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CN101812527A - 一种快速检测6种转基因玉米的方法 - Google Patents

一种快速检测6种转基因玉米的方法 Download PDF

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CN101812527A CN201010153788A CN201010153788A CN101812527A CN 101812527 A CN101812527 A CN 101812527A CN 201010153788 A CN201010153788 A CN 201010153788A CN 201010153788 A CN201010153788 A CN 201010153788A CN 101812527 A CN101812527 A CN 101812527A
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Abstract

本发明公开了一种快速检测6种转基因玉米的方法，该方法包括光学薄膜生物传感器芯片准备、转基因玉米的转化体特异性序列选择、探针合成及点阵、样品DNA提取及纯化、引物合成及生物素标记、PCR扩增、杂交、沉淀反应及显色观察的操作步骤。本发明检测方法的检测灵敏度和准确性高，样品中DNA浓度在0.01μM时便可检测出结果，准确率可达100.00％；检测通量大，适用于低、中、高不同通量的检测要求；检测速度快，所用时间短，只需30min便可检测出结果，比常规检测方法用时少10h以上；检测程序简单，检测结果可直接肉眼观察，免去了荧光标记和仪器扫描等常规检测的实验程序；检测成本低，极大地减少了试剂和设备投入。

Description

一种快速检测6种转基因玉米的方法
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种光学薄膜生物传感器芯片的可视化检测方法，应用于6种转基因玉米的快速检测。
背景技术
目前，转基因玉米检测是转基因生物检测的一项重要内容，在农产品和食品检测中具有重要的意义。转基因玉米检测方法有多种，主要有PCR(聚合酶链式反应)检测方法、多重PCR检测方法、转化体特异性PCR检测方法、基因芯片检测方法等。
PCR检测方法是一项最常用的检测方法，通过扩增特定的单个目标基因序列片段，达到从复杂的DNA混合物中检测出该目标基因的存在。但缺点是：该技术只能对单个目标基因进行检测，在检测较多目的基因时情况较为复杂，检测效率较低。
多重PCR检测方法，是在PCR检测方法基础上发展起来的检测方法，可以同时对多个目标基因进行检测，检测通量有一定的提高。但缺点是：该方法在同时扩增多对引物时，受扩增反应复杂性的限制，容易产生非特异性条带(假阳性)，偏离真实结果，检测精度较低。
转化体特异性PCR检测方法，也是在PCR检测方法基础上发展起来的检测方法，通过将外源DNA和植物DNA连接区某一部分基因序列作为转化体特异片段，由于该片段具有唯一标识性(高特异性)，因此可以获得更为精确的扩增，有效地降低检测误差。但缺点是：该技术对设计引物有比较高的要求。
基因芯片检测方法，是一种微阵列检测方法。该方法可以同时对多个目标基因进行精确检测，检测通量较大，检测速度快。通过将多个目标基因的探针，以阵列形式点样于芯片表面，然后用样品中的DNA(经过了同位素或荧光物等进行了标记处理)与探针的DNA进行互补杂交，再读取标记信息，即可获取高信息量的检测结果。但缺点是：该技术需要昂贵的激光扫描仪读取荧光标记数据，检测成本较高，推广普及受到一定限制。
发明内容
本发明提供一种应用光学薄膜生物传感器芯片快速检测6种转基因玉米的方法，即应用光学薄膜生物传感器芯片的检测方法，该方法是在转化体特异性PCR技术和微阵列技术及光学薄膜生物传感器芯片(生物芯片)技术的基础上研制出的对6种转基因玉米进行并行快速检测的新方法。
所述的检测方法的基本原理：光学薄膜生物传感器芯片是一种基于光的折射原理，将芯片表面厚度的变化转化为折射光波长的变化，再转变为肉眼可视的颜色变化的薄膜芯片。在6种转基因玉米(Bt11、Event176、GA21、MON810、NK603、T25)DNA的外源基因插入区，寻找转基因玉米的转化体特异性序列，以此设计相应的探针和引物，将探针点阵在光学薄膜生物传感器芯片上，提取待检测样品的DNA，用生物素标记的引物扩增待测样品中的目标基因；用标记了生物素的PCR扩增产物与芯片上的探针进行杂交，用连接了anti-biotin-HRP(辣根氧化酶的生物素抗体与生物素)结合，用TMB(四甲基联苯胺，)与辣根氧化酶进行沉淀反应，由于沉淀物改变了芯片表面的厚度，从而改变了芯片表面的反射光波长，引起芯片表面颜色的变化(颜色由金色变为兰色或紫色)，用肉眼便可观察到，因此而获得检测结果。本发明为一种应用光学薄膜生物传感器芯片快速检测6种转基因玉米的方法，包括光学薄膜生物传感器芯片准备、转基因玉米的转化体特异性序列选择及探针和引物设计、探针合成及点阵、样品DNA提取及纯化、引物合成及生物素标记、PCR扩增、杂交、沉淀反应及显色观察的操作步骤。
本发明的优点在于：
(1)检测灵敏度和准确性高，样品中DNA浓度在0.01μM时便可检测出结果，准确率可达100.00％；
(2)检测通量大，适用于低、中、高不同通量的检测要求；
(3)检测速度快，所用时间短，只需30min便可检测出结果，比常规检测方法用时少10h以上；
(4)检测程序简单，检测结果可直接肉眼观察，免去了荧光标记和仪器扫描等常规检测的实验程序；
(5)检测成本低，极大地减少了试剂和设备投入；
(6)应用前景广，可广泛用于转基因生物成分的检测，促进微阵列检测技术、转化体特异性检测技术和光学薄膜生物传感器芯片技术的推广普及。
附图说明
图1是本发明的6种转基因玉米的转化体特异性序列选定位置图；
图2A、2B是本发明中将探针点样于传感器芯片上的原理示意图；
图3A、3B是本发明中传感器芯片上杂交及检测的原理示意图；
图4是本发明的检测方法操作流程图。
具体实施方式
下面将结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
本发明提供的快速检测6种转基因玉米的方法，实现流程如图4所示，具体通过如下步骤实现：
步骤一、光学薄膜生物传感器芯片准备：从市场上订购的光学薄膜生物传感器芯片，如图2A所示，该传感器芯片为硅材质光学薄膜生物传感器芯片，规格为长5～20mm、宽5～20mm、厚0.3～0.6mm。芯片分为三层，从下到上依次为硅支持层1、光反射层2、表面附着层3，所述的硅支持层1上依次镀有光反射层2和表面附着层3。所述的硅支持层1厚度约为
Figure GSA00000090224200031
对光反射层2与表面附着层3起到支持作用；光反射层2物质为氮化硅(Si3N4)，其厚度约为
Figure GSA00000090224200032
其白光照射时反射光颜色为金黄色。在检测中，沉淀反应在芯片表面的沉淀物改变了表面附着层3厚度，从而改变了反射光颜色，这就将化学沉淀反应的结果反射出肉眼可见的颜色信号，达到检测的目的。表面附着层3为PPL(苯丙氨酸和赖氨酸同等比例的混合物)，其厚度约为
Figure GSA00000090224200033
表面富含联氨基团-NH-NH2，用于固定探针。
步骤二、转基因玉米的转化体特异性序列选择及探针和引物设计：如图1所示，在基因库和美国专利中查找到的6种转基因玉米(Bt11、Event176、GA21、MON810、NK603、T25)DNA序列上的外源基因序列与插入位置上的DNA序列，以及所包含的基因序列。在插入区选取100～300bp长度的DNA片段，使该片段既包含部分转入的外源基因序列，又包含部分该玉米品种所特有的基因序列，即获得了该种转基因玉米品种的转化体特异性序列，带箭头线段及其上部的数字分别表示所选择的该种转基因玉米品种的转化体特异性序列的位置和片段长度。根据该转化体特异性片段设计引物；在该转化体特异性序列上选取40bp长度的序列设计探针，该探针便是高特异性的或唯一性的。为便于探针的杂交反应，在探针的5’端连接20个腺嘌呤脱氧核苷酸序列；为了将探针固定在芯片上，再在探针的5’进行醛基修饰，具体探针和引物设计如下表1：
表1转化体特异性序列片段上具体探针和引物设计表
品种 目的基因 引物、探针序列   片段长度(bp) 片段来源
Bt11 IVS2/PAT   F：5’cttctgggaggccaaggtatct3’R：5’biotin-gctgctgtagctggcctaatct3’P：5’ALD-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaccatcccatttgtgatctttgtcagtagatatgatacaac3’ 192 基因库AY629236
T25 CaMV35S/PAT   F：5’agatcatcaatccactcttgtggtg3’R：5’biotin-ccttcgcaagacccttcctctata3’P：5’ALD-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaagccatatcagctgctgtagctggcctaatctcaactggtc3’ 231 基因库BD378188
Mon810 Maize genome/CaMV35S   F：5’tcgaaggacgaaggactctaacg3’R：5’biotin-tccatctttgggaccactgtcg3’P：5’ALD-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaccattgcccagctatctgtcactttattgtgaagatagtg3’ 170 美国专利U.S.Pat.6713259
  Event   CDPK/CryIA(b)   F：5’ctctcgccgttcatgtccgt3’   211   美国专利US
  176   R：5’biotin-ggtcaggctcaggctgatgt3’P：5’ALD-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaatccaacaatggacaacaaccccaacatcaacgagtgcat3’   Pat.5625136
品种 目的基因 引物、探针序列   片段长度(bp) 片段来源
NK603 ctp2/EPSPS   F：5’atgaatgacctcgagtaagcttgttaa3’R：5’biotin-aagagataacaggatccactcaaacact3’P：5’ALD-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagggatatcaagcttggtaccacgcgacacacttccactct3’ 108 美国专利US.Pat.6825400
GA21 OTP/m-EPSPS   F：5’acggtggaagagttcaatgtatg3’R：5’biotin-tctccttgatgggctgca3’P：5’ALD-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaccgtgatgatggcctcgtcggccaccgccgtcgctccg3’ 270 美国专利USPat.4940835
注：F：正向序列引物
R：在5’端带有生物素标记(biotin)的反向序列引物
P：在5’端带有20个dATP(腺嘌呤脱氧核苷酸)的序列，并进行了醛基修饰(ALD)的探针。
步骤三、探针合成及点阵：如图2A所示，根据步骤二中设计的探针序列，在选定的探针序列5’端连接20个dATP，然后在5’端进行醛基修饰(ALD)。如图2B所示，用PH7.8的0.1M磷酸盐缓冲液将探针浓度稀释为1μM，用移液器或点样仪将探针点阵在光学薄膜生物传感器芯片上，由于光学薄膜生物传感器芯片表面附着层3上富含联氨基团(氨基-NH-NH2)，能与探针上所带的醛基共价结合，从而将探针固定在光学薄膜生物传感器芯片表面上。室温湿润环境下放置2h后，用0.1×SDS(十二烷基硫酸钠)轻轻清洗3遍，再用ddH2O(双蒸水)洗3遍，吹干备用，(密闭、4℃保存有效期可达一年)。根据需要，在光学薄膜生物感器芯片上设计探针样点重复数，点样量为每点40～250nl。
步骤四、样品DNA提取及纯化：用Tiangen核酸提取纯化试剂盒提取并纯化DNA；用NanoDrop ND 1000(紫外可见分光光度计)测量所提取的DNA含量(判断提取DNA是否成功)；用琼脂糖凝胶电泳方法测量样品中DNA的质量。
步骤五、引物合成及生物素标记：按上表1中设计的引物序列，分别合成6种转基因玉米的正向序列引物和反向序列引物，其中反向引物在5’端进行生物素(biotin)标记。
步骤六、PCR扩增：用步骤五中合成的正向序列引物和反向序列引物对步骤四中提取的DNA进行PCR扩增，其PCR反应条件为25μl混合物，包括1×PCR Buffer，2mM MgCl(氯化镁)，0.1mM dNTP，0.2μM引物，1U rTaq(聚合酶)和100ng的DNA模板。反应在PTC-225 Peltier Thermal Cycler(PCR仪)中进行。扩增前先94℃变性5min；之后进行40个扩增循环，扩增循环程式设定为94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s；循环后72℃延伸10min；再用琼脂糖凝胶电泳测量PCR扩增产物的量和大小(用以初步检测样品中PCR扩增的特异性DNA片段是否与设计一致)；4℃保存。
步骤七、杂交：如图3A所示，取90μl HB(5×SSC和5mg/ml ATC的混合液)加到传感器芯片上，45℃温育5min；取2μl PCR扩增产物与8μl ddH2O混匀后，95℃变性3min；将变性后的PCR扩增产物加于传感器芯片上的HB缓冲液中，使得带有生物素标记的PCR产物与传感器芯片上的探针互补结合，混匀，45℃温育10min；室温下用0.1×SSC 100μl清洗芯片3次，吹干。
步骤八、沉淀反应及显色观察：如图3B所示，取100μl anti-biotin-HRP(连接了辣根氧化酶的生物素抗体，1∶1000稀释于HB缓冲液中)加到传感器芯片上，室温放置5min；室温下，用0.1×SSC 100μl清洗芯片3次，吹干；取100μl TMB(四甲基联苯胺)加到传感器芯片上，室温避光放置5min；用100μl ddH2O漂洗芯片3次，吹干；观察芯片表面探针颜色，获得检测结果。
如图3所示，当检测样品中存在转化体特异性片段，必会与探针片段互补配对结合，实现杂交，不会因清洗而被洗去；与探针杂交结合的转化体特异性片段由于是由引物合成的，其上标记有生物素，生物素与生物素抗体结合，生物素抗体又与TMB进行了沉淀反应，此时在传感器芯片上会显示出相应的颜色变化，则认为检测样品中有该转基因品种；如果检测样品中不存在转化体特异性片段，就不会与探针片段互补配对结合，就没有杂交，就会被清洗掉，就不会有沉淀反应，传感器芯片上就无任何变化，则认为检测样品中没有该转基因成分。

Claims (5)

1.一种快速检测6种转基因玉米的方法，其特征在于如下步骤：
步骤一、光学薄膜生物传感器芯片准备；
所述的光学薄膜生物传感器芯片为硅材质光学薄膜生物传感器芯片，芯片分为三层，从下到上依次为硅支持层、光反射层、表面附着层；
步骤二、转基因玉米的转化体特异性序列选择，探针和引物设计；
在6种转基因玉米品种DNA序列上的外源基因序列及插入位置上的DNA序列，以及所包含的基因序列上，在连接区域选取100～300bp长度的DNA片段，使该片段既包含部分转入的外源基因序列，又包含部分该玉米品种所特有的基因序列，即获得了该种转基因玉米品种的转化体特异性序列；所述的6中转基因玉米品种分别为Bt11、Event176、GA21、MON810、NK603、T25；
步骤三、探针合成及点阵；
根据步骤二中设计的探针序列，在探针5’端连接20个dATP，然后在5’端进行醛基修饰，用PH7.8的0.1M磷酸盐缓冲液稀释的探针浓度为1μM，用移液器或点样仪将探针点阵在芯片上；室温湿润环境下放置2h以上，用0.1×SDS轻轻清洗3遍，再用ddH2O洗3遍，吹干备用；
步骤四、样品DNA提取及纯化；
用Tiangen核酸提取纯化试剂盒提取并纯化DNA；
步骤五、引物合成及生物素标记；
按步骤二中设计的引物序列，分别合成6种转基因玉米的正向和反向序列引物，其中反向序列引物在5’端进行生物素标记；
步骤六、PCR扩增；
用合成的正向序列引物和反向序列引物对提取的DNA进行PCR扩增，其PCR反应条件为25μl混合物，包括1×PCR Buffer，2mM MgCl，0.1mM dNTP，0.2μM引物，1U rTaq和100ng的DNA模板；反应在PTC-225 Peltier Thermal Cycler中进行；扩增前先94℃变性5min；之后进行40个扩增循环，扩增循环程式设定为94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s；循环后72℃延伸10min；4℃保存；
步骤七、杂交；
取90μl HB加到芯片上，45℃温育5min；取2μl PCR产物与8μl ddH2O混匀后，95℃变性3min；将变性后的PCR产物加于芯片上的HB缓冲液中，混匀，45℃孵育10min；室温下用0.1×SSC 100μl清洗芯片3次，吹干；
步骤八、沉淀反应及显色观察检测结果；
取100μl anti-biotin-HRP加到传感器芯片上，室温放置5min；室温下，用0.1×SSC100μl清洗芯片3次，吹干；取100μl TMB加到传感器芯片上，室温避光放置5min；用100μl ddH2O漂洗芯片3次，吹干；观察芯片表面探针颜色，获得检测结果。
2.根据权利要求1所述的快速检测6种转基因玉米的方法，其特征在于：所述的硅支持层厚度为
Figure FSA00000090224100021
对光反射层与表面附着层起到支持作用；硅支撑层上依次镀有光反射层和表面附着层；所述的光反射层物质为氮化硅，厚度为
Figure FSA00000090224100022
表面附着层为PPL，厚度为
Figure FSA00000090224100023
表面富含氨基，用于固定探针。
3.根据权利要求1所述的快速检测6种转基因玉米的方法，其特征在于：所述的探针和引物的设计如下：
品种 目的基因 引物、探针序列   片段长度(bp) 片段来源 Bt11 IVS2/PAT   F：5’cttctgggaggccaaggtatct3’R：5’biotin-gctgctgtagctggcctaatct3’P：5’ALD-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaccatcccatttgtgatctttgtcagtagatatgatacaac3’ 192 基因库AY629236 T25 CaMV35S/PAT   F：5’agatcatcaatccactcttgtggtg3’R：5’biotin-ccttcgcaagacccttcctctata3’P：5’ALD-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaagccatatcagctgctgtagctggcctaatctcaactggtc3’ 231 基因库BD378188 Mon810 Maize genome/CaMV35S   F：5’tcgaaggacgaaggactctaacg3’R：5’biotin-tccatctttgggaccactgtcg3’P：5’ALD-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaccattgcccagctatctgtcactttattgtgaagatagtg3’ 170   美国专利U.S.Pat.6713259 Event 176 CDPK/CryIA(b)   F：5’ctctcgccgttcatgtccgt3’R：5’biotin-ggtcaggctcaggctgatgt3’P：5’ALD-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaatccaacaatggacaacaaccccaacatcaacgagtgcat3’ 211   美国专利USPat.5625136 NK603 ctp2/EPSPS   F：5’atgaatgacctcgagtaagcttgttaa3’R：5’biotin-aagagataacaggatccactcaaacact3’P：5’ALD-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagggatatcaagcttggtaccacgcgacacacttccactct3’ 108   美国专利US.Pat.6825400 GA21 OTP/m-EPSPS   F：5’acggtggaagagttcaatgtatg3’R：5’biotin-tctccttgatgggctgca3’P：5’ALD-aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaccgtgatgatggcctcgtcggccaccgccgtcgctccg3’ 270   美国专利USPat.4940835
注：F：正向序列引物；
R：在5’端带有生物素标记的反向序列引物；
P：在5’端带有20个dATP的序列，并进行了醛基修饰的探针。
4.根据权利要求1所述的快速检测6种转基因玉米的方法，其特征在于：步骤三中所述的探针点阵，在芯片上设计的探针样点重复数，点样量为每点40～250nl。
5.根据权利要求1所述的快速检测6种转基因玉米的方法，其特征在于：步骤八中所述的anti-biotin-HRP为连接了辣根氧化酶的生物素抗体，以1∶1000比例稀释于HB缓冲液中形成。
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