CN102011193B - 蛋白质修饰的GaN纳米线阵列及其制法和用途 - Google Patents
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Abstract
一种蛋白质修饰的GaN纳米线阵列，它是以直立的GaN纳米线阵列作为基片，纳米线表面经化学氧化或等离子氧化产生Ga-OH官能团；或者经化学气相沉积法在纳米线表面沉积SiO2、TiO2或Al2O3，经水解在在纳米线表面产生-OH官能团，GaN纳米线表面的-OH官能团与SiCl4反应形成-O-Si-Cl键，最后通过聚乙二醇分子与蛋白质分子相连接形成蛋白质修饰的GaN纳米线阵列。它可以应用于蛋白质分离提纯、识别或检测。本发明公开了其制法。
Description
技术领域：
本发明涉及GaN纳米线阵列，具体地说，是蛋白质修饰的GaN纳米线阵列及其制法和用途。
背景技术
氮化镓(GaN)纳米线同氧化锌(ZnO)、硅纳米线(Si)、碳纳米管(CNT)一样，是一种重要的一维半导体材料。在氮化镓晶体中，镓元素与氮元素之间形成强共价键，使其表现出可以与碳纳米管相媲美的的机械性能。GaN纳米线具有相对稳定的物理化学性质，它可以承受酸、碱、有机溶剂的侵蚀，有高度的热稳定性，可以承受900℃的高温。现有的技术已经可以熟练制备直径5～500nm，毫米级长度的纳米线。
GaN纳米线具有高度的生物兼容性能，可以在生物体内使用。作为一种一维纳米材料，它具有高的面积/体积比。未经处理的GaN纳米线表面没有官能团，不能用来嫁接有机单分子膜。GaN纳米线表面可以通过化学氧化例如硫酸/双氧水处理产生活性-OH官能团，但该技术所产生的-OH数量相对有限，因此寻找生成大量-OH的制备方法十分有意义。原子层沉积技术(ALD)属于真空化学气相沉积技术(CVD)，该项技术在产生致密氧化层的同时，能在其表面产生大量的-OH官能团，这部分的-OH就可以用来修饰有机单分子膜，进而嫁接生物分子。
生物分子表面含有众多的官能团，可以与有机分子上的活性官能团发生欧联反应，从而将生物分子嫁接在GaN纳米线表面上。直径处于100～500nm之间、间距处于200nm～20μm之间的直立GaN纳米线阵列对于生物分子的进出十分有利，从而提高嫁接或分离效率。聚乙二醇(PEG)具有高度的非特异性排斥生物分子能力，在PEG的末端固定生物分子，可避免生物分子的物理性吸附，从而大大提高生物分子的选择性。同时，相对于多孔的硅、铝等基生物传感器来说，由于GaN纳米线阵列直立，溶液在其表面的流动性更高，便于嫁接、分离生物分子。
GaN纳米线可以允许红外光谱穿过，其表面的官能团及有机修饰物包括生物分子可以吸收红外光，故利用红外光谱可监控GaN纳米线表面的化学反应。ALD沉积层的厚度通常在2～10纳米，微米级波长的红外光可以穿过ALD沉积层，故ALD沉积的GaN纳米线也可以用红外表征。
生物体内的某些痕量存在蛋白对生理功能起着极其重要的作用，提纯、识别、克隆它们具有重要的意义。由于GaN纳米线具有高比表面积，可作为嫁接高密度的生物分子的载体。当生物分子嫁接之后，就可以与与之相应的生物分子(例如抗体-抗原、受体-给体、酶-底物等)发生相互识别，然后通过一些检测手段，把这些生物分子的信息采集出来。由于生物分子的识别属可逆、可控的，该阵列可重复多次使用。通过生物分子的识别，可以将溶液中少量存在的生物分子捕获出来，实现浓缩分离目标生物分子的目的，避免了生化分离的高代价投入。
通常GaN纳米线阵列是一种垂直直立的纳米线，激光在其表面很容易发生干涉。当生物分子识别前后，其干涉条纹就会发生明显变化，采集其干涉数据，计算其光学厚度，可定量得到嫁接在其表面生物分子的嫁接密度。另外，若采用荧光标记的生物分子嫁接在纳米线的表面，其荧光强度就可以通过荧光扫描获得。利用荧光分析法，可定量得到荧光分子的数量，即可推导出生物分子的嫁接密度。
目前，有关GaN纳米线的专利主要集中在发光二极管和激光器方面。美国多项专利如6818061、7335262涉及GaN纳米线的制备。美国专利7421274，7420147，6949773，欧洲专利EP1145282A2，中国台湾专利TW569474涉及GaN纳米线在发光二极管方面的应用。中国专利200510048111涉及GaN纳米线的制备。中国专利200780016946涉及GaN纳米线的制备和在发光二极管和激光器方面的应用。
发明内容：
本发明的目的是提供一种蛋白质修饰的GaN纳米线阵列及其制法，以及将之用于蛋白质分子的分离、识别或检测。
本发明的技术方案如下：
一种蛋白质修饰的GaN纳米线阵列，它是以直立的GaN纳米线阵列作为基片，纳米线表面经化学氧化或等离子氧化产生Ga-OH官能团；或者经原子层沉积法在纳米线表面沉积SiO2、TiO2或Al2O3膜，其表面经水解具有-OH官能团，GaN纳米线表面的-OH官能团与SiCl4反应形成-O-Si-Cl键，最后通过聚乙二醇分子与蛋白质分子连接形成蛋白质修饰的GaN纳米线阵列。
上述的蛋白质修饰的GaN纳米线阵列，所述的蛋白质分子可以是任何蛋白质分子，例如：亲和素、小鼠单克隆抗体或脑利尿钠肽的单克隆抗体。
上述的蛋白质修饰的GaN纳米线阵列，所述的聚乙二醇是数均分子量为600-3000的聚乙二醇。
一种制备上述的蛋白质修饰的GaN纳米线阵列的方法，它包括下列步骤：
步骤1.将直立的GaN纳米线阵列用化学氧化法氧化或等离子辐射氧化，使纳米线表面产生-OH官能团；
步骤2.将步骤1得到的表面具有-OH官能团的GaN纳米线阵列在室温浸泡在纯SiCl4液体中0.5-2小时，使纳米线表面的-OH基转化为-O-SiCl3；
步骤3.将步骤2得到的表面具有-O-SiCl3的GaN纳米线阵列置于0.1mol/L的一端带有NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)的聚乙二醇的氯仿溶液中，在黑暗中放置0.5小时，取出GaN纳米线阵列，清洗，干燥，得到NHS活化的GaN纳米线；
步骤4.将步骤3得到的NHS活化的GaN纳米线置于蛋白质的水或PBS(磷酸缓冲溶液，pH＝7～10)溶液(10-50nmol/L)中放置0.5～1小时，取出GaN纳米线阵列，清洗，干燥，得到蛋白质修饰的GaN纳米线。
上述的制备蛋白质修饰的GaN纳米线阵列的方法，步骤1所述的化学氧化法是将GaN纳米线阵列置于硫酸和双氧水混合溶液(硫酸∶双氧水＝3∶1v/v)或硫酸与硝酸混合溶液(硫酸∶硝酸＝1∶1v/v)中，在80℃下加热4～10小时，取出清洗，吹干。
上述的制备蛋白质修饰的GaN纳米线阵列的方法，所述的步骤1可以用如下方法替代：
步骤1’将直立的GaN纳米线阵列用原子层沉积法在纳米线表面沉积SiO2、TiO2或Al2O3膜，其表面经水解产生-OH官能团。
上述的制备蛋白质修饰的GaN纳米线阵列的方法，所述的步骤3、4可以用如下两个步骤替代：
步骤3’将步骤2得到的表面具有-O-SiCl3的GaN纳米线阵列置于0.1mol/L的一端带有生物素的聚乙二醇DMF(二甲基甲酰胺)溶液中，加入少许三乙胺，放置0.5～1小时，清洗，干燥，得到生物素修饰的GaN纳米线。
步骤4’将步骤3’得到的生物素修饰的GaN纳米线置于浓度为10-50nmol/mL的亲和素水或PBS溶液中，放置0.5小时，清洗，干燥，得到亲和素修饰的GaN纳米线。
上述的制备蛋白质修饰的GaN纳米线阵列的方法，所述的蛋白质是任何蛋白质分子，它们可以是亲和素、小鼠单克隆抗体或脑利尿钠肽的单克隆抗体。
本发明中用来嫁接有机分子膜的有机分子含有双官能团，一端可以与GaN表面-OH反应的官能团(如Si-Cl)，另外一端与含有-NH2官能团发生交联的官能团(如NHS酯)。这里先将GaN阵列室温置于纯的SiCl4溶液0.5～2小时，GaN纳米线表面的-OH就与SiCl4反应，产物是-O-Si-Cl3，多余的Si-Cl可以与PEG一端的-OH反应，从而将PEG嫁接在GaN纳米线上，在PEG的另外一段通过酰胺键(-CONH-)与生物素或亲和素分子相连接，从而将它们固定在GaN的表面。这里，依据生物素和亲和素的官能团不同分别采用两种修饰路线。一种先固定生物素，然后识别亲和素；另一种先固定亲和素，然后识别生物素。
本发明可以首先合成PEG-Biotin，利用生物素分子一端的羧基活化成NHS酯，然后与PEG-NH2上的-NH2反应，从而合成PEG-Biotin：
将GaN纳米线表面的Si-Cl与PEG-Biotin另外一端的OH反应，从而将生物素通过酰胺键嫁接在GaN表面。在水相中，亲和素分子很容易与生物素分子发生识别，从而将亲和素固定在GaN纳米线表面。生物素与亲和素分子间的作用力为氢键、范德华力、静电力。其反应过程如图1所示。
本发明也可以首先合成GaN-PEG-NHS酯，将PEG-NH2上的-NH2与双琥珀酰亚胺(SC，bis(N-succinimidyl)carbonate)反应，生成活性的PEG-NHS酯：
该NHS酯可与亲和素分子上的另一-NH2发生交联反应。水相下，嫁接亲和素的GaN可以与生物素发生识别，从而将生物素转移在GaN纳米线表面。其反应过程如图2所示。
鉴于蛋白质(如小鼠单克隆抗体、脑利尿钠肽的单克隆抗体等)的表面均含有大量的活性-NH2，故均可以用上述方法嫁接这些蛋白质分子。当这些抗体分子嫁接后，纳米线就可以对应的抗原分子(如山羊鼠抗免疫蛋白(IgG)、脑利尿钠肽(BNP))发生识别，从而将抗原分子从液相转移到GaN纳米线表面。反之，先固定抗原，然后与它们的抗体发生识别，从而将抗体分子转移到GaN纳米线表面。显然，这种方法也可以嫁接未知的蛋白质分子，所嫁接的生物分子与有机分子之间通过共价的酰胺键相连。
本发明的蛋白质修饰的GaN纳米线阵列，可以应用于4个方面的生物分子检测。包括蛋白质的分子识别、及识别前后的激光干涉光谱、蛋白质分子的荧光检测、蛋白质分子的基质辅助激光解离飞行时间质谱检测。
本发明的蛋白质修饰的GaN纳米线阵列，可用于蛋白质的亲和分离。将生物素固定的GaN纳米线阵列置于含有亲和素的混合溶液中，依靠生物素和亲和素的特殊识别，溶液中的亲和素与生物素发生作用而被固定在GaN纳米线上，将该芯片取出，置于去离子水中，微微加热(50℃)半小时，亲和素从芯片上生物素的束缚中脱离，进入溶液中。将溶液低温干燥，就可得到高纯度的活性亲和素。反之，PEG-NHS酯活化的样品也可以先固定亲和素，从而提纯生物素。同理，将NHS酯活化的GaN芯片分别置于抗体(如脑利尿钠肽(BNP)的抗体、小鼠单克隆抗体)的PBS缓冲溶液中孵育一小时，取出后用PBS缓冲和去离子水清洗，干燥，这两种抗体上的-NH2与NHS作用，从而将它们固定到GaN芯片上。将芯片置于含有对应抗原(如脑利尿钠肽(BNP)、山羊鼠抗免疫蛋白(IgG))的PBS缓冲溶液中，依靠抗体-抗原相互作用，BNP和IgG抗原分子就被固定在GaN芯片上，置于一定pH值的PBS溶液中，洗脱所固定的抗原BNP和IgG分子。冷冻、干燥即可得到高纯度的抗原BNP和IgG。反之，先固定抗原，后识别抗体分子，就可以分离抗体分子。
本发明的蛋白质修饰的GaN纳米线阵列，可用于激光干涉传感器。本发明使用的均匀分布的规则的直立六方棱柱型GaN纳米线(纳米线形貌见图3)，入射激光在纳米线的表面发生反射，多束反射激光发生干涉，利用检测器把干涉条纹采集，利用利用公式nd＝(Δkλ1λ2)/2(λ1-λ2)，n是GaN的平均折射率，d是膜的厚度，λ1和λ2分别是相邻的两个波峰或波谷的波长值，而对于相邻的两个波峰或波谷来说，式中Δk＝1.0，可得干涉层的相对厚度。当生物分子嫁接或识别之后，由于生物分子自身的尺寸(蛋白质的约10nm)，干涉层厚度发生变化，其变化量来自于固定的生物分子。分别采集嫁接前后的干涉光谱，将数据代入公式，分别计算了光学厚度的变化量，依此衡量所嫁接蛋白质分子的嫁接密度，也即得到目标生物分子的浓度。
本发明的蛋白质修饰的GaN纳米线阵列可用于荧光检测。将生物分子进行荧光标记，利用荧光扫描可获得荧光图片。依据现有的荧光分析技术，一定浓度下荧光强度与荧光分子数呈线性对应关系，而荧光分子数与生物分子数具有固定的比例，这样借助荧光测量，可以定性、定量获得GaN纳米线所固定的生物分子数量。
本发明的蛋白质修饰的GaN纳米线阵列可用于基质辅助激光解离飞行时间(MALDI-ToF-MS)质谱检测。在NHS酯活化的GaN芯片上，首先固定亲和素、脑利尿钠肽(BNP)或小鼠单克隆抗体，然后亲和浓缩固定生物素、脑利尿钠肽(BNP)、山羊鼠抗免疫蛋白(IGg)。将干燥的样品置于MALDI-ToF-MS检测，就可以得到生物素、脑利尿钠肽、山羊鼠抗免疫蛋白的质谱图片。相对于普通的不锈钢衬底，蛋白质修饰的GaN纳米线陈列具有高得多的比表面积，PEG聚合物链可以排斥非目标蛋白质分子在纳米线表面的非特异性吸附，通过抗体-抗原相互作用可筛选高度浓缩的目标生物分子，从而获得更好的检测限。
本发明的NHS酯活化的GaN芯片还可以检测未知的蛋白质分子。将NHS酯活化的GaN芯片置于牛血清蛋白或肽(Fmoc-EAALKLAR)的溶液中，牛血清蛋白或肽(Fmoc-EAALKLAR)就被固定在GaN的表面，测试MALDI-ToF-MS，牛血清蛋白或肽(Fmoc-EAALKLAR)的质谱就会被采集。利用国际上已经建立了的蛋白质序列数据库比较，利用软件，可以分析出蛋白质的序列。同样，由于未知蛋白分子表面也含有-NH2，它们也可以被固定在GaN纳米线上，通过MALDI-ToF-MS检测得到其序列，从而揭示未知蛋白。
附图说明：
图1、生物素/亲和素分子固定路线。
图2、亲和素/生物素分子固定路线。
图3、垂直生长GaN纳米线的平面和剖面SEM图片，a为平面图；b为剖面图。
图4、PEG-Biotin合成红外图
图5、硫酸/双氧水处理的，和气相沉积后SiO2、Al2O3、TiO2覆盖的GaN纳米线的IR光谱，a为硫酸/双氧水处理；b为覆盖的TiO2；c为Al2O3覆盖的；d为SiO2覆盖的。
图6、图5中四样品的OH含量对比图。
图7、在SiO2覆盖GaN纳米线表面嫁接PEG-Biotin和Streptavidin的红外光谱。
图8、图5中四样品的TEM图片。
图9、图5中四样品表面嫁接亲和素后的TEM图片。
图10、图9样品嫁接亲和素前后的激光干涉曲线。A为亲和素修饰前的GaN纳米线阵列的激光干涉曲线；B为亲和素修饰后的GaN纳米线阵列的激光干涉曲线。
图11、图5中四样品表面嫁接荧光标记亲和素的荧光扫描图。
图12、纳米线阵列表面分离的荧光标记亲和素的荧光图像。
图13、牛血清蛋白BSA的MALDI-Tof-MS测试。
图14、Fmoc-EAALKLAR的MALDI-Tof-MS测试。
图15、脑利尿钠肽的的MALDI-Tof-MS测试对比。
具体实施方式：
实施例1.在GaN纳米线表面产生Ga-OH官能团
图3显示GaN纳米线阵列(USA，NIST)的平面和剖面SEM图片。从图中可见：单根GaN纳米线的直径处于50～500nm之间、高度处于9～10μm之间，纳米线阵列的间距处于200nm～20μm之间，所有GaN纳米线均显示了平整的表面，处于与支持片基直立的位置。
将GaN纳米线阵列置于80℃的硫酸∶双氧水(3∶1)的溶液中(5mL)，处理4小时，利用超声将GaN纳米线从生长片基上剥离，将剥离的GaN纳米线分散在CCl2H2溶液中，用移液器将溶液分散在干燥的KBr晶体片上，将样品置于80℃烤箱中干燥4小时，样品做红外光谱分析。红外光谱如图5a，在3400、1600cm-1区域出现了-OH的红外吸收。其中3168cm-1吸收峰对应OH，该OH可以用来嫁接有机分子膜。
将GaN纳米线阵列等离子处理2分钟(Harrick等离子体清洗机(PDC-002)，30W功率，10sccm空气)，利用超声将GaN纳米线从生长片基上剥离，将剥离的GaN纳米线分散在CCl2H2溶液中，用移液器将溶液分散在干燥的KBr晶体片上，将样品置于80℃烤箱中干燥4小时，样品做红外光谱分析。在3400、1600cm-1区域出现了-OH的红外吸收。其中3168cm-1吸收峰对应OH，该OH可以用来嫁接有机分子膜。
将GaN纳米线阵列表面分别各沉积TiO2，Al2O3，SiO2沉积ALD膜。高度真空下，先通入前体Al(OR)3和高纯水蒸汽，在GaN纳米线表面形成一层Al2O3膜，其表面具有OH，然后分别通入TiCl4，SiCl4和高纯水蒸汽，分别形成TiO2，SiO2膜，其表面具有OH。这样，氧化层就生长在GaN纳米线的表面，氧化层的厚度与通入气体的循环次数有关。利用超声将GaN纳米线从生长片基上剥离，将剥离的GaN纳米线分散在CCl2H2溶液中，用移液器将溶液分散在干燥的KBr晶体片上，将样品置于80℃烤箱中干燥4小时，样品做红外光谱分析。三种ALD沉积GaN纳米线的红外光谱分别对应图5b-5d，在3400、1600cm-1区域出现了-OH的红外吸收。其中3168cm-1吸收峰对应OH，该OH可以用来嫁接有机分子膜。
将图5a-d的红外光谱曲线进行拟合，得OH相对含量(O-H面积/Ga-N面积)分别为6.70％，47.32％，69.86％，和90.32％。其结果列于图6，相比，ALD沉积层使-OH含量增加了6.06，9.43，12.48倍。
将上述4种产生-OH的GaN纳米线从片基上剥离，分散在甲醇中，然后滴在TEM铜网上，做高分辨TEM图片，见图8，a为硫酸/双氧水处理的，b、c、d分别为SiO2、Al2O3、TiO2覆盖GaN纳米线。从图上可得，三种ALD涂层覆盖厚度分别为4～5nm，5～6nm，10～12nm。
实施例2.合成Biotin-NHS酯
取0.5g生物素溶解于50mL干燥的DMF(二甲基甲酰胺)溶液，放入0.51g DCC(N，N-二环己基碳二亚胺)和0.26g NHS，50℃下搅拌16小时，将不溶解沉淀过滤除去，加入过量的干燥乙醚，使之产生白色沉淀，抽滤、得白色的Biotin-NHS产品。药品做红外光谱，见图4b，出现了3228，3108，3063，2939，2915，2875，2846，1818，1787，1745，1729，1696cm-1的吸收峰。
实施例3.合成PEG-Biotin
取0.225g biotin-NHS加入50mL干燥的氯仿溶液中，加入1.0g PEG-NH2(M＝3000)(Sigma-Adrich购得)和少量的三乙胺，搅拌6小时，过滤不溶物，加入过量的干燥乙醚，使之产生白色沉淀。药品做红外光谱，见图4d，出现了3340，2978，2945，2883，2857，2806，2739，1702，1698，1667cm-1的吸收峰。表明合成了PEG-Biotin。
取0.225g biotin-NHS加入50mL干燥的氯仿溶液中，加入0.2g PEG-NH2(M＝600)(Sigma-Adrich购得)和少量的三乙胺，搅拌1小时，过滤不溶物，加入过量的干燥乙醚，使之产生白色沉淀。药品做红外光谱，出现了3340，2978，2945，2883，2857，2806，2739，1702，1698，1667cm-1的吸收峰。表明合成了PEG-Biotin。
取0.225g biotin-NHS加入50mL干燥的氯仿溶液中，加入0.33g PEG-NH2(M＝1000)(Sigma-Adrich购得)和少量的三乙胺，搅拌2小时，过滤不溶物，加入过量的干燥乙醚，使之产生白色沉淀。药品做红外光谱，出现了3340，2978，2945，2883，2857，2806，2739，1702，1698，1667cm-1的吸收峰。表明合成了PEG-Biotin。
实施例4.生物素修饰的GaN纳米线阵列的制备
将SiO2功能化的GaN纳米线阵列(样品对应图5d)置于纯SiCl4溶液中放置1小时，样品洗涤干燥后置于0.1Mol/L的PEG(M＝3000)-Biotin(生物素)的DMF溶液，于黑暗处放置0.5小时，取出GaN纳米线阵列，清洗，干燥，从阵列片基上剥离，做红外光谱分析，红外光谱图见图7h。出现了PEG(2887，2860cm-1)和Biotin(1665，1652cm-1)的特征吸收峰。表明PEG-Biotin已经被嫁接在GaN纳米线的表面。同样制备PEGM＝1000，和PEG M＝600对应的生物素修饰的GaN纳米线阵列，进行红外光谱分析，均出现了PEG-Biotin的特征吸收峰。
实施例5.用生物素修饰的GaN纳米线阵列分离亲和素
将上述实施例4中所得的样品置于Streptavidin(亲和素)(10nMol/mL)的水溶液中，孵育半小时，取出样品，洗净，吹干，从片基上剥离纳米线，做红外分析(见图7i)。红外中出现了亲和素的酰胺吸收峰。1652cm-1对应来自亲和素的C＝O峰，1543cm-1对应自亲和素的N-H峰。表明亲和素已经被固定在纳米线的表面。亲和素与生物素之间的作用力来源于氢键、范德华力、静电力。同样用PEG M＝1000，和PEG M＝600对应的生物素修饰的GaN纳米线阵列，进行相同的实验，均出现了亲和素的酰胺吸收峰。
实施例6.用生物素修饰的GaN纳米线阵列分离亲和素
将硫酸-双氧水处理的GaN纳米线阵列和覆盖Al2O3和TiO2的GaN纳米线阵列分别进行实施例4和5的实验，样品做红外分析，均出现了PEG，生物素和亲和素的特征吸收峰，它们的红外光谱中分别出现了PEG(2887，2860cm-1)，Biotin(1665，1652cm-1)，亲和素(1543，1652cm-1)的特征吸收峰。
实施例7.合成PEG-NHS
取3g PEG-NH2(M＝1500)置于干燥的乙腈中，加入0.52g SC(双琥珀酰亚胺)和少许的三乙胺，室温下搅拌0.5小时，减压蒸干，乙腈重结晶所得的PEG-NHS。样品做红外光谱，出现了2939，2915，2875，2846，1818，1775，1735，1729cm-1的吸收峰。表明生成PEG的NHS酯。
取2g PEG-NH2(M＝2000)置于干燥的乙腈中，加入0.44g SC和少许的三乙胺，室温下搅拌2小时，减压蒸干，乙腈重结晶所得的PEG-NHS。样品做红外光谱，在1775，1735cm-1处出现了NHS的特征吸收峰。表明生成PEG的NHS酯。
实施例8.PEG-NHS修饰的GaN纳米线阵列的制备
将实施例1中用硫酸-双氧水处理的产生-OH的GaN纳米线阵列置于纯SiCl4溶液中放置1小时，取出样品，洗净，吹干，得Si-Cl功能化样品。将该样品放入0.1Mol/L的PEG-NHS(M＝2000)的氯仿溶液中，加入少许三乙胺，反应半小时，取出样品，洗涤干燥的PEG-NHS修饰的GaN纳米线。利用超声将GaN纳米线从生长片基上剥离，将剥离的GaN纳米线分散在CCl2H2溶液中，用移液器将溶液分散在干燥的KBr晶体片上，将样品置于80℃烤箱中干燥4小时，样品做红外光谱分析。红外光谱中出现2939，2915，2875，2846，1818，1775，1735，1729，534cm-1的吸收峰。表明PEG-NHS被固定在GaN纳米线上。
实施例9.蛋白质修饰的GaN纳米线阵列的制备
取实施例8制备的PEG-NHS修饰的GaN纳米线阵列分别置于亲和素(10nMol/mL)、牛血清蛋白(20nMol/mL)、肽(Fmoc-EAALKLAR)(50nMol/mL)、脑利尿钠肽单克隆抗体(10nMol/mL)、老鼠单克隆抗体(50nMol/mL)的溶液中处理半小时，取出，清洁，干燥，剥离GaN纳米线做红分析。它们的红外光谱中均出现了酰胺I(～1560cm-1)和II(～1650cm-1)的红外吸收峰。表明这些生物分子已经被嫁接在纳米线的表面。
实施例10.用蛋白质修饰的GaN纳米线阵列分离相对应的蛋白质
室温下，将上述实施例9中脑利尿钠肽的单克隆抗体、老鼠单克隆抗体修饰的GaN纳米线阵列分别置于脑利尿钠肽(1nMol/mL)、山羊鼠抗免疫蛋白(5nMol/mL)的溶液中，10分钟取出，清洁，干燥，剥离GaN纳米线做红分析。它们的红外光谱中出现了加强的酰胺I(～1560cm-1)和II(～1650cm-1)的红外吸收峰。表明这两种抗原已经被嫁接在纳米线的表面。
实施例11.
将上述实施例5和实施例6中固定有亲和素的生物素修饰的GaN纳米线阵列用醋酸双氧铀染色，取出，清洁，干燥，剥离GaN纳米线后，做TEM分析，样品出现了亲和素分子的形貌(见图9)。图5a-d(硫酸/双氧水处理的，SiO2、Al2O3、TiO2覆盖GaN纳米线)样品对应于固定有亲和素的生物素修饰的GaN纳米线阵列的TEM图为图9i-l。由于蛋白质分子的覆盖，N元素含量明显增加。
实施例12.
用荧光标记的亲和素(1nMol/mL)代替没有荧光标记的亲和素，重复上述实施例5和6中的实验。将得到固定荧光亲和素的GaN纳米线阵列清洁，干燥，剥离出GaN纳米线，做荧光扫描，得到荧光图片列于图11，上述图5a-d中4个样品(硫酸/双氧水处理的，SiO2、Al2O3、TiO2覆盖GaN纳米线)的荧光图像分别对应图11i-l。其平均荧光强度分别为17.02，133.52，108.75，167.02。
实施例13.
将上述实施例5和6所得的样品分别作激光干涉光谱，得到图10。利用前面所述公式计算亲和素分子嫁接前后的光学厚度分别为4800和5500nm，即亲和素分子嫁接之后，光学厚度增加值((nd2-nd1)/nd1*100％)为14.5％。
实施例14
将上述实施例9得到的亲和素、肽、和牛血清修饰的的GaN纳米线阵列样品做激光干涉光谱。利用公式，计算亲和素、肽、和牛血清嫁接后光学厚度分别增加22.5％、11.3％、和14.2％。
实施例15
将上述实施例9得到的牛血清蛋白和肽(Fmoc-EAALKLAR)修饰的的GaN纳米线阵列做MALDI-ToF-MS测试。谱图如图13-14。谱图中出现了牛血清蛋白和肽分子质谱峰，表明GaN纳米线表面固定的牛血清蛋白、肽分子可以通过MALDI-ToF-MS检测。其中，图14b经国际蛋白质库解析，该肽的部分氨基酸序列经解析为EAALKLAR。同理，未知蛋白也可以固定在GaN纳米线上，其氨基酸序列也可以MALDI-ToF-MS解析而得。
实施例16.
将上述实施例9得到的脑利尿钠肽单克隆抗体修饰的样品(1×1cm2)用去离子水浸润，取10μL脑利尿钠肽抗原溶液(1nMol/mL)滴在其上，封闭孵育10min，取出GaN纳米线阵列样品，清洗，干燥，做MALDI-ToF-MS测试。谱图见图15a，谱图中出现了强的脑利尿钠肽质谱峰。取10μL脑利尿钠肽抗原溶液(1nMol/mL)滴在不锈钢的衬底上，氮气吹干，做MALDI-ToF-MS测试。谱图列于图15b，对比两条曲线，图15b显示了高度的噪声干扰，显然在GaN纳米线阵列所得到的谱图具有高度的信噪比。
实施例17.
将上述实施例12得到的纳米线样品(图11i和11l)分别置于5mL 50℃的去离子水中，孵育1小时后，分别取10μL两种溶液滴在2个清洁的硅片上，干燥气体吹干，做荧光扫描，图片见图12。显然，两个表面均呈现了不同荧光强度的荧光图像，表明亲和素从GaN纳米线阵列分离出来。其中，图11l对应的样品含有更多的亲和素分子，这和图12l样品中还有较多荧光标记的亲和素一致。将这两个溶液冷冻干燥，即可得到高纯度的亲和素。反之，先固定亲和素分子，后识别生物素分子，就可得到高纯度的生物素。同理，高纯度的抗体(如脑利尿钠肽单克隆抗体、老鼠单克隆抗体)和抗原(如脑利尿钠肽、山羊鼠抗免疫蛋白)也可以用同种方法提纯。
Claims (10)
1.一种蛋白质修饰的GaN纳米线阵列，其特征是：它是以直立的GaN纳米线阵列作为基片，纳米线表面经化学氧化或等离子氧化产生Ga-OH官能团；或者经化学气相沉积法在纳米线表面沉积SiO2、TiO2或Al2O3，经水解在表面产生-OH官能团，GaN纳米线表面的-OH官能团与SiCl4反应形成-O-Si-Cl键，最后通过聚乙二醇分子与蛋白质分子相连接形成蛋白质修饰的GaN纳米线阵列。
2.根据权利要求1所述的蛋白质修饰的GaN纳米线阵列，其特征是：所述的蛋白质分子是任何蛋白质分子。
3.根据权利要求1所述的蛋白质修饰的GaN纳米线阵列，其特征是：所述的蛋白质分子是亲和素、小鼠单克隆抗体或脑利尿钠肽的单克隆抗体。
4.根据权利要求1所述的蛋白质修饰的GaN纳米线阵列，其特征是：所述的聚乙二醇是数均分子量为600-3000的聚乙二醇。
5.一种制备权利要求1所述的蛋白质修饰的GaN纳米线阵列的方法，其特征是它包括下列步骤：
步骤1.将直立的GaN纳米线阵列用化学氧化法氧化或等离子辐射氧化，使纳米线表面产生-OH官能团；
步骤2.将步骤1得到的表面具有-OH官能团的GaN纳米线阵列在室温下浸泡在纯SiCl4液体中0.5-2小时，使纳米线表面的-OH基转化为-O-SiCl3；
步骤3.将步骤2得到的表面具有-O-SiCl3的GaN纳米线阵列置于0.1mol/L的一端带有NHS(N-OH琥珀酰亚胺)的聚乙二醇的氯仿溶液中，在黑暗中放置0.5小时，取出GaN纳米线阵列，清洗，干燥，得到NHS活化的GaN纳米线；
步骤4.将步骤3得到的NHS活化的GaN纳米线置于蛋白质的水或浓度为10-50nmol/L、pH＝7～10的磷酸缓冲溶液中放置0.5～1小时，取出GaN纳米线阵列，清洗，干燥，得到蛋白质修饰的GaN纳米线。
6.根据权利要求5所述的制备蛋白质修饰的GaN纳米线阵列的方法，其特征是：步骤1所述的化学氧化法氧化是将GaN纳米线阵列置于硫酸和双氧水混合溶液或硫酸与硝酸混合溶液中，在80℃下加热4～10小时，取出清洗，吹干。
7.根据权利要求5所述的制备蛋白质修饰的GaN纳米线阵列的方法，其特征是所述的步骤1用如下方法替代：
步骤1’将直立的GaN纳米线阵列用化学气相沉积法在纳米线表面沉积SiO2、TiO2或Al2O3，经水解在外表面产生-OH官能团。
8.根据权利要求5所述的制备蛋白质修饰的GaN纳米线阵列的方法，其特征是所述的步骤3和4可以用如下两个步骤替代：
步骤3’将步骤2得到的表面具有-O-SiCl3的GaN纳米线阵列置于0.1mol/L的一端带有生物素的聚乙二醇DMF溶液中，加入少许三乙胺，放置0.5小时，清洗，干燥，得到生物素修饰的GaN纳米线；
步骤4’将步骤3’得到的生物素修饰的GaN纳米线置于浓度为10-50nmol/mL的亲和素水或PBS溶液中，放置0.5小时，清洗，干燥，得到亲和素修饰的GaN纳米线。
9.根据权利要求5-8所述的任一制备蛋白质修饰的GaN纳米线阵列的方法，所述的蛋白质是任何蛋白质分子。
10.权利要求1所述的蛋白质修饰的GaN纳米线阵列在蛋白质分离提纯、识别或检测中的应用。
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