CN101983070A

CN101983070A - 由来源于原核细胞的重组n-糖基化蛋白制备生物共轭物

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Publication number: CN101983070A
Application number: CN200980110137XA
Authority: CN
Inventors: F·弗尔南德兹; M·威特; M·科沃瑞克; M·瓦克
Original assignee: Glycovaxyn AG
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2008-02-20
Filing date: 2009-02-19
Publication date: 2011-03-02
Anticipated expiration: 2029-02-19
Also published as: EP2257307B1; WO2009104074A2; US11944675B2; US10835592B2; EP2257307A2; HRP20181259T1; ES2684129T3; DK2257307T3; CY1120512T1; AU2009215341A1; IL207350A; JP2011514155A; CN101983070B; JP2015187174A; US20210085772A1; JP5782258B2; WO2009104074A3; PL2257307T3; SI2257307T1; SG10201400320TA

Abstract

本发明针对于生物共轭疫苗，例如O1-生物共轭疫苗，内容包括：含有至少一种共识序列的蛋白载体，共识序列为D/E-X-N-Z-S/T，序列中X和Z可以为除了脯氨酸以外的任何天然氨基酸；来源于至少一种病原细菌的至少一种抗原多糖，链接于蛋白载体上，而且，任选一种佐剂。另一方面，本发明还针对于一种在生物反应器中使用一些步骤生产O1-生物共轭疫苗的方法。

Description

由来源于原核细胞的重组N-糖基化蛋白制备生物共轭物

发明领域

本发明涉及生物共轭物，尤其是生物共轭疫苗，由重组糖蛋白制备，命名为N-糖基化蛋白。该发明包括一种或多种诱导N-糖基化蛋白，含有最优化的氨基酸共识序列，编码这些蛋白的核酸序列以及相应的载体和宿主细胞。另外，本发明还针对于使用所述蛋白、核酸、载体及宿主细胞用于制备生物共轭疫苗。进一步，本发明提供了制备生物共轭疫苗的方法。

发明背景

糖基化蛋白是含有一个或多个共价结合糖聚合物的蛋白质。N-连接的蛋白糖基化是存在于真核生物内质网上的一个必要及保守的过程。它对于蛋白质的折叠、齐聚、稳定性、质量控制、分泌蛋白和膜蛋白的分类及运输都很重要(Helenius，A.，and Aebi，M.(2004).Roles of N-linked glycans in the endoplasmic reticulum.Annu.Rev.Biochem.73，1019-1049)。

蛋白糖基化对于蛋白质的抗原性、稳定性及半衰期有深刻的影响。另外，糖基化还可以辅助色谱法纯化蛋白，例如，结合于固相的凝集素配体亲和色谱可与蛋白的糖基化基团反应。因此，已经建立实践用于在真核细胞中生产重组糖基化蛋白，从而提供生物及医药上有用的糖基化标品。

已经证实食源性致病菌空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)也能够N-糖基化其自身的蛋白质(Szymanski，et al.(1999).Evidence for a system of general protein glycosylation in Campylobacter jejuni.Mol.Microbiol.32，1022-1030)。所需要的糖基化系统由12个基因编码，位于所谓的pgl基因簇中。破坏N-糖基化会影响空肠弯曲菌的入侵及致病性，但不会像大部分真核生物那样致命(Burda P.and M.Aebi，(1999).The dolichol pathway of N-linked glycosylation.Biochim Biophys Acta 1426(2)：239-57)。在大肠杆菌中同时重组表达pgl基因簇和糖蛋白受体有可能重建空肠弯曲菌蛋白的N-糖基化过程(Wacker et al.(2002).N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E.coli.Science 298，1790-1793)。

腹泻是一种主要的健康疾病，它与频繁的国际旅行以及经济影响有关。旅行者的腹泻主要归因于获得性肠道疾病，例如当一个人从一个发达国家到发展中国家旅行时。如今，每年有超过5千万的人从发达国家到发展中国家旅行，而这些旅行者中有将近50％的人报告他们会在逗留时间的前两周内腹泻。自从二十世纪七十年代以来，尽管各地的旅游业努力改善当地的基础设施，但旅行者腹泻的发病率没有明显的下降。

旅行者是通过摄取受污染的食物以及较少的自来水而得了腹泻。细菌是旅行者腹泻的主要原因，至少80％的感染者是由于这个原因。在全世界与旅行者腹泻相关的细菌中，最常分离到的是产肠毒素大肠杆菌(ETEC)，然后是痢疾杆菌和空肠弯曲菌。

杆菌性痢疾仍然是一种严重且常见的疾病。除了造成水样腹泻，志贺氏菌还是痢疾(发烧、腹痛、便中含血和粘液)的主要原因。男子是这种细菌的天然宿主。每年感染痢疾的人数大约超过2亿。其中大约5百万需要住院治疗，1百万人会死亡。这种杆菌性痢疾病主要源于三种血清型：S.dysenteriae，S.flexneri以及S.sonnei。

S.dysenteriae和S.flexneri是热带地区感染的主要原因，死亡率可达20％。杆菌性痢疾既以地方性又以流行性疾病存在。在很多热带国家中，地方性感染主要源于S.flexneri，而主要的S.dysenteriae流行病存在于中美洲、中非以及东南亚。这些流行病是很大的公共健康危害。在工业化国家中，主要来自于S.sonnei而少部分来自于S.flexneri的感染仍然存在。

在抵抗细菌性痢疾方面，共轭疫苗已经显示出有希望的结果。I型S.dysenteriae的O-特异性多糖已被用于合成一种共轭疫苗，该疫苗在小鼠体内已引起免疫反应。这样的疫苗或已通过化学法合成并偶联于人血清白蛋白，或者开发用于志贺氏菌中O-多糖已被纯化的地方。S.sonnei和S.flexneri的O-特异性多糖也已经通过化学法偶联于绿脓杆菌外毒素，并且在小鼠体内引起明显的免疫反应。另外，它们在人体中已显示出免疫原性和安全性。然而，化学偶联是昂贵且耗时的过程，不能总产生可靠且重复性好的疫苗。当在商业规模上寻求开发这样的生物共轭疫苗时，这会导致生产质量管理规范(GMP)问题。

发明内容

一方面，本发明涉及一种生物共轭疫苗，包括：一种插入共识序列的蛋白载体，共识序列为D/E-X-N-Z-S/T，序列中X和Z可以为除了脯氨酸以外的任何天然氨基酸；来源于至少一种病原细菌的至少一种抗原多糖，链接于蛋白载体上，其中，至少一种抗原多糖是至少一种细菌性O-抗原，这些抗原来自于志贺氏菌、大肠杆菌以及绿脓杆菌其中的一种或多种；并且可选一种佐剂。

另一方面，本发明涉及一种志贺氏菌痢疾生物共轭疫苗，包括：一种包含绿脓杆菌外毒素(EPA)的蛋白载体，且被修饰为含有至少一种共识序列D/E-X-N-Z-S/T，序列中X和Z可以为除了脯氨酸以外的任何天然氨基酸；至少一条多糖链连接于蛋白载体上并且含有以下结构：并且可选一种佐剂。

另一方面，本发明涉及一种痢疾杆菌O1生物共轭疫苗，包括：一种蛋白载体，其中包含SEQ ID NO：7所示的序列；至少一条多糖链连接于蛋白载体上并且含有以下结构：以及一种佐剂。

另一方面，本发明涉及：一个包括SEQ ID NO：5序列的质粒；一段包括SEQ ID NO：5的基因序列；一段包括SEQ ID NO：6的氨基酸序列；一段包括SEQ ID NO：7的氨基酸序列；或者载体pGVXN64。

另一方面，本发明涉及一种表达系统用于生产一种至少抵抗一种细菌的生物共轭疫苗，包括：一段编码一种寡糖转移酶(OST/OTase)的核酸序列；一段编码蛋白载体的核酸序列；来自于至少一种细菌的至少一个抗原多糖合成基因簇，该抗原多糖为细菌O-抗原。

另一方面，本发明涉及一种表达系统用于生产一种抵抗痢疾杆菌O1的生物共轭疫苗，包括：一段含有SEQ ID NO：2的PgIB的核酸编码序列；一段含有SEQ ID NO：6的修饰EPA编码序列；以及含有SEQ ID NO：5的一个多糖合成基因簇。

另一方面，本发明还涉及了一种在生物反应器重生产O1-生物共轭疫苗的方法，包括以下步骤：在细菌中表达：修饰后的EPA(绿脓杆菌外毒素)，含有至少一种共识序列，D/E-X-N-Z-S/T，序列中X和Z可以为除了脯氨酸以外的任何天然氨基酸，或者是AcrA；PgIB；以及一条或多条O1-多糖；培养细菌一段时间来生产一定量的O1-生物共轭疫苗，其中含有连接于一条或多条O1-多糖上的AcrA或者修饰的EPA；提取周质蛋白；从提取到的周质蛋白中分离O1-生物共轭疫苗。

另一方面，本发明涉及了一种生产痢疾杆菌生物共轭疫苗的方法，所述方法包括：通过在一个重组生物中使用糖基转移酶组装痢疾杆菌多糖；将上述多糖连接至所述重组生物中的一个或多个目标蛋白的一个天冬酰胺残基上，其中所述的一个或多个目标蛋白包含至少一个或多个T-细胞抗原决定簇。

进一步，本发明还涉及了一种生产痢疾杆菌生物共轭疫苗的方法，所述方法包括：在一种原核生物中引入一种编码代谢机制的遗传信息，该代谢机制执行目标蛋白的N-糖基化，从而得到一种修饰的原核生物，其中，表达一个或多个重组目的蛋白所需的遗传信息被引入所述的原核生物中，代谢机制包括：特异性的糖基转移酶用于把痢疾杆菌的一种多糖组装至一种脂载体上，以及一种寡糖转移酶，该寡糖转移酶将多糖共价结合于目标蛋白的天冬酰胺残基上，目标蛋白含有至少一种T-细胞抗原决定簇；将修饰的原核生物进行培养；从培养基中得到糖基化的蛋白。

附图说明

图1显示的是来自于重组子A到C的脂蛋白的N-糖基化(见实施例1)。大肠杆菌Top 10细胞携带来自于C.jejuni的功能性pgl操纵子(Wacker et al.，2002，supra)以及一个质粒，编码重组子A(第二道)，B(第一道)，C(第三道)，或者重组子C的D121A突变体(第四道)。蛋白在细胞周质中表达并被纯化。图片显示的是纯化蛋白组分的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及考马斯亮蓝染色的结果。

图2描述的是不同蛋白的N-糖基化分析结果，用于分析C.jejuni的pgl操纵子在不同细胞中表达所述蛋白的序列特异的N-糖基化情况。这些细胞包括，CLM24细胞(Feldman et al.，(2005).Engineering N-linked protein glycosylation with O antigen lipopolysaccharide structures in Escherichia coli.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102，3016-3021)，或Top 10细胞(图片E，1-6道)或SCM7细胞(Alaimo，C，Catrein，I.，Morf，L.，Marolda，C.L.，Callewaert，N.，Valvano，M.A.，Feldman，M.F.，Aebi，M.(2006).Two distinct but interchangeable mechanisms for flipping of lipid-linked oligosaccharides.EMBO Journal 25，967-976)(图片E，7，8道)。图片显示的是经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后的细胞周质提取物转移至硝酸纤维素膜上并经特异性抗血清显色的结果。在图片A-D中，顶部显示的是用抗AcrA抗血清探针标记的免疫印迹结果(Wacker et al.2002，supra；Nita-Lazar，M.，Wacker，M.，Schegg，B.，Amber，S.，and Aebi，M.(2005).The N-X-S/Tconsensus sequence is required but not sufficient for bacterial N-linked protein glycosylation.Glycobiology 15，361-367)，底部显示的是用R12抗血清探针标记的免疫印迹结果(Wacker et al.，2002，supra)。+或-是指在细胞中存在功能性的或者突变的pgl操纵子。图片A中包含的样品有：可溶的野生型AcrA，其中含有pelB信号肽和6个组氨酸标签(1，2道)，AcrA-N273Q(3，4道)，AcrA-D121A(5道)。图片B：AcrA(1，2道)，AcrA-T145D(3道)，AcrA-N123Q-N273Q-T145D(4，5道)。图片C：AcrA-F115D-T145D(1，2道)，AcrA-N123Q-N273Q-N272D(3，4道)。图片D：AcrA-N273Q(1，2道)，AcrA-N273Q-F122P(3，4道)。图片E：CtxB(1，2道)，CtxB-W88D(3，4道)，CtxB-Q56/DSNIT(5，6道)，以及CtxB-W88D-Q56/DSNIT。

图3描述的是OmpH1中的多糖基化位点工程改造结果。Δwaal菌株SCM6采用质粒pACYCpgl(编码整个pgl簇)与表达以下类型的质粒共转化：野生型OmpH1(1道)，OmpH1^N139S-myc(2道)，OmpH1^{KGN→NIT，HFGDD→DSNIT}-myc(3道)，OmpH1^{RGD→NIT，HFGDD→DSNIT}-myc(4道)，OmpH1^{KGN→NIT，RGD→NIT}-myc(5道)，OmpH1^{KGN→NIT，RGD→NIT，HFGDD→DSNIT}-myc(6道)，或OmpH1^{KGN→NIT，V83T}-myc(7道)。好氧培养细胞，使用0.5％的阿拉伯糖诱导3小时然后进行分析。按照材料和方法部分所述，平衡培养液的光密度，然后将全细胞裂解液进行三氯乙酸沉淀。使用15％的SDS-PAGE分离蛋白后转印至PVDF膜上。上面的图片为使用抗myc标签抗体标记探针进行的全细胞裂解液免疫印迹。下面的图片为使用多糖特异性抗血清标记探针进行的全细胞裂解液免疫印迹。右侧指示的是非糖基化和糖基化的OmpH1的位置。

图4显示的是细胞表达不同OmpH1突变体时的荧光显微镜照片。使用Axioplan2显微镜(卡尔蔡司)进行荧光显微分析并使用Adobe Photoshop CS2进行图片组合。各图片分别表示表达不同OmpH1突变体的SCM6细胞：野生型OmpH1(图A)，OmpH1^N139S(图B)，OmpH1^C20S(图C)，OmpH1^{KGN→NIT，HFGDD→DSNIT}(图D)，OmpH1^{RGD→NIT，HFGDD→DSNIT}(图E)，OmpH1^{KGN→NIT，RGD→NIT}(图F)，OmpH1^{V83T，KGN→NIT}(图G)，以及OmpH1^{KGN→NIT，RGD→NIT，} ^{HFGDD→DSNIT}(图H)。第一列是后面3列的合并图片，在黑色背景下以灰色体现。第二列：灰色调下来自于DAPI斑点的蓝色荧光，第三列：来自于多糖特异性荧光的绿色荧光；第四列：来自于抗-myc斑点的红色荧光。

图5A是革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的荚膜多糖和脂多糖的示意图。

图5B是集成PgIB和EPA以及质粒DNA的基因组DNA，互相通用(例如，可互换)，编码多糖合成基因簇。

图6A描述的是使用本技术进行共轭疫苗生产的过程。

图6B描述了痢疾杆菌O1抗原表达质粒pGVXN64的构建过程。

图7A和7B为本发明中所用的蛋白质糖基化途径示意图。

图8A和8B为本发明中用于生产生物共轭物的各种表达平台示意图。

图9描述的是志贺氏杆菌生物共轭物的生产过程。

图10A描述的是O1血清型痢疾杆菌在焦磷酸葵烯醇(UPP)中O-抗原多糖生物合成。

图10B为载体蛋白示意图，例如EPA，可在之上设计N-糖基化位点。

图11描述的是在小鼠中引起抗志贺氏杆菌O1多糖免疫响应的生物共轭物。

图12为生物反应器中生产志贺氏菌O1-EPA生物共轭物(例如，O1-EPA)的结果。

图13描述的是O1-EPA的纯化。

图14A显示的是在不同条件下LB摇瓶中生产的一系列志贺氏菌O1-AcrA生物共轭物的免疫印迹分析。

图14B提供了不同的志贺氏菌血清型以及确定他们抗原性的多糖结构(例如，志贺氏菌O-抗原)。

图15显示的是本发明中O1血清型痢疾杆菌生物共轭物样品的1H核磁共振光谱的异头区域的展开图。

图16A显示的是志贺氏菌O1生物共轭物(例如，EPA-O1)正常化至生物量浓度(每道细胞浓度为0.1OD_600nm)的蛋白样品。

图16B显示的是志贺氏菌O1生物共轭物生产过程中的细胞周质提取物，加样于7.5％的SDS-PAGE上，使用考马斯亮蓝染色，来鉴定EPA和EPA-O1。

图17A显示的是来自于1.Source Q柱的蛋白组分经SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色分析后，用于鉴定志贺氏菌O1生物共轭物。

图17B显示的是来自于2.Source Q柱的蛋白组分经SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色分析后，用于鉴定志贺氏菌O1生物共轭物。

图18A显示的是来自于Superdex 200柱的蛋白组分经SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色分析后，用于鉴定志贺氏菌O1生物共轭物。

图18B显示的是来自于不同纯化步骤中的志贺氏菌生物共轭物，经SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色分析后的结果。

具体实施方式

发明介绍

本发明提供了一种多功能体内糖基化平台。

欧洲专利申请No.03702276.1(欧洲专利1 481 057)提到在一种原核生物体中引入核酸来编码：(i)特异性糖基转移酶用于组装寡糖至脂载体上，(ii)一种重组目标蛋白，包含共识序列“N-X-S/T”，其中X可为除脯氨酸一位的任何氨基酸，以及(iii)一种空肠弯曲菌寡糖转移酶(OTase)，可将所述寡糖共价结合于目标蛋白的共识序列中。所述原核生物可生产具有特异结构的N-糖链，该结构由特异的糖基转移酶的类型来确定。

蛋白质中已知的N-糖基化共识序列允许原核生物体中重组目标蛋白的N-糖基化，该共识序列包含空肠弯曲菌的寡糖转移酶(OTase)。

本发明的目的在于提供蛋白质以及生产此类蛋白的手段和方法，具有最优的N-糖基化效率，从而能在原核生物体内直接生产。本发明的另一目的致力于在重组蛋白中更有效的引入N-糖链，从而修饰所述蛋白的抗原性、稳定性、生物功能、预防和/或治疗活性。进一步的目的是提供一种宿主细胞，该细胞能够有效的将本发明中车重组N-糖基化蛋白展示在其表面上。

第一方面，本发明提供一种重组N-糖基化蛋白，包含一种或多种以下最优化N-糖基化氨基酸序列：D/E-X-N-Z-S/T(最优共识序列)，其中X和Z可以为除脯氨酸以外的任何天然氨基酸，并且至少引入一种所述的N-糖基化的部分氨基酸序列。

惊奇的发现，在蛋白中引入特异的部分氨基酸序列(最优共识序列)会导致这些蛋白在引入位点中更有效的被来源于空肠弯曲菌属尤其是空肠弯曲菌的寡糖转移酶(OST，OTase)N-糖基化。

本发明中所用的术语“部分氨基酸序列”也可被称为“最优共识序列”或“共识序列”。相对于已有技术中通常的共识序列“N-X-S/T”，最优共识序列可更有效的被来源于空肠弯曲菌属尤其是空肠弯曲菌的寡糖转移酶(OST，OTase)N-糖基化。

通常来说，术语“重组N-糖基化蛋白”指的是宿主细胞中生产的任何异源多肽或寡肽，而宿主细胞本身不包含编码所述蛋白的核酸序列。在本发明的上下文中，该术语指的是在任何宿主细胞中重组生产的蛋白，比如，真核或原核宿主细胞，优选原核宿主细胞，例如大肠杆菌属、空肠杆菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、幽门螺杆菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属，更优选大肠杆菌、空肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌等等，其中编码所述蛋白的核酸序列已被引入所述的宿主细胞中，编码蛋白被来源于空肠杆菌属优选空肠杆菌的寡糖转移酶N-糖基化，所述的转移酶天然存在于或者被引重组引入所述的宿主细胞。

依据国际上使用一个字母表示氨基酸的惯例，缩写字母D，E，N，S，和T分别表示天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、丝氨酸和苏氨酸。本发明中涉及到的蛋白与天然的或者先前技术中的蛋白的不同之处在于，引入了一个或多个最优共识序列D/E-X-N-Z-S/T，且被N-糖基化。因此，本发明中的蛋白与天然存在的空肠杆菌蛋白不同，虽然天然蛋白也研友最优共识序列，但其并不包含任何添加的(引入的)最优共识序列。

最优共识序列的引入可以通过一个或多个氨基酸的添加、删除及/或替换来完成。为了引入最优共识序列，添加、删除及/或替换一个或多个氨基酸可以使用本领域技术人员熟知的化学合成策略来实现，例如固相辅助的化学肽合成。对于本发明中较大的多肽，更优选的是，采用标准重组技术来制备蛋白。

本发明中的蛋白具有的优点是，它们可在含有功能性pgl操纵子的任何原核细胞中高效生产，操纵子来源于空肠杆菌属，优选空肠杆菌。为了实践本发明中的各方面体现，优选的来自于空肠杆菌属的寡糖转移酶为大肠空肠杆菌及拉里空肠杆菌(见Szymanski，C.M.and Wren，B.W.(2005).Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens.Nat.Rev.Microbiol.3：225-237)。当原核宿主细胞为空肠杆菌属，优选空肠杆菌的时候，功能性pgl操纵子可以天然存在。但是，就如先前的技术和本文描述的那样，功能性pgl操纵子可以被转入细胞并且在所述的新的胞内环境中保持原有的功能。

术语“来源于空肠杆菌属，优选空肠杆菌的功能性pgl操纵子”指的是，编码来源于空肠杆菌属，优选空肠杆菌的功能性寡糖转移酶(OTase)的核酸基因簇，以及编码一种或多种能够将寡糖组装至脂载体上的特异性糖基转移酶，其中，所述的寡糖可被该寡糖转移酶从脂载体上转移至含有一个或多个最优氨基酸序列D/E-X-N-Z-S/T的目标蛋白上。可以理解，本发明上下文中的术语“来源于空肠杆菌属，优选空肠杆菌的功能性pgl操纵子”未必指的是作为一个单独转录单元的操纵子。该术语只是需要在宿主细胞内的重组蛋白具有N-糖基化功能组分的存在。这些组分可被转录为一种或多种独立的信使RNA以及可被共同及分别调节。例如，该术语也包括宿主细胞内位于基因组或质粒DNA上的功能组分。为了达到高效的目的，优选该功能性pgl操纵子的所有组分都同时调节和表达。

意识到以下内容非常重要，只有功能性寡糖转移酶(OTase)应来源于空肠杆菌属，优选空肠杆菌，具有组装寡糖分子至脂载体能力的一种或多种特异糖基转移酶可以来源于宿主细胞或者被重组引入所述的宿主细胞，唯一的功能局限性是指，被所述糖基转移酶组装的寡糖分子可被寡糖转移酶从脂载体上转移到含有一个或多个最优共识序列的目标蛋白上。因此，选择含有天然特异性糖基转移酶的宿主和/或破坏所述宿主中天然存在特异性糖基转移酶，以及引入外源特异性糖基转移酶，都将使本领域的技术人员能够把本发明中的蛋白质的N-糖链键改为N-糖基化共识位点。

根据上述的结果，本发明为单独设计蛋白上的N-糖链模式提供了方案。因此，蛋白在它们的N-糖链模式上可被赋予不同特征用来适应生物、医药以及纯化的需要。

首选的具体化方案中，本发明的蛋白可以包含一个也可以包含大于一个所述的N-糖基化最优氨基酸序列，优选至少2个，至少3个，更优选至少5个。

本发明蛋白质中的一个或多个N-糖基化最优氨基酸序列的存在，对于提高蛋白的抗原性、稳定性、影响蛋白的生物活性，延长蛋白的生物半衰期和/或简化蛋白的纯化都有很大的优势。

最优共识序列可以包括任何氨基酸，除了在X和Z位置上不能是脯氨酸。术语“任何氨基酸”表示包括常见的和稀有的氨基酸，以及允许最优共识序列被寡糖转移酶N-糖基化的合成氨基酸衍生物和类似物。对于X和Z，优选天然存在的常见和稀有氨基酸。X和Z可以相同或不同。

值得注意的是，本发明涉及到的蛋白质中的每个最优共识序列中的X和Z可以不同。

当脂载体上的寡糖被寡糖转移酶组装转移时，结合于最优共识序列上的N-糖链键可通过特异的糖基转移酶和它们之间的反应来确定。本领域的技术人员可以通过改变预期目标宿主细胞中存在的特异性糖基转移酶的类型和数量来设计N-糖链键。

这里的N-糖链可定义为不同结构的单糖、寡糖或者多糖通过N-糖苷键连接至蛋白质中的一个天冬酰胺残基的ε-酰胺氮上。优选的是，寡糖转移酶转移的N-糖链是被组装在革兰氏阴性或阳性细菌细胞质膜上的焦磷酸葵烯醇脂锚上。它们涉及到O抗原、O多糖和肽聚糖的合成(Bugg，T.D.，and Brandish，P.E.(1994).From peptidoglycan to glycoproteins：common features of lipid-linked oligosaccharide biosynthesis.FEMS Microbiol Lett 119，255-262；Valvano，M.A.(2003).Export of O-specific lipopolysaccharide.Front Biosci 8，s452-471)。

本发明首选具体化方案中，重组蛋白包含一个或多个N-糖链，它们来源于于空肠杆菌属的N-糖链群体，优选空肠杆菌，在革兰氏阴性菌中，N-糖链衍生自转移至O抗原形成O多糖的寡糖及多糖，或者在革兰氏阳性菌中，衍生自荚膜多糖，优选绿脓杆菌09，011；大肠杆菌07，09，016，0157和痢疾杆菌O1，以及构建的突变菌株，通过插入或剔除影响多糖结构的糖基转移酶及差向异构酶来获得这些菌株。

本发明的进一步首选具体化方案中，重组蛋白包含两个或更多不同的N-糖链。

举例来说，同一个蛋白上的不同N-糖链可以通过控制特异性糖基转移酶的表达时间来制备，利用早期或晚期启动子或诱导因子来起始、沉默、增强和/或减弱不同特异性糖基转移酶的启动子活性。对于本领域技术人员来说，通常很容易找到合适的控制这些活性的启动子和因子。

发明中对于重组蛋白的来源没有限制。优选的是，所述蛋白来自于哺乳动物、细菌、病毒、真菌或者植物蛋白。更优选的是，所述蛋白来自于哺乳动物，最好来自于人类蛋白。根据本发明，为了制备抗原性重组蛋白，尤其用作疫苗中的活性组分，重组蛋白最好来自于细菌、病毒或者真菌蛋白。

在进一步优选具体化方案中，本发明规定的重组蛋白，其中无论蛋白和/或N-糖链是具有治疗和/或预防活性的。引入至少一种最优N-糖基化的共识序列能够修饰甚至诱导蛋白的治疗和/或预防活性。在更进一步优选具体化方案中，正是蛋白和/或N-糖链是具有免疫活性的。在这种情况下，引入的N-糖基化可以对蛋白的生物活性具有一定的修饰作用，和/或可以引入新的抗原位点和/或可以掩饰蛋白来躲避降解步骤和/或增长半衰期。

本发明的重组蛋白可有效地锚定于宿主细胞的外膜和/或表面上，宿主细胞优选细菌，更优选革兰氏阴性菌。为了辅助表面展示和/或外膜定位，本发明的重组蛋白最好包含至少一段多肽序列，能够帮助所述重组蛋白锚定于细菌的外膜和/或细胞表面，优选革兰氏阴性菌。

在优选具体化方案中，本发明的重组蛋白是这样一种蛋白，其中所述目标多肽序列来源于包含II型信号肽的群体(Paetzel，M.，Karla，A.，Strynadka，N.C.，and Dalbey，R.E.2002.Signal peptidases.Chem Rev 102：4549-4580.)，或者外膜蛋白(Wemerus，H.，and Stahl，S.2004.Biotechnological applications for surface-engineered bacteria.Biotechnol Appl Biochem 40：209-228)，优先从包含来自于空肠弯曲菌的OmpH1或JipA的全长蛋白或者信号肽的群体中选择，外膜蛋白来源于大肠杆菌，优选OmpS、OmpC、OmpA、OprF、PhoE、LamB、Lpp’OmpA(表面展示技术所用的一种融合蛋白，见Francisco，JA.，Earhart，C.F.，and Georgiou，G.1992.Transport and anchoring of beta-lactamase to the external surface of Escherichia coli.Proc Natl Acad Sci USA89：2713-2717.)，以及来源于绿脓杆菌的lnp蛋白。

在另一方面，本发明涉及一种核酸序列，该序列编码本发明中的重组蛋白。优选的，所述核酸可以为mRNA、DNA或者PNA，更优选的，为mRNA或DNA，最优选的是DNA。该核酸可以包含编码所述蛋白的序列，另外，还可以包含例如调节序列的其他序列，比如启动子、增强子、终止密码、起始密码以及需要通过提及的调节序列调节重组蛋白表达的基因，等等。术语“编码本发明中重组蛋白的核酸”指的是一种核酸，该核酸包含所述编码序列以及可选的任何其他核酸序列，不考虑序列信息，只要这种序列能够在含有功能性pgl操纵子的宿主细胞中生产本发明中的重组蛋白，功能性pgl操纵子来源于空肠杆菌属，优选空肠杆菌。更可取的是，本发明提供了分离纯化的核酸可与启动子相连，优选连接的启动子来源于含有已知诱导型和组成型原核启动子的群体，更优选的是四环素启动子、阿拉伯糖启动子、水杨酸启动子、lac-、trc-、以及tac启动子(Baneyx，F.(1999).Recombinant protein expression in Escherichia coli.Curr Opin Biotechnol 10，411-421；Billman-Jacobe，H.(1996).Expression in bacteria other than Escherichia coli.Curr Opin Biotechnol 7，500-504.)。所述的可操作连接的核酸能够用做疫苗接种。

进一步，本发明的另一方面涉及到一种宿主细胞，其含有与本发明相关的核酸和/或载体。宿主细胞的类型不限，只要它能容纳来自于空肠杆菌的功能性pgl操纵子，以及一个或多个编码本发明中重组蛋白的核酸序列。优选的宿主细胞为原核宿主细胞，更优选的是细菌，最优选的那些来自于由大肠杆菌属、空肠杆菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、幽门螺杆菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属的组成的集合，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌Top 10，W3110，CLM24，BL21，SCM6和SCM7(Feldman et al.，(2005).Engineering N-linked protein glycosylation with O antigen lipopolysaccharide structures in Escherichia coli.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102，3016-3021；Alaimo，C，Catrein，I.，Morf，L.，Marolda，C.L.，Callewaert，N.，Valvano，M.A.，Feldman，M.F.，Aebi，M.(2006).Two distinct but interchangeable mechanisms for flipping of lipid-linked oligosaccharides.EMBO Journal 25，967-976)以及肠炎沙门氏菌株SL3261(肠炎沙门氏菌亚属，伤寒菌LT2ΔaroA，见Hoiseth，S.K.，and Stocker，B.A.1981，Aromatic-dependent Salmonella typhimurium are non-virulent and effective as live vaccines.Nature 291：238-239)，SL3749(肠炎沙门氏菌亚属，伤寒菌LT2waaL，见Kaniuk et al.，J.Biol.Chem.279：36470-36480)和SL3261Δwaal。

在更优选具体化方案中，本发明涉及的宿主细胞是一个这样的细胞，它有益于本发明中的重组蛋白锚定于外膜和/或表面展示，优选一个，其中所述的宿主细胞为重组革兰氏阴性菌，并具有以下特征：

i)基因型含有编码以下内容的核酸：

a)至少一种用于组装寡糖分子至脂载体上的天然的或重组的特异性糖基转移酶，

b)至少一种天然的或重组的来自于空肠杆菌属优选空肠杆菌的原核寡糖转移酶(OTase)，

c)至少一种本发明涉及的重组蛋白，优选包含目标多肽的蛋白，以及

ii)基因型含有本发明涉及的重组N-糖基化蛋白，蛋白定位于革兰氏阴性菌外膜内或外膜上。

上述方案的宿主细胞最好来自于大肠杆菌属、空肠杆菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、幽门螺杆菌属、假单胞菌属，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌菌株Top10，W3110，CLM24，BL21，SCM6和SCM7以及肠炎沙门氏菌株SL3261、SL3749和SL326liδwaaL(见Hoiseth，S.K.，and Stocker，B.A.1981，Aromatic-dependent Salmonella typhimurium are non-virulent and effective as live vaccines.Nature 291：238-239)，SL3749(Kaniuk，N.A.，Vinogradov，E.，and Whitfield，C.2004.Investigation of the structural requirements in the lipopolysaccharide core acceptor for ligation of O antigens in the genus Salmonella：WaaL“ligase”is not the sole determinant of acceptor specificity.J.Biol Chem 279：36470-36480)。

因为本发明的优选蛋白自身和/或由于引入N-糖基化位点后具有治疗或预防活性，它们可用于药品制备。实践本发明的蛋白类型是不限的，因此，例如EPO、IFN-alpha、TNFalpha、IgG、IgM，IgA、白细胞介素、细胞因子、用于疫苗接种的病毒和细菌蛋白比如空肠杆菌蛋白HisJ(CjO734c)、AcrA(CjO367c)、OmpH1(CjO982c)、白喉毒素(CRM197)、霍乱毒素、绿脓杆菌外蛋白，仅举几例，发明中的具有最优化N-糖基化共识序列蛋白都可用于药品制备(Wyszynska，A.，Raczko，A.，Lis，M.，and Jagusztyn-Krynicka，E.K.(2004).Oral immunization of chickens with avirulent Salmonella vaccine strain carrying C.jeuni 72Dz/92cjaA gene elicits specific humoral immune response associated with protection against challenge with wild-type Campylobacter.Vaccine22，1379-1389)。

另外，本发明涉及的核酸和载体也可用于药品制备，尤其用于基因治疗方面。

此外，本发明的宿主细胞，优选基因型含有N-糖基化重组蛋白的细胞，其中重组蛋白定位于细菌的外膜内部和/或外膜上，优选革兰氏阴性菌，更优选之前列举的革兰氏阴性菌，尤其更有益于药品制备。

更优选的是，本发明的蛋白用于制备治疗性和/或预防性疫苗，按其所需的。

更进一步的优选具体方案，本发明涉及到使用核酸和/或载体用于制备治疗性和/或预防性疫苗，按其所需，尤其用于基因治疗。

本发明中的展示所述N-糖基化重组蛋白的宿主细胞尤其适用于制备疫苗，因为N-糖基化蛋白丰富地展示于细胞表面，很容易被免疫细胞接近，尤其是它们的亲水性N-糖链，另外因为宿主细胞具有佐剂的辅助效果，如果存活，甚至可以在一定程度上复制并且增强其免疫效果。

优选的是，本发明用于实践医学方面所用的宿主细胞为减毒的或者杀死的宿主细胞。

使用发明的宿主细胞制备药品，尤其是疫苗的另一个优势在于，它们会诱导基于细胞成分的IgA抗体。

优选的是，根据本发明涉及的所述宿主细胞可用于在动物内体诱导IgA抗体，尤其是哺乳动物、啮齿动物、羊、马、犬齿动物、牛或人类。首选的所述的疫苗接种目标为鸟类、哺乳动物或者鱼类，优选哺乳动物，更优选的是包含牛、羊、马、狗、猫和人类，最优选的是人类。家禽也是可选对象。

本发明的另一方面涉及到药用成分，包含本发明中的至少一种蛋白，至少一种核酸，至少一种载体和/或至少一种宿主细胞。药品制备包含蛋白或宿主细胞，优选减毒的或者杀死的宿主细胞，药品制备还包括本领域熟知的用于基因治疗的核酸和/或载体。最终的关于药用成分和投药方式和细节的制备方案依赖于所用的蛋白、宿主细胞、核酸和/或载体。

在优选具体化方案中，本发明的药用成分包含医药上接受的赋形剂、稀释剂和/或佐剂。

本发明提供的药用成分包含以下内容中的至少一种：(i)重组蛋白、宿主细胞、核酸和/或重组载体，用来作为/编码/表达本发明的重组蛋白，以及(ii)医药上接受的赋形剂、稀释剂和/或佐剂。

合适的赋形剂、稀释剂和/或佐剂在本领域是熟知的。赋形剂或者稀释剂可以为固体、半固体或者液体材料，用来作为活性组分的传送媒介。制药领域的通常技术能够根据所选产品的独特性质、要处理的疾病或状况、疾病的阶段以及其他相关的情况很容易的选择合适的形式和给药方式(Remigton’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.(1990))。医药上允许的稀释剂或赋形剂的比例和类型由以下内容来决定：所选的药学活性化合物的可溶性和化学性质，所选的给药途径，及标准药物实践。药品制剂可以适用于口服、注射或者局部使用，通过药片、胶囊、栓剂，药水、悬浮药浆或其他类似的形式将药品制剂给药至病人。本发明中的药学活性化合物，其本身有效时，可以通过医药上允许的盐的形式合成及给药，例如酸性盐或者碱性盐，这是为了提高其稳定性、便于结晶，增强可溶性等等。

本发明的进一方面涉及到生产N-连接的糖基化蛋白的方法，由以下步骤组成：

a)提供一种重组生物体，优选原核生物，包含的核酸编码以下内容：

i)来源于空肠杆菌属，优选空肠杆菌的功能性pgl操纵子，以及

ii)至少一种重组目标蛋白，包含一个或多个以下的N-糖基化最优氨基酸共识序列：D/E-X-N-Z-S/T，其中，X和Z可以为除了脯氨酸以外的任何天然氨基酸，至少引入一种所述的N-糖基化最优氨基酸共识序列，以及

b)以一种适合生产的方式培养重组微生物并且糖基化目标蛋白。

优选的是，目标蛋白是本发明之前描述的重组蛋白中的一种。

在本发明的一种优选方案中，功能性pgl操纵子来源于空肠杆菌属，优选空肠杆菌，包含的核酸编码以下内容：

i)来源于空肠杆菌属，优选空肠杆菌的重组寡糖转移酶，以及

ii)来源于空肠杆菌属，优选空肠杆菌的重组和/或天然的特异性糖基转移酶，和/或

iii)来源于空肠杆菌属以外的其他物种的重组和/或天然的特异性糖基转移酶；

在寡糖转移酶作用下将组装在脂载体上的寡糖分子转移至目标蛋白上。

进一步，在具体化优选方案中，本发明还涉及到一种制备宿主细胞的方法，包括以下步骤：

i)提供一种革兰氏阴性菌，

ii)在所述的细菌中引入至少一种核酸序列，编码：

a)至少一种重组特异性糖基转移酶，用于将寡糖分子组装至脂载体上，和/或

b)至少一种重组寡糖转移酶(OTase)来源于空肠杆菌属，优选空肠杆菌，和/或

c)至少一种重组目标蛋白，包含一个或多个以下的N-糖基化最优氨基酸共识序列：D/E-X-N-Z-S/T，其中，X和Z可以为除了脯氨酸以外的任何天然氨基酸，至少引入一种所述的N-糖基化最优氨基酸共识序列，以及

iii)培养所述细菌直到至少一种由c)中的核酸序列编码的重组N-糖基化蛋白定位于革兰氏阴性菌的外膜内部或表面。

为了实施之前的优选方法，重组原核生物体或宿主细胞最好从以下细菌群中选择，大肠杆菌属、空肠杆菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、幽门螺杆菌属、假单胞菌属，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌菌株Top10，W3110，W3110ΔwaaL，BL21，SCM6和SCM7以及肠炎沙门氏菌株SL3261、SL3749和SL3261ΔwaaL。

本发明另一种优选的用于生产，分离和/或纯化重组蛋白的方法，包括以下步骤：

a)培养宿主细胞，

b)剥离所述重组革兰氏阴性菌的外膜，以及

c)回收所述重组蛋白。

典型的剥离细胞外膜的方法，优选原核细胞，更优选革兰氏阴性菌细胞，是合适的酶处理法、渗透压休克清洗剂溶解法以及法式压力法。

最优选的是，本发明涉及一种方法，其中重组或天然的特异性糖基转移酶来自空肠杆菌属以外的种属，这些种属的糖基转移酶和差向异构酶起源于细菌、古细菌和/或真核细胞，而能够在所述的宿主细胞中进行功能性表达。

生物共轭物疫苗

本发明的一个具体化方案涉及到新的生物共轭疫苗。进一步具体化方案涉及到一种生产这些生物共轭疫苗的新方法，该方法使用重组细菌细胞，直接生产免疫原性或者抗原性的生物共轭物。在一种具体化方案中，生物共轭疫苗可用来处理或者阻止细菌性疾病，例如腹泻、医院内感染、脑膜炎。进一步具体化方案，生物共轭疫苗对于癌症或者其他疾病具有治疗和/或预防的潜力。

共轭疫苗可以给药至儿童来避免细菌性感染以及能够为成人提供一个长期持久的免疫反应。本发明的构建结果已被发现可以在动物体内产生IgG响应。已经发现，在人体中针对于支贺氏O-特异性多糖蛋白共轭疫苗的IgG响应与人类的免疫保护密切相关(Passwell，J.H.et al.，“Satety and Immunogenicity of Improved Shigella O-Specific Polysaccharide-Protein Conjugate Vaccines in Adults in Isreal”Infection and Immunity，69(3)：1351-1357(Mar.2001).)。据认为，多糖(即糖残基)会引发短期的糖-特异性免疫反应。确切的来说，人类的免疫系统会对细菌的特异性多糖表面结构产生强烈的响应，例如O-抗原性和荚膜多糖。然而，由于对多糖的免疫反应是IgM依赖性的，免疫系统不会形成记忆。含有多糖的蛋白载体引发的IgG响应是T-细胞依赖性的，免疫系统形成记忆，因此会提供长期有效的保护。

对人类来说，典型的接种剂量大约为1-25微克，优选大约1-10微克，最优选为约10微克。任选地，疫苗会包括一种佐剂，例如本发明中的生物共轭疫苗。

由多糖(即糖残基)和蛋白质(即蛋白载体)合成的配合物可以用作共轭疫苗来防御一些细菌感染。一方面，本发明针对于一种新的生产免疫原性的共轭疫苗的生物工程方法，比传统的化学共轭方法更有优势。在一具体化实施方案中，该方法包括在细菌细胞中体内生产糖蛋白，举例来说，在革兰氏阴性菌例如大肠杆菌中生产。

细菌细胞中不同多糖的生物合成是保守的。在细胞质膜上多糖被不同的糖基转移酶从常见的前体物(活化糖核苷酸)中组装至脂载体上，这些糖基转移酶都具有确切的特异性。脂多糖(LPS)只在革兰氏阴性菌中存在，例如志贺氏菌属，假单胞菌属以及大肠杆菌(ExPEC，EHEC)。

在细胞膜靠近细胞质这一侧，脂多糖的合成起始于单糖分子添加至脂载体磷酸十一异戊二烯上。通过不同的糖基转移酶连续的添加来自于活化糖核苷酸的单糖分子，抗原逐渐积累，连接脂类的多糖被翻转酶翻转至膜的另一侧。通过酶反应抗原重复单元被聚合。多糖然后被连接酶WaaL转移至脂质A上形成脂多糖，运输到表面，而荚膜多糖在聚合后被运输到表面，是从脂载体上释放。这些多糖的合成途径启动了体内脂多糖的生产，在细胞周质中捕获多糖到蛋白载体上。生物共轭物，例如脂多糖生物共轭物在本发明中是首选的。

如图5A所示，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有被荚膜多糖围绕的细胞膜。革兰氏阴性菌额外的在细胞膜上还有一层外膜，周质空间将两层膜隔开。另外，他们在表边上包含脂多糖。当使用革兰氏阴性菌，例如大肠杆菌生产本发明中的共轭疫苗时，共轭疫苗中所用的糖蛋白是在周质空间中组装的。

共轭疫苗已经成功用于防御细菌感染。抗原多糖与蛋白载体的共轭结合需要保护性记忆响应，因为多糖是T-细胞非依赖性抗原。可以通过不同的化学方法，使用多糖及蛋白中的活化反应基团，将多糖共轭结合至蛋白载体上。

图6A描述了使用本发明技术生产共轭疫苗的方法，同时与目前通用的方法进行了比较。通常，共轭疫苗的生产方法都是使用两轮发酵，以及多步纯化和化学裂解步骤，如上面的图片所示意。这种方法有一些问题。首先，需要大规模的培养病原微生物。第二，共轭结合方法要依赖于多糖。第三，该方法的重复能力较低。第四，由于非特异结合，该方法的均一性较低。第五，由于共轭结合过程中多糖过量，产物的纯度较低。最后，目前的方法的收率低于20％。

如图6中下面的图片所示，在具体实施方案中，本发明的创新的技术可用于在非病原性细胞体内生产共轭疫苗(例如生物共轭疫苗)，避免了化学反应，而且经过少许纯化步骤后，产物纯度较高。同时，该新方法能够生产一些生物共轭疫苗，而通常方法是不可行的。而且，共轭结合及纯化过程并不依赖于所使用的多糖抗原。因此，使用新的多糖结构，可使生物共轭疫苗设计的更快。所得共轭物较高的均一性和良好的重复性(即无批次差异)使得从质量控制和监管观点来说，本方法具有很高的吸引力。另外，该新方法能得到很好的收率(30-60mg/L，最高至200mg/L)。

本发明涉及到一种新的共轭结合方法，包括设计细菌细胞来生产最终的生物共轭疫苗。本发明的一个具体实施方案，使得生物共轭疫苗生产可在胞内进行，避免了化学结合，一次简化了生产方法。本技术包括一种新的基因/酶机理，用于体内合成新的由蛋白结合糖组成的生物共轭物。

本发明的一方面基础是，发现了空肠杆菌含有一种普遍的N-连接蛋白糖化系统，这对于原核生物是不常见的特征。已证实空肠杆菌不同的蛋白是被一种七糖分子修饰的。这种七糖是在内膜的细胞质一侧，通过特异性糖基转移酶催化，逐步添加核苷酸活化单糖，最终组装到焦磷酸十一异戊二烯，也就是脂载体上。脂连接的寡糖分子然后在翻转酶，例如PgIK的作用线翻转(横向扩散)进入周质空间。N-连接蛋白糖基化的最后一步，是寡糖转移酶(例如PglB)催化脂载体上的寡糖分子转移至共识序列Asp/Glu-Xaa-Asn-Zaa-Ser/Thr(即，D/E-X-N-Z-S/T)的天冬酰胺残基上，共识序列中Xaa和Zaa可以为除了脯氨酸以外的任何氨基酸(图7A)。我们已经成功的将七糖的糖化反应基因簇转入大肠杆菌，并且能够生产空肠杆菌的N-连接的糖化蛋白。

我们已能证实，PglB蛋白对于脂连接的糖底物没有严格的特异性。组装在焦磷酸十一异戊二烯上的抗原多糖可被细胞周质中的PglB捕获并转移至蛋白载体上(Feldman，2005；Wacker，M.，et al.，Substrate specificity of bacterial oligosaccharyltransferase suggests a common transfer mechanism for the bacterial and eukaryotic systems.Proc Natl Acad Sci U S A，2006，103(18)：p.7088-93)。该酶同样可以转移一系列的焦磷酸十一异戊二烯(UPP)连接的寡糖，只要它们的还原末端含有N-乙酰氨基己糖。SEQ ID NO：1给出了pglB的核酸序列，SEQ ID NO：2给出了PglB的氨基酸序列。

图7A和7B给出了本发明中蛋白糖基化(即，N-糖基化系统)途径的示意图。在具体实施方案中，空肠杆菌的蛋白糖基化途径(例如，包括pgl操纵子)可被引入大肠杆菌。在图7A中，一种寡糖分子，特定的由五个N-乙酰-D-半乳糖胺单元、一个葡萄糖单元和一个2，4-二乙酰胺-2，4，6-三脱氧-D-葡萄糖单元组成的七糖，利用内膜细胞质一侧的糖基转移酶(例如，pglA，pglC，pglH，J，I)组装至脂载体，十一异戊二烯焦磷酸(UDP)上，然后通过被称为PglK的翻转酶转移至周质空间中。个别地，描述为螺旋并且含有共识序列D/E-X-N-Z-S/T(即，Asp/Glu-Xaa-Asn-Zaa-Ser/Thr)的蛋白载体在细胞质中翻译并分泌至周质空间中。最后一步，寡糖转移酶(OST或OTase)(例如，PglB)催化该七糖分子转移至蛋白载体共识序列中的天冬酰胺残基上，得到糖蛋白。

图7B也描述了多糖(即，抗原多糖或抗原)的生物合成过程，包括糖基转移酶逐步反应，通过翻转酶转移O-抗原至周质中，然后在聚合酶(例如wzy)作用下聚合反应至多糖中。个别地，蛋白载体，例如EPA，是产生后分泌到细胞周质中的。寡糖转移酶(OST或OTase)，例如PglB，拥有宽松的底物特异性，将多糖从脂载体转移至EPA内共识序列的天冬酰胺上。

图8A显示的示意图描述了本发明生物共轭物生产的表达平台的具体实施方案。本发明技术对于采用不同的已知蛋白载体是通用的，只要蛋白载体包含或者经修饰后包含之前讨论的共识序列。特别地，图8A阐述了表达宿主的构建，例如本发明具体实施方案中的工程化大肠杆菌。该大肠杆菌包含糖基化系统的通用组分(即，一种寡糖转移酶，如PglB，以及一种蛋白载体，如EPA)。该通用组分可插入到大肠杆菌的基因组中。另外，连接酶WaaL以及WecG被删除。此外，多糖抗原表达的非特异组分(即，多糖合成基因簇，包括，例如糖基转移酶、聚合酶、翻转酶以及糖生物合成酶)可以通过添加一个可互换的质粒来提供。该方案还允许蛋白载体和体内可选的多糖进行特异的糖基化反应。

在具体实施方案中，细菌生物共轭物的表达系统符合生产质量管理规范(GMP)，编码可诱导寡糖转移酶和蛋白载体的DNA能够稳定插入到细菌(例如大肠杆菌)的基因组中，因此可以省略基因的抗生素筛选。举例来说，如图5B所示，PglB和EPA插入到基因组中，而编码多糖合成基因簇的质粒是可通用的(即，可互换的)。

在另一具体实施方案中，图8B展示了含有三个质粒的细菌生物共轭物表达系统。第一个质粒编码载体蛋白，例如来自空肠杆菌的AcrA蛋白，它含有两个N-糖基化位点并且被PelB信号肽导向于细胞周质。第二个质粒编码寡糖转移酶，例如来自于空肠杆菌的PglB蛋白，该蛋白结合于膜上。第三个质粒是一个天然质粒，编码多糖(O抗原)合成基因簇，例如痢疾杆菌O1抗原。

在具体实施方案中，用于细菌O抗原，例如痢疾杆菌O1抗原表达的质粒，可构建为pGVXN64，如图6B所示。该质粒编码痢疾杆菌中多糖合成所必需的所有酶，构成O1血清型。这些酶列于图6B的左侧。表达痢疾杆菌O1抗原的载体pGVXN64是这样构建的：使用EcoR I酶切质粒pLARFR1(Vanbleu，E.et al.，“Genetic and physical map of the pLAFR1 vector”DNA seq.15(3)：225-227)，然后插入寡核苷酸盒5’-AATTCTGCAGGATCCTCTAGAAGCTTGG(SEQ ID NO：3)以及5’-AATTCCAAGCTTCTAGAGGATCCTGCAG(SEQ ID NO：4)。质粒pSDM7(Falt，I.et al.，“Construction of recombinant aroA salmonellae stably producing the Shigella Dysenteriae serotype 1O-antigen and structural characterization of the Salmonella/Shigella hybrid LPS”Microb.Pathog.20(1)：11-30(1996))经BamH I消化后，含有痢疾杆菌O1的rfb和rfp基因簇的片段，通过BamH I位点克隆至pLAFR1的寡核苷酸盒中。质粒pGVXN64中编码痢疾杆菌O1抗原的完整核酸序列陈列于后面提供的序列表中，SEQ ID NO：5。

本发明的表达系统所用的宿主生物可以是，大肠杆菌，例如大肠杆菌W31110ΔwaaL。WaaL的敲除可以避免将任何多糖转移到脂质体A的核心。染色体上的WaaL拷贝可以被PglB替代。该菌株也包含wbbL突变，因此不会产生任何大肠杆菌O16多糖。为了进一步提高脂载体连接的多糖的产量，wecG也被敲除，从而避免ECA(肠共同性抗原)的形成。

一方面，本发明进一步涉及到生物共轭疫苗的开发，尤其是LPS生物共轭疫苗，抵抗一种或多种志贺氏菌种，这些菌是具有侵害性的革兰氏阴性菌。志贺氏菌种会造成细菌性痢疾，这是一种严重的结肠炎症。世界上每年有一亿六千五百万病例，其中70％发生在小于5岁的儿童身上。在发展中国家，志贺氏细菌性痢疾每年造成一百一十万人死亡。这是一种严重的通过粪-口途径传播的疾病，并且具有很高的传染性。针对于志贺氏菌种的免疫接种有益于很多潜在人群，例如儿童、旅行者以及难民营中的人群。志贺氏菌种有四种不同的血清组，分别为痢疾杆菌、福氏志贺氏菌、宋内氏志贺氏菌和鲍氏志贺氏菌。本发明的具体实施方案中，具有免疫性的生物共轭物可用来抵抗每种不同血清组的志贺氏菌属。举例来说，图14B提供了志贺氏菌的不同血清型以及确定它们抗原性的多糖结构(即，志贺氏菌O-抗原)。

在本发明的进一步具体化实施方案中，使用本说明书中的技术，产生免疫性的LPS生物共轭物可用来抵抗其他细菌，包括的细菌有：(1)造成医院内感染的，例如绿脓杆菌，以及(2)造成尿道感染的，例如肠外大肠杆菌(ExPEC)。

在一个具体实施方案中，发明者使用通常的大肠杆菌基因工程菌经过简单的发酵和纯化方法，开发了一种志贺氏痢疾杆菌O1LPS生物共轭疫苗(也成为痢疾杆菌生物共轭物)。图9描述的是志贺氏菌生物共轭物的生产过程。上面的图片显示的是大肠杆菌中生物共轭物的合成。在具体实施方案中，痢疾杆菌O1的O-抗原重复单元组装在十一异戊二烯焦磷酸脂载体上，翻转至周质空间进行聚合。痢疾杆菌O1的结构如下，图9的中部右侧也有显示。

PglB转移活化的多糖分子至蛋白载体的天冬酰胺残基上，形成了支贺氏菌生物共轭物。蛋白载体可以为，例如，AcrA蛋白或者一种已被修饰的蛋白载体，含有蛋白糖基化共识序列，即D/E-X-N-Z-S/T，其中X和Z可以为除了脯氨酸以外的任何氨基酸(例如，修饰的绿脓杆菌外毒素(EPA))。EPA已被成功用于共轭疫苗。

在图9阐述的具体实施方案中，在PglB和O1多糖簇存在时，表达修饰的EPA的大肠杆菌周质蛋白经SDS-PAGE分离后，转印至硝酸纤维素膜上，用高抗EPA的抗血清对EPA进行免疫检测(第二道)。第一道是，在PglB和O1多糖簇存在时，表达空肠杆菌蛋白AcrA的大肠杆菌周质蛋白经分离后，用高抗AcrA的抗血清进行免疫检测。两种蛋白都被O1-多糖簇所糖基化。图9的最下面图片中，来自于大肠杆菌的LPS蛋白经SDS-PAGE分离后，使用印染成像。左边一道显示的是提取自不表达WaaL的菌株的LPS，右边一道则显示了典型的O1LPS形态。两种菌株都表达了痢疾杆菌O1的多糖合成基因簇。

细菌生物共轭物，例如志贺氏菌生物共轭物的生产，在具体实施方案中进行了进一步详细描述，参照图10A和10B。在使用细菌系统，例如大肠杆菌进行细菌共轭物的组装之前，有必要在该细菌系统中引入特定的基因序列，用于编码所要用的各种酶和蛋白，如之前图8A和8B中所讨论的。举例来说，这包括寡糖转移酶，优选来自空肠杆菌的(例如PglB)，蛋白载体(例如EPA)以及涉及抗原多糖合成的基因簇(例如痢疾杆菌O1多糖合成基因簇)。

图10A显示了生产细菌生物共轭物的步骤1，也就是，多糖的生物合成，例如O1血清型志贺氏痢疾杆菌的O-抗原。此步骤中，抗原是在脂载体十一异戊二烯焦磷酸(UPP)上合成，然后经翻转酶转移至细胞周质中。抗原经聚合酶Wzy聚合后被连接酶WaaL转移至脂质体A核心。为了将多糖转移至蛋白载体上，连接酶被寡糖转移酶PglB所替换。

细菌生物共轭物生产的步骤2包括设计一个合适的蛋白载体。优选的蛋白载体应该含有特定的免疫学和药理学特征。从免疫学角度来说，优选的，蛋白载体应该：(1)含有T-细胞抗原表位；(2)能够在免疫系统中将抗原输送至抗原呈递细胞(APCs)；(3)高效耐用；以及(4)能够产生抗原-特异的系统IgG响应。从药理学角度来说，优选的，蛋白载体应该：(1)无毒；且(2)能够有效地输送抗原横跨完整上皮屏障。更有选的是，除了这些免疫学和药理学特征，适合于生产细菌生物共轭物的蛋白载体还应该：(1)易于分泌到周质空间；以及(2)含有易于引入环形或线性序列的抗原表位。

发明者发现，基因脱毒的绿脓杆菌外毒素(EPA)以及空肠杆菌AcrA蛋白适合于作为蛋白载体，最优选EPA。AcrA含有天然的糖基化位点而EPA需要修饰来编码糖基化位点。优选的，EPA被修饰成引入两个针对于志贺氏菌O1抗原的糖基化位点。更有选的是，引入两个共识序列，如实施例10所讨论的。

在本发明具体化实施方案中，被修饰后含有两个糖基化位点的EPA的氨基酸序列，如序列表中的SEQ ID NO：6(有信号序列)和SEQ ID NO：7(无信号序列)所示。SEQ ID NO：6和SEQ IDNO：7中的糖基化位点用下划线表示。

图10B所示的是蛋白载体示意图，例如EPA，根据细菌生物共轭物生产的步骤3来设计蛋白载体上的糖基化位点。N-糖基化位点需要引入之前讨论的共识序列，也就是，插入D/E-X-N-Z-S/T序列，其中，X和Z可以为除了脯氨酸以外的任何天然氨基酸。我们已发现，这样的共识序列最好经表面循环被引入，通过插入来优化N-糖基化位点的效用，而不是突变或者考虑使用侧翼残基。

图11显示了在小鼠体内能够引起抵抗志贺氏菌O1多糖免疫反应的生物共轭物。O1-AcrA和O1-EPA经亲和柱和离子交换纯化。纯化的生物共轭物注射至小鼠(n＝10)。汇集被O1-AcrA(上)和O1-EPA(下)免疫三次(第1，21，60天)的小鼠血清，在第70天进行ELISA分析，来检测糖特异性的IgG响应。杂交板(Nunc，polysorb)涂上分离自痢疾杆菌O1的LPS，并用汇集的血清以及抗鼠的多价辣根过氧化物酶孵育。接受任一共轭物的小鼠都会显现抵抗该多糖的IgG响应，确认了T-细胞抗原表位存在于两种蛋白载体上。

因此，本发明的细菌生物共轭物显示了体内免疫原性。在具体实施方案中，细菌生物共轭物能够展示出：(1)糖物质特异性响应；以及(2)载体特异性响应或者与载体蛋白无关的类似响应。而且，IgG的特异性响应显示了该免疫响应的T-细胞依赖性，因此响应记忆是可预期的。

图12指示的是在生物反应器中生产志贺氏菌O1生物共轭物，例如O1-EPA。表达EPA、PglB和O1-多糖的大肠杆菌在反应器中经两次营养脉冲生长至OD₆₀₀＝40。诱导PglB和EPA表达后，线性流加培养基过夜培养细胞。上图显示了细胞的生长曲线。全细胞提取物经SDS-PAGE分离后，经高抗EPA的多克隆抗血清免疫检测分析EPA的表达和糖基化情况(下图)。在高细胞密度下，细胞能有效地进行EPA的糖基化。该过程重复性很好，并且最终光密度(OD)值达90，比摇瓶培养时提高了45倍。因此，使用批式补料培养进行放大是可行的。

图13列举了O1-EPA纯化的一个实施例。更明确的是，图13给出了痢疾杆菌O1生物共轭物的色谱分离纯化组分。表达O1-EPA的大肠杆菌在反应器中生长至高密度(见图12)。离心收集细胞，渗压震扰法提取细胞周质蛋白。使用阴离子交换(Source Q)分离周质蛋白。富集的O1-EPA组分经第二根色谱柱(Fluoroapatite)进一步纯化。不同组分经SDS-PAGE分离后使用考马斯亮蓝显色。1道是全细胞提取物，2道是渗压震扰后的周质蛋白，3道是阴离子交换上样前的周质蛋白，4道和5道是阴离子交换后的洗脱液，6道是经第二根柱纯化后的O1-EPA洗脱液。本过程允许大规模的进行O1-EPA的纯化。在该具体实施方案中，纯化过程是：(1)高效的(＞10mg/L)；(2)大规模可行；(3)符合药品生产质量管理规范(GMP)。经过这些纯化过程，甘油-LB批式流加培养的EPA-O1产量最高可达200mg/L，这比摇瓶培养的产量0.6mg/L要高很多。

图14A显示的是不同条件下摇瓶培养生产的AcrA-ShigellaO1的一系列样品的免疫印迹分析，这些条件包括，诱导前，诱导4小时，以及氧-限制环境诱导4小时和19小时。经过提取和纯化后，周质蛋白经SDS-PAGE分离。使用抗-AcrA抗体并通过化学发光二抗来检测分析AcrA和AcrA-Shigella O1生物共轭物。不同取样时间的样品OD₆₀₀平衡到合适的浓度。

概括的说，一方面，本发明技术已用于开发一种抵抗痢疾杆菌O1感染的疫苗。例如，在大肠杆菌中，痢疾杆菌O1的多糖可被共轭结合于EPA。这是非常有益的，因为在此之前EPA结合的不同共轭物疫苗已被成功用于临床试验。在本发明中，痢疾杆菌O1生物共轭物是在3L规模的生物反应器中生产的。细胞生长到高OD后，通过渗压震扰来提取生物共轭物。共轭物经阴离子交换和体积排阻色谱纯化后纯度可达98％。生物共轭物注射到不同的小鼠品种体内。注射二到三次后，使用来自痢疾杆菌O1的LPS进行分析，检测到抵抗多糖的糖特异性的IgG响应(图11)。如预期的一样，当注射LPS时，可以引起IgM特异响应。生物共轭物导致了特异的抵抗痢疾杆菌多糖的IgG响应。抵抗相应的化学偶联至蛋白载体糖抗原的IgG响应，已经被证实与人类的防护一致。

这些结果都强烈的显示，我们发明的大肠杆菌菌株非常适合生产抗原性细菌疫苗，例如抗原性志贺氏菌疫苗。在具体实施方案中，使用不同的方法对EPA-Shigella生物共轭物进行了深入的表征，例如核磁共振，高效液相色谱以及质谱技术。图15显示了本发明中O1血清型痢疾杆菌生物共轭物样品的1H核磁共振光谱的异头区域的展开图。生物共轭物含有的糖/蛋白比率为0.15，蛋白上连接13.2个抗原重复单元，以及1-2个糖基化位点。用于糖基化的两个共识序列被引入EPA中，大约20％的蛋白被完全糖基化。多糖通过还原性末端连接到蛋白载体上，因此，多糖的抗原表位未被修饰。另外，体内共轭结合方法只结合O-抗原重复单元到蛋白上，而并没有脂质体A核心的单糖被结合。

使用本技术，可以生产具有免疫原性的细菌生物共轭物。遗传修饰使得细菌多糖可在体内共轭结合到目的蛋白的预期位置上。例如在之前讨论的具体实施方案中，痢疾杆菌O1的抗原多糖可在大肠杆菌中表达并且可在体内与两种不同的蛋白共轭结合(即EPA和AcrA)。两种生物共轭物均在小鼠体内引起抵抗多糖的特异性IgG响应。作为另外一个实施例，下面的表1列举了适合于细菌寡糖转移酶不同的多糖底物，例如，在本发明的方法中，PglB可在体内用于将多糖和载体蛋白进行共轭结合。

表1

表2列举了本发明中可用的其他不同的LPS多糖底物，分别针对于不同的菌株，例如志贺氏菌和大肠杆菌以及绿脓杆菌O11和土拉弗朗西斯菌。

表2

举例来说，在本发明的进一步具体实施方案中，同样可开发抵抗大肠杆菌的生物共轭疫苗。大肠杆菌是一种众所周知的细菌。从遗传学和临床角度来看，对人类有重要生物学意义的大肠杆菌种类可以广泛的分为共生菌、肠内致病菌和肠外致病大肠杆菌(ExPEC)。ExPEC菌株可以为部分正常的肠内菌群，分离自11％的正常个体。它们在人体内不会造成胃肠炎，但它们的主要特征是，能够拓殖肠外位点并且引发不同器官或解剖位点的感染。它们是尿路感染(UTI)的主要原因，而且与败血症、多种腹部感染及脑膜炎相关。菌血症提高了严重败血症的风险。2001年，四万一千例死亡与肠外致病菌(ExPEC)导致的严重败血症有关。肠外致病菌对抗生素敏感；然而越来越多的耐药性菌株在医院及社会生活中逐步进化。这种微生物抗性使得肠外致病菌感染的治疗更加困难；因此，开发新的疫苗避免这些感染是一种可选策略。

在动物实验模型中，被动或主动的免疫接种抵抗荚膜、O-特异抗原和不同的外膜蛋白，可以提供保护避免系统感染，而且，免疫接种这些不同的抗原，可以保护机体抵抗表达这些毒性因子的肠外致病菌导致的尿路感染。血清型O4，O6，O14，O22，O75和O83菌株会造成75％的尿路感染。在一个具体实施方案中，本发明的新技术可用来开发包含一个抗原的单价的LPS生物共轭物(例如血清型O6，主要血清型之一)，甚至可以开发包含六个抗原的多价LPS生物共轭物。例如，编码合成ExPEC的O-抗原的各种酶的基因簇可被扩增并在志贺氏生产菌株中表达。

本发明涉及了一种高效的、高产量的生产方法，可用于经济有效的工业规模生产过程。这种新的经济有效地生产生物共轭物的生物工程方法还可用于其它的共轭物以及其他的应用方面。本发明的另一个特点是，提供了一种非常简化的细菌疫苗生产方法，具有很高的重复性，潜在的降低了失败的风险。

制造共轭疫苗的过程

现在可以构建细菌表达系统来生产有生物活性的特异生物共轭物了。例如，痢疾杆菌的O-特异性多糖共轭结合到不同的蛋白载体上，得到的生物共轭物在小鼠体内引起特异的IgG响应抵抗该多糖。在具体实施方案中，本发明技术使用一种寡糖转移酶，例如空肠杆菌的PglB蛋白，在体内结合细菌多糖(O抗原)同时表达重组蛋白载体，可产生高免疫原性的生物共轭疫苗。

已经建立一种能够用于工业规模的生产方法。这开拓了使用简单的细菌发酵开发制造众多不同的共轭疫苗的可能性。与图6A中上面的图片描述的体外共轭结合方法相比，本方法具有很多优势。由于这是一种完全体内过程，失败的成本和风险大大降低，方法更容易重复。另外，共识捕捉序列允许多糖共轭结合到特定蛋白上的特异性固定位点，因此使监管认可和质量控制更容易。最后，由于该方法过程简单，只需要生物技术手段，因此共轭疫苗的开发非常迅速。另外，体内共轭结合方法还适用于多糖结构阻止化学交联的方面。

在具体实施方案中，本发明涉及到在细菌中大规模生产重组糖基化蛋白以及决定糖基化效率的各种因子。举例来说，本发明中的重组糖基化蛋白可以通过使用摇瓶方法来生产。之前的生物共轭物主要是在LB摇瓶培养中生产。更优选的是，本发明的一方面，首次采用批式流加方式用于在细菌中生产重组糖基化蛋白。在优选的制备过程中，目的是，在保持糖基化效率和重组蛋白产量以及维持本过程简单化、重复性高的情况下，尽可能获得较高的生物浓度。

在具体实施方案中，使用典型大肠杆菌生产过程，通过开发优化制备方法，本发明的细菌生物共轭物可在商业规模上进行制备。首先，可以使用不用类型的培养策略，例如批式培养，恒化培养以及批式流加培养。第二，可以使用需要供氧的过程以及不需要供氧的过程。第三，可以通过改变诱导方式，使得系统获得最大产物产量。

已经证实，与蛋白载体的表达对比，N-连接的糖基化的程度受到条件变化的严重影响，包括营养物供应、碳源和能源的类型，供氧方式以及诱导时间等。举例来说，在批式流加发酵过程中，当诱导剂添加到批式或流加批式培养基中，会迅速的导致比生长速率降低3倍，这表明，蛋白载体以及膜结合的寡糖转移酶的合成对细胞造成了很大的代谢负担和/或压力。根据发明者的发现，诱导之后，与非糖基化形式相比，糖基化的载体蛋白存在循环阻滞现象，因此，可以认为糖基化是生物共轭物合成过程中的限速步骤。

根据以上结果，在本发明的一个具体化实施例中，开发了以下方法用于细胞培养：批式流加培养模式来获得高细胞浓度；诱导后延长培养来促进最大糖基化；在直到诱导前的生物量增长的过程中维持营养物过剩(例如LB成分酵母提取物和蛋白胨)，来给生产过程提供最够的原料供给；使用甘油作为主要碳源和能源，避免分解代谢物阻遏以及乙酸形成。这种生物过程与LB批式培养相比，产量提高了50倍，这就为使用重组大肠杆菌经济有效的生产共轭疫苗铺平了道路。在此实施例中，生产过程中使用好氧条件，例如通过富氧通气实现；然而，低氧浓度也是可行的。实施例9对此批式流加过程进行了详细阐述。然而，，请意识到，也可使用其他方法生产本发明中的细菌LPS生物共轭物。

因此，在本发明的具体实施方案中，大肠杆菌可用于体内生产糖基化蛋白，并且适用于工业化生产糖基化蛋白。

以下的实施例有助于进一步阐述本发明，但并不以任何方式限制本发明的范围。

实施例

实施例1：选择AcrA作为模式蛋白用于优化N-糖基化反应

为了优化N-糖基化所需的受体蛋白，对空肠杆菌糖蛋白AcrA(CjO367c)进行了详细研究。AcrA是含有350个氨基酸残基的细胞周质脂蛋白。已经证实，分泌到周质中而非脂锚定是糖基化反应的必须条件(Nita-Lazar et al.，2005，supra)。当在大肠杆菌中表达时，用于蛋白输出的信号肽可以为天然AcrA的信号序列或者外源的PelB的信号序列。在五种可能的λMinked糖基化序列中(N117，N123，N147，N273，N274)，两种相同的用于空肠杆菌和大肠杆菌中(N123和N273(Nita-Lazar et al.，2005，supra))。选择AcrA作为模式蛋白是因为，它是空肠杆菌中唯一的有详细结构信息的周质N-糖蛋白。最近，来自革兰氏阴性菌绿脓杆菌的MexA蛋白，AcrA的同系物的晶体结构被公开(Higgins et al.，(2004).Structure of the periplasmic component of a bacterial drug efflux pump.Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 7Of₁9994-9999)。两种蛋白都是所谓的细胞周质外排泵蛋白(PEP)(Johnson，J.M.and Church，G.M.(1999).Alignment and structure prediction of divergent protein families：periplasmic and outer membrane proteins of bacterial efflux pumps.J.Mol.Biol.287，695-715)。该细长分子包含三个线性排列的子区域：一个α-螺旋，一个通过硫辛酸结合结构域连接在底部的反向平行螺旋，然后紧跟着一个六链β桶区域。晶体中，N-端的23-28残基和C-端的95-101残基是松散结构。MexA和AcrA蛋白序列有29.3％的同一性和50％的相似性。因此，两种蛋白的整体折叠很可能非常相似。

实施例2引发糖基化反应的基本多肽序列的说明

已经证实，与绿脓杆菌的MexA蛋白相似的硫辛酸结合结构域，相应的存在于空肠杆菌的AcrA蛋白中形成一个紧密蛋白，可以在大肠杆菌中分别表达(Berg，A.，and de Kok，A.(1997).2-Oxo acid dehydrogenase multienzyme complexes.The central role of the lipoyl domain.Biol.Chem.378，617-634)。为了检测在大肠杆菌中，经pgl机制N-糖基化反应需要哪种受体多肽，选择了AcrA的硫辛酸结合结构域。它可作为一种分子支架，转移不同长度的多肽到细胞周质中进行体内pgl机制反应。

因此，构建了一种编码硫辛酸结合结构域(Lip)的质粒，在N-末端融合了OmpA的信号序列(Choi，J.H.，and Lee，S.Y.(2004).Secretory and extracellular production of recombinant proteins using Escherichia coli.Appl Microbiol Biotechnol 64，625-635)，C-末端融合了6个组氨酸标签。所得克隆在阿拉伯糖启动子控制下进行基因表达。对于硫辛酸结合结构域边缘位置来说，选择出现在MexA蛋白中硫辛酸结合结构域边缘的相同位置的氨基酸。为了检测不同多肽接受N-糖链的能力，序列的延伸部分插入到硫辛酸结合结构域的两个锤头状部位中间。延伸部分由包含空肠杆菌AcrA蛋白N-糖基化位点N123的序列组成。产生的开发阅读框架由以下部分组成，编码OmpA信号肽的序列，AcrA的N-末端锤头状部分(D60-D95，氨基酸的编号指的是AcrA成熟肽的序列编号)，包含AcrA自身N123糖基化位点的不同延伸片段(见下面)，AcrA-硫辛酸结合结构域的C-末端锤头状部分(L167-D210)以及C-末端的组氨酸标签。

使用标准分子生物学技术构建质粒。三种不同长度的包含AcrA蛋白自身N123糖基化位点的延伸片段插入到硫辛酸结合结构域的两半中间，产生了三种不同的开放阅读框架：

重组子A含有A118-S130，产生的蛋白序列为：

MKKTAIAIAVALAGFATVAQADVIIKPQVSGVIVNKLFKAGDKVKKGQTLFIIEQDQASKDFNRSKALFSQLDHTEIKAPFDGTIGDALVNIGDYVSASTTELVRVTNLNPIYADGSHHHHHH(SEQID NO：8)。

重组子B含有F122-E138，产生的蛋白序列为：

MKKTAIAIAVALAGFATVAQADVIIKPQVSGVIVNKLFKAGDKVKKGQTLFIIEQDQFNRSKALFSQSAISQKELDHTEIKAPFDGTIGDALVNIGDYVSASTTELVRVTNLNPIYADGSHHHHHH(SEQ ID NO：9)。

重组子C含有D121-A127，产生的蛋白序列为：

MKKTAIAIAVALAGFATVAQADVIIKPQVSGVIVNKLFKAGDKVKKGQTLFIIEQDQDFNRSKALDHTEIKAPFDGTIGDALVNIGDYVSASTTELVRVTNLNPIYADGSHHHHHH(SEQ ID NO：10)

带下划线的延伸片段指的是OmpA信号肽，引入单个的下划线残基是由于克隆的原因或者使蛋白免受降解。黑体：对应于AcrA蛋白的N123糖基化位点。斜体：6个组氨酸标签。相应的基因在质粒pEC415骨架上的阿拉伯糖启动子控制下表达(Schulz，H.，Hennecke，H.，and Thony-Meyer，L.(1998).Prototype of a heme chaperone essential for cytochromec maturation.Science 281，1197-1200)。

为了检测三个延伸片段中是哪一个引发Lip蛋白的糖基化反应，进行了蛋白表达实验。大肠杆菌Top 10(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)携带pACYCpgl或pACYCpglmut(Wacker et al.，2002，supra)以及编码重组子A、B或C中的一个质粒，在含有氨苄青霉素和氯霉素的LB培养基中37℃生长至OD值达0.5。加入1/1000体积的20％阿拉伯糖(w/v)进行诱导，继续培养细胞2小时。离心收集细胞，重悬于含有20mM Tris/HCl、pH 8.5、20％蔗糖(w/v)、1mM EDTA、1mM PMSF以及1g/l溶菌酶的缓冲液中，4℃温浴1小时。除去未破碎的细胞后，将周质提取物用1/9体积的10×缓冲液A稀释(3M NaCl，0.5M Tris/HCl，pH 8.0，0.1M咪唑)，添加MgSO₄至2.5mM。在Amersham Pharmacia Biotech(Uppsala，Sweden)的1ml Ni-葡聚糖层析柱上进行镍离子亲和层析。使用含有0.25mM的缓冲液A洗脱蛋白质。

图1显示的是周质提取物经镍离子亲和层析纯化后，洗脱峰组分的考马斯亮蓝染色SDS-PAGE凝胶。表达分析结果显示，重组子B产生了单种突出蛋白(图1，1道)。重组子A和C除了突出蛋白外，都还产生了迁移率较低的第二条蛋白条带(图12，3道)。经MALDI-TOF/TOF检测，较重的蛋白确实被糖基化了(结果未列)。重组子B中没有而A和C中存在的唯一的氨基酸是D121，天冬氨酸残基，与糖基化N123位点N-末端方向隔2个位置。这表明，D121对于寡糖转移酶糖基化反应来说非常重要。为了确认D121是糖基化反应必须的，在重组子C中将其突变为丙氨酸。表达分析结果只有一条蛋白条带(图1，4道)，这就说明了D121对于糖基化反应的重要性。更进一步，人工多肽展示蛋白被糖基化的事实表明，D/E-X-N-Y-S/T类型的短肽包含了空肠杆菌发生N-糖基化反应的所有信息。

实施例3：确认实施例2；AcrA-D121A没有在N123处糖基化

为了确认多肽显示方式的结果，在可溶性的全长AcrA蛋白中，将121位置上的天冬氨酸突变为丙氨酸(D121A，即糖基化N123位点两个残基前)，检测在大肠杆菌中位点N123是否还能被糖基化。表达AcrA-D121A并对其糖基化状态进行了分析。使用改造的AcrA进行分析。这与原始的空肠杆菌基因有所不同，它含有PelB信号肽序列用来分泌至周质中(Choi and Lee，2004，supra)，并且在C-末端含有6个组氨酸标签便于纯化。已经证实，该AcrA突变体和脂固定的天然蛋白一样，进行了分泌、信号肽切除以及糖基化(Nita-Lazar et al.，2005，supra)。以下是该可溶性AcrA蛋白的氨基酸序列：

MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAMHMSKEEAPKIQMPPQPVTTMSAKSEDLPLS/TYPAKLVSDYDVIIKPQVSGVIVNKLFKAGDKVKKGQTLFIIEQDKFKASVDSAYGQALMAKATFENASKDFNRSKALFSKSAISQKEYDSSLATFNNSKASLASARAQLANARIDLDHTEIKAPFDGTIGDALVNIGDYVSASTTELVRVTNLNPIYADFFISDTDKLNLVRNTQSGKWDLDSIHANLNLNGETVQGKLYFIDSVIDANSGTVKAKABFDNNNSTLLPGAFATITSEGFIQKNGFKVPQIGVKQDQNDVYVLLVKNGKVEKSSVHISYQNNEYAIIDKGLQNGDKIILDNFKKIQVGSEVKEIGAQLEHHHHHH(SEQID NO：11)

下划线残基为PelB信号肽，斜体是组氨酸标签，黑体是连个天然糖基化位点N123和N273。含有质粒pEC415(Schulz et al.，1998)中的编码以上蛋白开放式阅读框架的质粒被构建用于生产pAcrAper。

用于检测AcrA和相应突变体(见下面)的糖基化状态的分析方法如下：大肠杆菌CLM24细胞(Feldman et al.，2005，supra)含有质粒骨架上的活性或非活性形式的pgl操纵子(pACYCpgl或pACYCpglmut，见(Wacker et al.，2002，supra))，以及编码AcrA(pAcrAper)的质粒，生长至对数期，使用0.02％的阿拉伯糖进行诱导。诱导4小时候，使用之前所述的方法制备细胞周质提取物，进行SDS-PAGE分析，电转移至膜上，使用抗-AcrA血清或者R12抗血清进行免疫检测。后者对空肠杆菌含有N-糖链的蛋白具有特异性(Wacker et al.，2002，supra)。

图2的前两道显示的是含有和缺失功能性pgl操纵子时AcrA的表达情况。当缺失功能性pgl操纵子时，只有一条带，而含有功能性pgl操纵子时，有三条带(图2A，上图)。这些条带分别对应的是非糖基化AcrA蛋白(1道)以及非糖基化、单糖基化、双糖基化AcrA蛋白(2道)。通过R12免疫印迹杂交确定2道中的两条较重的蛋白为糖基化蛋白(2道，下图)。当突变体AcrA-N273Q以相同的方式表达，存在功能性pgl操纵子时，只检测到单糖基化AcrA(3道)。缺失功能性pgl操纵子时，检测到非糖基化AcrA(4道)。突变体AcrA-D121A的分析结果只有两条带，其中之一被糖基化(5道)，如同3道中的AcrA-N273Q这就表明，对于123-125位置上的有效糖基化，D121是必须的。

实施例4：在AcrA中引入人工糖基化位点

为了检测引入天冬氨酸残基是否能够产生一个糖基化位点，构建了AcrA突变体，可溶性AcrA中非糖基化作用位点N117和N147之前-2位置的残基替换为天冬氨酸(F115D，T145D)。然后使用实施例2中描述的同样分析方法，检测被修饰的糖基化位点是否能被糖基化。两种突变分别插入到可溶性AcrA的野生型序列中，或者插入到两个可用糖基化位点(N123Q和N273Q)已被剔除的双突变体中。诱导4小时后，制备细胞周质提取物，经SDS-PAGE分离，进行免疫印迹杂交分析(图2B)。在同一块凝胶上，以野生型糖基化AcrA和非糖基化AcrA样品作为对照(1，2道)。T145D突变影响了天然非糖基化作用序列N147-S149的-2位置。AcrA-T145D表达后的抗AcrA血清免疫印迹分析结果有四条带，其中最深条带的电泳迁移率比2道中的双糖基化蛋白要低(图2B中3道)。R12杂交确认第四条带为三糖基化的AcrA。尽管最重的蛋白条带对于抗AcrA血清的信号强度较低，但却对糖基化特异的R12抗血清有最强的信号。当在天然N-糖基化序列(AcrA-N123Q-N273Q-T145D)缺失的情况下表达同样的突变体AcrA-T145D时，存在功能性pgl操纵子的情况下只检测到单糖基化AcrA(图2B，4道)，而缺失功能性pgl操纵子的情况下则看不到(5道)。这就表明，4道中较重的条带是被糖基化了的。因此，通过简单的引入T145D突变，产生了一个最优化的糖基化位点(DFNNS)。

为了进一步确认通过在-2位置插入天冬氨酸残基有可能引入糖基化位点，将天然非作用位点N117-S119和N274-T276改变成为最优化的N-糖基化位点。因此进一步构建了突变体(图2C)。使用之前描述的体系表达AcrA-F115D-T145D后，经抗AcrA抗血清检测，产生了五种蛋白(2道)。这就表示，在同一个AcrA分子中发生了四种糖基化。当使用空肠杆菌N糖链特异性R12抗血清检测时，出现了五条条带。最小的微弱条带是非糖基化AcrA，因为当无糖基化作用时，它也是存在的(1道)，最大的条带产生了最强的信号，可能是由于四重糖基化的AcrA具有五个抗原决定簇。因此，两个引入位点(N117和N147)以及两个天然作用位点(N123和N273)都经pgl机制，发生了糖基化反应。pgl机制存在与否的情况下，AcrA-N123Q-N273Q-N272D的表达结果证明了，第三个人工引入的糖基化位点N274(DNNST)，同样可被pgl操纵子所识别(图2C，3，4道)。

以上的实验确定了如下结论，被空肠杆菌寡糖转移酶识别的细菌N-糖基化位点由部分与真核细胞相同的共识序列(N-X-S/T，X≠P)组成，但除此之外，需要-2位置上的天冬氨酸来提高糖基化效率。而且，这些也证明了，通过重组手段引入如此一段最优共识序列，在蛋白的预期位点上进行糖基化反应是可能的。

实施例5：最优N-糖基化序列-1位置的确认

进一步的实验用来检验细菌糖基化位点的-1位置是否表现出与真核细胞+1位置同样的约束作用(Imperiali，B.，and Shannon，K.L.(1991).Differences between Asn-Xaa-Thr-containing peptides：a comparison of solution conformation and substrate behaviour with oligosaccharyl-transferase.Biochemistry 30，4374-4380；Rudd，P.M.，and Dwek，R.A.(1997).Glycosylation：heterogeneity and the3D structure of proteins.Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.32，1-100)。+1位置上的脯氨酸残基被认为是以限制糖基化的方式来约束多肽的。为了检验-1位置是否存在相似的作用，在第二个天然位点已被敲除的点突变体中，第一个天然作用位点处引入一个脯氨酸残基(AcrA-N273Q-F122P)。对照实验AcrA-N273Q的表达结果显示，在存在功能性Pgl操纵子的情况下，有一个单糖基化蛋白表达(图2D，1，2道)。然而，AcrA-N273Q-F122P并没有被糖基化(图2D，3，4道)。这就表明，当脯氨酸残基位于天冬酰胺和-2位置带负电的残基中间时，它会限制细菌的N-糖基化反应。

能被空肠杆菌pgl机制糖基化的所有已知位点的序列比对结果表明，他们均在-2位置含有D或E残基(Nita-Lazar et al.，2005，supra；Wacker et al.，2002，supra；Young et al.，(2002).Structure of the N-linked glycan present on multiple glycoproteins in the Gram-negative bacterium，Campylobacter jejuni.J.Biol.Chem.277，42530-42539)。因此可以确定，细菌的糖基化共识序列可通过-2位置的带负电氨基酸被优化，最终形成了D/E-X-N-Z-S/T，其中X和Z不能是脯氨酸。

实施例6：非-空肠杆菌蛋白的N-糖基化

为了证明基本所需序列(最优共识序列)对于细菌的N-糖基化反应是足够的，因此检验了通过使用上述策略能否将非-空肠杆菌蛋白进行N-糖基化。以霍乱毒素B亚基(CtxB)作为糖基化目标。从霍乱弧菌中扩增相应的基因，通过所述的方法使得其在N-端包含OmpA信号肽序列，C-端包含六个组氨酸标签，如同实施例1中的重组子A到C的方法。得到的DNA克隆至实施例1所用的质粒中，替换掉重组子A。W88到D点突变或者在W88后插入D产生了最优糖基化位点(DNNKT)。在含有或者缺失空肠杆菌功能性pgl操纵子的大肠杆菌Top 10以及其他细胞型中表达含有信号肽和组氨酸标签的野生型及W88D突变的CtxB蛋白。当使用SDS-PAGE，电转印以及CtxB抗血清连续免疫印迹分析Top 10细胞的周质提取物时，只有CtxB W88D在pgl基因簇背景下，产生了一个较大的糖基化条带(图2E，对比道3，4)。同样在CtxB中插入共识序列(DSNIT)替换CtxB的G54或者Q56(后者以CtxB-Q56/DSNIT表示)，即有助于CtxB神经节苷脂GM1结合活性的位置。图2E的5，6道结果证明，当使用之前描述的同样方式进行分析时，重组蛋白(以Top 10细胞表达的重组子为例，该重组子含有替代了Q56的多肽序列DSNIT)在有糖基化能力而不是糖基化缺陷型的细胞中产生了较低迁移率的糖基化条带。结果也证明，包含两种操作的CtxB蛋白，即在W88后插入D以及DSNIT替代Q56，在SCM7细胞中被双-糖基化(图E，7，8道)(Alaimo et al.，EMBO Journal 25：967-976(2006))。第7道所示的双-糖基化蛋白CtxB为Ni²⁺经离子亲和纯化，并使用标准方法，进行了胶内胰蛋白酶消化后ESI-MS/MS分析。预期的糖多肽经检测证明，通过突变或插入本发明中用于细菌N-糖基化的最优共识序列，细菌N-糖基化反应同样可在非-空肠杆菌蛋白中发生(结果未附)。其他可用于实践本发明的合适的大肠杆菌典型菌株为W3110，CLM24，BL21(Stratagene，La Jolla，CA，USA)，SCM6以及SCM7。

这里所用的CtxB蛋白的氨基酸序列如下所示(下划线部分为重组OmpA信号肽序列，斜体部分为6个组氨酸标签，黑体为W88)：

MKKTAIAIAVALAGFATVAQATPQNITDLCAEYHNTQIHTLNDKIFSYTESLAGKREMAIITFKNGATFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRIAYLTEAKVEKLCVWNNKTPHAIAAISMANGSHHHHHH(SEQ ID NO：12)。

实施例7：在空肠杆菌外膜蛋白OmpH1中引入人工N-糖基化位点

细菌N-糖基化的潜在应用是，将糖链展示于细菌宿主细胞表面，目的是将表现性和基因型连接起来，从而筛选特异的遗传突变。为了证明N-糖链能够存在于外膜蛋白上，以一种方式重构了OmpH1蛋白，其中包含多个本发明所述的最优共识位点。根据已知OmpH1的晶体结构，在蛋白的弯曲部位引入了这些位点(Muller，A.，Thomas，G.H.，Horler，R.，Brannigan，J.A.，Blagova，E.，Levdikov，V.M.，Fogg，M.J.，Wilson，K.S.，and Wilkinson，A.J.2005.An ATP-binding cassette-type cysteine transporter in Campylobacter jejuni inferred from the structure of an extracytoplasmic solute receptor protein.Mol.Microbiol.57：143-155)。之前的实验表明，最佳的糖基化区域由以下突变产生：V83T，K59N-G60I-N61T，R190N-G191I-D192T以及H263D-F264S-G265N-D266I-D267T。对于表面展示，需要评价这些引入位点的不同组合，从而建立最佳的N-糖链特异样品。在编码野生型OmpH1的质粒中构建这些组合，并以AcrA中所描述的类似方式进行检测。图3显示了含有除已有野生型序列外的多个糖基化序列的不同OmpH1变异体的分析结果。产生了含有3个(3，4，5，7道)及4个糖基化序列(6道)的OmpH1变异体。实验中还包括只有一个糖基化序列的野生型OmpH1以及缺失了糖基化所必需的天冬酰胺残基的突变体。这里检测的所有的变异体不仅证明了高效的糖基化效率，而且证明了每个糖基化序列都被利用。使用空肠杆菌N-糖链特异性免疫血清确认了以上结果(图3，下图片)。

以下是含有myc标签(斜体)的空肠杆菌OmpH1蛋白的氨基酸序列：

MKKILLSVLTTFVAVVLAACGGNSDSKTLNSLDKIKQNGWRIGVFGDKPPFGYVDEKGMMQGYDIALAKRIAKELFGDENKVQFVLVEAANRVEFLKSNKVDIILANFTQTPERAEQVDFCLPYMKVALGVAVPKDSNITSVEDLKDKTLLLNKGTTADAYFTQDYPNIKTLKYDQNTETFAALMDKRGDALSHDNTLLFAWVKDHPDFKMGIKELGNKDVIAPAVKKGDKELKEFIDNLIIKLGQEQFFHKAYDETLKAHFGDDVKADDWIEGGKILEQKL/SEEDL(SEQID NO：13)。

黑体为蛋白中的天然糖基化位点，下划线为信号肽序列。

实施例8：空肠杆菌N-糖链表面展示于大肠杆菌细胞外膜的 OmpH上

为了回答多重糖基化OmpH1突变体是否能够展示于细菌的细胞表面这个问题，对表达不同OmpH1变异体的细菌CLM24或SCM6细胞(SCM7ΔwaaL)进行了免疫荧光实验。实验中还包括野生型OmpH1以及缺失了糖基化所必需的天冬酰胺残基的突变体。另外，为了在周质中蛋白保留，构建了C20S突变体，作为实验的对照。经多聚甲醛处理后的细胞进行免疫染色。多聚甲醛使细胞固定但不破坏细胞结构或间隔化。使用c-Myc和N-糖链特异性免疫血清及相应的结合于FITC和Cy3的二抗组合分别检测细胞表面的蛋白(红色荧光)和N-糖链(绿色荧光)。另外，使用4，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI，蓝色)对细菌DNA染色，用于明确区分细菌细胞和细胞碎片。当表达野生型OmpH1的细胞染色后，检测了蛋白特异性以及N-糖链特异性的免疫荧光(图4A)。当缺失糖基化所必需的天冬酰胺残基的突变体N139S被抗-Myc和N-糖链特异免疫血清共同染色后，只得到蛋白信号而没有糖链特异性信号(图片4B)，表明了N-糖链特异免疫血清的特异性。当将蛋白保留在周质中，如C20S突变体，就检测不到蛋白特异的红色免疫荧光，表明了抗体不会扩散至细胞中，因此足以检测任何表面现象(图4C)。然后，将表达多重不同糖基化的OmpH1变异体细胞进行染色：OmpH1^{KGN→NIT，HFGDD→DSNIT}(图片4D)，OmpH1^{RGD→NIT，HFGDD→DSNIT}(图片4E)，OmpH1^KGN→NIT， ^RGD→NIT(图片4F)，OmpH1^{V83T，KGN→NIT}(图片4G)及OmpH1^KGN→NIT， ^{RGD→NIT，HFGDD→DSNIT}(图片4H)。所有的OmpH1变异体都被双重染色，表明糖基化蛋白存在于细胞表面。图4用灰色标尺表示，第一列为同行其他图片的合并。

图4显示了表达不同OmpH1变异体的细胞的荧光显微镜照片。含有表达野生型OmpH1及其变异体的大肠杆菌CLM24和SCM6细胞培养物的OD₆₀₀平衡至0.25/ml。使用pH7.4的磷酸缓冲盐(PBS)清洗细胞两次，100μl细胞悬浮液点到涂胶玻璃片上，放入增湿箱中室温温育30分钟。全细胞免疫荧光标记实验所有的后续步骤都在室温增湿箱中进行。除掉非结合细胞后，剩余细胞在室温下使用含有PBS的4％多聚甲醛温育30分钟。重要的是，多聚甲醛不是渗入细胞而是通过完整的膜保持分隔化。用PBS洗涤固定的细胞两次，重悬的封闭缓冲液在PBS中含有5％的牛血清白蛋白。封闭后，在100μl含有5％BSA的PBS缓冲液中用抗-myc单克隆鼠IgG(1∶50，Calbiochem)和/或抗-糖链抗血清(1∶4000)孵育1小时。使用100μl PBS洗涤细胞三次，每次5分钟，然后在100μl含有5％BSA的PBS缓冲液中使用结合于FIFC的第二抗-兔抗体(1∶250，Jackson Immunoresearch Laboratories)和/或结合于Cy3的抗-鼠抗体(1∶250，Jackson Immunoresearch Laboratories)孵育1小时。如果需要，在二抗孵育时加入4，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)(Sigma)(0.5μg/ml)对细菌DNA染色。将二抗从细胞PBS₁中冲洗掉，使用vectashield安放保护介质(Vector Laboratories)将盖玻片置于载片上，并用指甲油密封。用Axioplan2显微镜(Carl Zeiss)进行荧光显微照相并用Adobe Photoshop CS2版合并图像。SCM6细胞表达OmpH1(图片A)，OmpH1N^139S(图片B)，OmpH1^C20S(图片C)，OmpH1^{KGN→NIT，HFGDD→DSNIT}(图片D)，OmpH1^RGD→NIT， ^{HFGDD→DSNIT}(图片E)，OmpH1^{KGN→NIT，RGD→NIT}(图片F)，OmpH1^V83T， ^KGN→NIT(图片G)及OmpH1^{KGN→NIT，RGD→NIT，HFGDD→DSNIT}(图片H)。第一列是2，3，4列的合并图片，以黑色背景下的灰色调表示。第二列：DAPI染色，灰色调中蓝色荧光，第三列：来自于糖链特异性的绿色荧光，第四列：来自于抗-myc染色的红色荧光。

实施例9：志贺氏菌O1LPS生物共轭物的生产过程实例

这是生产过程的一个实施例；然而，不同的条件同样可产生相似的产物。

A.生产过程

使用含有三种质粒的大肠杆菌W3110ΔwaaL来生产LPS生物共轭物，这三种质粒分别表达PglB，EPA以及用于生物合成志贺氏菌O1多糖的酶。单菌落接种至50ml LB培养基中，37℃过夜培养。培养物接种于盛有1L培养基的21反应器中。反应器搅拌转速500rpm，通过自动控制流加2M的KOH或20％的磷酸将发酵pH维持在7.0，培养温度设为37℃。溶氧水平(pO₂)维持在0到10％之间。在含有卡那霉素的半精制甘油培养基中培养细胞至OD₆₀₀＝15。培养基含有以下组分：330mM甘油，10g酵母提取物，20g蛋白胨，34mM K₂HPO₄，22mM KH₂PO₄，38mM(NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄·7H₂O以及5mM柠檬酸。经过大约5小时的初始培养期，加入第一次营养脉冲维持生物量快速生长(甘油，蛋白胨和酵母提取物)。再过1.5小时培养液达到OD₆₀₀＝30。在此时加入第二次营养脉冲甘油和蛋白胨，同时加入所需的诱导剂1％的L-阿拉伯糖和1mM的IPTG。为了维持最大的诱导水平以及进一步提供重组蛋白合成所需的氨基酸，随着这次脉冲，开始线性流加营养液/诱导剂(28.8ml/h)。流加一直维持到过程结束。总计培养约24小时后，收集培养液，此时培养液OD₆₀₀应达到±80。

使用之前描述的免疫印迹方法分析生产过程(Wacker，M.，et al.，N-linked glycosylation in Campylobacter jujuni and its functional transfer into E.coli.Science，2002.298(5599)：p.1790-3.)。样品转印到硝酸纤维素膜上后，使用特异的抗-EPA进行免疫染色(Wacker，M.，et al.，N-linked glycosylation in Campylobacter jujuni and its functional transfer into E.coli.Science，2002.298(5599)：p.1790-3.)。采用抗-兔IgG-HRP(Biorad)作为二抗。使用ECL^TM免疫印迹检测试剂(Amersham Biosciences，Little Chalfont Buchinghamshire)进行检测。

图16A显示的是来自于批式流加过程的志贺氏菌O1LPS生物共轭物(即EPA-O1)的蛋白提取物，生物量浓度平衡至0.1OD₆₀₀细胞/道。蛋白经SDS-PAGE分离后转印至硝酸纤维素膜上，使用兔抗EPA抗体进行显色。PglB及EPA表达的诱导时间为1小时和过夜。

B.周质蛋白提取

10000g离心20分钟收集细胞，重悬于同体积的0.9％NaCl溶液中。7000g离心25-30分钟沉淀细胞，重悬于悬浮缓冲液(25％蔗糖，100mM EDTA，200mM Tris HCl，pH8.5，250OD/ml)中，悬浮液在4-8℃下搅拌30分钟。4-8℃下7000-10000g离心30分钟。除去上清液后，细胞重悬于同体积冰冷的20mM Tris HCl，pH8.5缓冲液中，在4-8℃下搅拌30分钟。破细胞在4-8℃下10000g离心25-30分钟，收集上清液并使用0.2μm膜过滤。

如图16B所示，周质提取物上样于7.5％的SDS-PAGE，使用考马斯亮蓝染色鉴定EPA和EPA-O1。EPA为70kDa左右的粗条带。O1-EPA(即EPA-O1)位于100-170kDa之间。

C.生物共轭物纯化

含有来自100,000OD细胞周质蛋白的上清液上样于经缓冲液A(20mM Tris HCl，pH8.0)平衡的Source Q阴离子交换柱(XK26/40≈180ml柱床材料)中。经5倍柱体积(CV)缓冲液A洗涤后，使用线性梯度至50％的15倍柱体积缓冲液B(20mM Tris HCl+1M NaCl，pH8.0)以及2倍柱体积至100％的缓冲液B洗脱蛋白。SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色分析蛋白。含有O1-EPA的组分汇集到一起。通常生物共轭物洗脱至电导率为6-17mS。样品浓缩10被后将缓冲液更换为20mM Tris HCl，pH8.0。

如图17A所示，来自于1.Source Q柱的蛋白组分使用SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色分析。将包含生物共轭物的C1到G9组分汇集到一起。

将O1-生物共轭物再次上样至经缓冲液A(20mM Tris HCl，pH8.0)平衡的Source Q阴离子交换柱(XK 26/40≈28ml柱床材料)中。使用之前所用的同样梯度来洗脱生物共轭物。SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色分析蛋白。含有O1-EPA的组分汇集到一起。通常生物共轭物洗脱至电导率为6-17mS。样品浓缩10被后将缓冲液更换为20mM Tris HCl，pH8.0。

如图17B所示，来自于2.Source Q柱的蛋白组分使用SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色分析。将包含生物共轭物的A11到B3组分汇集到一起。

将O 1-生物共轭物上样至经缓冲液20mM Tris HCl，pH8.0平衡的Superdex 200柱(Hi Load 26/60，制备级)中。

如图18A所示，来自于Superdex 200柱的蛋白组分使用SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色分析。F1到F11组分汇集到一起。

如图18B所示，来自于不同纯化步骤的志贺氏菌生物共轭物使用SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色分析。使用该过程纯化后，O1-EPA的纯度达到98％以上，这就表明，使用本技术可以成功生产O1-EPA生物共轭物。

实施例10：构建绿脓杆菌外毒素A用于抗原糖类糖基化

绿脓杆菌外毒素(EPA)是一个67kDa的胞外分泌蛋白，其成熟肽编码613个成熟氨基酸，包含四个二硫键桥(C11-C15，C197-C214，C265-C287，C372-C379)。为了能在大肠杆菌中进行糖基化，蛋白必须定位于周质空间中。因此，将来源于大肠杆菌DsbA蛋白的信号肽基因融合至成熟EPA序列的N-末端。来自pEC415的衍生质粒[Schulz，H.，Hennecke，H.，and Thony-M eyer，L.，Prototype of a heme chaperone essential for cytochro me c maturation，Science，281，1197-1200，1998]含有DsbA信号肽密码，其后跟着一个核酸酶序列，将质粒酶切消化(Nde I至EcoR I)，保留DsbA信号肽去掉核酸酶插入片段。使用PCR扩增EPA基因(正向引物为5’-AAGCTAGCGCCGCCGAGGAAGCCTTCGACC(SEQ ID NO：14)，反向引物为5’-AAGAATTCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTTCAGGTCCTCGCGCGGCGG(SEQ ID NO：15))，用Nde I/EcoR I消化后连接至载体中替换之前去掉的核酸酶片段。产生的重组子(pGVXN69)编码的蛋白产物含有DsbA信号肽，EPA成熟序列以及6-组氨酸标签。根据[Lukac，M.，Pier，G.B.，and Collier，R.J.，Toxoid of Pseudononas aeruginosa exotoxin A generated by deletion of an active-site residue，Infect Immun，56，3095-3098，1988]和[Ho，M.M.，et al.，Preclinical laboratory evaluation of a bivalent Staphylococcus aureus saccharide-exotoxin A protein conjugate vaccine，Hum Vaccin，2，89-98，2006]的方法，使用快速突变试剂盒(Stratagene)以及磷酸化寡核苷酸5’-GAAGGCGGGCGCGTGACCATTCTCGGC(SEQ ID NO：16)和5’-GCCGAGAATGGTCACGCGCCCGCCTTC(SEQ ID NO：17)突变/删除催化必需残基L552VΔE553进行脱毒，产生重组子pGVXN70。已经证实，在蛋白的合适位点插入D/E-Z-N-X-S/T类型的五肽序列可以导致糖基化反应。为了在大肠杆菌中糖基化EPA蛋白，根据以下描述，在之前构建的重组子中插入两种不同的糖基化位点。

为了在375位置插入一个位点，进行了两步操作。首先，以pGVXN70为模板，使用引物5’-CCTGACCTGCCCCGGGGAATGCGCGG(SEQ ID NO：18)和5’-CCGCGCATTCCCCGGGGCAGGTCAGG(SEQ ID NO：19)进行快速突变，通过删除三个残基产生的重组子在EPA蛋白序列的375氨基酸位置含有一个单独的Sma I位点，然而却保持了启始蛋白序列的完整性。在第二步中，插入片段由两个互补的磷酸化寡核酸序列组成，用于编码：(i)之前删掉的残基(当插入Sma I位点时)，(ii)五肽糖基化序列及(iii)共识序列侧边用于优化糖基化效率的额外赖氨酸残基，片段连接到此Sma I位点中(5’-GTCGCCAAAGATCAAAATAGAACTAAA(SEQ ID NO：20)以及5’-TTTACTTCTATTTTGATCTTTGGCGAC(SEQ ID NO：21))。产生的重组子为pGVXN137。

为了在重组子的240氨基酸位置处再插入一个额外的糖基化位点，利用快速突变对重组子pGVXN137进行了一步操作，使用的寡核苷酸为5’-CATGACCTGGACATCAAGGATAATAATAATTCTACTCCCACGGTCATCAGTCATC(SEQ ID NO：22)和5’-GATGACTGATGACCGTGGGAGTAGAATTATTATTATCCTTGATGTCCAGGTCATG(SEQ ID NO：23)。因此产生的重组子与野生型EPA蛋白相比，具有多样的变化：两个糖基化位点，DsbA信号肽，脱毒突变。

尽管利用文献及有关的具体实例对本发明进行了详细的说明和描述，本领域的技术人员应该理解，在不背离本发明权利要求所包含范围的情况下，可以进行形式和细节上的多方面改变。进一步，在说明书中标注特异核苷酸或氨基酸序列的任何实例中，可以理解，本发明包括任何与所注明序列含有相似功能的同源序列。优选的是，这些序列至少具有85％的同源性。更优选的是，这些序列至少具有90％的同源性。最优选的是，这些序列具有至少95％的同源性。

Claims

1.一种生物共轭疫苗，包括：

一种蛋白载体，包含插入的共识序列，D/E-X-N-Z-S/T，其中X和Z可以为除脯氨酸外的任何天然氨基酸；

来源于至少一种细菌的至少一种抗原多糖，链接于蛋白载体上，其中，至少一种抗原多糖是至少一种细菌性O-抗原，这些抗原来自于志贺氏菌、大肠杆菌以及绿脓杆菌其中的一种或多种；并且任选一种佐剂。

2.根据权利要求1的生物共轭疫苗，其中蛋白载体是一种被修饰的绿脓杆菌外毒素(EPA)，含有至少一个共识序列。

3.根据权利要求2的生物共轭疫苗，其中EPA含有两个共识序列。

4.根据权利要求1的生物共轭疫苗，其中，至少一种细菌性O-抗原来源于志贺氏痢疾杆菌O1。

5.根据权利要求1的生物共轭疫苗，其中至少一种细菌性O-抗原来源于肠外致病大肠杆菌(ExPEC)。

6.根据权利要求2的生物共轭疫苗，其中被修饰的EPA含有SEQ ID NO：7所提供的序列。

7.根据权利要求1的生物共轭疫苗，其中至少一种细菌性O-抗原来源于志贺式痢疾杆菌O1，福氏志贺氏菌2a、福氏志贺氏菌3a、福氏志贺氏菌3b、福氏志贺氏菌6、宋内氏志贺氏菌中的一种或多种。

8.根据权利要求1的生物共轭疫苗，其中至少一种细菌性O-抗原来源于大肠杆菌O4：K52(ExPEC)，大肠杆菌O4：K6(ExPEC)，大肠杆菌O6：K2(ExPEC)，大肠杆菌O6：K54(ExPEC)，大肠杆菌O22(ExPEC)，大肠杆菌O75(ExPEC)，大肠杆菌O83(ExPEC)，大肠杆菌O7，大肠杆菌O9，大肠杆菌O16，大肠杆菌O121，大肠杆菌O157(EHEC)中的一种或多种。

9.根据权利要求1的生物共轭疫苗，其中至少一种细菌性O-抗原来源于绿脓杆菌O11。

10.一种志贺氏生物共轭疫苗，包括：

一种包含绿脓杆菌外毒素(EPA)的蛋白载体，且被修饰为含有至少一种共识序列D/E-X-N-Z-S/T，其中X和Z可以为除了脯氨酸以外的任何天然氨基酸；至少一条多糖链连接于蛋白载体上并且含有以下结构：

并且，任选一种佐剂。

11.根据权利要求10的志贺氏生物共轭疫苗，其中蛋白载体为被修饰的EPA，含有两个共识序列。

12.一种志贺式痢疾杆菌O1生物共轭疫苗，包括：

一种蛋白载体，具有SEQ ID NO：7所提供的序列；

至少一条多糖链连接于蛋白载体上，并且含有如下结构：

以及一种佐剂。

13.一个包含SEQ ID NO：5序列的质粒。

14.一段包含SEQ ID NO：5的基因序列。

15.一段包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。

16.一段包括SEQ ID NO：7的氨基酸序列。

17.载体pGVXN64。

18.一种表达系统，用于生产至少抵抗一种细菌的生物共轭疫苗，包括：

一段编码一种寡糖转移酶(OST/OTase)的核酸序列；

一段编码蛋白载体的核酸序列；

来自于至少一种细菌的至少一个抗原多糖合成基因簇，该抗原多糖为细菌O-抗原。

19.根据权利要求18的表达系统，其中寡糖转移酶(OST/OTase)具有SEQ ID NO：2所提供的序列。

20.根据权利要求18的表达系统，其中蛋白载体已被修饰为含有至少一个共识序列，D/E-X-N-Z-S/T，其中X和Z可以为除脯氨酸外的任何天然氨基酸。

21.根据权利要求18的表达系统，其中所选的蛋白载体由AcrA和EPA组成，已被修饰为含有至少一个共识序列，D/E-X-N-Z-S/T，其中X和Z可以为除脯氨酸外的任何天然氨基酸。

22.根据权利要求18的表达系统，其中编码蛋白载体的核酸序列包含SEQ ID NO：6。

23.根据权利要求18的表达系统，其中的细菌选自于致病菌集合，志贺氏菌、大肠杆菌、绿脓杆菌O11或土拉弗朗西斯菌。

24.一种表达系统，用于生产抵抗志贺式痢疾杆菌O1的生物共轭疫苗，包括：

一段含有SEQ ID NO：2的PgIB的核酸编码序列；

一段含有SEQ ID NO：6的修饰EPA编码序列；以及

含有SEQ ID NO：5的一个多糖合成基因簇。

25.一种工程细菌，含有权利要求24的表达系统，其中编码PgIB的核酸序列以及编码修饰的EPA的核酸序列稳定的整合于大肠杆菌基因组中，多糖合成基因簇以质粒形式引入。

26.根据权利要求25的细菌，其中细菌为大肠杆菌。

27.一种在生物反应器重生产O1-生物共轭疫苗的方法，包括以下步骤：

在细菌中表达：修饰后的EPA，含有至少一种共识序列，D/E-X-N-Z-S/T，序列中X和Z可以为除了脯氨酸以外的任何天然氨基酸，或者是AcrA；PgIB；以及一条或多条O1-多糖；

培养细菌一段时间来生产一定量的O1-生物共轭疫苗，含有连接于一条或多条O1-多糖上的AcrA或者修饰的EPA；

提取周质蛋白；以及

从提取到的周质蛋白中分离O1-生物共轭疫苗。

28.一种生产志贺式痢疾杆菌生物共轭疫苗的方法，所述方法包括：

通过在一个重组生物中使用糖基转移酶组装痢疾杆菌多糖；

将上述多糖连接至所述重组生物中的一个或多个目标蛋白的一个天冬酰胺残基上，其中所述的一个或多个目标蛋白包含至少一个或多个T-细胞抗原决定簇。

29.一种生产志贺式痢疾杆菌生物共轭疫苗的方法，所述方法包括：

在一种原核生物中引入一种编码代谢机制的遗传信息，该代谢机制执行目标蛋白的N-糖基化，从而得到一种修饰的原核生物，其中，表达一个或多个重组目的蛋白所需的遗传信息被引入所述的原核生物中，代谢机制包括：特异性的糖基转移酶用于把痢疾杆菌的一种多糖组装至一种脂载体上，以及一种寡糖转移酶，该寡糖转移酶将多糖共价结合于目标蛋白的天冬酰胺残基上，目标蛋白含有至少一种T-细胞抗原决定簇；

将修饰的原核生物进行培养；以及

从培养基中得到糖基化的蛋白。