CN101948566B

CN101948566B - 一种用于抗真菌、抗癌及细胞成像的多功能聚合物及其制备方法

Info

Publication number: CN101948566B
Application number: CN2010102173346A
Authority: CN
Inventors: 王树; 刘礼兵; 邢成芬
Original assignee: Institute of Chemistry CAS
Current assignee: Institute of Chemistry CAS
Priority date: 2010-06-23
Filing date: 2010-06-23
Publication date: 2012-09-19
Anticipated expiration: 2030-06-23
Also published as: CN101948566A

Abstract

本发明公开了一种用于抗真菌、抗癌及细胞成像的多功能聚合物及其制备方法。该聚合物的结构式如式(I)所示，其中R₁代表链端含有四级胺的直链或支链的烷基，所述烷基的主链长为2-12个碳；R₂代表含有非对称卟啉结构的基团；X代表卤素基团；y为含R₁基团单体的摩尔分数，n为聚合度，n＞8。本发明所提供的聚合物PTP具有双亲结构，该结构可以促使其通过静电及疏水作用与真菌和细胞紧密地结合，并且PTP在水体系中聚集成纳米颗粒促使比较容易的进入癌细胞中；由于光照时可以发生从PTP分子的噻吩主链到侧链卟啉的高效能量转移，提高了体系产生单线态氧的效率，所以对细胞及真菌的杀伤作用很大。因此本发明所提供的新型高效的光敏材料在抗癌、抗菌及细胞成像等方面具有应用价值。

Description

一种用于抗真菌、抗癌及细胞成像的多功能聚合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于抗真菌、抗癌及细胞成像的多功能聚合物及其制备方法。

背景技术

癌症成为威胁人类健康的重要原因，因此癌症的检测和治疗具有极其重要的意义。近年来由于临床上抗生素、免疫抑制剂的广泛使用，特别是AIDS患者的增多，使系统性真菌感染日益增多。光动力疗法(Photodynamic Therapy，PDT)是在近几年来迅速发展起来的一种癌症治疗新技术，而且可以代替传统的抗生素用于治疗细菌和真菌感染。光敏剂是光动力学疗法(PDT)的核心物质，PDT的问世、发展和应用都是随着光敏剂研究的发展而逐渐完善改进的。设计发展新型高效的光敏剂材料在治疗癌症及真菌感染方面具有极其重要的意义。

目前，在光动力疗法的光敏材料主要有卟啉类、酞菁类以及吩噻嗪类等。虽然这些材料能够比较有效地应由于抗菌抗癌领域中，但是由于真菌是一类具有坚韧细胞壁的真核生物，增加了光敏剂进入其细胞的难度，因此需要提高光敏剂和光的剂量。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有抗癌、抗真菌活性以及细胞成像功能的聚合物。

本发明所提供的聚合物的结构式如式(I)所示：

式(I)；

式(I)中R₁代表链端含有四级胺的直链或支链的烷基，所述烷基的主链长为2-12个碳；R₂代表含有非对称卟啉结构的基团；X代表卤素基团；y为含R₁基团单体的摩尔分数，其取值为0.9-0.99；n为聚合度，n＞8。

该聚合物可命名为PTP。

其中，R₁具体可选自下述基团中的任意一种：6-三甲胺基己基、6-三乙胺基己基、5-三甲胺基戊基、5-三乙胺基戊基、4-三甲胺基丁基、4-三乙胺基丁基、3-三甲胺基丙基和3-三乙胺基丙基；

R₂具体可选自下述基团中的任意-种：5-[4-(6-(4-苯氧基)己氧基)苯基]-10，15，20-三对甲苯基卟啉、5-[4-(6-(4-苯氧基)戊氧基)苯基]-10，15，20-三对甲苯基卟啉、5-[4-(6-(4-苯氧基)丁氧基)苯基]-10，15，20-三对甲苯基卟啉和5-[4-(6-(4-苯氧基)丙氧基)苯基]-10，15，20-三对甲苯基卟啉；

X具体可为氯、溴或碘。

式(I)所示聚合物的制备方法，包括下述步骤：在无水三氯化铁存在的条件下，使式(II)所示化合物与式(III)所示化合物在氮气气氛中进行反应，得到所述聚合物；

(式II) (式III)

其中，式(II)中的R₁、X与式(I)中得R₁、X相同，式(III)中的R₂与式(I)中得R₂相同。

所述反应可在有机溶剂(如氯仿)中进行；所述反应的反应温度为室温，反应时间为2-3天。

本发明的再一个目的是提供式(I)所示聚合物的应用。

本发明的所提供的式(I)所示聚合物的应用包括下述四个方面：

1)该聚合物作为荧光探针在细胞成像中的应用；

2)该聚合物在光动力疗法中监测细胞凋亡的应用；

3)该聚合物在制备光动力疗法用癌细胞凋亡诱导剂中的应用；

4)该聚合物在制备光动力疗法用抗真菌剂中的应用。

在所述细胞成像的应用中，所述细胞可为癌细胞，如肾癌细胞，具体可为肾癌细胞A498。

在所述光动力疗法中监测细胞凋亡的应用中，聚合物PTP可以对细胞进行染色，光照之前，通过荧光显微镜观察PTP主要集中在细胞的细胞膜部位，活细胞的细胞核不能被聚合物染色；而当细胞死亡或者凋亡晚期，PTP可以进入细胞的细胞核，从而实现对细胞凋亡的监测。

在所述制备光动力疗法用癌细胞凋亡诱导剂中的应用中，所述癌细胞可为肾癌细胞和/或肺癌细胞，所述肾癌细胞优选为肾癌细胞A498，所述肺癌细胞优选为肺癌细胞A549；所述光动力疗法中光照条件可为：光源470nm白光，光照30min，光照强度为1.4mW·cm^-2。

在所述制备光动力疗法用抗真菌剂中的应用中，所述真菌可为黑曲霉菌；所述光动力疗法中光照条件可为：光源470nm白光，光照30min，光照强度为50mW·cm^-2。

真菌细胞壁的主要成分为多糖、蛋白质、类脂等，真菌表面带有负电荷，而式(I)所示聚合物均带有正电荷，所以真菌通过静电作用和疏水作用与双亲分子PTP紧密结合，这样可以使PTP在光照条件下产生的单线态氧与真菌细胞壁足够近，进而有效地破坏其细胞壁并抑制孢子的萌发。由于光照时可以发生从PTP分子的噻吩主链到侧链卟啉的高效能量转移，能提高体系产生单线态氧的效率，所以对细胞及真菌的杀伤作用很大。

本发明所提供的聚合物具有下述四大优点，第一：共价连接到化合物PTP侧链的卟啉部分所占摩尔比例很小(约1-10％)，因此可以降低光敏材料暗处的毒性；第二：PTP的双亲结构可以促使其通过静电及疏水作用与真菌及细胞紧密地结合，并且PTP在水体系中聚集成纳米颗粒促使比较容易的进入癌细胞中；第三：把能量受体分子共价连接到PTP上可以减小与能量供体部分的距离，进而提高从供体到受体的能量转移效率，因此提高了单线态氧的产生效率，这样提高了光敏材料对细胞的杀伤作用；第四：可以通过PTP的荧光监测细胞的凋亡或死亡过程。本发明在抗癌、抗菌及细胞成像等方面具有应用价值。

附图说明

图1为PTP-1的H-NMR图谱。

图2为PTP中单体摩尔百分数的线性关系图。

图3为在光照(激发波长为470nm)条件下，不同PTP浓度对应的肾癌细胞存活率曲线。

图4为实施例3中光照前后聚合物PTP-1对肾癌细胞的染色图像，其中左图为光照前图像，右图为光照30分钟的后图像。

图5为实施例6中在白光条件下，不同剂量PTP的抑菌效果图。

具体实施方式

以下的实施例为了便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、PTP-1(式(I)中，R₁＝6-三甲胺基己基，R₂＝5-[4-(6-(4-甲基苯氧基)己氧基)苯基]-10，15，20-三对甲苯基卟啉，X＝溴，y为0.99，n＞8)的合成

1、5-[4-(6-溴己氧基)苯基]-10，15，20-三对甲苯基卟啉的合成

757mg吡咯、805mg 4-(6-溴己氧基)苯甲醛与1.02g对甲苯甲醛溶解在154mL氯仿中搅拌15min，加入389mg三氟化硼乙醚，充分搅拌1h，加入1.91g 2，3-二氯-5，6-二氰-对苯醌(DDQ)，混合液继续搅拌2h，然后加入三乙胺，粗产物硅胶柱层析分离纯化，展开剂为石油醚/二氯甲烷(1/1，v/v)，得紫色粉末(产物)256mg。

产物的表征：

¹H-NMR：(400MHz，CDCl₃)δ(ppm)8.85(s，8H)，8.10-8.08(d，8H)，7.56-7.54(d，6H)，7.27-7.25(d，2H)，4.26-4.23(t，2H)，3.52-3.48(t，2H)，2.67(s，9H)，2.01-1.98(m，4H)，1.66-1.65(m，4H)，-2.77(s，2H).。

表征数据表明：得到了5-[4-(6-溴己氧基)苯基]-10，15，20-三对甲苯基卟啉。

2、4-(2-(3-噻吩)乙氧基)苯酚的合成

4.4g对苯二酚与1.38g碳酸钾溶解在150ml丙酮中，加入30mg 18-冠醚-6和256mg 2-(3-噻吩)-乙醇对甲苯磺酸酯，氮气气氛下反应液升温至70℃，反应48h；反应停止并冷却至室温后除去溶剂，反应液倒入水中，并用二氯甲烷萃取，合并有机相，用蒸馏水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩；粗产物硅胶柱层析分离纯化，展开剂为石油醚/乙酸乙酯(80/1，v/v)，得到浅黄色油状液体(产物)240mg。

产物的表征：¹H-NMR：(400MHz，CDCl₃)δ(ppm)7.26(m，1H)，7.07(s，1H)，7.02-7.01(d 1H)，6.79-6.73(dd，4H)，4.75(s，1H)，4.13-4.10(t，2H)，3.10-3.07(t，2H).

表征数据表明：得到了4-(2-(3-噻吩)乙氧基)苯酚。

3、5-[4-(6-(4-苯氧基-(2-(3-噻吩)乙氧基))己氧基)苯基]-10，15，20-三对甲苯基卟啉的合成

0.24g 4-(2-(3-噻吩)乙氧基)苯酚与0.3g碳酸钾溶解在50mL DMF中，加入10mg 18-冠醚-6和0.91g 5-[4-(6-溴己氧基)苯基]-10，15，20-三对甲苯基卟啉，氮气气氛下反应液升温至70℃，反应24h；反应停止并冷却至室温后倒入水中，并用二氯甲烷萃取，合并有机相，用蒸馏水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩；粗产物硅胶柱层析分离纯化，展开剂为石油醚/乙酸乙酯(40/1，v/v)，得到得紫色粉末(产物)0.46g。

产物的表征：¹H-NMR：(400MHz，CDCl₃)δ(ppm)8.85(s，8H)，8.10-8.08(d，8H)，7.56-7.54(d，6H)，7.26-7.22(m，2H)，7.07-7.02(m，2H)，6.86-6.82(m，3H)，6.58-6.54(m，2H)，4.25-3.99(t，6H)，3.10-3.08(m，2H)，2.70(s，9H)，2.01-1.89(m，4H)，1.68(m，4H)，-2.76(s，2H)。

表征数据表明：得到了5-[4-(6-(4-苯氧基-(2-(3-噻吩)乙氧基))己氧基)苯基]-10，15，20-三对甲苯基卟啉

4、3-(2-(6-溴己氧基)乙基)噻吩的合成

100mL单口瓶中加入663μL 2-(3-噻吩)乙醇、0.206g氢化钠、50mL无水DMF(二甲基甲酰胺)，氮气气氛下反应液室温搅拌30min；然后加入4.6mL 1，6-二溴己烷继续搅拌过夜，反应停止后倒入水中，并用二氯甲烷萃取，合并有机相，用蒸馏水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩；粗产物硅胶柱层析分离纯化，展开剂为石油醚/乙酸乙酯(40/1，v/v)，得到得白色粉末(产物)0.54g。

产物的表征：¹H-NMR：(400MHz，CDCl₃)δ(ppm)7.37(m，1H)，7.15-7.10(m，2H)，3.76(t，2H)，3.57(t，2H)，3.53(t，2H)，3.04(t，2H)，1.99(m，2H)，1.72(m，2H)，1.61-1.45(m，4H)。表征数据表明：得到了3-(2-(6-溴己氧基)乙基)噻吩。

5、3-(2-(6-溴化三甲胺基己氧基)乙基)噻吩的合成

0.29g 3-(2-(6-溴己氧基)乙基)噻吩溶于1mL四氢呋喃中，加入3mL 33％三甲胺的甲醇溶液，反应液升温至40℃反应过夜；反应停止并冷却至室温后除去溶剂，加入正己烷洗涤，然后离心，干燥得白色固体(产物)0.31g。

产物的表征：¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ(ppm)7.27(m，1H)；7.02-6.98(m，2H)，3.65-3.56(m，4H)，3.47(m，11H)，2.91(t，2H，6.78)，1.75(br，2H)，1.58(br，2H)，1.42(br，4H)。

表征数据表明：得到了3-(2-(6-溴化三甲胺基己氧基)乙基)噻吩。

6、PTP-1的合成

在反应瓶中依次加入15mL氯仿，130mg无水三氯化铁，通半小时N₂，然后滴加含135mg(0.386mmol)3-(2-(6-溴化三甲胺基己氧基)乙基)噻吩和33mg(0.033mmol)5-[4-(6-(4-苯氧基-(2-(3-噻吩)乙氧基))己氧基)苯基]-10，15，20-三对甲苯基卟啉的10mL氯仿溶液，室温反应2天。抽滤，滤饼用甲醇洗涤，得到固体用二甲基亚砜/水(1/10，v/v)溶解，利用截留分子量为3500Da的透析袋透析(2天换水8次)；除去溶剂，干燥得到11mg深红色固体(产物)。

产物的表征：¹H-NMR：(400MHz，d⁶-DMSO)δ(ppm)7.31(br)，3.70(br)，3.44-3.31(br)，3.08-2.67(br)，1.65-1.54(br)，1.34-1.24(br).。

表征数据表明：得到了化合物PTP-1。

PTP-1中单体摩尔分数的验证：

根据PTP-1中含卟啉基团的单体在422nm处有紫外吸收；而以含四级胺的单体制备的共聚物，其聚噻吩主链在422nm处和385nm处均有紫外吸收。

将含卟啉基团的单体和以含四级胺的单体制备的共聚物以不同摩尔比例混合，测定该混合溶液在422nm和385nm紫外吸收值。将上述混合液中含卟啉基团单体的摩尔分数记为(1-y)。以A_422nm/A_385nm为横坐标、(1-y)％为纵坐标作图，见图2。所得的标准曲线方程为(1-y)＝-0.732+0.94x。

然后将PTP-1配制成溶液并测定A_422nm、A_385nm值，计算A_422nm/A_385nm＝2.4。

将该值代入标准曲线方程中，计算得到(1-y)％＝-0.732+0.94*2.4＝1.5。说明所制备得到的PTP-1中含四级胺单体的摩尔分数为1.5(％)。

实施例2、白光照射下PTP-1产生单线态氧能力的检测

向300μL PTP-1的水溶液(浓度为10μM)中加入6μL 9，10-二苯基蒽丙酸钠(ADPA)的水溶液(6mM).D₂O代替H₂O作为溶剂。用白光照射样品，光照强度为50mW/cm²，测量样品光照0分钟，1分钟，2分钟，3分钟，4分钟，5分钟后的紫外吸收光谱，观察9，10-二苯基蒽丙酸钠(ADPA)在378nm的吸收值(A_378nm)随着光照时间的变化，结果如下表所示：

t(分钟)	0	1.0	2.0	3.0	4.0	5.0
							A_378nm	1.00131	0.40467	0.19133	0.12843	0.09697	0.0787

在含有PTP-1的水溶液中，光照后9，10-二苯基蒽丙酸钠(ADPA)在378nm的吸收随着光照时间的增加显著降低，说明光照条件下PTP-1可以高效地产生单线态氧。

实施例3、PTP-1在监测细胞凋亡过程中的应用

1)细胞复苏和培养

将肾癌细胞A498冻存管从液氮中取出，置37℃恒温水浴中快速融化。转入细胞培养瓶，加入含10％新生牛血清的DMEM培养液10mL，置CO₂培养箱(5％CO₂，95％过滤空气，37℃恒温)中培养。

2)细胞给药

将状态良好的肾癌细胞A498消化之后，按8×10⁴个/mL的细胞密度传代接种到35mm培养皿中，在培养箱放置24h后，吸去培养基，用1×PBS洗涤一次细胞，加入1mL含10％血清的DMEM培养基，加入10μM的PTP-1，继续培养12h后用荧光显微镜观察染色结果。

PTP-1可以对细胞进行染色，其主要集中在细胞的细胞膜部位(见图4)。

3)光照已给药细胞

将步骤1)准备的细胞用波长470nm的光照射，光照强度为1.4mW·cm^-2，时间分别为0，10和30分钟，然后加入溴乙锭，混匀1-2分钟后，用荧光显微镜观察结果，见图4。

随着光照时间的增加，细胞的体积变小，细胞质浓缩，染色质边集，进而细胞裂解和凋亡小体形成。活细胞的细胞核不能被聚合物染色，而当细胞死亡或者凋亡晚期，溴乙锭染料和聚合物同时都可以进入该细胞的细胞核。

实施例4、光动力疗法诱导肾癌细胞A498凋亡的应用

细胞存活率分析：四甲基偶氮唑盐比色法(MTT方法)是常用的分析细胞活性的方法，利用活细胞线粒体脱氢酶能将MTT盐还原成蓝紫色不溶于水的甲瓒颗粒，以颗粒溶解后呈现的颜色深浅反映细胞活性，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目，然后计算存活率。

(1)光照条件下，PTP-1浓度与细胞存活率的关系

收集对数期细胞，调整肾癌细胞A498悬液浓度，每孔加入100μL，铺板使待测细胞密度调至4～7×10⁴/mL，5％CO₂，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度的PTP-1溶液(浓度依次为0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0μM)，5％CO₂，37℃孵育24小时，吸去培养基，用1×PBS洗涤一次细胞，加入100μL含10％血清的DMEM培养基，用470nm的光光照，时间分别为30分钟，光照强度为1.4mW·cm^-2。光照后细胞继续培养24小时，弃掉培养液，每孔加入100μLMTT溶液(1mg/ml，继续培养4h。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150μL二甲基亚砜，测量OD_520nm处各孔的吸光值。实验组与对照组的比率即为细胞的存活率。

以PTP-1的浓度为横坐标，细胞存活率为纵坐标作图，见图3。由图3可知，随着药物PTP-1浓度的增加，细胞存活率逐渐减小。结果表明，光照条件下，药物PTP-1对肾癌细胞A498具有显著的杀伤效应。

(2)光照条件下，光照时间与细胞存活率的关系

收集对数期细胞，调整肾癌细胞A498悬液浓度，每孔加入100μL，铺板使待测细胞调密度至4～7×10⁴/mL，5％CO₂，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入PTP-1(10μM)，5％CO₂，37℃孵育24小时，吸去培养基，用1×PBS洗涤一次细胞，加入100μL含10％血清的DMEM培养基，用470nm的光光照，时间分别为0分钟，10分钟，20分钟，30分钟，光照剂量为2.5J·cm^-2。光照后细胞继续培养24小时，弃掉培养液，每孔加入100μL MTT溶液(1mg/ml，继续培养4h。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150μL二甲基亚砜，测量OD_520nm处各孔的吸光值。实验组与对照组的比率即为细胞的存活率。

光照条件下，药物PTP-1对肾癌细胞A498具有显著的杀伤效应。在PTP-1浓度为10μM时，光照时间为0，10，20，30分钟时，细胞的存活率分别为100％，93％，64％，34％随着药物光照时间的增加，细胞存活率逐渐减小。

实施例5、光动力疗法诱导肺癌细胞A549凋亡的应用

收集对数期细胞，调整肺癌细胞A549悬液浓度，每孔加入100μL，铺板使待测细胞调密度至4～7×10⁴/mL，5％CO₂，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度的PTP-1溶液(浓度依次为0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0μM)，5％CO₂，37℃孵育24小时，吸去培养基，用1×PBS洗涤一次细胞，加入100μL含10％血清的DMEM培养基，用470nm的光光照，时间分别为30分钟，光照强度为1.4mW·cm^-2。光照后细胞继续培养24小时，弃掉培养液，每孔加入100μLMTT溶液(1mg/ml，继续培养4h。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入150μL二甲基亚砜，测量OD_520nm处各孔的吸光值。实验组与对照组的比率即为细胞的存活率。

光照条件下，药物PTP-1对肺癌细胞A549具有显著的杀伤效应。随着药物PTP-1浓度的增加，细胞存活率逐渐减小，在PTP-1浓度为10μM时，光照30分钟后细胞存活率降低到32％左右。

实施例6、光照条件下，PTP-1的抗真菌效应

(一)黑曲霉菌种的复苏培养

在超净工作台中划破所购买的装有黑曲霉的安培瓶，加入少许灭菌蒸馏水，用接种环轻沾，然后划线接种于新制备的改良马丁培养基斜面上，使之充分分布在斜面上，室温避光培养(约26℃)。大约4-5天，待斜面培养基上长出分生孢子后，用接种环移至另一斜面上培养，如此连续传3-4代培养，获得稳定的菌株。

(二)PTP-1与真菌的自组装

(1)PTP-1/真菌的荧光显微镜观察

取长出孢子的黑曲霉，加入少许无菌的Millipore水，并用接种环轻刮菌丝，制备孢子悬液。使用时，用液体的改良马丁培养基将孢子浓度稀释到5×10⁵个/mL，加入10μMPTP-1，放于26℃培养4h，用荧光显微镜观察。

黑曲霉是一种普通的丝状真菌，它的细胞壁是由壳多糖、葡聚糖、磷酸盐以及少量蛋白质和脂类等组成，使得具有双亲性的PTP-1分子可以通过静电吸引力和疏水相互作用力在黑曲霉表面吸附组装。在荧光显微镜下可以看到明场的黑曲霉与PTP-1的荧光位置完全重合，黑曲霉所显现的荧光是PTP-1吸附在真菌表面所发出的荧光。

(2)PTP-1/真菌的电镜观察

取处理好的、干净的小块硅片，将待检的较浓的菌丝直接涂上，自然干燥。然后将上述样品置于1％～2％戊二醛磷酸缓冲液(pH7.2左右)中，于40℃冰箱中固定过夜。次日以0.15％的戊二醛磷酸缓冲液冲洗，再用40％、70％、90％和100％的乙醇分别依次脱水，每次15min。最后将样品冷冻干燥，观察组装体的微观结构。

低倍镜下出现了很多线状的真菌菌丝，直径在3～5μm，高倍镜下菌丝的外表面十分光滑，加了PTP-1之后的组装体PTP-1/真菌在高倍镜下可以看到在菌丝的外表面有一层连续且粗糙的膜状结构。说明PTP-1与真菌具有很强的结合能力，可以很好的吸附到真菌的表面。

(三)光照条件下PTP-1的抗菌效果

(1)菌接种液的制备

接种黑曲霉(CGMCCC，编码：3.0808)的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，26℃培养4～5天，加入灭菌水，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液至无菌试管内。此孢子悬液用液体的改良马丁培养基和无菌的Millipore水稀释至浊度为5×10⁵个/mL。

(2)真菌给药

在无菌条件下，使用无菌的96微孔反应板，每排加入80μL步骤(1)准备的黑曲霉悬浮液，由低浓度到高浓度的顺序(浓度依次为0，3.0，5.0，9.0，15.0μM)加入20μL相应的药物PTP-1，生长对照孔不加药物。

(3)光照条件下，PTP-1的抗真菌效果

白光照射步骤(2)准备的孢子悬浮液，光照强度为50mW/cm²，光照时间为30分钟，光照后经26℃培养72h后观察结果，在不搅动的情况下与对照孔进行比较。肉眼观察微孔中真菌的浊度，照片见图4。分光光度计测定微量培养板各孔的浊度，与对照孔进行比较。实验组与对照组的比率即为真菌的存活率。

光照条件下，药物PTP-1具有显著的抑菌效应。随着药物PTP-1浓度的增加，真菌浊度逐渐减小(图5)，PTP-1的最小抑菌浓度为5.0μM。在PTP-1浓度为20μM时，光照30分钟后真菌存活率降低到10％左右。

Claims

1.式(I)所示的聚合物

式(I)；

式(I)中R₁选自下述基团中的任意一种：6-三甲胺基己基、6-三乙胺基己基、5-三甲胺基戊基、5-三乙胺基戊基、4-三甲胺基丁基、4-三乙胺基丁基、3-三甲胺基丙基和3-三乙胺基丙基；

R₂选自下述基团中的任意一种：5-[4-(6-(4-甲基苯氧基)己氧基)苯基]-10，15，20-三对甲苯基卟啉、5-[4-(6-(4-苯氧基)戊氧基)苯基]-10，15，20-三对甲苯基卟啉、5-[4-(6-(4-苯氧基)丁氧基)苯基]-10，15，20-三对甲苯基卟啉和5-[4-(6-(4-苯氧基)丙氧基)苯基]-10，15，20-三对甲苯基卟啉；

X为氯、溴或碘；

y为含R₁基团单体的摩尔分数，其取值为0.99-0.90；

n为聚合度，n＝8。

2.根据权利要求1所述的聚合物，其特征在于：式(I)中所述R₁为6-三甲胺基己基，所述R₂为5-[4-(6-(4-甲基苯氧基)己氧基)苯基]-10，15，20-三对甲苯基卟啉，所述X为溴，y＝0.985，n＝8。

3.根据权利要求2所述的聚合物，其特征在于：所述聚合物按照下述方法进行制备：在无水三氯化铁存在的条件下，使式(II)所示化合物与式(III)所示化合物按照摩尔比0.386∶0.033在氮气气氛中于室温反应2天；反应结束后，抽滤，滤饼用甲醇洗涤，得到的固体用体积比为1∶10的二甲基亚砜与水的混合溶剂溶解，利用截留分子量为3500Da的透析袋透析，除去溶剂，即得到所述聚合物；其中，R₁为6-三甲胺基己基，R₂为5-[4-(6-(4-甲基苯氧基)己氧基)苯基]-10，15，20-三对甲苯基卟啉，X为溴；

(式II) (式III)。

4.制备权利要求1-3中任一所述聚合物的方法，包括下述步骤：在无水三氯化铁存在的条件下，使式(II)所示化合物与式(III)所示化合物在氮气气氛中进行反应，得到所述聚合物；

(式II) (式III)

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述反应在氯仿中进行；所述反应的反应温度为室温，反应时间为2-3天。

6.权利要求1-3中任一所述的聚合物在下述1)-2)中任意一种中的应用：

1)在制备光动力疗法用癌细胞凋亡诱导剂中的应用；

2)在制备光动力疗法用抗真菌剂中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述应用1)中，所述癌细胞为肾癌细胞和/或肺癌细胞；所述光动力疗法中光照条件为：光源470nm白光，光照30min，光照强度为1.4mW·cm^-2。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述应用1)中，所述肾癌细胞为肾癌细胞A498，所述肺癌细胞为肺癌细胞A549。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述真菌为黑曲霉菌；所述光动力疗法中光照条件为：光源470nm白光，光照30min，光照强度为50mW·cm^-2。