CN101815785A

CN101815785A - 特异性基因表达的方法

Info

Publication number: CN101815785A
Application number: CN200880102998A
Authority: CN
Inventors: 峰野纯一; 冈本幸子; 住冈理早; 北川正成; 珠玖洋; 加藤郁之进
Original assignee: Takara Bio Inc; Oji Paper Co Ltd
Current assignee: New Oji Paper Co Ltd; Takara Bio Inc; Mie University NUC
Priority date: 2007-06-11
Filing date: 2008-06-10
Publication date: 2010-08-25
Anticipated expiration: 2028-06-10
Also published as: WO2008153029A1; CN101815785B; JP5828861B2; JP5271901B2; EP2172547B1; EP3031916A1; EP2172547A4; EP2172547A1; JPWO2008153029A1; EP3031916B1; US9051391B2; KR101363928B1; US20150232530A1; JP2013162797A; US20100273213A1; US9296807B2; KR20100058447A

Abstract

公开了可表达非天然寡聚蛋白的细胞，在所述细胞中已导入了编码相应于至少一种组成天然寡聚蛋白的内源多肽的外源多肽的基因，并且其中所述内源多肽的表达被抑制。

Description

特异性基因表达的方法

技术领域

本发明涉及表达非天然寡聚蛋白的细胞、产生所述细胞的方法和形成非天然寡聚蛋白的方法，所述寡聚蛋白可用于医疗领域。

背景技术

活体主要通过免疫应答来保护免受外源物质的侵害，免疫系统由不同的细胞和由细胞产生的可溶性因子构成。其中，白细胞特别地淋巴细胞起着中心作用。淋巴细胞被分为称为B淋巴细胞(在下文中，在一些情况下称为B细胞)和T淋巴细胞(在下文中，在一些情况下称为T细胞)的两个主要类型，它们中的任一种特异性识别抗原，并且作用于其以保护活体。

大多数T细胞由在外表面表达CD(分化抗原簇(Cluster ofDifferentiation))4标记的CD4阳性T细胞和表达CD8标记的CD8阳性T细胞组成。大部分CD4阳性T细胞称为辅助T细胞(在下文中称为T_H)，其参与协助抗体产生和诱导各种免疫应答，以及分化成Th1型和Th2型，在所述两种类型中，通过抗原刺激所产生的细胞因子的类型彼此不同。大部CD8阳性T细胞分化成细胞毒性T细胞[Tc：细胞毒性T淋巴细胞，也称为杀伤T细胞，在下文中在一些情况下称为CTL]，通过抗原刺激其展示细胞毒性活性。

作为外科手术、化学疗法和放射疗法之后的第四癌症疗法，免疫疗法近来日益吸引人们的注意。由于免疫疗法利用人类本身具有的免疫能力，因此据认为与其他疗法相比较，其对患者的身体负荷更小。已知的免疫疗法包括导入通过体外诱导的CTL获得的淋巴因子活化细胞、NKT细胞、γδT细胞等、根据多种方法扩增培养产生的外周血淋巴细胞的疗法、树突细胞转移疗法和预期体外诱导抗原特异性CTL的肽疫苗疗法、Th 1细胞疗法以及此外，免疫基因疗法(在该疗法中，将可从其预期各种效应的基因在体外导入此类细胞，然后转移至体内)。

一些细胞毒性T细胞(CTL)通过由α链和β链的异二聚体组成的特异性T细胞受体(在下文中缩写为TCR)识别为主要组织相容性抗原分子(MHC分子，在人类的情况下，称为人白细胞抗原，在下文中缩写为HLA)(其由主要组织相容性基因复合物(在下文中缩写为MHC)编码)与抗原肽的结合物的复合物，并且可破坏在其表面上呈递该复合物的细胞。

预期通过将识别目的抗原的TCR基因导入T细胞来将针对目的抗原的特异性细胞毒性活性赋予具有细胞毒性活性的T细胞。基于该预期，已尝试了使用靶向不同抗原例如MART1(非专利文献1)、gp100(非专利文献2)和mHAG HA-2抗原(非专利文献3)的TCR基因的基因疗法。然而，例如，当将由识别目的抗原的α链和β链组成的TCR基因导入T细胞时，由T细胞本身表达的内源TCRα链和TCRβ链引起导入的识别目的抗原的TCR的β链与α链之间的错配。即，当将α’和β’导入表达α和β的细胞时，形成各αβ、αβ’、α’β和α’β’异二聚体，从而引起形成识别目的抗原的正确异二聚体的TCR减少和可形成识别预料之外的抗原的异二聚体的问题。

作为解决该问题的方法，已尝试了将不与内源TCR形成异二聚体的单链TCR导入T细胞的方法(非专利文献4)和将具有识别目的抗原的抗体的嵌合受体(T-体(T-body))导入T细胞的方法(非专利文献5)。然而，因为通过此类方法获得的T细胞同时具有内源TCR和导入的TCR，因此T细胞可识别两种类型的抗原。此外，因为重组TCR不是天然存在的TCR，所以必需确认至T细胞的信号传递、安全性等。此外，作为另一种方法，存在将识别目的抗原的TCR的β链和α链导入不表达TCR的α链和β链的T细胞例如表达γ链和δ链的T细胞(γδT细胞)的方法(非专利文献6)。然而，通过该方法获得的T细胞具有与使用重组TCR的方法的顾虑相同的顾虑。

如上通过TCR举例说明的，当将可作为组成性多肽(constituentpolypeptide)而被整合入寡聚蛋白的外源多肽导入表达所述蛋白的细胞时，存在可形成不能表现期望的功能和其中内源多肽和外源多肽混合在一起的寡聚蛋白，或表现期望的功能的寡聚蛋白可因内源多肽与外源多肽之间的竞争而减少的问题。

非专利文献1：J.Immunol.，第163卷，pp.507-513(1999)

非专利文献2：J.Immunol.，第1703卷，即.2186-2194(2003)

非专利文献3：Blood，第103卷，pp.3530-3540(2003)

非专利文献4：Gene Therapy，第7卷，pp.1369-1377(2000)

非专利文献5：J.Clin.Invest.，第114卷，pp.1774-1781(2004)

非专利文献6：Cancer Res.，第66卷，pp.3331-3337(2006)

本发明的公开内容

通过本发明解决的问题

本发明的目的是提供其中不期望的寡聚物形成被抑制的细胞和抑制寡聚物形成的方法，所述不期望的寡聚物的形成是在将编码能够组成寡聚蛋白的外源多肽的基因导入表达所述寡聚蛋白的细胞时引起内源和外源多肽混合而发生的。

解决问题的方法

本发明的第一方面涉及表达非天然寡聚蛋白的细胞，其包含导入的编码相应于至少一种组成天然寡聚蛋白的内源多肽的组成非天然寡聚蛋白的外源多肽的基因，其中所述内源多肽的表达被抑制。

在本发明的第一方面，寡聚蛋白可由可变区和恒定区组成，寡聚蛋白可以是抗原识别受体，特别地，抗原识别受体可以是T细胞受体(TCR)。此外，内源多肽的表达可被RNA干扰抑制，寡聚蛋白可由可变区和恒定区组成，并且组成寡聚蛋白的内源多肽的表达可被靶向相应于多肽的恒定区的mRNA序列的RNA干扰抑制。此外，外源多肽可具有与内源多肽的恒定区的氨基酸序列有相同的氨基酸序列的恒定区，并且内源多肽的表达可通过产生与内源多肽的mRNA的核苷酸序列不同的外源多肽的mRNA的核苷酸序列来抑制。

本发明的第二方面涉及产生表达非天然寡聚蛋白的细胞的方法，其包括进行下列步骤：

(a)将基因导入能够表达所述天然寡聚蛋白的细胞的步骤，其中所述基因编码相应于至少一种组成天然寡聚蛋白的内源多肽的组成非天然寡聚蛋白的外源多肽，和

(b)抑制所述内源多肽的表达的步骤。

在本发明的第二方面，寡聚蛋白可由可变区和恒定区组成，寡聚蛋白可以是抗原识别受体，特别地，抗原识别受体可以是TCR。此外，内源多肽的表达可被RNA干扰抑制，寡聚蛋白可由可变区和恒定区组成，并且组成寡聚蛋白的内源多肽的表达可被靶向相应于多肽的恒定区的mRNA序列的RNA干扰抑制。此外，外源多肽可具有与内源多肽的恒定区的氨基酸序列有相同的氨基酸序列的恒定区，并且内源多肽的表达可通过产生与内源多肽的mRNA的核苷酸序列不同的外源多肽的mRNA的核苷酸序列来抑制。

本发明的第三方面涉及形成非天然寡聚蛋白的方法，其包括进行下列步骤：

(b)抑制所述内源多肽的表达的步骤。

在本发明的第三方面，寡聚蛋白可由可变区和恒定区组成，寡聚蛋白可以是抗原识别受体，特别地，抗原识别受体可以是TCR。此外，内源多肽的表达可被RNA干扰抑制，寡聚蛋白可由可变区和恒定区组成，并且组成寡聚蛋白的内源多肽的表达可被靶向相应于多肽的恒定区的mRNA序列的RNA干扰抑制。此外，外源多肽可具有与内源多肽的恒定区的氨基酸序列有相同的氨基酸序列的恒定区，并且内源多肽的表达可通过产生与内源多肽的mRNA的核苷酸序列不同的外源多肽的mRNA的核苷酸序列来抑制。

本发明的效果

根据本发明，提供了以高比率表达保持期望的功能的寡聚蛋白的细胞，其中至少一种内源多肽用外源多肽来替代。所述细胞极其适用于通过细胞医疗来治疗疾病。

附图概述

图1是显示TCR基因的表达的图。

图2是显示TCR阳性细胞的比率的图。

图3是显示TCR阳性细胞的PE的荧光强度的图。

图4是显示TCRα基因的表达的图。

图5是显示TCRβ基因的表达的图。

图6是显示MAGE-A4四聚体阳性细胞的比率的图。

图7是显示Rm/Fh插入物的构建的流程的图。

图8是显示T3载体的构建的流程的图。

图9是显示T7载体的构建的流程的图。

图10是显示T15载体的构建的流程的图。

图11是显示pSINsi-hH/hU的构建的流程的图。

图12是显示HB/UA插入物的构建的流程的图。

图13是显示TN1载体的构建的流程的图。

图14是显示TN5载体的构建的流程的图。

图15是显示pMS-a-hUTCRA-Pb1的构建的流程的图。

图16是显示TN9载体和TN11载体的构建的流程图的图。

图17是显示TCR基因的表达的图。

图18是显示MAGE-A4四聚体阳生细胞比率的图。

图19是显示TCR基因的表达的图。

图20是显示MAGE-A4四聚体阳性细胞的比率的图。

图21是显示细胞内IFNγ阳性细胞的比率的图。

图22是显示TCR基因的表达(感染后5天)的图。

图23是显示TCR基因的表达(感染后11天)的图。

图24是显示MAGE-A4四聚体阳性细胞的比率的图。

图25是显示细胞内IFNγ阳性细胞的比率的图。

图26是显示MAGE-A4四聚体阳性细胞的比率的图。

图27是显示TCR基因的表达的图。

实施本发明的最佳模式

如本文所使用的，“寡聚蛋白”意指由多个组成性多肽(亚基)组成的蛋白质。寡聚蛋白可以是由多个相同多肽组成的同寡聚体(homooligomer)或由多种类型的多肽组成的异寡聚(heterooligomer)。此外，作为组成元件的多肽的数目不受特别限制，本发明可用于二聚体、三聚体、四聚体和由更多数目的多肽组成的寡聚体的任一种。寡聚蛋白通过共价键例如多肽之间的二硫键(SS键)、静电键等形成。

如本文所使用的，“内源多肽”意指从细胞内原有基因天然表达的多肽。相反地，“外源多肽”意指已人为地从外部导入的多肽，其实例包括通过物理方法导入细胞的多肽和由本身不存在于其中导入了所述多肽的细胞中的外源基因表达的多肽。此外，“非天然寡聚蛋白”是其中至少一种组成蛋白的内源多肽用外源多肽替代的寡聚蛋白，其包括由单独的外源多肽组成的寡聚蛋白和包含内源多肽和外源多肽的寡聚蛋白的任一种寡聚蛋白。虽然本发明不受特别限制，但通常地，外源多肽具有在使得可形成寡聚蛋白的范围内与内源多肽的氨基酸序列不同的氨基酸序列。

如本文所使用的，“多肽的表达的抑制”意指通过阻止编码多肽的基因的转录和/或翻译产生的对最终多肽的产生的抑制，即，作为产物的多肽的量的减少。因此，即使当编码多肽的基因的转录未被抑制时，只要转录产物(mRNA)被快速降解以及蛋白质的产生被抑制，其仍包括在“表达的抑制”内。在本发明中，选择性抑制其表达期望被抑制的内源多肽的表达。

“多肽的表达的抑制”的意义不受特别限制。优选，使用可选择性抑制多肽的表达的意义。例如，基于对多肽的空间结构或氨基酸序列或编码多肽的核苷酸序列的特异性抑制多肽的表达的意义在本发明中是优选的。所述意义不受特别限制，以作为抑制多肽从mRNA翻译的方法的RNA干扰、核酶和反义RNAT为例进行了说明。

如本文所使用的，“抗原识别受体”意指特异性识别抗原的蛋白质。作为抗原识别受体，例示了人源性T细胞受体(TCR)和来源了除了人以外的生物体的TCR。作为TCR，由α链和β链组成的异二聚体和由γ链和δ链组成的异二聚体是已知的，并且其中的任一个可优选用于本发明。

如本文所使用的，“T细胞”也称为T淋巴细胞，意指在参与免疫应答的淋巴细胞当中来源于胸腺的细胞。T细胞的实例包括辅助T细胞、抑制性T细胞、控制性T细胞(controlling T cell)、CTL、幼稚T细胞(

T cell)、记忆性T细胞、表达α链和β链的TCR的αβT细胞和表达γ链和δ链的TCR的γδT细胞。作为“包含T细胞的细胞群体”，例示了细胞群体包括血液(外周血、脐带血等)或骨髓液、从血液、骨髓液等收集、分离、纯化和诱导的外周血单核细胞(PBMC)、血细胞、造血干细胞或脐带血单核细胞。此外，来源于血细胞的包含T细胞的不同细胞群体可用于本发明。此类细胞可用细胞因子例如IL-2体内或离体(exo vivo)激活。关于此类细胞，可使用从活体收集的细胞、或通过体外培养获得的细胞例如实际上通过本发明的方法获得的T细胞群体、或已冷藏保存的包含T细胞群体的群体的任一种。

在下面，将具体地解释本发明。

(1)本发明的细胞

本发明的细胞是包含导入的编码相应于至少一种组成天然寡聚蛋白的内源多肽的外源多肽的基因的细胞，其中所述内源多肽的表达被抑制，由此，可表达非天然寡聚蛋白。通过上述构建，本发明具有这样的有利方面，即与其中只是将外源多肽在细胞中表达的情况相比较，更有效地形成了具有期望的功能并且包含作为组成性多肽的外源多肽的非天然寡聚蛋白。

当待表达的非天然寡聚蛋白是同寡聚体时，如果内源多肽的表达被适当的表达抑制方法抑制，并且外源多肽表达时，期望的非天然寡聚蛋白的形成比率得到提高。在异寡聚体的情况下，存在两种情况：其中寡聚蛋白的功能通过用外源多肽只替代一种类型的组成性多肽来改变的情况；和其中用外源多肽替代所有组成性多肽是必需的情况。在两种情况中，进行这样的处理以使相应于待导入的外源多肽的不期望被整合入期望的非天然寡聚蛋白的内源多肽的表达被抑制。例如，在其中当用两种类型的外源多肽形成作为寡聚蛋白的异二聚体时期望的功能得到发挥的情况下，抑制相应于各多肽的两种类型的内源多肽的表达。此外，当期望形成由一种类型的外源多肽和另一种类型的内源多肽组成的异二聚体时，选择性抑制与外源多肽竞争的内源多肽的表达。

此外，本发明的细胞可以是这样的细胞，在所述细胞中内源多肽的表达，与外源多肽的表达相比较，被选择性抑制，并且与不使用表达抑制方法的情况相比较，内源多肽的表达水平可以是20％或更多，40％或更多，60％或更多，80％或更多或100％，即表达可被完全抑制。

本发明可用于的寡聚蛋白不受特别限制，仅例示了结构蛋白、酶、转录因子、受体和抗体。此外，在本发明中，寡聚蛋白可以是细胞表面蛋白(膜蛋白)，并且对于抗原识别受体，例如实施例部分中例示的T细胞受体(TCR)的应用是特别优选的。

在本发明的细胞中，由于组成天然寡聚蛋白的内源多肽的表达被抑制，因此外源多肽与内源多肽之间的竞争被抑制，从而形成包含外源多肽(其表达是期望的)的适当的寡聚蛋白。

用于本发明的细胞不受特别限制，只要细胞表达寡聚蛋白，并且可使用动物细胞、植物细胞和微生物中的任一种。由于来源于人或除了人以外的动物的T细胞表达形成异二聚体的TCR，因而为了改变TCR(虽然目的不受特别限制)可在本发明中使用所述细胞。本发明的细胞不需要目的在于使内源多肽不表达的编码内源多肽的基因的缺失或分化诱导。即，本发明可使用表达内源多肽的细胞，从而其是有用的。

在本发明中，作为抑制多肽的表达的方法的一个方面，利用RNA干扰(RNAi)。RNA干扰报导于1998年，并且一直以来作为抑制基因表达(归因于通过双链RNA进行的序列特异性mRNA的降解)的现象吸引人们的注意。RNA干扰据认为是通过这样的机制而发生的，在该机制中，长双链RNA由于称为切酶(Dicer)的RNA酶III型的活性而被降解成称为siRNA的21至25个核苷酸的短RNA，随后，siRNA被整合入称为RISC(RNA诱导沉默复合物)的核糖核酸-蛋白质复合物，然后该复合物以ATP依赖性的方式结合至靶RNA，从而降解靶RNA。

在本发明的RNA干扰中，为了选择性抑制内源多肽的表达，利用与从编码内源多肽的基因转录的mRNA的核苷酸序列同源或与其互补的RNA分子或包含与mRNA的核苷酸序列同源或与其互补的序列的链的双链RNA分子。在本文中，“与从编码内源多肽的基因转录的mRNA的核苷酸序列同源或互补”和“与编码内源多肽的mRNA的核苷酸序列同源或互补”不仅指与mRNA的核苷酸序列完全同源或互补，而且还指在使得发挥期望的功能的范围内大体上同源或互补。此外，用于本发明的RNA分子称为siRNA(短干扰RNA)。siRNA可以是与从编码内源多肽的基因转录的mRNA的一个区域同源或互补的一种类型的siRNA，或可以是包括多个与多个区域同源或互补的双链RNA分子的siRNA。

关于用于本发明的siRNA的链长，从哺乳动物细胞中干扰素应答的抑制的角度来看，例如，例示了具有13至29个碱基的链长的siRNA，优选具有15至25个碱基对的链长的siRNA和更优选，具有20至25个碱基对的链长的siRNA。此外，可能使用其中所有具有上述链长的核苷酸序列都来源于内源多肽的mRNA的核苷酸序列或其部分来源于所述核苷酸序列的siRNA。此外，用于本发明的siRNA，从哺乳动物细胞中RNA干扰的功效的角度来看，可以是例如具有在3’-末端侧上突出的2至4个碱基的单链区的双链RNA的形状的siRNA或更优选具有在3’-末端侧上突变的2个碱基的单链区的双链RNA的形状的siRNA。作为突出的单链区，例示了2至4个碱基(TT、TTT、TTTT)的连续脱氧胸苷残基。

用于本发明的siRNA主要由核糖核苷酸组成，并且其部分可包含脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸的衍生物和/或核糖核苷酸的衍生物。本发明的RNA不受特别限制，可通过已知的化学合成方法合成。备选地，可用适当的模板核酸酶促制备(例如，使用RNA聚合酶)RNA。用于本发明的siRNA可来源于能够在分子中形成双链的单链RNA，例示了具有作为茎的siRNA和作为环(shRNA)的任选序列的茎-环结构(短发夹结构：sh结构)的单链RNA。作为任选序列，例示了1至30个核苷酸的序列，可使用优选1至25个核苷酸的序列，更优选5至22个核苷酸的序列。

关于用于本发明的siRNA，可将siRNA或包含siRNA的RNA分子直接导入细胞，或可将在细胞中从其转录siRNA或包含siRNA的RNA分子的核酸构建体导入细胞。当将siRNA或包含siRNA的RNA分子直接导入细胞时，适当地可使用TransIT-TKO(由Mirus生产的)或人T细胞Nucleofector试剂盒(Amaxa)。在另一方面，当使用从其转录RNA分子的核酸构建体时，可能使用其中编码siRNA或包含siRNA的RNA的核酸与启动子的下游连接的构建体，所述启动子能够以其中可转录siRNA的状态，即功能性地，在哺乳动物细胞中发挥功能，虽然本发明不特别地限定于其。作为优选方面，例示了其中编码组成能够抑制编码内源多肽的基因的表达的双链RNA的RNA链的核酸被置于启动子的下游的构建体。

用于核酸构建体的启动子不受特别限制，只要其可在哺乳动物中发挥功能，其实例包括RNA聚合酶II启动子、RNA聚合酶III启动子和可用四环素调控的启动子。此外，有利地使用组织特异性启动子，因为这使得可能在期望的细胞、位置或器官中特异性抑制内源多肽的功能。RNA聚合酶II启动子的实例包括但不限于CMV启动子等。此外，RNA聚合酶III启动子的实例包括tRNA启动子、U6snRNA启动子、组蛋白H1启动子等。可用四环素调控的启动子的实例包括四环素调控型U6启动子、TR启动子等。通过将启动子与Cre-lox P系统组合，可更严格地控制RNA的转录。

用于本发明的核酸构建体的构建不受特别限制。例如，可这样构建构建体以使得能够抑制目的基因的功能的双链RNA的有义和反义链根据下列系统转录：(A)分别转录有义RNA和反义RNA的串联型，其中编码有义RNA的核酸和编码反义RNA的核酸分别连接至不同的两个启动子的下游，并且两个转录单位以正向排列，(B)转录茎-环型(或短发夹型)的RNA的类型，其中有义RNA和反义RNA直接连接或通过环连接，其中编码有义RNA的核酸和编码反义RNA的核酸以正向置于一个启动子的下游，或(C)相对型(opposite type)，其中启动子在每一条链中分别被置于编码有义链或反义链的核酸的两个末端，并且两条RNA链都通过分开的启动子转录。在本发明中，取决于使用条件，例如哺乳动物细胞的类型以及有义序列和反义序列的类型，可选择性使用串联型、茎-环型或相对型。

用于本发明的核酸构建体可被整合入适当的载体，例如质粒载体或病毒载体以使其可在细胞中更稳定地发挥作用。此外，本发明的核酸构建体可被整合入细胞的染色体DNA。质粒载体不受特别限制，其实例包括表达用于RNA干扰的核酸的piGENE tRNA质粒(商品名称，由iGENE生产的)、siLentGene(由Promega生产的)、pSEC Hygro载体(由Ambion生产的)、pBAsi载体(由TAKARA BIO生产的)等。病毒载体的实例包括腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。作为可商购获得的腺病毒载体的实例，例示了基因敲除腺病毒RNAi系统(由Clontech生产的)，以及，作为可商购获得的逆转录病毒载体的实例，例示了pSINsi载体(由TAKARA BIO生产的)和pSIREN-RetroQ载体(由Clontech生产的)。

可按照适合于载体的适当方法，例如在质粒载体的情况下通过电穿孔法、脂质转染法等或在病毒载体的情况下通过利用病毒感染细胞的能力将制备的载体导入目的细胞。

在本发明中，当包含在非天然寡聚蛋白中的外源多肽与相应于外源多肽的内源多肽存在时，它们彼此竞争寡聚蛋白的形成并且，同时，形成几种类型的包含外源多肽或内源多肽的寡聚蛋白。在本发明的细胞中表达的外源多肽不受特别限制，只要其是与内源多肽相比其表达几乎不被所使用的抑制表达的方法抑制的多肽，优选其表达不被抑制的多肽。例如，当siRNA用作抑制表达的方法时，优选地，编码待导入的外源多肽的基因优选是从其转录的RNA与siRNA不具有高度同源性或互补的这样的核苷酸序列，即不接受siRNA的作用的序列。当siRNA所作用的RNA上的区域在内源多肽与外源多肽之间相同时，可改变外源多肽的核苷酸序列而不改变编码的氨基酸序列。已知对于每一种氨基酸，基因上存在1至6种赋予氨基酸的密码子(3个碱基的组合)。通过选择适当的密码子，可改变碱基而不改变编码的氨基酸序列(该改变称为沉默突变)。即，核酸序列不同，但氨基酸序列可以相同。在沉默突变中，可在许多情况下改变密码子的第三碱基。当将该沉默突变导入编码外源多肽的基因时，抑制内源多肽的表达的siRNA不作用于从编码外源多肽的基因转录的RNA，从而减少了对外源多肽表达的抑制。因此，与外源多肽的表达相比较，可选择性抑制内源多肽的表达。在本说明书中，其中如上所述导入了沉默突变的基因在下面的一些情况下称为“密码子修饰(odonmodified)”基因。当通过通过选择密码子(所述密码子是其中使用该密码子的宿主中频繁使用的密码子)和增加翻译效率的序列进行的改变来改变核苷酸序列时，可提高外源多肽的表达效率，虽然本发明不限定于其。

此外，在用siRNA抑制内源多肽的表达的另一个方面中，关于相应于siRNA所作用的RNA的区域的外源多肽的氨基酸序列，可通过在使得外源多肽的功能不受损的范围内用另一种氨基酸置换，例如使用相似氨基酸置换来改变氨基酸序列。相似的氨基酸意指在物理化学性质上相似的氨基酸，其实例包括分类为相同类型的氨基酸，例如芳香族氨基酸(Phe、Trp、Tyr)、脂肪族氨基酸(Ala、Leu、Ile、Val)、极性氨基酸(Gln、Asn)、碱性氨基酸(Lys、Arg、His)、酸性氨基酸(Glu、Asp)、具有羟基的氨基酸(Ser、Thr)、具有小侧链的氨基酸(Gly、Ala、Ser、Thr、Met)等。预期使用这样的相似的氨基酸的置换不导致多肽的表型的改变(即保守氨基酸置换)。保守氨基酸置换的实例在本领域内是熟知，并且公开于许多文献中(例如，请参见例如Bowie等人，Science，第247卷，pp.1306-1310(1990))。通过将保守氨基酸置换导入外源多肽，抑制源内源多肽的外源多肽表达的siRNA不作用于从编码外源多肽的基因转录的RNA，从而减小表达的抑制。因此，与外源多肽的表达相比较，内源多肽的表达可被选择性抑制。

作为T细胞受体(TCR)，存在两种类型的TCR，包括由α链和β链组成的异二聚体和由γ链和δ链组成的异二聚体。TCR的各链由可变(V)区、连接(J)区和恒定(C)区组成。TCR的V区的多样性因编码V区的基因区段的组合、重排结合位点的滑脱和在DNA重排后N序列至结合位点的插入而发生。在α链和β链的V区中，其中氨基酸序列的突变特别频繁发生的高变区(CDR)得到公认。

作为本发明的一个方面，例示了表达非天然TCR的T细胞，其包含导入的编码组成非天然TCR的外源多肽的基因，其中相应于所述外源多肽的内源多肽的表达被抑制。例如，当将识别期望的抗原的TCR作为外源TCR导入T细胞时，在其中内源TCR的表达被抑制的本发明的T细胞中，外源多肽与内源多肽之间的错配减少，从而，包含目的外源多肽的TCR异二聚体的分子数目增加。此外，因为内源TCR的表达被抑制，在存在于细胞表面上的TCR当中，非天然TCR的比率增加，并且只表达非天然TCR的单价T细胞增加。因此，对于抗原的特异性得到提高，这在细胞治疗等的领域内是非常有利的。此外，存在这样的可能性，即在将外源TCR导入表达内源TCR的细胞时，内源TCR和外源TCR的基因表达彼此竞争，从而外源TCR的表达减少。此外，还存在另外的可能性，即由于错配的TCR而导致的副作用例如移植物抗宿主病(GVHD)等可发生。本发明的细胞可避免外源TCR的表达减少或包括GVDH在内的副作用。

各T细胞中内源TCR的V区的氨基酸序列彼此不同，然而C区的氨基酸序列适合用作siRNA的靶，因为C区的氨基酸序列由相同核苷酸序列的基因编码，所述核苷酸序列为各个T细胞的共同序列。此外，通过在其中siRNA作用于编码内源多肽的基因的区域中改变(置换)编码外源多肽的基因，即通过获得密码子修饰基因来使其成为非作用区域，内源多肽的表达被抑制，从而可高效率进行外源多肽的表达。

例如，当抑制内源TCR的表达时，在编码TCR的基因的C区中，可将内源α链的核苷酸序列AGTAAGGATTCTGATGTGTAT(SEQ IDNo.：19)密码子修饰成外源α链的核苷酸序列AGCAAGGACAGCGACGTGTAC(SEQ ID No.：20)，虽然本发明不受限于其。由上述两个核苷酸序列编码的氨基酸序列在SKDSDVY(SEQ IDNo.：21)中具有共同的区域，但内源TCR的α链被通过退火如SEQ ID NO.：3和SEQ ID No.：4显示的RNA而制备的双链siRNA选择性抑制。外源TCRα链的一个实例是由如SEQ ID No.：1显示的核苷酸序列编码的多肽。在SEQ ID No.：1中，核苷酸68至883的核苷酸序列编码TCRα链。其中，核苷酸68至401、核苷酸406至461和核苷酸462至883分别编码V区、J区和C区。SEQ ID No.：1的核苷酸569至589相应于SEQ IDNo.：20，并且上述区域的序列与内源TCRα链的相应区域的序列不同。

此外，内源β链的核苷酸序列GCCACCATCCTCTATGAGATC(SEQ ID No.：22)可被密码子修饰成外源β链的核苷酸序列GCCACCATCCTGTACGAGATC(SEQ ID No.：23)。由上述两个核苷酸序列编码的氨基酸序列ATILYEI(SEQ ID No.：24)中具有共同的区域，但内源TCR的β链被通过退火如SEQ ID NO.：5和SEQ ID No.：6显示的RNA而制备的双链siRNA选择性抑制。外源TCRβ链的一个实例是由SEQ ID No.：2中描述的核苷酸序列编码的多肽。在SEQ ID No.：1中，核苷酸68至883的核苷酸序列编码TCRβ链。在SEQ ID No.：2中，核苷酸编号68至1006的核苷酸序列编码TCRβ链。其中，核苷酸68至414、核苷酸427至470和核苷酸471至1006分别编码V区、J区和C区。SEQ ID No.：2的核苷酸902至922相应于SEQ ID No.：23，并且上述区域的序列与内源TCRβ链的相应区域的序列不同。

对其施用含有导入的本发明的外源TCR的T细胞的疾病不受特别限制，只要其是呈现对T细胞敏感的疾病即可，所述疾病的实例包括癌症(白血病，实体瘤等)、具有病毒、细菌或真菌的病原体的传染性疾病例如肝炎、流感、HIV等，例如结核病、MRSA、VRE和深部真菌病(deepmycosis)。此外，本发明的细胞可用于在骨髓移植或辐射照射后或在为了缓和再发性白血病而输注供体淋巴细胞中预防传染性疾病。

在本发明中，用于导入编码外源多肽的基因的方法不受特别限制，并且可从已知的基因导入方法中选择适当的方法进行使用。关于基因导入方法，可使用任何使用病毒载体的方法和不使用载体的方法。许多文献已经公开关于此类方法的详细描述。

病毒载体不受特别限制，可使用通常用于基因导入方法的已知的病毒载体，例如，可使用逆转录病毒载体(包括慢病毒载体，假型载体)、腺病毒载体、腺伴随病毒载体、猿猴病毒载体、痘苗病毒载体、仙台病毒载体等。特别优选，使用逆转录病毒载体、腺病毒载体或慢病毒载体。在复制能力上有缺陷从而不能在感染细胞中自我复制的病毒载体是适当的。此外，提高基因导入效率的物质例如RetroNectin(注册商标，由TAKARA BIO制造的)可用于基因导入。

作为不使用病毒载体的基因导入方法，可使用例如使用载体例如脂质体或配体-多聚赖氨酸的方法、磷酸钙法、电穿孔法、基因枪法等，虽然本发明不受限于其。在该情况下，导入整合入质粒DNA的外原基因、线性DNA(straight DNA)或RNA。

逆转录病毒载体和慢病毒载体可将插入载体中的外源基因稳定地整合入将向其中导入载体的细胞的染色体DNA，和用于基因治疗等目的。

可使用编码外源多肽的基因，其中将基因插入载体或质粒以使基因在适当的启动子控制之下表达。备选地，为了获得基因的高效率转录，与启动子或转录起始位点合作的另一种调控序列例如增强子或终止子序列可存在于载体中。备选地，为了通过同源重组插入将向其中导入基因的T细胞的染色体，例如，可将基因置于侧翼序列之间，所述侧翼序列由各自具有与染色体中基因的期望靶插入位点的两侧上的核苷酸序列的同源性的核苷酸序列组成。

可将用于“抑制多肽的表达”的方法中的核酸，例如从其转录siRNA或包含siRNA的RNA的核酸构建体和编码外源多肽的基因分别地导入细胞，或可用单个载体将其导入细胞。

(2)用于产生本发明的细胞的方法，和形成本发明的非天然寡聚蛋白的方法

用于产生本发明的细胞的方法和用于抑制本发明的内源和外源多肽组成的寡聚体形成的方法，包括下列步骤：

(a)将编码相应于至少一种组成寡聚蛋白的内源多肽的外源多肽的基因导入表达所述寡聚蛋白的细胞的步骤；和

(b)抑制所述内源多肽的表达的步骤。

用于产生本发明的细胞的方法是用于产生(1)中描述的本发明的细胞的方法。因为通过该方法获得的细胞减少了内源多肽对含有外源多肽的非天然寡聚蛋白的形成的干扰，所以与在其中只是将外源多肽在细胞中表达的情况相比较，具有期望的功能的非天然寡聚蛋白得到高效率地形成。

步骤(a)和步骤(b)的顺序不受特别限定，其中的任一步骤都可以为第一步骤。备选地，可同时进行这些步骤。可通过向在本发明的方法中进行的步骤加入分选或分离其中所述内源多肽的表达被抑制的细胞的步骤来诱导、培养或分离含有所述细胞的细胞群体，此外，产生含有此类细胞的细胞群体的方法也包括在本发明的方法内。可进行该分选或分离步骤，使用组成适当的非天然寡聚蛋白的外源多肽的表达作为指标。

此外，可向本发明的方法的步骤加入已知的蛋白质或化学组分，例如，在T细胞的情况下，可加入细胞因子、趋化因子和其他组分。在本文中，细胞因子不受特别限制，只要其可作用于并且活化T细胞，其实例包括IL-2、IFN-γ、TGF-β、IL-15、IL-7、IFN-α、IL-12、CD40L、IL-27等，从细胞免疫的增强的角度来看，特别优选实例包括IL-2、IFN-γ和IL-12。此外，趋化因子不受特别限制，只要其作用于T细胞并且展示迁移活性，其实例包括RANTES、CCL21、MIP1α、MIP1β、CCL19、CXCL12、IP-10或MIG。

实施例

下列实施例进一步更具体地举例说明本发明，但本发明不限定于下列实施例。

此外，根据由T.Maniatis，等人编著，由Cold Spring HarborLaboratory于2001出版的Molecular Cloning：A Laboratory Manual第3版的描述进行本文所描述的操作的基本操作。

实施例1野生型和密码子修饰人T细胞受体的α和β基因的制备

通过改变野生型基因的一部分来制备密码子修饰人抗-MAGE-A4TCRα基因。将含有该基因的核酸片段克隆入pPCR-Script(Stratagene)的KpnI-XhoI位点。含有密码子修饰人抗-MAGE-A4TCRα基因的核酸片段的序列在序列表中表示为SEQ ID No.：1。

通过改变野生型基因的一部分来制备密码子修饰人抗-MAGE-4TCRβ基因。将含有该基因的核酸片段克隆入pPCR-Script的KpnI-XhoI位点。含有密码修饰人抗-MAGE-A4TCRβ基因的核酸片段的序列在序列表中表示为SEQ ID No.：2。

实施例2人外周血单核细胞中siRNA的基因沉默效应的确认

将通过退火SEQ ID Nos.：3和4而制备的针对野生型TCRα的双链siRNA(siTCR-A，50pmol)和通过退火SEQ ID Nos.：5和6而制备的针对野生型TCRβ的双链siRNA(siTCR-B，50pmol)混合，然后按照产品手册中的步骤使用人T细胞Nucleofector试剂盒(Amaxa)将其导入从人外周血分离的外周血单核细胞(PBMC)。作为阴性对照，导入100pmol的通过退火SEQ ID Nos.：7和8而制备的siRNA(siNC)。在导入后2天，回收细胞，使用QIAGEN RNeasy Micro试剂盒(由Qiagen生产的)进行总RNA的提取和DNA酶I处理。通过使用随机引物(6聚体)，利用M-MLV-RT酶使提取的总RNA经历逆转录反应，然后使用SYBR PremixEx Taq以及SEQ ID Nos.：9和10的用于扩增野生型TCRα的引物和SEQID Nos.：13和14的用于扩增野生型TCRβ的引物进行实时PCR，计算野生型TCRα和野生型TCRβ基因的表达水平的相对值。使用SEQ IDNos.：17和18的用于扩增β-肌动蛋白基因的引物进行总RNA量的标准化。

通过计算各实验组中表达相对值相对于对照实验组中野生型TCRα和野生型TCRβ基因的表达相对值的比率，可评估基因沉默效应。结果示于图1。在附图中，纵轴显示在假定阴性对照的值为100的情况下以相对值表示的野生型TCRα和野生型TCRβ基因的表达水平。横轴显示导入的siRNA。如图1中所示，通过将双链siRNA导入野生型TCRα和β，获得对野生型TCRα和β基因的表达的沉默效应。

实施例3人外周血单核细胞的蛋白质表达抑制效应的确认

在导入双链siRNA后3天，用PE-抗人TCR抗体(由BD Pharmingen生产的)对在实施例2中其中已导入了双链siRNA的人外周血单核细胞进行染色，通过流式细胞仪测量TCR阳性细胞的比率和TCR阳性细胞中的荧光强度。图2显示TCR阳性细胞的比率，图3显示TCR阳性细胞中PE的荧光强度。横轴显示导入的siRNA。纵轴在图2中显示TCR阳性细胞的比率，在图3中显示TCR阳性细胞中PE的荧光强度。如图2和3中所示，通过导入针对野生型TCRα和β的双链siRNA，观察到人外周血单核细胞的内源野生型TCRα/β复合蛋白的表达比率和表达水平的减少。

实施例4密码子修饰TCR表达逆转录病毒载体的制备

首先，使用如SEQ ID No.：25所示的pPGK5引物和如SEQ ID No.：26所示的pPGK3引物，利用小鼠基因组作为模板进行PCR，获得含有PGK启动子的DNA片段。将该片段TA克隆入pT7Blue载体(由MERCK生产的)。

然后，用NotI和BamHI从该质粒切出PGK启动子，将其克隆入pBlueScript-SK+载体(由Stratagene生产的)的NotI和BamHI位点来制备pBS-PPGK。

使用pMSCVneo(由Clontech生产的)作为模板用如SEQ ID No.：27所示的3MSCV5引物和如SEQ ID No.：28的3MSCV3引物进行PCR来扩增CMV3’LTR位点，用XhoI和EcoRI切割所得的片段，然后克隆入pMT载体[Gene Therapy，第7卷，pp.797-804(2000)中描述的pM载体]的Xho-EcoRI位点来制备pMSMC。

用PstI从其中已克隆了实施例1中的密码子修饰TCRβ基因的质粒切取密码子修饰TCRβ基因，然后将其克隆入pBS-PPGK的PstI位点来制备pBS-Pb2。

然后，用SacII和XhoI从pBS-Pb2切出PGK启动子+修饰TCRβ基因，然后将其克隆入pMSMC的SacII-XhoI位点来制备pMS-Pb2。

从其中已克隆了实施例1的密码子修饰TCRα基因的质粒切出密码子修饰TCRα基因，然后将其克隆入pMSMC的NotI位点来制备pMS-Ma2.

然后，用NotI从pMS-Ma2切出密码子修饰TCRα基因，将其克隆入pMS-Pb2的NotI位点，从而获得pMS-aPb1。

用质粒载体pMS-aPb1转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109，然后使用QIAGEN Plasmid Midi试剂盒(由Qiagen生产的)纯化质粒DNA，将其用作用于转染的DNA。

按照产品方案使用Retrovirus Packaging试剂盒Eco(由TAKARABIO生产的)将制备的pMS-aPb1载体导入293T细胞，获得不同的双嗜性病毒(amphotropic virus)上清液，用0.45μm的过滤器(Milex HV，由Millipore生产的)过滤，然后利用使用凝聚胺(Polybrene)的方法感染PG13细胞(ATCC CRL-10686)，通过极限稀释法克隆细胞。回收所得的克隆细胞的培养上清液，用0.45μm过滤器过滤，其用作MS-aPb1密码子修饰TCR表达逆转染病毒溶液。

实施例5使用密码子修饰TCR表达逆转录病毒进行的人外周血单核细胞的感染和siRNA的导入。

按照标准方法，使用RetroNectin将实施例4中制备的密码子修饰TCR表达逆转录病毒感染入从人外周血分离的外周血单核细胞(PBMC)2次来制备导入改变的TCR表达的外周血单核细胞。在感染后3天，将50pmol siTCR-A(针对野生型TCRα)和50pmol siTCR-B(针对野生型TCRβ)混合，所述siTCR-A和siTCR-B的基因沉默效应已在实施例2和3中得到确认，按照产品手册中的方案导入混合物。作为阴性对照，导入100pmol的siNC。各进行2个实验组。在导入siRNA 2天后，回收细胞，使用QIAGEN RNeasy Micro试剂盒(由Qiagen生产的)进行总RNA的提取和DNA酶I处理。使用随机引物(6聚体)利用M-MLV-RT酶(由TAKARA BIO生产的)将提取的总RNA经历逆转录反应，使用SYBR Premix Ex Taq(由TAKARA BIO生产的)以及SEQ IDNos.：9和10的用于扩增野生型TCRα的引物、SEQ ID Nos.：11和12的用于扩增密码子修饰TCRα的引物、SEQ ID Nos.：13和14的用于扩增野生型TCRβ的引物或SEQ ID Nos.：15和16的用于扩增密码子修饰TCRβ的引物进行实时PCR。计算野生型TCRα、修饰TCRα、野生型TCRβ和修饰TCRβ基因的表达水平的相对值。使用SEQ ID Nos.：17和18的用于扩增β-肌动蛋白的引物进行总RNA量的标准化。

通过计算各实验组中表达相对值相对于对照实验组中野生型TCRα、修饰TCRα、野生型TCRβ和修饰TCRβ基因的表达相对值的比率来评估基因沉默效应。TCRα的结果示于图4，TCRβ的结果示于图5。在附图中，纵轴显示在假定阴性对照的值为100的情况下以相对值表示的野生型TCRα、修饰TCRα、野生型TCRβ和修饰TCRβ基因的表达水平。横轴显示导入的siRNA。如图4和5中所示，通过导入针对野生型TCRα和β的双链siRNA，野生型TCRα和β基因的表达在PBMC中被抑制，但不发生修饰TCRα和β基因的表达的抑制。

实施例6siRNA至已导入密码子修饰TCR的人外周血单核细胞的导入对密码子修饰TCR蛋白的表达的作用

在将siRNA导入其中已在实施例5中导入了密码子修饰TCR的人外周血单核细胞后3天，用HLA-A2402MAGE-A4四聚体-PE(由MBL生产的)和人CD8TRI-COLOR CONJUGATE(CALTAG Laboratories)对细胞进行染色，通过流式细胞仪测量CD8-阳性和四聚体阳性细胞的比率。各进行2个实验组。图6显示MAGE-A4四聚体阳性细胞的比率。横轴显示导入的siRNA，纵轴显示MAGE-A4四聚体阳性细胞的比率。如图6所示，通过导入针对野生型TCRα和β的双链siRNA，观察到其基因已被导入人外周血单核细胞的修饰抗-MAGE-A4TCRα/β复合蛋白的表达比率增加。

实施例7密码子修饰TCR和siRNA的共表达逆转录病毒载体的制备

将通过退火SEQ ID Nos.：29和30而制备的双链DNA克隆入pSINsi-hU6载体(由TAKARA BIO生产的)的BamHI-ClaI位点来制备pSINsi-hU6-TCRA。分开地，将通过退火SEQ ID Nos.：31和32而制备的双链DNA克隆pBAsi-mU6载体(由TAKARA BIO生产的)的BamHI-HindIII位点来制备pBAsi-mU6-TCRB。

如图7中所示，用EcoRV切取制备的pBAsi-mU6-TCRB以获得mU6-TCRB插入物，将该插入物克隆入pSINsi-hU6-TCRA的PmeI位点以获得pSINsi-Rm/Fh。用NheI和ClaI消化制备的pSINsi-Rm/Fh，并且使两个末端成平端以获得Rm/Fh插入物。

如图8中所示，用MluI消化实施例4中制备的pMS-aPb1载体，使两个末端成平端，然后将Rm/Fh插入物克隆入其中来制备T3载体。

此外，如图9中所示，用ClaI消化实施例4中制备的pMS-aPb1载体，使两个末端成平端，将Rm/Fh插入物克隆入其中来制备T7载体。

然后，如图10中所示，用MluI和SacII消化如SEQ ID No.：33所示的人工合成的基因以获得TCR-环-MluI/SacII，将其克隆入实施例4中制备的pMS-aPb1的MluI-SacII位点来获得T15载体。

此外，如图11中所示，用ClaI消化pSINsi-hH1载体(由TAKARA BIO生产的)，使之经历末端平端化，然后用NotI消化来获得片段，将所述片段克隆入pSINsi-hU6(由TAKARA BIO生产的)的PmeI-NotI位点来制备pSINsi-hH/hU。

如图12中所示，用BamHI消化pSINsi-hH/hU以获得片段，将所述片段克隆入通过用BamHI消化pSINsi-Rm/Fh而获得的位点，从而制备pSINsi-RHB/FUA，用NheI和ClaI消化该pSINsi-RHB/FUA，将其经历末端平端化以获得HB/UA插入物。

如图13中所示，用MluI消化实施例4中制备的pMS-aPb1载体，将其经历末端平端化，然后将HB/UA插入物克隆入其中来制备TN1载体。

如图14中所示，用NotI消化T15载体，将其经历末端平端化来制备α1-平端插入物。分开地，用NotI消化T15载体，用MluI消化通过载体的自身连接获得的pMS-环-Pb1载体，然后将α1-平端插入物克隆入末端平端化的位点，从而制备TN5载体。

如图15中所示，用NotI消化实施例4中制备的pMS-aPb1载体，以产生α1Not插入物。分开地，用NotI消化pMS-aPb1载体，使之经历末端平端化，然后用ClaI消化来制备PGK+β1插入物。此外，用ClaI消化pSINsi-hU6-TCRA载体，使之经历末端平端化，然后用NotI消化来产生hU6-TCRA插入物。将PGK+β1插入物和hU6-TCRA插入物克隆入pMS-aPb1的NotI-ClaI位点来制备pMS-hURA-Pb1，用NotI消化该pMS-hURA-Pb1，然后将α1Not插入物克隆入其中来制备pMS-a-hUTCRA-Pb1。

如图16中所示，用EcoRI和HindIII消化pSINsi-RHB/FUA，使之经历末端平端化以获得hH1-TCRB-平端插入物。用ClaI消化pMS-a-hUTCRA-Pb1，使之经历末端平端化，然后将hH1-TCRB-平端插入物克隆入其中以制备TN9载体和TN11载体。

用质粒载体pMS-aPb1、T3、T7、T15、TN1、TN5或TN9载体转化大肠杆菌JM109，然后使用QIAGEN Plasmid Midi试剂盒(由Qiagen生产的)纯化质粒DNA以提供用于转染的DNA。

按照产品方案使用Retrovirus Packaging试剂盒Eco(由TAKARABIO生产的)，利用制备的pMS-aPb1、T3、T7、T15、TN1、TN5或TN9转染293T细胞，获得不同双嗜性病毒上清液，用0.45μm的过滤器(MilexHV，由Millipore生产的)过滤，利用使用的凝聚胺的方法感染PG13细胞(ATCC CRL-10686)，然后回收培养上清液，用0.45μm的过滤器进行过滤来获得MS-aPb1，T3，T7，T15，TN1，TN5或TN9逆转录病毒溶液。

实施例8使用密码子修饰TCR和siRNA的共表达逆转录病毒载体1进行的人外周血单核细胞的感染

按照标准方法，使用RetroNectin，用实施例7中制备的T3、T7或T15密码子修饰TCR和siRNA的共表达逆转录病毒以及作为对照的密码修饰TCR表达pMS-aPb1载体感染从人外周血分离的外周血单核细胞(PBMC)2次来制备已导入密码子修饰TCR和siRNA的共表达的外周血单核细胞。在第2次病毒感染后3天，收获细胞，用QIAGEN RNeasyMini试剂盒(由Qiagen生产的)进行总RNA的提取和DNA酶I处理。使用PrimeScript RT试剂试剂盒(Perfect Real Time)(由TAKARA BIO生产的)使提取的总RNA经历逆转录反应，使用SYBR Premix Ex TaqII(由TAKARA BIO生产的)、SEQ ID Nos.：9和10的用于扩增野生型TCRα的引物、SEQ ID Nos.：11和12的用于扩增密码子修饰TCRα的引物、SEQ ID Nos.：13和14的用于扩增野生型TCRβ的引物和SEQ ID Nos.：15和16的用于扩增密码子修饰TCRβ的引物进行实时PCR，计算野生型TCRα、修饰TCRα、野生型TCRβ和修饰TCRβ基因的表达水平的相对值。使用SEQ ID Nos.：34和35的用于扩增GAPDH基因的引物进行总RNA量的标准化。

通过计算各实验组中表达相对值相对于对照实验组中野生型TCRα、修饰TCRα、野生型TCRβ和修饰TCRβ基因的表达相对值的比率，可评估野生型TCR基因抑制效应和修饰TCR基因的表达水平。结果示于图17中。在图中，纵轴显示在假定无基因导入的阴性对照的值为100的情况下以相对值表示的野生型TCRα、修饰TCRα、野生型TCRβ和修饰TCRβ基因的表达水平。横轴显示导入的逆转录病毒。如图17中所示，通过导入针对野生型TCRα和β的siRNA，野生型TCRα和β基因的表达在PBMC中被抑制。与pMS-aPb1相比较，修饰TCRα和β基因的表达在T3、T7和T15中较低。

实施例9密码子修饰TCR和siRNA的共表达逆转录病毒载体的导入对密码子修饰TCR蛋白1的表达的作用

在实施例8中，在用T3、T7或T15密码子修饰TCR和siRNA的共表达逆转录病毒进行第2次感染后3天，回收细胞，按照与实施例6的方法相同的方法测量CD8-阳性和四聚体阳性细胞的比率。图18显示MAGE-A4四聚体阳性细胞的比率。横轴显示导入的逆转录病毒，纵轴显示MAGE-A4四聚体阳性细胞的比率。如图18中所示，通过导入T15密码子修饰TCR和siRNA的共表达逆转录病毒载体，其基因已被导入人外周血单核细胞的修饰抗-MAGE-A4TCRα/β复合蛋白的表达比率与作为对照的密码子修饰TCR表达pMS-aPb1相比得到提高。如实施例8中所示，通过插入siRNA表达单位，虽然与pMS-aPb1相比较密码子修饰TCR基因的表达水平更低，但观察到由于siRNA在抑制野生型TCR基因的表达上的作用而导致的密码子修饰抗-MAGE-A4TCRα/β复合蛋白的表达比率的增加。

实施例10密码子修饰TCR和siRNA的共表达逆转录病毒载体对人外周血单核细胞2的感染

通过使用从人外周血分离的外周血单核细胞(PBMC)，如实施例8中一样制备已导入密码子修饰TCR和siRNA的共表达的外周血单核细胞。在病毒感染7天后，进行总RNA的提取和DNA酶I处理。按照与实施例8的方法相同的方法进行实时PCR，计算野生型TCRα、修饰TCRα、野生型TCRβ和修饰TCRβ基因的表达水平的相对值。

通过计算各实验组中表达相对值相对于对照实验组中野生型TCRα、修饰TCRα、野生型TCRβ和修饰TCRβ基因的表达相对值的比率，评估野生型TCR基因沉默效应和修饰TCR基因的表达水平。结果示于图19中。在图中，纵轴显示在假定无基因导入的阴性对照的值为100的情况下以相对值表示的野生型TCRα、修饰TCRα、野生型TCRβ和修饰TCRβ基因的表达量。横轴显示导入的逆转录病毒。如图19中所示，通过表达针对野生型TCRα和β的siRNA，野生型TCRα和β基因的表达在PBMC中被抑制。此外，对抑制野生型TCR基因的表达的作用在病毒感染后第7天比在病毒感染后第3天实施例8的结果更高。然而，通过插入针对野生型的siRNA表达单位，与pMS-aPb1相比较，修饰TCRα和β基因的表达更低。

实施例11密码子修饰TCR和siRNA的共表达逆转录病毒载体的导入对密码子修饰TCR蛋白2的表达的作用

在实施例10中，在用T3、T7或T15密码子修饰TCR和siRNA的共表达逆转录病毒进行第2次感染后7天，回收细胞，按照与实施例6的方法相同的方法测量CD8-阳性和四聚体阳性细胞的比率。图20显示MAGE-A4四聚体阳性细胞的比率。横轴显示导入的逆转录病毒，纵轴显示MAGE-A4四聚体阳性细胞的比率。如图20中所示，通过导入T3或T7密码子修饰TCR和siRNA的共表达逆转录病毒载体，其基因已被导入人外周血单核细胞的修饰抗-MAGE-A4TCRα/β复合蛋白的表达比率与作为对照的密码子修饰TCR表达pMS-aPb1相比得到了提高。如实施例10中所示，通过插入siRNA表达单位，虽然密码子修饰TCR基因的表达水平降低，但观察到由于siRNA抑制野生型TCR基因的表达的作用而导致的密码子修饰抗-MAGE-A4TCRα/β复合蛋白的表达比率的增加。

实施例12由于密码子修饰TCR和siRNA的共表达逆转录病毒载体1的导入而导致的密码子修饰TCR复合物的产生抗原特异性细胞因子的能力

在向用PMA和伊屋诺霉素抗原非特异性刺激的通过用MAGE-A4_143-151肽脉冲T2A24细胞(所述T2A24细胞是通过将HLA-A2402cDNA基因导入T2细胞株(ATCC CRL-1992)制备的)获得的T2A24(+)或T2A24(-)细胞(未用所述肽脉冲T2A24细胞)和实施例10中T3、T7、T15或MS-aPb 1导入后3天的细胞以及实施例10中T3、T7、T 15或MS-aPb1导入后3天的细胞的混合物中加入Breferdin A后，将所得的细胞在37℃下温育过夜，通过使用IntraPrep(BeckmanCoulter)，用CD8-FITC抗体(BD Biosciences)和IO Test IFN γ-PE(BeckmanCoulter)进行CD8染色和细胞内IFN γ染色，利用流式细胞仪测量为CD8阳性和IFN γ阳性的细胞的比率。图21显示细胞内IFN γ阳性细胞的比率。横轴显示导入的逆转录病毒，纵轴显示IFN γ阳性细胞的比率。如图21中所示，确认了通过导入T3、T7或T15密码子修饰TCR和siRNA的共表达逆转录病毒载体，产生MAGE-A4抗原特异性IFN γ的能力与作为对照的已导入MS-aPb1的细胞的所述能力大致相同。

实施例13使用密码子修饰TCR和siRNA的共表达逆转录病毒载体3进行的人外周血单核细胞的感染

按照标准方法，使用RetroNectin，用实施例7中制备的TN1、TN5或TN9密码子修饰TCR和siRNA的共表达逆转录病毒载体感染从人外周血分离的外周血单核细胞(PBMC)2次，作为对照，用密码子修饰TCR表达pMS-aPb1载体进行所述感染，从而制备已导入密码子修饰TCR和siRNA的共表达的人外周血单核细胞。在第2次病毒感染后5天和11天，回收细胞，按照与实施例8的方法相同的方法进行实时PCR，并且计算野生型TCRα、修饰TCRα、野生型TCRβ和修饰TCRβ基因的表达水平的相对值。

通过计算各实验组中表达相对值相对于对照实验组中野生型TCRα、修饰TCRα、野生型TCRβ和修饰TCRβ基因的表达相对值的比率，评估野生型TCR基因沉默效应和修饰TCR基因的表达水平。图22显示了感染后5天的结果，图23显示了感染后11天的结果。在图中，纵轴显示在假定导入了MS-aPb1的细胞的值为100的情况下以相对值表示的野生型TCRα、修饰TCRα、野生型TCRβ和修饰TCRβ基因的表达量。横轴显示导入的逆转录病毒。如图22和图23中所示，通过表达针对野生型TCRα和β的siRNA，野生型TCRα和β基因的表达在PBMC中被抑制。

实施例14密码子修饰TCR和siRNA的共表达逆转录病毒载体的导入对密码子修饰TCR蛋白3的表达的作用

在实施例13中，在用TN1、TN5或TN9密码子修饰TCR和siRNA的共表达逆转录病毒进行第2次感染后4天，回收细胞，按照与实施例6的方法相同的方法测量为CD8-阳性和四聚体阳性的细胞的比率。图24显示病毒感染后4天MAGE-A4四聚体阳性细胞的比率。横轴显示导入的逆转录病毒，纵轴显示MAGE-A4四聚体阳性细胞的比率。如图24中所示，通过导入TN5或TN9密码子修饰TCR和siRNA的共表达逆转录病毒载体，其基因已被导入人外周血单核细胞的修饰抗-MAGE-A4TCRα/β复合蛋白的表达比率与作为对照的密码子修饰TCR表达pMS-aPb1相比得到提高。如实施例13中所示，通过插入siRNA表达单位，虽然与作为对照的已导入MS-aPb1的细胞相比较，密码子修饰TCR基因的表达更低，但观察到由于siRNA抑制野生型TCR基因的表达的作用而导致的密码子修饰抗-MAGE-A4TCRα/β复合蛋白的表达比率的增加。

实施例15由于密码子修饰TCR和siRNA的共表达逆转录病毒载体2的导入而导致的密码子修饰TCR复合物的产生抗原特异性细胞因子的能力

按照与实施例12的方法相同的方法使用实施例13中TN5、TN9或MS-aPb1导入后4天的细胞测量为CD8-阳性和IFNγ阳性的细胞的比率。图25显示IFNγ阳性细胞的比率。横轴显示导入的逆转录病毒，纵轴显示IFNγ阳性细胞的比率。如图25中所示，确认了通过导入TN5或TN9密码子修饰TCR和siRNA的共表达逆转录病毒载体，产生MAGE-A4抗原特异性IFNγ的能力与已导入MS-aPb1的细胞相比大致相同。

实施例16使用密码子修饰TCR和siRNA的共表达逆转录病毒载体4进行的人外周血单核细胞的感染

按照标准方法，使用RetroNectin，用实施例7中制备的TN5、TN9密码子修饰TCR和siRNA的共表达逆转录病毒以及作为对照的密码修饰TCR表达pMS-aPb1载体感染从人外周血分离的外周血单核细胞(PBMC)2次来制备已导入密码子修饰TCR和siRNA的共表达的外周血单核细胞。

在第2次感染后4天，回收细胞，已导入TN5、TN9和MS-aPb1的细胞的每细胞载体的平均拷贝数分别为3.64、2.21和9.15个拷贝/细胞。此外，按照与实施例6的方法相同的方法测量为CD8阳性和四聚体阳性的细胞的比率。图26显示病毒感染后4天MAGE-A4四聚体阳性细胞的比率。横轴显示导入的逆转录病毒，纵轴显示MAGE-A4四聚体阳性细胞的比率。如图26中所示，通过导入TN5或TN9密码子修饰TCR和siRNA的共表达逆转录病毒载体，虽然每细胞载体的拷贝数比MS-aPb的更少，但其基因已被导入人外周血单核细胞的修饰抗-MAGE-A4TCRα/β复合蛋白的表达比率与作为对照的密码子修饰TCR表达pMS-aPb1的相等。

实施例17使用密码子修饰TCR和siRNA的共表达逆转录病毒载体4进行的人外周血单核细胞的感染

在实施例16中，通过使用从人外周血分离的外周血单核细胞(PBMC)，制备了已导入密码子修饰TCR和siRNA的共表达的外周血单核细胞。在病毒感染后5天，用MAGE-A4四聚体进行染色，并且只有MAGE-A4四聚体阳性细胞被抗-PE微珠(Miltenyi Biotec)收集。从收集的细胞提取总RNA并且进行DNA酶I处理。按照与实施例8的方法相同的方法进行实时PCR，计算野生型TCRα、修饰TCRα、野生型TCRβ和修饰TCRβ基因的表达水平的相对值。

通过计算各实验组中表达相对值相对于对照实验组中野生型TCRα、修饰TCRα、野生型TCRβ和修饰TCRβ基因的表达相对值的比率，评估野生型TCR基因抑制效应和修饰TCR基因的表达水平。结果示于图27中。在图中，纵轴显示在假定导入了MS-aPb1的细胞的值为100的情况下以相对值表示的野生型TCRα、修饰TCRα、野生型TCRβ和修饰TCRβ基因的表达量。横轴显示导入的逆转录病毒。如图27中所示，通过表达针对野生型TCRα和β的siRNA，野生型TCRα和β基因的表达在PBMC中被抑制。此外，与pMS-aPb1相比较在TN5和TN9中，虽然修饰TCRα和β基因的表达低(由于针对野生型TCRα和β的siRNA的表达对内源TCR基因的抑制而导致的)，如图26中所示，但通过导入TN5或TN9密码子修饰TCR和siRNA的共表达逆转录病毒载体，其基因已被导入人外周血单核细胞的修饰抗-MAGE-A4TCRα/β复合蛋白的表达比率与作为对照的密码子修饰TCR表达pMS-aPb1的相等。

工业实用性

根据本发明，提供了表达用于医疗领域的寡聚蛋白的细胞，特别地T细胞以及产生所述T细胞的方法。

序列表自定义文本

SEQ ID NO：1：密码子修饰抗-MAGE A4TCR α链。

SEQ ID NO：2：密码子修饰抗-MAGE A4TCR β链。

SEQ ID NO：3：用于siRNA-A的合成的嵌合体寡核苷酸。核苷酸1至19是核糖核苷酸-其他核苷酸是脱氧核糖核苷酸。

SEQ ID NO：4：用于siRNA-A的合成的嵌合体寡核苷酸。核苷酸1至19是核糖核苷酸-其他核苷酸是脱氧核糖核苷酸。

SEQ ID NO：5：用于siRNA-B的合成的嵌合体寡核苷酸。核苷酸1至19是核糖核苷酸-其他核苷酸是脱氧核糖核苷酸。

SEQ ID NO：6：用于siRNA-B的合成的嵌合体寡核苷酸。核苷酸1至19是核糖核苷酸-其他核苷酸是脱氧核糖核苷酸。

SEQ ID NO：7：用于siRNA-C的合成的嵌合体寡核苷酸。核苷酸1至19是核糖核苷酸-其他核苷酸是脱氧核糖核苷酸。

SEQ ID NO：8：用于siRNA-C的合成的嵌合体寡核苷酸。核苷酸1至19是核糖核苷酸-其他核苷酸是脱氧核糖核苷酸。

SEQ ID NO：9：用于野生型TCRα链的合成的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：10：用于野生型TCRα链的合成的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：11：用于密码子修饰TCRα链的合成的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：12：用于密码子修饰TCRα链的合成的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：13：用于野生型TCRβ链的合成的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：14：用于野生型TCRβ链的合成的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：15：用于密码子修饰TCRβ链的合成的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：16：用于密码子修饰TCRβ链的合成的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：17：用于β-肌动蛋白的合成的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：18：用于β-肌动蛋白的合成的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：19：TCRα链的一部分。

SEQ ID NO：20：密码子修饰TCRα链的一部分。

SEQ ID NO：21：TCRα链的一部分。

SEQ ID NO：22：TCRβ链的一部分。

SEQ ID NO：23：密码子修饰TCRβ链的一部分。

SEQ ID NO：24：TCRβ链的一部分。

SEQ ID NO：25：合成的寡核苷酸引物pPGK5。

SEQ ID NO：26：合成的寡核苷酸引物pPGK3。

SEQ ID NO：27：合成的寡核苷酸引物3MSCV5。

SEQ ID NO：28：合成的寡核苷酸引物3MSCV3。

SEQ ID NO：29：用于pSINsi-hU6-TCRA的合成的寡核苷酸。

SEQ ID NO：30：用于pSINsi-hU6-TCRA的合成的寡核苷酸。

SEQ ID NO：31：用于pBAsi-mU6-TCRB的合成的寡核苷酸。

SEQ ID NO：32：用于pBAsi-mU6-TCRB的合成的寡核苷酸。

SEQ ID NO：33：用于TCR-环-MluI/SacII的合成的寡核苷酸。

SEQ ID NO：34：用于GAPDH基因的扩增的寡核苷酸引物。

SEQ ID NO：35：用于GAPDH基因的扩增的寡核苷酸引物。

序列表

<110>TAKARA BIO INC.

MIE UNIVERSITY

<120>特异性基因的表达的方法

<130>668358

<150>JP 2007-154351

<151>2007-06-11

<160>35

<210>1

<211>918

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>密码子修饰抗-MAGE A4TCRα链

<400>1

ggtaccgaat tcaaggaaaa aagcggccgc taatacgact cactataggg cctgcaggag 60

ctccgccatg ctgctgctgc tgatccccgt gctgggcatg atcttcgccc tgcgggacgc 120

cagagcccag agcgtgagcc agcacaacca ccacgtgatc ctgagcgagg ccgccagcct 180

ggaactgggc tgcaactaca gctacggcgg caccgtgaac ctgttttggt acgtgcagta 240

ccccggccag cacctgcagc tgctgctgaa gtactttagc ggcgaccccc tggtgaaggg 300

catcaagggc ttcgaggccg agttcatcaa gagcaagttc agcttcaacc tgcggaagcc 360

cagcgtgcag tggagcgaca ccgccgagta cttttgcgcc ggcagaggcg gcggaaacaa 420

gctgaccttc ggcaccggca cccagctgaa ggtggagctg aacatccaga accccgaccc 480

cgccgtgtac cagctgcggg acagcaagag cagcgacaag agcgtgtgcc tgttcaccga 540

cttcgacagc cagaccaacg tgagccagag caaggacagc gacgtgtaca tcaccgacaa 600

gaccgtgctg gacatgcgga gcatggactt caagagcaac agcgccgtgg cctggtccaa 660

caagagcgac ttcgcctgcg ccaacgcctt caacaacagc atcatccccg aggacacctt 720

tttccccagc cccgagagca gctgcgacgt gaaactggtg gagaagagct tcgagaccga 780

caccaacctg aacttccaga atctgagcgt gatcggcttc cggatcctgc tgctgaaagt 840

ggccggcttc aatctgctga tgaccctgcg gctgtggagc agctgacctg cagggcggcc 900

gcaaaaggaa aactcgag 918

<210>2

<211>1041

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>密码子修饰抗-MAGE A4 TCRβ链

<400>2

ggtaccgaat tcaaggaaaa aagcggccgc taatacgact cactataggg cctgcaggga 60

ccccgccatg ggcaccagcc tgctgtgctg gatggccctg tgcctgctgg gcgccgacca 120

cgccgatacc ggcgtgagcc agaacccccg gcacaagatc accaagcggg gccagaacgt 180

gaccttcaga tgcgacccca tcagcgagca caaccggctg tactggtaca ggcagacact 240

gggccagggc cccgagttcc tgacctactt ccagaacgag gcccagctgg aaaagagccg 300

gctgctgtcc gaccggttca gcgccgagcg gcccaagggc agcttcagca ccctggaaat 360

ccagcggacc gagcagggcg acagcgccat gtacctgtgc gccagcagcc tggctcaggg 420

agccggcgag acccagtact tcggccctgg cacccggctg ctggtgctgg aagatctgaa 480

gaacgtgttc ccccccgagg tggccgtgtt cgagcccagc gaggccgaga tcagccacac 540

ccagaaagcc accctggtgt gcctggccac cggcttctac cccgaccacg tggagctgtc 600

ttggtgggtg aacggcaaag aggtgcacag cggcgtcagc accgaccccc agcccctgaa 660

agagcagccc gccctgaacg acagccggta ctgcctgagc agccggctga gagtgagcgc 720

caccttctgg cagaacccca ggaaccactt ccgctgtcag gtgcagttct acggcctgag 780

cgagaacgac gagtggaccc aggacagagc caagcccgtg acccagatcg tgagcgccga 840

ggcctggggc agagccgact gcggcttcac cagcgagagc taccagcagg gcgtgctgtc 900

cgccaccatc ctgtacgaga tcctgctggg caaggccacc ctgtacgccg tgctggtgtc 960

cgccctggtg ctgatggcca tggtgaagcg gaaggacagc cggggctgac ctgcagggcg 1020

gccgcaaaag gaaaactcga g 1041

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于siRNA-A的合成的嵌合体寡核苷酸。核苷酸1至19是核糖核苷酸-其他核苷酸是脱

氧核糖核苷酸

<400>3

guaaggauuc ugauguguat t 21

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

氧核糖核苷酸

<400>4

uacacaucag aauccuuact t 21

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于siRNA-B的合成的嵌合体寡核苷酸。核苷酸1至19是核糖核苷酸-其他核苷酸是脱

氧核糖核苷酸

<400>5

ccaccauccu cuaugagaut t 21

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

氧核糖核苷酸

<400>6

aucucauaga ggaugguggt t 21

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于siRNA-C的合成的嵌合体寡核苷酸。核苷酸1至19是核糖核苷酸-其他核苷酸是脱

氧核糖核苷酸

<400>7

ccaauuacgc guugguagct t 21

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

氧核糖核苷酸

<400>8

gcuaccaacg cguaauuggt t 21

<210>9

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于野生型TCRα链的合成的寡核苷酸引物

<400>9

gtgcaaacgc cttcaacaac a 21

<210>10

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于野生型TCRα链的合成的寡核苷酸引物

<400>10

gaccagcttg acatcacagg aac 23

<210>11

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于密码子修饰TCRα链的合成的寡核苷酸引物

<400>11

agagcttcga gaccgacacc a 21

<210>12

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于密码子修饰TCRα链的合成的寡核苷酸引物

<400>12

tgaagccggc cactttcag 19

<210>13

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于野生型TCRβ链的合成的寡核苷酸引物

<400>13

cgccctcaat gactccagat ac 22

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于野生型TCRβ链的合成的寡核苷酸引物

<400>14

cctgggtcca ctcgtcattc 20

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于密码子修饰TCRβ链的合成的寡核苷酸引物

<400>15

ggcttcacca gcgagagcta 20

<210>16

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于密码子修饰TCRβ链的合成的寡核苷酸引物

<400>16

tcaccatggc catcagca 18

<210>17

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于β-肌动蛋白的合成的寡核苷酸引物

<400>17

attgccgaca ggatgcaga 19

<210>18

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于β-肌动蛋白的合成的寡核苷酸引物

<400>18

gagtacttgc gctcaggagg a 21

<210>19

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>TCRα链的一部分

<400>19

agtaaggatt ctgatgtgta t 21

<210>20

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>密码子修饰TCRα链的一部分

<400>20

agcaaggaca gcgacgtgta c 21

<210>21

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>TCRα链的一部分

<400>21

Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr

1 5

<210>22

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>TCRβ链的一部分

<400>22

gccaccatcc tctatgagat c 21

<210>23

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>密码子修饰TCRβ链的一部分

<400>23

gccaccatcc tgtacgagat c 21

<210>24

<211>7

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>TCRβ链的一部分

<400>24

Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile

1 5

<210>25

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸引物pPGK5

<400>25

acgcgtgcgg ccgcagatct aattctaccg ggtagggga 39

<210>26

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸引物pPGK3

<400>26

ctcgaggcgg cgcggatccc tgcaggtcga aaggcccgg 39

<210>27

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸引物3MSCV5

<400>27

tacctcgagc gataaaataa aagattttat ttag 34

<210>28

<211>45

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸引物3MSCV3.

<400>28

tacgaattcg attgaatccg tcgactgaaa gacccccgct gacgg 45

<210>29

<211>69

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于pSINsi-hU6-TCRA的合成的寡核苷酸

<400>29

gatccgtaag gattctgatg tgtacacagg gaagcgagtc tgtacacatc agaatcctta 60

cttttttat 69

<210>30

<211>67

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于pSINsi-hU6-TCRA的合成的寡核苷酸

<400>30

cgataaaaaa gtaaggattc tgatgtgtac agactcgctt ccctgtgtac acatcagaat 60

ccttacg 67

<210>31

<211>67

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于pBAsi-mU6-TCRB的合成的寡核苷酸

<400>31

gatccgccac catcctctat gagattagtg ctcctggttg atctcataga ggatggtggc 60

tttttta 67

<210>32

<211>67

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于pBAsi-mU6-TCRB的合成的寡核苷酸

<400>32

agcttaaaaa agccaccatc ctctatgaga tcaaccagga gcactaatct catagaggat 60

ggtggcg 67

<210>33

<211>357

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于TCR-环-MluI/SacII的合成的寡核苷酸

<400>33

cccggatccg taagtacgcg ttatttcaaa tttagcagga aaaaagagaa catcaccttg 60

taaaactgaa gattgtgacc agtcagaata atgtgtaagg attctgatgt gtacacaggg 120

aagcgagtct gtacacatca gaatccttac agcattatgg tgacagctgc ctcgggaagc 180

caagttgggc tttaaagtgc agggcctgct gatgttgagt gctttttgtt cccaccatcc 240

tctatgagat tagtgctcct ggttgatctc atagaggatg gtggggcata agaagttatg 300

tattcatcca ataattcaag ccaagcaagt atataggtgt tttaatagcc gcggggg 357

<210>34

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于GAPDH基因的扩增的寡核苷酸引物

<400>34

atggtggtga agacgccagt 20

<210>35

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>用于GAPDH基因的扩增的寡核苷酸引物

<400>35

gcaccgtcaa ggctgagaac 20

Claims

1.表达非天然寡聚蛋白的细胞，其包含已导入的基因，所述基因编码相应于至少一种组成天然寡聚蛋白的内源多肽的组成非天然寡聚蛋白的外源多肽，其中所述内源多肽的表达被抑制。

2.权利要求1的细胞，其中所述寡聚蛋白由可变区和恒定区组成。

3.权利要求1的细胞，其中所述寡聚蛋白是抗原识别受体。

4.权利要求3的细胞，其中所述抗原识别受体是T细胞受体(TCR)。

5.权利要求1至4的任一项的细胞，其中所述内源多肽的表达被RNA干扰抑制。

6.权利要求5的细胞，其中所述寡聚蛋白由可变区和恒定区组成，并且组成所述寡聚蛋白的内源多肽的表达被靶向相应于所述多肽的恒定区的mRNA序列的RNA干扰抑制。

7.权利要求6的细胞，其中所述外源多肽具有与内源多肽的恒定区的氨基酸序列有相同的氨基酸序列的恒定区，并且所述内源多肽的表达通过产生与所述内源多肽的mRNA的核苷酸序列不同的外源多肽的mRNA的核苷酸序列来抑制。

8.用于产生表达非天然寡聚蛋白的细胞的方法，该方法包括进行下列步骤：

(a)将基因导入能够表达天然寡聚蛋白的细胞的步骤，所述基因编码相应于至少一种组成天然寡聚蛋白的内源多肽的组成非天然寡聚蛋白的外源多肽，和

(b)抑制所述内源多肽的表达的步骤。

9.权利要求8的方法，其中所述寡聚蛋白由可变区和恒定区组成。

10.权利要求8的方法，其中所述寡聚蛋白是抗原识别受体。

11.权利要求10的方法，其中所述抗原识别受体是TCR。

12.权利要求8至11的任一项的方法，其中所述内源多肽的表达被RNA干扰抑制。

13.权利要求12的方法，其中所述寡聚蛋白由可变区和恒定区组成，并且组成所述寡聚蛋白的内源多肽的表达被靶向相应于所述多肽的恒定区的mRNA序列的RNA干扰抑制。

14.权利要求12或13的方法，其中所述外源多肽具有与内源多肽的恒定区的氨基酸序列有相同的氨基酸序列的恒定区，并且所述内源多肽的表达通过产生与所述内源多肽的mRNA的核苷酸序列不同的外源多肽的mRNA的核苷酸序列来抑制。

15.用于形成非天然寡聚蛋白的方法，该方法包括进行下列步骤：

(a)将基因导入能够表达天然寡聚蛋白的细胞的步骤，其中所述基因编码相应于至少一种组成天然寡聚蛋白的内源多肽的组成非天然寡聚蛋白的外源多肽，和

(b)抑制所述内源多肽的表达的步骤。

16.权利要求15的方法，其中所述寡聚蛋白由可变区和恒定区组成。

17.权利要求15的方法，其中所述寡聚蛋白是抗原识别受体。

18.权利要求17的方法，其中所述抗原识别受体是TCR。

19.权利要求15至18的任一项的方法，其中所述内源多肽的表达被RNA干扰抑制。

20.权利要求19的方法，其中所述寡聚蛋白由可变区和恒定区组成，并且组成所述寡聚蛋白的内源多肽的表达被靶向相应于所述多肽的恒定区的mRNA序列的RNA干扰抑制。

21.权利要求19或20的方法，其中所述外源多肽具有与内源多肽的恒定区的氨基酸序列有相同的氨基酸序列的恒定区，并且所述内源多肽的表达通过产生与所述内源多肽的mRNA的核苷酸序列不同的外源多肽的mRNA的核苷酸序列来抑制。