CN101928767A - 用于检测慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因的电化学dna生物传感器 - Google Patents
用于检测慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因的电化学dna生物传感器 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了用于检测慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因的电化学DNA生物传感器,待检测基为慢性粒细胞白血病(CML)的BCR/ABL融合基因,包括如下步骤:(1)根据所选择的待检测CML基因型别通用引物序列的融合位点,对CML的特异性序列进行设计及合成;(2)采用化学键合技术、分子杂交技术、锁核酸探针技术、电化学酶联免疫技术相结合构建电化学DNA生物传感器用于检测CML的BCR/ABL融合基因。该传感器极大地增强了灵敏度和特异性,可实现对慢性粒细胞白血病的早期诊断。
Description
技术领域
本发明涉及用于检测慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因的电化学DNA生物传感器
背景技术
慢性粒细胞白血病,简称慢粒(Chronic Myelocytic Leukemia,CML),是伴有获得性染色体异常的多能干细胞水平的恶性病变而引起的一种细胞株病,其临床特征为显著的粒细胞过度生成。慢性粒细胞白血病是严重危害中青年健康的恶性血液病之一,为白血病中较常见的类型。由于白血病病人在得病初期并没有出现明显的症状,这给白血病的早期诊断以及检测带来了一定程度的困难,而早期诊断水平将直接影响白血病患者的治疗效果及生存质量,其重要意义不言而喻。
目前CML的临床诊断方法主要包括染色体分析、Southern-Blot、FISH、RT-PCR技术等,这些方法都存在一定的局限性,如染色体分析费时费力,且灵敏度低;传统的Southern Blot检测虽特异性强,但对低拷贝基因序列的检测极不灵敏,不仅方法复杂,检测周期长,且价格昂贵兼有放射性污染,限制了临床上的广泛应用;RT-PCR操作繁琐、价格昂贵。如特异性、敏感度不高、操作繁琐、检测费用高等问题,限制了临床中的应用。因此,开发研究一种简便、快速、准确、灵敏、经济的CML基因诊断技术具有极其广阔的应用前景。
电化学DNA生物传感器是采用电化学换能器,用电化学手段选择性检测特定DNA序列(基因)的生物传感器。有关电化学DNA生物传感器的综述性文章已有较多报道,主要针对电极(玻碳电极、金电极、碳糊电极等)表面ssDNA探针的固定化与高灵敏度的电化学杂交指示剂(即标识物)的筛选进行研究。在适当的温度、pH、离子强度下,电极表面的DNA探针分子能与靶序列选择性地杂交,形成双链DNA(dsDNA),从而导致电极表面结构的改变。这种杂交前后的结构差异,可以通过具有电活性的杂交指示剂来识别,从而达到检测靶序列(或特定基因)的目的。
DNA探针与互补链间的相互作用在很大程度上影响了电化学传感器的性能,且用以设计感器的ssDNA多数存在稳定性差的问题。所以,研制高灵敏度和高特异性的DNA探针,将其应用于与互补序列间的杂交信息的检测具有重要意义。
现代分子生物学研究表明慢粒白血病Ph染色体为t(9;22)相互易位所致,其易位产物BCR/ABL融合基因发生于95%以上的慢性粒细胞白血病中,是恶性克隆的标志基因。
下面所述为本发明人率先将设计的慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因探针(5’修饰氨基或巯基探针、5’修饰氨基或巯基发夹探针、5’修饰氨基或巯基锁核酸探针、3’修饰氨基或巯基的捕获探针和5’修饰生物素的信号探针),根据不同类型材料电极(金、玻碳、碳糊电极等),选择不同组装方式将核酸探针修饰到电极表面((表面含有羧基的电极以EDC和NHS作为偶联活化剂将氨基修饰探针到电极表面,金表面电极以金硫键将巯基修饰探针固定到电极表面),形成ssDNA探针修饰电极;再利用电化学杂交指示剂(姜黄素、芦荟大黄素、丹参酮和吖啶酮衍生物)或电化学酶联免疫方法,将DNA杂交前后信息变化转化为可测定的电化学响应信号(电流、电压或电导/电阻)变化,从而实现对目标慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因片断的检测。
发明内容
本发明实施例所要解决的技术问题在于提供用于检测慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因的电化学DNA传感器,旨在解决现有检测方法灵敏度低、检测周期长、价格昂贵等。
本发明实施例是这样实现的,用于检测慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因的电化学DNA传感器,待检测BCR/ABL融合基因,包括如下步骤:
(1)从NCBI基因数据库中查找BCR/ABL融合基因的融合位点,选择位点前后的碱基作为人工合成的探针使用,选出BCL-ABL基因中突变率最高的基因片段作为探针,经过同源比对,将对应序列作为CML的特异性序列进行合成(5’-NH2(或SH)AGA GTT CAAAAG CCCTTC-3’,发夹式5′-NH2(或SH)-(CH2)6-TTCCAAC TCT CAA TGG CTG CCT CCCGTTGG-3′、锁核酸5’-NH2(或SH)、3’端巯基标记的LNA捕获探针5’-CLGG CCA GTA GCLATCT GAC TTTL G-TTT TTT TTT T-SH-3’;5’端生物素标记的LNA信号探针5’-Biotin-GC ALGA GLTT CLAAALAG CLCC TLTC ALG-3’(L为锁核酸单体位置),其中对LNA的设计,考虑到使用最少的锁核酸单体,但能较好地保持探针链的刚性并提高其特异性.
(3)对于氨基或巯基修饰探针,利用化学键合法将探针固定到电极表面(表面含有羧基的电极以EDC和NHS作为偶联活化剂将氨基修饰探针到电极表面,金表面电极以金硫键将巯基修饰探针固定到电极表面),形成ssDNA修饰电极。再利用筛选和合成的电化学杂交指示剂来识别杂交前后电化学信号的变化,选择性地检测靶序列即慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因片断。当互补序列DNA的浓度发生改变时,杂交信息转化为可测定的指示剂电化学响应信号(电流、电压或电导/电阻)变化。在一定范围内指示剂的响应信号与待测DNA片断的浓度成线性关系,从而实现对目标慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因片断的检测。
(4)对于利用酶联免疫方法的修饰探针,采用化学键合法或自组装膜法固定捕获探针,但对金材料电极表面未结合的位点通过封闭剂(巯基己醇,巯基乙酸,牛血清白蛋白,酪蛋白等)进行封闭;在特定的条件下,固定在电极表面的捕获探针和5′端标记有生物素的信号探针杂交可以与目标互补DNA进行杂交;再将修饰有亲和素的酶(辣根过氧化物酶等)利用结合到5′端标记有生物素的信号探针上去,利用酶的信号放大作用,通过检测酶催化底物(3,3′,5,5′-四甲基联苯胺等)杂交前后电信号的差异,从而实现对目标慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因片断的检测
与现有临床慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因技术相比,该技术的检测周期相对较短、灵敏度高,为临床上快速灵敏诊断提供可能。
附图说明
图1为本发明构建了氨基或巯基修饰探针的用于检测慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因的电化学DNA生物传感器的机理图
图2为本发明构建了酶联免疫方法的用于检测慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因的电化学DNA生物传感器的机理图
图3为本发明的锁核酸修饰的三明治型电化学DNA生物传感器检测BCR/ABL融合基因的不同目标序列检测图。
图4为本发明的锁核酸修饰的三明治型电化学DNA生物传感器检测BCR/ABL融合基因的电信号检测图。
图3中:锁核酸探针与完全互补、单碱基错配或完全错配DNA杂交后在三明治型电化学DNA生物传感器检的电流-时间曲线图:完全互补DNA(a),单碱塞错配DNA(b),完全错配DNA(c),捕获探针(d),背景电流(e).
图4中:(A)不同浓度的杂交链电化学信号比较;目标DNA量从(a)到(h)分别为10nM,5nM,1nM,100pM,10pM,100fM and 10fM。插入图片为电流与目标DNA浓度的对数坐标图。(B)电流强度与目标DNA浓度的线性关系图(浓度范围10~250fM)
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
本发明实施例提供的用于检测慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因的电化学DNA传感器,待检测BCR/ABL融合基因,包括如下步骤:
(1)从NCBI基因数据库中查找BCR/ABL融合基因的融合位点,选择位点前后的碱基作为人工合成的探针使用,选出BCL-ABL基因中突变率最高的基因片段作为探针,经过同源比对,将对应序列作为CML的特异性序列进行合成(5’-NH2(或SH)AGA GTT CAAAAG CCCTTC-3’,发夹式5′-NH2(或SH)-(CH2)6-TTCCAAC TCT CAA TGG CTG CCT CCCGTTGG-3′、锁核酸5’-NH2(或SH)、3’端巯基标记的LNA捕获探针5’-CLGG CCA GTA GCLATCT GAC TTTL G-TTT TTT TTT T-SH-3’;5’端生物素标记的LNA信号探针5’-Biotin-GC ALGA GLTT CLAA ALAG CLCC TLTC ALG-3’(L为锁核酸单体位置)。
(2)对于氨基或巯基修饰探针(图1:2探针),利用化学键合法将1×10-6mol/L探针固定到电极表面(图1:1电极)(表面含有羧基的电极以5mmol/L EDC和8mmol/LNHS为偶联活化剂的20μl缓冲液将氨基修饰探针到电极表面;金表面电极以金硫键将巯基修饰探针固定到电极表面,对未结合的金位点通过1×10-5mol/L巯基己醇,1×10-5mol/L巯基乙酸,0.5%牛血清白蛋白,0.5%酪蛋白等封闭剂进行封闭,封闭后,需采用洗涤剂洗涤除去非特异性吸附,如0.2mol/L pH 7.4PBS、0.2%SDS等),形成ssDNA修饰电极。再在合适的条件(DNA杂交溶液酸度、杂交温度、时间、离子强度)下,利用筛选和合成的电化学杂交指示剂(图1:3电化学杂交指示剂)(姜黄素、芦荟大黄素、丹参酮和吖啶酮衍生物)来识别杂交(图1:4目标DNA)前后电化学信号的变化,选择性地检测靶序列即慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因片断。
(3)对于利用酶联免疫方法的巯基(-SH)锁核酸修饰探针(图2)为例,采用自组装膜法固定1×10-6mol/L捕获探针,根据带巯基(-SH)的捕获探针在金电极表面可以形成自组装单分子膜的特性来固定,对金电极表面未结合的位点通过封闭剂进行封闭,如1×10-5mol/L巯基己醇,1×10-5mol/L巯基乙酸,0.5%牛血清白蛋白,0.5%酪蛋白等。封闭后,需采用洗涤剂洗涤除去非特异性吸附,如0.2mol/L pH 7.4PBS、0.2%SDS等。
(4)在相同条件下用紫外分光光度法分别绘制LNA-DNA的解链温度曲线。在石英比色皿中加入一定浓度的LNA探针,而后加入同浓度的互补序列,室温杂交30min。以0.4℃/min的升温速率,从10℃升至110℃,每间隔1℃,于260nm处测得相应溶液的吸光度,并进行空白校正,绘制吸光度-温度曲线。选择特定的温度作为探针与互补链进行杂交的温度;
(5)在特定的温度下,固定在电极表面的捕获探针(1×10-6mol/L)和5′端标记有生物素的信号探针(1×10-6mol/L)杂交可以与目标互补DNA实现共杂交,在电极表面形成三明治结构,此时三明治结构中含有信号探针末端标记的生物素;在酶加入前也需要对未结合的位点通过封闭剂进行封闭,如巯基己醇,巯基乙酸,牛血清白蛋白,酪蛋白等,另外再采用洗涤剂洗涤除去非特异性吸附,如PBS、0.2%SDS等。
(6)由于辣根过氧化物酶(HRP)上修饰有亲和素(avidin),根据亲和素与生物素之间的亲和作用,将酶(浓度稀释1∶1000)结合上去,酶作用后,需采用洗涤剂洗涤除去非特异性吸附,如0.5%Tween 20,0.2mol/L pH 7.4PBS、0.2%SDS等。主要利用酶的信号放大作用,在底物3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)中采用安培电流时间曲线法研究杂交前后电信号的差异。
本发明检测慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因的电化学DNA生物传感器具有高灵敏度,高特异性的特点,且相对其它的检测方法成本低。本发明适应于:慢性粒细胞白血病基因型与肿瘤相关性的研究,白血病发生和发展的检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改,等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.利用电化学DNA生物传感器检测慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因。
2.用于检测慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因的电化学DNA生物传感器,包括不同类型材料电极(金、玻碳、碳糊电极等),不同类型核酸探针(5’修饰氨基或巯基探针、5’修饰氨基或巯基发夹探针、5’修饰氨基或巯基锁核酸探针、3’修饰氨基或巯基的捕获探针和5’修饰生物素的信号探针),不同类型电化学杂交指示剂(姜黄素、芦荟大黄素、丹参酮和吖啶酮衍生物)和电化学酶联免疫方法,进行慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因测定。其特征在于:采用化学键合技术、分子杂交技术、锁核酸探针技术、电化学酶联免疫技术相结合制作电化学DNA生物传感器,该传感器包含与待测DNA互补的修饰核酸探针,通过与目标互补DNA进行杂交,再利用电化学分析方法检测电化学杂交指示剂电信号或酶催化底物产生电信号,从而实现对慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因的测定。
3.如权利要求1和2所述用于检测慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因的电化学DNA生物传感器,其特征在于所述的修饰探针序列为慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因(5’-NH2(或SH)AGA GTT CAAAAG CCC TTC-3’,发夹式5′-NH2(或SH)-(CH2)6-TTCCAAC TCTCAA TGG CTG CCT CCC GTTGG-3′、锁核酸5’-NH2(或SH)--ALGA GTT CALA AAG CCCLTTC-3′、3’端巯基标记的LNA捕获探针5’-CLGG CCA GTA GCLA TCT GAC TTTL G-TTTTTT TTT T-SH-3’;5’端生物素标记的LNA信号探针5’-Biotin-GC ALGA GLTT CLAAALAG CLCC TLTC ALG-3’(L为锁核酸单体位置)。
4.权利要求1、2和3所述的化学键合法,分子杂交技术和电化学分析方法,依序包括如下步骤:利用化学键合法将探针固定到电极表面(表面含有羧基的电极以EDC和NHS作为偶联活化剂将氨基修饰探针到电极表面,金表面电极以金硫键将巯基修饰探针固定到电极表面),形成ssDNA修饰电极。再利用筛选和合成的电化学杂交指示剂来识别杂交前后电化学信号的变化,选择性地检测靶序列即慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因片断。当互补序列DNA的浓度发生改变时,杂交信息转化为可测定的指示剂电化学响应信号(电流、电压或电导/电阻)变化。在一定范围内指示剂的响应信号与待测DNA片断的浓度成线性关系,从而实现对目标慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因片断的检测。
5.权利要求1、2和3所述的电化学酶联免疫方法,依序包括如下步骤:(1)采用化学键合法或自组装膜法固定捕获探针,但对金材料电极表面未结合的位点通过封闭剂(巯基己醇,巯基乙酸,牛血清白蛋白,酪蛋白等)进行封闭;(2)在特定的条件下,固定在电极表面的捕获探针和5′端标记有生物素的信号探针杂交可以与目标互补DNA进行杂交;(3)将修饰有亲和素的酶(辣根过氧化物酶等)利用结合到5′端标记有生物素的信号探针上去,利用酶的信号放大作用,通过检测酶催化底物(3,3′,5,5′-四甲基联苯胺等)杂交前后电信号的差异,从而实现对目标慢性粒细胞白血病BCR/ABL融合基因片断的检测。
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C57 | Notification of unclear or unknown address | ||
DD01 | Delivery of document by public notice |
Addressee: Liu Ailin Document name: Notification to Make Rectification |
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C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20101229 |