CN101980714A

CN101980714A - 借助干细胞或骨髓细胞进行组织再生的方法和组合物

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Publication number: CN101980714A
Application number: CN2009801112567A
Authority: CN
Inventors: 奥古斯蒂努斯·巴德
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2008-03-31
Filing date: 2009-03-24
Publication date: 2011-02-23
Also published as: CA2719437A1; WO2009121503A3; AU2009231139A1; EP2273997B1; RU2491076C2; JP2011516436A; US20110020299A1; RU2010142988A; EP2273997A2; WO2009121503A2

Abstract

本发明涉及基本由血液或血浆以及干细胞或骨髓细胞组成的新型可聚合组合物，以及借助该组合物进行组织再生的方法。该类型混合物可以在内源的或外源的聚合因子如凝血酶、钙离子或细胞碎屑作用下聚合成粘性的凝胶，其非常有利于干细胞或骨髓细胞发育和分化成组织特异性细胞。特别是还含有红细胞生成素(EPO)或者相似作用的生长因子的该类型聚合产物，在其对于组织再生或者骨缺损再生应用方面显示突出的性质。

Description

借助干细胞或骨髓细胞进行组织再生的方法和组合物

本发明涉及一种新型的可聚合的组合物，其包含血液、血小板或血浆，以及干细胞或骨髓细胞，以及任选地包含血液、脂肪组织、或者源自有待形成或有待再生的目的组织或与之相应的组织的细胞。借助该血液/干细胞制剂可以在很短的时间内有目的地制造任意的目的组织。

在许多创伤和疾病情况下，身体存在基于进化障碍不能修复的缺损。本发明的目的是，使得“复制模型(Kopiervorlage)”在其制造能力方面能够用于组织“工程”，并且还展示了可以制造任意目的组织的方法。

该类型的混合物可以在内源的或外源的聚合因子如凝血酶、钙离子或细胞碎屑影响下聚合成粘性的凝胶，所述聚合因子对于干细胞或骨髓细胞向组织特异性细胞的发育和分化是很有利的。

特别是还包含红细胞生成素(EPO)、EPO的类似物或衍生物(例如以氨甲酰化形式)或者EPO的肽序列，和或者血小板生成素或凝血酶的该类型的聚合产物，在其对于组织再生或者骨缺损再生应用时显示突出的性质。备选地也可以单独地或与EPO组合地使用GM-CSF或G-CSF。

本发明还涉及借助源自血液组分、干细胞/骨髓细胞和优选的促进细胞生长和细胞分化的因子和物质，特别是EPO和其具有生物活性的衍生物和/或片段，以及GM-CSF或G-CSF以及必要的维生素，例如维生素C或激素的这种聚合产物进行组织再生和发生的方法。

胚胎的、分娩的(自脐带)和成人的干细胞被认为是用于新的治疗形式的有希望的承担者，它们应该使损坏的组织和器官的再生变得可能。这些细胞显然确实具有用于修复损坏组织部分的潜能，然而其所基于的机制以及与特异性组织相关的实际可应用性一如既往地被争论着。

术语“干细胞”概括了一组不相同的细胞，其同时具有如下两个特征：干细胞是高度分化的细胞的前体细胞。干细胞分裂后，根据教学观点，子细胞可以再度生成干细胞或者分化为组织特异性细胞，例如分化为心脏细胞、神经细胞、皮肤细胞或肌肉细胞。

干细胞首先出现在胚胎发育早期。受精的卵细胞(受精卵)就是已经具有全能性的干细胞，其经历胚胎发育早期，之后由其形成人体的所有组织。因此在胚胎发育过程中特定生长因子的影响下例如由胚胎结缔组织(间质细胞)干细胞形成肌肉细胞。干细胞的子细胞分化越完全，其向不同组织的分化可能性的范围越受限制。

其它干细胞，所谓的成人干细胞，相反在整个生命中起重要作用，特别是在组织再生和组织修复中。通过补给分化细胞并取代受损或者死亡的细胞，它们维持组织和器官的功能。例如骨髓干细胞负责补给寿命短暂的血细胞。

直到不久前人们持有这种观点，成人干细胞不仅可以分化成其所在器官的细胞，而且也可以分化成其它组织或器官的细胞。例如由骨髓不仅可以衍生新的血细胞，而且也可以衍生不同体组织的细胞，诸如骨、软骨、腱膜、肌肉、肝脏。

但是基于最新结果，所述来自骨髓的成人干细胞可以向任意分化的细胞转变的观点有待商榷，最新结果显示，在间质干细胞仅早期地或者在特定前提下显示这种转分化的潜能：在许多情况下，其中由间质干细胞确实转化为具有完全功能的特异性组织细胞，例如骨骼肌细胞，是通过干细胞与存在的已经分化的细胞融合而完成的。虽然实验显示，当这些细胞与产生特定生长因子的细胞一起孵育，其表达例如一系列心脏和骨骼肌特异性基因。虽然在这些细胞也可以观察到形态上的变化，但是最终不能形成具有完全功能的肌细胞。

因此到目前为止不能在人体成功地实行用于真正的特异性组织原地再生的干细胞治疗。例如向心脏移植成人干细胞导致加强血管发生，但明显地不导致心肌组织的构建。

因此经常使用已经相应特异化的或已分化的起始细胞进行组织再生。例如对于软骨组织的再生，相应于现有技术使用基质例如纤维蛋白(异源的也使用自源的)，但也使用例如大鼠尾胶原。在该聚合的基质中通常加入源自关节的软骨细胞。该软骨细胞来自相应患者的膝关节活组织检查，并在使用离体的增殖方法下接种在该基质中。备选地可以用已知方式在藻酸盐基质、源自动物的纤维蛋白基质或者胶原基质中直接培育软骨细胞，并且在孵育几周时间后进行移植。用于制备其它组织特异性细胞的类似方法也是已知的。

该方法的缺点在于，所述必需的较长预孵育时间导致所选的特异性细胞的去分化过程，其被认为是不期望的特性。例如此类错误导向的软骨细胞分化过程有利于不期望的纤维变性软骨而非透明软骨的产生。

目前的常规方法的另一明显的缺点在于，目前使用的聚合的基质不利于组织的新生和改造，并且引起不期望的细胞活化。此外，接受者也经常出现免疫不耐受性。

所述缺点现在可以根据本发明通过使用干细胞代替已分化的细胞而避免，其中干细胞，不像目前为止大多直接并入待再生的目标组织中，而是借助基本上源自聚合的血液或者血浆或者可聚合的血小板浓缩物或制剂的基质，其中在聚合之前包埋了干细胞或其前体细胞。

因此可以令人惊讶地显示，使用这类特别是含有成人干细胞的基于血液或者其细胞组分(红细胞和白细胞、血小板)或非细胞组分(蛋白质、脂质、糖等)的聚合产物，与上述已知的方法包括用组织细胞作为起始细胞的方法相比，明显更高的所获得的分化的特异性细胞的产率和质量。

令人惊讶的是，也在之前不聚合的相应血液制剂观察到该效果。聚合的血液或血浆相对于液态血液样本，对干细胞向组织特异性细胞分化的能力和以分化的形式增殖的能力产生非常积极的效果。

特别是聚合启动剂如凝血酶、Ca++或者合成的或生物的基质片段例如含有胶原序列或RDG序列的肽，不仅对聚合负责，而且也对聚合后在血液三维结构、血浆结构或血小板制剂结构中的生物效果负责。

其原因在于，经此释放了一系列对干细胞具有直接刺激效果的生长因子。对此EGF，但TGF_β也计算在内。然而，除了这些因子以外，通常不出现在一般的合成材料中的细胞膜成分、基质成分、细胞内成分和复合矿物质元素(钠、钾、氯、镁、锌)代表杂质。另外，鉴于环境的复杂性，纤维蛋白聚合产物也不能满足这种功效。

此外，根据本发明确认，经聚合的血液的这种效果特别是在促进释放、增殖或分化干细胞的因子的存在下出现。所述因子不仅是通常在干细胞制备方法中使用的激素、维生素或者生长因子，例如GM-CSF、G-CSF，而且令人惊讶的且以特别规模地还包含红细胞生成素(EPO)、其类似物、氨甲酰化形式或者还有天然物质序列的肽片段。

即，根据本发明发现，在根据本发明的血凝胶的三维结构中，与干细胞或祖细胞相结合创造人造的且具有潜能的创伤环境，其与在该条件下出现的缺氧和局部出现释放的急性期细胞因子，例如白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1(IL-1)和肿瘤坏死因子(TNF)相结合，引起涉及干细胞的级联反应。用EPO/衍生物或类似物共同刺激，在此显示基本允许的效果，其使本来的效用细胞(干细胞或祖细胞)在组织分化中转换。

凝胶结构和经此由液态(溶胶)向固化(聚合的)凝胶结构可表明的转变的另外优点在于，其在创伤腔体或创伤缺损处的可塑性，以及通过化合物的粘性效果普遍的局部可施用性。经此可以高效地向创伤基底附近引入干细胞，并且因此简单地填充缺损。

同样在慢性疾病形式下，例如在局部的创伤位置已经消退的情形下，或者还有在用于疤痕修整或用于缺损填充的构建的皮肤区域内的整容情形下，或者在重复皮下注射或还有局部的以3-4天间隔的胸部重新塑形的情形下的慢性状态的截面创伤中，可以通过该根据本发明的施用混合物局部限制地施用于所述创伤位置。经此在微范围中为用于引导区域特异性组织重新构建的干细胞刺激创造理想的环境。通过三维构造的渗透性，可以将另外的激素信号和旁分泌信号从周围环境对干细胞产生影响，并刺激干细胞。

与创伤的自然状态不同，通过这些因子的组合引起能产生直至约50％的加速的创伤愈合。凝胶结构的另一优点是，除了自源的基础，用合成组分(BMPs、PDGF、EPO、GCSF、GM-CSF)或合成的基质组分的完全可补充性。

含有干细胞和优选还含有EPO和/或GM-CSF或G-CSF的血液聚合物、骨髓聚合物或者血小板浓缩物，将其引入相应的组织或相应的(缺损的)骨骼结构，显示了起到大幅度地增强产生目标组织功能性分化细胞的能力的作用。

此外另一优点明显，即在不再可能自行完全恢复或重新形成原来组织的缺损大小或者缺损类型的情况下，在此可以混入近似目标组织的填充材料，并且由此形成用于在施用混合物中激活的干细胞的重塑过程的“复制模型”。复制模型的材料可以例如是骨骼的矿物质特性或者在牙的情形下的牙质替代物。合成的RGD类似物、胶原肽(优选动物胶原)可以在此混入骨骼的天然组成，并且将之在创伤或缺损就地形成凝胶聚合产物。

因此本发明的主题是源自优选自身的和主要是人或动物的含有所有其衰退成分如细胞碎屑的血液或血液成分的聚合产物，其特征在于，含有干细胞或骨髓细胞，以及至少一种引起或促进或加强干细胞或骨髓细胞释放、增殖或分化的物质。

相应的促进干细胞生长和分化的物质是生长激素，如HGH或者细胞因子，例如白细胞介素、干扰素、TNFa或G-CSF或GM-CSF。

特别适用的是红细胞生成素(EPO)或其生物活性的类似物、衍生物或片段。红细胞生成素(EPO)是一种糖蛋白激素，其控制由骨髓中的前体细胞形成红细胞(红细胞生成)。EPO在此与在所有造血细胞中表达的其受体(EPO-R)结合。

近些年，不同的作者报导，EPO也发挥非造血的作用，而所述EPO-R相应地也在特定的非造血细胞中表达。例如，有关于通过EPO刺激神经细胞、脑的神经元细胞和内皮细胞的报道，其中在一些情况下与造血EPO受体的直接表达相联系。

在其它情况下，预计存在另一种非造血的受体。特别是在不久前得知的红细胞生成素(EPO)的非造血作用例如与内皮细胞和组织细胞的活跃的生成和再生相关联，被赋予越来越重要的意义。

例如，WO 2004/001023尤其描述EPO和TPO用于刺激血管新生和组织再生和改善创伤愈合，例如在手术和受伤后。

在WO 2005/063965中教导了EPO用于创伤组织有目的的结构控制性再生，其中不仅刺激内皮细胞的生长，而且还促进薄壁组织再生和壁结构形成，使得发生协调的三维生长以构建功能性组织、器官或其部分。红细胞生成素和EPO衍生物或还有EPO模拟物看似在全身应用中也是适宜的，从而在皮肤、粘膜受伤下，在开放性皮肤和皮肉伤下或者也在由烧伤或烫伤引起的皮肤刺激下，有目的地启动和控制所涉及组织的新生和再生，并且能够最终促进和加快愈合。

WO 2005/070450和有关发明人的其它论文描述了EPO以周剂量小于90IU/kg体重在血管和组织再生中的用途，尤其还用于创伤护理领域。经此应该实现，在骨髓区中的造血被较小地刺激，但根据如所描述的新教导，活化血液区中的内皮祖细胞是可能的。使内皮细胞的前体细胞在血液还有在组织中的活化和内皮细胞的发育(其形成血管的最内层的细胞层)与血管形成的改善相关联并假设，经此也使组织再生成为可能。这在临床试验期间在烧伤的情况下得以证明。

根据本发明现在发现，当相应的聚合产物另外含有EPO时，通过血液聚合物对干细胞发育和分化的促进效果可以进一步提高约10-50％，其中EPO剂量在50至500IU/kg体重之间，优选在100至300IU/kg体重之间。原因不仅在于所提供的三维结构，也在于令人惊讶的协同效果，其相应于至今相反的教学阐释。因此已知，在组织工程中不能达到较高的层厚度，因为出现的缺氧将组织形成限制在数微米的层厚度(大多100-500μm)。另外制备不应含有死细胞的高纯度细胞群。

然而，组合物的整体为在血液聚合物中加入的干细胞显示了令人惊讶的积极效果，其中所述聚合、增加的层厚度、例如单核细胞的细胞碎屑和其在缺血状态的活化促成异源干细胞的急性期反应，其特别是与EPO相结合引起爆炸性扳机效果。如果之后再加入细胞外环境的选择性的“有复制能力”的组分，则根据本发明产生导致组织重新形成的真正的“重新塑造”效果。当缺损的类型和大小不能自行痊愈时，也可以产生这种组织形成。

因此本发明的主题特别是具有干细胞或骨髓细胞的血液聚合产物，其还含有适合剂量的红细胞生成素(EPO)。与根据使用已经特异化的组织细胞的常规方法相比，使用该类型聚合产物分别根据组织特异性的施用，实现使组织再生加快10-50％并改善质量/功能。

根据本发明含有EPO的基于优选自身血液或血浆或血小板的干细胞聚合产物还可以具有促进生长和分化的物质，特别是GM-CSF、G-CSF或TNFalpha。

通过EPO和其生物活性的衍生物根据本发明与血液/骨髓/血小板浓缩物、血浆、红血球和/或白血球部分的聚合过程相结合使干细胞或其前体细胞的存活和进一步发育，以及组织特异性的激活和在创伤情况下特异性的组织再生成为可能。

本发明所基于的根本发现是，与干细胞相结合的血液或血浆呈现粘性稠度并经此显然地产生的三维结构有利于干细胞的发育。通过向源自血液/血浆、干细胞、EPO等的液态混合物中加入外源的凝胶形成剂，可以进一步加强该效果，其中可以制成不同凝固性和具体良好的可加工性质的凝胶或聚合产物。作为简单的和根据本发明非常成功的凝胶形成剂例如是可以添加到还是液态的混合中的含有和不合有钙离子的凝血酶或者鱼精蛋白。

从中可以发现特殊施用方法的应用，例如将在注射器中的含有干细胞的混合物经与含有“复制模型”的第二个注射器的加速的混合被导入唯一的施用管中，并且然后在应用部位聚合。

在上述讨论的意义上，还通过向待聚合的混合物加入细胞碎屑获得足够的有利于干细胞或其前体细胞发育的聚合效果。细胞碎屑通过如单核细胞、红血球和白血球(白细胞)、血小板或干细胞、前体细胞、纤维原细胞、内皮细胞、结缔组织细胞、软骨细胞和巨噬细胞由于缺乏补给而死亡的含有细胞的样本形成，其中释放有利的物质，所述有利的物质对聚合或者聚合产物的质量显示有利的性质。因此内源钙离子也被释放，其完全或部分地节省外源钙离子的添加。有利的是向待聚合的混合物添加自身来源的细胞碎屑。

因此本发明的主题也是相应的含有血液的聚合产物，其含有促进干细胞可固定和构造的结构并因此促进其发育的内源的或外源的物质。该类型的物质可以是凝血酶、钙离子、不同类型的优选自身细胞的细胞碎屑、生物胶原或其片段、细胞外基质成分、纤维蛋白、纤维蛋白胶或其它成凝胶的物质。

所述聚合可以以替代方式或另外地通过其它天然或合成的聚合物形成剂起作用，例如凝胶形成性可膨胀的多糖，如羟烷基纤维素和/或羧烷基纤维素或基于丙烯酸酯合成的聚合物形成剂，例如(聚)甲基丙烯酸酯、(聚)甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酰胺、(聚)甲基丙烯酸乙氧基乙酯。

此外确认，通过向待聚合的混合物加入冻干的血液改善或加强聚合产物的聚合稳定性以及同样的涉及其组织再生效果的性质。另外可以混合基于天然或合成形式的扇贝粘性蛋白。同样地可以加入血清素，其不仅刺激神经元祖细胞，而且支持粘性效果。

借助于凝血酶、钙离子和/或细胞碎屑和/或其它适合的凝胶形成剂和/或冻干的血液提供了更多的可能性，其使源自血液/血浆和干细胞的混合物的聚合性质变化或改变，并且经此令人惊讶地影响到干细胞的发育和分化。

根据本发明不需要特意地分离干细胞。使用个体的骨髓也是足够的，并且优选地将其与自身的血液或血浆混合，通过离心、过滤或沉淀在关于细胞组分的需求上浓缩，并用凝血酶、钙离子和/或细胞碎屑、基质(矿物质、肽、糖、脂质和它们的组合)和优选EPO混合并使其形成凝胶。该类型的凝胶可以直接用于最不同的施用。

因此本发明的主题是可以用于组织或骨骼，特别是用于创伤组织和/或尤其是体内骨骼的再生的相应聚合物。

本发明的主题特别是用于创伤组织或骨骼结构再生的相应聚合产物的应用，其中所述聚合产物用于在所涉及的创伤部位或其直接相邻部位施用，或者用于填充缺损。

经显示，在骨骼缺损时可以特别有利地与骨骼替代材料相结合地使用这种根据本发明的聚合产物。在此可以将所述混合物在聚合出现之前的短时间内与还未完全聚合的骨骼替代材料同时引入骨骼缺损，并在缺损处混合，以便随后聚合。特别有利的是，对于例如纳米结晶的氢氧磷石灰或者其它纳米结晶的矿物质或生物材料(蛋白质、肽、脂质、糖、塑料)，其以干燥形式或者以氢化形式存在。通过这种粉状或糊状的材料性质限制了干细胞的可繁殖性，或者甚至对于所述生物材料是缺点。因此显示，该类型材料(例如“Ostim”)是在其上不可繁殖的。

尽管并且令人惊讶的是，根据本发明在被认作为在其上不能繁殖的纳米结晶材料中实现高的干细胞厚度是可能的。

在体内移植之后，在不添加EPO时其已经导致骨骼构建加速约50％。在另外同时以局部形式加入EPO时可以另外地使骨骼构建加速10-20％。备选地，支架(Scaffold)材料作为粉末也可以已经与EPO、其衍生物或肽片段混合。这具有更好的可贮藏性的优点。

备选地可以例如在使用两种以注射器形式的施用容器时，EPO以冻干的形式在注射器中备用，该注射器吸取血液、骨髓-干细胞混合物。在这方面(注射器2)同样可以存在其它基质(支架)组分，所述基质组分是自身来源的(冻干的血液或血浆、纤维蛋白、凝血酶)以及合成来源的(基质蛋白的肽片段、自行聚集的肽结构(RADA)、磷脂酰胆碱、鞘脂、卵磷脂、HDL(高密度脂蛋白))，以及葡萄糖、葡糖胺、硫酸葡糖胺、透明质酸、壳多糖、丝蛋白、扇贝粘蛋白、胶原及其片段以及肽。

这种施用方法允许干细胞最佳的分布，并且在例如骨骼替代材料基质内获得异源的“支架”结构，在该结构中，骨骼组织可以从外部通过进入通道直接向内生长并且逐渐取代骨骼替代材料。经此产生的内部连接的多孔性由此是从一开始就以干细胞在凝胶状结构中实现的。经此尽管具有非常高的层厚度也形成了最佳的生长条件。

与传统的教导相反，加入EPO、GM-CSF或G-CSF，但在此情况下特别是加入EPO引发在最佳的环境中对干细胞或祖细胞特别有效的刺激。经此使在施用地点(诊所、手术室)之外的祖细胞相应增殖方法的放弃成为可能，并与手术本身(术中)同步实施干细胞治疗。这具有实质的调控性和经济性优点(费用下降)，意味着危险最小化和实质性的质量改善。

然而在特别大缺损的情况下，在干细胞凝胶中提前增殖可以是有利的。根据本发明可以在三维血凝胶或者也可以在血浆凝胶中立即进行该培养。出于该目的，所述聚合也可以在体外引发，以便经此在体外创造生长环境，在由于直径数毫米至数厘米厚度的增加的层厚度的氧缺乏下在旁分泌的刺激性环境中引发对于干细胞/祖细胞理想的生长条件。在所述的术中变化方案下，数秒至数分钟就已足够同时引发必需的干细胞刺激过程(IL-6、EPO、GM-CSF、G-CSF、基质)。

因此，本发明的主题是与此相关的聚合产物与骨骼替代材料相结合的用途，其特别是用于在体外、体内或离体的缺损的、创伤的或患有疾病的骨骼结构或骨骼组织的再生和重新构造。

在此骨骼替代材料的矿物质组分应该是适用于支持填充骨骼缺损的。作为适用的骨骼替代材料有例如氢氧磷石灰、磷酸三钙和相似的物质。

根据本发明的聚合产物适用于通过创伤或疾病产生的组织或骨骼缺损的最多样化的医疗用途。特别是它也可以在牙和颌缺损的情况下在齿区内使用，但也可以在皮肤或粘膜创伤的情况下在局部区域内使用。

此外，本发明的主题是制备包含人或动物血液以及人或动物干细胞或骨髓细胞的相应的聚合产物的方法，其中所述组分以液态彼此混合，并且该混合物借助凝胶形成剂，特别是通过加入钙离子、凝血酶、纤维蛋白或生物来源的细胞外基质成分或细胞碎屑和任选的还有冻干的血液进行聚合或凝固，其中在特殊的实施方式中在聚合前向液态混合物中加入引起或促进干细胞或骨髓细胞释放、增殖或分化的物质。

此外，本发明的主题是用于组织或骨骼结构在体外或离体再生的方法，包括以下步骤：

(i)提供分离的干细胞或骨髓

(ii)将所述细胞引入血液、血小板或血浆样本

(iii)使源自(ii)的样本聚合和

(iv)在适合引发和/或促进细胞生长和分化为所期望组织的环境中培养细胞。

此外，本发明的主题是用于组织或骨骼结构再生的方法，包括以下步骤：

(i)提供分离的干细胞或骨髓

(ii)将所述细胞引入血液或血浆样本，或者直接使用骨髓并与EPO、GCSF、GM-CSF混合

(iii)用例如Ca++或凝血酶原、鱼精蛋白和任选地用其它的合成或天然来源的因子如“复制材料”和分化因子使源自(ii)的样本聚合。

(iv)直接的将样本引入受伤的、患有疾病的、损伤的或衰退的身体部位。

上文提及的分化因子可以是TGF_β或副甲状腺素(软骨形成)或者维生素C(用于诱导神经元出芽)。

作为改善“组织工程”的重要补充将目标组织的片段或颗粒与之并入。其理想地具有厚度约100-200μm和直径约200-300μm。较大或较小的片段也可行。理想地用解剖刀或锋利的刀进行捣碎。优点是该准备过程仅需要很短时间。因此在优选的形式中，该全部过程可以同步用于手术本身。

备选于完整的混合物，在骨髓中包含的细胞也可以使用分离的干细胞或祖细胞群如CD31、CD71和CD134和CD90阳性细胞。

主题特别是这种在体内、体外和离体的方法，其中血液或血浆样本通过加入钙离子和/或天然的或合成的凝胶形成性物质和/或细胞碎屑进行聚合。

主题进一步是这种在体内、体外和离体的方法，其中加入生长因子和/或激素和/或促进生长或分化的物质和/或细胞，特别是选自由EPO、GM-CSF、G-CSF、GH、结缔组织细胞、纤维原细胞、巨噬细胞、细胞碎屑组成的组。

以下实施例应该进一步阐述本发明，而非限制本发明。特别是不限制所述特殊的方法步骤、方法参数、物质、组织样本和应用，并且当专业人员认为为此没有其它起因时，可以通过其它同样作用的方法步骤、方法参数、物质、组织样本和应用替代。

实施例1：

神经创伤特别是截面创伤的治疗

在急性的截面创伤情况下必须对也受损的神经区域进行减压。

根据本发明，在此红细胞生成素与骨髓和血液相结合地混合，并且向创伤部位涂覆如软膏或凝胶。

所述凝胶理想地具有约1-2mm厚度并且含有约100000个细胞。

在椎管较大损伤情况下，可以使骨髓与冻干的血液或者备选地与捣碎的胶原海绵混合。这促进较大团块和引导结构(Leitstruktur)的构成。在该团块中同样可以加入原始的或冻干的血小板浓缩物。将所述全部同时用维生素C(10-20mg)混合。

实施例2：

与矿物质相结合的骨骼构建

本发明的主要优点之一在于，终产物例如溶于水性溶液中的基本上不能在其上繁殖的骨骼替代材料，尽管如此可以以非常有效的方式在其上繁殖干细胞。

为此在串连注射器系统中，在第一个注射器中使用常规的骨骼替代材料且在第二个注射器中使用含有或不含EPO的、含有或不含钙离子的、细胞碎屑等的血液-骨髓细胞混合物。详细地，在空注射器中存放EPO(例如10 000IU用于70KG体重的人)的冻干物、还有Ca++(1mg以结晶形式或1mol/l)。将1-2ml的骨髓吸入该注射器中，以及另外1ml的血小板浓缩物。所述第二个注射器的混合物然后平行地经双注射器系统的加速混合螺旋器与在第一个注射器中还可变形的骨骼替代材料同时施用在骨骼缺损处，并且原位混合并使其聚合。

所述第二个注射器可以另外地含有合成的或生物的胶原或者其片段、细胞外基质的成分或者其它物质例如RGD肽。另外可以混合BMP或者以冻干或原始形式作为浓缩物的血小板或血液浓缩物。

实施例3：

骨囊肿的填充：

如下进行用于制备用以填充腔室的糊状和柔韧的团块：将约10ml骨髓加入到小管/注射器中，其中存有冻干的红细胞生成素、冻干的血浆和纳米结晶的氢氧磷石灰或者磷酸三钙。

短时间内产生浓糊状的粘性团块，将之用抹刀(Spatel)或经管道(Kanüle)引入骨骼的损伤部位。

此外加入细胞外基质的合成组分如纤维连接蛋白或胶原，由此产生用于细胞系统整合的加速的生长区域或改善该区域。

实施例4：

心肌组织的再生：

取约500ml的外周血，并在50g的情形下离心5分钟。然后将上清液在800g的情形下再次离心5分钟并将剩余物(Pellet)与之前的剩余物合并。将所有如此从外周血得到的细胞收纳于含有250单位/kg体重EPO的注射器中，并在5分钟的孵育时间和干细胞的EPO受体活化后已准备好用于移植。备选地或者联同地可以将5-10ml的骨髓加入到具有冻干EPO的注射器中。

以类似的方式在肌肉纤维拉伤后将干细胞施用于受伤部位。为此每注射部位使用约1-2ml。

实施例5：

乳腺组织的再生：

将源自膝关节部位的2-3ml脂肪组织与经离心的骨髓混合，并以250单位/KG/KGW局部施用。在约10秒至5分钟的孵育时间后，干细胞是已准备好用于注射。注射液可以含有冻干的凝血酶和Ca++。以类似的方式将所述干细胞混合物用于皮下脂肪组织构建和用于皮肤的褶皱减少和年轻化的应用。将源自骨髓(源自10ml)或外周血(源自100ml)的干细胞在离心后与凝血酶和/或Ca++混合，并且经皮下以每注射部位约500μl施用。可以每3-4天或每周重复该过程。

实施例6：

椎间盘(Bandscheiben)的再生

在急性或慢性的椎间盘创伤情况下必须对也受损的神经区域进行减压。在死骨切除术时将减轻该神经部位的负担。由该死骨材料通过机械捣碎制备最小的组织片段。将其(±0.5ml)与原始或者浓缩形式的骨髓(2ml)混合，并同时加入基于体重的相应常规建议剂量的冻干的EPO、冻干形式的GM-CSF或G-CSF。但在此不进行全身施用，而优选局部施用。所述全部混合物可以与1-2ml血小板浓缩物优选以冻干形式混合。

根据本发明，在此将红细胞生成素与骨髓和/或血液相结合地混合，并且如凝胶借助消毒的注射器注射到椎间盘部位上。

所述凝胶理想地含有约100000-1000000个细胞，但更多或更少也是可行的。

在椎间盘较大缺损的情况下，可以使骨髓与冻干的血液或者备选地与捣碎的胶原海绵混合。这促进较大团块和引导结构的构成。在该团块中同样可以加入原始的或冻干的血小板浓缩物。将所述全部同时用维生素C(10-20mg)混合。

实施例7：

软骨组织的再生

在急性或慢性软骨受伤和关节炎的情况下，借助柔软的例如硅树脂管在微小打开的关节部位引入即将凝固的聚合产物，从而可以进行原位聚合。在死骨切除术时可以将其通过机械捣碎变化为最小的组织片段。将其(±0.5ml)与原始或者浓缩形式的骨髓(2ml)混合，并同时加入基于体重的相应常规建议剂量的冻干的EPO、冻干形式的GM-CSF或G-CSF。但在此不进行全身施用，而优选局部施用。所述全部混合物可以与1-2ml血小板浓缩物优选以冻干形式混合。

在软骨较大缺损的情况下，可以使骨髓与冻干的血液或者备选地与捣碎的胶原海绵混合。这促进较大团块和引导结构的构成。在该团块中同样可以加入原始的或冻干的血小板浓缩物。将所述全部同时用维生素C(10-20mg)混合。经此也可以供给非常大的关节面积。在上关节部位至关节缝隙将更多地层层使用血小板浓缩物。在特定的情况下可以使用TGF_β和/或副甲状腺素用于促进软骨形成。

实施例8：

腱膜组织和半月板的再生

在腱膜组织(例如人和马的跟腱)或半月板受伤的情况下将浓缩的骨髓与EPO和GCSF或GM-CSF混合注射入受伤部位。理想地借助常规方式的缝合处理裂开。制备源自撕裂部位的组织片段，引入到聚合凝胶中，并将其重新注射到裂开部位及其周围。

以类似的方式进行内耳小骨或视网膜的再生。

实施例9：

改善移植物表面以避免人造乳房的被膜纤维化

人造乳房移植的重大问题之一在于，在移植物周围形成被膜纤维化。根据本发明将在移植物表面涂覆微结构，其使干细胞在该表面的生长行为成为可能。该微结构具有下部直径理想地为4-5μm的空腔，并且较大空腔的直径为25-250μm。该空腔结构可以理想地与连接的管道结构相连接，该管道结构使血管床的自行组织成为可能。在空腔中，在理想地在取得新鲜骨髓后进行骨髓直接的繁殖。为了浓缩细胞，在约30-50g的情形下离心可以使温和的富集成为可能。为了引发聚合和启动组织新生使用凝血酶。

通过添加凝血酶使源自骨髓的细胞与血液的混合在微结构中发生凝胶形成和聚合。所述凝血酶混合物/干细胞混合物与血液结合具有特别的有利再生的作用。经此与局部的创伤部位相结合引发移植部位的生长过程，其导致约50％降低的纤维化。与有利的局部应用红细胞生成素相结合产生了区域性刺激效果，其导致直接活化所导入的以及该区域的祖细胞。对此包括脂肪生成(adipogene)和腺体祖细胞(Drüsenprogenitoren)。在这些祖细胞上发现有表面标记CD 90、SCA1、CD71。所述被膜纤维化也在疝之后的网膜(Netzen)移植或腹壁缺陷的闭合起到重要的对于痊愈过程复杂的作用。

以类似的方式将含有或不含EPO/衍生物/类似物的原位聚合的干细胞血凝胶用于其它移植物微结构表面的。

以类似的方式进行髋假体或其它关节假体的治疗。

实施例10：

齿移植物：

在根部治疗后的牙质再生可以根据本发明通过引入纳米结构的含有氢氧磷石灰或磷酸三钙的含有或者不含EPO的以及含有或者不含干细胞的干细胞-血凝胶实现。在此颗粒粒度或者矿物质粒度理想的是5-100μm，其中增大意味着在钻通的管道中流动性的下降。

实施例11：

如在上述实施例中描述的以类似的方式，可以处理其它的移植物，例如：心脏起搏器、腹壁网、支气管替代物、血管替代物或者心脏瓣膜替代物。

实施例12：

烧伤创伤、褥疮或者糖尿病溃疡感染的创伤的再生

在急性或慢性皮肤受伤的情况下，在创伤基底的清洗后如下地制备干细胞凝胶并局部安置。

由未受伤皮肤部位通过机械捣碎如上所述的原理制备最小的皮肤片段。将其(±0.5ml)与原始或者浓缩形式的骨髓(2ml)混合，并同时加入基于体重的相应常规建议剂量的冻干的EPO、GM-CSF或G-CSF。但在此不进行全身施用，而优选局部施用。所述全部混合物可以与1-2ml血小板浓缩物优选以冻干形式混合。

根据本发明，在此红细胞生成素与骨髓和/或血液相结合混合，并且如凝胶借助消毒的注射器或抹刀涂覆在创伤部位。所述凝胶理想地含有约100000-1000 000个细胞/10cm²，但更多或更少也是可行的。

在较大损伤情况下，可以使骨髓与冻干的血液或者备选地与捣碎的胶原海绵混合。这促进大团块和导向结构的形成。在该团块中同样可以加入原始的或冻干的血小板浓缩物。所述全部将同时用维生素C(10-20mg)予以混合。

Claims

1.包含人或动物血液、血浆或血小板浓缩物的聚合产物，其特征在于，含有干细胞或骨髓细胞以及至少一种引起或促进干细胞或骨髓细胞释放、增殖或分化的物质。

2.根据权利要求1的聚合产物，其特征在于，所述促进的物质是生长因子、激素或细胞因子。

3.根据权利要求2的聚合产物，其特征在于，所述促进的物质是红细胞生成素(EPO)、GM-CSF、G-CSF或者它们的生物活性的衍生物或片段。

4.根据权利要求3的聚合产物，其特征在于，所述促进的物质是EPO或者其相应的生物活性衍生物或片段。

5.根据权利要求1至4之一的聚合产物，其特征在于，另外含有冻干的血液或血浆。

6.根据权利要求1至5之一的聚合产物，其特征在于，另外含有天然的或合成的聚合物和/或钙离子和/或凝血酶和/或鱼精蛋白。

7.根据权利要求6的聚合产物，其特征在于，所述聚合物是纤维蛋白或基于纤维蛋白的胶粘剂。

8.根据权利要求1至7之一的聚合产物，其特征在于，使用自身的干细胞或骨髓细胞。

9.根据权利要求1至8之一的聚合产物，其特征在于，含有源自目标组织的细胞碎屑和/或其它自身的或异源的细胞，其选自由纤维原细胞、内皮细胞、结缔组织细胞、软骨细胞和巨噬细胞组成的组。

10.根据权利要求1至9之一的聚合产物用于组织或骨骼再生，特别是体内的创伤组织/骨骼。

11.根据权利要求1至10之一的聚合产物的用途，其用于制备用于组织再生的药物，特别是创伤组织或创伤骨骼结构。

12.根据权利要求11的用途，用于局部治疗受伤的皮肤。

13.根据权利要求11的用途，用于创伤组织或骨骼结构的再生，其中所述聚合产物用于引入到所涉及的创伤部位或其直接邻近的部位。

14.根据权利要求13的用途，其特征在于，还施用骨骼替代材料。

15.根据权利要求1至9之一的聚合产物的用途，其用于组织再生，特别是体内或离体的创伤组织或者创伤的或缺损的骨骼结构。

16.根据权利要求15的用途，在添加支持填充骨骼缺损的矿物质组分下用于骨骼缺损的再生。

17.用于体外或离体的组织或骨骼结构再生的方法，包括步骤：

(i)提供分离的干细胞或骨髓细胞

(ii)将所述细胞引入血液或血浆样本或者血小板浓缩物

(iii)使源自(ii)的样本聚合

18.根据权利要求17的方法，其特征在于，血液或血浆样本或血小板浓缩物的所述聚合通过加入钙离子和/或天然的或合成的凝胶形成性物质和/或细胞碎屑和/或凝血酶进行。

19.根据权利要求17或18的方法，其特征在于，加入冻干的血液或血浆。

20.根据权利要求17至19之一的方法，其特征在于，加入生长因子和/或激素和/或促进生长或分化的物质和/或源自目标组织的细胞。

21.根据权利要求20的方法，其特征在于，加入一种或多种物质、因子或细胞，其选自由EPO、GM-CSF、G-CSF、GH、结缔组织细胞、纤维原细胞、巨噬细胞、细胞碎屑组成的组。

22.用于制备包含人或动物血液、血浆或血小板以及人或动物干细胞或骨髓细胞的聚合产物的方法，其特征在于，所述组分以液态彼此混合，并且使该混合物借助凝胶形成剂聚合，特别是通过加入钙离子、凝血酶、纤维蛋白或生物来源的细胞外基质的成分使之聚合。

23.根据权利要求22的方法，其特征在于，还加入冻干的血液。

24.根据权利要求22或23的方法，其特征在于，在聚合前向液态混合物加入一种或多种引起或促进干细胞或骨髓细胞释放、增殖或分化的物质。