CN102027998B - 芽孢杆菌芽胞和木霉菌厚垣孢子复合制剂、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于防治植物病害的复合制剂，所述复合制剂包含芽孢杆菌芽胞和木霉菌厚垣孢子。本发明还提供了制备该复合制剂的方法及其应用。

Description

芽孢杆菌芽胞和木霉菌厚垣孢子复合制剂、其制备方法及应用

技术领域

本申请涉及生物技术领域，尤其是农业生物技术领域。具体而言，本申请涉及芽孢杆菌芽胞和木霉菌厚垣孢子复合制剂、其制备方法及应用。

背景技术

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一种嗜温性的好氧产芽孢的杆状细菌，其生理特征丰富多样，分布广泛，极易分离培养。该菌在自然界中广泛存在，对人畜无毒无害，不污染环境，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力。枯草芽孢杆菌不仅可以在土壤、植物根际、体表等外界环境中广泛存在，同时还是植物体内常见的植物内生细菌，尤其是在植物的根、茎部。目前该菌已经在水稻、辣椒、棉花、小麦、黄瓜、大豆、玉米等农作物上显现出很好的病害防治效果。枯草芽孢杆菌最突出的特征是生长快、营养简单，能产生耐热抗逆的芽孢，这不仅有利于生防菌剂的生产、剂型加工及在环境中的存活、定殖与繁殖，而且批量生产工艺简单，成本也较低，施用方便，储存期长，是一种理想的生防微生物，具有广阔的应用前景。

枯草芽孢杆菌通过定殖在植物根际、体表或体内，同病原菌竞争植物周围的营养、分泌抗菌物质抑制病原菌生长，同时诱导植物防御系统抵御病原菌入侵，从而达到生防的目的。主要防治对象大部分为丝状真菌所引起的植物病害，如水稻纹枯病(Stagonospora curtisii)、番茄叶霉病(Cladosporium fulvum)、大豆根腐病(Fusariumgraminerarum)、苹果霉心病(Alternaria alternata)、棉花立枯病(Rhizoctonia solani)、棉花枯萎病(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)等。枯草芽孢杆菌生防机制主要包括竞争作用、拮抗作用和诱导抗性作用3个方面。另外，枯草芽孢杆菌产生的具有生防活性的抗菌物质，包括脂肽类、肽类、蛋白类、磷脂类、多烯类、氨基酸类和核酸类等多种化合物，它们对真菌、细菌、病毒等具有抑制作用。

尽管枯草芽孢杆菌作为生物杀菌剂在植物病害的生物防治中取得了一定的成就，但从整体上看还存在不少问题(R.campbell，1993)。

首先，作为生物杀菌剂，枯草芽孢杆菌在田间效果表现并不稳定，这可能由于通常采用室内保存多代的菌株，与野生菌株活性有较大差异，且室内盆栽试验与田间复杂的微生态环境迥然不同，造成室内抑菌圈测定结果与田间结果差异较大。其次，微生物制剂其毒性和安全性一般认为好与化学药剂，倾向于无毒和无残留，但是一些微生物制剂也可能引起病原菌抗性，特别是那些以抗生素类分泌物抑制病原菌的菌株。欧洲已将产抗生素杆菌肽锌的枯草芽孢杆菌畜用制剂列入禁用名单，理由是容易产生耐药性和抗生素残留。我国对微生物农药安全性的研究还很少，多数没有引起足够的重视。最后，作为微生物农药，其防治成本一般要高于化学药剂，而且主要为保护剂，在植物发病后使用，效果较差，有些甚至无效，这是许多微生物农药都存在的弊病。

为解决上述存在的问题，增强生防菌的生防效果，并改善它们对环境条件的适应性等，国内外许多实验室已在利用细胞工程和基因工程技术进行生防微生物的遗传改良，构建新型高效的生防菌(王金生，2002)。如陈中义等(1999)通过质粒载体将Bt基因导入水稻生防芽孢杆菌B916，室内试验表明重组菌株具有良好的杀虫防病作用和很好的遗传稳定性。但由于不少拮抗基因特别是抗生素合成基因均由结构复杂的基因簇构成，遗传操作比较困难。因此，有关技术还需进一步研究。

木霉用于防治植物病害的历史已有70多年，其生防效果已得到公认，是全世界应用较为广泛的生防菌。木霉属于半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，粘孢菌类，是一类普遍存在于土壤中的真菌，是土壤微生物的重要群落，其可寄生于植物残体及动物粪便上，从植物根围、叶片及种子、球茎表面也经常可以分离到，木霉能够寄生于多种土传植物的病原菌上。八十年代以来，随着分子生物学的快速发展，木霉的研究主要集中在如何提高其生物防效方面，如通过加强几丁质酶、葡聚糖酶基因的表达、种间融合等手段。木霉菌PDA培养菌落初为棉絮状或致密丛束状，颜色为白色至灰白色，无固定形状。当分生孢子成熟后，菌落自中央到边缘，渐渐变为不同程度的绿色，极少数为白色粉状。分生孢子梗从菌丝的侧枝生出，直立分枝，小枝常对生，顶端不膨大，上生分生孢子团。分生孢子球形，浅色或无色。大部分木霉对营养的需求并不严格，它们可在各种碳源和氮源下生长，同时可转化和降解一些有害或持久有害的环境污染物；可直接利用各种单糖、单糖的衍生物、有机酸类；有显著的降解各种多糖(纤维素、半纤维素)和相关的多聚糖(几丁质)；还可转化和降解一些农药，如：马拉硫磷、茅草枯、五氯硝基苯等。木霉可利用复杂和简单的氮，水解酪蛋白氨基酸混合液、天门冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸均能很好利用，在高氮条件下有利于木霉产生一些酶，如纤维素酶、乳糖酶等。木霉是需氧菌，适合的氧压有利于菌丝的生长和孢子产生；最佳pH为4.0-6.5；生长温度因种而不同，大多数在25℃左右生长十分迅速，并自我调节环境的pH值，使环境适应其生长条件。

木霉菌的拮抗作用范围具有广谱性，相关研究显示，木霉菌至少对18个属29种病原真菌有拮抗作用。木霉菌能寄生的植物病原菌即拮抗对象包括丝核菌属(Rhizotonoa)、小核菌(Sclerotium)、核盘菌属(Sclerotinia)、长蠕孢属(Helminth osporium)、镰刀菌属(Fusarium)、毛盘孢属(Colletotrichum、轮枝孢属(Verticillium)、黑星菌属(Venturia)、内座壳属(Endothia)、腐霉属(Pythium)、疫霉属(Phytophthora)、间座壳属(Diaporthe)和黑星孢属(Fusicladium)等等。

目前市场上的木霉制剂均是分生孢子制剂和菌丝型制剂，多是由固体发酵而来。固态发酵不仅是目前真菌培养通过气生菌丝获得大量分生孢子的最好方法，而且其特有的优势已使其被广泛应用和研究。另外，固体发酵产生的分生孢子比液体发酵产生的分生孢子质量好，耐干燥力强，存活时间长。而且在田间应用时，固态发酵产物可直接施用，无需制成制剂，后处理简单，成本低。但其生产和应用规模不大，究其原因，最关键的难题没有解决：即产品的货架期短。一般以分生孢子为有效成分的制剂，保证活菌含量的时间不会超过3个月，后期所接制剂中的木霉存活量难以达到要求，其防效的稳定性没有得到有效保证，在植物病害防治中目前尚不能完全取代化学防治等其它治理措施。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了以下技术方案。

本发明第一方面提供了一种用于防治植物病害的复合制剂，所述复合制剂包含芽孢杆菌芽胞和木霉菌厚垣孢子。

在一个较佳的实施方案中，所述复合制剂是可湿性粉剂，所述复合制剂包含载体和润湿分散剂，所述载体选自白碳黑或硅藻土，所述润湿分散剂选自烷基萘磺酸盐。在一个更佳的实施方案中，所述载体的含量为5-30％(W/W)，所述润湿分散剂的含量为0.5-5％(W/W)，以发酵液的重量为基准(以可湿性粉剂干燥之前发酵液的重量为基准)。在另一个较佳的实施方案中，所述复合制剂中所述芽孢杆菌芽胞的含量为10⁸-10¹⁰个细胞/克(制剂)，所述木霉菌厚垣孢子的含量为10⁸-10⁹个活孢子/克(制剂)。

本发明另一方面提供了一种制备上述复合制剂的方法，该方法包括以下步骤：

(1)提供含芽孢杆菌芽胞的发酵液以及含木霉菌厚垣孢子的发酵液；

(2)将含木霉菌厚垣孢子的发酵液匀浆，然后与含芽孢杆菌芽胞的发酵液混合，得到所述复合制剂。

在一个较佳的实施方案中，所述步骤(1)中的含木霉菌厚垣孢子的发酵液用以下方法获得：

在发酵培养基中，温度25～33℃、种子接种量5～10％、种子浓度10⁵-10⁶个/mL、通气比1∶2至2∶1，罐压0.03-0.05MPa下，发酵84-96小时，获得含木霉菌厚垣孢子的发酵液，其中所述发酵培养基的组成是：麸皮0.4-0.6％，(NH₄)₂SO₄ 0.1-0.3％，KH₂PO₄0.1-0.2％，CaCO₃ 0.1-0.2％，葡萄糖1-3％，0.2-0.5％的大豆油，pH5.5-6.0。

在另一较佳的实施方案中，所述复合制剂是可湿性粉剂，它是通过对步骤(2)所得的复合制剂进一步干燥制得的，且在所述步骤(2)中还包括混合入载体和润湿分散剂的步骤，所述载体选自白碳黑粉或硅藻土，所述润湿分散剂选自烷基萘磺酸盐。在更佳的实施方案中，所述载体的含量为5-30％(W/W)，所述润湿分散剂的含量为0.5-5％(W/W)，以发酵液的重量为基准。

本发明另一方面涉及本发明上述复合制剂在防治植物病害中的应用。在较佳的实施方案中，所述植物病害选自西瓜枯萎病和蔓枯病。

本发明的复合制剂可用于防治多种植物土传病害，同时，该菌剂能够促进植物生长，提高肥料利用率，诱导植物产生抗逆境和抗病害的能力。通过该发明生产出的厚垣孢子制剂比用传统方法生产的分生孢子制剂具有更强的生活力和抗逆能力，作用功能更多，更适合于生产应用。

具体实施方式

本发明第一方面提供了一种用于防治植物病害的复合制剂，所述复合制剂包含芽孢杆菌芽胞和木霉菌厚垣孢子。所述芽孢杆菌宜为枯草芽孢杆菌。

在一个优选的实施方案中，所述复合制剂中所述芽孢杆菌芽胞的含量为10⁸-10¹⁰个细胞/克制剂，所述木霉菌厚垣孢子的含量为10⁸-10¹⁰个活孢子/克制剂。

本发明的复合制剂可以采用本领域技术人员熟知的各类农药剂型，其包括但不局限于：粉剂、可湿性粉剂、乳油、颗粒剂、胶悬剂、水溶剂、气雾剂、片剂、烟剂、熏蒸剂、油雾剂、缓释剂、微胶囊剂、悬浮乳剂、固体乳油、微乳剂和可流动粉剂等，其中优选可湿性粉剂、微胶囊制剂、悬浮乳剂、固体乳油、微乳剂和可流动粉剂。由于可湿性粉剂和微胶囊剂使用方便安全、持续性强，有利于生物农药的长效作用，且使用的助剂无害，不含有有机溶剂，对环境友好，所以是最为优选的。

在本发明的复合制剂(如可湿性粉剂)中，还可包含其它载体和助剂等。在一个优选的实施方案中，本发明的复合制剂是可湿性粉剂，该可湿性粉剂包含载体和润湿分散剂。惰性的载体常用于加工粉剂、可湿性粉剂、颗粒剂等固体剂型，其作用是稀释有效成分便于加工，改善理化性状便于使用。作为制剂载体的惰性材料会在一定程度上影响制剂中孢子的稳定性。制剂中孢子的存活表现为一定水平的新陈代谢。即使在特定贮存条件下代谢活动非常微弱，但积累起来的代谢副产物会对孢子自身产生抑制作用。

在本发明中，优选的惰性载体是所述载体选自白碳黑粉或硅藻土。

润湿分散剂能降低水的表面张力使有效成分很快被水润湿的物质。加工可湿性粉剂、悬浮剂、干悬浮剂、水分散性粒剂等，兑水配成悬浮液喷洒用的剂型时添加润湿剂，使不溶于水的药粒表面很快被润湿而分散悬浮于水中。药液喷洒到靶体表面上易于展布，扩大覆盖面积。常用的润湿剂有皂角、茶枯、木质素磺酸盐、烷基苯磺酸盐、拉开粉、多种非离子型表面活性剂等。在本发明中，优选的润湿分散剂为烷基萘磺酸盐。

所述载体和润湿分散剂的含量很容易由本领域技术人员根据有限实验来确定。在一个较佳的实施方案中，所述载体的含量为5-30％(W/W)，所述润湿分散剂的含量为0.5-5％(W/W)，以发酵液的重量为基准。

另外，本发明的复合制剂内还可添加其它具有活性组分，这可由本领域技术人员根据具体目的通过常规试验来进行选择和确定。

制备方法

本发明另一方面提供了一种制备本发明复合制剂的方法，该方法包括以下步骤：

(1)提供含芽孢杆菌芽胞的发酵液以及含木霉菌厚垣孢子的发酵液；

(2)将含木霉菌厚垣孢子的发酵液匀浆，然后与含芽孢杆菌芽胞的发酵液混合，得到所述复合制剂。

含芽孢杆菌芽胞的发酵液以及含木霉菌厚垣孢子的发酵液的用量(或其混合比例)可由本领域技术人员根据具体情况通过常规试验来确定，通常较佳的是希望复合制剂中所述芽孢杆菌芽胞的含量为10⁸-10¹⁰个细胞/克，所述木霉菌厚垣孢子的含量为10⁸-10¹⁰个活孢子/克。在所述步骤(2)中，所述匀浆步骤的目的是使菌丝体充分破碎，具体可采用本领域技术人员熟知的各种机械破碎方法。

在一个优选的实施方案中，所述复合制剂是可湿性粉剂。为了便于长期贮存，可将发酵液与载体、润湿分散剂或其它助剂按照一定的比例混合后得到液固混合物，然后采用诸如压力式喷雾、离心式喷雾等方式进行干燥，从而制得所述可湿性粉剂。因此，在该实施方案中，还包括在所述混合液中混合入载体和润湿分散剂的步骤。所述载体和润湿分散剂的添加次序没有特别的限制，它们之一或两者可以先部分或全部加入含芽孢杆菌芽胞的发酵液后再与含木霉菌厚垣孢子的发酵液匀浆后的匀浆液混合得到混合液，也可以先部分或全部加入与含木霉菌厚垣孢子的发酵液匀浆后的匀浆液后再与含芽孢杆菌芽胞的发酵液混合得到混合液，或者可以在将含木霉菌厚垣孢子的发酵液匀浆后的匀浆液与含芽孢杆菌芽胞的发酵液混合之后再加入部分或全部载体和/或润湿分散剂。在一个优选的实施方案中，所述载体宜选自白碳黑粉或硅藻土，所述润湿分散剂宜选自烷基萘磺酸盐。在更优选的实施方案中，所述载体的添加量，以发酵液总重量(即步骤(2)的发酵液混合物的重量)计，5-30％(优选10-20％)的载体以及0.5-5％(优选1-2％)的润湿分散剂。

如何提高已有制剂中的孢子的耐受能力也是解决现有技术中存在的问题的重要方面。木霉的厚垣孢子是木霉抵抗不良环境而休眠的生存结构。厚垣孢子，一般是在不良条件下，菌丝细胞内的原生质收缩，细胞壁加厚而形成。在无隔菌丝中，菌丝的一部分集中储存养料，同时产生厚壁，两端形成封闭的隔膜而与菌丝其它细胞切断，形成厚垣孢子；在有隔菌丝的较老菌丝部位往往可形成厚垣孢子。厚垣孢子一旦遇到适宜的环境条件便萌发产生菌丝。所以，利用厚垣孢子为主体的生防制剂就可能具有耐贮藏和货架寿命长长等优点，能满足作为生物农药的要求。然而，由于厚垣孢子对人工发酵培养要求条件比较苛刻，所以寻找适宜的发酵培养条件以求得到高生物量的厚垣孢子成为亟待解决的问题。

在本发明中，还提供了一种获得木霉菌厚垣孢子或含木霉菌厚垣孢子发酵液的方法，该方法包括在发酵培养基中，温度25～33℃、种子接种量5～10％、种子浓度10⁵-10⁶个/mL、通气比1∶2至2∶1，罐压0.03-0.05MPa下，对木霉菌进行液体发酵84-96小时，从而获得富含木霉菌厚垣孢子的发酵液。所用的发酵培养基的组成是：麸皮0.4-0.6％，(NH₄)₂SO₄ 0.1-0.3％，KH₂PO₄ 0.1-0.2％，CaCO₃ 0.1-0.2％，葡萄糖1-3％，0.2-0.5％的大豆油，pH5.5-6.0。

在更优选的实施方案中，该方法包括在发酵培养基中，温度28-30℃、种子接种量6-9％、种子浓度10⁵-10⁶个/mL、通气比1∶2至2∶1，罐压0.03-0.05MPa下，对木霉菌进行液体发酵96小时，从而获得富含木霉菌厚垣孢子的发酵液。所用的发酵培养基的组成是：麸皮0.5％，(NH₄)₂SO₄ 0.2％，KH₂PO₄ 0.1％，CaCO₃ 0.1％，葡萄糖2％，0.2-0.3％的大豆油，pH5.5-6.0。

防治植物病害的应用

本发明提供的复合制剂可以用于有效地防治各种植物病害。在一个较佳的实施方案中，本发明的复合制剂可以用于有效地防治包括丝核菌属(Rhizocionia)、壳球孢属(Macrophomina)、镰刀菌属(Fusarium)、核盘菌属(sclerotium)、腐霉属(Phythium)、疫霉属(Phytophthora)、小核菌(Sclerotium)、长蠕孢属(Helminth osporium)、毛盘孢属(Colletotrichum、轮枝孢属(Verticillium)、黑星菌属(Venturia)、内座壳属(Endothia)、间座壳属(Diaporthe)和黑星孢属(Fusicladium)等引起的植物病害或土传植物病害。另外，本发明的复合制剂还可以防治草莓等植物的白粉病和灰霉病等，还可以控制瓜、果的采后各种腐烂病。

更具体地说，本发明的复合制剂可以用于防治以下植物病害：水稻纹枯病、稻曲病；三七，烟草，花卉，小麦，白菜等的土传病害；白粉病，灰斑病，炭疽病等疫病；小麦纹枯病；稻瘟病，甘蓝黑斑病；黄瓜白粉病，草莓白粉病和灰霉病；猝倒病(如番茄，黄瓜，茄子，青椒，西瓜，香瓜，甜瓜)，根腐病，立枯病，枯萎病等病害。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本发明的所有技术方案(包括较佳的、更较的或最佳的技术方案)均可任意组合而形成新的技术方案。所有这些技术方案均视为在本申请的文字记载范围内。除非另有描述，本发明的实施将采用本领域技术人员所知道的常规技术。或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。

实施例1：木霉T4的500L罐液体发酵产厚垣孢子的研究

本实施例对木霉T4在500L发酵罐中的厚垣孢子产生进行了研究。所用菌株为绿色木霉(T.viride)T4，从植物根际土壤中分离获得，并可从华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室购买，另可参见文献(夏斯琴，王伟，化学与生物工程，“绿色木霉T4的固体发酵工艺及其制剂稳定性的研究”，2008年，Vol.25，No.12，52-56页)。

在发酵培养基中，温度28-30℃、种子接种量6-9％、种子浓度10⁵-10⁶个/mL、通气比1∶2至2∶1，罐压0.03-0.05MPa下，对木霉菌进行液体发酵96小时，从而获得富含木霉菌厚垣孢子的发酵液。所用的发酵培养基的组成是：麸皮0.5％，(NH₄)₂SO₄ 0.2％，KH₂PO₄ 0.1％，CaCO₃ 0.1％，葡萄糖2％，0.2％的大豆油，pH5.5-6.0。

结果发现，木霉T4在500L发酵罐中进行液体发酵有较好的厚垣孢子形成能力。在500L发酵罐中，前24h大量形成菌丝，无厚垣孢子形成，到36h厚垣孢子已经开始形成，但是数量很少，这时木霉的菌丝形成丰富，较稠密；随着发酵时间延长，厚垣孢子逐渐形成，到72h厚垣孢子量达到1.5×10⁷个/mL，72h～84h厚垣孢子增长较快，到84h厚垣孢子已有3.16×10⁷个/mL，到96h厚垣孢子量略有上升，3.24×10⁷个/mL，肉眼明显可见发酵液中菌丝物质变细，发酵液变稀，终止发酵。从种子液到发酵终止结束需要6d时间，与国内外研究相比所需时间相对较少，厚垣孢子产量也达到较高水平。

实施例2：植物油对木霉T4菌厚垣孢子的影响

重复实施例1的发酵工艺，只是在培养基中添加四种浓度的大豆油，然后测定木霉T4的厚垣孢子产量。

结果发现，与不加入大豆油相比，加入大豆油可明显促进木霉T4厚垣孢子的产生，随着大豆油浓度的增大，产生的厚垣孢子逐渐增多，在5g/L的浓度下厚垣孢子数最多，达3.3×10⁷个/mL，2g/L的浓度下产生的厚垣孢子量也达到了3.28×10⁷个/mL，几乎接近5g/L的产量。同时在5g/L的浓度下发现，镜检计数时发现发酵液中仍有大的油滴存在，说明5g/L的浓度过量，不能被木霉全部吸收，因此，2-3g/L(即0.2％-0.3％)的大豆油的添加最利于木霉T4厚垣孢子的产生。

实施例3：木霉可湿性粉剂的制备

按照实施例1所述，利用500L发酵罐进行培养获取厚垣孢子发酵液，条件：30℃，180r/min，2.1L/min，接种量为6％，96小时厚垣孢子大量形成后，发酵结束。将发酵液高速匀浆(5000r/min匀浆3分钟)后，加入10％(W/W)的载体和1％(W/W)(以发酵液总重量计)润湿分散剂，用喷雾干燥(条件：进口温度155℃、出口温度105-110℃、进料速度4.5L/h)干燥后制成可湿性粉剂。对其按可湿性粉剂标准进行检测。表1中列出了不同载体(轻质碳酸钙(1250目)、高岭土(1250目)、白炭黑(500目)、滑石粉(800目)、硅藻土(500目)、膨润土(325目))对木霉活力的影响。

表1

供试载体	2d后萌发率(％)12h	60d后萌发率(％)24h	菌落日增长量(mm/d)	菌落日增长量(调pH)(mm/d)
					PDA对照	99.24±0.80A	98.36±0.58A	32.5±0.71	32.5±0.71
高岭土	86.28±0.32D	68.72±0.20D	30.3±0.58	31.5±0.71
					白炭黑	96.93±0.76B	91.79±0.32B	31.5±0.71	31.6±0.58
滑石粉	88.52±0.65C	85.22±0.64C	27.5±0.71	29.3±0.58
					硅藻土	81.17±0.53E	38.48±0.37F	32.3±0.58	32.5±0.71
膨润土	62.45±0.56G	22.41±0.38G	22.6±0.58	20.3±0.58
					轻质碳酸钙	76.34±0.81F	46.26±0.41E	7.3±0.58	7.5±0.71

从表1可以看出，载体的孢子粉剂贮存一段时间后，孢子的萌发率发生了变化，白炭黑和滑石粉为载体的孢子萌发率变化相对较小；膨润土无论是在起始还是在60d后孢子萌发率均是最低。另外，也发现总体上一段时间后孢子的萌发时间均有所延长。从各种供试载体的菌落日增长量平板试验中可看出各种载体本身的pH值对木霉生长的影响不大，可以排除pH值的干扰，也可以看出轻质碳酸钙能够严重抑制木霉的菌丝生长，白炭黑、硅藻土和高岭土对木霉的菌丝生长几乎无影响，滑石粉和膨润土能在一定程度上抑制木霉菌丝的生长。从上述研究中也可以看出同一载体对木霉的孢子和菌丝有着不同程度的影响作用。

以不同处理的萌发率变化低、菌丝生长速度快为筛选依据。经综合分析，供试样品中可以作为木霉可湿性粉剂加工用的载体有白炭黑和滑石粉、高岭土等。其中白炭黑吸水性能较大、密度较轻，是更为优选的的木霉菌厚垣孢子发酵液载体。

下表2列出了5种润湿分散剂：EFW(烷基萘磺酸盐，南京捷润科技有限公司)，茶皂素(宁波联合生物技术有限公司)，Morwet D-425(缩聚萘磺酸盐，南京捷润科技有限公司)，T型木质素(吉林图们市石岘前进福利化工有限公司)，D110(缩聚萘磺酸盐，南京捷润科技有限公司)，MT-150(萘磺酸甲醛缩合物钠盐，日本花王石碱株式会社)对以白碳黑为载体的粉剂的润湿性和分散性的影响。

表2

结果表明，随着润湿分散剂的量增大，粉剂的润湿时间减少，悬浮率有所上升。根据润湿时间越短、润湿性越好和悬浮率越高、分散性越好的原则，认为EFW是最佳的润湿分散剂，1％和3％的添加量，其润湿性、分散性均已符合国家标准。由于木霉的厚垣孢子较大，在悬浮液中会有不同程度的沉降，为增加其悬浮力，添加3％的浓度更为优选。

利用喷雾干燥工艺制备木霉菌厚垣孢子可湿性粉剂，选用白炭黑为吸附载体，添加量为10％；EFW为润湿分散剂，添加量为3％，干燥后对其依据可湿性粉剂的标准进行检测，结果如下表3所示。

表3

项目	测定值	国家标准
			活孢子含量(个/g)	1.4×108	----
含水率(％)	4.6	5

pH值	6.95	6.0～7.5
			悬浮率(％)	48.3	34
润湿时间(s)	55	180
			细度(通过44um筛)(％)	97.25	95

另外，在为期6个月的贮存中，4℃下木霉可湿性粉剂的萌发率仍保留在90％以上，证实低温冷藏有利于维持孢子活力，室温条件(20℃～25℃)下，制剂的活孢率随贮存时间的延长缓慢下降，6个月后活孢率仍高达62％。显著高于分生孢子的细粒剂(30％)。

实施例4：枯草芽孢杆菌发酵工艺优化和可湿性粉剂的研制

材料和仪器

菌种：

枯草芽胞杆菌B99-2(从植物根际土壤中分离获得，可从华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室购得)。

培养基：

LB平板培养基：土豆200g，去皮，切片，煮沸30min，过滤，在滤液中加入20g葡萄糖，定容至1000mL，琼脂20g，pH自然。

SDAY种子培养基：葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏5g，水1000ml，pH7.0。

试剂

碳源：葡萄糖、可溶性淀粉、麦芽糖、蔗糖、玉米粉、甘油、红糖、乳糖、麸皮、糯米粉、高粱粉、小麦粉

氮源：蛋白胨、酵母膏、酵母粉、花生粉、豆饼粉、黄豆粉、干酪素、尿素、硫酸铵、硝酸钾

无机盐：MgSO₄·7H₂O、MnSO₄·H₂O、KH₂PO₄、K₂HPO₄

载体：轻质碳酸钙(1250目)、高岭土(1250目)、白炭黑(500目)、滑石粉(800目)、硅藻土(800目)、膨润土(325目)。

助剂：D110(缩聚萘磺酸盐)；T型木质素磺酸钠；CMC(羧甲基纤维素钠)；PVA(聚乙烯醇)；PEG 8000；阿拉伯树胶；十二烷基硫酸钠(SDS)；EFW(烷基萘磺酸盐)；MorwetD-425(缩聚萘磺酸盐)；十二烷基苯磺酸钠；吐温-60；茶皂素，My100

保护剂：抗坏血酸(VC)、羧甲基纤维素(CMC)，糊精，SDS。

稳定剂：碳酸钙、磷酸钾、磷酸氢二钾，羧甲基纤维素

主要仪器设备：生化培养箱，干燥箱，三目生物显微镜，微波炉，恒温水浴锅、精密酸度计、恒温磁力搅拌器，小型粉碎机。

方法和结果

以初始发酵培养基：葡萄糖、蛋白胨、MgSO₄·7H₂O、MnSO₄·H₂O、KH₂PO₄、K₂HPO₄为基本培养基，分别选用工业上常用且价格低廉的11种碳源：可溶性淀粉、麦芽糖、蔗糖、玉米粉、甘油、红糖、乳糖、麸皮、糯米粉、高粱粉、小麦粉作为碳源，替换初始发酵培养基中的葡萄糖。一共构成12组，作为不同碳源的培养基。以无碳源的培养基做对照，每个处理3个重复，每隔6小时取样测定菌体生物量及芽孢率，以确定不同碳源培养基对菌体生物量的影响。结果表明，从菌体生物量(CFU)来看，在这12种碳源中，枯草芽孢杆菌B99-2最易利用玉米粉，小麦粉。从芽孢大量形成的时间来看，麸皮大量形成芽孢的时间较早，但是麸皮生物量较低；小麦粉虽然生物量较高，形成芽孢的时间较迟，因此选用玉米粉作为培养基的碳源。

将上一步筛选出的碳源替换初始发酵培养基的碳源，分别选用工业上常用且价格低廉的9种氮源：酵母膏、酵母粉、花生粉、豆饼粉、黄豆粉、干酪素、尿素、硫酸铵、硝酸钾作为碳源，替换初始发酵培养基中的蛋白胨。一共构成10组，作为不同氮源的培养基。以无氮源的培养基做对照，每个处理3个重复，每隔6小时取样测定菌体生物量及芽孢率，以确定不同氮源源培养基对菌体生物量的影响。从菌体生物量(CFU)来看，在这10种氮源中，枯草芽孢杆菌B99-2最易利用豆饼粉，黄豆粉。再从芽孢大量形成的时间来看，黄豆粉大量形成芽孢的时间较早，而豆饼粉形成芽孢的时间较迟，因此选用黄豆粉作为培养基的碳源。考虑到玉米粉，黄豆粉是一种迟效碳源，迟效氮源，如添加少量速效碳源，速效氮源可促进菌体的前期生长，故培养基配方保留部分葡萄糖，添加KNO₃。

将通过碳源，氮源筛选试验筛选的培养基中，分别添加葡萄糖10g、KNO₃ 10g、葡萄糖10g和KNO₃ 10g作为速效碳源与氮源，分别分析B99-2在这三种培养基中的CFU值与芽孢率变化情况，与速效碳源，速效氮源都未添加的培养基做对比，每隔6h测定不同时间的的CFU量和芽孢率，以确定B99-2在速效与迟效碳氮源组合的培养基的生长情况。

可湿性粉剂的研制

可湿性粉剂中的载体，对制剂的性能影响很大。选择对菌体生长没有影响或者影响很小的载体，根据载体的吸附容量、流动性、价格等方面的因素确定最佳载体。农药原药为液态的制剂，要选择吸油率高的填料，如果是固体原药，则选择一般吸油率的填料，所选择的填料制成的样品是松散流动的干粉体。

选择白炭黑，高岭土，硅藻土，膨润土，滑石粉，轻钙六种载体做填料，以空白做对照，比较不同载体的吸附容量，价格及对芽孢含量的影响。

表4

如表5所示，白炭黑和硅藻土性能相差不大，但农药原药为液态的制剂，要选择吸附率高的填料，白炭黑吸附性能更大且流动性比硅藻土好。因此选择白炭黑作为填料制成的样品松散易流动。

可湿性粉剂质量指标分析测定

将上一步试验制的可湿性粉剂，按照《中华人民共和国国家标准》进行测定，润湿性测定GB 5451-2001；悬浮率测定GB/T 14825-1993；细度测定GB/T16150-1995；水分测定GB/T 1600-2001；pH测定GB/T 1601-1993；加速贮存试验GB/T19136-2003。其他指标根据相关文献方法进行测试。

表5

项目	国家指标值	实际测定值
			有效成分含量(cfu/g)		1.8×109个细胞/克
pH范围	5-7	6.8
			水分含量(％)	4	3.7
悬浮率(％)	70	88
			润湿时间(s)	180	65
细度(％)	98	99

热贮藏试验(分解率＜5％)	合格
			冷贮稳定性	合格	合格
室温	合格

实施例5：芽孢杆菌芽胞和木霉菌厚垣孢子复合制剂的制备

(1)采用液态发酵的方法培养芽孢杆菌的芽胞

所用菌株：枯草芽胞杆菌B99-2(从植物根际土壤中分离获得，可从华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室购得)。

发酵培养基：小麦粉2％，大豆粉2％，MgSO4·7H₂O 0.5％，MnSO4·H₂O 0.0003％，KH₂PO₄ 0.05％，K₂HPO₄ 0.2％，pH6.5-7.5。

培养条件：温度25～35℃，种子接种量5～10％，种子浓度1×10⁶个/mL，通气比1∶1，罐压0.04MPa，发酵时间为28～36小时。

(2)采用液态发酵的方法培养木霉的厚垣孢子

所用菌株：绿色木霉(T.viride)T4，从植物根际土壤中分离获得，并可从华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室购买，另可参见文献(夏斯琴，王伟，化学与生物工程，“绿色木霉T4的固体发酵工艺及其制剂稳定性的研究”，2008年，Vol.25，No.12，52-56页)。

发酵培养基：麸皮0.5％，(NH₄)₂SO₄ 0.2％，KH₂PO₄ 0.1％，CaCO₃ 0.1％，葡萄糖2％，0.2％的大豆油，pH5.5-6.0。

培养条件：温度25～33℃，种子接种量5～10％，种子浓度1×10⁶个/mL，通气比1∶1，罐压0.04MPa，发酵时间96小时。

(3)发酵液处理

将上述步骤(2)所得到的木霉菌厚垣孢子发酵液高速匀浆(5000r/min 3分钟)后，与上述步骤(2)所得到的芽孢杆菌的芽胞发酵液1∶1(V/V)混合。加入10％(W/W)的载体白炭黑粉(500目)，和1％(W/W)润湿分散剂烷基萘磺酸盐，充分混匀。

(4)干燥

对步骤(3)得到的混匀的发酵液进行喷雾干燥，具体工艺为：进口温度130～170℃、出口温度80-120℃，干燥后制成复合可湿性粉剂。经稀释平板法测得，总含量可达2×10⁹个细胞/克可湿性粉剂。

实施例6：生防试验

材料与方法

供试药剂：芽孢杆菌、木霉菌单制剂和复合可湿性粉剂(实施例制得)；对照药剂为50％多菌灵可湿性粉剂。

供试作物：上海市南汇区惠南镇大棚西瓜，品种8424。

试验设计与施用方法

试验在连作的大棚中进行可湿性粉剂处理；以50％多菌灵可湿性粉剂作药剂对照，以清水作空白对照。随机区组排列，重复4次，每个小区处理2行(24株)。

用药时间为西瓜田整地时和定殖后一周，两次施药，分别于1月30日洒施和3月1日灌根，可湿性粉剂稀释500倍(10⁵个/mL)，多菌灵稀释1000倍。每株西瓜施100mL，对照均灌清水。

病情调查

收获前期分别调查枯萎病、蔓枯病发病情况，计算相对防效。枯萎病以发病株数计病株率及防治效果。蔓枯病以茎蔓部病情指数计发病严重度。

蔓枯病茎蔓部分级标准：

0级-无病；

I级-节部出现梭形或圆形病斑；

II级-病斑表皮破裂有琥珀色胶物质溢出，并有1/3长度的茎枯死；

III级-病斑表皮破裂有琥珀色胶物质溢出，并有1/2长度的茎枯死；

IV级-病斑表皮破裂有琥珀色胶物质溢出，并有2/3长度的茎枯死；V级-全株枯死。

病情指数＝[∑(各级病株数×该级代表值)÷(调查总株数×最高级代表值)]×100。

防效(％)＝[(对照区病指-防治区病指)÷对照区病指]×100。

结果与分析

制剂对大棚西瓜枯萎病防治效果

用制剂进行试验结果显示，对西瓜生长期枯萎病具有明显的防治效果，复合可湿性粉剂防效达84.02％，比单独木霉制剂和单独枯草芽孢杆菌制剂的防治效果都好。试验过程中发现初期制剂处理的西瓜植株长势好于对照处理。

表6 制剂对西瓜枯萎病的防病效果

药剂处理	调查株数	病株数	病株率(％)	相对防效(％)
					木霉可湿性粉剂	94	8	8.51	77.14
枯草芽孢杆菌可湿性粉剂	96	16	16.67	55.22
					芽胞和厚垣孢子复合制剂	95	5	5.26	85.87
多菌灵1000倍液	95	17	17.89	51.95
					清水对照	94	35	37.23	--

制剂对大棚西瓜蔓枯病防治效果

对病害的调查发现，清水对照的病情指数显著高于四种药剂的处理，使用芽胞和厚垣孢子复合制剂的病情指数最低，仅为9.36％，木霉制剂为16.29％，枯草芽孢杆菌制剂为14.22％，对菌灵处理的病情指数也有54.73％。可见复合湿性粉剂对蔓枯病的防效最高，为86.67％，显著高于使用单独木霉和单独枯草芽孢杆菌制剂。

表7 制剂对西瓜蔓枯病的防病效果

药剂处理	调查株数	病情指数(％)	相对防效(％)
				木霉可湿性粉剂	94	16.29	78.33
枯草芽孢杆菌可湿性粉剂	95	14.22	81.08
				芽胞和厚垣孢子复合制剂	92	9.36	87.55
多菌灵1000倍液	95	54.73	27.18
				清水对照	94	75.16	--

从大棚试验中可以看出复合可湿性粉剂对西瓜枯萎病和蔓枯病均有较好的防效，对蔓枯病的防治要好于枯萎病。多菌灵对枯萎病有一定防效，但是对蔓枯病的防效则较低。实验中还发现，经制剂处理的西瓜幼苗长势明显健壮，根系发达，叶色浓绿，有明显的促进西瓜植株生长的作用。

试验大棚为2年瓜类重茬地，上一年病株率有时能达50％以上，产量较低。由试验结果可以看出：可几种湿性粉剂对西瓜枯萎病和蔓枯病病害的防治均有较好的防效，明显高于化学药剂；制剂对西瓜幼苗有明显的促生长作用。

西瓜枯萎病和蔓枯病是西瓜栽培中较为常见的严重病害，枯萎病是一种典型系统性侵染的土传病害，在西瓜重茬栽培情况下，更易发病，重茬地一般发病率在30％左右，严重时高达80％以上。蔓枯病俗称“蔓割病”，在我国西瓜种植区均有发生。据报导，西瓜蔓枯病发病株率一般为15％～25％，严重时高达60％～80％，病害流行时可使瓜田出现大量死藤，减产30％以上。病害的发生严重影响了西瓜的产量和质量。

本试验结果表明，芽孢杆菌、木霉菌复合厚垣孢子可湿性粉剂对西瓜枯萎病和蔓枯病均有较好的抑制作用。另外，与单用枯草芽孢杆菌可湿性粉剂以及单用木霉菌厚垣孢子可湿性粉剂的结果相比，采用本发明的芽孢杆菌、木霉菌复合厚垣孢子可湿性粉剂的结果有明显提高。

另外，发现厚垣孢子可湿性粉剂的防治效果好于分生孢子细粒剂，原因可能是属厚垣孢子在土壤中存活能力和定殖能力要优于分生孢子，一般至少能存活20个月；即使同一菌株，孢子类型不同，大小不一，对土壤抑真菌作用敏感程度也不同，个体较小的孢子对土壤的抑真菌作用更加敏感。

尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均纳入本文作参考。

Claims (6)

1.一种用于防治植物病害的复合制剂，其特征在于，所述复合制剂包含芽孢杆菌芽胞和木霉菌厚垣孢子，所述复合制剂是可湿性粉剂，所述复合制剂包含载体和润湿分散剂，所述载体选自白碳黑或硅藻土，所述润湿分散剂选自烷基萘磺酸盐，所述复合制剂中所述芽孢杆菌芽胞的含量为10⁸-10¹⁰个细胞/克，所述木霉菌厚垣孢子的含量为10⁸-10⁹个活孢子/克。

2.如权利要求1所述的复合制剂，其特征在于，所述可湿性粉剂用以下方法制得：

(1)提供含芽孢杆菌芽胞的发酵液以及含木霉菌厚垣孢子的发酵液；

(2)将含木霉菌厚垣孢子的发酵液匀浆，然后与含芽孢杆菌芽胞的发酵液混合，得到复合制剂；

对步骤(2)所得的复合制剂进一步干燥制得所述可湿性粉剂，

且在所述步骤(2)中还包括混合入载体和润湿分散剂的步骤，所述载体的含量为5-30%(W/W)，所述润湿分散剂的含量为0.5-5%(W/W)，以可湿性粉剂干燥之前发酵液的重量为基准。

3.一种制备权利要求1所述复合制剂的方法，该方法包括以下步骤：

(1)提供含芽孢杆菌芽胞的发酵液以及含木霉菌厚垣孢子的发酵液；

(2)将含木霉菌厚垣孢子的发酵液匀浆，然后与含芽孢杆菌芽胞的发酵液混合，得到所述复合制剂，

所述复合制剂是可湿性粉剂，它是通过对步骤(2)所得的复合制剂进一步干燥制得的，且在所述步骤(2)中还包括混合入载体和润湿分散剂的步骤，所述载体选自白碳黑粉或硅藻土，所述润湿分散剂选自烷基萘磺酸盐。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的含木霉菌厚垣孢子的发酵液用以下方法获得：

在发酵培养基中，温度25～33℃、种子接种量5～10%、种子浓度10⁵-10⁶个/mL、通气比1:2至2:1，罐压0.03-0.05MPa下，发酵84-96小时，获得含木霉菌厚垣孢子的发酵液，其中所述发酵培养基的组成是：麸皮0.4-0.6%，(NH₄)₂SO₄0.1-0.3%，KH₂PO₄0.1-0.2%，CaCO₃0.1-0.2%，葡萄糖1-3%，0.2-0.5%的大豆油，pH5.5-6.0。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述载体的含量为5-30%(W/W)，所述润湿分散剂的含量为0.5-5%(W/W)，以发酵液的重量为基准。

6.权利要求1所述的复合制剂在防治植物病害中的应用，所述植物病害选自西瓜枯萎病和蔓枯病。