CN101952443A - 涉及编码miR827的基因的耐旱植物、以及相关的构建体和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分离的多核苷酸和多肽，以及用于提供耐旱性的重组DNA构建体、包含这些重组DNA构建体的组合物(例如植物或种子)，以及利用这些重组DNA构建体的方法。所述重组DNA构建体包含可操作地连接至植物中有功能的启动子的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码miR827微RNA。

Description

涉及编码miR827的基因的耐旱植物、以及相关的构建体和方法

相关申请的交叉引用

本专利申请要求提交于2007年12月21日的美国临时申请61/015,683的优选权，其全部内容以引用方式并入本文。

发明领域

本发明领域涉及植物育种和基因学，并且具体地讲，涉及用于赋予植物抗旱性的重组DNA构建体。

发明背景

微RNA(miRNA)对调节基因活性起着重要作用。这些20-22个核苷酸非编码RNA可经由碱基配对与特异性靶mRNA杂交，并且通过介导RNA裂解或翻译阻抑来下调这些转录物的表达。最近的研究已经表明，miRNA在发育期间具有重要功能。在植物中，已经表明它们控制多个发育过程，包括开花时间、叶子形态学、器官极性、花形态学以及根发育(综述于Mallory和Vaucheret(2006)Nat Genet 38：S31-36中)。由于miRNA的确定的调节作用，它们有可能还参与某些主要作物特征例如抗旱性和抗病性。

植物miRNA是从长度为～50至500个核苷酸、称为pre-miRNA的较长前体转录物加工的，并且这些前体能够形成稳定的发夹结构(综述于Bartel(2004)Cell 116：281-297中)。很多miRNA发夹前体最初是作为1-2kb或更长的较长转录物存在，其称为pri-miRNA，是聚腺苷酸化的和加帽的。该事实与在表达序列标记(EST)文库中检测到很多pri-miRNA结合在一起表明，RNA聚合酶II是负责miRNA基因转录的酶。转基因实验表明，是pre-miRNA的结构而不是其序列指导它们的正确加工，并且对于miRNA的生成来说，不需要其余pri-miRNA。虽然在后生动物中，pri-miRNA在细胞核中通过Drosha被加工成pre-miRNA，并且在细胞质中Dicer裂解pre-miRNA，但是植物中的miRNA成熟与动物中的途径不同，因为植物缺乏Drosha同系物。反而，除了其在发夹加工中的已知功能以外，与Dicer同源的RNase III酶DICER-LIKE 1(DCL1)还可具有Drosha功能(Kurihara和Watanabe(2004)Proc Natl Acad Sci 101：12753-12758)。

通过几个实验室的克隆努力，已经在拟南芥属(Arabidopsis)中鉴定出了至少30个miRNA家族(综述于Meyers等人(2006)Curr Opin Biotech 17；1-8中)。很多这些miRNA序列由一个以上基因座表现，总数目最高达大约100个。因为由一个实验室发现的特定mi RNA与另一个实验室发现的miRNA一般不重叠，所以假定对于由给定植物基因组表达的整组miRNA-“miRNome”的探求仍然是不完整的。导致这种情况的一个原因可能是，很多miRNA仅在非常特定的条件下表达，并且由此被标准克隆工作所遗漏。Sunkar和Zhu的最近研究(2004，Plant Cell 16：2001-2019)提出，实际上，可通过给文库构建选择“非标准”生长条件来帮助miRNA发现。Sunkar和Zhu在由多种不同胁迫诱导的组织组成的文库中鉴定了新的miRNA。他们继续进行研究，以证实干旱、寒冷和其他胁迫对这些miRNA当中的某一些的诱导，这意味着在miRNA在应激反应中的作用。完全表征植物miRNome的努力可能需要在很多不同组织中以及在很多不同条件下测定小的RNA状况。

标准miRNA克隆的一个补充方法是使用可获得的基因组和/或EST序列计算预测miRNA，并且已经有几个实验室报道了使用该方法发现了新的拟南芥属miRNA(综述于onnet等人(2006)New Phytol 171：451-468)。使用部分依赖于观察到已知miRNA位于发夹前体中的这些计算方法，已经预测了几百种植物miRNA。然而，只有一小部分已经通过Northern印记分析得到实验证实。此外，这些计算方法中的大部分依赖于比较两个典型基因组(例如拟南芥和水稻)，以发现保守基因间隔区，因此不适于鉴定物种特异性miRNA，物种特异性miRNA可能代表任何给定生物体的miRNome的相当大的一部分。

计算方法还已经帮助了miRNA靶的预测，并且通常植物miRNA与其靶共享高度的互补性(综述于Bonnet等人(2006)New Phytol 171：451-468)。所预测的植物miRNA的mRNA靶编码多种不同蛋白。这些蛋白有很多是转录因子，因此可能对于发育来说是重要的。然而，还有很多假定被定向的酶，并且这些酶可能在过程例如线粒体代谢、氧化应激反应、蛋白酶体功能和木质化中具有作用。随着另外的miRNA被鉴定出来，过程的目录可能会变得更长，并且可能最终miRNA将涉及对于作物改善来说是至关重要的过程。例如，在硫同化途径中鉴定出了最近鉴定的miRNA靶基因，并且表明其在硫酸盐饥饿条件下被诱导(Jones-Rhoades和Bartel(2004)Mol Cell 14：787-799)。于是该特定miRNA成为提高硫同化效率的候选基因。这使得有兴趣推测，同化其他化合物例如水和硝酸盐的途径也在miRNA控制下。

鉴定新miRNA的很多工作是在模型系统拟南芥属中进行的，因此对于作物植物例如玉米、水稻和大豆的miRNome的了解较不充分。对于作物例如玉米和大豆，没有完全的基因组序列可利用，这妨碍了miRNome分析。很多拟南芥属miRNA在这些其他物种中具有同系物，然而，也存在似乎是拟南芥属所特有的miRNA。同样，预计也存在上述作物物种所特有的非保守miRNA。有相当一部分非保守miRNA可为与物种特异性生长条件或发育过程有关的调节网络的一部分。这样，在作物物种例如玉米中进行miRNA克隆，以补充目前正在使用的生物信息学方法，并且最终完全表征作物物种的miRNome，是至关重要的。

发明内容

在一个实施方案中，本发明包括在基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有的核酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27进行比较时，具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增加的耐旱性。所述植物可为玉米植物或大豆植物。

在另一个实施方案中，本发明包括在基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码包含第一和第二寡核苷酸的修饰植物miRNA前体，其中第一或第二寡核苷酸中的至少一种是与前体异源的，其中所述第一寡核苷酸基本上与所述第二寡核苷酸互补，并且所述第二寡核苷酸编码与选自SEQ ID NO：3、6、9、12、15、18、21、24和27的序列具有0、1、2或3个错配的miRNA，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增加的耐旱性。所述植物可为玉米植物或大豆植物。

在另一个实施方案中，本发明包括增加植物耐旱性的方法，所述方法包括：(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中多核苷酸具有的核酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ I D NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27进行比较时具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；和(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增加的耐旱性。所述方法可进一步包括：(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增加的耐旱性。

在另一个实施方案中，本发明包括评价植物耐旱性的方法，所述方法包括：(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中多核苷酸具有的核酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27进行比较时具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(c)评价该转基因植物在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时的耐旱性；所述方法可进一步包括：(d)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(e)评价该子代植物在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时的耐旱性。

在另一个实施方案中，本发明包括评价植物耐旱性的方法，所述方法包括：(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中多核苷酸具有的核酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27进行比较时具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；(c)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(d)评价该子代植物在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时的耐旱性。

在另一个实施方案中，本发明包括测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括：(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中多核苷酸具有的核酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27进行比较时具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(c)测定该转基因植物在与不包含该重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。所述方法可进一步包括：(d)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(e)测定该子代植物在与不包含该重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。此外，所述测定步骤(c)可包括测定所述转基因植物在水限制条件下与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。此外，所述测定步骤(e)可包括测定所述子代植物在水限制条件下与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

在另一个实施方案中，本发明包括测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括：(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中多核苷酸具有的核酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27进行比较时具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；(c)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(d)测定该子代植物在与不包含该重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。所述测定步骤(d)可进一步包括测定所述转基因植物在水限制条件下与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

附图简述和序列表

根据以下的详细描述和附图以及序列表，可更全面地理解本发明，以下的详细描述和附图以及序列表形成本申请的一部分。

图1是pBC载体的示意图(SEQ ID NO：40)。

图2示出载体pDONR^TM/Zeo(SEQ ID NO：41)的图谱。attP1位点位于核苷酸570-801；attP2位点位于核苷酸2754-2985(互补链)。

图3示出载体pDONR^TM221(SEQ ID NO：42)的图谱。attP1位点位于核苷酸570-801；attP2位点位于核苷酸2754-2985(互补链)。

图4示出载体pBC-yellow(SEQ ID NO：43)的图谱，该载体是用于构建拟南芥属表达载体的目的载体。attR1位点位于核苷酸11276-11399(互补链)；attR2位点位于核苷酸9695-9819(互补链)。

图5示出PHP27840(SEQ ID NO：44)的图谱，该载体是用于构建大豆表达载体的目的载体。attR1位点位于核苷酸7310-7434；attR2位点位于核苷酸8890-9014。

图6示出PHP23236(SEQ ID NO：45)的图谱，是用于构建Gaspe Flint来源的玉米品系的表达载体的目的载体。attR1位点位于核苷酸2006-2130；attR2位点位于核苷酸2899-3023。

图7示出PHP10523(SEQ ID NO：46)的图谱，该载体是存在于农杆菌菌株LBA4404中的质粒DNA(Komari等人，Plant J.10：165-174(1996)；NCBI通用标识符59797027)。

图8示出PHP23235(SEQ ID NO：47)的图谱，它是用于构建目的载体PHP23236的载体。

图9示出PHP28647(SEQ ID NO：48)的图谱，它是用于玉米自交系来源的品系的目的载体。attR1位点位于核苷酸2289-2413；attR2位点位于核苷酸3869-3993。

图10示出AtmiR827超表达品系1至9加野生型对照(Col-0)的Northern印迹分析结果。

图11示出AtmiR827超表达品系2与对照植物相比较的耐旱性。相似结果可见于品系1。

图12示出AtmiR827超表达品系2与对照植物(Col-0)相比较的发芽抑制ABA超敏性。

SEQ ID NO：1-39在表1中描述。

表1

编码植物miR827多核苷酸和靶蛋白的序列

SEQ ID NO：40是15.3kb的pBC载体的核苷酸序列。

SEQ ID NO：41是

供体载体pDONR^TM/Zeo的核苷酸序列。

SEQ ID NO：42是

供体载体pDONR^TM/221的核苷酸序列。

SEQ ID NO：43是pBC-yellow的核苷酸序列，pBC-yellow是用于拟南芥属的目的载体。

SEQ ID NO：44是PHP27840的核苷酸序列，PHP27840是用于大豆的目的载体。

SEQ ID NO：45是PHP23236的核苷酸序列，PHP23236是用于Gaspe Flint来源的玉米品系的目的载体。

SEQ ID NO：46是PHP10523的核苷酸序列(Komari等人，Plant J.10：165-174(1996)；NCBI通用标识符59797027)。

SEQ ID NO：47是PHP23235的核苷酸序列，PHP23235是用于Gaspe Flint来源的品系的目的载体。

SEQ ID NO：48是PHP28647的核苷酸序列，PHP28647是用于玉米自交来源品系的目的载体。

SEQ ID NO：49是attB1位点的核苷酸序列。

SEQ ID NO：50是attB2位点的核苷酸序列。

SEQ ID NO：51是AtmiR827pre-5’attB正向引物的核苷酸序列，它包含attB1序列，用于扩增At-miR827-编码区。

SEQ ID NO：52是AtmiR827pre-3’attB反向引物的核苷酸序列，它包含attB2序列，用于扩增At-miR827-编码区。

SEQ ID NO：53是VC062引物的核苷酸序列，它包含T3启动子和attB1位点，用于扩增克隆进II SK(+)载体(Stratagene)的cDNA插入序列。

SEQ ID NO：54是VC063引物的核苷酸序列，它包含T7启动子和attB2位点，用于扩增克隆进

II SK(+)载体(Stratagene)的cDNA插入序列。

SEQ ID NO：55是用于小RNA RT-PCR的5’RNA衔接子的核苷酸序列。

SEQ ID NO：56是用于小RNA RT-PCR的3’RNA衔接子的核苷酸序列。

序列描述以及相关联的序列表遵循如37C.F.R.§1.821-1.825中所列出的管理专利申请中的核苷酸和/或氨基酸序列公开的规则。

序列表包含核苷酸序列字符的单字母码以及氨基酸的三字母码，如遵照IUPAC-IUBMB标准所定义的，该标准在Nucleic Acids Res.13：3021-3030(1985)以及在Biochemical J.219(No.2)：345-373(1984)中有所描述，这两篇文献以引用的方式并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§1.822中提出的规则。

发明详述

本文中所列出的每篇参考文献的公开内容均全文以引用方式并入本文。

如本文所用的并在所附权利要求书中的单数形式“一个”和“所述”包括复数涵义，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一株植物”的涵义包括多株该类植物。“一个细胞”的涵义包括一个或多个细胞及其本领域的技术人员已知的等同物，等等。

与本申请有关的信息可参见于2004年10月12日提交的美国专利申请10/963,238和10/963,394。上述专利申请全文引入本文以供参考。

其他可用于理解本发明的参考文献包括2004年8月6日提交的美国专利申请10/913,288；和2006年1月6日提交的美国专利申请11/334,776。

小RNA在控制基因表达中起重要作用。包括开花在内的很多发育过程是由小RNA控制的。现在有可能通过使用在植物中产生小RNA的转基因构建体来以工程手段改变植物基因的基因表达。

本发明提供了用于抑制靶序列的方法和组合物。本发明的组合物可用于任何类型的植物细胞，以及包含适当的加工成分(例如RNA干扰成分)的其他细胞，包括无脊椎动物和脊椎动物细胞。本发明组合物和方法是基于在拟南芥属中发现的内源性miRNA沉默过程，类似策略也用于扩大组合物和使用这些方法的生物体的数量。可让本发明方法适于在任何真核细胞系统中实施。此外，本文所述组合物和方法可用于培养物中的个体细胞、细胞或组织，或者在体内用于生物体，或者用于器官或生物体的其他部分。

本发明的组合物通过编码与靶序列区域具有显著互补性的miRNA而选择性地抑制靶序列。miRNA在核酸构建体中提供，当转录成RNA时，预计所述核酸构建体会形成发夹结构，细胞加工该发夹结构以产生miRNA，而miRNA抑制靶序列的表达。

本申请公开了编码来自玉米的miRNA的核酸序列。还公开了含有个体miRNA序列的骨架发夹。描述了用于miRNA及其骨架的转基因表达的构建体。或者，描述了构建体，其中骨架序列与miRNA序列交换，由此改变转基因宿主中miRNA及其随后的特定靶序列的表达模式。任何miRNA可与任何其他骨架交换，以产生新的miRNA/骨架杂合体。

本申请提供了抑制靶序列的方法。该方法利用上面所述的任一构建体，其中设计miRNA来识别靶序列区域，并且插入到构建体内。在导入到细胞内后，产生的miRNA抑制靶序列的表达。靶序列可为内源性植物序列，或者是植物中的异源转基因。

本文还提及了靶基因，例如来自植物病原体，例如致病病毒、线虫、昆虫、霉菌或真菌的基因。

本发明的另一个方面涉及包含构建体和/或miRNA的植物、细胞和种子。通常，细胞是得自植物的细胞，但是也可为其他原核细胞或真核细胞，包括但不限于病毒、细菌、酵母、昆虫、线虫或动物细胞。植物细胞包括来自单子叶植物(monocots)和双子叶植物(dicots)的细胞。本发明还提供了包含构建体和/或miRNA的植物和种子。

如本文所用：

本文互换使用的术语“微RNA”或“miRNA”指调节包含靶序列的多核苷酸表达的寡核糖核酸。“成熟miRNA”是指从miRNA前体加工产生的miRNA。“miRNA模板”是核酸构建体中编码miRNA的区域。miRNA的“背面”区域是与miRNA模板基本上互补，并且预计与miRNA模板碱基配对的多核苷酸构建体的部分。miRNA模板和背面可形成包括发夹结构的双链多核苷酸。

本文互换使用的术语“结构域”或“功能结构域”指能够引起植物生物学应答的核酸序列。本发明涉及由单独起作用或者与其他miRNA序列协同起作用的至少21种核苷酸序列组成的miRNA，由此，结构域可指个体miRNA或miRNA群。而且，与其骨架序列有关的miRNA序列可被认为是用于将miRNA加工成其活性形式的结构域。本文所用的“亚结构域”或“亚功能结构域”是指能够引起植物中的生物反应的结构域的亚序列。miRNA可被认为是骨架序列的亚结构域。“邻接”的序列或结构域是指顺序连接的、在结构域之间没有额外核苷酸插入的序列。

术语“靶序列””和“所关注序列”在本文中可互换使用。靶序列是用于指选择用来改变(例如阻抑)表达的核酸序列，并且其不限于编码多肽的多核苷酸。靶序列包括与miRNA基本上或完全互补的序列。靶序列包括但不限于包含靶序列的RNA、DNA或多核苷酸。如Bartel和Bartel(2003)Plant Phys.132：709-719中所讨论的那样，大部分微RNA序列是20-22个核苷酸，当与其靶序列比较时，在任何位置具有0、1、2或3个错配。

在某些实施方案中，相对于靶序列，miRNA模板(即编码miRNA的多核苷酸)以及由此miRNA可包含某些错配。在某些实施方案中，与靶序列相比，miRNA模板具有≥1个核苷酸错配，例如，与靶序列相比，miRNA模板可具有1、2、3、4、5或更多个错配。错配程度还可通过确定miRNA模板与靶序列的互补序列的同一性百分比来描述。例如，与靶序列的互补序列相比，miRNA模板可具有包括约至少70％、75％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性百分比。

在某些实施方案中，相对于miRNA背面，miRNA模板(即编码miRNA的多核苷酸)以及由此miRNA可包含某些错配。在某些实施方案中，与miRNA背面相比，miRNA模板具有≥1个核苷酸错配，例如，与miRNA背面相比，miRNA模板可具有1、2、3、4、5或更多个错配。错配程度还可通过确定miRNA模板与miRNA背面的互补序列的同一性百分比来描述。例如，与miRNA背面的互补序列相比，miRNA模板可具有包括约至少70％、75％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性百分比。

人工miRNA前体的设计在PCT国际专利公布WO2005/035769A2和WO2006/044322A2中提供，其内容以引用方式并入本文。

“表达序列标签”(“EST”)是得自cDNA文库的DNA序列，并且因此是已经被转录的序列。EST通常通过cDNA插入序列单程测序获取。将完整的cDNA插入序列称为“全长插入序列”(“FIS”)。“重叠群”序列是由选自但不限于EST、FIS和PCR序列的两个或更多个序列装配成的序列。将编码完整或功能性蛋白的序列称为“完全基因序列”(“CGS”)，该序列可得自FIS或重叠群。

“农学特性”是可测量的参数，包括但不限于绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、收获指数、茎倒伏、植株高度、穗高和穗长。

“转基因”指其基因组因异源核酸(如重组DNA构建体)的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性生殖而产生的那些。如本文所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)改变。

“基因组”在用于植物细胞时不仅涵盖存在于细胞核中的染色体DNA，而且还包括存在于细胞的亚细胞组分(如线粒体、质粒)中的细胞器DNA。

“植物”包括整个植株、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及同一植株的子代。植物细胞包括但不限于得自下列物质的细胞：种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。

“子代”包括植物的任何后续世代。

“转基因植物”包括在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。例如异源多核苷酸被稳定地整合进基因组中，使得该多核苷酸传递至连续的世代。异源多核苷酸可单独地或作为重组DNA构建体的部分整合进基因组中。

针对序列而言的“异源”意指来自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。

“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用并且是任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基的单链或双链RNA或DNA聚合物。核苷酸(通常以它们的5′-单磷酸形式存在)通过如下它们的单个字母名称来指代：“A”为腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别对应RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，并且“N”表示任何核苷酸。

“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰形式，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。

“信使RNA(mRNA)”指无内含子并且可通过细胞翻译成蛋白质的RNA。

“cDNA”指与mRNA模板互补并且利用逆转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可为单链的或者可用DNA聚合成酶I的Klenow片段转化成双链形式。

“成熟”蛋白质指经翻译后加工的多肽；即已经去除了存在于初级翻译产物中的任何前肽或原肽的多肽。

“前体”蛋白质指mRNA的翻译初级产物；即具有仍然存在的前肽和原肽。前肽和原肽可为并且不限于细胞内定位信号。

“分离的”指物质，例如核酸和/或蛋白质，该物质基本上不含在天然存在的环境中通常伴随该物质或与其反应的组分，或者说是该物质被从所述组分移出。分离的多核苷酸可从它们天然存在的宿主细胞中纯化。技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得分离的多核苷酸。该术语也涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。

“重组体”指(例如)通过化学合成或者通过用基因工程技术操纵分离的核酸片段来实现的两个原本分离的序列片段的人工组合。“重组体”也包括指已经通过引入异源核酸而进行了修饰的细胞或载体，或源于经这样修饰的细胞的细胞，但不涵盖由天然发生的事件(如自发突变、自然转化/转导/转座)对细胞或载体的改变，例如没有蓄意人为干扰而发生的那些。

“重组DNA构建体”指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，重组DNA构建体可包含源于不同来源的调控序列和编码序列，或源于相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。

术语“入门克隆”和“入门载体”本文可互换使用。

“调控序列”指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。术语“调控序列”和“调控元件”在本文中可互换使用。

“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。

“植物启动子功能”是能够控制植物细胞中的转录的启动子，无论其是否来源于植物细胞。

“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可互换使用，并且指主要但非必须专一地在一种组织或器官中表达，而是也可在一种特定细胞中表达的启动子。

“发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。

术语“可操作地连接”指核酸片段连接成单一片段，使得其中一个核酸片段的功能受到另一个核酸片段的调控。例如，在启动子能够调节核酸片段的转录时，该启动子与该核酸片段进行了可操作地连接。

“表达”指功能产物的产生。因此，核酸片段的表达可指核酸片段的转录(如生成mRNA或功能RNA的转录)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。

“表型”意指细胞或生物体的可检测的特征。

有关将核酸片段(例如重组DNA构建体)插入细胞内的“导入”是指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括指将核酸片段整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸片段可整合进细胞的基因组(如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)内，转变成自主的复制子或瞬时表达(如转染的mRNA)。

“转化细胞”是将核酸片段(如重组DNA构建体)引入其中的任何细胞。

本文所用的“转化”指稳定转化和瞬时转化两者。

“稳定转化”指将核酸片段引入宿主生物体的基因组中，导致基因稳定遗传。一旦稳定转化，核酸片段稳定地整合进宿主生物体和任何连续世代的基因组中。

“瞬时转化”指将核酸片段引入宿主生物体的核中或包含DNA的细胞器中，引起基因表达而没有基因稳定遗传。

“等位基因”是占据染色体上给定位点的基因的几种供选择形式的其中一种。当二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因相同时，该植物在该基因座处是纯合的。如果二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因不同，则该植物在该基因座处是杂合的。如果转基因存在于二倍体植物中一对同源染色体中的其中之一上，则该植物在该基因座处是半合子的。

序列比对和同一性百分比可用设计用于检测同源序列的多种比较方法来测定，这些方法包括但不限于

生物信息计算包(

Inc.，Madison，WI)的

程序。除非另外说明，本文提供的序列的多重比对用Clustal V比对方法(Higgins和Sharp，1989，CABIOS.5：151-153)采用默认参数(空位罚分＝10，空位长度罚分＝10)执行。用Clustal V方法进行成对比对和蛋白质序列的同一性百分比计算的默认参数为KTUPLE＝1、空位罚分(GAP PENALTY)＝3、窗口(WINDOW)＝5和DIAGONALS SAVED＝5。而对于核酸，这些参数为KTUPLE＝2，空位罚分＝5，窗口＝4和DIAGONALS SAVED＝4。用Clustal V程序比对序列后，可通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“同一性百分比”和“趋异”值。除非另外说明，本文提供的和申明的同一性百分比和趋异度是以该方式计算。

本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor，1989(下文称为“Sambrook”)。

现在转向实施方案：

实施方案包括分离的多核苷酸和多肽、用于提供耐旱性的重组DNA构建体、包含这些重组DNA构建体的组合物(例如植物或种子)，以及利用这些重组DNA构建体的方法。

分离的多核苷酸和多肽：

本发明包括如下分离的多核苷酸和多肽：

分离的多核苷酸，其包含：(i)核酸序列，所述核酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27进行比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性；或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列，其中所述全长互补序列和(i)的所述核酸序列由相同数目的核苷酸组成并且是100％互补的。任一上述分离的多核苷酸可用于本发明的任何重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)。所述多核苷酸优选地编码miR827序列。

分离的多肽，所述多肽的氨基酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：29、31、33、35、37或39进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性。所述多肽优选是SPX/MFS或SPX/RING蛋白。

重组DNA构建体和抑制DNA构建体：

在一个方面，本发明包括重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)。

在一个实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(如在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括(i)核酸序列，所述核酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ IDNO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27进行比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列。

在另一个实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(如，在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码miR827序列。例如，miR827序列来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、烟豆(Glycine tabacina)、野大豆(Glycine soja)和短绒野大豆(Glycine tomentella)。

在另一个实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件(例如在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码包含第一和第二寡核苷酸的修饰的植物miRNA前体，其中第一或第二寡核苷酸中的至少一种是与前体异源的，其中第一寡核苷酸基本上与第二寡核苷酸互补，并且第二寡核苷酸所编码的miRNA与选自SEQ ID NO：3、6、9、12、15、18、21、24和27的序列具有0、1、2或3个错配，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增加的耐旱性。

在另一方面，本发明包括抑制DNA构建体。

抑制DNA构建体可包含至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)，该调控序列可操作地连接至：(a)以下序列的全部或部分：(i)核酸序列，所述核酸序列的序列基于Clustal V比对方法在与SEQID NO：28、30、32、34、36或38进行比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或(ii)(a)(i)的核酸序列的全长互补序列；或者(b)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的区域，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码SPX/MFS或SPX/RING蛋白；抑制DNA构建体可包含共抑制构建体、反义构建体、病毒抑制构建体、发夹抑制构建体、茎环抑制构建体、产生双链RNA的构建体、RNAi构建体或小RNA构建体(如，siRNA构建体或miRNA构建体)。

应当理解(正如本领域技术人员将会理解的)，本发明不仅仅涵盖这些具体的示例性序列。导致给定位点处产生化学上等价的氨基酸但不影响所编码多肽的功能特性的核酸片段中的改变是本领域众所周知的。因此，氨基酸丙氨酸(一种疏水性氨基酸)的密码子可被编码另一个疏水性较弱的残基(例如甘氨酸)或疏水性较强的残基(例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致一个带负电荷的残基替换为另一个带负电荷的残基(例如，天冬氨酸替代谷氨酸)或者一个带正电荷的残基替换为另一个带正电荷的残基(例如，赖氨酸替换精氨酸)的改变也可预期产生功能上等价的产物。导致多肽分子的N-末端和C-末端部分改变的核苷酸变化也将预计不会改变多肽的活性。所提出的修饰中的每一种均完全在本领域常规技术内，如测定所编码的产物的生物活性的保留。

“抑制DNA构建体”是在转化或稳定整合进植物基因组时，导致该植物中的靶基因“沉默”的重组DNA构建体。对该植物来说，该靶基因可为内源性的或是转基因的。如本文针对靶基因所使用的，“沉默”通常指在由靶基因表达的mRNA或蛋白质/酶的水平上的抑制，和/或在酶活性或蛋白质功能性的水平上的抑制。本文中可交换使用的术语“抑制”、“抑制性”以及“沉默”包括降低、减少、减退、减小、抑制、消除或防止。“沉默”或“基因沉默”不确定机理并且包括但不限于反义、共抑制、病毒-抑制、发夹抑制、茎-环抑制、基于RNAi的方法以及基于小RNAi的方法。

抑制DNA构建体可包含源自所关注的靶基因的区域并且可包含所关注的靶基因的有义链(或反义链)的核酸序列的全部或部分。取决于所要利用的方法，该区域可与所关注基因的有义链(或反义链)的全部或部分100％相同或者具有少于100％同一性的同一性(如，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同一性)。

抑制DNA构建体是本领域所熟知的，一旦选定所关注的靶基因就很容易构建，并且包括但不限于共抑制构建体、反义构建体、病毒-抑制构建体、发夹抑制构建体、茎-环抑制构建体、产生双链RNA的构建体，以及更通常的是，RNAi(RNA干扰)构建体和小RNA构建体，例如siRNA(短干扰RNA)构建体和miRNA(微RNA)构建体。

“反义抑制”指产生能够抑制靶基因或基因产物表达的反义RNA转录物。“反义RNA”指与靶初级转录物或mRNA的全部或部分互补，并阻断分离的靶核酸片段表达的RNA转录物(美国专利号：5,107,065)。反义RNA可与特定基因转录物的任何部分，即5′非编码序列、3′非编码序列、内含子或编码序列互补。

“共抑制”指产生能够抑制靶基因或基因产物表达的有义RNA转录物。“有义”RNA指包括mRNA并且可在细胞内或体外翻译成蛋白质的RNA转录物。此前，已通过着眼于以有义方向过表达与内源mRNA具有同源性的核酸序列(其导致与过表达的序列具有同源性的所有RNA减少)设计出了植物中的共抑制构建体(参见Vaucheret等人，Plant J.，16：651-659(1998)；以及Gura，Nature 404：804-808(2000))。

另一种变型描述了将植物病毒序列用于引导对近端mRNA编码序列的抑制(于1998年8月20日公开的PCT公开WO 98/36083)。

此前描述的是“发夹”结构的利用，该结构以互补方向整合mRNA编码序列的全部或部分，导致已表达的RNA形成潜在的“茎-环”结构(于1999年10月21日公开的PCT公开WO99/53050)。在这种情况下，茎由对应相对于启动子以有义或反义方向插入的相关基因的多核苷酸形成，并且环由一些相关基因的多核苷酸形成，在构建体中该多核苷酸不具有互补序列。这增加了获得的转基因植物中的共抑制或沉默频率。关于发夹抑制的综述，参见Wesley，S.V.等人，2003，Methods in Molecular Biology，Plant Functional Genomics：Methods and Protocols 236：273-286。

其中茎由至少30个来自待抑制基因的核苷酸形成而环由任意的核苷酸序列形成的构建体也已经有效地用于抑制(于1999年12月2日公开的PCT公开WO 99/61632)。

使用聚-T和聚-A序列产生茎-环结构中的茎已经有所描述(于2002年1月3日公开的PCT公开WO 02/00894)。

然而另一种变型涉及使用合成的重复序列来促进茎-环结构中的茎的形成。用这种重组DNA片段产生的转基因生物体已经显示由形成茎环结构的核苷酸片段编码的蛋白质的水平降低，如于2002年1月3日公开的PCT公开WO 02/00904中所述。

RNA干扰是指由短干扰性RNA(siRNA)介导的动物中序列特异性转录后基因沉默的过程(Fire等人，Nature 391：8061998)。在植物中的对应过程通常称为转录后基因沉默(PTGS)或RNA沉默，并且在真菌中也称为阻抑作用(quelling)。据信转录后基因沉默过程是用于防止外来基因表达的进化保守性细胞防御机制，并且通常由不同植物区系和门所共有(Fire等人，Trends Genet.15：358(1999))。这种防止外来基因表达的保护作用可能是通过特异性破坏病毒基因组RNA的同源单链RNA的细胞反应，响应源自病毒感染或源自转座因子随机整合到宿主基因组内的双链RNA(dsRNA)的生成而进化而来。dsRNA在细胞中的存在通过还没有完全表征的机制引发了RNAi反应。

细胞中长dsRNA的存在刺激了称为dicer的核糖核酸酶III的活性。Dicer涉及使dsRNA加工成称为短干扰RNA(siRNA)的短dsRNA片段(Berstein等人，Nature 409：363 2001)。源自dicer活性的短干扰性RNA的长度通常是约21至约23个核苷酸，并且包含约19个碱基对的双链体(Elbashir等人，Genes Dev.15：188(2001))。还有人提出Dicer参与从保守结构的前体RNA上切下21-和22-核苷酸小分子时序RNA(stRNA)，所述小分子时序RNA参与翻译控制(Hutvagner等人，2001，Science 293：834)。RNAi应答还涉及内切核酸酶复合物，通常称为RNA诱导沉默复合物(RISC)，其介导具有与siRNA双链体的反义链互补的序列的单链RNA的裂解。靶RNA的裂解在与siRNA双链体的反义链互补的区域中间发生。此外，RNA干扰还涉及小RNA(如miRNA)介导的基因沉默，可推定是通过调节染色质结构并由此防止靶基因序列转录的细胞机制(参见例如Allshire，Science 297：1818-1819(2002)；Volpe等人，Science 297：1833-1837(2002)；Jenuwein，Science 297：2215-2218(2002)；以及Hall等人，Science 297：2232-2237(2002))。这样，本发明的miRNA分子可用于通过与RNA转录物相互作用或者作为另一种选择通过与特定基因序列相互作用来介导基因沉默，其中这样的相互作用导致在转录或转录后水平上的基因沉默。

已经在多种系统中研究了RNAi。Fire等人(Nature 391：806(1998))首次在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)中观察到RNAi。Wianny和Goetz(Nature Cell Biol.2：70(1999))描述了在小鼠胚胎中由dsRNA介导的RNAi。Hammond等人(Nature 404：293(2000))描述了在用dsRNA转染的果蝇(Drosophila)细胞中的RNAi。Elbashir等人，(Nature 411：4942001)描述了通过在包括人胚胎肾和HeLa细胞的培养的哺乳动物细胞中导入合成21-核苷酸RNA的双链体而诱导的RNAi。

小RNA在控制基因表达中起重要作用。很多发育过程(包括开花)的调节是由小RNA控制的。现在有可能通过使用在植物中产生小RNA的转基因构建体来以工程手段改变植物基因的基因表达。

小RNA似乎是通过与互补RNA或DNA靶序列碱基配对来行使功能的。当与RNA结合时，小RNA或者引发靶序列的RNA裂解或者引发翻译抑制。当与DNA靶序列结合时，据信小RNA可介导靶序列的DNA甲基化。无论具体机制是什么，这些事件的后果是基因表达受到抑制。

据认为，小RNA和它们的RNA靶标之间的序列互补性有助于确定采用了哪种机制(RNA裂解或翻译抑制)。据信，优选与它们的靶标互补的siRNA通过RNA裂解起作用。一些miRNA与它们的靶基因具有完全或几乎完全的互补性，并且对于至少一些这样的miRNA，已经证实了RNA裂解。其他miRNA与它们的靶标具有若干错配，并且在翻译水平上明显抑制了它们的靶标。同样，无需坚持特定的作用机理，出现了这样一种一般规律：完全或几乎完全的互补性引起RNA裂解，而当miRNA/靶标双链体含有许多错配时倾向于翻译抑制。对于此规律的一个明显例外是植物中微RNA 172(miR172)。miR172的其中一个靶标是APETALA2(AP2)，尽管miR172与AP2具有几乎完全的互补性，但其表现出引起AP2的翻译抑制而不是引起RNA裂解。

微RNA(miRNA)是长度为约19至约24个核苷酸(nt)的已经在动物和植物中鉴定出的非编码RNA(Lagos-Quintana等人，Science294：853-8582001，Lagos-Quintana等人，Curr.Biol.12：735-739(2002)；Lau等人，Science 294：858-862(2001)；Lee和Ambros，Science 294：862-864(2001)；Llave等人，Plant Cell 14：1605-1619(2002)；Mourelatos等人，Genes.Dev.16：720-728(2002)；Park等人，Curr.Biol.12：1484-1495(2002)；Reinhart等人，Genes.Dev.16：1616-1626(2002))。它们是由大小为大约70至200nt的较长的前体转录物加工生成的，并且这些前体转录物能够形成稳定的发夹结构。在动物中，涉及加工miRNA前体的酶称为Dicer，这是一种核糖核酸酶III样蛋白(Grishok等人，Cell 106：23-34(2001)；Hutvagner等人，Science 293：834-838(2001)；Ketting等人，Genes.Dev.15：2654-2659(2001))。植物也具有Dicer样酶，DCL1(以前称为CARPELFACTORY/SHORT INTEGUMENTS1/SUSPENSOR1)，并且最近的证据表明，其象Dicer一样也涉及发夹前体的加工以产生成熟miRNA(Park等人，Curr.Biol.12：1484-1495(2002)；Reinhart等人，Genes Dev.16：1616-1626(2002))。此外，最近的研究已经清楚地表明，至少某些miRNA发夹前体最初是作为较长的聚腺苷酸化转录物存在，并且在单个转录物中可存在几种不同的miRNA以及相关发夹(Lagos-Quintana等人，Science 294：853-858(2001)；Lee等人，EMBO J.21：4663-4670(2002))。最近的研究还测定了从dsRNA产物的miRNA链选择，所述dsRNA产物是通过DICER加工发夹而产生的(Schwartz等人，Cell115：199-208(2003))。看起来，经加工的dsRNA的两端的稳定性(即G∶C对A∶U的含量比，和/或错配)影响链选择，具有低稳定性的末端更容易因解旋酶活性而解旋。低稳定性末端的5′末端链被整合至RISC复合物内，而另一条链被降解。

微RNA(miRNA)看起来通过与位于由这些基因产生的转录物中的互补序列结合来调节靶基因。就lin-4和let-7而言，靶位点位于靶mRNA的3′UTR中(Lee等人，Cell 75：843-854(1993)；Wightman等人，Cell75：855-862(1993)；Reinhart等人，Nature 403：901-906(2000)；Slack等人，Mol.Cell 5：659669(2000))，并且在lin-4和let-7miRNA与其靶位点之间有几个错配。结合lin-4或let-7miRNA似乎引起由靶miRNA编码的蛋白的稳态水平的下调，而不影响自身的转录物(Olsen和Ambros，Dev.Biol.216：671-680(1999))。另一方面，最近有证据表明，在某些情况下，miRNA可引起靶转录物在靶位点内特异性RNA裂解，并且该裂解步骤看起来需要miRNA与靶转录物之间具有100％的互补性(Hutvagner和Zamore，Science 297：2056-2060(2002)；Llave等人，Plant Cell 14：1605-1619(2002))。看起来有可能miRNA可进入至少两条靶基因调控途径：(1)当靶互补性＜100％时，蛋白下调；并且(2)当靶互补性是100％时，RNA裂解。进入RNA裂解途径的微RNA与在动物中RNA干扰(RNAi)期间以及在植物中转录后基因沉默(PTGS)期间产生的21-25nt短干扰RNA(siRNA)类似，并且可能整合进与在RNAi情况中观察到的复合物类似或相同的RNA诱导的沉默复合物(RISC)内。

用生物信息学鉴定miRNA的靶标在动物中没有成功，这可能是因为动物miRNA与它们的靶标具有低水平的互补性。另一方面，生物信息学方法已经成功地用于预测植物miRNA的靶标(Llave等人，Plant Cell 14：1605-1619(2002)；Park等人，Curr.Biol.12：1484-1495(2002)；Rhoades等人，Cell 110：513-520(2002))，因此，看起来植物miRNA与它们的推定靶标的整体互补性高于动物miRNA。植物miRNA的这些预测靶标中的大部分编码涉及植物发育模式或细胞分化的转录因子家族的成员。

调控序列：

本发明的重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)包含至少一种调控序列。

调控序列可为启动子。

多种启动子可用于本发明的重组DNA构建体中。可根据所需结果来选择启动子，并且可包括用于在宿主生物体中表达的组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子或其他启动子。

虽然候选基因当通过组成型启动子驱动表达时可预测其效应，但候选基因在35S或UBI启动子控制下的高水平、组成型表达可具有多重效应。使用组织特异和/或胁迫特异启动子可消除不需要的效应但保留耐旱性的能力。在拟南芥属中已经观察到了该效应(Kasuga等人(1999)Nature Biotechnol.17：287-91)；

适用于植物宿主细胞的组成型启动子包括(例如)Rsyn7启动子的核心启动子和在WO 99/43838和美国专利6,072,050中公开的其他组成型启动子；CaMV 35S核心启动子(Odell等人，Nature 313：810-812(1985))；稻肌动蛋白(McElroy等人，Plant Cell2：163-171(1990))；泛素启动子(Christensen等人，Plant Mol.Biol.12：619-632(1989)和Christensen等人，Plant Mol.Biol.18：675-689(1992))；pEMU(Last等人，Theor.Appl.Genet.81：581-588(1991))；MAS(Velten等人，EMBO J.3：2723-2730(1984))；ALS启动子(美国专利5,659,026)等。其他组成型启动子包括例如在美国专利5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611中公开的那些启动子。

在选择启动子用于本发明方法时，可能有利的是使用组织特异性启动子或发育调节启动子。

优选的组织特异性启动子或发育调节启动子是这样的DNA序列，该序列调节DNA序列选择性地在对雄穗发育、结籽或两者重要的植物细胞/组织中表达，并限制这种DNA序列只在植物的雄穗发育或种子成熟期间表达。任何引起所需时空表达的可鉴定启动子均可用于本发明的方法中。

种子或胚特异性的并且可用于本发明的启动子包括大豆Kunitz胰蛋白酶抑制剂(Kti3，Jofuku和Goldberg，Plant Cell 1：1079-1093(1989))、patatin(马铃薯块茎)(Rocha-Sosa，M.等人，1989，EMBO J.8：23-29)、convicilin、豌豆球蛋白和豆球蛋白(豌豆子叶)(Rerie，W.G.等人，1991，Mol.Gen.Genet.259：149-157；Newbigin，E.J.等人，1990，Planta 180：461-470；Higgins，T.J.V.等人，1988，Plant.Mol.Biol.11：683-695)、玉米蛋白(玉米胚乳)(Schemthaner，J.P.等人，1988，EMBO J.7：1249-1255)、菜豆蛋白(菜豆子叶)(Segupta-Gopalan，C.等人，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3320-3324)、植物血球凝集素(菜豆子叶)(Voelker，T.等人，1987，EMBO J. 6：3571-3577)、B-伴球蛋白和大豆球蛋白(大豆子叶)(Chen，Z-L等人，1988，EMBO J.7：297-302)、谷蛋白(稻胚乳)、大麦醇溶蛋白(大麦胚乳)(Marris，C.等人，1988，Plant Mol.Biol.10：359-366)、麦谷蛋白和麦醇溶蛋白(小麦胚乳)(Colot，V.等人，1987，EMBO J.6：3559-3564)和甘薯贮藏蛋白(sporamin)(甘薯块根)(Hattori，T.等人，1990，Plant Mol.Biol.14：595-604)。可操作地连接至嵌合基因构建体异源编码区的种子特异性基因的启动子在转基因植物中保持它们的时空表达模式。这样的实施例包括在拟南芥和甘蓝型油菜(Brassica napus)种子中表达脑啡肽的拟南芥属2S种子储藏蛋白基因启动子(Vanderkerckhove等人，Bio/Technology 7：L929-932(1989))、表达荧光素酶的菜豆凝集素和β-菜豆蛋白启动子(Riggs等人，Plant Sci.63：47-57(1989))，以及表达氯霉素乙酰转移酶的小麦谷蛋白启动子(Colot等人，EMBO J6：3559-3564(1987))。

可诱导启动子响应内源性或外源性刺激的存在，例如，通过化合物(化学诱导剂)，或响应环境、激素、化学信号和/或发育信号而选择性表达可操纵连接的DNA序列。可诱导的或受调控的启动子包括(例如)受光、热、胁迫、水涝或干旱、植物激素、创伤或诸如乙醇、茉莉酮酸酯、水杨酸或安全剂之类的化学品调控的启动子。

用于本发明的启动子可包括以下启动子：1)胁迫诱导型RD29A启动子(Kasuga等人，1999，Nature Biotechnol.17：287-91)；2)大麦启动子B22E；B22E的表达是发育中的玉米籽粒中的柄所特异性的(“Primary Structure of a Novel Barley Gene Differentially Expressed in Immature Aleurone Layers(在未成熟糊粉层中差异表达的新大麦基因的一级结构)”。Klemsdal，S.S.等人，Mol.Gen.Genet.228(1/2)：9-16(1991))；和3)玉米启动子，Zag2(“Identification and molecular characterization of ZAGl，the maize homolog of the Arabidopsis floral homeotic gene AGAMOUS”，Schmidt，R.J.等人，Plant Cell 5(7)：729-737(1993)；“Structural characterization，chromosomal localization and phylogenetic evaluation of two pairs of AGAMOUS-like MADS-box genes from maize”，Theissen等人，Gene 156(2)：155-166(1995)；NCBI GenBank Accession X80206))。Zag2转录物可在授粉前5天至授粉后(DAP)7至8天被检测到，并且引导Ciml在发育中的雌花序的心皮中表达，Ciml对发育中的玉米籽粒的籽仁而言是特异性的。Ciml转录物在授粉前4至5天至授粉后6至8天被检测到。其他可用的启动子包括可源自其表达与发育中的雌小花母系相关的基因的任何启动子。

用于调控本发明的核苷酸序列在植物中表达的启动子是茎特异性启动子。这种茎特异性启动子包括苜蓿S2A启动子(GenBank登录号：EF030816；Abrahams等人，Plant Mol.Biol.27：513-528(1995))和S2B启动子(GenBank登录号：EF030817)等等，这些文献以引用的方式并入本文。

启动子可整个源于天然基因，或者由源于不同的天然存在的启动子的不同元件组成，或者甚至包括合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件而引导基因的表达。还应认识到，由于在大多数情况下还不能完全确定调控序列的确切范围，一些变型的DNA片段可能具有相同的启动子活性。在多数情况下引起基因在大多数细胞型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。目前不断在发现可用于植物细胞中的不同类型的新启动子；在Okamuro，J.K.和Goldberg，R.B.，Biochemistry of Plants 15：1-82(1989)的汇编中可找到许多实例。

附加启动子可包括：RIP2、mLIP15、ZmCOR1、Rab17、CaMV 35S、RD29A、B22E、Zag2、SAM合成酶、泛素、CaMV 19S、nos、Adh、蔗糖合成酶、R-等位基因、维管组织优选启动子S2A(Genbank登录号EF030816)和S2B(Genbank登录号EF030817)及来自玉米的组成型启动子GOS2。其他启动子可包括根优选的启动子，例如玉米NAS2启动子、玉米Cyclo启动子(US 2006/0156439，公开于2006年7月13日)、玉米ROOTMET2启动子(WO05063998，公开于2005年7月14日)、CR1BIO启动子(WO06055487，公开于2006年5月26日)、CRWAQ81(WO 05035770，公开于2005年4月21日)和玉米ZRP2.47启动子(NCBI登录号：U38790；GI No.1063664)、

本发明的重组DNA构建体也可包括其他调控序列，包括但不限于翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。在本发明的另一个实施方案中，本发明的重组DNA构建体还包括增强子或沉默子。

内含子序列可加至5’非翻译区、蛋白编码区或3’非翻译区以增加积聚在胞浆中的成熟信息的量。已经显示，在植物和动物两者的表达构建体的转录单位中包含可剪接内含子可使基因表达在mRNA和蛋白质水平上均增强高达1000倍。参见Buchman和Berg，Mol.Cell Biol.8：4395-4405(1988)；Callis等人，Genes Dev.1：1183-1200(1987)。这种内含子对基因表达的增强通常在将其设置接近转录单位的5’端时为最大。玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6、Bronze-1内含子的使用是本领域已知的。通常参见The Maize Handbook，第116章，Freeling和Walbot(编辑)，Springer，纽约(1994)。

如果期望进行多肽表达，则通常希望在多核苷酸编码区的3′-端处包含有多腺苷酸化区。该多腺苷酸化区可源自天然基因，源自多种其他植物基因或源自T-DNA。要加入的3′端序列可源自(例如)胭脂碱合成酶或章鱼碱合成酶基因，或作为选择源自另外的植物基因，或源自任何其他真核基因。

“翻译前导序列”指位于基因启动子序列和编码序列之间的DNA序列。翻译前导序列存在于翻译起始序列的经完全加工后的mRNA上游。翻译前导序列可影响mRNA的初级转录过程、mRNA稳定性或翻译效率。翻译前导序列的实例已经有所描述(Turner，R.和Foster，G.Molecular Biotechnology 3：225(1995))。

任何植物都可选择用来鉴定将用于本发明重组DNA构建体的调控序列和miR827序列。适用于分离基因和调控序列的靶植物的实例应该包括但不限于苜蓿、苹果、杏、拟南芥属、洋蓟、芝麻菜、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆类、甜菜、黑莓、蓝莓、西兰花、抱子甘蓝、卷心菜、卡诺拉、香瓜、胡萝卜、木薯、蓖麻、菜花、芹菜、樱桃、菊苣、芜荽、柑桔类、克莱门氏小柑橘类、三叶草、椰子、咖啡、玉米、棉、蔓越莓、黄瓜、花旗松、茄子、菊苣、茅菜、桉树、茴香、无花果、大蒜、葫芦、葡萄、柚子树、白兰瓜、豆薯、猕猴桃、生菜、韭葱、柠檬、酸橙、火炬松、亚麻子、芒果、甜瓜、蘑菇、油桃、坚果、燕麦、油棕、油菜、秋葵、橄榄树、洋葱、橙、观赏植物、棕榈、木瓜树、欧芹、欧洲防风草、豌豆、桃树、花生、梨树、胡椒、柿树、松树、菠萝、大蕉、李树、石榴树、白杨、马铃薯、南瓜、温柏、辐射松、红菊苣、萝卜、油菜、树莓、稻、黑麦、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、枫香树、柑橘、茶、烟草、蕃茄、黑小麦、草皮草、芜菁、葡萄树、西瓜、小麦、薯蓣和西葫芦。

组合物：

本发明的组合物是其基因组中包含本发明的任何重组DNA构建体(包括任何抑制DNA构建体)(例如上面所讨论的任何一种构建体)的植物。组合物也包括任何植物的子代，以及获取自植物或其子代的任何种子，其中所述子代或种子在其基因组中包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)。子代包括通过植物的自花授粉或异型杂交而获得的连续世代。子代也包括杂交种和自交系。

在杂交种子繁殖的农作物中，成熟的转基因植物可自花授粉而产生纯合的自交系植物。该自交系植物产生含有新引入的重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的种子。这些种子可生长而产生将会表现出改变的农学特性(例如，任选地在水限制条件下农学特性增加)的植物，或者可用于育种程序以产生杂交种子，这些杂交种子可生长而产生将会表现出如改变的农学特性的植物。所述种子可为玉米种子。

植物可为单子叶植物或双子叶植物，例如玉米或大豆植物，如玉米杂种植物或玉米自交系植物。植物还可为向日葵、高梁、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦或黍。

重组DNA构建体可稳定地整合进植物的基因组中。

实施方案包括但不限于以下实施方案：

1.在基因组中包含重组DNA构建体的植物(例如玉米或大豆植物)，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸的序列在与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27进行比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增加的耐旱性。在与该对照植物比较时，该植物进一步表现出至少一种农学特性的改变。

2.在基因组中包含重组DNA构建体的植物(例如玉米或大豆植物)，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码miR827序列，并且其中在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时，所述植物表现出增加的耐旱性。在与该对照植物比较时，该植物还可表现出至少一种农学特性的改变。

3.在基因组中包含重组DNA构建体的植物(在例如玉米或大豆植物)，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码miR827序列，并且其中在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时，所述植物表现出至少一种农学特性的改变。

4.在基因组中包含重组DNA构建体的植物(例如玉米或大豆植物)，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸的序列在与SEQ I D NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27进行比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种农学特性的改变。

5.在基因组中包含抑制DNA构建体的植物(例如玉米或大豆植物)，所述抑制DNA构建体包含至少一种可操作地连接至源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域的调控元件，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码SPX/MFS或SPX/RING蛋白，并且其中在与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物进行比较时，所述植物表现出至少一种农学特性的改变。

6.在基因组中包含抑制DNA构建体的植物(例如玉米或大豆植物)，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控元件，该调控元件可操作地连接至以下序列的全部或部分：(a)核酸序列，所述核酸序列的序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：28、30、32、34、36或38进行比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或(b)(a)的核酸序列的全长互补序列，并且其中所述植物在与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物进行比较时表现出至少一种农学特性的改变。

7.在基因组中包含重组DNA构建体的植物(例如玉米或大豆植物)，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码包含第一和第二寡核苷酸的修饰的植物miRNA前体，其中第一或第二寡核苷酸中的至少一种是与前体异源的，其中第一寡核苷酸基本上与所述第二寡核苷酸互补，并且第二寡核苷酸所编码的miRNA与选自SEQ ID NO：3、6、9、12、15、18、21、24和27的序列具有0、1、2或3个错配，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增加的耐旱性。

8.上述实施方案1-8中的植物的任何子代、上述实施方案1-8中的植物的任何种子、上述实施方案1-8中的植物的子代的任何种子以及来自上述实施方案1-8中的植物以及它们的子代的细胞。

在上述实施方案1-8或本发明的任一其他实施方案中的任何一项中，miR827序列可来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、烟豆(Glycine tabacina)、野大豆(Glycine soja)或短绒野大豆(Glycine tomentella)。

在上述实施方案1-8或本发明的任一其他实施方案中的任何一项中，重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)可包含至少一种在植物中有功能的启动子作为调控序列。

在上述实施方案1-8或本发明的任一其他实施方案中的任何一项中，至少一种农学特性的改变是增加或减少。

在任一前述的实施方案1-8或本发明的任一其他实施方案中，至少一种农学特性可选自：绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、收获指数、茎倒伏、植株高度、穗高以及穗长。例如，至少一种农学特性的改变可为产量、绿度或生物量的增加。

在任一上述实施方案1-8或本发明的任一其他实施方案中，在与不包含所述重组DNA构建体(或所述抑制DNA构建体)的对照植物在水限制条件下进行比较时，植物可表现出至少一种农学特性的改变。

“干旱”指植物可利用的水不足，尤其是当时间延长时，能够引起植物损伤或阻止其正常发育(例如限制植物生长或种子产量)。

“耐旱性”指植物在干旱条件下存活较长时间并且基本上不表现出生理或物理退化的特性。

植物的“耐旱性增加”相对于参比植物或对照植物进行测量，它是植物在干旱条件下存活较长时间，并且相对于在相似干旱条件下生长的参比或对照植物基本上不表现出相同程度的生理或物理退化的特性。通常当转基因植物在其基因组中包含重组DNA构建体或抑制DNA构建体时，它相对于参比或对照植物表现出增加的耐旱性，所述参比或对照植物在其基因组中不包含重组DNA构建体或抑制DNA构建体。

本领域的普通技术人员熟悉模拟干旱条件并评价植物耐旱性的规程，所述植物已经遭受了模拟的或天然存在的干旱条件。例如，技术人员可通过向植物提供比正常需求较少的水或在一定时期内不提供水来模拟干旱条件，并且技术人员可通过寻找在生理和/或物理条件上的差异来评价耐旱性，包括但不限于活力、生长、大小、或根长、或具体地讲叶片颜色或叶片面积大小。用于评价耐旱性的其他技术包括测量叶绿素荧光、光合作用速率和换气速率。

干旱胁迫实验可涉及慢性胁迫(即缓慢干燥)和/或可涉及两种急性胁迫(即突然除去水)，它们由一天或两次恢复分开。慢性胁迫可持续8-10天。急性胁迫可持续3-5天。在对转基因植物和相应对照植物进行干旱胁迫以及良好灌溉处理期间可测量以下变量：

变量“％面积chg_慢性开始-急性2”是介于慢性胁迫第一天和第二次急性胁迫那一天之间的、通过远可见光谱成像测定的总面积百分比变化的量度

变量“％面积chg_慢性开始-慢性结束”是介于慢性胁迫第一天和慢性胁迫最后一天之间的、通过远可见光谱成像测定的总面积百分比变化的量度

变量“％面积chg_慢性开始收获”是介于慢性胁迫第一天和收获那一天之间的、通过远可见光谱成像测定的总面积百分比变化的量度

变量“％面积chg_慢性开始-恢复24小时”是介于慢性胁迫第一天和恢复24小时(急性胁迫2之后24小时)之间的、通过远可见光谱成像测定的总面积百分比变化的量度

变量“psii_急性1”是在第一次急性胁迫末期的光系统II(PSII)效率的量度。它提供对PSII天线吸光效率的评估，并且直接涉及叶片内部的二氧化碳同化。

变量“psii_急性2”是在第二次急性胁迫末期的光系统II(PSII)效率的量度。它提供对PSII天线吸光效率的评估，并且直接涉及叶片内部的二氧化碳同化。

变量“fv/fm_急性1”是在第一次急性胁迫末期的最佳量子产率(Fv/Fm)的量度-(最大和最小荧光之间的可变荧光差值/最大荧光)

变量“fv/fm_急性2”是在第二次急性胁迫末期的最佳量子产率(Fv/Fm)的量度-(最大和最小荧光之间的可变荧光差值/最大荧光)

变量“叶片卷曲_收获”是在收获日的顶部图像对侧面图像的比率的量度。

变量“叶片卷曲_恢复24小时”是恢复24小时顶部图像对侧面图像的比率的量度。

变量“比生长速率(SGR)”指植物总表面积经过单独一天的变化(通过Lemna Tec Instrument测量)(Y(t)＝Y0^*e^r*t)。Y(t)＝Y0^*e^r*t等同于在Y/Δt中的％变化，其中的单个术语如下所述：Y(t)＝在t时的总表面积；Y0＝初始总表面积(估计的)；r＝比生长速率天^-1，并且t＝种植后的天数(“DAP”)

变量“苗干重”是将苗置于104℃烘箱96小时后的苗重量的量度

变量“苗鲜重”是从植物切除后立即称重的苗重量的量度

下文实例描述一些用于模拟干旱条件和/或评价耐旱性的代表性规程和技术。

也可通过在田间测试中比较植物在模拟的或天然存在的干旱条件下(例如通过测量与非干旱条件下相比，在干旱条件下基本等同的产量，或测量与对照或参比植物相比，在干旱条件下更少的产量损失)保持足够产量(至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％产量)的能力来评价耐旱性。

在评估或测量其中利用了对照或参照植物的本发明任何实施方案(如，如本文描述的组合物或方法)中的转基因植物的农学特性或表型时，本领域的普通技术人员将很容易认识到要利用的合适对照植物。例如，通过如下非限制性示例来说明：

1.转化的植物的子代，该植物对于重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)来说是半合子的，使得该子代分离成包含或不包含该DNA构建体(或抑制DNA构建体)的植株：包含该重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的子代将通常相对于不包含该重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的子代来进行测量(即，不包含该重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的子代是对照或参照植株)。

2.重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)基因掺入至自交系中，例如在玉米中，或基因掺入进变体中，例如在大豆中：基因掺入品系将通常相对于亲本自交系或变种品系进行测量(即，亲本自交系或变种品系是对照或参照植物)。

3.双杂交系，其中第一杂交系由两个亲本自交系产生，而第二杂交系由相同的两个亲本自交系产生，不同的是其中一个亲本自交系含有重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)：第二杂交系通常将相对于第一杂交系进行测量(即第一杂交系为对照植物或参照植物)。

4.包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的植株：该植株可相对于这样的对照植株进行评估或测量，该对照植株不包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)，但具有与该植株相当的遗传背景(例如，与包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的植株相比较，核遗传物质具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性)。存在许多可用于分析、比较和表征植物遗传背景的基于实验室的技术；其中这些技术是同工酶电泳、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、任何引物聚合成酶链反应(AP-PCR)、DNA扩增指纹(DAF)、序列特异扩增区域(SCAR)、扩增片段长度多态性

和也称为微卫星的简单序列重复(SSR)。

此外，本领域的普通技术人员将容易认识到，评估或测量转基因植物的农学特性或表型时合适的对照或参照植物将不包括先前已经针对所需的农学特性或表型通过诱变或转化而选择的植物。

方法：

方法包括但不限于：用于提高植物耐旱性的方法、用于评价植物耐旱性的方法、用于改变植物农学特性的方法、用于测定植物农学特性改变的方法、和用于制备种子的方法。所述植物可为单子叶或双子叶植物，例如玉米或大豆植物。植物还可为向日葵、高梁、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦或黍。所述种子可为玉米或大豆种子，例如玉米杂交种子或玉米自交系种子。

方法包括但不限于如下方法：

增加植物耐旱性的方法，所述方法包括：(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸的序列基于Clustal V比对方法在与SEQ I D NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27进行比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；和(b)在步骤(a)之后，从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该重组DNA构建体并且在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增加的耐旱性。所述方法可进一步包括(c)获得源自该转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含重组DNA构建体并且在与不包含该重组DNA构建体的对照植物比较时表现出增加的耐旱性。

增加植物耐旱性的方法，所述方法包括：(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该抑制DNA构建体包含至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)，该调控序列可操作地连接至以下序列的全部或部分：(i)核酸序列，所述核酸序列的序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：28、30、32、34、36或38进行比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或(ii)(a)(i)的核酸序列的全长互补序列；和(b)在步骤(a)之后，从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体并且在与不包含该抑制DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增加的耐旱性。所述方法可进一步包括(c)获得源自该转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含抑制DNA构建体并且在与不包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时表现出增加的耐旱性。

增加植物耐旱性的方法，所述方法包括：(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该抑制DNA构建体包含至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)，该调控序列可操作地连接至源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码SPX/MFS或SPX/RING蛋白；和(b)在步骤(a)之后，从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体并且在与不包含该抑制DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增加的耐旱性。所述方法可进一步包括(c)获得源自该转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含抑制DNA构建体并且在与不包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时表现出增加的耐旱性。

评价植物耐旱性的方法，所述方法包括：(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸的序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27进行比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(c)评价该转基因植物在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时的耐旱性。该方法可进一步包括：(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(e)评价该子代植物在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时的耐旱性。

评价植物耐旱性的方法，所述方法包括：(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该抑制DNA构建体包含至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)，该调控序列可操作地连接至以下序列的全部或部分：(i)核酸序列，该核酸序列的序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：28、30、32、34、36或38进行比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；或(ii)(a)(i)的核酸序列的全长互补序列；(b)在步骤(a)之后，从该可再生的植物细胞再生转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(c)评价该转基因植物在与不包含该抑制DNA构建体的对照植物进行比较时的耐旱性；该方法可进一步包括：(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(e)评价该子代植物在与不包含该抑制DNA构建体的对照植物进行比较时的耐旱性。

评价植物耐旱性的方法，所述方法包括：(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该抑制DNA构建体包含至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)，该调控序列可操作地连接至来源于所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当基于Clustal V比对方法与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分进行比较时，所述区域的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码SPX/MFS或SPX/RING蛋白；(b)在步骤(a)之后，从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(c)评价该转基因植物在与不包含该抑制DNA构建体的对照植物进行比较时的耐旱性；该方法可进一步包括：(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(e)评价该子代植物在与不包含该抑制DNA构建体的对照植物进行比较时的耐旱性。

评价植物耐旱性的方法，所述方法包括：(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸的序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27进行比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(d)评价该子代植物在与不包含该重组DNA构建体的对照植物进行比较时的耐旱性。

评价植物耐旱性的方法，所述方法包括：(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该抑制DNA构建体包含至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)，该调控序列可操作地连接至以下序列的全部或部分：(i)核酸序列，所述核酸序列的序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：28、30、32、34、36或38进行比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；或(ii)(a)(i)的核酸序列的全长互补序列；(b)在步骤(a)之后，从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(d)评价该子代植物在与不包含该抑制DNA构建体的对照植物进行比较时的耐旱性。

评价植物耐旱性的方法，所述方法包括：(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该抑制DNA构建体包含至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)，该调控序列可操作地连接至来源于所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当基于Clustal V比对方法与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分进行比较时，所述区域的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码SPX/MFS或SPX/RING蛋白；(b)在步骤(a)之后，从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；(c)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(d)评价该子代植物在与不包含该抑制DNA构建体的对照植物进行比较时的耐旱性。

测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括：(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸的序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27进行比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(c)测定所述转基因植物任选地在水限制条件下与不包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。该方法可进一步包括：(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(e)测定所述子代植物任选地在水限制条件下与不包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

测定植物农学特性改变的方法，该方法包括：(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该抑制DNA构建体包含至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)，所述调控序列可操作地连接至以下序列的全部或部分：(i)核酸序列，该核酸序列的序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：28、30、32、34、36或38进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列；(b)在步骤(a)之后，从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(c)测定所述转基因植物任选地在水限制条件下与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。该方法可进一步包括：(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(e)测定所述子代植物任选地在水限制条件下与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括：(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该抑制DNA构建体包含至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)，该调控序列可操作地连接至源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码SPX/MFS或SPX/RI NG蛋白；(b)在步骤(a)之后，从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(c)测定所述转基因植物任选地在水限制条件下与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。该方法可进一步包括：(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(e)测定所述子代植物任选地在水限制条件下与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括：(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸的序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27进行比较时，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(d)测定所述子代植物任选地在水限制条件下与不包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

测定植物农学特性改变的方法，该方法包括：(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该抑制DNA构建体包含至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)，所述调控序列可操作地连接至以下序列的全部或部分：(i)核酸序列，该核酸序列的序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：28、30、32、34、36或38进行比较时具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列；(b)在步骤(a)之后，从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(d)测定所述子代植物任选地在水限制条件下与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括：(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该抑制DNA构建体包含至少一种调控序列(例如在植物中有功能的启动子)，该调控序列可操作地连接至源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、56％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码SPX/MFS或SPX/RING蛋白；(b)在步骤(a)之后，从该可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(d)测定所述子代植物任选地在水限制条件下与不包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

产生种子(例如可作为提供耐旱性的产品销售的种子)的方法，该方法包括任一上述的方法，并且还包括从所述子代植物获得种子，其中所述种子在其基因组中包含所述重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)。

在任一前述方法或本发明方法的任一其他实施方案中，在所述导入步骤中所述可再生的植物细胞可包括愈伤组织细胞、胚胎愈伤组织细胞、配子细胞、分生细胞或未成熟胚芽细胞。可再生的植物细胞可来自近交系玉米植物。

在任一上述方法或本发明方法的任一其他实施方案中，所述再生步骤可包括：(i)在包含促进胚发生的激素的培养基中培育所述转化的植物细胞直至观察到愈伤组织；(ii)将所述步骤(i)的转化的植物细胞转移至包含促进组织机体形成的激素的第一培养基；以及(iii)在第二培养基上传代培养步骤(ii)后的所述转化的植物细胞，以允许嫩芽伸长、根发育或这两者同时发生。

在任一上述方法或本发明方法的任一其他实施方案中，至少一种农学特性优选选自：绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物氮含量、果实氮含量、种子氮含量、营养组织中的氮含量、总植物游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织中的氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织中的蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、收获指数、茎倒伏、植物高度、穗高以及穗长；至少一种农学特性的改变可为产量、绿度或生物量的增加。

在任一上述方法或本发明的任一其他方法中，在与不包含所述重组DNA构建体(或所述抑制DNA构建体)的对照植物在水限制条件下进行比较时，植物可表现出至少一种农学特性的改变。

在涉及将抑制DNA构建体导入可再生的植物细胞的任一上述方法中，每种方法可进一步包括将第二抑制DNA构建体导入可再生的植物细胞中，其中所述第二抑制DNA构建体包含至少一种调控元件，该调控元件可操作地连接至以下序列的全部或部分：(1)核酸序列，所述核酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：28、30、32、34、36或38进行比较时，具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；或(2)(a)(1)的核酸序列的全长互补序列。可通过以下方法将第二抑制DNA构建体导入植物细胞中：通过与第一抑制DNA构建体共转化、通过连续转化包含第一抑制DNA构建体的植物、植物细胞、或植物组织培养品系、或通过杂交用不同抑制DNA构建体转化过的两种植物。

在任一前述方法或本发明方法的任何其他实施方案中，存在供选择的替代方案用于将包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸的重组DNA构建体导入可再生的植物细胞中。例如，可将调控序列(例如一种或多种增强子，如作为转位因子的部件)导入可再生的植物细胞，然后筛选其中将所述调控序列可操作地连接至本发明内源基因的事件。

将本发明的重组DNA构建体引入植物可通过任何合适的技术来进行，这些技术包括但不限于引导DNA摄取、化学处理、电穿孔、微注射、细胞融合、感染、载体介导的DNA转移、轰击或农杆菌(Agrobacterium)介导的转化。

技术如下文实施例所示，用于转化玉米植物细胞和大豆植物细胞。

用于转化双子叶植物(主要通过利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens))以及获得转基因植物的其他方法包括公开的用于棉花的那些(美国专利5,004,863、美国专利5,159,135、美国专利5,518,908)；用于大豆的那些(美国专利5,569,834、美国专利5,416,011、McCabe等人，Biol Technology 6：923(1988)，Christou等人，Plant Physiol.87：671674(1988))；用于芸苔属植物(Brassica)的那些(美国专利5,463,174)；用于花生的那些(Cheng等人，Plant Cell Rep.15：653 657(1996)，McKently等人，Plant Cell Rep.14：699703(1995))；用于番木瓜的那些；以及用于豌豆的那些(Grant等人，Plant Cell Rep.15：254258，(1995))。

用电穿孔、粒子轰击和农杆菌转化单子叶植物也已有报道，例如在天门冬属(asparagus)中实现的转化和植物再生(Bytebier等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)84：5354，(1987))；大麦(Wan和Lemaux，Plant Physiol 104：37(1994))；玉米(Rhodes等人，Science 240：204(1988)，Gordon-Kamm等人，Plant Cell 2：603 618(1990)，Fromm等人，BiolTechnology 8：833(1990)，Koziel等人，BiolTechnology 11：194，(1993)，Armstrong等人，Crop Science35：550 557(1995))；燕麦(Somers等人，Biol Technology 10：15 89(1992))；在野茅(orchard grass)中实现的转化和植物再生(Horn等人，Plant Cell Rep.7：469(1988))；水稻(Toriyama等人，TheorAppl.Genet.205：34，(1986)；Part等人，Plant Mol.Biol.32：1135 1148，(1996)；Abedinia等人，Aust.J.Plant Physiol.24：133 141(1997)；Zhang和Wu，Theor.Appl.Genet.76：835(1988)；Zhang等人Plant Cell Rep.7：379，(1988)；Battraw和Hall，Plant Sci.86：191 202(1992)；Christou等人，Bio/Technology 9：957(1991))；裸麦(De la Pena等人，Nature325：274(1987))；甘蔗(Bower和Birch，Plant J.2：409(1992))；高羊茅(Wang等人，Biol Technology 10：691(1992))，和小麦(Vasil等人，Bio/Technology 10：667(1992)；美国专利5,631,152)。

存在多种用于从植物组织再生植物的方法。再生的具体方法将取决于起始植物组织以及要再生的具体植物物种。

从单植物原生质体转化体或从多种经转化的外植体再生、发育和培育植物是本领域所熟知的(Weissbach和Weissbach(编辑)，载于：Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，Inc.San Diego，CA，(1988))。该再生和生长方法通常包括如下步骤：选择转化的细胞，培养这些单独化的细胞通过胚发育的通常阶段以及通过生根小植株阶段。转基因胚以及种子以类似的方式再生。随后将所得的转基因的生根小苗种植在诸如土壤之类的合适植物生长培养基中。

含有编码所关注蛋白质的外来的外源性分离的核酸片段的植物的发育或再生是本领域所熟知的。可将再生的植物进行自花授粉以产生纯合的转基因植物。或者，将得自再生植物的花粉与农学上重要的品系的产生种子的植株进行杂交。反过来，将来自这些重要品系的植物用于给再生的植物授粉。利用本领域技术人员所熟知的方法培育含有所需多肽的本发明的转基因植物。

实施例

本发明将在下面的实施例中进一步说明，其中份数和百分比是以重量计并且度数是摄氏度，除非另外说明。应当理解，尽管这些实施例说明了本发明的实施方案，但仅是以例证的方式给出的。根据上面的论述和这些实施例，本领域的技术人员可确定本发明的基本特征，并在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可对本发明做出多种改变和修饰，以使其适用于多种用法和条件。因此，除了那些本文所示和描述的那些之外，根据前文所述，本发明的各种修改形式对本领域的技术人员来说将是显而易见的。这些修改形式也旨在属于附加的权利要求书的范围内。

实施例1

分离小RNA进行测序及前体结构分析

使用Trizol试剂(Invitrogen)从混合后期阶段的玉米种仁(授粉后7、14和21天)中提取RNA样本。在15％聚丙烯酰胺TBE/尿素凝胶上分离总RNA，并且在单独的泳道中还包括21-nt RNA标记。在电泳之后，将凝胶用溴化乙锭染色，并且将与20-22个核苷酸相对应的凝胶区域切下来。将小的RNA片段洗脱过夜，乙醇沉淀，然后使用T4RNA连接酶依次与5′和3′RNA衔接子连接(5′RNA衔接子GGUCUUAGUCGCAUCCUGUAGAUGGAUC和3′RNA衔接子pAUGCACACUGAUGCUGACACCUGCidT，其中p＝磷酸；idT＝反向脱氧胸苷；分别是SEQ ID NO：55和56)。将每一连接的产物在10％变性聚丙烯酰胺凝胶上进行凝胶纯化以除去未连接的衔接子。然后对最终的连接产物进行RT-PCR，使用与5′和3′衔接子序列互补的引物。通过串联，然后进行标准二脱氧测序(Elbashir等人，2001 Genes &Dev.15：88-200)测定与小RNA相对应的扩增cDNA的序列。

从混合阶段的种仁文库中对大约3000个小RNA测序。在修剪衔接子序列后，将小RNA序列用作在BLAST搜索中的查询序列以识别在DuPont内部cDNA数据库中的较长序列，该数据库可用于生成预测的miRNA前体序列。使用公开可用的RNA折叠算法(Vienna RNA Package)进行潜在的发夹前体结构折叠，根据目测发夹结构选择候选miRNA。

鉴定玉米miRNA(SEQ ID NO：3)和对应的前体(SEQ ID NO：1)，将miRNA命名为“w3-4”。我们随后通过BLAST搜索拟南芥属基因组鉴定了w3-4的拟南芥属同源物。随后，其他人公布了命名为“miR827”的w3-4的拟南芥属同源物(Rajagopalan等人，2006 Genes Devel.20：3407-3425)。因此，术语“w3-4”和“miR827”本文互换使用。

实施例2

鉴定植物miR827基因和候选靶基因

使用BLAST搜索分析专有和公布数据库，鉴定了以下miR827同源物。表2列出了miR827的每个植物同源物的推定前体序列(它们的大小可为全长、近全长或中等长度)、短发夹结构序列和成熟的miRNA序列。

表2

miR827同源物

此外，鉴定了来自拟南芥属、玉米和水稻的候选靶基因。这些靶基因都具有SPX结构域。所述候选靶基因在表3中列出。

表3

miR827的候选靶基因

表3列出的候选miR827靶基因包含据推测涉及G-蛋白信号转导的SPX结构域、以及涉及蛋白-蛋白相互作用如泛素途径的环指结构域、或涉及小溶质运输的MFS(“主要易化子超家族，Major Facilitator Superfamily”)转膜结构域

来自拟南芥属、玉米、水稻和大豆的miR827同源物以及推定靶基因也在PCT国际专利公布WO2008/133643A2中进行了描述。在WO2008/133643A2中，玉米miR827和/或miR827前体的表达水平在胁迫条件下进行检查，胁迫在以下范围内：干旱、温度、氮和磷酸盐。

实施例3

在转基因拟南芥属中超表达AtmiR827

用紧接Invitrogen^TM

C1转化插入序列上游的1.3-kb的35S启动子构建15.3-kb的T-DNA基二元载体，称为pBC(SEQ IDNO：40；图1)。在该载体中的植物选择性标记是BAR基因，该基因赋予除草剂草胺磷(BASTA)抗性。

AtmiR827区域包含发夹前体结构加上附加的旁侧序列，它使用以下引物通过PCR从拟南芥属基因组DNA中扩增得到：

(1)AtmiR827pre-5’attB正向引物(SEQ ID NO：51)：

TTAAACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGTCTGGATTCATGTTCTTGTTTGT

(2)AtmiR827pre-3’attB反向引物(SEQ ID NO：52)：

TTAAACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGCTAAGCTGTGTAACGACTGCAGA

正向引物包含attB1序列(ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT；SEQ IDNO：49)，它邻近对应于基因组序列的24个核苷酸，位于AtmiR827发夹前体上游的大约100个核苷酸。

反向引物包含attB2序列(ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT；SEQ IDNO：50)，它邻近24个核苷酸的基因组序列的反向互补序列，位于AtmiR827发夹前体下游大约200个核苷酸。

使用Invitrogen^TM Clonase^TM技术，用pDONR^TM/Zeo(SEQID NO：41；图2)进行BP重组反应。这种方法将细菌致死ccdB基因以及氯霉素抗性基因(CAM)从pDONR^TM/Zeo移除并定向地克隆了在旁侧具有attB1和attB2位点的PCR产物而得到入门克隆(entry clone)。该入门克隆与目的载体一起用于随后的LR重组反应如下。

称为pBC(SEQ ID NO：40；图1)的15.3-kb的T-DNA基二元载体(目的载体)包含细菌致死基因ccdB以及氯霉素抗性基因(CAM)，侧接attR1和attR2序列。使用Invitrogen^TM

技术，对包含定向克隆PCR产物和pBC的入门克隆进行LR重组反应。这允许迅速的和定向的克隆pBC中在35S启动子后的候选基因以制备35S启动子::AtmiR827表达构建体，pBC-AtmiR827。

使用以下整植株农杆菌属转化程序将35S启动子::AtmiR827表达构建体导入野生型拟南芥属生态型Col-0中。将35S启动子::AtmiR827构建体转化到根癌农杆菌菌株C58中，在25℃下在LB中培养至OD600～1.0。然后离心沉淀细胞，并重悬在相等体积的5％蔗糖/0.05％Silwet L-77(OSI Specialties，Inc)中。在早期抽薹时，培育拟南芥属生态型Col-0的土壤使用农杆菌悬浮液进行顶部灌溉。一周后，相同植株再次用在蔗糖/Silwet中的相同农杆菌菌株进行顶部灌溉。然后将该植物的种子设为标准。将所得T1种子在土壤中播种，通过喷洒草胺磷(AgrEvo；Bayer Environmental Science)选择转基因幼苗。通过Northern印迹和用标记寡核苷酸互补序列杂交AtmiR827(图10)表征若干个T1品系以超表达AtmiR827。两个品系显示超表达AtmiR827，它们是品系1和2，收获它们的种子并随后将这些T2品系用于干旱表型分析。

实施例4

筛选以鉴定耐旱性增加的品系

定量的干旱筛选：将植物种植在包含

200土壤的罐中。

土壤浇水至饱和，然后植物在标准条件下生长(即，16小时光照，8小时黑暗的循环；22℃；～60％的相对湿度)。不提供附加的水。

在可见的干旱胁迫症状出现时拍摄植物的数字图像。每天拍摄图像一次(在每天的相同时间)，直至植物变干。通常收集连续四天的数据。

使用颜色分析鉴定潜在的耐旱性品系。可使用颜色分析测量进入黄色区的叶片面积百分比的增加。使用色调、饱和度和强度数据(“HSI”)，黄色区由色调35至45组成。

叶片面积的保持也被用作鉴定潜在耐旱性品系的另一个标准，因为拟南芥属叶片在干旱胁迫期间萎蔫。叶片面积的保持可用莲座型叶丛面积随时间的减少来测量。

叶片面积根据使用LemnaTec成像系统获取的绿色像素数目进行测量。转基因和对照(例如野生型)植物在浅箱中并列生长，浅箱包含72株植物(9株/罐)。当萎蔫开始时，拍摄图像多日以监控萎蔫过程。基于连续四天获取的绿色像素数，从这些数据中测定转基因植物和伴随的对照植物的萎蔫特征图。该特征图选自发生最大程度萎蔫的四天中的一系列测量结果。耐旱能力通过转基因植物与对照植物相比的抗萎蔫倾向来测量。

使用LemnaTec HTSBonitUV软件分析CCD图像。根据绿色像素数目获取对拟南芥属植物的叶片面积的评估。对每张图像的数据进行平均化以获取对转基因植物和对照植物的绿色像素值的平均值和标准偏差的评估。噪声函数的参数通过平方偏差对平均像素数的直线回归获得，使用批中的所有图像数据。平均像素数数据的误差估计使用噪声函数的拟合参数进行计算。转基因植物和野生型植物的平均像素数相加以获取每张图像的总叶片面积的评估。具有最大萎蔫的四天间隔通过选择对应于植物生长最大差异的间隔获得。转基因植物和野生型植物的单个萎蔫响应通过归一化使用间隔第一天的绿色像素数值的数据获得。转基因植物与野生型植物相比的耐旱性通过相加经过两天至四天的转基因植物和野生型植物间的萎蔫响应的加权差值来评分；加权数通过传递数据误差进行评估。耐旱性评分为正对应于转基因植物与野生型植物相比萎蔫更慢。转基因植物和野生型植物之间的萎蔫响应的差异显著性从平方偏差的加权和获取。

将在与整个浅箱的平均值进行比较时具有黄色积聚显著延迟和/或莲座型叶丛面积显著保持的品系命名为Phase 1 hits。在相同分析条件下进行Phase 1 hits的重复试样再筛选。当Phase 2平行测定的其中一个或全部显示与整个浅箱的平均值有显著差异时(评分大于0.9)，则认为该品系是经验证的耐旱性品系。

实施例5

耐旱性增加的转基因拟南芥属品系的表型

将转基因AtmiR827超表达品系的T2种子播种在四个Metro-

200土壤罐中，使得每个罐包含18-27个种子，种子置于9个位点(每个位点2-3个种子)。将这四个罐分散置于一个浅箱中，浅箱具有四个Col-0罐，以相同方式种植。土壤浇水至饱和，然后植物在标准条件下生长(即，16小时光照，8小时黑暗的循环；22℃；～60％的相对湿度)。不提供附加的水。在发芽大约一周后，将具有转基因T2幼苗的四个罐从浅箱中取出，并且喷洒草胺磷以除去非转基因的同属幼苗。然后将罐重置并监控草胺磷抗性，经过这一选择后转基因和对照(Col-0)秧苗都变稀了，使得每个罐中仅保留了9株植物(总计36株转基因植物和总计36株对照植物)。

发现AtmiR827超表达品系1和2在干旱条件下在与Col-0对照植物(图11)进行比较时显示显著保留了莲座型叶丛区域，因此AtmiR827当超表达时赋予耐旱性。通过实施例4的方法测定的耐旱性评分是2.5。

实施例6

ABA抑制发芽的检测分析

来自AtmiR827超表达品系2和对照植物(Col-0)的种子进行灭菌并置于0.7％琼脂板上，该琼脂板包含0.5X Murashige and Skoog盐，1％蔗糖，和0、0.5、或1um的脱落酸(ABA)。随后在4℃冷处理三天，将平板置于设为20℃的生长室中，在16小时光照/8小时黑暗的光周期下以100μmole/m²/s光照强度培养48小时。然后在解剖显微镜下检查琼脂板并对种子发芽情况评分。将从种皮上根生的突出用作阳性发芽事件的标准。进行三个平行测定实验，每个实验有至少30个对照植物种子和至少30个转基因品系种子。相对于对照植物，AtmiR827超表达品系显示出增加的ABA发芽抑制(图12)，因此对ABA超敏。

实施例7

制备包含miR827基因同源物的植物表达载体

可使用诸如BLAST(基本的局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool)；Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410，1993；也参见美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)国立医学图书馆(National Library of Medicine)的国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)的万维网网址上对BLAST算法的解释)之类的序列比较算法，鉴定与拟南芥属miR827基因同源的序列。编码同源miR827基因的序列可通过以下方法进行PCR扩增。

方法1(基于RNA的方法)：如果miR827-编码区的5’和3’序列信息是可用的，可如上所述设计基因特异性引物。可将RT-PCR用于植物RNA来获得含有蛋白编码区的核酸片段，该EXST蛋白编码区旁侧为attB1(SEQ ID NO：49)和attB2(SEQ ID NO：50)序列。

方法2(基于DNA的方法)：作为另外一种选择，如果编码miR827前体的基因的cDNA克隆是可用的，可以PCR扩增完整cDNA插入序列(含有5′和3′非编码区)。可设计正向引物和反向引物，使它们分别或者含有attB1序列和在该cDNA插入序列前面的载体特异性序列或者含有attB2序列和在该cDNA插入序列后面的载体特异性序列。对于克隆进载体pBulescript SK+中的cDNA插入序列，可使用正向引物VC062(SEQ IDNO：53)和反向引物VC063(SEQ ID NO：54)。

方法1和方法2可根据本领域技术人员已知的步骤进行修改。例如，方法1的引物可含有限制性酶切位点而不是attB1和attB2位点，用于后来将PCR产物克隆进含有attB1和attB2位点的载体内。另外，方法2可涉及从cDNA克隆、λ克隆、BAC克隆或基因组DNA扩增。

可利用BP重组反应将通过任一种上述方法获得的PCR产物与

供体载体(例如pDONR^TM/Zeo(Invitrogen^TM，图2；SEQ ID NO：41)或pDONR^TM221(Invitrogen^TM；图3；SEQ ID NO：42)组合。这种方法将细菌致死ccdB基因以及氯霉素抗性基因(CAM)从pDONR^TM221移除并定向地克隆在旁侧具有attB1和attB2位点的PCR产物而得到入门克隆(entry clone)。使用Invitrogen^TM Clonase^TM技术，然后可将来自入门克隆的编码miR827序列的序列转移到合适的目的载体中(如pBC-Yellow(图4；SEQ ID NO：43)、PHP27840(图5；SEQ ID NO：44)或PHP23236(图6；SEQ ID NO：45))以获得植物表达载体，所述载体分别用于拟南芥属、大豆、和玉米。

供体载体pDONR^TM/Zeo或pDONR^TM221的attP1和attP2位点分别在图2和图3中显示。目的载体pBC-Yellow、PHP27840和PHP23236的attR1和attR2位点分别在图4、5和6中显示。

作为另外一种选择，可进行多个入门克隆和合适的目的载体之间的MultiSite

LR重组反应以产生表达载体。

实施例8

制备大豆表达载体并用miR827序列转化大豆

为了检查所得表型，大豆植物可被转化以过表达miR827序列。

可将上述相同

入门克隆用于将每个基因定向克隆进PHP27840载体(SEQ ID NO：44；图5)中，使得该基因的表达处于SCP1启动子的控制下。

然后可用包含编码本多肽的序列的表达载体转化大豆胚。

为了诱导体细胞胚，可将子叶(长度为3-5mm，从大豆品种A2872的表面灭菌的未成熟种子解剖出来)于26℃在光下或黑暗下培养6-10周。然后切取体细胞胚(其产生次生胚)并将其置于合适的液体培养基内。在重复选择增殖为早期球形阶段胚的体细胞胚的簇后，按下面的描述保持该悬浮液。

可将大豆胚发生悬浮培养物在26℃下在摇床(150rpm)上的35mL液体培养基中保持，荧光光照采用16:8小时(白天/黑夜)的时间表。通过将大约35mg组织移植进35mL液体培养基中，每两周将培养物进行传代培养。然后可通过基因枪轰击方法(Klein等人，Nature(London)327：70-73，1987；美国专利4,945,050)转化大豆胚发生悬浮培养物。DuPont^TM Biolistic^TM PDS1000/HE仪器(氦气改进型)可用于这些转化。

可用于帮助大豆转化的可选标记基因是由来自花椰菜花叶病毒的35S启动子(Odell等人，Nature 313：810-812，1985)、来自质粒pJR225(来自大肠杆菌；Gritz等人，Gene 25：179-188，1983)的潮霉素磷酸转移酶基因以及胭脂碱合成酶基因的3′区构成的嵌合基因，该胭脂碱合成酶基因来自根癌农杆菌Ti质粒的T-DNA。可用于帮助大豆转化的另一种可选标记基因是来自大豆或拟南芥属的除草剂抗性乙酰乳酸合成酶(ALS)基因。ALS是支链氨基酸缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成中的第一共用酶。已经鉴定出ALS中的突变导致对三类ALS抑制剂中的某些或全部具有抗性(美国专利5,013,659；其全部内容以引用的方式并入本文)。除草剂抗性ALS基因的表达可处于SAM合成酶启动子(美国专利申请US-2003-0226166-A1；其全部内容以引用的方式并入本文)的控制下。

将如下物质(依次)加入50μL 60mg/mL的1μm金颗粒悬浮液中：5μLDNA(1μg/μL)、20μL亚精胺(0.1M)和50μL CaCl₂(2.5M)。然后搅拌该颗粒制备物三分钟，在微量离心机(microfuge)中离心10秒并移除上清液。然后将DNA包覆的颗粒在400μL 70％乙醇中洗涤一次并再悬浮于40μL无水乙醇中。可将DNA/颗粒悬浮液用超声波处理三次，每次一秒钟。然后将5μL该DNA-包覆的金颗粒装载至每个宏载体盘上。

将大约300-400mg两周大的悬浮培养物置于60×15mm的空培养皿中并用吸管将残留的液体从组织中移除。对于每次转化实验，大约5-10板的组织受到正常轰击。膜破裂压力设定为1100psi并将腔室抽成28英寸汞柱的真空。将组织置于离阻挡网大约3.5英寸的地方并轰击三次。轰击后，可将组织分成两份并放回液体培养基中，如上所述进行培养。

轰击后五至七天，用新鲜培养基更换该液体培养基，并在轰击后七至十二天，用含有50mg/mL潮霉素的新鲜培养基更换。可每周更换这种选择培养基。轰击后七至八周，可观察到绿色的转化组织从未转化的坏死的胚芽发生簇长出来。移出分离的绿色组织并将其移植进单独的烧瓶中以产生新的、无性繁殖的、转化的胚发生悬浮培养物。可将每一新品系当成是独立的转化事件。然后可将这些悬浮培养物作为未成熟胚进行传代培养和维持，或者通过使单独体细胞胚成熟并萌发而再生成整株植株。

T1植物可经受土壤基的干旱胁迫。使用图像分析，可在干旱胁迫之前和期间进行多次植物面积、体积、生长速率和颜色分析。导致萎蔫或叶片面积减少推迟、黄色积聚和/或在干旱胁迫期间生长速率提高的超表达构建体将被认为是拟南芥属基因在大豆中发挥功能以提高耐旱性的证据。

然后可在较严格的大田基研究条件下检测分析用miR827序列转化的大豆植物以研究在灌溉良好和水限制条件下的产量增加和/或稳定性。

实施例9

通过粒子轰击用miR827序列转化玉米

为了检查所得表型，玉米植物可被转化以过表达miR827序列。

可将上述相同的

入门克隆用于将每种基因定向克隆进玉米转化载体中。在玉米转化载体中的基因的表达可处于组成型启动子的控制下，例如玉米泛素启动子(Christensen等人，(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen等人，(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)

然后可通过下面的方法将上述重组DNA构建体引入玉米细胞中。可从源于自交玉米系H99和LH132杂交的发育中的颖果切取未成熟的玉米胚。在授粉后10至11天分离胚，这时它们长为1.0至1.5mm。然后将胚以轴线侧朝下放置并接触琼脂糖硬化的N6培养基(Chu等人，(1975)Sci.Sin.Peking 18：659-668)。将胚在27℃下保持在黑暗中。从这些未成熟胚的胚鳞增生出易脆的胚发生愈伤组织，该愈伤组织由未分化的细胞块构成，在胚柄结构上长有体细胞原胚状体和胚状体。可将从该原外植体分离的胚发生愈伤组织在N6培养基上培养，并每2至3周在这种培养基上进行传代培养。

可将质粒p35S/Ac(得自Peter Eckes博士，Hoechst Ag，Frankfurt，Germany)用于转化实验以便提供可选标记。该质粒含有pat基因(见欧洲专利公布0242236)，该基因编码草胺膦乙酰转移酶(PAT)。酶PAT赋予对除草性谷氨酰胺合成酶抑制剂例如草胺膦的抗性。p35S/Ac的pat基因处于来自花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)的35S启动子(Odell等人，Nature 313：810-812(1985))和胭脂碱合成酶基因的3′区的控制下，该胭脂碱合成酶基因来自根癌农杆菌Ti质粒的T-DNA。

可将粒子轰击法(Klein等人，(1987)Nature 327：70-73)用于将基因转移至愈伤组织培养细胞。根据该方法，利用下面的技术用DNA包覆金颗粒(直径1μm)。将十μg质粒DNA加到50μL金颗粒的悬浮液(60mg每mL)中。将氯化钙(50μL的2.5M溶液)和亚精胺游离碱(20μL的1.0M溶液)加入到该颗粒中。在加入这些溶液过程中涡旋该悬浮液。10分钟后，将试管粗略地离心(以15,000rpm10进行5秒钟)并移除上清液。将该颗粒再悬浮于200μL的无水乙醇中，再次离心并移除上清液。再次进行乙醇冲洗并将颗粒再悬浮于终体积为30μL的乙醇中。可将DNA包覆的金颗粒等分试样(5μL)置于Kapton^TM飞行圆盘(Bio-Rad Labs)的中心。然后使用DuPont^TMBiolistic^TMPDS-1000/He(Bio-Rad Instruments，Hercules CA)，采用1000psi的氦气压、0.5cm的间隙距离以及1.0cm的飞行距离，将颗粒加速射入玉米组织中。

对于轰击，将胚发生组织置于琼脂糖硬化的N6培养基上的滤纸上。组织布置成薄薄一层，并覆盖直径为约5cm的圆形区域。然后可将包含组织的培养皿置于离阻挡网大约8cm的PDS-1000/He的腔室内。然后将该腔室中的空气抽出至28英寸汞柱的真空。利用在击波管中氦气压力达到1000psi时破裂的可破裂膜，宏载体被氦气冲击波加速。

轰击后七天，可将组织转移至N6培养基中，该培养基含有双丙氨磷(每升5mg)并缺少酪蛋白或脯氨酸。组织继续在这种培养基上缓慢生长。另外2周后，可将组织转移至含有双丙氨磷的新鲜N6培养基上。6周后，在某些装有补充了双丙氨磷的培养基的盘上，可辨别直径约1cm的区域上有活性生长的愈伤组织。当在选择培养基上传代培养时，这些愈伤组织可继续生长。

可通过以下方法由愈伤组织再生出植物：首先将组织簇转移到N6培养基中，所述培养基补充了0.2mg 2，4-D/升。两周后，可将组织转移至再生培养基(Fromm等人，(1990)Bio/Technology 8：833-839)中。可再生转基因T0植物并按照高通量(“HTP”)程序测定它们的表型。可收集T1种子。

T1植物可经受土壤基的干旱胁迫。使用图像分析，可在干旱胁迫之前和期间进行多次植物面积、体积、生长速率和颜色分析。导致萎蔫或叶片面积减少推迟、黄色积聚和/或在干旱胁迫期间生长速率提高的超表达构建体将被认为是miR827序列在玉米中发挥功能以提高耐旱性的证据。

实施例10

电穿孔根癌农杆菌LBA4404

将电穿孔感受态细胞(40μL)，例如含有PHP10523的根癌农杆菌LBA4404(图7；SEQ ID NO：46)在冰上解冻(20-30分钟)。PHP10523含有用于T-DNA转移的VIR基因、农杆菌属的低拷贝数质粒复制起始区、四环素抗性基因以及用于体内DNA生物分子重组的cos位点。同时，将电穿孔管(electroporation cuvette)在冰上冷却。将该电穿孔仪的设置调节至2.1kV。将DNA等分试样(0.5μL亲代DNA，在低盐缓冲液或双蒸H₂O中的浓度为0.2μg-1.0μg)与解冻的根癌农杆菌LBA4404细胞混合，同时仍然保持在冰上。将该混合物转移至电穿孔管的底部并静止保持在冰上1-2分钟。通过按下“pulse(脉冲)”键两次(理想的是获得4.0毫秒的脉冲)对细胞进行电穿孔(Eppendorf电穿孔仪2510)。随后，将0.5mL室温下的2xYT培养基(或SOC培养基)加入到电穿孔管并转移至15mL按压盖管(例如FALCON^TM管)中。将细胞在28-30℃、200-250rpm下培养3小时。

将250μL的等分试样散布在包含YM培养基和50μg/mL奇放线菌素的板上并在28-30℃下培养三天。为了增加转化体的数目，可进行如下两个可选步骤中的其中一个：

选择1：用30μL 15mg/mL的利福平覆盖平板。LBA4404具有针对利福平的染色体抗性基因。这种附加的选择消除了在使用较差的LBA4404感受态细胞制备物时观察到的一些污染克隆。

选择2：进行两次重复的电穿孔以补偿较差的电感受态细胞。

转化体的鉴定：

选取四个独立的克隆并划痕接种在包含AB基本培养基和50μg/mL奇放线菌素的平板上用于分离单个克隆。将平板在28℃下孵育二至三天。对于每个推定的共整合体选取单个克隆并将其接种在4mL的10g/L细菌蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L氯化钠，和50mg/L奇放线菌素中。将该混合物在28℃下摇动培养24小时。采用QIAGEN Miniprep和可选的PB缓冲液洗涤，从4mL培养物分离出质粒DNA。洗脱出30μL DNA。将2μL等分试样如上用于电穿孔20μL DH10b+20μL双蒸馏H₂O。任选地，可将15μL等分试样用于转化75-100μL的Invitrogen^TMLibrary Efficiency DH5α。将细胞散布在包含LB培养基和50μg/mL奇放线菌素的平板上并将其在37℃下培养过夜。

对于每个推定的共整合体选取三至四个独立克隆并将其接种在4mL的2xYT培养基(10g/L细菌蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L氯化钠)和50μg/mL奇放线菌素中。将细胞在37℃下摇晃培养过夜。接下来，使用

Miniprep，用任选PB缓冲液洗涤液(洗脱成50μL)从4mL培养物中分离质粒DNA。8μL质粒DNA用SalI(使用亲本DNA和PHP10523作对照物)进行消化。对于4个质粒，利用限制性内切酶BamHI、EcoRI和HindIII再进行三次消化(使用亲代DNA和PHP10523作为对照)，这4个质粒代表2种具有正确SalI消化模式的推定共整合体。推荐电凝胶(Electronic gel)用于比较。

实施例11

使用农杆菌属(Agrobacterium)细菌转化玉米

为了检查所得表型，玉米植物可被转化以过表达miR827序列。

农杆菌介导的玉米转化基本上按照以下文献中描述的方法进行：Zhao等人，在Meth.Mol.Biol.318：315-323(2006)中描述的方法进行(还可参见Zhao等人，Mol.Breed.8：323-333(2001)和1999年11月9日公布的美国专利5,981,840，以引用的方式将该文献并入本文)。该转化过程涉及细菌接种、共培养、静止期、选择以及植株再生。

1.未成熟胚芽制备：

将未成熟胚芽从颖果上切下来，并且放置在含有2mL PHI-A培养基的2mL微管中。

2.未成熟胚芽的农杆菌感染和共培养：

2.1感染步骤：

用1mL微吸移管将(1)的PHI-A培养基取出，并且加入1mL农杆菌属细菌悬浮液。将该管轻轻地倒置以混合。将该混合物在室温下培养5分钟。

2.2共培养步骤：

用1mL微吸移管将农杆菌悬浮液从感染步骤中取出。使用无菌刮刀将胚从管中刮出并转移到100×15mm培养皿中的PHI-B培养基的平板中。确定胚的朝向，使得胚轴在培养基表面上朝下。将具有胚芽的平板在20℃于黑暗中培养3天。L-半胱氨酸可用于共培养阶段。采用标准二元载体，补充有100-400mg/L L-半胱氨酸的共培养培养基对于回收稳定的转基因事件是至关重要的。

3.选择推定的转基因事件：

向在100×15mm培养皿中的PHI-D培养基的平板中转移10个胚芽，保持朝向，并且用石蜡膜将培养皿密封。将平板在黑暗中于28℃下培养。预计在六至八周将看见作为黄色胚芽组织的主动生长推定事件。不产生事件的胚可能是棕色和坏死的，并且几乎看不见脆性组织生长。以2-3周的间隔将推定的转基因胚芽组织转移到新鲜的PHI-D平板上进行传代培养，时间间隔取决于生长速度。记录事件。

4.T0植株的再生：

将在PHI-D培养基上繁殖的胚芽组织转移到在100×25mm培养皿中的PHI-E培养基(体细胞胚芽成熟培养基)中进行传代培养，在28℃下于黑暗中培养直至体细胞胚芽成熟，培养大约10-18天。将具有良好限定的盾片和胚芽鞘的个体成熟体细胞胚芽转移到PHI-F胚芽发芽培养基中，并且在28℃下于光中(约80μE，来自冷光灯或同等荧光灯)培养。在7-10天，将约10cm高的再生的植株置于盆中的园艺混合物中，并且使用标准园艺方法进行耐寒锻炼(hardened-off)。

用于植物转化的培养基：

1.PHI-A：4g/L CHU基础盐，1.0mL/L 1000X Eriksson′s维生素混合物，0.5mg/L盐酸硫胺，1.5mg/L 2，4-D，0.69g/L L-脯氨酸，68.5g/L蔗糖，36g/L葡萄糖，pH5.2。加入100μM乙酰丁香酮(过滤灭菌的)。

2.PHI-B：PHI-A，不含有葡萄糖，将2，4-D增加至2mg/L，将蔗糖降低至30g/L，并且补充0.85mg/L硝酸银(过滤灭菌的)，3.0g/L100μM乙酰丁香酮(过滤灭菌的)，pH 5.8。

3.PHI-C：PHI-B，不含

和乙酰丁香酮，将2，4-D降低至1.5mg/L，并且补充8.0g/L琼脂，0.5g/L 2-[N-吗啉代]乙烷-磺酸(MES)缓冲液，100mg/L羧苄西林(过滤灭菌的)。

4.PHI-D：PHI-C补充3mg/L双丙氨磷(过滤灭菌的)。

5.PHI-E：4.3g/L Murashige and Skoog(MS)盐(Gibco，BRL11117-074)，0.5mg/L烟酸，0.1mg/L盐酸硫胺，0.5mg/L盐酸吡哆醇，2.0mg/L甘氨酸，0.1g/L肌醇，0.5mg/L玉米素(Sigma，Cat.No.Z-0164)，1mg/L吲哚乙酸(IAA)，26.4μg/L脱落酸(ABA)，60g/L蔗糖，3mg/L双丙氨磷(过滤灭菌的)，100mg/L羧苄西林(过滤灭菌的)，8g/L琼脂，pH 5.6。

6.PHI-F：不含玉米素、IAA、ABA的PHI-E；将蔗糖降低至40g/L；用1.5g/L

替代琼脂；pH5.6。

可通过以下方法由愈伤组织再生出植物：首先将组织簇转移到N6培养基中，所述培养基补充了0.2mg 2，4-D/升。两周后，可将组织转移至再生培养基中(Fromm等人，Bio/Technology 8：833-839(1990))。

转基因T0植株可再生，并且可确定其表型。可收集T1种子。

此外，可将重组DNA构建体引入优良玉米自交品系中，该引入或者是通过直接转化或者是通过从独立转化的品系基因渗入而来。

自交或杂交的转基因植物可通过更严苛的大田试验来研究在水限制条件下和不限制水条件下的产量增加和/或稳定性

随后可进行产量分析以测定包含miR827序列的植物在与不包含验证过的拟南芥属前导基因的对照植物(或参比植物)进行比较时是否具有产量改善(在水限制条件下和不限制水条件下)。具体地讲，可在包含验证过的拟南芥属前导基因的植物和对照植物的开花期和/或结实期施加水限制条件。包含验证过的拟南芥属前导基因的植物相对于对照植物将具有更少的产量损失，例如在水限制条件下产量损失减少25％，或在不限制水条件下相对于对照植物将具有提高的产量。

实施例12

制备miR827表达载体用于转化玉米使用Invitrogen’s^TM

技术，用miR827入门克隆和目的载体(PHP28647)进行LR重组反应以制备超表达载体。超表达载体将包含以下表达盒：

1.泛素启动子::moPAT::PinII终止子；表达用于在转化过程中的选择的PAT抗除草剂性基因的表达盒。

2.LTP2启动子::DS-RED2::PinII终止子；表达用于种子分选的DS-RED颜色标记基因的表达盒。

3.泛素启动子::miR827::PinII终止子；过表达受关注基因miR827的表达盒。

实施例13

用miR827表达载体通过农杆菌属转化玉米

可使用如上所述的农杆菌介导转化将在表达载体中存在的miR827序列导入玉米自交品系中，或来源于优良玉米自交品系的可转化玉米品系中。

可将miR827表达载体电穿孔导入包含载体PHP10523(图7；SEQ IDNO：46)的LBA4404农杆菌属菌株中以制备miR827共整合载体。该共整合载体是通过2个质粒、miR827表达载体与PHP10523的重组(通过每个载体上含有的COS重组位点)而形成。共整合miR827载体除包含农杆菌属菌株和农杆菌介导转化所需的其他基因(TET、TET、TRFA、ORI终止子、CTL、ORI V、VIR C1、VIR C2、VIR G、VIR B)之外，还将包含同上(实施例12)的3个表达盒。

实施例14

制备目的载体PHP23236用于转化Gaspe Flint来源的玉米品系

目的载体PHP23236(图6，SEQ ID NO：45)是通过用质粒PHP23235(图8，SEQ ID NO：47)转化包含质粒PHP10523(图7，SEQ ID NO：46)的农杆菌菌株LBA4404并分离所得的共整合产物而获得。目的载体PHP23236可被用于如上所述的与入门克隆的重组反应，以产生用于转化Gaspe Flint来源的玉米品系的玉米表达载体。

实施例15

制备玉米miR827表达质粒用于转化Gaspe Flint夹源的玉米品系

玉米miR827或Zm-miR827(SEQ ID NO：3)最初在由玉米种仁制成的专有DuPont/Pioneer小RNA文库中鉴定。我们将Zm-miR827作为At-miR827(拟南芥属miR827)的同源物反映了这一事实：两个成熟的miRNA序列具有广泛的同一性，仅在两个位点不同。此外，两个物种中鉴定的靶基因是相似的，每个靶基因编码具有N-末端SPX结构域并在5′UTR中具有miR827靶序列的蛋白。

我们使用BLAST比对搜索专有DuPont/Pioneer cDNA序列以鉴定玉米克隆cillc.pk002.15a，该克隆包含长度大约为1kb的cDNA插入序列，它编码Zm-miR827成熟序列(SEQ ID NO：3)。在cDNA插入序列中是一个132个核苷酸的区域，该区域包括成熟Zm-miR827微RNA序列并被预测形成通常是微RNA前体的发夹前体结构。因此，克隆cillc.pk002.15a具有编码Zm-miR827(SEQ ID NO：3)的初级转录物(SEQ ID NO：1)的cDNA插入序列。

使用上述的Invitrogen^TM

重组技术，将cillc.pk002.15a直接克隆进目的载体PHP23236(SEQ ID NO：45；图6)以制备表达载体PHP26200，该表达载体包含在UBI启动子控制下的受关注cDNA，并且是用于如本文实施例所述(但不限于)的农杆菌介导转化进玉米的T-DNA二元载体。

实施例16

用miR827序列转化Gaspe Flint来源的玉米品系

为了检查所得表型，玉米植物可被转化以过表达miR827序列。

受体植株：

受体植株细胞可来自具有短的生活周期(“快速循环”)、大小减少以及转化潜能高的单一玉米品系。对玉米典型的这些植株细胞是来自可公开获得的Gaspe Flint(GBF)品系品种的植株细胞。一种可能的候选植株品系品种是GBF×QTM(Quick Turnaround Maize(快速周转玉米)，选择用于在温室条件下生长的Gaspe Flint的可公开获得形式)的F1杂交种，其在Tomes等人的美国专利申请公开2003/0221212中有所公开。从该品系获得的转基因植株具有如此小的大小使得它们可在4英寸的盆中生长(是正常大小的玉米植株所需空间的1/4)并且它们在少于2.5个月时间内成熟。(传统上，一旦转基因植株适应温室后需要3.5个月来获得转基因T0种子。)另一合适的品系是GS3(高度可转化的品系)×Gaspe Flint的双单倍体品系。还有另一种合适的品系是携带引起较早开花、高度减小或这两者的转基因的可转化的优良近交系。

转化规程：

任何合适的方法可用于将转基因引入玉米细胞中，包括但不限于利用基于农杆菌载体的接种类型的步骤。转化可在受体(靶标)植株的未成熟胚上进行。

精确的生长和植株跟踪：

将由转化的玉米胚产生的转基因(T0)植株的事件群体在受控的温室环境中栽培，该温室使用改良的随机分块(block)设计以降低或消除环境误差。随机分块设计是这样一种植株布局，在该布局中，实验植株被分成组(如，每组30株植株)，称为块，而每株植株随块被随机分配一个位置。

对于一组30株植株，24株转化的实验植株和6株对照植株(具有设定好的表型的植株)(总起来说称为“重复组”)被置于盆中，这些盆在位于温室内的桌子上布置成阵列(也叫做重复组或块)。每株植株(对照植株或实验植株)随块被随机分配一个位置，所述的块映射一个唯一的、温室物理位置以及映射该重复组。在单次实验中多个30株植株的重复组中的每一个可栽培在相同的温室中。应该确定重复组的布局(布置方式)以使对空间的要求最小以及温室内的环境影响最小。这样一种布局可称为压缩的温室布局。

对于加入特定的对照组的一种替代方法是鉴定不表达所关注基因的那些转基因植株。可将诸如RT-PCR之类的多种技术应用于定量评估引入基因的表达水平。可将不表达转基因的T0植株与表达转基因的那些植株进行比较。

在整个评价过程中鉴定和跟踪事件群体中的每株植株，并且从那些植株收集的数据自动与那些植株相关联，使得所搜集的数据可与由该植株携带的转基因关联。例如，每个植株容器具有机器可读的标签(例如通用货单代码(UPC)条形码)，该标签包含了关于植物身份的信息，身份信息继而又与温室位置相关，使得从植物获得的数据可自动与该植物相关联。

作为另外一种选择，可使用任何有效的、机器可读的植物识别系统，例如二维矩阵代码或甚至是射频识别标签(RFID)，其中数据被接收并由射频接收器/处理器进行翻译。参见美国公布的专利申请2004/0122592，其以引用方式并入本文。

利用三维成像进行表型分析：

对T0事件群体中的每株温室植株(包括任何对照植株)分析所关注的农学特性，并且以这样一种方式记录或存储每株植株的农学数据，该方式使得数据与该植株的辨识数据(见上面)相关联。可利用与上述类似的实验设计，可在T1代中完成对表型(基因效应)的确认。

在植物的整个温室生活周期中，利用定量的非破坏性成像技术在表型水平上来分析T0植株以评估所关注的性状。例如可将数字成像分析仪用于整株植物的自动多维分析。成像可在温室内进行。将两个摄像系统(位于顶部和侧面)和用于旋转植物的装置用于从所有侧面观察植物和成像。从每株植物的顶部、前面和侧面采集图像。所有的三个图像一起提供了足够的信息用于评价每株植物的生物量、大小和形态。

由于植物在第一片叶片从土壤显现出来时到植物处于它们发育的末期时大小的改变，最好是从顶部以较高的放大倍率记录植物发育的早期。这可通过利用完全由成像软件控制的自动变焦镜头系统来完成。

在单次成像分析操作中，进行如下事件：(1)将植株传送至分析仪区域内，旋转360度以便其机器可读标签可被读取，并且让其保持静止直至其叶片停止移动；(2)获取侧面图像并将其输入数据库；(3)将植株旋转90度并再次让其保持静止直至其叶片停止移动，以及(4)将该植株传送出分析仪。

每24小时的周期让植物至少6个小时处于黑暗以便具有正常的白天/黑夜周期。

成像仪器：

可使用任何合适的成像仪器，包括但不限于可从LemnaTec GmbH(Wurselen，Germany)商购获得的光谱数字成像仪。获取图像并用具有1/2″IT Progressive Scan IEE CCD成像设备的LemnaTec ScanalyzerHTS LT-0001-2进行分析。该成像照相机可配备有自动变焦、自动调节光圈和自动聚焦。可利用LemnaTec软件设定所有的照相机设置。例如对于主要组成成像分析仪的仪器差异可小于约5％，对于次要组成成像分析仪的仪器差异可小于约10％。

软件：

成像分析系统包括用于颜色和构造分析的LemnaTec HTS Bonit软件程序和用于存储约500,000次分析的数据(包括分析数据)的服务器数据库。原始图像和分析过的图像储存在一起以允许用户根据需要进行再次分析。可将数据库连接至成像硬件用于自动的数据收集和存储。可将多种市售的软件系统(如Matlab等)用于定量判读成像数据，并且这些软件系统中的任何一种均可应用于图像数据集。

传送系统：

具有植物旋转装置的传送系统可用于将植物传送至成像区域并在成像过程中选择植物。例如，将最多4株植物(每株最高高度为1.5m)装上小车，该小车在循环的传送系统上行进并通过成像测量区域。在这种情况下，该单位(成像分析仪和传送环线)的总占有面积为约5m×5m。

可扩大传送系统以同时容纳更多植物。将植物沿传送环线传送至成像区域并对每株植物分析最多50秒。获取植物的三个视图。传送系统以及成像设备应该能够用于温室环境条件。

照明：

任何合适的照明模式可用于图像采集。例如，可在暗背景上使用顶部照明。作为另外一种选择，可采用使用白色背景的顶部照明和背部照明的组合。应该将被照亮的区域围起来以确保恒定的照明条件。遮蔽物应该长于测量区域使得能保持恒定的光条件而不需要打开和关闭门。作为另一种选择，可变化照明以引起转基因(如，绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP))的激发或者引起内源性(如叶绿素)荧光基团的激发。

基于三维成像的生物量估计：

为了更好地估计生物量，应该从至少三个轴(例如顶部视图和两个侧面(侧面1和侧面2)视图)获取植物图像。然后分析这些图像以将植物从背景(盆和花粉控制袋(如果适用的话))分离。可通过如下计算来评价植物的体积：

在上面的等式中，体积和面积的单位是“任意单位”。在该体系中，任意单位完全足以检测基因对植物大小和生长影响，因为所需的是检测与实验平均值或对照平均值的差值(正-较大和负-较小两者)。大小(如面积)的任意单位可通过将物理参照加入到成像过程而轻易地转化成物理量度。例如，可在顶部成像过程和侧面成像过程两者中均包括已知面积的物理参照。基于这些物理参照的面积，可测定转换因子以允许从像素转换为面积单位，例如平方厘米(cm²)。物理参照可以是或可以不是独立的样本。例如，具有已知直径和高度的盆足可用作物理参照。

颜色分类：

成像技术还可用于确定植物颜色以及用于将植物颜色归为各种衍生类型。将图像颜色归属于颜色类型是LemnaTec软件的固有特色。使用其他图像分析软件系统，可通过多种计算方法确定颜色分类。

对于植物大小和生长参数的测定，一种有用的分类方案是定义一种单一颜色方案，包括绿色的两种或三种色调，此外，还有关于缺绿病、坏死和漂白(在这些条件出现时)的颜色类型。还使用了背景颜色类型，其包括图像中的非植物颜色(例如盆和土壤颜色)，并将这些像素特别地从测定大小中排除。在受控的恒定照明下分析植物，使得可以定量一株植物内随时间推移的任何改变，或者植物之间或植物不同分枝之间的任何改变(如季节差异)。

除了其在测定植物的大小、生长中的有效性，颜色分类还可用于评估其他产量构成性状。对于这些其他产量构成性状，可使用另外的颜色分离方案。例如，称为“保绿度(staygreen)”的性状(已经将其与产量的提高相关联)可通过颜色分类来评估，该颜色分类将绿色色调与黄色和棕色色调(其指示老化的组织)相分离。通过将这种颜色分类应用于在T0或T1植物生活周期末获取的图像，可鉴定绿色的量相对于黄色和棕色(例如，可表示为绿色/黄色比率)增加的植物。这种绿色/黄色比率具有显著差异的植物可被鉴定为携带影响这种重要农学特性的转基因。

熟练的植物学家将认识到可以指示植物健康或应激反应的其他植物颜色(花青素)的出现，以及认识到其他颜色分类方案可提供对基因在与这些响应相关的性状方面的作用的进一步度量。

植物结构分析：

改变植物结构参数的转基因也可用本发明鉴定，包括诸如最大高度和宽度、节间距离、叶与茎之间的角度、在节处开始的叶片数以及叶片长度。LemnaTec系统软件可如下用于确定植物构造。在第一成像步骤中将植物简化至其主要的几何构造，并且随后基于该图像可进行不同构造参数的参数化鉴定。或者是单独地或者是组合地修改任何这些构造参数的转基因可通过应用此前所述的统计方法来鉴定。

花粉脱落日期：

花粉脱落日期是转基因植物中要分析的一个重要参数，并且可通过活性雄花第一次出现在植物上来确定。为了找到雄花目标，通过颜色对茎的上端进行分类以检测黄色或紫色花药。然后将这种颜色分类分析用于定义活性花，活性花继而可用于计算花粉脱落日期。

作为另外一种选择，花粉脱落日期和其他易于在视觉上检测到的植物属性(如授粉日期、第一穗丝日期)可由负责进行植物看护的工作人员来记录。为了使数据完整性和过程效率最大化，通过利用相同的由LemnaTec光谱数字分析设备利用的条形码来跟踪该数据。可将具有条形码阅读器的电脑、掌上设备或笔记本电脑用于使记录观察时间、植物标识符的数据捕捉变得容易，并且使捕捉数据的操作者感觉舒适。

植物的取向：

以接近商业栽培的密度种植的成熟玉米植物通常具有平面的结构。也就是说，植物具有一可清晰分辨的宽的侧面和窄的侧面。对来自植物宽侧的图像进行测定。对于每株植物，给其赋予一个明确界定的基本取向以获得宽侧图像与窄侧(edgewise)图像之间的最大差别。将顶部图像用于确定植物的主轴，而将额外的旋转装置用于在开始主图像采集前将植物转至合适的取向。

实施例17

筛选Gaspe Flint来源的玉米品系的耐旱性

可用以下方法筛选具有耐旱性的含miR827序列的转基因Gaspe Flint来源的玉米品系。

转基因玉米植物经受供水良好条件(对照)和干旱胁迫条件。在T1阶段或更晚的时期筛选转基因玉米植物。

在播种后(DAS)10至14天或移植后7天时开始施加胁迫，持续至抽穗丝。在整个干旱胁迫处理期间通过自动系统给罐浇水，该自动系统配有定时器以提供25或50％的田间持水量的水。该胁迫的强度和持续时间将允许鉴定对植物生长的影响以及对开花-抽穗丝间隔的影响。

罐混合物：使用1/3蒙脱石(Profile Products LLC，IL，USA)、1/3沙土和1/3SB300(Sun Gro Horticulture，WA，USA)的混合物。SB300可用Fafard Fine-Germ(Conrad Fafard，Inc.，MA，USA)替代，并且可减少沙土在混合物中的比例。因此，最终罐混合物可为3/8(37.5％)的蒙脱石、3/8(37.5％)的Fafard和1/4(25％)沙土。

田间持水量测定：测量用于一个S200罐(减去罐重量)的土壤混合物(w1)的重量。如果土壤混合物的所有组分都不是干燥的，在测定W1前在100℃下干燥土壤至恒重。罐中的土壤加水至完全饱和，并排出所有土壤重力水。测定排出土壤重力水后的土壤(w2)重量(减去罐重量)。田间持水量是获取自w2至w1的土壤中保有的水的重量。它可被描述为烘干土壤重量的百分比。

胁迫处理：在植物生长的早期阶段(10DAS至21DAS)，供水良好的对照植物具有75％田间持水量的每日供水，而干旱胁迫处理具有25％田间持水量的每日供水，两者都是在或约10AM时的单日剂量。当植物进一步生长时(21DAS)，必须将供水良好对照植物的每日供水量提高到全田间持水量，并将干旱胁迫处理的每日供水量提高到50％田间持水量。

营养物质溶液：用自来水稀释至1/16的改良Hoagland溶液被用于灌溉。

表4

使用以下配方制备20L改良Hoagland溶液：

组分	量/20L
		10X微量营养素溶液	16mL
KH2PO4(分子量：136.02)	22g
		MgSO4(分子量：120.36)	77g
KNO3(分子量：101.2)	129.5g
		Ca(NO3)2·4H2O(分子量：236.15)	151g
NH4NO3(分子量：80.04)	25.6g
		Sprint 330(铁螯合物)	32g

表5

使用以下配方制备1L 10X微量营养素溶液：

组分	mg/L	浓缩
			H3BO3	1854	30mM
MnCl2·4H2O	1980	10mM
			ZnSO4·7H2O	2874	10mM
CuSO4·5H2O	250	1mM
			H2MoO4·H2O	242	1mM

使用肥料级KNO₃。

在移植时或在出苗后加入半茶匙奥绿肥(Osmocote)(NPK 15∶9∶12)到罐中是有用的(The Scotts Miracle-Gro Company，OH，USA)。

边界植物：将一排边界植物放置在邻近温室玻璃墙的工作台边缘，或邻近其他潜在微环境变化原因(如制冷风扇)的工作台边缘。

自动操作：使用具有钻孔的PVC管进行浇水，使用虹吸装置将水系统地供给到放置的罐中。使用定时器安排灌溉时序。

统计分析：在不同胁迫处理条件下的转基因事件中记录的植物尺寸、颜色和叶绿素荧光的平均值将被输出到Spotfire(Spotfire，Inc.，MA，USA)。处理平均值将使用方差分析进行差值评估。

重复：每个事件每种处理使用八至十株植物。

进行观察：在整个生长阶段每周进行三次Lemnatec测量以捕集植物生长速率。在整个胁迫期间使用Lemnatec每周进行三次叶片颜色测定。使用Hansatech FMS2仪(LemnaTec GmbH，Wurselen，Germany)，在实验期间将叶绿素荧光记录为PhiPSII(它指示光合体系II光化学的工作量子效率)和Fv’/Fm’(它是光合体系II的最大效率)二至四次，记录在测量日的11AM开始。在胁迫期间，在开始看到干旱胁迫症状(即，叶片灰化及叶片卷曲)时开始测量，直至实验结束，并且在最幼嫩的、伸展最充分的叶片上进行测量并记录。记录每单株植物的抽穗和抽穗丝日期，并计算ASI。

可使用以上方法选择在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时具有增加耐旱性的转基因植物。

实施例18

评价Gaspe Flint来源的玉米品系的耐旱性

通过农杆菌属用质粒PHP26200转化Gaspe Flint来源的玉米品系，该质粒编码来自克隆cillc.pk002.15a的玉米miR827前体。用以下方法评价每个质粒构建体的五个转化事件的耐旱性。

土壤混合物由37.5％

37.5％SB300和25％沙土混合物构成。所有罐装满相同量的土壤+/-10克。手动浇水使得罐达到最多100％的罐体容量(FC)。用包含营养物质溶液的6.5mM KNO₃浇灌所有植物直至进行处理的第26天。将植物保持50％FC直至种植后21天(DAP)。在第17天，灌溉系统发生故障，一部分植物浇灌了太多水。因此，使所有植物再次达到至多100％的罐体容量。这导致该实验延长，使得处理在发育的较晚阶段进行；大约发育的V7-V8阶段。在26DAP，水减少的植物经受慢性干旱胁迫；无水或营养物质供应直至植物达到大约25％FC。水减少的植物在实验期间经过两次急性干旱胁迫；第29天和第34天。在急性干旱胁迫期间收集叶绿素荧光测量数据。在急性干旱胁迫后用包含营养物质溶液的9mM NO₃使水减少的植物达到最多40％FC。每张表每周监控pH至少三次。

计算更大的Student’s t检验的概率用于比较每个转基因平均值与合适的无效转基因平均值(分离无效转基因或构建体无效转基因)。t检验是一种单尾检验。使用最小值(P＜t)0.1作为具有统计意义上显著性的结果的临界值。

表7和8显示每个转基因事件的变量，所述事件与无效分离相比发生了显著改变。将“正效应”定义为转基因事件的变量相对于无效对照植物发生了具有统计意义上的显著性的改善。将“负效应”定义为无效对照植物相对于转基因事件的变量发生了具有统计意义上的显著性的改善。表6提供了单个事件具有显著性改变的变量的数目，所述事件用五个质粒DNA构建体中的每一个进行转化。表7提供了每个构建体的事件数目，其显示每个变量的显著改变。

表6

用编码玉米miR827的PHP26200转化的单个事件的具有显著改变 ^* 的 变量数目

*P值小于或等于0.1

表7

单个变量具有显著改变 ^* 的用编码玉米miR827的PHP26200转化的事 件的数目

*P值小于或等于0.1

就构建体PHP26200而言，与每个改善变量相关联的统计值在图13A-14中提供。显著正效应具有小于或等于0.1的P值。显著负效应在圆括号中显示。空白条目指示在转基因事件和无效分离之间未观察到显著差异。四个转化玉米品系中的每一个的结果在图13A-13B中提供。五个事件中的其中一个，EA1909.300.1.3，在水减少和水足够条件下其变量都具有改善的效应。对具有构建体PHP26200的所有四个事件的综合评估在图14中提供。许多这些玉米品系显示增加的耐旱性。

实施例19

制备玉米miR827表达载体用于转化玉米

构建入门克隆PHP32214，它包含玉米miR827前体编码区和以下调控元件：玉米泛素启动子、玉米泛素5’非翻译区域、玉米泛素5’内含子-1和PinII终止子区域。

使用Invitrogen’s^TM

技术，用玉米miR827入门克隆、PHP32214、和目的载体PHP22964进行LR重组反应以制备超表达载体PHP34054。超表达载体PHP34054包含以下表达盒：

1.泛素启动子::moPAT::PinII终止子；表达用于在转化过程中的选择的PAT抗除草剂性基因的表达盒。

2.LTP2启动子::DS-RED2::PinII终止子；表达用于种子分选的DS-RED颜色标记基因的表达盒。

3.泛素启动子::Zm-miR827::PinII终止子；过表达受关注基因玉米miR827的表达盒。

实施例20

用玉米miR827表达载体使用农杆菌属转化玉米

可使用如上所述的农杆菌介导的转化将在表达载体PHP34054中存在的玉米miR827序列导入可转化的玉米品系中，该品系来源于优良玉米自交品系。

将miR827表达载体PHP34054电穿孔导入包含载体PHP10523(图7；SEQ ID NO：46)的LBA4404农杆菌属菌株中以制备miR827共整合载体PHP34082。共整合载体PHP34082是通过2个质粒、PHP34054与PHP10523的重组(通过每个载体上含有的COS重组位点)而形成。共整合玉米miR827载体PHP34082除包含农杆菌属菌株和农杆菌介导转化所需的其他基因(TET、TET、TRFA、ORI终止子、CTL、ORI V、VIR C1、VIR C2、VIRG、VIR B)之外，还包含同上(实施例19)的3个表达盒。

实施例21

包含玉米miR827前导基因的玉米品系的产量分析

可通过直接转化或者从单独转化的品系基因掺入而将包含玉米miR827基因的重组DNA构建体导入优良玉米自交品系中。

自交或杂交的转基因植物可通过更严苛的大田试验来研究在水限制条件下和水充分条件下的产量增加和/或稳定性。

随后可进行产量分析以测定包含玉米miR827基因的植物在与不包含玉米miR827基因的对照植物进行比较时是否具有产量改善(在水限制条件下)。具体地讲，可在包含玉米miR827基因的植物和对照植物的开花期和/或结实期施加干旱条件。可测得这两种植物的产量都有所减少。包含玉米miR827基因的植物相对于对照植物可具有更少的产量损失，例如少于25％的产量损失。

可使用以上方法选择在水限制条件下和/或水充分条件下，与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时具有增加产量的转基因植物。选择的植物在水限制条件下将具有增加的产量。

Claims (15)

1.在基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有的核酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27进行比较时，具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增加的耐旱性。

2.权利要求1的植物，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。

3.在基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码包含第一和第二寡核苷酸的修饰的植物miRNA前体，其中所述第一或第二寡核苷酸中的至少一种是与所述前体异源的，其中所述第一寡核苷酸基本上与所述第二寡核苷酸互补，并且所述第二寡核苷酸所编码的miRNA与选自SEQ ID NO：3、6、9、12、15、18、21、24和27的序列具有0、1、2或3个错配，并且其中所述植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增加的耐旱性。

4.权利要求3的植物，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。

5.增加植物耐旱性的方法，所述方法包括：

(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有的核酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27进行比较时具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；以及

(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增加的耐旱性。

6.权利要求5的方法，所述方法还包括：

(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体并且在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时表现出增加的耐旱性。

7.评价植物耐旱性的方法，所述方法包括：

(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有的核酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27进行比较时具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；

(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及

(c)评价所述转基因植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时的耐旱性。

8.权利要求7的方法，所述方法还包括：

(d)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及

(e)评价所述子代植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时的耐旱性。

9.评价植物耐旱性的方法，所述方法包括：

(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有的核酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27进行比较时具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；

(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；

(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及

(d)评价所述子代植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时的耐旱性。

10.测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括：

(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有的核酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27进行比较时具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；

(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及

(c)测定所述转基因植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

11.权利要求10的方法，所述方法还包括：

(d)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及

(e)测定所述子代植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物进行比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

12.权利要求10的方法，其中所述测定步骤(c)包括测定所述转基因植物在水限制条件下与不包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

13.权利要求11的方法，其中所述测定步骤(e)包括测定所述子代植物在水限制条件下与不包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

14.测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括：

(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有的核酸序列基于Clustal V比对方法在与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27进行比较时具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；

(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；

(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及

(d)测定所述子代植物在与不包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

15.权利要求14的方法，其中所述测定步骤(d)包括测定所述转基因植物在水限制条件下与不包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

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