CN101935665B

CN101935665B - 一种重组蛋白a基因及其表达产物的制备方法和用途

Info

Publication number: CN101935665B
Application number: CN 201010245004
Authority: CN
Inventors: 谈珉; 胡辉; 郭亚军
Original assignee: ANTIBODIES NATIONAL ENGINEERING RESEARCH CENTER
Current assignee: Shanghai Shengguo Pharmaceutical Development Co.,Ltd.
Priority date: 2006-03-17
Filing date: 2007-03-14
Publication date: 2013-08-28
Anticipated expiration: 2027-03-14
Also published as: CN101935665A

Abstract

本发明提供了一种重组蛋白A基因，具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，及由该基因编码的重组蛋白A。本发明还提供了表达该重组蛋白A基因的重组表达载体PET32a-P，和被它所转化的大肠杆菌BL21/DE3，以及制备重组蛋白A的方法。本发明提供的重组蛋白A用于抗体检测、分离、纯化，并能与层析介质载体组成亲和层析介质。本发明生产的重组蛋白A具有蛋白结合特异性强，亲和力高，纯化效率大大改善的优点，与市售的ProteinA Sepharose 4Fast Flow相比，其动态吸附载量明显提高。

Description

一种重组蛋白A基因及其表达产物的制备方法和用途

本发明为发明名称为：一种重组蛋白A基因及其表达产物的制备方法和用途，申请号为：200710085148.X的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的说，涉及一种重组蛋白A基因，以及含有这种重组基因的载体、转化的菌株和重组蛋白A基因表达的产物，及其制备方法和用途。

背景技术

葡萄球菌蛋白A(Staphylococal Protein A，SPA)是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质。1940年，Vevwey发现在某些金黄色葡萄球菌中，含有一种物质，在双向扩散试验中，能与正常人血清形成沉淀。Jensen(1959)也发现了类似现象，将其命名为A抗原。

1963年Lofkvist等分离了A抗原，并证明它是一种蛋白质，且与糖有区别；Grov(1960)将其命名为葡萄球菌蛋白A，简称SPA蛋白A(ProteinA)。编码SPA的基因于1983年被克隆并在大肠杆菌中表达(Duggleby，C.J and Jones，SA：cloning and expression of the Staphylococcus aureus protein A gene in Escherichiacoli.Nucl Acids Res.11(1983)3065-3076；Lofdahl，S.，Guss，B.，et al；Gene forStaphylococcal protein A.Proc.Natl.Acid.Sci.USA 80(1983)697-701)。对SPA结构和功能的研究发现，SPA分子包含A、B、C、D、E五个同源结构域，每个结构域都有能与IgG自主结合的能力。SPA基因有1600bp。

由于葡萄球菌蛋白A上有5个结构域可以与IgG的Fc区结合，具有与大多数哺乳动物IgG的Fc段结合的能力。作为一种亲和配基，蛋白A被固定在琼脂糖上面，它上面的5个结构域就可以与IgG的Fc自由结合，一分子固定的蛋白A可以与两分子的IgG结合，重组蛋白A其C端有一个胱氨酸，结合IgG的能力更强。重组蛋白A被广泛应用于单克隆抗体或多克隆抗体的分离纯化和检测。在使用含有proteinA的亲和层析技术时，存在亲和力低、纯化效率低等问题，因此在使用该亲和层析技术时，需要一种改进的ProteinA，来实现更高的亲和力，提高纯化的效果。

发明内容

本发明需要解决的技术问题之一是提供一种新的重组蛋白A的基因序列，以克服现有技术的不足。

本发明需要解决的技术问题之二是提供该重组蛋白A的氨基酸序列，以克服现有技术的不足。

本发明需要解决的技术问题之三是提供含有该重组蛋白A基因的载体。

本发明需要解决的技术问题之四是提供被含有重组蛋白A基因的表达载体转化宿主细胞。

本发明需要解决的技术问题之五是提供该重组蛋白A的制备方法。

本发明需要解决的技术问题之六是提供该重组蛋白A的用途。

本发明需要解决的技术问题之七是提供一种由该重组蛋白A和层析介质载体组成的亲和层析介质。

本发明的技术方案如下：

本发明提供的重组蛋白A基因是以3个人工合成的重组蛋白A基因单体串连而成，5‘端Ala-Asp突变成Val-Asp，以形成AccI酶切位点(GTAGAC)，各重组蛋白A基因单体间以AccI酶切位点相连，其中第一个重组蛋白A基因单体前端加入与表达载体相连的NcoI酶切位点，6个His(用于亲和层析，与镍柱结合，减少纯化步骤)和EK酶切位点(将His和DDDDK切去，形成正确的Protein A)，最后一个重组蛋白A基因单体末端加入终止密码子TAA和与表达载体 pET32a相连的BamH I酶切位点。该基因由621个核苷酸构成，编码180个氨基酸。该基因序列及其编码的氨基酸序列见序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。

本发明还构建了含有上述重组蛋白A基因的载体，这些载体的构建方法是按照常规方法，将通过人工合成的重组蛋白A基因单体酶切后接入相应载体的相应酶切位点之间，再以Acc I内切酶酶切，连接成包含多个串连重组蛋白A基因单体的重组蛋白A基因表达载体。

上述含重组蛋白A基因的大肠杆菌表达载体优先由本发明合成的重组蛋白A基因与大肠杆菌表达载体PET32构建成的重组表达载体，命名为pET32a-P。

本发明还提供了利用上述含大肠杆菌重组表达载体的大肠杆菌重组株生产重组蛋白A的方法，该方法是将菌种进行培养发酵使其高效表达重组蛋白A，再收集菌体，经分离纯化得到重组蛋白A产品。

本发明上述能表达重组蛋白A的大肠杆菌菌株优先为由含有重组蛋白A基因的表达载体pET32a-P转化大肠杆菌BL21(DE3)得到的菌株，命名为BL21-pET32a。

本发明生产的重组蛋白A表达于大肠杆菌胞周质中，有利于表达产物的分离纯化。利用本发明表达生产重组蛋白A，具有表达效率高，表达量大(占细菌可溶性蛋白总量的60-80％)，表达时间短(仅3-5小时)，易于纯化等优点。

本发明采用大肠杆菌表达系统生产重组蛋白A，还具有生产周期短(1天)，生产成本低的特点，有利于基因工程重组蛋白A的产业化应用。

本发明的重组蛋白A基因的表达产物重组蛋白A用于与各种不同的层析介质载体如：琼脂糖凝胶、葡聚糖、纤维素、带羟基的高分子聚合物、硅胶等偶联成为亲和层析介质用于抗体的分离纯化。

本发明生产的重组蛋白A具有蛋白结合特异性强，亲和力高，纯化效率大大改善的优点，与市售的ProteinA Sepharose4Fast Flow相比，其动态吸附载量明显提高。

图1是本发明构建的重组表达载体pET32a-P，是在载体pET32a中连入 proteinA基因。

图2：菌体的SDS-PAGE凝胶电泳结果，其中泳道1和5是marker；泳道2是空载体；泳道3是经诱导的BL21-pET32a的碎菌后的上清；泳道4是经诱导的BL21-pET32a的碎菌后的沉淀。

图3：重组蛋白A琼脂糖凝胶5S CP从小鼠腹水中分离纯化IgG2aSDS-PAGE电泳结果：泳道1为标准蛋白Marker，泳道2为腹水，泳道3为本发明的重组蛋白A琼脂糖凝胶5S CP亲和介质的洗脱峰。

图4：重组蛋白A葡聚糖凝胶从小鼠腹水中分离纯化IgG2aSDS-PAGE电泳结果：泳道1为标准蛋白Marker，泳道2为腹水，泳道3为本发明的重组蛋白A葡聚糖凝胶亲和介质所装的柱子的洗脱峰。泳道3中，上、下两条带分别是IgG2a的重链和轻链。

实施例1重组蛋白A基因单体的合成

通过化学合成的方法，设计合成重组蛋白A基因一个重复片段的序列，其序列包括长度为168bp，前端加入与表达载体相连的NcoI酶切位点，6个His(用于亲和层析，与镍柱结合，减少纯化步骤)和EK酶切位点，以及用于连入多个重复片段的AccI酶切位点。另外，还包括终止密码子TAA，及克隆用BamH I限制性内切酶接头共9bp。还须通过化学合成的方法，设计合成重组蛋白A基因一个重复片段的序列，其序列包括长度为168bp，两端为AccI酶切位点，用于构建含有多个重复片段的序列。

实施例2含一个重组蛋白A基因单体的pET32a载体的构建

用限制型内切酶NcoI和BamH I将上述重组蛋白A基因单体切下，与经NcoI及BamHI酶切的载体pET32a连接，转化大肠杆菌，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子，经质粒提取，酶切鉴定后证明重组蛋白A基因单体已克隆至pET32a中。

实施例3含有重组蛋白A基因的pET32a-P载体的构建

将上述含一个重组蛋白A基因单体的pET32a载体及重组蛋白A基因单体以AccI酶切，回收相应片段后连接，转化大肠杆菌，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子，经质粒提取，酶切筛选获得含有3个蛋白A基因单体的重组蛋白A的pET32a-P载体。

实施例4表达重组蛋白A的大肠杆菌菌株BL21-pET32a的构建

用CaCl₂法将pET32a-P转化BL21(DE3)，在含有氨苄青霉素的LB平板上筛选转化子，经质粒检测和酶切分析获得含有pET32a的重组转化子BL21-pET32a。

实施例5利用大肠杆菌工程菌BL21-pET32a生产重组蛋白A

1)菌种的培养发酵

挑取大肠杆菌工程菌BL21-pET32a，接种于LB培养基中，接种量1～2％V/V，于30℃培养过夜，次日在无菌条件下将上述培养好的种子培养基按1∶10-1∶5接种于发酵培养基上，30℃发酵至O.D600达到0.4～0.8，升温至42℃诱导，3～5小时后离心收菌；

取少量细胞加2×上样缓冲液，按标准做SDS-PAGE凝胶电泳，结果如说明书附图2，经诱导的BL21-pET32a的碎菌后的上清在20kD的位置出现一条新的蛋白带(见图2泳道3)，转化PET32空载体的BL21(DE3)菌和经诱导的BL21-pET32a的碎菌后的沉淀中不出现此带(见图2泳道2和4)，证明重组蛋自A已在BL21-pET32a中诱导可溶表达。

2)表达的重组蛋白A的纯化

将上述收集菌体用NaCl十磷酸盐缓冲液(pH7.0-8.0)悬浮，超声破碎，4℃离心，收集上清，得粗提液。

经SDS-PAGE电泳检测表明，用本法提取表达于大肠杆菌胞周质的重组蛋白A效果很好，粗提后大部分重组蛋白A被粗提，残存于菌体的量极微：将粗提液进行Sephacryl 5200分子筛纯化，收集特征峰(第二洗脱峰)即为纯化的重组蛋白A，其纯度可达90％以上。

实施例6 ELISA方法检测重组蛋白A与抗体结合活性的试验

1)包被：在96孔板中每孔包被重组蛋白A样品100u l，37℃，1h；

2)封闭：每孔以100u l的1％的BSA封闭，37℃，1h；

3)加一抗：每孔加入约100ug人IgG抗体，37℃，1h；

4)加二抗：每孔加入约100u l1∶1000辣根过氧化物酶标记抗体，37℃，1h；

5)显色。

经ELISA检测表明本发明提取的重组蛋白A与人IgG抗体结合活性强，每孔包被4.5ng重组蛋白A即可获得明显的检测信号，结果显示本发明提供的重组蛋白A可用于抗体的检测。

实施例7 重组蛋白A琼脂糖凝胶5S CP的制备

1、用环氧氯丙烷、氢氧化钠与琼脂糖(5％的交联琼脂糖凝胶)在水介质中进行反应，在30-60℃的温度下反应2-3小时，反应完后用蒸馏水清洗至中性后抽干；

2、将上述产物与本发明的重组蛋白A在5-25℃温度下反应15-20小时，反应完后清洗再抽干，即得到重组蛋白A琼脂糖凝胶5S CP

重组蛋白A琼脂糖凝胶5S CP具有以下特性：

1)特点：基团脱落少，结合特异性强；

2).配基密度：≈6mg重组蛋白A/ml；

3)吸附载量：3～30mg鼠IgG2a/ml；

4)亲和介质的颗粒大小：30-180μm；

5)最大流速：250cm/h

6)pH范围：2-11；

7)保存温度：4-8℃；

8)保存液体：20％乙醇。

如果待分离纯化的抗体与亲和层析介质间的吸附力比较弱，则可适当提高吸附缓冲液的pH值和盐浓度，即可获得较好的分离效果。

实施例8重组蛋白A琼脂糖凝胶5S CP从小鼠腹水中分离纯化IgG2a

1、重组蛋白A琼脂糖凝胶5S CP装柱，1.6×20cm，柱床体积为10ml；

2、用缓冲液A(20mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，即pH7.4的PBS溶液。配制：0.2M NaH₂PO₄19ml，0.2M Na₂HPO₄81ml，NaCl 9g加水至1000ml。)平衡5-10个床体积，流速为1ml/min；

3、将2ml小鼠腹水用缓冲液A稀释到20ml，0.45μm滤膜过滤，上样。流速为1ml/min；

4、用缓冲液A再洗5-10个床体积，流速为1ml/min；

5、用缓冲液B(20mM柠檬酸缓冲液，pH4.0。配制：柠檬酸2.1g加水950ml，用5M NaOH调至pH 4.0，加水至1000ml)洗脱，流速为1ml/min，收集洗脱峰；

6、用纯水流洗10个柱床体积，再用20％的乙醇流洗10个柱床体积，流速为2ml/min，柱子置于4-8℃环境中保存；

7、将分离纯化的IgG2a与对照品同时进行SDS-PAGE电泳分析；(柱子每使用几次后应该用以缓冲液C(0.5M醋酸缓冲液，pH3.0。配制：0.5M醋酸溶液用固体NaOH调至pH 3.0)流洗1次，以便将吸附更牢的蛋白去除。)结果：

SDS-PAGE电泳分析结果见图3，泳道1为标准蛋白Marker，泳道2为腹水，泳道3为本发明的重组蛋白A琼脂糖凝胶5S CP亲和介质所装的柱子的洗脱峰。泳道3中，上、下两条带分别是IgG2a的重链和轻链。试验结果表明了本发明的重组蛋白A琼脂糖凝胶5S CP亲和层析介质一步就可以得到纯度大于95％的IgG2a。

实施例9 重组蛋白A葡聚糖凝胶的制备

1、用环氧氯丙烷、氢氧化钠与葡聚糖凝胶在水介质中进行反应，在30-60℃的温度下反应2-3小时，反应完后用蒸馏水清洗至中性后抽干；

2、将上述产物与本发明的重组蛋白A在5-25℃温度下反应15-20小时，反应完后清洗再抽干，即得到重组蛋白A葡聚糖凝胶。

重组蛋白A葡聚糖凝胶具有以下特性：

1)特点：基团脱落少，结合特异性强；

2)配基密度：≈6mg重组蛋白A/ml；

3)吸附载量：3～30mg鼠IgG2a/ml；

4)亲和介质的颗粒大小：20-130μm；

5)最大流速：200cm/h

6)pH范围：2-11；

7)保存温度：4-8℃；

8)保存液体：20％乙醇。

实施例10 重组蛋白A葡聚糖凝胶从小鼠腹水中分离纯化IgG2a

1、重组蛋白A葡聚糖凝胶装柱，1.6×20cm，柱床体积为10ml；

2、用缓冲液A(20mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，即pH7.4的PBS溶液。配制：0.2M NaH₂PO₄19ml，0.2M Na₂HP0481ml，NaCl 9g加水至1000ml。)平衡5-10个床体积，流速为1ml/min；

4、用缓冲液A再洗5-10个床体积，流速为1ml/min；

7、将分离纯化的IgG2a与对照品同时进行SDS-PAGE电泳分析；

(柱子每使用几次后应该用以缓冲液C(0.5M醋酸缓冲液，pH3.0。配制：0.5M醋酸溶液用固体NaOH调至pH 3.0)流洗1次，以便将吸附更牢的蛋白去除。) 结果：

SDS-PAGE电泳分析结果见图4，泳道1为标准蛋白Marker，泳道2为腹水，泳道3为本发明的重组蛋白A葡聚糖凝胶亲和介质所装的柱子的洗脱峰。泳道3中，上、下两条带分别是IgG2a的重链和轻链，试验结果表明了本发明的重组蛋白A葡聚糖凝胶亲和层析介质一步就可以得到纯度大于95％的IgG2a。

实施例11 重组蛋白A琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶及市售ProteinA Sepharose 4Fast Flow对人IgG1动态吸附载量的测定比较

1、用缓冲液A(20mM磷酸盐缓冲液，pH7.4，即pH7.4的PBS溶液。配制：0.2M NaH₂PO₄19ml，0.2M Na₂HP0₄81ml，NaCl 9g加水至1000ml。)平衡5-10个床体积，流速为1ml/min；

2、已知浓度人IgG1(按中国发明专利01132225.X中公开的实施例得到)上样，流速为1ml/min，至10％穿透时停止；

3、根据样品浓度、上样体积及柱体积计算出10％穿透时各凝胶的动态吸附载量。

根据结果(见表1)可以判断，本专利提供的重组蛋白A琼脂糖凝胶及重组蛋白A葡聚糖凝胶对人IgG1的动态吸附载量均高于市售ProteinA Sepharose 4FastFlow。

表1：各凝胶IgG1动态吸附载量比较

Claims

1.一种重组蛋白A亲和层析介质的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

(1)通过化学合成的方法设计合成重组蛋白A基因单体，5‘端Ala-Asp突变成Val-Asp，以形成AccI酶切位点，各重组蛋白A基因单体间以AccI酶切位点相连，第一个重组蛋白A基因单体前端加入与表达载体相连的NcoI酶切位点，6个His和EK酶切位点，最后一个重组蛋白A基因单体末端加入终止密码子TAA和与表达载体pET32a相连的BamH I酶切位点；

(2)将步骤(1)的重组蛋白A基因单体酶切后接入载体pET32a的相应酶切位点之间，再以Acc I内切酶酶切，连接成包含3个串连重组蛋白A基因单体的重组蛋白A基因表达载体pET32a-P；

(3)将步骤(2)的表达载体pET32a-P转化大肠杆菌BL21(DE3)，筛选、酶切，获得菌株BL21-pET32a；

(4)将步骤(3)的菌株BL21-pET32a进行培养发酵，使其高效表达重组蛋白A，再收集菌体，经分离、纯化得到重组蛋白A产品；

(5)用环氧氯丙烷、氢氧化钠与琼脂糖或葡聚糖凝胶在水介质中进行反应，反应产物与步骤(4)获得的重组蛋白A在5-25℃温度下反应15-20小时，反应完后清洗再抽干，获得重组蛋白A凝胶；

所述重组蛋白A的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)琼脂糖凝胶为5％的交联琼脂糖凝胶。

3.如权利要求1-2中任一项所述的制备方法获得的重组蛋白A亲和层析介质，其中重组蛋白A的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.如权利要求3所述的重组蛋白A亲和层析介质，其中重组蛋白A的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.如权利要求1-2中任一项所述的制备方法获得的重组蛋白A亲和层析介质的用途，其特征在于，所述重组蛋白A亲和层析介质用于抗体分离纯化。

6.如权利要求3-4中任一项所述的重组蛋白A亲和层析介质的用途，其特征在于，所述重组蛋白A亲和层析介质用于抗体分离纯化。