CN101914496A - 一种简化的脐带间充质干细胞的规模化制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种脐带间充质干细胞的规模化制备方法。在该方法中，脐带剪切块虽较大，但仍能大量的缩短原代培养时间。培养基含bFGF及FBS，既促进了间充质干细胞贴壁生长，又不影响干细胞的分化能力，至8-9天细胞即达80％左右融合，细胞生长快，传代时间短。

Description

一种简化的脐带间充质干细胞的规模化制备方法

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及一种间充质干细胞的规模化制备方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。

间充质干细胞临床应用于解决多种血液系统疾病，糖尿病及糖尿病足，心血管疾病，肝硬化，脊髓损伤，帕金森病等神经系统疾病，膝关节半月板部分切除损伤修复，自身免疫性疾病等方面取得了重大突破，挽救了许多病患的生命。

间充质干细胞广泛分布于胎儿和成体的骨髓、骨膜、松骨质、脂肪、滑膜、骨骼肌、胎肝、乳牙、脐带、脐带血中，其中脐带来源的间充质干细胞质量高、纯净、数量多。脐带来源的间充质干细胞不但能够成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，而且具有更大的应用潜能。

脐带间充质干细胞表达多种胚胎干细胞的特有分子标志，具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制等特征，因此有可能成为最具临床应用前景的多能干细胞。但脐带间充质干细胞的分离提取过程繁琐且提取效率低，间充质干细胞的规模化制备成了其广泛应用的瓶颈。

目前间充质干细胞制备多采用酶消化法和组织贴壁法来制备。酶消化法提取脐带间充质干细胞是将脐带组织剪成碎块后，用胰蛋白酶和胶原酶消化1-2小时，用含胎牛血清的培养基终止酶消化，然后洗涤细胞弃去消化酶，洗涤后的细胞接种至培养器皿中进行培养扩增。洗涤细胞需时约1小时，且洗涤过程中对细胞损伤较重，操作步骤繁琐，易污染，消化酶对细胞损伤亦较重，最终导致获得的细胞活力低、增殖慢。组织贴壁法是目前应用比较广泛的一种方法，传统的组织贴壁法是将脐带组织剪碎，要求组织剪碎程度很高，要剪至肉糜状，剪切时间在30min以上，耗时费力；离心洗去组织液后接种培养，间充质干细胞贴壁生长较慢，多需要10-14天。

酶消化法制备间充质干细胞耗时长，操作过程中对细胞损伤较大，使得分离得到的间充质干细胞活力低、增殖慢。组织贴壁法要求脐带组织剪碎程度很高，操作费力，且细胞贴壁慢，生长慢。

发明内容

本发明人针对上述缺点，广泛查阅大量国内外文献，在现有间充质干细胞制备技术的基础上，改进组织贴壁法制备技术，使组织块剪切过程不再费力，且在培养液中添加bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)，可以加快细胞的贴壁和生长，就使得整个原代培养时间由原来的10-14天大为缩短。

本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种脐带间充质干细胞的制备方法，包括以下步骤：

1)新鲜脐带，用PBS缓冲液冲洗；所述PBS缓冲液含100kU/L青霉素及100mg/L链霉素；

2)剪取6-8cm长脐带，将脐带剪成2cm长的小段，用PBS缓冲液反复冲洗；所述PBS缓冲液含100kU/L青霉素及100mg/L链霉素；

3)将脐带组织块剪碎成2-3mm³小块；

4)将剪碎组织加入L-DMEM培养基洗涤，在650g条件下离心5分钟，弃上清；

5)将组织块和培养基按体积比2.5-3∶1比例加入培养基，混匀组织块，接种至细胞培养皿中，置培养箱培养；所述的培养基为含1-10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及体积百分比10％-15％胎牛血清(FBS)的L-DMEM培养基；

6)24小时后补加步骤5所述的培养基。

7)每3天换一次培养基，第6天后换含体积比10％胎牛血清的L-DMEM培养基，至8-9天细胞达80％左右融合时传代；传代培养基为含体积比10％胎牛血清的L-DMEM培养基；

8)以后每3天传代一次。

附图说明

图1：人脐带来源的间充质干细胞的细胞形态：(A-C)是采用本发明的方法获得的间充质干细胞原代第4、5、7天的细胞形态；(D-F)是间充质干细胞第一代第1、2、3天后的细胞形态；(G)是间充质干细胞第二代第3天的细胞形态；(H-J)是间充质干细胞第三代第1、2、3天的细胞形态。

图2：人脐带间充质干细胞的细胞生长曲线

图3：流式细胞术细胞表型分析

技术效果

1、脐带冲洗彻底，冲洗液中含有抗生素，可以最大量洗去污物和残存血，避免污染。

2、脐带剪切块较大，剪切省时省力。在此情况下仍能大量的缩短原代培养时间。

3、确定了混匀组织块时添加培养基的最佳比例，避免了培养基不足或多余对细胞培养的影响。

4、培养基为含bFGF(浓度1-10ng/ml)及10％-15％FBS的新鲜完全培养基L-DMEM。添加的低浓度bFGF既促进了间充质干细胞贴壁生长，又不影响干细胞的分化能力。

5、第6天后换培养基为(L-DMEM+FBS)，至8-9天细胞达80％左右融合时传代，细胞生长快，传代时间短。

具本实施方式

1.新鲜脐带，经过病毒检测合格后，用含100kU/L青霉素及100mg/L链霉素的PBS缓冲液((pH7.2～7.4)，含NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 4.3mmol/L，KH₂PO₄ 1.4mmol/)洗去污物及血液。

2.剪取大约6-8cm脐带，将脐带剪成2cm左右的小段，用含100kU/L青霉素及100mg/L链霉素的PBS缓冲液尽量冲去脐静脉及动脉内的残存血。

3.用脐带剪将脐带组织块剪碎成2-3mm³小块。

4.将剪碎组织加入L-DMEM培养基(Gibco公司，USA)洗涤，在650g条件下离心5分钟，弃上清。

5.按照2.5-3∶1比例(组织块：培养基，体积比)加入培养基(L-DMEM+FBS+bFGF)(即，含1-10ng/ml bFGF及体积百分比10％-15％FBS的L-DMEM培养基)混匀组织块，接种至细胞培养皿中，置37℃、5％CO₂的饱和湿度培养箱培养。所述FBS为胎牛血清，bFGF为碱性成纤维细胞生长因子。

6.24小时后补加步骤5所述的培养基。

7.每3天换一次培养基，5-6天组织块周围见梭形细胞爬出。第6天后换培养基为(L-DMEM+体积比10％FBS)，至8-9天细胞达80％左右融合时传代；传代培养基为L-DMEM+体积比10％FBS。

8.以后每3天传代一次，至第三代鉴定。

各阶段的间充质干细胞的细胞形态、生长状况、细胞表型分析见图1、图2、图3。对照实验(常规组织块贴壁法)

1.取脐带，无菌生理盐水冲洗去污物及血液；

2.无菌手工剪脐带至1-2mm³大小。

3.将组织块转移入50ml的离心管中，加入含1％青链霉素的PBS缓冲液40ml，室温在250g条件下离心5分钟，弃上清。

4.所获组织块用含体积比10％的DMEM培养基培养，每3天换一次培养。

5.7天左右组织块周围有梭形及多角形细胞爬出，10-14天左右细胞才达80％左右融合，用0.25％胰酶消化传代。

实验结果：本发明的方法，脐带冲洗液中含有抗生素，可以最大量洗去污物和残存血，避免了污染；脐带剪切块虽较大，但仍能大量的缩短原代培养时间；确定了混匀组织块时添加培养基的最佳比例，培养基为含bFGF(浓度1-10ng/ml)及10％-15％FBS的新鲜完全培养基L-DMEM，既促进了间充质干细胞贴壁生长，又不影响干细胞的分化能力，至8-9天细胞即达80％左右融合，细胞生长快，传代时间短。

Claims (2)

1.一种脐带间充质干细胞的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)新鲜脐带，用PBS缓冲液冲洗；

2)剪取6-8cm长脐带，将脐带剪成2cm长的小段，用PBS缓冲液反复冲洗；

3)将脐带组织块剪碎成2-3mm³小块；

4)将剪碎组织加入L-DMEM培养基洗涤，在650g条件下离心5分钟，弃上清；

5)将组织块和培养基按体积比2.5-3∶1比例加入培养基，混匀组织块，接种至细胞培养皿中，置培养箱培养；所述的培养基为含1-10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子及体积百分比10％-15％胎牛血清的L-DMEM培养基；

6)24小时后补加步骤5所述的培养基；

7)每3天换一次培养基，第6天后换含体积比10％胎牛血清的L-DMEM培养基，至8-9天细胞达80％左右融合时传代；传代培养基为含体积比10％胎牛血清的L-DMEM培养基；

8)以后每3天传代一次。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述PBS缓冲液含100kU/L青霉素及100mg/L链霉素。

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