcgacgtcccccccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcacccaggaacagtgcgaggcccgcggctgctgctacatccctgcaaagcaggggctgcagggagcccagatggggcagccctggtgcttcttcccacccagctaccccagctacaagctggagaacctgagctcctctgaaatgggctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttcttccccaaggacatcctgaccctgcggctggacgtgatgatggagactgagaaccgcctccacttcacgatcaaagatccagctaacaggcgctacgaggtgcccttggagaccccgcgtgtccacagccgggcaccgtccccactctacagcgtggagttctctgaggagcccttcggggtgatcgtgcaccggcagctggacggccgcgtgctgctgaacacgacggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacctcgctgccctcgcagtatatcacaggcctcgccgagcacctcagtcccctgatgctcagcaccagctggaccaggatcaccctgtggaaccgggaccttgcgcccacgcccggtgcgaacctctacgggtctcaccctttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtgttcctgctaaacagcaatgccatggatgtggtcctgcagccgagccctgcccttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctacatcttcctgggcccagagcccaagagcgtggtgcagcagtacctggacgttgtgggatacccgttcatgccgccatactggggcctgggcttccacctgtgccgctggggctactcctccaccgctatcacccgccaggtggtggagaacatgaccagggcccacttccccctggacgtccaatggaacgacctggactacatggactcccggagggacttcacgttcaacaaggatggcttccgggacttcccggccatggtgcaggagctgcaccagggcggccggcgctacatgatgatcgtggatcctgccatcagcagctcgggccctgccgggagctacaggccctacgacgagggtctgcggaggggggttttcatcaccaacgagaccggccagccgctgattgggaaggtatggcccgggtccactgccttccccgacttcaccaaccccacagccctggcctggtgggaggacatggtggctgagttccatgaccaggtgcccttcgacggcatgtggattgacatgaacgagccttccaacttcatcaggggctctgaggacggctgccccaacaatgagctggagaacccaccctacgtgcctggggtggttggggggaccctccaggcggcaaccatctgtgcctccagccaccagtttctctccacacactacaacctgcacaacctctacggcctgaccgaagccatcgcctcccacagggcgctggtgaaggctcgggggacacgcccatttgtgatctcccgctcgacctttgctggccacggccgatacgccggccactggacgggggacgtgtggagctcctgggagcagctcgcctcctccgtgccagaaatcctgcagtttaacctgctgggggtgcctctggtcggggccgacgtctgcggcttcctgggcaacacctcagaggagctgtgtgtgcgctggacccagctgggggccttctaccccttcatgcggaaccacaacagcctgctcagtctgccccaggagccgtacagcttcagcgagccggcccagcaggccatgaggaaggccctcaccctgcgctacgcactcctcccccacctctacacgctgttccaccaggcccacgtcgcgggggagaccgtggcccggcccctcttcctggagttccccaaggactctagcacctggactgtggaccaccagctcctgtggggggaggccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaaggccgaagtgactggctacttccccttgggcacatggtacgacctgcagacggtgccaatagaggcccttggcagcctcccacccccacctgcagctccccgtgagccagccatccacagcgaggggcagtgggtgacgctgccggcccccctggacaccatcaacgtccacctccgggctgggtacatcatccccctgcagggccctggcctcacaaccacagagtcccgccagcagcccatggccctggctgtggccctgaccaagggtggagaggcccgaggggagctgttctgggacgatggagagagcctggaagtgctggagcgaggggcctacacacaggtcatcttcctggccaggaataacacgatcgtgaatgagctggtacgtgtgaccagtgagggagctggcctgcagctgcagaaggtgactgtcctgggcgtggccacggcgccccagcaggtcctctccaacggtgtccctgtctccaacttcacctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtctcgctgttgatgggagagcagtttctcgtcagctggtgttagtctagagcttgcta
Figure BDA0000039488110000371
(SEQ ID NO：21)
构件1758
使用所述盒的Asp718和NotI位点以及载体pCEP4克隆了以下的GILTΔ2-7Δ34-39-GAA70-952盒以产生pCEP-GILTΔ2-7Δ34-39-GAA70-952(质粒1758)。用于克隆的限制位点为小写加粗的。间隔区氨基酸序列Gly、Ala、Pro(加下划线的序列)将GAA基因与GILTΔ2-7Δ34-39标记(大写的序列)分开。该间隔区和标记位于GAA残基Ala70的上游。GILTΔ2-7Δ34-39盒含有从人IGF-II序列中氨基酸残基34-39(Arg-Val-Ser-Arg-Arg-Ser)的缺失。
Figure BDA0000039488110000381
agctgctagcaagctaattcacaccaATGGGAATCCCAATGGGGAAGTCGATGCTGGTGCTTCTCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTCTGTGCGGCGGGGAGCTGGTGGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCCGCAAGCCGTGGCATCGTTGAGGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGTGACCTGGCCCTCCTGGAGACGTACTGTGCTACCCCCGCCAAGTCCGAGGGCGCGCCGgcacaccccggccgtcccagagcagtgcccacacagtgcgacgtcccccccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcacccaggaacagtgcgaggcccgcggctgctgctacatccctgcaaagcaggggctgcagggagcccagatggggcagccctggtgcttcttcccacccagctaccccagctacaagctggagaacctgagctcctctgaaatgggctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttcttccccaaggacatcctgaccctgcggctggacgtgatgatggagactgagaaccgcctccacttcacgatcaaagatccagctaacaggcgctacgaggtgcccttggagaccccgcgtgtccacagccgggcaccgtccccactctacagcgtggagttctctgaggagcccttcggggtgatcgtgcaccggcagctggacggccgcgtgctgctgaacacgacggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacctcgctgccctcgcagtatatcacaggcctcgccgagcacctcagtcccctgatgctcagcaccagctggaccaggatcaccctgtggaaccgggaccttgcgcccacgcccggtgcgaacctctacgggtctcaccctttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtgttcctgctaaacagcaatgccatggatgtggtcctgcagccgagccctgcccttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctacatcttcctgggcccagagcccaagagcgtggtgcagcagtacctggacgttgtgggatacccgttcatgccgccatactggggcctgggcttccacctgtgccgctggggctactcctccaccgctatcacccgccaggtggtggagaacatgaccagggcccacttccccctggacgtccaatggaacgacctggactacatggactcccggagggacttcacgttcaacaaggatggcttccgggacttcccggccatggtgcaggagctgcaccagggcggccggcgctacatgatgatcgtggatcctgccatcagcagctcgggccctgccgggagctacaggccctacgacgagggtctgcggaggggggttttcatcaccaacgagaccggccagccgctgattgggaaggtatggcccgggtccactgccttccccgacttcaccaaccccacagccctggcctggtgggaggacatggtggctgagttccatgaccaggtgcccttcgacggcatgtggattgacatgaacgagccttccaacttcatcaggggctctgaggacggctgccccaacaatgagctggagaacccaccctacgtgcctggggtggttggggggaccctccaggcggcaaccatctgtgcctccagccaccagtttctctccacacactacaacctgcacaacctctacggcctgaccgaagccatcgcctcccacagggcgctggtgaaggctcgggggacacgcccatttgtgatctcccgctcgacctttgctggccacggccgatacgccggccactggacgggggacgtgtggagctcctgggagcagctcgcctcctccgtgccagaaatcctgcagtttaacctgctgggggtgcctctggtcggggccgacgtctgcggcttcctgggcaacacctcagaggagctgtgtgtgcgctggacccagctgggggccttctaccccttcatgcggaaccacaacagcctgctcagtctgccccaggagccgtacagcttcagcgagccggcccagcaggccatgaggaaggccctcaccctgcgctacgcactcctcccccacctctacacgctgttccaccaggcccacgtcgcgggggagaccgtggcccggcccctcttcctggagttccccaaggactctagcacctggactgtggaccaccagctcctgtggggggaggccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaaggccgaagtgactggctacttccccttgggcacatggtacgacctgcagacggtgccaatagaggcccttggcagcctcccacccccacctgcagctccccgtgagccagccatccacagcgaggggcagtgggtgacgctgccggcccccctggacaccatcaacgtccacctccgggctgggtacatcatccccctgcagggccctggcctcacaaccacagagtcccgccagcagcccatggccctggctgtggccctgaccaagggtggagaggcccgaggggagctgttctgggacgatggagagagcctggaagtgctggagcgaggggcctacacacaggtcatcttcctggccaggaataacacgatcgtgaatgagctggtacgtgtgaccagtgagggagctggcctgcagctgcagaaggtgactgtcctgggcgtggccacggcgccccagcaggtcctctccaacggtgtccctgtctccaacttcacctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtctcgctgttgatgggagagcagtttctcgtcagctggtgttagtctagagcttgcta
Figure BDA0000039488110000391
(SEQ ID NO：22)
构件1750
使用所述盒的Asp718和NotI位点以及载体pCEP4克隆了以下的GILTΔ2-7Δ35-39-GAA70-952盒以产生pCEP-GILTΔ2-7Δ35-39-GAA70-952(质粒1750)。用于克隆的限制位点为小写加粗的。间隔区氨基酸序列Gly、Ala、Pro(加下划线的序列)将GAA基因与GILTΔ2-7Δ35-39标记(大写的序列)分开。该间隔区和标记位于GAA残基Ala70的上游。GILTΔ2-7Δ35-39盒含有从人IGF-II序列中氨基酸残基35-39(Val-Ser-Arg-Arg-Ser)的缺失。
Figure BDA0000039488110000392
agctgctagcaagctaattcacaccaATGGGAATCCCAATGGGGAAGTCGATGCTGGTGCTTCTCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTCTGTGCGGCGGGGAGCTGGTGGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCCGCAAGCCGTCGTGGCATCGTTGAGGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGTGACCTGGCCCTCCTGGAGACGTACTGTGCTACCCCCGCCAAGTCCGAGGGCGCGCCGgcacaccccggccgtcccagagcagtgcccacacagtgcgacgtcccccccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcacccaggaacagtgcgaggcccgcggctgctgctacatccctgcaaagcaggggctgcagggagcccagatggggcagccctggtgcttcttcccacccagctaccccagctacaagctggagaacctgagctcctctgaaatgggctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttcttccccaaggacatcctgaccctgcggctggacgtgatgatggagactgagaaccgcctccacttcacgatcaaagatccagctaacaggcgctacgaggtgcccttggagaccccgcgtgtccacagccgggcaccgtccccactctacagcgtggagttctctgaggagcccttcggggtgatcgtgcaccggcagctggacggccgcgtgctgctgaacacgacggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacctcgctgccctcgcagtatatcacaggcctcgccgagcacctcagtcccctgatgctcagcaccagctggaccaggatcaccctgtggaaccgggaccttgcgcccacgcccggtgcgaacctctacgggtctcaccctttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtgttcctgctaaacagcaatgccatggatgtggtcctgcagccgagccctgcccttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctacatcttcctgggcccagagcccaagagcgtggtgcagcagtacctggacgttgtgggatacccgttcatgccgccatactggggcctgggcttccacctgtgccgctggggctactcctccaccgctatcacccgccaggtggtggagaacatgaccagggcccacttccccctggacgtccaatggaacgacctggactacatggactcccggagggacttcacgttcaacaaggatggcttccgggacttcccggccatggtgcaggagctgcaccagggcggccggcgctacatgatgatcgtggatcctgccatcagcagctcgggccctgccgggagctacaggccctacgacgagggtctgcggaggggggttttcatcaccaacgagaccggccagccgctgattgggaaggtatggcccgggtccactgccttccccgacttcaccaaccccacagccctggcctggtgggaggacatggtggctgagttccatgaccaggtgcccttcgacggcatgtggattgacatgaacgagccttccaacttcatcaggggctctgaggacggctgccccaacaatgagctggagaacccaccctacgtgcctggggtggttggggggaccctccaggcggcaaccatctgtgcctccagccaccagtttctctccacacactacaacctgcacaacctctacggcctgaccgaagccatcgcctcccacagggcgctggtgaaggctcgggggacacgcccatttgtgatctcccgctcgacctttgctggccacggccgatacgccggccactggacgggggacgtgtggagctcctgggagcagctcgcctcctccgtgccagaaatcctgcagtttaacctgctgggggtgcctctggtcggggccgacgtctgcggcttcctgggcaacacctcagaggagctgtgtgtgcgctggacccagctgggggccttctaccccttcatgcggaaccacaacagcctgctcagtctgccccaggagccgtacagcttcagcgagccggcccagcaggccatgaggaaggccctcaccctgcgctacgcactcctcccccacctctacacgctgttccaccaggcccacgtcgcgggggagaccgtggcccggcccctcttcctggagttccccaaggactctagcacctggactgtggaccaccagctcctgtggggggaggccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaaggccgaagtgactggctacttccccttgggcacatggtacgacctgcagacggtgccaatagaggcccttggcagcctcccacccccacctgcagctccccgtgagccagccatccacagcgaggggcagtgggtgacgctgccggcccccctggacaccatcaacgtccacctccgggctgggtacatcatccccctgcagggccctggcctcacaaccacagagtcccgccagcagcccatggccctggctgtggccctgaccaagggtggagaggcccgaggggagctgttctgggacgatggagagagcctggaagtgctggagcgaggggcctacacacaggtcatcttcctggccaggaataacacgatcgtgaatgagctggtacgtgtgaccagtgagggagctggcctgcagctgcagaaggtgactgtcctgggcgtggccacggcgccccagcaggtcctctccaacggtgtccctgtctccaacttcacctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtctcgctgttgatgggagagcagtttctcgtcagctggtgttagtctagagcttgcta
Figure BDA0000039488110000401
(SEQ ID NO：23)
构件1748
使用所述盒的Asp718和NotI位点以及载体pCEP4克隆了以下的GILTΔ2-7Δ36-39-GAA70-952盒以产生pCEP-GILTΔ2-7Δ36-39-GAA70-952(质粒1748)。用于克隆的限制位点为小写加粗的。间隔区氨基酸序列Gly、Ala、Pro(加下划线的序列)将GAA基因与GILTΔ2-7Δ36-39标记(大写的序列)分开。该间隔区和标记位于GAA残基Ala70的上游。GILTΔ2-7Δ36-39盒含有从人IGF-II序列中氨基酸残基36-39(Ser-Arg-Arg-Ser)的缺失。
Figure BDA0000039488110000402
agctgctagcaagctaattcacaccaATGGGAATCCCAATGGGGAAGTCGATGCTGGTGCTTCTCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTCTGTGCGGCGGGGAGCTGGTGGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCCGCAAGCCGTGTGCGTGGCATCGTTGAGGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGTGACCTGGCCCTCCTGGAGACGTACTGTGCTACCCCCGCCAAGTCCGAGGGCGCGCCGgcacaccccggccgtcccagagcagtgcccacacagtgcgacgtcccccccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcacccaggaacagtgcgaggcccgcggctgctgctacatccctgcaaagcaggggctgcagggagcccagatggggcagccctggtgcttcttcccacccagctaccccagctacaagctggagaacctgagctcctctgaaatgggctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttcttccccaaggacatcctgaccctgcggctggacgtgatgatggagactgagaaccgcctccacttcacgatcaaagatccagctaacaggcgctacgaggtgcccttggagaccccgcgtgtccacagccgggcaccgtccccactctacagcgtggagttctctgaggagcccttcggggtgatcgtgcaccggcagctggacggccgcgtgctgctgaacacgacggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacctcgctgccctcgcagtatatcacaggcctcgccgagcacctcagtcccctgatgctcagcaccagctggaccaggatcaccctgtggaaccgggaccttgcgcccacgcccggtgcgaacctctacgggtctcaccctttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtgttcctgctaaacagcaatgccatggatgtggtcctgcagccgagccctgcccttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctacatcttcctgggcccagagcccaagagcgtggtgcagcagtacctggacgttgtgggatacccgttcatgccgccatactggggcctgggcttccacctgtgccgctggggctactcctccaccgctatcacccgccaggtggtggagaacatgaccagggcccacttccccctggacgtccaatggaacgacctggactacatggactcccggagggacttcacgttcaacaaggatggcttccgggacttcccggccatggtgcaggagctgcaccagggcggccggcgctacatgatgatcgtggatcctgccatcagcagctcgggccctgccgggagctacaggccctacgacgagggtctgcggaggggggttttcatcaccaacgagaccggccagccgctgattgggaaggtatggcccgggtccactgccttccccgacttcaccaaccccacagccctggcctggtgggaggacatggtggctgagttccatgaccaggtgcccttcgacggcatgtggattgacatgaacgagccttccaacttcatcaggggctctgaggacggctgccccaacaatgagctggagaacccaccctacgtgcctggggtggttggggggaccctccaggcggcaaccatctgtgcctccagccaccagtttctctccacacactacaacctgcacaacctctacggcctgaccgaagccatcgcctcccacagggcgctggtgaaggctcgggggacacgcccatttgtgatctcccgctcgacctttgctggccacggccgatacgccggccactggacgggggacgtgtggagctcctgggagcagctcgcctcctccgtgccagaaatcctgcagtttaacctgctgggggtgcctctggtcggggccgacgtctgcggcttcctgggcaacacctcagaggagctgtgtgtgcgctggacccagctgggggccttctaccccttcatgcggaaccacaacagcctgctcagtctgccccaggagccgtacagcttcagcgagccggcccagcaggccatgaggaaggccctcaccctgcgctacgcactcctcccccacctctacacgctgttccaccaggcccacgtcgcgggggagaccgtggcccggcccctcttcctggagttccccaaggactctagcacctggactgtggaccaccagctcctgtggggggaggccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaaggccgaagtgactggctacttccccttgggcacatggtacgacctgcagacggtgccaatagaggcccttggcagcctcccacccccacctgcagctccccgtgagccagccatccacagcgaggggcagtgggtgacgctgccggcccccctggacaccatcaacgtccacctccgggctgggtacatcatccccctgcagggccctggcctcacaaccacagagtcccgccagcagcccatggccctggctgtggccctgaccaagggtggagaggcccgaggggagctgttctgggacgatggagagagcctggaagtgctggagcgaggggcctacacacaggtcatcttcctggccaggaataacacgatcgtgaatgagctggtacgtgtgaccagtgagggagctggcctgcagctgcagaaggtgactgtcctgggcgtggccacggcgccccagcaggtcctctccaacggtgtccctgtctccaacttcacctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtctcgctgttgatgggagagcagtttctcgtcagctggtgttagtctagagcttgcta
Figure BDA0000039488110000411
(SEQ ID NO：24)
构件1751
使用所述盒的Asp718和NotI位点以及载体pCEP4克隆了以下的GILTΔ2-7Δ29-40-GAA70-952盒以产生pCEP-GILTΔ2-7Δ29-40-GAA70-952(质粒1751)。用于克隆的限制位点为小写加粗的。间隔区氨基酸序列Gly、Ala、Pro(加下划线的序列)将GAA基因与GILTΔ2-7Δ29-40标记(大写的序列)分开。该间隔区和标记位于GAA残基Ala70的上游。GILTΔ2-7Δ29-40盒含有从人IGF-II序列中氨基酸残基29-40(Ser-Arg-Pro-Ala-Ser-Arg-Val-Ser-Arg-Arg-Ser-Arg)的缺失。
Figure BDA0000039488110000412
agctgctagcaagctaattcacaccaATGGGAATCCCAATGGGGAAGTCGATGCTGGTGCTTCTCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTCTGTGCGGCGGGGAGCTGGTGGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCGGCATCGTTGAGGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGTGACCTGGCCCTCCTGGAGACGTACTGTGCTACCCCCGCCAAGTCCGAGGGCGCGCCGgcacaccccggccgtcccagagcagtgcccacacagtgcgacgtcccccccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcacccaggaacagtgcgaggcccgcggctgctgctacatccctgcaaagcaggggctgcagggagcccagatggggcagccctggtgcttcttcccacccagctaccccagctacaagctggagaacctgagctcctctgaaatgggctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttcttccccaaggacatcctgaccctgcggctggacgtgatgatggagactgagaaccgcctccacttcacgatcaaagatccagctaacaggcgctacgaggtgcccttggagaccccgcgtgtccacagccgggcaccgtccccactctacagcgtggagttctctgaggagcccttcggggtgatcgtgcaccggcagctggacggccgcgtgctgctgaacacgacggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacctcgctgccctcgcagtatatcacaggcctcgccgagcacctcagtcccctgatgctcagcaccagctggaccaggatcaccctgtggaaccgggaccttgcgcccacgcccggtgcgaacctctacgggtctcaccctttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtgttcctgctaaacagcaatgccatggatgtggtcctgcagccgagccctgcccttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctacatcttcctgggcccagagcccaagagcgtggtgcagcagtacctggacgttgtgggatacccgttcatgccgccatactggggcctgggcttccacctgtgccgctggggctactcctccaccgctatcacccgccaggtggtggagaacatgaccagggcccacttccccctggacgtccaatggaacgacctggactacatggactcccggagggacttcacgttcaacaaggatggcttccgggacttcccggccatggtgcaggagctgcaccagggcggccggcgctacatgatgatcgtggatcctgccatcagcagctcgggccctgccgggagctacaggccctacgacgagggtctgcggaggggggttttcatcaccaacgagaccggccagccgctgattgggaaggtatggcccgggtccactgccttccccgacttcaccaaccccacagccctggcctggtgggaggacatggtggctgagttccatgaccaggtgcccttcgacggcatgtggattgacatgaacgagccttccaacttcatcaggggctctgaggacggctgccccaacaatgagctggagaacccaccctacgtgcctggggtggttggggggaccctccaggcggcaaccatctgtgcctccagccaccagtttctctccacacactacaacctgcacaacctctacggcctgaccgaagccatcgcctcccacagggcgctggtgaaggctcgggggacacgcccatttgtgatctcccgctcgacctttgctggccacggccgatacgccggccactggacgggggacgtgtggagctcctgggagcagctcgcctcctccgtgccagaaatcctgcagtttaacctgctgggggtgcctctggtcggggccgacgtctgcggcttcctgggcaacacctcagaggagctgtgtgtgcgctggacccagctgggggccttctaccccttcatgcggaaccacaacagcctgctcagtctgccccaggagccgtacagcttcagcgagccggcccagcaggccatgaggaaggccctcaccctgcgctacgcactcctcccccacctctacacgctgttccaccaggcccacgtcgcgggggagaccgtggcccggcccctcttcctggagttccccaaggactctagcacctggactgtggaccaccagctcctgtggggggaggccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaaggccgaagtgactggctacttccccttgggcacatggtacgacctgcagacggtgccaatagaggcccttggcagcctcccacccccacctgcagctccccgtgagccagccatccacagcgaggggcagtgggtgacgctgccggcccccctggacaccatcaacgtccacctccgggctgggtacatcatccccctgcagggccctggcctcacaaccacagagtcccgccagcagcccatggccctggctgtggccctgaccaagggtggagaggcccgaggggagctgttctgggacgatggagagagcctggaagtgctggagcgaggggcctacacacaggtcatcttcctggccaggaataacacgatcgtgaatgagctggtacgtgtgaccagtgagggagctggcctgcagctgcagaaggtgactgtcctgggcgtggccacggcgccccagcaggtcctctccaacggtgtccctgtctccaacttcacctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtctcgctgttgatgggagagcagtttctcgtcagctggtgttagtctagagcttgcta
Figure BDA0000039488110000421
(SEQ IDNO：25)
构件1752
使用所述盒的Asp718和NotI位点以及载体pCEP4克隆了以下的GILTΔ2-7Δ30-40-GAA70-952盆以产生pCEP-GILTΔ2-7Δ30-40-GAA70-952(质粒1752)。用于克隆的限制位点为小写加粗的。间隔区氨基酸序列Gly、Ala、Pro(加下划线的序列)将GAA基因与GILTΔ2-7Δ30-40标记(大写的序列)分开。该间隔区和标记位于GAA残基Ala70的上游。GILTΔ2-7Δ30-40盒含有从人IGF-II序列中氨基酸残基30-40(Arg-Pro-Ala-Ser-Arg-Val-Ser-Arg-Arg-Ser-Arg)的缺失。
Figure BDA0000039488110000431
agctgctagcaagctaattcacaccaATGGGAATCCCAATGGGGAAGTCGATGCTGGTGCTTCTCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTCTGTGCGGCGGGGAGCTGGTGGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCGGCATCGTTGAGGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGTGACCTGGCCCTCCTGGAGACGTACTGTGCTACCCCCGCCAAGTCCGAGGGCGCGCCGgcacaccccggccgtcccagagcagtgcccacacagtgcgacgtcccccccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcacccaggaacagtgcgaggcccgcggctgctgctacatccctgcaaagcaggggctgcagggagcccagatggggcagccctggtgcttcttcccacccagctaccccagctacaagctggagaacctgagctcctctgaaatgggctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttcttccccaaggacatcctgaccctgcggctggacgtgatgatggagactgagaaccgcctccacttcacgatcaaagatccagctaacaggcgctacgaggtgcccttggagaccccgcgtgtccacagccgggcaccgtccccactctacagcgtggagttctctgaggagcccttcggggtgatcgtgcaccggcagctggacggccgcgtgctgctgaacacgacggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacctcgctgccctcgcagtatatcacaggcctcgccgagcacctcagtcccctgatgctcagcaccagctggaccaggatcaccctgtggaaccgggaccttgcgcccacgcccggtgcgaacctctacgggtctcaccctttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtgttcctgctaaacagcaatgccatggatgtggtcctgcagccgagccctgcccttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctacatcttcctgggcccagagcccaagagcgtggtgcagcagtacctggacgttgtgggatacccgttcatgccgccatactggggcctgggcttccacctgtgccgctggggctactcctccaccgctatcacccgccaggtggtggagaacatgaccagggcccacttccccctggacgtccaatggaacgacctggactacatggactcccggagggacttcacgttcaacaaggatggcttccgggacttcccggccatggtgcaggagctgcaccagggcggccggcgctacatgatgatcgtggatcctgccatcagcagctcgggccctgccgggagctacaggccctacgacgagggtctgcggaggggggttttcatcaccaacgagaccggccagccgctgattgggaaggtatggcccgggtccactgccttccccgacttcaccaaccccacagccctggcctggtgggaggacatggtggctgagttccatgaccaggtgcccttcgacggcatgtggattgacatgaacgagccttccaacttcatcaggggctctgaggacggctgccccaacaatgagctggagaacccaccctacgtgcctggggtggttggggggaccctccaggcggcaaccatctgtgcctccagccaccagtttctctccacacactacaacctgcacaacctctacggcctgaccgaagccatcgcctcccacagggcgctggtgaaggctcgggggacacgcccatttgtgatctcccgctcgacctttgctggccacggccgatacgccggccactggacgggggacgtgtggagctcctgggagcagctcgcctcctccgtgccagaaatcctgcagtttaacctgctgggggtgcctctggtcggggccgacgtctgcggcttcctgggcaacacctcagaggagctgtgtgtgcgctggacccagctgggggccttctaccccttcatgcggaaccacaacagcctgctcagtctgccccaggagccgtacagcttcagcgagccggcccagcaggccatgaggaaggccctcaccctgcgctacgcactcctcccccacctctacacgctgttccaccaggcccacgtcgcgggggagaccgtggcccggcccctcttcctggagttccccaaggactctagcacctggactgtggaccaccagctcctgtggggggaggccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaaggccgaagtgactggctacttccccttgggcacatggtacgacctgcagacggtgccaatagaggcccttggcagcctcccacccccacctgcagctccccgtgagccagccatccacagcgaggggcagtgggtgacgctgccggcccccctggacaccatcaacgtccacctccgggctgggtacatcatccccctgcagggccctggcctcacaaccacagagtcccgccagcagcccatggccctggctgtggccctgaccaagggtggagaggcccgaggggagctgttctgggacgatggagagagcctggaagtgctggagcgaggggcctacacacaggtcatcttcctggccaggaataacacgatcgtgaatgagctggtacgtgtgaccagtgagggagctggcctgcagctgcagaaggtgactgtcctgggcgtggccacggcgccccagcaggtcctctccaacggtgtccctgtctccaacttcacctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtctcgctgttgatgggagagcagtttctcgtcagctggtgttagtctagagcttgcta(SEQID NO：26)
构件1753
使用所述盒的Asp718和NotI位点以及载体pCEP4克隆了以下的GILTΔ2-7Δ31-40-GAA70-952盒以产生pCEP-GILTΔ2-7Δ31-40-GAA70-952(质粒1753)。用于克隆的限制位点为小写加粗的。间隔区氨基酸序列Gly、Ala、Pro(加下划线的序列)将GAA基因与GILTΔ2-7Δ31-40标记(大写的序列)分开。该间隔区和标记位于GAA残基Ala70的上游。GILTΔ2-7Δ31-40盒含有从人IGF-II序列中氨基酸残基31-40(Pro-Ala-Ser-Arg-Val-Ser-Arg-Arg-Ser-Arg)的缺失。
agctgctagcaagctaattcacaccaATGGGAATCCCAATGGGGAAGTCGATGCTGGTGCTTCTCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTCTGTGCGGCGGGGAGCTGGTGGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGGGCATCGTTGAGGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGTGACCTGGCCCTCCTGGAGACGTACTGTGCTACCCCCGCCAAGTCCGAGGGCGCGCCGgcacaccccggccgtcccagagcagtgcccacacagtgcgacgtcccccccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcacccaggaacagtgcgaggcccgcggctgctgctacatccctgcaaagcaggggctgcagggagcccagatggggcagccctggtgcttcttcccacccagctaccccagctacaagctggagaacctgagctcctctgaaatgggctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttcttccccaaggacatcctgaccctgcggctggacgtgatgatggagactgagaaccgcctccacttcacgatcaaagatccagctaacaggcgctacgaggtgcccttggagaccccgcgtgtccacagccgggcaccgtccccactctacagcgtggagttctctgaggagcccttcggggtgatcgtgcaccggcagctggacggccgcgtgctgctgaacacgacggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacctcgctgccctcgcagtatatcacaggcctcgccgagcacctcagtcccctgatgctcagcaccagctggaccaggatcaccctgtggaaccgggaccttgcgcccacgcccggtgcgaacctctacgggtctcaccctttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtgttcctgctaaacagcaatgccatggatgtggtcctgcagccgagccctgcccttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctacatcttcctgggcccagagcccaagagcgtggtgcagcagtacctggacgttgtgggatacccgttcatgccgccatactggggcctgggcttccacctgtgccgctggggctactcctccaccgctatcacccgccaggtggtggagaacatgaccagggcccacttccccctggacgtccaatggaacgacctggactacatggactcccggagggacttcacgttcaacaaggatggcttccgggacttcccggccatggtgcaggagctgcaccagggcggccggcgctacatgatgatcgtggatcctgccatcagcagctcgggccctgccgggagctacaggccctacgacgagggtctgcggaggggggttttcatcaccaacgagaccggccagccgctgattgggaaggtatggcccgggtccactgccttccccgacttcaccaaccccacagccctggcctggtgggaggacatggtggctgagttccatgaccaggtgcccttcgacggcatgtggattgacatgaacgagccttccaacttcatcaggggctctgaggacggctgccccaacaatgagctggagaacccaccctacgtgcctggggtggttggggggaccctccaggcggcaaccatctgtgcctccagccaccagtttctctccacacactacaacctgcacaacctctacggcctgaccgaagccatcgcctcccacagggcgctggtgaaggctcgggggacacgcccatttgtgatctcccgctcgacctttgctggccacggccgatacgccggccactggacgggggacgtgtggagctcctgggagcagctcgcctcctccgtgccagaaatcctgcagtttaacctgctgggggtgcctctggtcggggccgacgtctgcggcttcctgggcaacacctcagaggagctgtgtgtgcgctggacccagctgggggccttctaccccttcatgcggaaccacaacagcctgctcagtctgccccaggagccgtacagcttcagcgagccggcccagcaggccatgaggaaggccctcaccctgcgctacgcactcctcccccacctctacacgctgttccaccaggcccacgtcgcgggggagaccgtggcccggcccctcttcctggagttccccaaggactctagcacctggactgtggaccaccagctcctgtggggggaggccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaaggccgaagtgactggctacttccccttgggcacatggtacgacctgcagacggtgccaatagaggcccttggcagcctcccacccccacctgcagctccccgtgagccagccatccacagcgaggggcagtgggtgacgctgccggcccccctggacaccatcaacgtccacctccgggctgggtacatcatccccctgcagggccctggcctcacaaccacagagtcccgccagcagcccatggccctggctgtggccctgaccaagggtggagaggcccgaggggagctgttctgggacgatggagagagcctggaagtgctggagcgaggggcctacacacaggtcatcttcctggccaggaataacacgatcgtgaatgagctggtacgtgtgaccagtgagggagctggcctgcagctgcagaaggtgactgtcctgggcgtggccacggcgccccagcaggtcctctccaacggtgtccctgtctccaacttcacctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtctcgctgttgatgggagagcagtttctcgtcagctggtgttagtctagagcttgcta
Figure BDA0000039488110000451
(SEQ ID NO：27)
构件1754
使用所述盒的Asp718和NotI位点以及载体pCEP4克隆了以下的GILTΔ2-7Δ32-40-GAA70-952盆以产生pCEP-GILTΔ2-7Δ32-40-GAA70-952(质粒1754)。用于克隆的限制位点为小写加粗的。间隔区氨基酸序列Gly、Ala、Pro(加下划线的序列)将GAA基因与GILTΔ2-7Δ32-40标记(大写的序列)分开。该间隔区和标记位于GAA残基Ala70的上游。GILTΔ2-7Δ32-40盒含有从人IGF-II序列中氨基酸残基32-40(Ala-Ser-Arg-Val-Ser-Arg-Arg-Ser-Arg)的缺失。
Figure BDA0000039488110000452
agctgctagcaagctaattcacaccaATGGGAATCCCAATGGGGAAGTCGATGCTGGTGCTTCTCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTCTGTGCGGCGGGGAGCTGGTGGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCCGGCATCGTTGAGGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGTGACCTGGCCCTCCTGGAGACGTACTGTGCTACCCCCGCCAAGTCCGAGGGCGCGCCGgcacaccccggccgtcccagagcagtgcccacacagtgcgacgtcccccccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcacccaggaacagtgcgaggcccgcggctgctgctacatccctgcaaagcaggggctgcagggagcccagatggggcagccctggtgcttcttcccacccagctaccccagctacaagctggagaacctgagctcctctgaaatgggctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttcttccccaaggacatcctgaccctgcggctggacgtgatgatggagactgagaaccgcctccacttcacgatcaaagatccagctaacaggcgctacgaggtgcccttggagaccccgcgtgtccacagccgggcaccgtccccactctacagcgtggagttctctgaggagcccttcggggtgatcgtgcaccggcagctggacggccgcgtgctgctgaacacgacggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacctcgctgccctcgcagtatatcacaggcctcgccgagcacctcagtcccctgatgctcagcaccagctggaccaggatcaccctgtggaaccgggaccttgcgcccacgcccggtgcgaacctctacgggtctcaccctttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtgttcctgctaaacagcaatgccatggatgtggtcctgcagccgagccctgcccttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctacatcttcctgggcccagagcccaagagcgtggtgcagcagtacctggacgttgtgggatacccgttcatgccgccatactggggcctgggcttccacctgtgccgctggggctactcctccaccgctatcacccgccaggtggtggagaacatgaccagggcccacttccccctggacgtccaatggaacgacctggactacatggactcccggagggacttcacgttcaacaaggatggcttccgggacttcccggccatggtgcaggagctgcaccagggcggccggcgctacatgatgatcgtggatcctgccatcagcagctcgggccctgccgggagctacaggccctacgacgagggtctgcggaggggggttttcatcaccaacgagaccggccagccgctgattgggaaggtatggcccgggtccactgccttccccgacttcaccaaccccacagccctggcctggtgggaggacatggtggctgagttccatgaccaggtgcccttcgacggcatgtggattgacatgaacgagccttccaacttcatcaggggctctgaggacggctgccccaacaatgagctggagaacccaccctacgtgcctggggtggttggggggaccctccaggcggcaaccatctgtgcctccagccaccagtttctctccacacactacaacctgcacaacctctacggcctgaccgaagccatcgcctcccacagggcgctggtgaaggctcgggggacacgcccatttgtgatctcccgctcgacctttgctggccacggccgatacgccggccactggacgggggacgtgtggagctcctgggagcagctcgcctcctccgtgccagaaatcctgcagtttaacctgctgggggtgcctctggtcggggccgacgtctgcggcttcctgggcaacacctcagaggagctgtgtgtgcgctggacccagctgggggccttctaccccttcatgcggaaccacaacagcctgctcagtctgccccaggagccgtacagcttcagcgagccggcccagcaggccatgaggaaggccctcaccctgcgctacgcactcctcccccacctctacacgctgttccaccaggcccacgtcgcgggggagaccgtggcccggcccctcttcctggagttccccaaggactctagcacctggactgtggaccaccagctcctgtggggggaggccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaaggccgaagtgactggctacttccccttgggcacatggtacgacctgcagacggtgccaatagaggcccttggcagcctcccacccccacctgcagctccccgtgagccagccatccacagcgaggggcagtgggtgacgctgccggcccccctggacaccatcaacgtccacctccgggctgggtacatcatccccctgcagggccctggcctcacaaccacagagtcccgccagcagcccatggccctggctgtggccctgaccaagggtggagaggcccgaggggagctgttctgggacgatggagagagcctggaagtgctggagcgaggggcctacacacaggtcatcttcctggccaggaataacacgatcgtgaatgagctggtacgtgtgaccagtgagggagctggcctgcagctgcagaaggtgactgtcctgggcgtggccacggcgccccagcaggtcctctccaacggtgtccctgtctccaacttcacctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtctcgctgttgatgggagagcagtttctcgtcagctggtgttagtctagagcttgcta
Figure BDA0000039488110000461
Figure BDA0000039488110000462
(SEQ ID NO：28)
构件1755
使用所述盒的Asp718和NotI位点以及载体pCEP4克隆了以下的GILTΔ2-7Δ33-40-GAA70-952盒以产生pCEP-GILTΔ2-7Δ33-40-GAA70-952(质粒1755)。用于克隆的限制位点为小写加粗的。间隔区氨基酸序列Gly、Ala、Pro(加下划线的序列)将GAA基因与GILTΔ2-7Δ33-40标记(大写的序列)分开。该间隔区和标记位于GAA残基Ala70的上游。GILTΔ2-7Δ33-40盒含有从人IGF-II序列中氨基酸残基33-40(Ser-Arg-Val-Ser-Arg-Arg-Ser-Arg)的缺失。
Figure BDA0000039488110000463
agctgctagcaagctaattcacaccaATGGGAATCCCAATGGGGAAGTCGATGCTGGTGCTTCTCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTCTGTGCGGCGGGGAGCTGGTGGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCCGCAGGCATCGTTGAGGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGTGACCTGGCCCTCCTGGAGACGTACTGTGCTACCCCCGCCAAGTCCGAGGGCGCGCCGgcacaccccggccgtcccagagcagtgcccacacagtgcgacgtcccccccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcacccaggaacagtgcgaggcccgcggctgctgctacatccctgcaaagcaggggctgcagggagcccagatggggcagccctggtgcttcttcccacccagctaccccagctacaagctggagaacctgagctcctctgaaatgggctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttcttccccaaggacatcctgaccctgcggctggacgtgatgatggagactgagaaccgcctccacttcacgatcaaagatccagctaacaggcgctacgaggtgcccttggagaccccgcgtgtccacagccgggcaccgtccccactctacagcgtggagttctctgaggagcccttcggggtgatcgtgcaccggcagctggacggccgcgtgctgctgaacacgacggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacctcgctgccctcgcagtatatcacaggcctcgccgagcacctcagtcccctgatgctcagcaccagctggaccaggatcaccctgtggaaccgggaccttgcgcccacgcccggtgcgaacctctacgggtctcaccctttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtgttcctgctaaacagcaatgccatggatgtggtcctgcagccgagccctgcccttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctacatcttcctgggcccagagcccaagagcgtggtgcagcagtacctggacgttgtgggatacccgttcatgccgccatactggggcctgggcttccacctgtgccgctggggctactcctccaccgctatcacccgccaggtggtggagaacatgaccagggcccacttccccctggacgtccaatggaacgacctggactacatggactcccggagggacttcacgttcaacaaggatggcttccgggacttcccggccatggtgcaggagctgcaccagggcggccggcgctacatgatgatcgtggatcctgccatcagcagctcgggccctgccgggagctacaggccctacgacgagggtctgcggaggggggttttcatcaccaacgagaccggccagccgctgattgggaaggtatggcccgggtccactgccttccccgacttcaccaaccccacagccctggcctggtgggaggacatggtggctgagttccatgaccaggtgcccttcgacggcatgtggattgacatgaacgagccttccaacttcatcaggggctctgaggacggctgccccaacaatgagctggagaacccaccctacgtgcctggggtggttggggggaccctccaggcggcaaccatctgtgcctccagccaccagtttctctccacacactacaacctgcacaacctctacggcctgaccgaagccatcgcctcccacagggcgctggtgaaggctcgggggacacgcccatttgtgatctcccgctcgacctttgctggccacggccgatacgccggccactggacgggggacgtgtggagctcctgggagcagctcgcctcctccgtgccagaaatcctgcagtttaacctgctgggggtgcctctggtcggggccgacgtctgcggcttcctgggcaacacctcagaggagctgtgtgtgcgctggacccagctgggggccttctaccccttcatgcggaaccacaacagcctgctcagtctgccccaggagccgtacagcttcagcgagccggcccagcaggccatgaggaaggccctcaccctgcgctacgcactcctcccccacctctacacgctgttccaccaggcccacgtcgcgggggagaccgtggcccggcccctcttcctggagttccccaaggactctagcacctggactgtggaccaccagctcctgtggggggaggccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaaggccgaagtgactggctacttccccttgggcacatggtacgacctgcagacggtgccaatagaggcccttggcagcctcccacccccacctgcagctccccgtgagccagccatccacagcgaggggcagtgggtgacgctgccggcccccctggacaccatcaacgtccacctccgggctgggtacatcatccccctgcagggccctggcctcacaaccacagagtcccgccagcagcccatggccctggctgtggccctgaccaagggtggagaggcccgaggggagctgttctgggacgatggagagagcctggaagtgctggagcgaggggcctacacacaggtcatcttcctggccaggaataacacgatcgtgaatgagctggtacgtgtgaccagtgagggagctggcctgcagctgcagaaggtgactgtcctgggcgtggccacggcgccccagcaggtcctctccaacggtgtccctgtctccaacttcacctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtctcgctgttgatgggagagcagtttctcgtcagctggtgttagtctagagcttgcta
Figure BDA0000039488110000471
(SEQ ID NO：29)
构件1756
使用所述盒的Asp718和NotI位点以及载体pCEP4克隆了以下的GILTΔ2-7Δ34-40-GAA70-952盒以产生pCEP-GILTΔ2-7Δ34-40-GAA70-952(质粒1756)。用于克隆的限制位点为小写加粗的。间隔区氨基酸序列Gly、Ala、Pro(加下划线的序列)将GAA基因与GILTΔ2-7Δ34-40标记(大写的序列)分开。该间隔区和标记位于GAA残基Ala70的上游。GILTΔ2-7Δ34-40盒含有从人IGF-II序列中氨基酸残基34-40(Arg-Val-Ser-Arg-Arg-Ser-Arg)的缺失。
Figure BDA0000039488110000472
agctgctagcaagctaattcacaccaATGGGAATCCCAATGGGGAAGTCGATGCTGGTGCTTCTCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTCTGTGCGGCGGGGAGCTGGTGGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCCGCAAGCGGCATCGTTGAGGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGTGACCTGGCCCTCCTGGAGACGTACTGTGCTACCCCCGCCAAGTCCGAGGGCGCGCCGgcacaccccggccgtcccagagcagtgcccacacagtgcgacgtcccccccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcacccaggaacagtgcgaggcccgcggctgctgctacatccctgcaaagcaggggctgcagggagcccagatggggcagccctggtgcttcttcccacccagctaccccagctacaagctggagaacctgagctcctctgaaatgggctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttcttccccaaggacatcctgaccctgcggctggacgtgatgatggagactgagaaccgcctccacttcacgatcaaagatccagctaacaggcgctacgaggtgcccttggagaccccgcgtgtccacagccgggcaccgtccccactctacagcgtggagttctctgaggagcccttcggggtgatcgtgcaccggcagctggacggccgcgtgctgctgaacacgacggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacctcgctgccctcgcagtatatcacaggcctcgccgagcacctcagtcccctgatgctcagcaccagctggaccaggatcaccctgtggaaccgggaccttgcgcccacgcccggtgcgaacctctacgggtctcaccctttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtgttcctgctaaacagcaatgccatggatgtggtcctgcagccgagccctgcccttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctacatcttcctgggcccagagcccaagagcgtggtgcagcagtacctggacgttgtgggatacccgttcatgccgccatactggggcctgggcttccacctgtgccgctggggctactcctccaccgctatcacccgccaggtggtggagaacatgaccagggcccacttccccctggacgtccaatggaacgacctggactacatggactcccggagggacttcacgttcaacaaggatggcttccgggacttcccggccatggtgcaggagctgcaccagggcggccggcgctacatgatgatcgtggatcctgccatcagcagctcgggccctgccgggagctacaggccctacgacgagggtctgcggaggggggttttcatcaccaacgagaccggccagccgctgattgggaaggtatggcccgggtccactgccttccccgacttcaccaaccccacagccctggcctggtgggaggacatggtggctgagttccatgaccaggtgcccttcgacggcatgtggattgacatgaacgagccttccaacttcatcaggggctctgaggacggctgccccaacaatgagctggagaacccaccctacgtgcctggggtggttggggggaccctccaggcggcaaccatctgtgcctccagccaccagtttctctccacacactacaacctgcacaacctctacggcctgaccgaagccatcgcctcccacagggcgctggtgaaggctcgggggacacgcccatttgtgatctcccgctcgacctttgctggccacggccgatacgccggccactggacgggggacgtgtggagctcctgggagcagctcgcctcctccgtgccagaaatcctgcagtttaacctgctgggggtgcctctggtcggggccgacgtctgcggcttcctgggcaacacctcagaggagctgtgtgtgcgctggacccagctgggggccttctaccccttcatgcggaaccacaacagcctgctcagtctgccccaggagccgtacagcttcagcgagccggcccagcaggccatgaggaaggccctcaccctgcgctacgcactcctcccccacctctacacgctgttccaccaggcccacgtcgcgggggagaccgtggcccggcccctcttcctggagttccccaaggactctagcacctggactgtggaccaccagctcctgtggggggaggccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaaggccgaagtgactggctacttccccttgggcacatggtacgacctgcagacggtgccaatagaggcccttggcagcctcccacccccacctgcagctccccgtgagccagccatccacagcgaggggcagtgggtgacgctgccggcccccctggacaccatcaacgtccacctccgggctgggtacatcatccccctgcagggccctggcctcacaaccacagagtcccgccagcagcccatggccctggctgtggccctgaccaagggtggagaggcccgaggggagctgttctgggacgatggagagagcctggaagtgctggagcgaggggcctacacacaggtcatcttcctggccaggaataacacgatcgtgaatgagctggtacgtgtgaccagtgagggagctggcctgcagctgcagaaggtgactgtcctgggcgtggccacggcgccccagcaggtcctctccaacggtgtccctgtctccaacttcacctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtctcgctgttgatgggagagcagtttctcgtcagctggtgttagtctagagcttgcta
Figure BDA0000039488110000481
(SEQ ID NO：30)
构件1763
使用所述盒的Asp718和NotI位点以及载体pCEP4克隆了以下的GILTΔ2-7M1/L27A37-GAA70-952盒以产生pCEP-GILTΔ2-7M1/L27A37-GAA70-952(质粒1763)。用于克隆的限制位点为小写加粗的。间隔区氨基酸序列Gly、Ala、Pro(加下划线的序列)将GAA基因与GILTΔ2-7M1/L27A37标记(大写的序列)分开。该间隔区和标记位于GAA残基Ala70的上游。GILTΔ2-7M1/L27A37盒含有人IGFII序列中的Y27L和R37A取代。GILT盒的DNA序列与人DNA序列在每个第6个密码子处不同。
Figure BDA0000039488110000491
aagcttgccATGGGAATCCCAATGGGCAAGTCGATGCTGGTGCTGCTCACCTTCTTGGCCTTTGCCTCGTGCTGCATTGCCGCTCTGTGCGGCGGGGAACTGGTGGACACCCTCCAATTCGTCTGTGGGGACCGGGGCTTCCTGTTCAGCAGACCCGCAAGCCGTGTGAGTGCTCGCAGCCGTGGCATTGTTGAGGAGTGCTGTTTTCGCAGCTGTGACCTGGCTCTCCTGGAGACGTACTGCGCTACCCCCGCCAAGTCTGAGGGCGCGCCGgcacaccccggccgtcccagagcagtgcccacacagtgcgacgtcccccccaacagccgcttcgattgcgcccctgacaaggccatcacccaggaacagtgcgaggcccgcggctgctgctacatccctgcaaagcaggggctgcagggagcccagatggggcagccctggtgcttcttcccacccagctaccccagctacaagctggagaacctgagctcctctgaaatgggctacacggccaccctgacccgtaccacccccaccttcttccccaaggacatcctgaccctgcggctggacgtgatgatggagactgagaaccgcctccacttcacgatcaaagatccagctaacaggcgctacgaggtgcccttggagaccccgcgtgtccacagccgggcaccgtccccactctacagcgtggagttctctgaggagcccttcggggtgatcgtgcaccggcagctggacggccgcgtgctgctgaacacgacggtggcgcccctgttctttgcggaccagttccttcagctgtccacctcgctgccctcgcagtatatcacaggcctcgccgagcacctcagtcccctgatgctcagcaccagctggaccaggatcaccctgtggaaccgggaccttgcgcccacgcccggtgcgaacctctacgggtctcaccctttctacctggcgctggaggacggcgggtcggcacacggggtgttcctgctaaacagcaatgccatggatgtggtcctgcagccgagccctgcccttagctggaggtcgacaggtgggatcctggatgtctacatcttcctgggcccagagcccaagagcgtggtgcagcagtacctggacgttgtgggatacccgttcatgccgccatactggggcctgggcttccacctgtgccgctggggctactcctccaccgctatcacccgccaggtggtggagaacatgaccagggcccacttccccctggacgtccaatggaacgacctggactacatggactcccggagggacttcacgttcaacaaggatggcttccgggacttcccggccatggtgcaggagctgcaccagggcggccggcgctacatgatgatcgtggatcctgccatcagcagctcgggccctgccgggagctacaggccctacgacgagggtctgcggaggggggttttcatcaccaacgagaccggccagccgctgattgggaaggtatggcccgggtccactgccttccccgacttcaccaaccccacagccctggcctggtgggaggacatggtggctgagttccatgaccaggtgcccttcgacggcatgtggattgacatgaacgagccttccaacttcatcaggggctctgaggacggctgccccaacaatgagctggagaacccaccctacgtgcctggggtggttggggggaccctccaggcggcaaccatctgtgcctccagccaccagtttctctccacacactacaacctgcacaacctctacggcctgaccgaagccatcgcctcccacagggcgctggtgaaggctcgggggacacgcccatttgtgatctcccgctcgacctttgctggccacggccgatacgccggccactggacgggggacgtgtggagctcctgggagcagctcgcctcctccgtgccagaaatcctgcagtttaacctgctgggggtgcctctggtcggggccgacgtctgcggcttcctgggcaacacctcagaggagctgtgtgtgcgctggacccagctgggggccttctaccccttcatgcggaaccacaacagcctgctcagtctgccccaggagccgtacagcttcagcgagccggcccagcaggccatgaggaaggccctcaccctgcgctacgcactcctcccccacctctacacgctgttccaccaggcccacgtcgcgggggagaccgtggcccggcccctcttcctggagttccccaaggactctagcacctggactgtggaccaccagctcctgtggggggaggccctgctcatcaccccagtgctccaggccgggaaggccgaagtgactggctacttccccttgggcacatggtacgacctgcagacggtgccaatagaggcccttggcagcctcccacccccacctgcagctccccgtgagccagccatccacagcgaggggcagtgggtgacgctgccggcccccctggacaccatcaacgtccacctccgggctgggtacatcatccccctgcagggccctggcctcacaaccacagagtcccgccagcagcccatggccctggctgtggccctgaccaagggtggagaggcccgaggggagctgttctgggacgatggagagagcctggaagtgctggagcgaggggcctacacacaggtcatcttcctggccaggaataacacgatcgtgaatgagctggtacgtgtgaccagtgagggagctggcctgcagctgcagaaggtgactgtcctgggcgtggccacggcgccccagcaggtcctctccaacggtgtccctgtctccaacttcacctacagccccgacaccaaggtcctggacatctgtgtctcgctgttgatgggagagcagtttctcgtcagctggtgttagtctagagcttgcta(SEQ ID NO：31)
实施例3：GILT标记的GAA酶的表达和纯化
组织培养
如生产商(Invitrogen)所描述的，将GILT标记的GAA质粒各自转染到悬浮的FreeStyle 293-F细胞中。简要地，在37℃和8％CO2下，使细胞在位于回旋振荡器(orbital shaker)上的聚碳酸酯震荡烧瓶中的Opti-MEM I介质(Invitrogen)中生长。将细胞调节至1×106个细胞/ml的浓度，然后用1∶1∶1比率的mL细胞：μg DNA：μl 293fectin进行转染。在转染后5-7天收获培养等分试样，并在5,000xg下离心5分钟。将上清液在-80℃下冷冻保存。
蛋白质纯化和浓缩
起始材料为如上所述的从-80℃下保存融化的哺乳动物细胞培养上清液。加入柠檬酸至达到pH 6.0，然后加入硫酸铵至达到1M的最终浓度。将材料通过0.2μm的Supor-Mach过滤器(Nalgene)。
将过滤的材料装载到用HIC加载缓冲液(50mM柠檬酸，pH 6.0，1MAmSO4)准备的Phenyl-Sepharose(苯基-琼脂糖)TM 6Low Sub Fast-Flow(GE Healthcare)柱上。用10倍柱体积的HIC清洗缓冲液(50mM柠檬酸，pH 6.0，0.8M AmSO4)清洗柱，然后用5倍柱体积的HIC洗脱缓冲液(50mM柠檬酸，pH 6.0)洗脱。将来自洗脱峰的样品混合，并且使用微量离心(微量离心浓缩器，centricon)旋转浓缩器(Amicon)和Bio-Spin-6脱盐柱(Bio-Rad)将缓冲液交换为磷酸盐缓冲盐水(145.15mM NaCl，2.33mM KCl，10mM Na2HPO4，2mM KH2PO4，pH 6.2)。
酶活性
通过对硝基苯酚(PNP)酶测定确定了GAA的表达。将GAA酶在含有100mM醋酸钠(pH 4.2)和10mM对硝基苯酚(PNP)α-糖苷底物(Sigma N1377)的50μl反应混合物中培育。将反应在37℃培育20分钟并用300μl的100mM的碳酸钠终止。在96孔微量滴定板中测量了在405nm下的吸光度并与从对硝基苯酚(Sigma N7660)获得的标准曲线进行比较。将1个GAAPNP单元定义为1纳摩尔(nmole)水解的PNP/小时。
实施例4：竞争受体结合测定
在以96孔板规格进行的竞争结合实验中检查了GILT标记的蛋白质对IGF2受体(IGF2R)、IGF1受体(IGF1R)和胰岛素受体(IR)的亲和力。在室温下将受体在涂覆缓冲液(0.05M碳酸盐缓冲液，pH 9.6)中以0.5μg/孔(IGF2R)或1μg/孔(IGF1R，IR)的浓度涂覆到Reacti-结合白板上(Pierce，Cat#437111)过夜。用清洗缓冲液(磷酸盐缓冲盐水加0.05％的吐温-20)清洗板，然后在Super Blocking(超封闭)缓冲液(Pierce Cat#37516)中封闭1小时。在再次板清洗后，将生物素化的配体(Cell Sciences)加入孔中；IGF2R孔中加入8nM的IGF2-生物素，IGF1R孔中加入30nM的IGF1-生物素并且IR孔中加入20nM的胰岛素-生物素。与生物素化的配体一起，孔中还含有连续稀释的GILT标记的GAA蛋白样品或非生物素化的对照配体以起到生物素化的配体的结合抑制剂的作用。震荡培育2小时后，清洗板并且用抗生蛋白链菌素-HRP培育(R&D，Cat#890803，在封闭缓冲液中1∶200稀释，30分钟)，接着通过Super Elisa Pico化学发光底物(Super Elisa Pico Chemiluminescent Substrate)培育(Pierce，Cat#37070，5分钟)检测了结合的生物素化的配体。在425nm下测量化学发光信号。
在IGF2R结合竞争测定中对每个竞争剂浓度计算了结合的生物素化的配体百分比并且确定了IC50值(图4)。具有IGF2残基30-40缺失的蛋白1752显示出与GILT标记的ZC-701类似的IC50值(图4)，这表明IGF2环状区中的这些残基的缺失似乎不影响IGF2R结合。具有IGF2残基29-40缺失的蛋白1751表现出较高的IC50值(图4)，这表明它也不竞争与IGF2R的结合。
在单独的IGF2R测定板上，ZC-701与蛋白1763的比较得到了相差35％的IC50值(参见图5)。
在测量与生物素化的胰岛素竞争对结合在板上的胰岛素结合的测定中，与701或IGF-II相比，1751和1752蛋白不如抑制剂有效(参见图6)。这表明与，与701或IGF-II上完整的GILT标记相比，在对应于GILT标记的氨基酸30-40的环状区中具有缺失的1751和1752蛋白对胰岛素受体具有降低的亲和力。
在测量与生物素化的IGF-I竞争对结合在板上的IGF1R结合的测定中，与701、IGF-II或IGF-I相比，1763蛋白不如抑制剂有效(参见图7)。这表明，与ZC-701或IGF-II相比，在GILT标记中具有Δ2-7、Y27L和R37A突变的1763蛋白对IGF1受体具有降低的亲和力。
实施例4.另外的胰岛素受体结合测定
测试了蛋白质ZC-1487对胰岛素受体的结合亲和力。蛋白质ZC-1487包含GILTD2-7M1/A37盒，所述GILTD2-7M1/A37盒含有在人IGF2序列的氨基酸37处的Ala对Arg的取代，并且它耐受弗林蛋白酶的蛋白水解。从CHO细胞纯化该蛋白的两个不同批次，在测量与生物素化的胰岛素竞争对结合在板上的胰岛素结合的测定中分析了ZC-1487-B26和ZC-1487-B28。
通过将胰岛素、IGF-II、ZC710B20和ZC1487B26或ZC-1487-B28与生物素化的胰岛素竞争对胰岛素受体(胰岛素-R)的结合进行了胰岛素受体结合测定。
具体地，用浓度为1μg/孔/100μl(38.4nM)的胰岛素-R涂覆了白色Reacti-BindTM板。将涂覆的板在室温下培育过夜，然后用清洗缓冲液(300μl/孔)清洗3次。然后，用封闭缓冲液(300μl/孔)对板封闭1小时。重复清洗步骤，并且除去板上任何微量的溶液。
将20nM的生物素化的胰岛素与通过连续稀释的不同浓度的胰岛素、IGF-II、ZC701B20、B26和B28混合(最终浓度示出在表2中)。将100μl在20nM的胰岛素-生物素中的稀释的胰岛素、IGF-II、ZC710B20、ZC1487B26和ZC1487B28加入到涂覆的板中，并将板在室温下培育2小时。然后，用清洗缓冲液将板清洗3次。将100μl的链霉亲和素-HRP工作溶液(在10ml封闭缓冲液中的50μl链霉亲和素-HRP)加入到板中并将板在室温下培育30分钟。加入100μl含有Elisa-Pico化学发光底物的Elisa-Pico工作溶液，并在425nm下测量化学发光。表2、图8和图9中示出了示例性的结果。与ZC-701或胰岛素对照相比，两批ZC-1487均不如抑制剂有效。从表2和图8可以看出，抗弗林蛋白酶的肽ZC-1487B26与胰岛素受体的结合比ZC-701期望地低大于10倍并且比野生型IGF-II低大于20倍。
这表明与ZC-701上的GILT标记相比，1487蛋白对胰岛素受体具有降低的亲和力。
Figure BDA0000039488110000541
实施例5.吸收测定
对一些突变体测试了吸收活性的保留。用构件1479(R37K)、1487(R37A)或ZC-701转染了HEK293细胞。收获后，通过HIC色谱部分纯化培养上清液。在电泳前，用肽N-糖苷酶处理所有样品。
图10示出了通过SDS-PAGE和免疫印迹法分析的含有抗弗林蛋白酶的IGF-II突变蛋白标记的靶向的融合蛋白的部分纯化制剂。可以看出，含有R37A突变的构件1487所编码的融合蛋白耐受外源弗林蛋白酶。
图11示出了大鼠L6成肌细胞对抗弗林蛋白酶的GILT标记的GAA的示例性吸收结果。如图11所示，蛋白1479、1487、ZC-701和纯化的ZC-701的示例性K吸收分别为4.5nM、4.4nM、5.0nM和2.6nM，其表明构件1487(R37A)和1479(R37K)所编码的蛋白保留了有效吸收到大鼠L6成肌细胞中的能力。含有抗弗林蛋白酶的GILT标记的融合蛋白的有效吸收还表明抗弗林蛋白酶的标记保留了对CI-MPR的高亲和力。
等价物
仅仅使用常规试验方法，本领域的技术人员就将确认或能够确定本文所述的本发明的具体实施方式的多种等价物。不用于将本发明的范围限制于上述的说明，而是如所附权利要求中所陈述的。如本文所使用的，在说明书和权利要求书中的冠词“一个”、“一种”和“所述”除非明确相反地指明，否则均应理解为包括复数对象。除非相反地指明或以其他方式从上下文是显而易见的，否则如果给定产品或方法中存在、使用或以其他方式相关于一个、大于一个或全部组中成员的话，则认为包括“或”在组中一个或多个成员之间的权利要求或说明得到满足。本发明包括了其中在给定产品或方法中存在、使用或以其他方式相关于组中确切的一个成员的实施方式。本发明还包括了其中在给定产品或方法中存在、使用或以其他方式相关于组中大于一个或全部组中成员的实施方式。此外，应当理解本发明包含了这样的变化、组合和置换，其中除非另外指明或除非对本领域普通技术人员来说将明显会出现矛盾或者不一致的情况，否则将一个或多个权利要求的一个或多个限制、元素、从句、描述性术语等引入到从属于相同基础权利要求的另一个权利要求中(或者，作为相关的、任何其它权利要求)。在元素作为列表给出的情况下，例如，以马库什组或类似形式，应当理解还公开了元素的每个亚组并且可以从该组中除去任何元素。应当理解，一般来说，在本发明或本发明的方面被称作包含特定元素、特征等时，本发明的一些实施方式或本发明的方面由这样的元素、特征等组成或基本由它们组成。为了简单起见，在本文中没有对那些实施方式的每种情况进行具体说明。还应当理解，可以将本发明的任何实施方式，例如，在现有技术内找到的任何实施方式，明确地从权利要求中排除而无论是否在说明书中陈述了具体的排除。
还应理解，除非明确相反地指明，否则在本文所要求的包括大于一个动作的任何方法中，该方法所述的动作的顺序不必限制于其中说明该方法所述动作的顺序，而是本发明包括其中所述顺序受到限制的实施方式。此外，在权利要求书说明组合物的情况下，本发明包含了使用组合物的方法和制备组合物的方法。在权利要求书说明组合物的情况下，应当理解本发明包含了使用组合物的方法和制备组合物的方法。参考文献的合并
本申请中所引用的所有出版物和专利文献均以其整体作为参考并入以达到各个单独的出版物或专利文件的内容似乎并入本文中的相同程度。

Claims (31)

1.一种靶向的治疗性融合蛋白，包含：
溶酶体酶；以及
IGF-II突变蛋白，所述IGF-II突变蛋白具有与成熟人IGF-II(SEQ ID NO：1)至少70％相同的氨基酸序列，其中，所述IGF-II突变蛋白抗弗林蛋白酶的切割并且以不依赖于甘露糖-6-磷酸的方式与人的非阳离子依赖型甘露糖-6-磷酸受体结合。
2.一种靶向的治疗性融合蛋白，包含：
溶酶体酶；以及
IGF-II突变蛋白，所述IGF-II突变蛋白具有与成熟人IGF-II(SEQ ID NO：1)至少70％相同的氨基酸序列，并且相对于天然存在的人IGF-II对胰岛素受体的亲和力，所述IGF-II突变蛋白对胰岛素受体具有减小的结合亲和力；
其中，所述IGF-II突变蛋白以不依赖于甘露糖-6-磷酸的方式与人的非阳离子依赖型甘露糖-6-磷酸受体结合。
3.一种靶向的治疗性融合蛋白，包含：
溶酶体酶；以及
IGF-II突变蛋白，所述IGF-II突变蛋白具有与成熟人IGF-II(SEQ ID NO：1)至少70％相同的氨基酸序列，并且相对于天然存在的人IGF-II对胰岛素受体的亲和力，所述IGF-II突变蛋白对胰岛素受体具有减小的结合亲和力；
其中，所述IGF-II突变蛋白抗弗林蛋白酶的切割并且以不依赖于甘露糖-6-磷酸的方式与人的非阳离子依赖型甘露糖-6-磷酸受体结合。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的靶向的治疗性融合蛋白，其中，所述IGF-II突变蛋白包含在对应于SEQ ID NO：1的氨基酸30-40的区域内的突变。
5.根据前述权利要求中任一项所述的靶向的治疗性融合蛋白，其中，所述IGF-II突变蛋白包含在对应于SEQ ID NO：1的氨基酸34-40的区域内的突变，使得所述突变消除了至少一个弗林蛋白酶切割位点。
6.根据权利要求4或5所述的靶向的治疗性融合蛋白，其中，所述突变为氨基酸取代、缺失和/或插入。
7.根据权利要求6所述的靶向的治疗性融合蛋白，其中，所述突变为对应于SEQ ID NO：1的Arg37或Arg40的位置处的氨基酸取代。
8.根据权利要求7所述的靶向的治疗性融合蛋白，其中，所述氨基酸取代为Lys或Ala取代。
9.根据权利要求6所述的靶向的治疗性融合蛋白，其中，所述突变为对应于下列位置的氨基酸残基的缺失或替代，所述位置选自由SEQID NO：1的31-40、32-40、33-40、34-40、30-39、31-39、32-39、34-37、32-39、33-39、34-39、35-39、36-39、37-40、34-40、以及它们的组合组成的组。
10.根据前述权利要求中任一项所述的靶向的治疗性融合蛋白，其中，所述IGF-II突变蛋白进一步包含对应于SEQ ID NO：1的位置2-7的氨基酸的缺失或替代。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的靶向的治疗性融合蛋白，其中，所述IGF-II突变蛋白进一步包含对应于SEQ ID NO：1的位置1-7的氨基酸的缺失或替代。
12.根据前述权利要求中任一项所述的靶向的治疗性融合蛋白，其中，所述IGF-II突变蛋白进一步包含对应于SEQ ID NO：1的位置62-67的氨基酸的缺失或替代。
13.根据前述权利要求中任一项所述的靶向的治疗性融合蛋白，其中，所述IGF-II突变蛋白进一步包含对应于SEQ ID NO：1的Tyr27、Leu43或Ser26的位置处的氨基酸取代。
14.根据权利要求13所述的靶向的治疗性融合蛋白，其中，所述IGF-II突变蛋白至少包含选自由Tyr27Leu、Leu43Val、Ser26Phe、以及它们的组合组成的组中的氨基酸取代。
15.根据前述权利要求中任一项所述的靶向的治疗性融合蛋白，其中，所述IGF-II突变蛋白包含对应于SEQ ID NO：1的位置48-55的氨基酸。
16.根据前述权利要求中任一项所述的靶向的治疗性融合蛋白，其中，所述IGF-II突变蛋白包含选自由对应于SEQ ID NO：1的位置8、48、49、50、54和55的氨基酸组成的组中的至少三种氨基酸。
17.根据前述权利要求中任一项所述的靶向的治疗性融合蛋白，其中，所述IGF-II突变蛋白包含在对应于SEQ ID NO：1的位置54和55的位置处的氨基酸，每个所述氨基酸在pH 7.4下不带电或带负电。
18.根据前述权利要求中任一项所述的靶向的治疗性融合蛋白，其中，相对于天然存在的人IGF-II对IGF-I受体的亲和力，所述IGF-II突变蛋白对IGF-I受体具有减小的结合亲和力。
19.根据前述权利要求中任一项所述的靶向的治疗性融合蛋白，其中，所述溶酶体酶为人酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)、或其功能性变体。
20.根据权利要求18所述的靶向的治疗性融合蛋白，其中，所述溶酶体酶包含人GAA的氨基酸70-952。
21.根据前述权利要求中任一项所述的靶向的治疗性融合蛋白，其中，所述靶向的治疗性融合蛋白进一步包含在所述溶酶体酶与所述IGF-II突变蛋白之间的间隔区。
22.根据权利要求21所述的靶向的治疗性融合蛋白，其中，所述间隔区包含氨基酸序列Gly-Ala-Pro。
23.一种编码根据前述权利要求中任一项所述的靶向的治疗性融合蛋白的核酸。
24.一种包含根据权利要求23所述的核酸的细胞。
25.一种适合于治疗溶酶体贮积病的药物组合物，包含根据前述权利要求中任一项所述的靶向的治疗性融合蛋白。
26.一种治疗溶酶体贮积病的方法，包括向需要治疗的受试者给予根据前述权利要求中任一项所述的靶向的治疗性融合蛋白。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述溶酶体贮积病为蓬珀病。
28.根据权利要求26所述的方法，其中，所述溶酶体贮积病为法布里病。
29.根据权利要求26所述的方法，其中，所述溶酶体贮积病为高歇病。
30.一种生产靶向的治疗性融合蛋白的方法，包括以下步骤：
在细胞培养基中培养哺乳动物细胞，其中
所述哺乳动物细胞具有根据权利要求23所述的核酸；以及
在允许所述靶向的治疗性融合蛋白表达的条件下进行所述培养。
31.一种生产靶向的治疗性融合蛋白的方法，包括以下步骤：
在细胞培养基中培养弗林蛋白酶缺陷型细胞，其中
所述弗林蛋白酶缺陷型细胞具有编码包含溶酶体酶和IGF-II突变蛋白的融合蛋白的核酸，所述IGF-II突变蛋白具有与成熟人IGF-II(SEQ ID NO：1)至少70％相同的氨基酸序列，其中，所述IGF-II突变蛋白以不依赖于甘露糖-6-磷酸的方式与人的非阳离子依赖型甘露糖-6-磷酸受体结合；以及
其中，所述培养是在允许所述靶向的治疗性融合蛋白表达的条件下进行的。
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