[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

CN101883866A - 通过同时等温扩增核酸和信号探针检测核酸的方法 - Google Patents

通过同时等温扩增核酸和信号探针检测核酸的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN101883866A
CN101883866A CN2008801189206A CN200880118920A CN101883866A CN 101883866 A CN101883866 A CN 101883866A CN 2008801189206 A CN2008801189206 A CN 2008801189206A CN 200880118920 A CN200880118920 A CN 200880118920A CN 101883866 A CN101883866 A CN 101883866A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
rna
target
hybrid
isothermal duplication
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN2008801189206A
Other languages
English (en)
Inventor
金珉焕
李淑
金云玉
郑芝媛
李珠熙
Original Assignee
Raplegene Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Raplegene Inc filed Critical Raplegene Inc
Publication of CN101883866A publication Critical patent/CN101883866A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/161—Modifications characterised by incorporating target specific and non-target specific sites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
    • C12Q2527/101—Temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/119—Strand displacement amplification [SDA]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及通过使用外引物组、DNA-RNA-DNA杂种引物组和DNA-RNA-DNA杂种信号探针同时等温扩增靶核酸和信号探针5而检测靶核酸的方法。与常规方法如PCR相比，本发明的方法可以用于以快速精确方式而没有污染风险地扩增样品中的靶核酸，并且其能同时扩增靶核酸和信号探针，由此其可以用于多种基因组计划，检测和鉴定病原体，检测产生预定基因型的基因修饰，检测遗传疾病或确定对疾病的敏感性，以及估测基因表达。因此，其可用于分子生物学研究和疾病诊断。

Description

通过同时等温扩增核酸和信号探针检测核酸的方法
技术领域
本发明涉及等温扩增核酸和信号探针的方法，并且涉及通过等温扩增信号探针检测靶核酸的方法。更特别地，本发明涉及使用外引物组、DNA-RNA-DNA杂种引物组和DNA-RNA-DNA杂种信号探针通过同时扩增靶核酸和信号探针快速检测靶核酸的方法。
背景技术
核酸扩增技术对于检测和分析少量核酸非常有用。核酸扩增中对于靶核酸的高灵敏性使得能够在用于诊断和分析感染性疾病和遗传疾病的基因分离领域以及在法医学领域开发检测特异性核酸的技术。基于这种检测核酸的方法，已经开发了能够进行非常灵敏的诊断和分析的多种方法(Belkum，CurrentOpinion in Pharmacology，3：497，2003)。通过DNA链的互补性和单链核酸在体外形成双链杂种分子的能力实现了核酸的检测。由于这种能力，可以在样品中检测特异性核酸(Barry et al，Current Opinion in Biotechnology，12：21，2001)。
用于核酸检测的探针由能够与核酸样品中存在的靶序列杂交的特异序列组成。探针通过化学材料、免疫化学物、荧光材料或放射性同位素读取。通常，探针包括能够读取DNA杂交的荧光材料和与靶核酸具有互补序列的核酸片段，或者标记或报道分子如生物素和洋地黄毒苷(digoxygenin)。
然而，上述方法的问题在于它们不能检测染色体DNA上的短序列，导致低拷贝数和难于解决野生型基因修饰的等位基因的有限拷贝数的问题。上述方法的另一个问题涉及体外或原位环境条件，其限制了靶序列、化学物、探针和另一种分子结构之间的物理学相互作用。
检测靶核酸的方法分为3类，即(1)靶序列扩增，其中扩增靶核酸(2)探针扩增，其中扩增探针分子自身，和(3)信号扩增，其中通过探针杂交技术或多重连接依赖性探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification)技术增加每种探针信号。
体外核酸扩增技术在检测和分析少量核酸中被用作主要方法。其中，PCR(聚合酶链反应)被最广泛地用作核酸扩增技术，其使用互补序列的每条链作为模板同时进行引物依赖性核酸合成的重复循环，因此合成互补序列的每条链的拷贝。然而，为了进行PCR，需要预先编程的热循环设备。而且，PCR技术基因以下缺点：其成本高；其具有相对低的特异性；操作程序应极端标准化以重复PCR结果。
在另一种核酸扩增技术的LCR(连接酶链反应)中，两个邻近寡核苷酸与靶核酸杂交，并用连接酶连接，然后与互补核苷酸一起通过温度循环扩增通过这种方法形成的探针。
因为LCR比使用引物的引物延伸具有更高的分辨能力，其在基因定型点突变中比PCR显示更高的等位基因特异性。在迄今开发的核酸扩增技术中，LCR具有最高的特异性并且其是最容易进行的方法，因为所有区分机制均已优化。然而，它具有的缺点在于其反应速度是最慢的并且其需要许多修饰的探针。
在使用连接如LCR的方法中，基因定型使用没有PCR靶扩增的RCA技术经伴随LCR或RCA(滚环复制)方法的DNA连接通过扩增最初环化持锁探针进行(Qi et al，Nucleic Acids Res.，29：el 16，2001)。
然而，使用热循环过程的扩增方法如PCR需要热模块以达到每个循环的“靶”温度以及直到热模块达到靶温度的时间延迟，因此完成扩增反应其要经历长时间。
SDA(链置换扩增)是使用核酸内切酶通过链置换扩增样品中靶核酸序列和其互补链的方法。这个方法使用含有核酸聚合酶、至少一种互补于靶片段3′末端的引物和多种dNTP(脱氧核苷三磷酸)的混合物，所述多种dNTP包含至少一种取代的dNTP。每种引物在5′末端具有限制性核酸内切酶可以识别的序列(Walker et al，Nucleic Acids Res.，29：1691，1992)。
与SDA相似的方法有使用5′-RNA-DNA-3′引物的SPIA(单引物等温扩增)技术(US 6,251,639)、使用5′-DNA-RNA-3′引物的ICAN(等温嵌合引物起始的核酸扩增)技术(US 2005/0123950)和使用RNA引物的Ribo引物技术(US2004/0180361)等，其中使用RNA-DNA杂种引物或RNA引物的引物延伸之后，引物和模板DNA用消化与模板DNA杂交的RNA引物的RNaseH消化，然后通过链置换延伸新的引物。
TMA(转录介导的扩增)是在恒温、恒定离子强度和恒定pH下仅使用一种启动子-引物的靶核酸扩增技术(Kwoh et al，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，86：1173，1989)。TMA包括组合靶核酸的混合物和启动子-引物的步骤，所述启动子-引物是与靶序列的3′末端互补、用于与靶核酸的3′末端或者其邻近区域杂交的寡核苷酸。所述启动子-引物包含位于复合序列5′末端的RNA聚合酶的启动子区域序列。所述启动子-引物和靶序列形成启动子-引物/靶序列杂种以延伸DNA。
在TMA技术的DNA延伸过程中，假设靶序列的3′末端延伸自接近复合物的位置，其中启动子-引物在复合序列和靶序列之间杂交。启动子序列产生第一DNA延伸产物以作为形成双链启动子序列的延伸过程中的模板。启动子-引物的3′末端可以用作第二DNA延伸过程中的引物。在延伸过程中，使用作为模板的靶序列形成双链核酸复合物。当使用RNA靶序列时，复合物是DNA/RNA复合物，当使用DNA靶序列时，复合物是DNA/DNA复合物。随后，识别启动子-引物的启动子的RNA聚合酶使用第一DNA延伸产物合成RNA以产生靶序列的不同RNA拷贝。
NASBA(基于核酸序列的扩增)技术包括合成单链RNA、单链DNA和双链DNA(Compton，Nature，350：91，1991)。单链RNA是第一引物的第一模板，单链DNA是第二引物的第二模板，双链DNA是合成第一模板拷贝中的第三模板。
因为等温扩增靶核酸的方法如SDA、NASBA和TMA在恒温下进行，其不需要独立的热循环装置，因此易于进行。然而，目前公开的靶核酸等温扩增方法具有几个缺点。SDA方法对于给定的限制性酶需要特异性区域，由此其应用受到限制。基于转录的扩增方法如NASBA和TMA需要聚合酶启动子序列和引物产生的扩增产物之间的结合，这个过程倾向产生非特异性扩增。由于这些缺点，通过基于转录的扩增方法扩增DNA靶的机制还未被充分建立。
而且，目前使用的扩增方法的不利之处在于存在测试样品被之前的扩增反应产物污染的可能性，由此导致非特异性靶扩增。为了防止这个，开发了使用不同手段包括在扩增反应的最后一步或者在靶核酸扩增开始之前去除样品污染的物理学手段的样品溶液的污染检测方法，但是大多数方法使得核酸扩增过程复杂化。
作为检测核酸的另一种方法的扩增探针的方法包括用于所述核酸扩增方法中的LCR方法。
另一种检测核酸的方法是扩增信号而不是靶核酸和探针的方法。这些方法有使用4组探针捕获靶核酸的bDNA(分支DNA)扩增方法(Ross et al，J.Virol.Method.，101：159，2002)。与直接检测和扩增靶核酸的方法相比，使用信号扩增的杂种捕获方法具有灵敏性，并且使用抗体或发光化学物进行信号检测(vander Pol et al，J.Clinical Microbiol，40：3564，2002；Nelson et al，Nucleic AcidsResearch，24：4998，1996)。
而且，扩增信号探针的方法有CPT(循环探针技术)(Duck et al，BioTechniques，9：142，1990)。所述方法使用具有与靶核酸互补的碱基序列的DNA/RNA/DNA杂种探针。该方法中，通过重复如下过程扩增信号探针，其中当信号探针与靶核酸杂交时，杂种信号探针的RNA区域用RNaseH消化，将消化的杂种信号探针与所述靶核酸分离，然后另一种DNA-RNA-DNA杂种探针与靶核酸杂交。然而，CPT(循环探针技术)方法具有的缺点在于其具有102～104相对低的扩增效率，因此其难于在诊断中独立使用，而且其过程复杂，需要高成本和长处理时间，因为所述信号探针在靶核酸的特定区域通过常规核酸扩增如PCR扩增后被单独扩增。
同时，本发明人开发了通过使用RNA-DNA杂种引物等同时等温扩增核酸和信号探针来检测靶核酸的方法(韩国专利申请No.10-2006-0085818)。然而，所述方法的缺点在于杂交的成本高，因为RNA-DNA杂种引物具有15～25个碱基的RNA区域，因此RNA单体的成本高，并且杂种引物的稳定性在其纯化和储存时被提高，因为与DNA相比，RNA的化学特性是高度易于水解。
因此，本发明人进行的广泛研究已克服上述问题并开发了以快速精确方式扩增靶核酸的方法，同时开发了检测扩增产物的方法，结果证实当使用具有与靶核酸互补的碱基序列的外引物组(external primer set)和具有与靶核酸部分互补的碱基序列的DNA-RNA-DNA杂种引物组时可以在等温温度下快速扩增靶核酸，同时最小化构成杂种引物的RNA区域，当使用具有与通过上述方法扩增的扩增产物互补的碱基序列的DNA-RNA-DNA杂种探针时可以在等温温度下同时扩增靶核酸和探针信号，从而完成本发明。
发明内容
本发明的目的是提供在等温温度下快速和精确扩增靶核酸和信号探针的方法。
本发明的另一个目的是提供检测靶核酸的方法，其包括进行靶核酸和探针信号的同时等温扩增。
为了实现上述目的，本发明提供了等温扩增靶DNA的方法，所述方法包括步骤：(a)变性含有(i)靶DNA，(ii)具有与靶DNA互补的碱基序列的外引物组和(iii)具有在3′末端与靶DNA互补和在5′末端与靶DNA不互补的碱基序列的DNA-RNA-DNA杂种引物组的反应混合物；和(b)将含有RNase，能够进行链置换的DNA聚合酶和具有与通过外引物组和杂种引物组产生的扩增产物互补的碱基序列的DNA-RNA-DNA杂种信号探针的酶反应混合物溶液加入步骤(a)变性的反应混合物中，然后在等温温度下同时扩增所述靶DNA和所述信号探针。本发明还提供了检测靶DNA的方法，其包括使用上述扩增的信号探针。
本发明还提供了等温扩增靶RNA的方法，所述方法包括步骤：将含有(i)靶RNA，(ii)具有与所述靶RNA互补的碱基序列的外引物组，和(iii)具有在3′末端与靶RNA互补和在5′末端与靶RNA不互补的碱基序列的DNA-RNA-DNA杂种引物组的反应混合物加入含有(iv)能够进行链置换的DNA聚合酶、RNase、逆转录酶和具有与通过外引物组和杂种引物组产生的扩增产物互补的碱基序列的DNA-RNA-DNA杂种信号探针的酶反应混合物溶液中，然后在等温温度下同时扩增所述靶RNA和所述信号探针。
通过如下的详细说明书和所附的权利要求书，本发明的其他特征和方面将是明显的。
附图说明
图1是本发明等温扩增靶DNA的方法的图示说明；
图2是本发明等温扩增靶DNA和信号探针的方法的图示说明；
图3是本发明等温扩增靶RNA的方法的图示说明；
图4是本发明等温扩增靶RNA和信号探针的方法的图示说明；
图5是通过本发明等温扩增靶DNA的方法产生的扩增产物的电泳图；
图6通过酶免疫测定检测通过本发明的扩增方法产生的信号探针的方法的示意图；
图7是通过酶免疫测定检测通过本发明的靶DNA扩增方法产生的信号探针的分析结果；
图8是通过横向流动层析(lateral-flow chromatography)检测通过本发明的靶DNA扩增方法产生的信号探针的方法的示意图；
图9是通过横向流动层析检测通过本发明的靶DNA扩增方法产生的信号探针的分析结果；
图10是通过本发明的靶RNA等温扩增方法产生的扩增产物的电泳图；
图11是通过本发明的靶RNA等温扩增方法产生的扩增产物的电泳图；
图12是通过酶免疫测定检测通过本发明的靶RNA扩增方法产生的信号探针的分析结果。
具体实施例
在一个方面，本发明涉及等温扩增靶DNA的方法，所述方法包括步骤：(a)变性含有(i)靶DNA，(ii)具有与靶DNA互补的碱基序列的外引物组，和(iii)具有在3′末端与靶DNA互补和在5′末端与靶DNA不互补的碱基序列的DNA-RNA-DNA杂种引物组的反应混合物；以及(b)将含有RNase、能够进行链置换的DNA聚合酶和具有与通过外引物组和杂种引物组产生的扩增产物互补的碱基序列的DNA-RNA-DNA杂种信号探针的酶反应混合物溶液加入步骤(a)变性的反应混合物中，然后在等温温度下同时扩增所述靶DNA和所述信号探针。
本发明靶DNA的等温扩增如图1所示方式进行。首先变性在扩增中作为模板的待扩增的靶DNA、外引物组和DNA-RNA-DNA杂种引物组的混合物以使其每个均成为单链。冷却变性的混合物至等温扩增温度，向其中加入含有RNase和DNA聚合酶的酶反应混合物溶液。然后将外引物组和DNA-RNA-DNA杂种引物组与冷却至扩增温度的反应溶液中的靶DNA退火。优选外引物组与杂种引物组相比包含与更接近靶DNA两端的序列互补的序列，杂种引物组与外引物组相比包含更接近靶DNA中间的序列。这种情况中，与外引物相比，杂种引物以DNA链延伸的正向退火。退火的外引物和杂种引物使用能够进行链置换的DNA聚合酶延伸。因为外引物沿着靶DNA延伸，延伸自位于延伸正向的杂种引物的DNA链与靶DNA分离以导致链置换。最终，分别获得了延伸自杂种引物的单链DNA扩增产物和延伸自外引物的双链DNA扩增产物。
外引物组和杂种引物组使用作为模板的单链DNA扩增产物退火。退火的外引物和杂种引物通过能够进行链置换的DNA聚合酶延伸，因为外引物沿着单链DNA模板延伸，延伸自位于延伸正向的杂种引物的DNA链与单链DNA分离以导致链置换。最终，获得了延伸自杂种引物的单链DNA扩增产物和延伸自外引物的双链DNA扩增产物。延伸外引物形成双链DNA，延伸的DNA-RNA-DNA杂种引物通过链置换分离以获得单链DNA。使用扩增的单链DNA作为模板将DNA-RNA-DNA杂种引物退火并延伸以获得含有RNA的双链DNA扩增产物。双链DNA的RNA区域通过RNase H消化，通过链置换获得单链DNA。使用单链DNA作为模板重复退火、延伸、链置换和RNA消化过程以扩增靶DNA(图1)。
根据本发明的一个实施方案，用核酸的等温扩增同时扩增探针信号。通过靶DNA的等温扩增扩增的靶DNA与DNA-RNA-DNA杂种信号探针退火形成双链RNA/DNA杂种后，DNA-RNA-DNA杂种探针的RNA区域通过RNase H活性消化。然后，消化的信号探针与靶DNA分离，然后将新的DNA-RNA-DNA杂种信号探针与用RNase H消化并分离。重复上述方法以扩增探针信号(图2)。
在本发明中，外引物组可以是选自由寡DNA、寡RNA、和杂种寡RNA/DNA组成的组的任一个。外引物组优选互补于靶核酸的序列，优选具有15～30个碱基。互补于外引物的靶DNA序列优选是邻近互补于杂种引物的靶DNA序列的序列(碱基差异是1～60bp)且互补于外引物的靶DNA序列优选是比互补于杂种引物的靶DNA序列更接近靶核酸的3′端的序列。
本发明中使用的DNA-RNA-DNA杂种引物组在DNA-RNA的5′端不互补于靶DNA，在DNA的3′端互补于靶DNA。DNA-RNA-DNA杂种引物优选由32～68个碱基组成，优选DNA区域长度是15～30个碱基，RNA区域长度是2～6个碱基。
本发明中，互补于DNA-RNA-DNA杂种引物的靶DNA序列优选比互补于外引物的靶DNA序列更接近靶DNA的5′端的序列，互补于杂种引物的靶DNA序列优选是邻近互补于外引物的靶DNA序列的序列(碱基差异是1～60bp)。
本发明中使用的DNA聚合酶是能够沿着DNA模板延伸核酸引物的酶，且应能够从多核苷酸链置换核酸链。可以用于本发明的DNA聚合酶优选是热稳定DNA聚合酶且其实例包括Bst DNA聚合酶、exo(-)vent DNA聚合酶、exo(-)Deep vent DNA聚合酶、exo(-)Pfu DNA聚合酶、Bca DNA聚合酶或phi29DNA聚合酶等。
本发明使用的RNase特异性消化RNA/DNA杂种的RNA链，其优选不降解单链RNA，优选使用RNase H。
优选本发明使用的DNA-RNA-DNA杂种信号探针是具有与通过外引物或DNA-RNA-DNA杂种引物扩增的核酸扩增产物互补的序列的寡核苷酸，且DNA-RNA-DNA杂种信号探针的5′端和3′端由寡DNA组成以及其中间由寡RNA组成。
优选DNA-RNA-DNA杂种信号探针由18～38个碱基组成，寡DNA区域的5′端和3′端分别由8～16个碱基组成，且位于中间的寡RNA由2～6个碱基组成。
本发明中DNA-RNA-DNA杂种信号探针优选在末端用标记物标记，所述标记物包括生物素、荧光素、洋地黄毒苷、2，4-二硝基苯基等。
本发明中等温扩增反应优选在本发明引物可与DNA模板退火且使用的酶的活性基本上不被抑制的温度下进行。本发明中扩增温度优选是30～75℃，更优选37～70℃，最优选50～65℃。
而且，本发明等温扩增核酸的方法具有高特异性，因为其与使用单一RNA-DNA杂种引物的常规方法相比使用了额外的外引物(US 6,251,639)。此外，使用由外引物替代的内引物(inner primer)作为模板通过指数扩增可以显著提高扩增效率。而且，常规方法使用独立的阻断剂阻断扩增或者模板转换寡核苷酸(template-switch oligonucleotide，TSO)以在使用单一RNA-DNA杂种引物扩增靶碱基序列时扩增特异区域，相反，本发明方法的优点在于使用正向/反向引物对而不使用独立的阻断物或TSO可以只明显扩增所需区域。
本发明方法的优点在于其能同时进行核酸的扩增和检测，因为核酸和信号探针的扩增可以通过重复一种方法同时完成，其中DNA-RNA-DNA杂种信号探针结合和分离，使用扩增的DNA作为模板扩增信号探针。
本发明方法还具有的优点在于其不需要考虑常规方法中当RNase的反应活性高于DNA聚合酶的引物延伸活性时发生的问题，因为本发明使用的DNA-RNA-DNA杂种引物的DNA-RNA区域的5′端具有与模板非互补的序列。
本发明的核酸的等温扩增，当第一引物延伸和链置换反应之后新合成的扩增产物用作新模板时，与模板非互补的RNA区域作为与引物互补的模板以提高引物的退火温度，由此提高扩增效率以及防止引物-二聚体形成以提高扩增产物的纯度。
自样品中的DNA提取开始，本发明的核酸等温扩增方法需要大约1小时实现完整的扩增，如果DNA提取已经完成，其需要大约40分钟，从而使得其可以进行快速扩增。
另一方面，本发明涉及检测靶DNA的方法，所述方法包括步骤：(a)变性含有(i)靶DNA，(ii)具有与靶DNA互补的碱基序列的外引物组，和(iii)具有在3′末端与靶DNA互补和在5′末端与靶DNA非互补的碱基序列的DNA-RNA-DNA杂种引物组的反应混合物；(b)将含有RNase、能够进行链置换的DNA聚合酶和具有与提高外引物组和杂种引物组产生的扩增产物互补的碱基序列的DNA-RNA-DNA杂种信号探针的酶反应混合物溶液加入步骤(a)变性的反应混合物中，然后在等温温度同时扩增所述靶DNA和所述信号探针；和(c)使用酶-免疫检测或横向流动层析从步骤(b)中扩增的靶DNA扩增产物和信号探针扩增产物检测靶DNA。
本发明方法扩增的信号探针可以在微平板中使用辣根过氧化物酶检测(Bekkaoui et al，Diagn.Microbiol.Infect.Dis.，34：83-93，1999)。在这个情况中，DNA-RNA-DNA杂种探针优选分别用荧光素和生物素末端标记。在信号探针扩增中，信号探针可以被但不限于如下程序检测：信号探针结合用选择性结合生物素的链霉抗生物素蛋白和用选择性结合荧光素的抗荧光素抗体缀合的HRP(辣根过氧化物酶)处理的微孔平板表面，洗涤，然后与HRP的TMB(四硝基联苯胺)底物反应，然后测量465nm的吸光变化。而且，除了荧光素和生物素之外还可以使用用选择性结合2，4-二硝基苯或洋地黄毒苷的抗体缀合的标记物。
而且，本发明扩增的信号探针可以使用横向流动测定在硝基纤维素膜上检测(Fong et al，J.Clin.Microbiol，38：2525-2529，2000)。在这个情况中，DNA-RNA-DNA杂种信号探针优选分别用荧光素和生物素末端标记。在信号探针扩增中，信号探针可以但不限于将信号探针结合至用选择性结合生物素的链霉抗生物素蛋白缀合的金材料或者用选择性结合荧光素的荧光素抗体表面处理的条(strip)上而在硝基纤维素膜上目测。而且，除了荧光素和生物素之外还可以使用用选择性结合2，4-二硝基苯或洋地黄毒苷的抗体缀合的标记物。
在另一方面，本发明涉及等温扩增靶RNA的方法，所述方法包括步骤：将含有(i)靶RNA，(ii)具有与所述靶RNA互补的碱基序列的外引物组，和(iii)具有在3′末端与靶RNA互补和在5′末端与靶RNA不互补的碱基序列的DNA-RNA-DNA杂种引物组的反应混合物加入含有(iv)能够进行链置换的DNA聚合酶、RNase、逆转录酶和具有与通过外引物组和杂种引物组产生的扩增产物互补的碱基序列的DNA-RNA-DNA杂种信号探针的酶反应混合物溶液中，然后在等温温度下同时扩增所述靶RNA和所述信号探针。
如图3所示，本发明的靶RNA等温扩增以如下方式进行：将DNA-RNA-DNA杂种信号探针加入作为模板的靶RNA、外引物组、DNA-RNA-DNA杂种引物组，和含有DNA聚合酶、RNase和逆转录酶的酶反应混合物溶液。外引物组和DNA-RNA-DNA杂种引物组然后与反应溶液中的靶RNA退火至扩增温度。优选外引物组包含比杂种引物组更接近靶RNA两端的序列互补的序列，并且杂种引物组包含比外引物组更接近靶RNA中间的序列。在这个情况中，杂种引物与外引物相比以DNA链延伸的正向退火。最终，获得了延伸自杂种引物的单链DNA扩增产物和双链DNA扩增产物，DNA/RNA杂种。
外引物组和杂种引物组使用单链DNA扩增产物作为模板进行退火。通过能够进行链置换的DNA聚合酶延伸退火的外引物和杂种引物，因为外引物沿着单链DNA模板延伸，延伸自位于延伸正向的杂种引物的DNA链与靶DNA分离导致链置换，最终，获得延伸自杂种引物的单链DNA扩增产物和延伸自外引物的双链DNA扩增产物。外引物延伸形成双链DNA，延伸的DNA-RNA-DNA杂种引物通过链置换分离以获得单链DNA。DNA-RNA-DNA杂种引物使用扩增的单链DNA作为模板退火并延伸以获得含有RNA的双链DNA扩增产物。通过RNase H消化双链DNA的RNA区域，并通过链置换获得单链DNA。使用单链DNA作为模板重复退火、延伸、链置换和RNA消化过程以扩增靶RNA(图3)。
根据本发明的另一个实施方案，与靶RNA的等温扩增同时进行探针信号的扩增。通过靶RNA的等温扩增扩增的靶DNA与DNA-RNA-DNA杂种信号探针退火以形成双链RNA/DNA杂种，DNA-RNA-DNA杂种探针的RNA区域通过RNase H活性消化。然后，消化的信号探针与靶DNA分离，随后将新的DNA-RNA-DNA杂种探针用RNase H消化并分离。重复上述循环以扩增探针信号(图4)。
本发明靶RNA的等温扩增，除了额外加入酶反应混合物溶液中的逆转录酶之外，在上述靶DNA的等温扩增中可以使用外引物组、DNA-RNA-DNA杂种引物组、DNA聚合酶、RNase、DNA-RNA-DNA杂种引物和DNA-RNA-DNA杂种信号探针。而且如靶DNA的等温扩增一样，等温扩增可以在相同的扩增温度下进行。逆转录酶用于使用RNA作为模板延伸DNA，优选使用AMV(禽类成髓细胞性白血病病毒)逆转录酶或MMLV(莫洛尼鼠白血病毒)逆转录酶。
在另一方面，本发明涉及检测靶RNA的方法，上述方法包括步骤：将含有(i)靶RNA，(ii)具有与靶RNA互补的碱基序列的外引物组，和(iii)具有在3′-末端与靶RNA互补和在5′-末端与靶RNA非互补的碱基序列的DNA-RNA-DNA杂种引物组的反应混合物加入含有(iv)能够进行链置换的DNA聚合酶、RNase、逆转录酶和具有与通过外引物组和杂种引物组产生的扩增产物互补的碱基序列的DNA-RNA-DNA杂种信号探针的酶反应混合物溶液中，然后在等温温度同时扩增所述靶RNA和所述信号探针，使用酶-免疫测定或横向流动层析从上述步骤扩增的靶RNA扩增产物和信号探针扩增产物中检测靶DNA。
本发明的等温扩增方法和核酸(DNA、RNA)检测方法能够以快速简单方式扩增，因为其使用一步方法，其中反应在恒温下进行，因此由于靶核酸和信号探针的等温扩增，其不需要独立的热传导物。另外，所述方法通过使用两对引物和探针，与常规方法相比其仅精确扩增靶核酸，以及扩增信号探针，从而具有优异的特异性。
本发明的等温扩增方法和核酸的检测方法在一个试管中进行，因此可以大量实时检测核酸。这种优点可以最小化限制扩增技术广泛应用的额外污染反应的风险。
实施例
在下文，本发明通过实施例更详细地描述。然而，很明显本领域技术人员知道这些实施例仅是说明目的，不应理解为对本发明范围的限制。
实施例1：等温扩增DNA
沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)(ATCC VR-887)DNA用作靶核酸。基因组DNA使用G-spinTM Genomic DNA extraction Kit(iNtRON Biotechnology，Cat.No.17121)提取自革兰氏阴性菌沙眼衣原体，然后进行扩增。对于基因组DNA提取，500mL细菌悬液在13,000rpm离心1min，然后取出上清，向其中加入500mL的PBS(pH 7.2)，然后离心以去除上清。然后将细胞沉淀通过加入300ml含有RNase A和蛋白酶K的G-buffer溶液悬浮，在65℃静置15min，然后向其中加入250mL的结合缓冲液，充分混合，然后将DNA结合至离心柱。之后，向离心柱加入500mL的洗涤缓冲液A，在13,000rpm离心1min以洗涤，向离心柱加入500mL的洗涤缓冲液B以离心，然后将柱移至1.5mL微离心管，然后加入50mL的洗脱缓冲液以离心1min，如此获得15.8ng/mL基因组DNA。获得的基因组DNA以给定比例稀释并用作等温扩增反应的模板。
设计外引物(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)以便其包含与沙眼衣原体隐蔽性质粒DNA互补的序列。
SEQ ID NO：1：5′-TAAACATGAAAACTCGTTCCG-3′
SEQ ID NO：2：5′-TTTTATGATGAGAACACTTAAACTCA-3′
设计DNA-RNA-DNA杂种引物(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)以便其寡DNA-RNA区域的5′-端具有与沙眼衣原体隐蔽性质粒DNA非互补的序列，且其寡DNA区域的3′-端具有与沙眼衣原体隐蔽性质粒DNA互补的序列(寡RNA区域下划线)。
SEQ ID NO：3：5′-ACCGCATCGAATCGATGTAAAATAGAAAATCGCATGCAAGATA-3′
SEQ ID NO：4：5′-GATTCCGCTCCAGACTTAAAAAGCTGCCTCAGAATATACTCAG-3′
进行信号扩增的DNA-RNA-DNA杂种信号探针(SEQ ID NO：5)具有与通过上述引物组扩增的DNA互补的碱基序列，并在其5′-端和3′-端分别用荧光素和生物素标记(寡RNA区域下划线)：
SEQ ID NO：5：5′-荧光素-GCTTTGTTAGGTAAAGCTCTGATA TTTG-生物素-3′
为了使用外引物组和杂种引物组扩增靶核酸，制备了含有外引物组、杂种引物组和靶DNA的反应混合物。将10mM的(NH4)2SO4、4mM的MgSO4、10mM的KCl、0.25mM的每种dNTP(Fermentas)、2.9mM的DTT、0.1μg的BSA、0.1mM精胺、0.05mM EGTA、0.1μM的外引物组、0.5μM的内引物组和10fg～1ng的沙眼衣原体隐蔽性质粒DNA加入10mM的Tris-HCl(pH 8.5)缓冲液中制备反应混合物。
所述反应混合物在95℃变性5min，在60℃冷却5min，加入酶反应混合物溶液至终体积20μl用于DNA扩增，然后在60℃进行等温扩增1hr。
酶反应混合物溶液的组成如下：0.3μg的T4Gene 32蛋白(USB)、6单位Rnase抑制剂(Intron)、3单位RNaseH(Epicentre)、6单位Bst DNA聚合酶(NEBM0275M)和1nM DNA-RNA-DNA杂种信号探针。
同时，使用人基因组DNA作为对照。扩增反应之后取6μl的反应溶液，与上样缓冲液混合，然后在含有溴化乙锭的0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳，然后在UV透射仪上通过条带显色确定扩增效率。
结果在图5中示出，证实与加入了人基因组DNA的样品相比，加入了沙眼衣原体隐蔽性质粒DNA的样品中存在靶DNA扩增产物。
实施例2：通过酶免疫测定的DNA检测
将170ml的PBST结合缓冲液加入实施例1中获得的扩增产物中以制备由如下成分组成的反应混合物：136mM的NaCl、2.7mM的KCl、8.1mM的Na2HPO4、1.5mM KH2PO4、0.05％Tween 20、1/7000稀释的抗-F-HRP(PerkinElmer，辣根过氧化物酶缀合抗荧光素抗体)。将反应混合物转移至链霉抗生物素蛋白包被的微平板孔(Roche)，在37℃和200rpm反应10。取出每孔的上清，每孔中加入300ml的PBST洗涤缓冲液以洗涤，其中PBST洗涤缓冲液与上述结合缓冲液具有相同的组成，除了从中去除了抗体。洗涤后，每孔加入200ml的HRP底物，3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(Bio-Rad，TMB)，暗处保温5min以显色，然后加入100ml的1N H2SO4终止反应。为了确定样品和对照的效率，使用ELISA读数仪(Zenyth 340rt)比较465nm的吸收值。确定了值间的差异越大，其越有效。
结果示于图6和图7中，证实了具有扩增产物的实验样品用抗荧光素缀合的HRP(辣根过氧化物酶)不显色。
实施例3：通过横向流动层析的DNA检测
将10ml直径40nm的胶体金溶液(Chemicon)加入100mg链霉抗生物素蛋白(Sigma)，涡旋2min，然后反应3hr。然后，将1mL的1％BSA(溶于2mM硼酸盐)溶液加入所得混合物中，在4℃在10,000rpm离心15min，取出上清，然后将1mL的2mM硼酸盐缓冲液加入取出上清的所得物中以洗涤3次，随后加入1％BSA(溶于2mM硼酸盐)以重悬。
将在520nm具有吸收值10的金缀合物溶液在4℃储存，通过稀释至适当比例使用。在硝基纤维素膜上，分别荧光素抗体(Chemicon)被包被为测试线以及生物素缀合的酪蛋白(Biofocus)被包被为对照线。
将用运行缓冲液(1x PBS，1％Triton X-100，0.6％BSA)1∶50稀释的60mL金缀合物溶液加入实施例1中获得的扩增产物中，将硝基纤维素条浸泡在所述溶液中并在室温进行横向流动层析10min，因此通过检测测试线来检测靶核酸的存在。
结果示于图8和图9中，在阴性对照样品中，显示两条线(测试线盒对照线)，而在加入了沙眼衣原体隐蔽性质粒DNA的样品中只有一条线(对照线)。因此，可以证实在测试样品中存在靶核酸扩增产物。
实施例4：RNA的等温扩增
体外转录自质粒DNA(具有克隆至pDrive载体中的Norovirus G1型RNA的eDNA)的RNA用作靶RNA。MEGAscript High Yield Transcription kit(Ambion，Cat.No.AMI 333)用于进行体外转录。体外转录反应如下进行；用限制性酶线性化质粒DNA模板，将1mg的DNA加入8mL的dNTP(dATP，dUTP，dGTP，dCTP)混合物，2mL的10x反应缓冲液，2mL的T7 RNA聚合酶和没有核酸酶的水至终体积20mL，充分混合，然后在37℃反应4hr。反应完成后，为了去除DNA模板，将1mL的Turbo DNase加入所得混合物中并在37℃反应15min，然后通过RNeasy MinElute Cleanup Kit(Qiagen，Cat.No.74204)纯化扩增的RNA。将纯化的RNA以给定比例稀释并用作等温扩增反应的模板。
设计外引物(SEQ ID No.6和SEQ ID No.7)以便其包含与Norovirus G1型RNA互补的序列。
SEQ ID NO：6：5′-ATGCGGTTCCACGATCTTGG-3′
SEQ ID NO：7：5′-GCGACTGCTGTTGAATCACC-3′
设计DNA-RNA-DNA杂种引物(SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9)以便其寡DNA-RNA区域的5′-端具有与Norovirus G1型RNA非互补的序列，以及其寡DNA区域的3′-端具有与Norovirus G1型RNA互补的序列(寡RNA区域下划线)。
SEQ ID NO：8：5′-CCAATTCACAAGTGAAGAGCAAAATCTCCTGCCCGAATTCGTAA-3′
SEQ ID NO：9：5′-TCTACCGCTGATCATGTGCTAAAATGCTCAGCTGTATTAGCCTC-3′
进行信号扩增的DNA-RNA-DNA杂种信号探针(SEQ ID NO：10)具有与通过上述引物组扩增的DNA互补的碱基序列，并且在其5′-端和3′-端分别用荧光素和生物素标记(寡RNA区域下划线)：
SEQ ID NO：10：5′-荧光素-GCCCGAATTCGTAAATGATGATGGCGTC-生物素-3′
为了使用外引物组、杂种引物组和杂种信号探针扩增靶RNA，制备反应混合物。将10mM的(NH4)2SO4、16mM的MgSO4、10mM的KCl、0.25mM的每种dNTP(Fermentas)、2.9mM的DTT、0.1μg的BSA、0.1μM的外引物组、0.5μM的杂种引物组、0.3μg T4 Gene 32蛋白(USB)、6单位Rnase抑制剂(Intron)、9单位RNaseH(Epicentre)、3单位Bst DNA聚合酶(NEBM0275M)、3单位AMV逆转录酶(USB)、10nM DNA-RNA-DNA杂种信号探针和100pgNorovirus G1型RNA加入10mM的Tris-HCl(pH 8.5)缓冲液中至终体积20μl，如此制备反应混合物。将反应混合物在60℃进行等温扩增90min。
同时，人RNA用作对照。扩增反应后取6μl的反应溶液，与上样缓冲液混合，然后在含有溴化乙锭的2.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，然后在UV透射仪上由条带显色确定扩增效率。
结果示于图10，证实了与加入人RNA的阴性对照相比，加入了NorovirusG1型RNA的样品中存在靶DNA扩增产物。另外，为了检测所述扩增产物是否是DNA污染所致，使用Norovirus G1型质粒DNA和具有和没有AMV逆转录酶的酶反应混合物溶液进行上述相同的实验。结果示于图11，证实了扩增的产物是通过扩增作为模板的RNA获得的扩增产物。
实施例5：通过酶免疫测定的RNA检测
将170ml的PBST结合缓冲液加入实施例4获得的扩增产物中以制备由如下成分组成的反应混合物：136mM的NaCl、2.7mM的KCl、8.1mM的Na2HPO4、1.5mM KH2PO4、0.05％Tween 20、1/7000稀释的抗-F-HRP(PerkinElmer，辣根过氧化物酶缀合抗荧光素抗体)。将反应混合物转移至链霉抗生物素蛋白包被的微平板孔(Roche)，在37℃和200rpm反应10min。除去每孔中的上清，每孔加入300ml的PBST洗涤缓冲液以洗涤，其中PBST洗涤缓冲液与上述结合缓冲液具有相同的组成，除了从中除去了抗体。洗涤后，每孔加入200ml的HRP底物，3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(Bio-Rad，TMB)，在暗处保温5min以显色，然后加入100ml的1N H2SO4终止反应。为了确定样品和对照的效率，使用ELISA读数仪(Zenyth 340rt)比较了465nm的吸收值。确定了值间的差异越大，效率越高。
结果示于图12，证实了具有扩增产物的实验样品用缀合了抗荧光素的HRP(辣根过氧化物酶)不显色。
工业实用性
如上所详述，本发明提供了在等温温度快速精确扩增靶核酸的方法，并提供了检测核酸的方法，其包括在等温温度同时进行靶核酸和信号探针的扩增。本发明的方法与常规方法如PCR相比可以用于以快速精确方式而没有污染风险地扩增样品中的靶核酸，并且其能同时扩增靶核酸和信号探针，由此其可以用于多种基因组计划，检测和鉴定病原体，检测产生预定基因型的基因修饰，检测遗传疾病或确定对疾病的敏感性，以及估测基因表达。因此，其可用于分子生物学研究和疾病诊断。
尽管本发明参考特定特征被详细描述，对于本领域技术人员显而易见本说明书仅是优选的实施方案，并不是限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附的权利要求书和其等同方案限定。

Claims (29)

1.一种等温扩增靶DNA的方法，所述方法包括步骤：
(a)变性含有(i)靶DNA，(ii)具有与靶DNA互补的碱基序列的外引物组，和(iii)具有在3′-末端与靶DNA互补和在5′-末端与靶DNA非互补的碱基序列的DNA-RNA-DNA杂种引物组的反应混合物；和
(b)将含有RNase、能够进行链置换的DNA聚合酶和具有与通过外引物组和杂种引物组产生的扩增产物互补的碱基序列的DNA-RNA-DNA杂种信号探针的酶反应混合物溶液加入步骤(a)中变性的反应混合物中，然后在等温温度同时扩增所述靶DNA和所述信号探针。本发明还提供了检测靶DNA的方法，其包括使用扩增的信号探针。
2.权利要求1的等温扩增靶DNA的方法，其中外引物组选自由寡DNA、寡RNA和杂种寡RNA/DNA组成的组。
3.权利要求1的等温扩增靶DNA的方法，其中DNA-RNA-DNA杂种引物组与DNA-RNA的5′-端的靶DNA不互补，与DNA的3′-端的靶DNA互补。
4.权利要求1的等温扩增靶DNA的方法，其中DNA聚合酶是热稳定DNA聚合酶。
5.权利要求1的等温扩增靶DNA的方法，其中热稳定DNA聚合酶是选
自由Bst DNA聚合酶、exo(-)vent DNA聚合酶、exo(-)Deep vent DNA聚合酶、exo(-)Pfu DNA聚合酶、Bca DNA聚合酶和phi 29DNA聚合酶组成的组中的任一种。
6.权利要求1的等温扩增靶DNA的方法，其中RNase是RNase H。
7.权利要求1的等温扩增靶DNA的方法，其中DNA-RNA-DNA杂种引物由32～66个碱基组成。
8.权利要求7的等温扩增靶DNA的方法，其中DNA-RNA-DNA杂种引物的DNA区域长度是15～30个碱基，DNA-RNA-DNA杂种引物的RNA区域长度是2～6个碱基。
9.权利要求1的等温扩增靶DNA的方法，其中DNA-RNA-DNA杂种信号探针由18～38个碱基组成。
10.权利要求9的等温扩增靶DNA的方法，其中DNA-RNA-DNA杂种信号探针的DNA区域长度为8～16个碱基，DNA-RNA-DNA杂种信号探针的RNA区域长度为2～6个碱基。
11.权利要求1的等温扩增靶DNA的方法，其中DNA-RNA-DNA杂种信号探针的两端均用标记物标记。
12.权利要求11的等温扩增靶DNA的方法，其中标记物选自由生物素、荧光素、洋地黄毒苷和2，4-二硝基苯基组成的组。
13.权利要求1的等温扩增靶DNA的方法，其中等温扩增在30～75℃进行。
14.一种检测靶DNA的方法，所述方法包括步骤：
(a)变性含有(i)靶DNA，(ii)具有与靶DNA互补的碱基序列的外引物组，和(iii)具有在3′末端与靶DNA互补和在5′末端与靶DNA非互补的碱基序列的DNA-RNA-DNA杂种引物组的反应混合物；
(b)将含有RNase、能够进行链置换的DNA聚合酶和具有与通过外引物组和杂种引物组产生的扩增产物互补的碱基序列的DNA-RNA-DNA杂种信号探针的酶反应混合物溶液加入步骤(a)变性的反应混合物中，然后在等温温度同时扩增所述靶DNA和所述信号探针；和
(c)使用酶-免疫检测或横向流动层析从步骤(b)中扩增的靶DNA扩增产物和信号探针扩增产物检测靶DNA。
15.一种等温扩增靶RNA的方法，所述方法包括步骤：
将含有(i)靶RNA，(ii)具有与所述靶RNA互补的碱基序列的外引物组，和(iii)具有在3′末端与靶RNA互补和在5′末端与靶RNA不互补的碱基序列的DNA-RNA-DNA杂种引物组的反应混合物加入含有(iv)能够进行链置换的DNA聚合酶、RNase、逆转录酶和具有与通过外引物组和杂种引物组产生的扩增产物互补的碱基序列的DNA-RNA-DNA杂种信号探针的酶反应混合物溶液中，然后在等温温度下同时扩增所述靶。
16.权利要求15的等温扩增靶RNA的方法，其中外引物组选自由寡DNA、寡RNA和杂种寡RNA/DNA组成的组。
17.权利要求15的等温扩增靶RNA的方法，其中DNA-RNA-DNA杂种引物组与DNA-RNA的5′-端的靶RNA不互补，与DNA的3′-端的靶RNA互补。
18.权利要求15的等温扩增靶RNA的方法，其中DNA聚合酶是热稳定DNA聚合酶。
19.权利要求18的等温扩增靶RNA的方法，其中热稳定DNA聚合酶是选自由Bst DNA聚合酶、exo(-)vent DNA聚合酶、exo(-)Deep vent DNA聚合酶、exo(-)Pfu DNA聚合酶、Bca DNA聚合酶和phi 29DNA聚合酶组成的组中的任一种。
20.权利要求15的等温扩增靶RNA的方法，其中RNase是RNase H。
21.权利要求15的等温扩增靶RNA的方法，其中逆转录酶是AMV(禽类成髓细胞性白血病病毒)逆转录酶或MMLV(莫洛尼鼠白血病毒)逆转录酶。
22.权利要求15的等温扩增靶RNA的方法，其中DNA-RNA-DNA杂种引物由32～66个碱基组成。
23.权利要求22的等温扩增靶RNA的方法，其中DNA-RNA-DNA杂种引物的DNA区域长度是15～30个碱基，DNA-RNA-DNA杂种引物的RNA区域长度是2～6个碱基。
24.权利要求15的等温扩增靶RNA的方法，其中DNA-RNA-DNA杂种信号探针由18～38个碱基组成。
25.权利要求24的等温扩增靶RNA的方法，其中DNA-RNA-DNA杂种信号探针的DNA区域长度为8～16个碱基，DNA-RNA-DNA杂种信号探针的RNA区域长度为2～6个碱基。
26.权利要求15的等温扩增靶RNA的方法，其中DNA-RNA-DNA杂种信号探针的两端均用标记物标记。
27.权利要求26的等温扩增靶RNA的方法，其中标记物选自由生物素、荧光素、洋地黄毒苷和2，4-二硝基苯基组成的组。
28.权利要求15的等温扩增靶RNA的方法，其中等温扩增在30～75℃进行。
29.一种检测靶RNA的方法，所述方法包括步骤：
(a)将含有(i)靶RNA，(ii)具有与靶RNA互补的碱基序列的外引物组，和(iii)具有在3′-末端与靶RNA互补和在5′-末端与靶RNA非互补的碱基序列的DNA-RNA-DNA杂种引物组的反应混合物加入含有(iv)能够进行链置换的DNA聚合酶、RNase、逆转录酶和具有与通过外引物组和杂种引物组产生的扩增产物互补的碱基序列的DNA-RNA-DNA杂种信号探针的酶反应混合物溶液中，然后在等温温度同时扩增所述靶RNA和所述信号探针，和
(b)使用酶-免疫测定或横向流动层析从步骤(a)中扩增的靶RNA扩增产物和信号探针扩增产物中检测靶DNA。
CN2008801189206A 2007-12-03 2008-04-24 通过同时等温扩增核酸和信号探针检测核酸的方法 Pending CN101883866A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2007-0124399 2007-12-03
KR1020070124399A KR100957057B1 (ko) 2007-12-03 2007-12-03 핵산과 신호 프로브의 동시 등온증폭을 이용한 핵산의검출방법
PCT/KR2008/002341 WO2009072705A1 (en) 2007-12-03 2008-04-24 Method for detecting nucleic acids by simultaneous isothermal amplification of nucleic acids and signal probe

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101883866A true CN101883866A (zh) 2010-11-10

Family

ID=40717870

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2008801189206A Pending CN101883866A (zh) 2007-12-03 2008-04-24 通过同时等温扩增核酸和信号探针检测核酸的方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20100311058A1 (zh)
JP (1) JP2011505129A (zh)
KR (1) KR100957057B1 (zh)
CN (1) CN101883866A (zh)
DE (1) DE112008003229T5 (zh)
GB (1) GB2467081B (zh)
WO (1) WO2009072705A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109750091A (zh) * 2019-03-13 2019-05-14 江苏宏微特斯医药科技有限公司 单管检测一种或多种待测目标核酸序列的方法及其试剂盒
CN112135913A (zh) * 2018-05-18 2020-12-25 株式会社百义纳理 使用等温核酸扩增对生物组织三维核酸成像诊断的方法
CN113151404A (zh) * 2011-02-15 2021-07-23 莱卡生物系统纽卡斯尔有限责任公司 用于mrna的定位的原位检测的方法

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8053191B2 (en) 2006-08-31 2011-11-08 Westend Asset Clearinghouse Company, Llc Iterative nucleic acid assembly using activation of vector-encoded traits
EP2369325A1 (en) 2010-03-12 2011-09-28 Eppendorf Ag Array analysis for online detection
US9295965B2 (en) 2010-11-12 2016-03-29 Gen9, Inc. Methods and devices for nucleic acid synthesis
EP2637780B1 (en) 2010-11-12 2022-02-09 Gen9, Inc. Protein arrays and methods of using and making the same
LT3594340T (lt) 2011-08-26 2021-10-25 Gen9, Inc. Kompozicijos ir būdai, skirti nukleorūgščių didelio tikslumo sąrankai
US9150853B2 (en) 2012-03-21 2015-10-06 Gen9, Inc. Methods for screening proteins using DNA encoded chemical libraries as templates for enzyme catalysis
US10081807B2 (en) 2012-04-24 2018-09-25 Gen9, Inc. Methods for sorting nucleic acids and multiplexed preparative in vitro cloning
JP6509727B2 (ja) 2012-06-25 2019-05-15 ギンゴー バイオワークス， インコーポレイテッド 核酸アセンブリおよび高処理シークエンシングのための方法
US9777319B2 (en) 2012-06-29 2017-10-03 General Electric Company Method for isothermal DNA amplification starting from an RNA template
KR101589483B1 (ko) * 2014-02-21 2016-01-28 디엑스진주식회사 핵산과 신호 프로브의 비대칭 등온증폭을 이용한 핵산의 검출방법
KR101501414B1 (ko) * 2014-06-30 2015-03-17 중앙대학교 산학협력단 노로바이러스 검출을 위한 등온증폭 반응용 프라이머 및 이를 이용한 노로바이러스 검출 방법
EP3209777A4 (en) * 2014-10-21 2018-07-04 Gen9, Inc. Methods for nucleic acid assembly
CN104313187B (zh) * 2014-11-11 2016-03-23 舟山市质量技术监督检测研究院 Gi基因组型诺如病毒逆转录滚环扩增方法
KR101901749B1 (ko) 2016-02-15 2018-09-28 주식회사 누리바이오 실시간 핵산 또는 단백질 검출용 단일핵산 및 이를 이용한 검출 방법
GB201621477D0 (en) 2016-12-16 2017-02-01 Multiplicom Nv Modified multiplex and multistep amplification reactions and reagents therefor
KR102261979B1 (ko) * 2019-10-28 2021-06-07 재단법인 대구경북첨단의료산업진흥재단 핵산분해효소 연쇄 반응
CN111662961A (zh) * 2020-06-16 2020-09-15 河北农业大学 一种酸土脂环酸芽胞杆菌的分子检测方法
CN111979303A (zh) * 2020-08-11 2020-11-24 上海奕谱生物科技有限公司 一种核酸检测试剂盒、方法及其应用

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5733733A (en) 1992-08-04 1998-03-31 Replicon, Inc. Methods for the isothermal amplification of nucleic acid molecules
FR2737223B1 (fr) * 1995-07-24 1997-09-12 Bio Merieux Procede d'amplification de sequences d'acide nucleique par deplacement, a l'aide d'amorces chimeres
US6951722B2 (en) 1999-03-19 2005-10-04 Takara Bio Inc. Method for amplifying nucleic acid sequence
CN1373812B (zh) 1999-09-13 2012-04-11 纽亘技术公司 用于多核苷酸序列线性等温扩增的方法及组合物
EP1359219A4 (en) * 2001-02-06 2004-09-22 Takara Bio Inc AMPLIFIED NUCLEIC ACIDS AND IMMOBILIZED PRODUCTS THEREOF
CN1738914A (zh) 2002-11-21 2006-02-22 震源技术公司 使用编码双链启动子一条链的引物的方法
KR101041106B1 (ko) * 2003-11-25 2011-06-13 한면기 핵산과 단백질의 신규한 실시간 탐지방법
KR20060085818A (ko) 2005-01-25 2006-07-28 엘지전자 주식회사 드럼세탁기의 컨트롤패널 어셈블리
KR100816419B1 (ko) * 2005-10-14 2008-03-27 래플진(주) 핵산의 등온증폭 방법 및 핵산과 신호 프로브의 동시등온증폭을 이용한 핵산의 검출방법

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113151404A (zh) * 2011-02-15 2021-07-23 莱卡生物系统纽卡斯尔有限责任公司 用于mrna的定位的原位检测的方法
CN112135913A (zh) * 2018-05-18 2020-12-25 株式会社百义纳理 使用等温核酸扩增对生物组织三维核酸成像诊断的方法
CN109750091A (zh) * 2019-03-13 2019-05-14 江苏宏微特斯医药科技有限公司 单管检测一种或多种待测目标核酸序列的方法及其试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
WO2009072705A1 (en) 2009-06-11
KR20090057703A (ko) 2009-06-08
GB2467081A (en) 2010-07-21
KR100957057B1 (ko) 2010-05-13
DE112008003229T5 (de) 2010-09-16
US20100311058A1 (en) 2010-12-09
JP2011505129A (ja) 2011-02-24
GB201008439D0 (en) 2010-07-07
GB2467081B (en) 2012-12-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101883866A (zh) 通过同时等温扩增核酸和信号探针检测核酸的方法
US5627054A (en) Competitor primer asymmetric polymerase chain reaction
US20120021930A1 (en) Multiplex Nucleic Acid Detection
KR100816419B1 (ko) 핵산의 등온증폭 방법 및 핵산과 신호 프로브의 동시등온증폭을 이용한 핵산의 검출방법
US20100273159A1 (en) Nested Multiplex Amplification Method for Identification of Multiple Biological Entities
KR101589483B1 (ko) 핵산과 신호 프로브의 비대칭 등온증폭을 이용한 핵산의 검출방법
US20210254139A1 (en) Probe detection of loop-mediated amplification products
KR101823353B1 (ko) 보툴리눔 독소 A, B, E 및 클로스트리디움 퍼프린젠스 alpha 독소 유전자의 신속한 검출방법 및 검출 키트
JP2011510612A (ja) Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａの検出および／または監視のための組成物、キットおよび関連する方法
US12275990B2 (en) Modified primers for nucleic acid amplification and detection
JP4727771B2 (ja) 増幅によるクラミジア・トラコマティスの分析およびクラミジア・トラコマティスの核酸の検出
CA3012815C (en) Method for detecting target nucleic acid and nucleic acid probe used therein
CN102933720A (zh) 用于生成具有单链悬突的双链核酸的方法
KR20140071968A (ko) Ｐｃｒ에 의한 미생물 ｄｎａ 검출 방법, 이를 위한 시스템 및 조성물
AU2020281107B2 (en) Compositions and methods for detecting Zika virus nucleic acid
CN101535504A (zh) 核酸的多重分析
KR101785687B1 (ko) 다중 증폭 이중 시그널 증폭에 의한 타겟 핵산 서열의 검출 방법
US20150079587A1 (en) Method for detecting nucleic acids by simultaneous isothermal amplification of nucleic acids and signal probe
KR102180462B1 (ko) 삼중접합구조 기반 등온 핵산 증폭 기술을 이용한 표적핵산 검출 방법
KR101518561B1 (ko) 아시네토박터 균종 검출을 위한 종-특이 ｐｃｒ 기법 개발
JP5417752B2 (ja) 高精度の標的核酸の検出方法および標的核酸検出用キット
JP4395363B2 (ja) 核酸検出方法
KR20250040124A (ko) 프라이머 형성 회전환 증폭용 프로브를 이용한 식중독균 검출 방법
JP2011087534A (ja) 夾雑物の影響を排除する方法
JP2001346589A (ja) Ｈａｄｓ分解菌に特異的なポリヌクレオチド、並びに該ポリヌクレオチドを用いるｈａｄｓ分解菌の検出および定量方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: GREEN CROSS PHARMACEUTICALS INC.

Free format text: FORMER OWNER: RAPLEGENE INC.

Effective date: 20121126

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20121126

Address after: Long Ren

Applicant after: Green Cross Medical Technology Co

Address before: Gyeonggi Do, South Korea

Applicant before: Raplegene Inc.

C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20101110