CN102021232A

CN102021232A - 用于定量检测egfr突变的试剂盒

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Publication number: CN102021232A
Application number: CN2009101768525A
Authority: CN
Inventors: 许军普; 陈钊; 李隽�
Original assignee: YAKANGBO BIOLOGICAL SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd BEIJING
Current assignee: YAKANGBO BIOLOGICAL SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd BEIJING; Beijing ACCB Biotech Ltd
Priority date: 2009-09-22
Filing date: 2009-09-22
Publication date: 2011-04-20
Also published as: US20120237935A1; WO2011035538A1; EP2481809A1; EP2481809A4; JP2013505005A

Abstract

本发明涉及与分子靶向抗癌药物疗效相关的EGFR基因突变检测方法及检测试剂盒。尤其涉及一种在EGFR基因突变热点区域检测突变的荧光定量PCR检测方法、试剂盒及其应用。本发明对EGFR基因特定位点的突变进行检测，并可对分子靶向抗肿瘤药EGFR酪氨酸激酶抑制剂进行疗效预测，进而对肿瘤患者的临床个体化用药方案提供指导。

Description

用于定量检测EGFR突变的试剂盒

发明背景

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)是一种广泛分布于人体各组织细胞膜上的多功能糖蛋白，是HER/ErbB家族成员之一，与肿瘤增殖、血管生成、肿瘤转移和抗细胞凋亡有关。

大多数肿瘤细胞表达EGFR及其天然配体，结合后可引起自身的磷酸化，通过一系列反应将信号传递到核内，从而通过影响肿瘤细胞的生长凋亡，肿瘤血管生成，来影响肿瘤的发展与演进。

有研究表明EGFR在癌症启动和进展阶段发挥重要作用。针对EGFR的靶向治疗药物，如阿瓦斯丁(AVASTIN)、特罗凯(Erlotinib)，吉非替尼(Irressa)等EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKI)能通过阻断肿瘤细胞EGFR信号传导，来抑制肿瘤细胞的增生、侵袭、转移、血管生成并促进肿瘤细胞的凋亡。

但是临床实践显示仅有8-18％的非小细胞肺癌患者可以受益于易瑞沙等EGFR酪氨酸激酶抑制剂(Paez JG，et al，Science，2004，304：1497-1500；Sequist LV，et al，Oncologist，2007，12(1)：90-8)。目前发现，携带EGFR基因突变的病人疗效显著，突变的频率与易瑞沙相对敏感的人群相一致：女性多于男性；非吸烟者多于吸烟者；腺癌多于其他；东方人多于西方人。通过对易瑞沙相对敏感患者组织EGFR基因的突变分析，发现大多数个体在EGFR基因酪氨酸激酶区域发生突变。这些突变主要集中在外显子18-21上(Chan SK，et al，Eur J Cancer，2006，42(1)：17-23)。因此，通过EGFR基因18-21号外显子的突变检测可以很好预测易瑞沙等分子靶向药物的治疗效果。本发明主要考虑中国人EGFR基因突变的热点位点(韩宇等，中华肿瘤学杂志，2007，29(4)：278-282；郭健等，中国肺癌杂志，2007，10(6)：504-507)，通过实时定量PCR方法检测分子靶向抗肿瘤药疗效相关的肿瘤相关基因EGFR第18、19、21外显子5种类型的突变情况，通过本发明EGFR基因突变检测来预测易瑞沙等分子靶向药物的治疗效果。

本发明采用的检测方法具有以下几个优点：操作简单，易于标准化。其它方法如等位基因特异的寡核苷酸探针杂交法，对杂交的条件非常敏感，需要严格控制实验条件；限制性片段长度多态性实验需投入相当的人力操作，且不能定量。实验周期短，2小时内就可以完成。不需要测序验证结果，而直接测序法与高分辨溶解曲线分析需要4天-2周。敏感度高，我们通过对实验条件进行优化，突变检测的敏感度可达到1％，而直接测序法敏感度20-50％。特异性高，免疫组化方法假阳性与假阴性率高，且不能确定点突变的位置和类型；定量准确，这是本发明实验方法最独特的优点，通过绝对定量法处理数据，从而绘制标准曲线，精确测定样本中野生型与突变型基因的含量，进而得到突变型基因所占比例，辅助临床诊断和用药。另外，本发明安全无毒性，其它方法如错配碱基的化学断裂法需要用到同位素和剧毒化学试剂。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种EGFR基因突变的定量检测试剂盒。定量检测EGFR基因第18外显子(SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：2)2155位G碱基置换为A碱基；第19外显子(SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：3)2235-2249位碱基缺失；第19外显子2236-2250位碱基缺失；第19外显子2254-2277位碱基缺失；第21外显子(SEQ ID NO：1；SEQ ID NO：4)2573位T碱基置换为G碱基的突变情况。

为解决上述问题，本发明提供包含Taq酶、10×Taq缓冲液、MgCl₂、dNTP混合液及可特异性扩增EGFR基因突变位点序列的PCR引物与可特异性识别野生型与突变型序列的探针的定量检测试剂盒及检测方法：

(1)分别在EGFR基因第18、19、21外显子突变位点附近设计上下游引物，以及根据每个突变位点的突变情况设计特异性的探针，该探针可与EGFR特定位点的野生型或欲检测的突变型序列特异性结合，从而确定该位点有无发生所检测的基因突变。

(2)为精确定量所测EGFR突变比例，本发明设计了标准品。

(3)对待测样品与标准品进行荧光定量PCR检测。

(4)由标准品检测结果得到用于定量的标准曲线，由标准曲线计算得到待测样品核酸的EGFR基因突变占总体EGFR基因的比例。

所述步骤(1)之前还包括：对待测样品中的核酸进行提取、纯化和浓度测定。

荧光定量PCR检测所用探针在适宜的PCR条件下与EGFR基因突变位置的碱基序列特异性结合。所述探针优选在5’端连接有荧光发光基团，3’端连接有荧光淬灭基团。所述的荧光发射基团选自：FAM、TET、HEX、ROX；所述的荧光淬灭基团选自：BHQ、TAMARA。优选的，所述荧光发射基团为FAM，所述的荧光淬灭基团为BHQ。所述探针的序列优选为SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQID NO：30、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQID NO：38、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：42。

所述标准品至少包括质粒、基因组DNA或化学合成序列中的一种。优选地，所述标准品包含野生型质粒和/或突变型质粒，其中野生型质粒包含EGFR基因野生型序列，突变型质粒包含EGFR基因突变型序列。更优选地，所述标准品由野生型质粒和/或突变型质粒组成。优选地，所述野生型质粒包含的EGFR基因野生型序列为SEQ ID NO：46、SEQID NO：48或SEQ ID NO：52；所述突变型质粒包含的EGFR基因突变型序列为SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51或SEQ ID NO：53。

所述待检样品包括新鲜组织、石蜡包埋组织、细胞株、血液、胸腔积液、腹腔积液、唾液、消化液、尿液、唾液、粪便。

所述引物由上游引物与下游引物组成。所述引物优选为SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16。

所述的EGFR基因突变的定量检测试剂盒包括选自以下的试剂：如上所述的引物、探针和标准品。所述试剂盒优选还包括Taq酶、10×Taq缓冲液、MgCl₂、dNTP混合液。优选的引物与探针的比例为2∶1-10∶1，优选的正向与反向引物之间的比例为1∶3-3∶1。标准品包括以上所述的质粒按一定比例的混合，野生型质粒和突变型质粒的含量的比例分别为：0％-100％。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。

图1是本发明实施例2所用质粒标准品构建方法示意图。

图2是本发明实施例2野生型质粒图谱，箭头所指即为载体中插入野生型PCR产物序列的位置。

图3是本发明实施例2的野生型质粒标准品测序结果图，其中图A是EGFR 18外显子2155G野生型质粒测序图，图B是EGFR19外显子2235-2249位、2236-2250位、2254-2277位野生型质粒测序图，图C是EGFR 21外显子2573位T野生型质粒测序图。

图4是本发明实施例2的突变型质粒标准品测序结果图，箭头所指为碱基突变位点。其中图A是EGFR 18外显子2155G→A突变质粒测序图，图B是EGFR 19外显子2235-2249位缺失突变质粒测序图，图C是EGFR 19外显子2236-2250位缺失突变质粒测序图，图D是EGFR 19外显子2254-2277位缺失突变质粒测序图，图E是EGFR 21外显子第21外显子2573位T→G突变质粒测序图。

图5是本发明实施例3的标准品扩增曲线图，其中图A是EGFR 18外显子2155G野生型质粒标准品扩增曲线，图B是EGFR 19外显子2235-2249位、2236-2250位、2254-2277位野生型质粒标准品扩增曲线，图C是EGFR 21外显子2573位T野生型质粒标准品扩增曲线，图D是EGFR 18外显子2155G→A突变质粒标准品扩增曲线，图E是EGFR19外显子2235-2249位缺失突变质粒标准品扩增曲线，图F是EGFR 19外显子2236-2250位缺失突变质粒标准品扩增曲线，图G是EGFR 19外显子2254-2277位缺失突变质粒标准品扩增曲线，图H是EGFR 21外显子2573位T→G突变质粒标准品扩增曲线。

图6是根据图4绘制的标准曲线图，其中图A是EGFR 18外显子2155G野生型质粒标准曲线，图B是EGFR 19外显子2235-2249位、2236-2250位、2254-2277位野生型质粒标准曲线，图C是EGFR 21外显子2573位T野生型质粒标准曲线，图D是EGFR 18外显子2155G→A突变质粒标准曲线，图E是EGFR 19外显子2235-2249位缺失突变质粒标准曲线，图F是EGFR 19外显子2236-2250位缺失突变质粒标准曲线，图G是EGFR 19外显子2254-2277位缺失突变质粒标准品标准曲线，图H是EGFR 21外显子2573位T→G突变质粒标准品标准曲线

图7是本发明实施例3检测的组织样本EGFR 21外显子2573位野生型(图A)与T→G置换突变型(图B)荧光定量PCR扩增曲线图，组织样本EGFR 19外显子野生型(图C)与2235-2249位缺失突变型(图D)荧光定量PCR扩增曲线图，全血样本EGFR 19外显子2236-2250位缺失突变型(图E)荧光定量PCR扩增曲线图，全血样本EGFR2254-2277位缺失突变型(图F)荧光定量PCR扩增曲线图，细胞系样本EGFR 18外显子2155位野生型(图G)与G→A置换突变型(图H)荧光定量PCR扩增曲线图。

图8是本发明的定量方法示意图。

实施例

以下的实施例用于为本领域中的普通技术人员提供有关如何实施和使用本发明的完整披露和描述，并且这些例子并非意在对发明人所认为的发明范围进行限制，亦非意指下文的实验是被实施的全部实验而且是仅可实施的实验。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南第三版(Sambrook J.)，或按照厂商所建议的条件。

实施例1：人类新鲜肿瘤组织、石蜡包埋组织、外周血、胸水、人类细胞系基因组DNA抽提

我们所测试的人类癌细胞系包括非小细胞肺癌(NSCLC)(A549、H460、H838和H1703)、乳腺癌(MCF-7，BT474和HuL100)、恶性多间皮瘤细胞系(H513，H2052，H290，MS-1和H28)、结肠癌细胞系(SW480)、头颈癌细胞系(U87)、子宫颈癌(Hela)、肉瘤细胞系(Mes-SA、Saos-2和A204)。

我们所测试的人类新鲜肿瘤组织、外周血、石蜡包埋组织包括NSCLC、间皮瘤、结肠癌、恶性黑素瘤、肾癌、食道癌、甲状腺癌、恶性毒瘤和卵巢癌。

标本DNA抽提

可以使用Qiagen公司、Promega公司、Roche公司的DNA提取试剂盒提取样本基因组DNA，使用Gene公司Nanodrop ND1000型核酸微量测量仪检测所提DNA浓度与纯度(OD260/OD280约为1.8，OD260/OD230大于2.0)。下面以使用Promega公司的DNA提取试剂盒为例介绍样本DNA提取步骤：

1.新鲜组织DNA抽提

(1)用剪刀切取约黄豆粒大小的组织，置于研钵中，将组织剪碎，加液氮研成粉末。

(2)加入600μl预冷的裂解液于研钵中，用1ml大枪头吹打6次，尽量使组织粉末与裂解液混匀，转移混合物到1.5ml EP管中，上下颠倒6次混匀后65℃水浴20分钟。

(3)加3μl的RNA酶，上下颠倒6次混匀，37℃水浴20分钟。

(4)冷却到室温，加200μl蛋白沉淀剂，上下颠倒6次混匀，冰上放置5分钟后13,000*g，室温离心4分钟。

(5)转移上清至事先加600μl异丙醇(室温)的新EP管中，轻柔混匀6次后13,000*g，室温离心1分钟。

(6)弃上清，加600μl 70％乙醇(室温)至沉淀中，上下颠倒6次混匀后13,000*g，室温离心1分钟。

(7)吸干乙醇，空气干燥15分钟。

(8)沉淀加入40μl DNA溶解液，65℃1小时或4℃过夜。

2.石蜡包埋组织DNA抽提

(1)将1mg或少于1mg的组织放入1.5ml离心管内。

(2)加入新鲜制备的100μl温育缓冲液/蛋白酶K溶液。根据样品的类型，56℃温育过夜。

(3)取出温育的样品管，加入两倍体积的裂解缓冲液。

(4)高速涡旋振荡树脂10秒钟至树脂完全悬浮，加入7μl完全悬浮的树脂。高速涡旋振荡3秒钟后室温温育5分钟。

(5)高速涡旋振荡2秒钟，将管子放在

磁分离架上。磁分离立刻进行。

(6)小心去除所有溶液，不要触碰管壁上的树脂。

(7)加入100μl裂解缓冲液，从磁分离架上取下管子，并高速涡旋振荡2秒钟。

(8)将管子放回到磁分离架上，并去除所有的裂解液。

(9)加入100μl配制的1x洗涤液，从磁分离架上取下管子，并高速涡旋振荡2秒钟。

(10)将管子放回到磁分离架上，去掉所有洗涤液。

(11)重复步骤9和10两次，共3次洗涤，并确保在最后一次洗涤后，除去所有的液体。

(12)打开盖子，将管子放在磁分离架上，空气中干燥5分钟。

(13)加入25μl洗脱液。

(14)盖上管盖并高速涡旋振荡2秒钟。65℃温育5分钟。

(15)取出温育的管子，高速涡旋振荡2秒钟。立即放到磁分离架上。

(16)将DNA溶液小心地转移到选定的容器中。

3.全血DNA抽提

(1)收集抗凝全血300μl，加入900μl细胞裂解液，用1ml枪头吹打混匀6次，尽量使全血与细胞裂解液混匀，室温放置10分钟，期间用1ml枪头吹打混匀3次。

(2)13,000*g，室温离心20秒后弃上清，剧烈震荡，加入300μl预冷的裂解液，用1ml枪头吹打混匀至沉淀完全溶解。

(3)加1.5μl的RNA酶，上下颠倒6次混匀，37℃水浴20分钟。

(4)冷却到室温，加100μl蛋白沉淀剂，上下颠倒6次混匀，冰上放置5分钟后13,000*g，室温离心4分钟。

(5)转移上清至事先加300μl异丙醇(室温)的新EP管中，轻柔混匀6次后13,000*g，室温离心1分钟。

(6)弃上清，加1ml 70％乙醇(室温)至沉淀中，上下颠倒6次混匀13,000*g，室温离心1分钟。

(7)吸干乙醇，空气干燥15分钟。

(8)沉淀加入40μl DNA溶解液，65℃1小时或4℃过夜。

4.胸水DNA抽提

(1)收集胸水5ml，2000rpm室温离心10分钟，取上清加入1ml细胞裂解液，颠倒混匀6次，室温放置10分钟。

(2)13,000*g，室温离心20秒后弃上清，剧烈震荡，加入1ml预冷的裂解液，混匀至沉淀完全溶解。

(3)加3μl的RNA酶，上下颠倒6次混匀，37℃水浴20分钟。

(5)转移上清至事先加5ml异丙醇(室温)的新EP管中，轻柔混匀6次后13,000*g，室温离心1分钟。

(7)吸干乙醇，空气干燥15分钟。

(8)沉淀加入40μl DNA溶解液，65℃1小时或4℃过夜。

5.细胞系DNA抽提

(1)收集至少约1×10⁶的细胞并转移至1.5ml的EP管中，13,000*g，室温离心10秒，如果是贴壁细胞，收集细胞前要用胰酶消化。

(2)弃上清，加200μl PBS洗细胞，13,000*g，室温离心10秒后，弃上清，剧烈震荡至沉淀混悬。

(3)加入600μl预冷的裂解液，用1ml大枪头吹打混匀至没有肉眼可见的细胞块。

(4)加3μl的RNA酶，上下颠倒6次混匀，37℃水浴20分钟。

(5)冷却到室温，加200μl蛋白沉淀剂，上下颠倒6次混匀，冰上放置5分钟后13,000*g，室温离心4分钟。

(6)转移上清至事先加600μl异丙醇(室温)的新EP管中，轻柔混匀6次后13,000*g，室温离心1分钟。

(7)弃上清，加600μl 70％乙醇(室温)至沉淀中，上下颠倒6次混匀后13,000*g，室温离心1分钟。

(8)吸干乙醇，空气干燥15分钟。

(9)沉淀加入40μl DNA溶解液，65℃1小时或4℃过夜。

实施例2：含突变型与野生型检测序列的质粒标准品的准备

1.野生型质粒构建(图1，图2)

1.1载体的准备

TA克隆载体pMD18-T购自TAKARA公司。

1.2插入片段的准备

使用PCR方法制备插入片段，PCR的模板为经步骤1提取的样本基因组DNA，反应体系与扩增条件如下表(表1、表2、表3)：

表1：PCR反应体系(50μl)

若制备含EGFR基因第18外显子2155位野生型序列的质粒，扩增体系中需要加入E18-F-1(SEQ ID NO：5)或E18-F-2(SEQ ID NO：6)与E18-R-1(SEQ ID NO：7)或E18-R-2(SEQ ID NO：8)引物序列；若制备含EGFR基因第19外显子2235-2249位、2236-2250位、2254-2277位野生型的质粒，扩增体系中需要加入E19-F-1(SEQ ID NO：9)或E19-F-2(SEQ ID NO：10)与E19-R-1(SEQ ID NO：11)或E19-R-2(SEQID NO：12)引物序列；若制备EGFR基因第21外显子2573位野生型序列的质粒，扩增体系中需要加入E21-F-1(SEQ ID NO：13)或E21-F-2(SEQ ID NO：14)与E21-R-1(SEQ ID NO：15)或E21-R-2(SEQ IDNO：16)引物序列。

表2：PCR引物

表3：PCR扩增条件

1.3使用QIAgen凝胶回收试剂盒回收目标片段后，通过TA克隆将其连接入pMD18-T载体(购自TAKARA公司)。

1.4新构建的质粒在大肠杆菌DH5α菌株中进行大量扩增，并通过抽提纯化获得(具体方法见《分子克隆实验指南》第三版第96-99、103页)。

1.5利用BamH1与Hind111对其进行双酶切鉴定。

1.6将酶切结果呈阳性的菌种送测序，测序正确后作为含野生型序列的标准品(图3)。

2.突变型质粒构建：设计突变点处的突变引物，利用DPN1法得到含突变型序列的标准品。

2.1根据希望得到的突变序列，设计突变点处的突变引物(表4)。

表4：突变引物

2.2以5ng野生型质粒为模板，利用突变引物以及Pfu酶，突变目标位点。扩增体系与条件如表1、表4、表3。

在制备含EGFR基因第18外显子2155位G→A突变序列的质粒过程中，扩增体系中需要加入E18-M-F(SEQ ID NO：17)与E18-M-R(SEQID NO：18)引物；在制备含EGFR基因第19外显子2235-2249位缺失突变型序列的质粒过程中，扩增体系中需要加入E19-1-F(SEQ IDNO：19)与E19-1-R(SEQ ID NO：20)引物；在制备含EGFR基因第19外显子2236-2250位缺失突变型序列的质粒过程中，扩增体系中需要加入E19-2-F(SEQ ID NO：21)与E19-2-R(SEQ ID NO：22)引物；在制备含EGFR基因第19外显子2254-2277位缺失突变型序列的质粒过程中，扩增体系中需要加入E19-3-F(SEQ ID NO：23)与E19-3-R(SEQ IDNO：24)引物；在制备含EGFR基因第21外显子2573位T→G突变序列的质粒过程中，扩增体系中需要加入E21-M-F(SEQ ID NO：25)与E21-M-R引物(SEQ ID NO：26)。

2.3利用DPN1酶对步骤2.2.得到的产物进行处理，37℃温育1小时后产物回收，在大肠杆菌DH5α菌株中进行大量扩增，并通过抽提纯化获得。

2.4利用BamH1与Hind111对其进行双酶切鉴定。

2.5将酶切结果呈阳性的菌种送测序，测序正确后作为含突变型序列的标准品(图4)。

实施例3：以肺癌与子宫颈癌样本为例：人类细胞系、人类新鲜肿瘤组织、外周血、石蜡包埋组织基因组DNA EGFR突变检测

1.荧光定量PCR反应模板为实施例1提取的肺癌与子宫颈癌样本基因组DNA与实施例2制备的标准品，以双蒸水为阴性对照。为制作标准曲线，标准品倍比稀释为1ng/μl、0.5ng/μl、0.25ng/μl、0.125ng/μl、0.0625ng/μl、0.03125ng/μl。

2.反应体系及反应条件(表2、表5、表6、表7)，其中标记探针荧光发射基团选自：FAM、TET、HEX、ROX；荧光淬灭基团选自：BHQ、TAMARA。

表5：荧光定量PCR反应体系(20μl/管)

若检测EGFR基因第18外显子2155位G→A突变情况则需要配置2个体系，即分别加入E18-F-1(SEQ ID NO：5)或E18-F-2(SEQ ID NO：6)与E18-R-1(SEQ ID NO：7)或E18-R-2(SEQ ID NO：8)引物、E18W-1(SEQ ID NO：27)或E18W-2(SEQ ID NO：28)探针；E18-F-1(SEQ IDNO：5)或E18-F-2(SEQ IDNO：6)与E18-R-1(SEQ IDNO：7)或E18-R-2(SEQ ID NO：8)引物、E18M-1(SEQ ID NO：29)或E18W-2(SEQ IDNO：30)探针。

若检测第19外显子2235-2249位缺失、2236-2250位缺失、2254-2277位缺失突变情况则需要配置4个体系即分别加入E19-F-1(SEQ ID NO：9)或E19-F-2(SEQ ID NO：10)与E19-R-1(SEQ ID NO：11)或E19-R-2(SEQ ID NO：12)引物、E19W-1(SEQ ID NO：31)或E19W-2(SEQ ID NO：32)探针；E19-F-1(SEQ ID NO：9)或E19-F-2(SEQ IDNO：10)与E19-R-1(SEQ ID NO：11)或E19-R-2(SEQ ID NO：12)引物、E19M1-1(SEQ ID NO：33)或E19M1-2(SEQ ID NO：34)探针；E19-F-1(SEQ ID NO：9)或E19-F-2(SEQ ID NO：10)与E19-R-1(SEQ ID NO：11)或E19-R-2(SEQ ID NO：12)引物、E19M2-1探针(SEQ ID NO：35)或E19M2-2(SEQ ID NO：36)；E19-F-1(SEQ ID NO：9)或E19-F-2(SEQID NO：10)与E19-R-1(SEQ ID NO：11)或E19-R-2(SEQ ID NO：12)引物、E19M3-1(SEQ ID NO：37)或E19M3-2(SEQ ID NO：38)探针。

若检测第21外显子2573位T→G突变情况则需要配置2个体系，即分别加入E21-F-1(SEQ ID NO：13)或E21-F-2(SEQ ID NO：14)与E21-R-1(SEQ ID NO：15)或E21-R-2(SEQ ID NO：16)引物、E21W-1(SEQ ID NO：39)或E21W-2(SEQ ID NO：40)探针；21-F-1(SEQ IDNO：13)或E21-F-2(SEQ ID NO：14)与E21-R-1(SEQ ID NO：15)或E21-R-2(SEQ ID NO：16)引物、E21M-1(SEQ ID NO：41)或E21M-2(SEQ ID NO：42)探针。

表6：探针

表7：扩增条件

3.绘制标准曲线

根据步骤3中标准品所得CT值结果绘制绘制标准曲线。图5为质粒标准品扩增曲线，在图中，上升的5条曲线自左到右依次分别代表倍比稀释为0.5ng/μl、0.25ng/μl、0.125ng/μl、0.0625ng/μl、0.03125ng/μl的质粒标准品的扩增曲线。横轴指循环数，纵轴指荧光检测值。由此可进一步绘制用于计算的标准曲线(图6)。在图6中，横轴为模板拷贝数的对数值，纵轴为CT值。其中模板拷贝数＝质量/分子量×6.02×10²³，质粒分子量≈碱基数×324.5，也可以使用软件DNAMAN计算，本实验中质粒由pMD18-T载体与插入片段共同组成，由于插入片段碱基长度基本一致，最大的差距仅有二十几个碱基的长度，相对于PMD18-T载体2692bp的长度影响不大，所以野生型与突变型质粒标准品的拷贝数之比≈质量之比，本实验质粒的分子量≈890～900Kda，因此1ng质粒拷贝数约为6.69×10⁸～6.76×10⁸。

4.标本EGFR基因特定突变型比例计算

根据标准曲线，由样本的CT值求出反应的野生型与突变型基因组DNA的拷贝数，从而求得突变型EGFR DNA与EGFR DNA总量(该位点野生型加所有突变型)的比值。如图7所示测得某组织样本EGFR

21外显子野生型CT值为19.15，2573位T→G突变型为20.74，则由分别对应的标准曲线公式(图6)可以求得各自的拷贝数，由此可知突变型与野生型的含量之比为89∶100，推测组织中有约47％的EGFR基因发生2573位T→G突变。

5.检测结果

本实施例对48例肺癌与子宫颈癌的组织、全血与细胞系标本进行了EGFR基因突变的检测。共检测到13例发生突变，具体的突变例数见表8，突变比例即该样本中突变基因与未突变基因的比值见表9

表8：EGFR突变例数

表9：EGFR突变比例

实施例4：人类细胞系、人类新鲜肿瘤组织、外周血、石蜡包埋组织基因组mRNA EGFR突变检测

1.标本总RNA提取

使用Invotrogen公司OMEGA公司的总RNA提取试剂盒提取样本RNA，使用Gene公司Nanodrop ND1000型核酸微量测量仪检测所提RNA浓度与纯度(OD260/280在1.8-2.0范围内，OD260/230＞2.0)。

2.cDNA合成：

逆转录采用M-MLV逆转录酶进行，步骤和反应体系如表10：

表10：逆转录体系(10μl)与步骤

3.标准品的制备方法、实时荧光定量PCR检测步骤与实施例1类似，制备野生型质粒标准品所用引物及待测样品荧光定量PCR检测时所用探针与实施例1相同，不同的是制备野生型质粒标准品与待测样品荧光定量PCR检测时所用引物不同(表11)；标准曲线绘制及标本EGFR基因特定突变型含量计算方法同实施例1。

表11：cDNA为模板时，制备野生型质粒标准品与待测样品荧光定量PCR检测时所用引物

野生型质粒标准品制备引物的选择：

若制备含EGFR基因第18外显子2155位野生型序列的质粒，需要加入E18-F-1(SEQ ID NO：5)与E18-R-3(SEQ ID NO：43)引物；若制备含EGFR基因第19外显子2235-2249位、2236-2250位、2254-2277位野生型的质粒需要加入E19-F-1(SEQ ID NO：9)与E19-R-3(SEQ IDNO：44)引物；若制备EGFR基因第21外显子2573位野生型序列的质粒，需要加入E21-F-1(SEQ ID NO：13)与E21-R-2引物(SEQ ID NO：45)。

待测样品荧光定量PCR检测时引物与探针的选择：

若若检测EGFR基因第18外显子2155位G→A突变情况则需要配置2个体系，即分别加入E18-F-1(SEQ ID NO：5)与E18-R-3(SEQ IDNO：43)引物、E18W-1(SEQ ID NO：27)或E18W-2(SEQ ID NO：28)探针；E18-F-1(SEQ ID NO：5)与E18-R-3(SEQ ID NO：43)引物、E18M-1(SEQ ID NO：29)或E18W-2(SEQ ID NO：30)探针。

若检测第19外显子2235-2249位缺失、2236-2250位缺失、2254-2277位缺失突变情况则需要配置4个体系即分别加入E19-F-1(SEQ ID NO：9)与E19-R-3(SEQ ID NO：44)引物、E19W-1(SEQ IDNO：31)或E19W-2(SEQ ID NO：32)探针；E19-F-1(SEQ ID NO：9)与E19-R-3(SEQ ID NO：44)引物、E19M1-1(SEQ ID NO：33)或E19M1-2(SEQ ID NO：34)探针；E19-F-1(SEQ ID NO：9)与E19-R-3(SEQ IDNO：44)引物、E19M2-1探针(SEQ ID NO：35)或E19M2-2(SEQ IDNO：36)；E19-F-1(SEQ ID NO：9)与E19-R-3(SEQ ID NO：44)引物、E19M3-1(SEQ ID NO：37)或E19M3-2(SEQ ID NO：38)探针。

若检测第21外显子2573位T→G突变情况则需要配置2个体系，即分别加入E21-F-1(SEQ ID NO：13)与E21-R-3(SEQ ID NO：45)引物、E21W-1(SEQ ID NO：39)或E21W-2(SEQ ID NO：40)探针；E21-F-1(SEQ ID NO：13)与E21-R-3(SEQ ID NO：45)引物、E21M-1(SEQ IDNO：41)或E21M-2(SEQ ID NO：42)探针。

序列表：

<110>北京雅康博生物科技有限公司

<120>用于定量检测EGFR突变的试剂盒

<210>1

<211>3633bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：1 EGFR基因外显子序列(参考NCBI序列NM_005228，2155位点、2235-2277序列、2573位点以下划线标注)

<400>1

ATGCGACCCTCCGGGACGGCCGGGGCAGCGCTCCTGGCGCTGCTGGCTGCGCTCT

GCCCGGCGAGTCGGGCTCTGGAGGAAAAGAAAGTTTGCCAAGGCACGAGTAACA

AGCTCACGCAGTTGGGCACTTTTGAAGATCATTTTCTCAGCCTCCAGAGGATGTTC

AATAACTGTGAGGTGGTCCTTGGGAATTTGGAAATTACCTATGTGCAGAGGAATT

ATGATCTTTCCTTCTTAAAGACCATCCAGGAGGTGGCTGGTTATGTCCTCATTGCC

CTCAACACAGTGGAGCGAATTCCTTTGGAAAACCTGCAGATCATCAGAGGAAAT

ATGTACTACGAAAATTCCTATGCCTTAGCAGTCTTATCTAACTATGATGCAAATA

AAACCGGACTGAAGGAGCTGCCCATGAGAAATTTACAGGAAATCCTGCATGGCG

CCGTGCGGTTCAGCAACAACCCTGCCCTGTGCAACGTGGAGAGCATCCAGTGGCG

GGACATAGTCAGCAGTGACTTTCTCAGCAACATGTCGATGGACTTCCAGAACCAC

CTGGGCAGCTGCCAAAAGTGTGATCCAAGCTGTCCCAATGGGAGCTGCTGGGGTG

CAGGAGAGGAGAACTGCCAGAAACTGACCAAAATCATCTGTGCCCAGCAGTGCT

CCGGGCGCTGCCGTGGCAAGTCCCCCAGTGACTGCTGCCACAACCAGTGTGCTGC

AGGCTGCACAGGCCCCCGGGAGAGCGACTGCCTGGTCTGCCGCAAATTCCGAGA

CGAAGCCACGTGCAAGGACACCTGCCCCCCACTCATGCTCTACAACCCCACCACG

TACCAGATGGATGTGAACCCCGAGGGCAAATACAGCTTTGGTGCCACCTGCGTGA

AGAAGTGTCCCCGTAATTATGTGGTGACAGATCACGGCTCGTGCGTCCGAGCCTG

TGGGGCCGACAGCTATGAGATGGAGGAAGACGGCGTCCGCAAGTGTAAGAAGTG

CGAAGGGCCTTGCCGCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTATTGGTGAATTTAAAGA

CTCACTCTCCATAAATGCTACGAATATTAAACACTTCAAAAACTGCACCTCCATC

AGTGGCGATCTCCACATCCTGCCGGTGGCATTTAGGGGTGACTCCTTCACACATA

CTCCTCCTCTGGATCCACAGGAACTGGATATTCTGAAAACCGTAAAGGAAATCAC

AGGGTTTTTGCTGATTCAGGCTTGGCCTGAAAACAGGACGGACCTCCATGCCTTT

GAGAACCTAGAAATCATACGCGGCAGGACCAAGCAACATGGTCAGTTTTCTCTTG

CAGTCGTCAGCCTGAACATAACATCCTTGGGATTACGCTCCCTCAAGGAGATAAG

TGATGGAGATGTGATAATTTCAGGAAACAAAAATTTGTGCTATGCAAATACAATA

AACTGGAAAAAACTGTTTGGGACCTCCGGTCAGAAAACCAAAATTATAAGCAAC

AGAGGTGAAAACAGCTGCAAGGCCACAGGCCAGGTCTGCCATGCCTTGTGCTCCC

CCGAGGGCTGCTGGGGCCCGGAGCCCAGGGACTGCGTCTCTTGCCGGAATGTCAG

CCGAGGCAGGGAATGCGTGGACAAGTGCAAGCTTCTGGAGGGTGAGCCAAGGGA

GTTTGTGGAGAACTCTGAGTGCATACAGTGCCACCCAGAGTGCCTGCCTCAGGCC

ATGAACATCACCTGCACAGGACGGGGACCAGACAACTGTATCCAGTGTGCCCACT

ACATTGACGGCCCCCACTGCGTCAAGACCTGCCCGGCAGGAGTCATGGGAGAAA

ACAACACCCTGGTCTGGAAGTACGCAGACGCCGGCCATGTGTGCCACCTGTGCCA

TCCAAACTGCACCTACGGATGCACTGGGCCAGGTCTTGAAGGCTGTCCAACGAAT

GGGCCTAAGATCCCGTCCATCGCCACTGGGATGGTGGGGGCCCTCCTCTTGCTGC

TGGTGGTGGCCCTGGGGATCGGCCTCTTCATGCGAAGGCGCCACATCGTTCGGAA

GCGCACGCTGCGGAGGCTGCTGCAGGAGAGGGAGCTTGTGGAGCCTCTTACACC

CAGTGGAGAAGCTCCCAACCAAGCTCTCTTGAGGATCTTGAAGGAAACTGAATTC

AAAAAGATCAAAGTGCTGGGCTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATAAGGGACTCT

GGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAG

AAGCAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGAAGCCTACGTGATGG

CCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCAC

CGTGCAACTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGG

GAACACAAAGACAATATTGGCTCCCAGTACCTGCTCAACTGGTGTGTGCAGATCG

CAAAGGGCATGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGTGCACCGCGACCTGGCAG

CCAGGAACGTACTGGTGAAAACACCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCT

GGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAG

TGCCTATCAAGTGGATGGCATTGGAATCAATTTTACACAGAATCTATACCCACCA

GAGTGATGTCTGGAGCTACGGGGTGACCGTTTGGGAGTTGATGACCTTTGGATCC

AAGCCATATGACGGAATCCCTGCCAGCGAGATCTCCTCCATCCTGGAGAAAGGA

GAACGCCTCCCTCAGCCACCCATATGTACCATCGATGTCTACATGATCATGGTCA

AGTGCTGGATGATAGACGCAGATAGTCGCCCAAAGTTCCGTGAGTTGATCATCGA

ATTCTCCAAAATGGCCCGAGACCCCCAGCGCTACCTTGTCATTCAGGGGGATGAA

AGAATGCATTTGCCAAGTCCTACAGACTCCAACTTCTACCGTGCCCTGATGGATG

AAGAAGACATGGACGACGTGGTGGATGCCGACGAGTACCTCATCCCACAGCAGG

GCTTCTTCAGCAGCCCCTCCACGTCACGGACTCCCCTCCTGAGCTCTCTGAGTGCA

ACCAGCAACAATTCCACCGTGGCTTGCATTGATAGAAATGGGCTGCAAAGCTGTC

CCATCAAGGAAGACAGCTTCTTGCAGCGATACAGCTCAGACCCCACAGGCGCCTT

GACTGAGGACAGCATAGACGACACCTTCCTCCCAGTGCCTGAATACATAAACCAG

TCCGTTCCCAAAAGGCCCGCTGGCTCTGTGCAGAATCCTGTCTATCACAATCAGC

CTCTGAACCCCGCGCCCAGCAGAGACCCACACTACCAGGACCCCCACAGCACTGC

AGTGGGCAACCCCGAGTATCTCAACACTGTCCAGCCCACCTGTGTCAACAGCACA

TTCGACAGCCCTGCCCACTGGGCCCAGAAAGGCAGCCACCAAATTAGCCTGGAC

AACCCTGACTACCAGCAGGACTTCTTTCCCAAGGAAGCCAAGCCAAATGGCATCT

TTAAGGGCTCCACAGCTGAAAATGCAGAATACCTAAGGGTCGCGCCACAAAGCA

GTGAATTTATTGGAGCATGA

<210>2

<211>200bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：2 EGFR18部分野生型DNA序列(参考NCBI序列NT_033968.5)

<400>2

GCTGAGGTGA CCCTTGTCTC TGTGTTCTTG TCCCCCCCAG CTTGTGGAGC

55209117

CTCTTACACC CAGTGGAGAA GCTCCCAACC AAGCTCTCTT GAGGATCTTG

55209167

AAGGAAACTG AATTCAAAAA GATCAAAGTG CTGGGCTCCG GTGCGTTCGG

55209217

CACGGTGTAT AAGGTAAGGT CCCTGGCACA GGCCTCTGGG CTGGGCCGCA

55209267

<210>3

<211>300bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：3 EGFR19部分野生型DNA序列(参考NCBI序列NT_033968.5)

<400>3

CGTCACAGCC CCCAGCAATA TCAGCCTTAG GTGCGGCTCC ACAGCCCCAG

55209797

TGTCCCTCAC CTTCGGGGTG CATCGCTGGT AACATCCACC CAGATCACTG

55209847

GGCAGCATGT GGCACCATCT CACAATTGCC AGTTAACGTC TTCCTTCTCT

55209897

CTCTGTCATA GGGACTCTGG ATCCCAGAAG GTGAGAAAGT TAAAATTCCC

55209947

GTCGCTATCA AGGAATTAAG AGAAGCAACA TCTCCGAAAG CCAACAAGGA

55209997

AATCCTCGAT GTGAGTTTCT GCTTTGCTGT GTGGGGGTCC ATGGCTCTGA

55210047

<210>4

<211>300bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：4 EGFR 21部分野生型DNA序列(参考NCBI序列NT_033968.5)

<400>4

TTCTTCCCAT GATGATCTGT CCCTCACAGC AGGGTCTTCT CTGTTTCAGG

55226906

GCATGAACTA CTTGGAGGAC CGTCGCTTGG TGCACCGCGA CCTGGCAGCC

55226956

AGGAACGTAC TGGTGAAAAC ACCGCAGCAT GTCAAGATCA CAGATTTTGG

55227006

GCTGGCCAAA CTGCTGGGTG CGGAAGAGAA AGAATACCAT GCAGAAGGAG

55227056

GCAAAGTAAG GAGGTGGCTT TAGGTCAGCC AGCATTTTCC TGACACCAGG

55227106

GACCAGGCTG CCTTCCCACT AGCTGTATTG TTTAACACAT GCAGGGGAGG

55227156

<210>5

<211>20bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：5 EGFR 18外显子上游引物

<400>5

GAGGATCTTGAAGGAAACTG

<210>6

<211>19bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：6 EGFR 18外显子上游引物

<400>6

CCAGCTTGTGGAGCCTCTT

<210>7

<211>19bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：7 EGFR 18外显子下游引物

<400>7

GCCAGGGACCTTACCTTAT

<210>8

<211>21bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：8 EGFR 18外显子下游引物

<400>8

CTGTGCCAGGGACCTTACCTT

<210>9

<211>19bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：9 EGFR 19外显子上游引物

<400>9

CCCAGAAGGTGAGAAAGTT

<210>10

<211>20bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：10 EGFR 19外显子上游引物

<400>10

GGGACTCTGGATCCCAGAAG

<210>11

<211>18bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：11 EGFR 19外显子下游引物

<400>11

CCTGAGGTTCAGAGCCAT

<210>12

<211>19bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：12 EGFR 19外显子下游引物

<400>12

CCCACACAGCAAAGCAGAA

<210>13

<211>20bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：13 EGFR 21外显子上游引物

<400>13

GCAGCCAGGAACGTACTGGT

<210>14

<211>20bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：14 EGFR 21外显子上游引物

<400>14

CCCTCACAGCAGGGTCTTCT

<210>15

<211>18bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：15 EGFR 21外显子下游引物

<400>15

GTGGGAAGGCAGCCTGGT

<210>16

<211>18bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：16 EGFR 21外显子下游引物

<400>16

GTGGGAAGGCAGCCTGGT

<210>17

<211>21bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：17 EGFR 18外显子2155位G→A突变上游引物

<400>17

TGCTGAGCTCCGGTGCGTTCG

<210>18

<211>21bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：18 EGFR 18外显子2155位G→A突变下游引物

<400>18

GGAGCTCAGCACTTTGATCTT

<210>19

<211>21bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：19 EGFR 19外显子2235-2249位缺失突变上游引物

<400>19

ATCAAAACATCTCCGAAAGCC

<210>20

<211>21bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：20 EGFR 19外显子2235-2249位缺失突变下游引物

<400>20

ATGTTTTGATAGCGACGGGAA

<210>21

<211>21bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：21 EGFR 19外显子2236-2250位缺失突变上游引物

<400>21

TCAAGACATCTCCGAAAGCCA

<210>22

<211>21bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：22 EGFR 19外显子2236-2250位缺失突变下游引物

<400>22

GATGTCTTGATAGCGACGGGA

<210>23

<211>21bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：23 EGFR 19外显子2254-2277位缺失突变上游引物

<400>23

CAACACTCGATGTGAGTTTCT

<210>24

<211>21bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：24 EGFR 19外显子2254-2277位缺失突变下游引物

<400>24

TCGAGTGTTGCTTCTCTTAAT

<210>25

<211>21bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：25 EGFR 21外显子2573位T→G突变上游引物

<400>25

TGGGCGGGCCAAACTGCTGGG

<210>26

<211>21bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：26 EGFR 21外显子2573位T→G突变下游引物

<400>26

TGGCCCGCCCAAAATCTGTGA

<210>27

<211>18bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：27 EGFR 18外显子野生型探针

<400>27

GGCTCCGGTGCGTTCGGC

<210>28

<211>21bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：28 EGFR 18外显子野生型探针

<400>28

CGGAGCCCAGCACTTTGATCT

<210>29

<211>19bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：29 EGFR 18外显子2155位G→A突变型探针

<400>29

TGCTGAGCTCCGGTGCGTT

<210>30

<211>22bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：30 EGFR 18外显子2155位G→A突变型探针

<400>30

CGGAGCTCAGCACTTTGATCTT

<210>31

<211>25bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：31 EGFR 19外显子野生型探针

<400>31

TCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATC

<210>32

<211>26bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：32 EGFR 19外显子野生型探针

<400>32

CGGAGATGTTGCTTCTCTTAATTCCT

<210>33

<211>21bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：33 EGFR 19外显子2235-2249位缺失突变型探针

<400>33

CCCGTCGCTATCAAAACATCT

<210>34

<211>21bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：34 EGFR 19外显子2235-2249位缺失突变型探针

<400>34

AGATGTTTTGATAGCGACGGG

<210>35

<211>22bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：35 EGFR 19外显子2236-2250位缺失突变型探针

<400>35

CCCGTCGCTATCAAGACATCTC

<210>36

<211>22bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：36 EGFR 19外显子2236-2250位缺失突变型探针

<400>36

GAGATGTCTTGATAGCGACGGG

<210>37

<211>23bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：37 EGFR 19外显子2254-2277位缺失突变型探针

<400>37

AATTAAGAGAAGCAACACTCGAT

<210>38

<211>23bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：38 EGFR 19外显子2254-2277位缺失突变型探针

<400>38

ATCGAGTGTTGCTTCTCTTAATT

<210>39

<211>20bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：39 EGFR 21外显子野生型探针

<400>39

TGGCCAGCCCAAAATCTGTG

<210>40

<211>23bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：40 EGFR 21外显子野生型探针

<400>40

AAGATCACAGATTTTGGGCTGGC

<210>41

<211>19bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：41 EGFR 21外显子2573位T→G突变型探针

<400>41

TGGCCCGCCCAAAATCTGT

<210>42

<211>21bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：42 EGFR 21外显子2573位T→G突变型探针

<400>42

GATCACAGATTTTGGGCGGGC

<210>43

<211>18bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：43 EGFR 18外显子下游引物

<400>43

TGGGATCCAGAGTCCCTT

<210>44

<211>20bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：44 EGFR 19外显子下游引物

<400>44

GTCTTTGTGTTCCCGGACAT

<210>45

<211>20bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：45 EGFR21外显子下游引物

<400>45

GCCTCCTTCTGCATGGTATT

<210>46

<211>18bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：46含EGFR基因第18外显子2155位G碱基的核酸序列(2155位点以下划线标注)

<400>46

AAAGTGCTGGGCTCCGGT

<210>47

<211>18bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：47含EGFR基因第18外显子2155位A碱基的DNA序列(2155位点以下划线标注)

<400>47

AAAGTGCTGGGCTCCGGT

<210>48

<211>53bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：48含EGFR基因第19外显子2235-2277位野生型序列的DNA序列(2235-2277位以下划线标注)

<400>48

TCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGAT

<210>49

<211>38bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：49含EGFR基因第19外显子2235-2249位缺失突变型序列的DNA序列

<400>49

CGCTATCAAAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCC

<210>50

<211>39bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：50含EGFR基因第19外显子2236-2250位缺失突变型序列的DNA序列

<400>50

CGTCGCTATCAAGACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAAT

<210>51

<211>35bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：51含EGFR基因第19外显子2254-2277位缺失突变型序列的DNA序列

<400>51

AAGAGAAGCAACACTCGATGTGAGTTTCTGCTTTG

<210>52

<211>18bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：52含EGFR基因第21外显子2573位T碱基的DNA序列(2573位点以下划线标注)

<400>52

ACAGATTTTGGGCTGGCC

<210>53

<211>18bp

<212>DNA

<213>SEQ ID NO：53含EGFR基因第21外显子2573位G碱基的DNA序列(2573位点以下划线标注)

<400>53

ACAGATTTTGGGCGGGCC

Claims

1.一种聚合酶链式反应引物，其在适宜的PCR条件下与EGFR基因突变位置的上下游200个以内的核苷酸结合。

2.如权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物由上游引物与下游引物组成。

3.一种荧光定量PCR探针，其在适宜的PCR条件下与EGFR基因突变位置的碱基序列特异性结合。

4.如权利要求3所述的探针，其特征在于，所述探针5’端连接有荧光发光基团，3’端连接有荧光淬灭基团。

5.一种质粒，该质粒包含待检测的EGFR基因野生型序列。

6.如权利要求5所述的质粒，其特征在于，所述质粒包含的EGFR基因野生型序列为SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：52。

7.一种质粒，该质粒包含待检测的EGFR基因突变型序列。

8.如权利要求7所述的质粒，其特征在于，所述质粒包含的EGFR基因突变型序列为SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQID NO：51或SEQ ID NO：53。

9.一种EGFR基因突变的定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括选自以下的试剂：如权利要求1或2所述的引物、权利要求3或4所述的探针、以及权利要求5和/或7所述的质粒。

10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，引物与探针的比例为2∶1-10∶1，正向与反向引物之间的比例为1∶3-3∶1。