CN101796070A

CN101796070A - p53肽疫苗

Info

Publication number: CN101796070A
Application number: CN200880101471A
Authority: CN
Inventors: 斯约尔格德·亨利库斯·万德伯格; 瑞恩克·奥弗凌阿; 柯内利斯·约翰尼斯·玛利亚·麦莱弗; 戈玛·G·肯特尔
Original assignee: OctoPlus Technologies BV
Current assignee: Leids Universitair Medisch Centrum LUMC; OctoPlus Technologies BV
Priority date: 2007-05-31
Filing date: 2008-05-27
Publication date: 2010-08-04
Also published as: ES2406077T3; US20150010586A1; EP2155780B1; US20100210529A1; WO2008147186A1; AU2008257791B2; US8663646B2; CA2689536A1; AU2008257791A1; EP2155780A1

Abstract

本发明涉及源于p53的可用作针对癌症的疫苗的肽。

Description

p53肽疫苗

发明领域

本发明涉及医学和免疫学领域，尤其是涉及改善的p53肽疫苗。

发明背景

在本申请中，将p53当作普遍表达的、已知与癌症相关的自体抗原的代表性实例。用于设计针对p53的疫苗的策略可用来设计针对任何其它普遍表达的、已知与癌症相关的自体抗原的疫苗。细胞核磷蛋白p53为肿瘤抑制蛋白，其在正常组织中以低水平普遍表达，所述组织包括胸腺、脾和淋巴造血细胞(Rogerl A et al，Milner J et al，Terada N et al)。野生型p53的正常半衰期小于30分钟。泛素化后，野生型(WT)p53被蛋白酶体快速降解(Honda R et al，Momand J et al，Shkedy D et al)。蛋白酶体介导的p53消化可以导致产生由I类MHC分子呈递的肽。对I类MHC肽复合物有高亲和力的未成熟胸腺T细胞对胸腺APC表面的这些I类MHC结合的野生型p53衍生肽的识别将产生负选择(Allen PM et al，Ashton-Rickardt PG et al，Kappler JW et al)。结果，外周T细胞储库(T-cell repertoire)将不含有功能的p53特异I类MHC限制性T细胞。Theobald等人巧妙地证实，特异于天然加工肽p53_187-197的CTL在WTp53小鼠中被从该储库删除，但在p53-/-小鼠中不被删除(Theobald Met al，1997)，说明对高亲和力p53特异CTL的负选择可发生在胸腺中。自相矛盾的是，能够在肿瘤细胞表面识别内源加工的WTp53的I类MHC限制性CTL在小鼠和人体内都被检测到(Theobald M et al 1997，Macagno A，et al，Mayordomo JI et al，Barfoed AM et al，Chikamatsu K et al，Eura M et al，Houbiers JG et al，Ropke M et al)，这提示有功能的p53特异I类MHC限制性CTL可逃脱耐受诱导。

已经开发了几种p53疫苗。例如，WO 00/75336公开了源于p53的多表位肽，其具有被蛋白酶体降解以及以高亲和力与I类MHC分子结合的能力。这些性能被认为是诱导针对p53的免疫反应所必要的。更可能地，对这种类型的肽有反应的T细胞或者在胸腺中被清除，在外周被耐受，或者对T细胞受体亲和力过低而不能介导有效的抗肿瘤反应(Theobald M&Offringa R.2003，and Morgan et al.)。因此，预期源于普遍表达的自体抗原如p53的这些肽将不能在体内触发强烈和有效的免疫反应。

因而，亟需新的和改善的p53疫苗，其不具有现有p53疫苗的所有缺点。

发明内容

本发明基于这样的出人意料的发现，即为了诱导有效的抗p53反应，源于p53的肽应该不被蛋白酶体有效加工和/或显示出低至中等的稳定地形成细胞表面I类MHC-肽复合物的能力和/或为显示低至中等MHC结合亲和力的肽。优选地，源于p53的肽应该不被蛋白酶体有效加工和/或显示出低至中等的稳定地形成细胞表面I类MHC-肽复合物的能力。

我们发现自身特异T细胞在胸腺中逃避负选择可以通过TCR和MHC之间的低亲和力相互作用而发生。实际上，识别它们的同源肽的WTp53特异CTL在WTp53小鼠中被检测到，但是与从p53-/-小鼠中获得的CTL相比具有低10倍的亲和力(Theobald M et al，1997 andHernandez J et al)。另外，所谓的看家蛋白酶体(household proteasome)和免疫蛋白酶体(immunoproteasome)之间在产生某些肽表位方面的差异也可能允许胸腺上皮的正选择，但是由于缺乏胸腺APC呈递这些MHC-肽复合物而未能清除这些细胞。在胸腺中检测到组成型表达免疫蛋白酶体的树突细胞(Kloetzel PM&Ossendorp 2004)和高水平的免疫蛋白酶体(Zanelli E et al，and Stohwasser R et al)。Morel等人证实，识别黑素瘤抗原Melan-A的人CTL以及识别新的普遍表达蛋白的CTL不识别带有免疫蛋白酶体的APC，而它们能够识别表达看家蛋白酶体的细胞。未能呈递足够的呈递该相同肽的I类MHC分子也可能允许T细胞在胸腺选择中存活(Sebzda E et al)。某些I类MHC限制性肽的适度表面表达可通过几种非互斥机制来实现：1)细胞中蛋白的低表达或低周转导致不产生足量的CTL可识别的表位(Vierboom MP et al)，2)对MHC仅有弱结合亲和力的肽可能失去与具有较好MHC结合性能的肽的竞争，这样就几乎不在细胞表面表达，3)仅具有弱的与I类MHC稳定结合能力的肽可能在细胞表面形成快速分解的I类MHC-肽复合物，这样就不再是T细胞刺激物(van der Burg SH et al 1996)，以及4)蛋白酶体生成的CTL表位可能不足以产生有效量的MHC-肽复合物。

肽

因此，在第一方面，提供了源于蛋白的肽，该蛋白为普遍表达的自体抗原并且已知与癌症相关，所述肽包含显示低至中等的在细胞表面形成稳定I类MHC-肽复合物能力的表位和/或不被蛋白酶体有效加工和/或显示低至中等的MHC结合亲和力。优选地，肽包含显示低至中等的在细胞表面形成稳定I类MHC-肽复合物能力的表位和/或不被蛋白酶体有效加工。

在本发明上下文中，“显示低至中等的MHC结合亲和力”优选指，包含在肽中的表位的相对结合亲和力包含于5至50μM。更优选地，该相对结合亲和力包含于10至50μM，甚至更优选包含于15至50μM。该相对结合亲和力优选通过基于竞争的细胞结合测定法评估，如以前所述(van der Burg SH 1995)(还参见实施例1)。存在于肽内的给定表位的亲和力表述为抑制50％(IC50)的参照表位结合的该表位浓度。该表位的长度通常包含于8至12个氨基酸长度，并一般基于用于HLA-A*0101、A*0301、A*1101和A*2401的典型锚定残基(Rammensee HGet al)进行选择。优选的肽为实施例1中描述的那些。

在本发明上下文中，“显示低至中等MHC结合亲和力”优选通过测量结合至MHC的稳定性来衡量，如(van der Burg SH et al 1996)中所描述的。

其它肽-HLA复合物的稳定性优选按如下方式来确定。在4℃和20℃进行肽结合，并确定IC₅₀。在2小时内＞50％的起始复合物的肽的损失被认为是不稳定的。稳定的肽在20℃显示的IC₅₀偏离4℃时的IC₅₀小于2倍。在20℃时显示的IC₅₀大于4℃时IC₅₀的两倍但IC₅₀＜15μM的肽认为是以中等稳定性结合。剩下的指定为不稳定的肽结合。

在本发明上下文中，“不被蛋白酶体有效加工”优选指，在蛋白酶体消化的第一小时内，发现总共被消化的肽小于1％。蛋白酶体的加工优选通过以下方式评估：37℃下，在至少1小时期间于蛋白酶体消化缓冲液中将纯化的蛋白酶体(优选人蛋白酶体)与包含潜在CTL表位的肽(约30个氨基酸长度)一起孵育。然后通过添加三氟乙酸来终止反应。用电喷雾电离质谱对消化的肽进行分析(见实施例1)。甚至更优选地，所述人蛋白酶体为来自B-LCL JY细胞的免疫蛋白酶体(Kessler JH et al.2001)。

用在本发明中的肽的序列不是关键的，只要其源于作为普遍表达的自体抗原且已知与癌症相关的蛋白，并且只要该肽包含在细胞表面显示低的形成稳定I类MHC的能力的表位和/或其不被蛋白酶体有效加工和/或显示低至中等的MHC结合亲和力。优选地，肽包含在细胞表面显示低的形成稳定I类MHC的能力的表位和/或其不被蛋白酶体有效加工。

相应地，优选使用这样的肽，其包含源于蛋白的氨基酸序列的连续氨基酸序列，该蛋白为普遍表达的自体抗原且已知与癌症相关。

在本发明上下文中，蛋白为普遍表达的。优选地，当蛋白广泛表达时，其为普遍表达的。广泛表达指其表达可通过阵列或Northern法在包括胸腺在内的至少5种不同类型的组织中检测到，更优选在包括胸腺在内的至少7种以及甚至更优选在包括胸腺在内的至少10种组织种检测到。

在以下的阐释性和非限定性情形下，蛋白被优选认为与癌症相关：通过与没有癌症的个体的对应组织相比，在癌症患者的指定组织中，蛋白过表达和/或突变的和/或异常表达。异常表达的蛋白可以在组织中从头(de novo)表达，而正常情况下其不被表达。突变的蛋白可以为剪接变体。作为异位的结果，突变的蛋白还可以作为异常的融合蛋白被生成。

作为已知与癌症相关的普遍表达自体抗原的蛋白的实例为p53、MDM-2、HDM2和其它的在p53途径中起作用的蛋白，诸如survivin的分子，端粒酶，细胞色素P450亚型1B1，Her-2/neu和CD19，以及所有的所谓看家蛋白。

在优选的实施方案中，该蛋白为p53，更优选人p53。

人p53的氨基酸序列描述在SEQ ID No.1中。优选地，源于蛋白(优选p53)的连续氨基酸序列的长度不超过45个氨基酸，并且包含至少19个源于蛋白(优选p53)的氨基酸序列的连续氨基酸。包含在该肽内的源于蛋白(优选p53)的连续氨基酸序列的长度优选包含于19-45、22-45、22-40、22-35、24-43、26-41、28-39、30-40、30-37、30-35、32-3533-35、31-34个氨基酸。在另一优选的实施方案中，肽包含蛋白(优选p53)的22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、或45或多于45个连续氨基酸残基。因此，技术人员会理解，本发明的肽不同于p53蛋白，优选不同于人p53。在另一优选的实施方案中，本发明的肽由来自本文定义的蛋白(优选p53)的任何连续氨基酸序列组成。本发明中使用的这种长度的肽可以容易地被合成。

在优选的实施方案中，存在于肽中的抗原源于蛋白(优选p53)或其免疫原性部分、衍生物和/或类似物。这种肽应该满足上文中定义的活性(肽包含显示低至中等的形成稳定的细胞表面表达I类MHC-肽复合物能力的表位和/或不被蛋白酶体有效加工和/或显示低至中等的MHC结合亲和力。优选地，肽包含显示低至中等的形成稳定的细胞表面表达I类MHC-肽复合物能力的表位和/或不被蛋白酶体有效加工。蛋白(优选p53)的免疫原性部分、衍生物和/或类似物包含在性质上与所述蛋白自身相同但不必在量上相同的免疫原性能力。这种蛋白的衍生物可优选地通过保守氨基酸置换获得。

在优选的实施方案中，当所述蛋白为p53时，已经鉴定了几种显示低至中等的形成稳定的细胞表面表达I类MHC-肽复合物能力的表位，并描述在表5中。在该优选的实施方案中，本发明的肽包含任意这些HLA A1、A2、A3、A11和/或A24类型表位：

A1：229-236和/或

A2：149-157和/或

A3：101-110、112-120、113-120、117-126、154-163、156-163、360-370、363-372、373-381、376-386和/或

A11：101-110、112-120、283-291、311-319、311-320、312-319、363-370、374-382和/或

A24：340-348。

可选地或者与前述优选实施方案组合，在另一优选的实施方案中，当所述蛋白是p53时，已经鉴定出不被蛋白酶体有效加工的表位并描述在表5中。在该优选的实施方案中，本发明的肽包含任意这些HLAA1、A2、A3和/或A11类型表位：

A1：117-126、196-205、229-236和/或

A2：264-272和/或

A3：101-110、154-163、154-164、156-163、156-164、172-181、376-386和/或

A11：101-110、156-164、311-319、311-320、312-319、374-382。

可选地或者与前述优选实施方案的一种或两种组合，在优选的实施方案中，当所述蛋白是p53时，已经鉴定出几种显示低至中等的MHC结合亲和力的表位并描述在表5中。在该优选的实施方案中，本发明的肽包含任意这些HLA A1、A2、A3和/或A11类型表位：

A1：117-126、196-205、205-214、229-236、229-236、和/或

A2：113-122、149-157、264-272、322-330、和/或

A3：112-120、113-120、117-126、154-163、156-163、172-181、360-370、363-372、373-381和/或

A11：112-120、283-291、363-370、374-382。

在甚至更优选的实施方案中，将前两个优选的实施方案进行组合来定义几种表位，当所述蛋白是p53时，所述表位显示低至中等的形成稳定的细胞表面表达I类MHC-肽的能力并且不被蛋白酶体有效加工。在该甚至更优选的实施方案中，本发明的肽包含任意这些HLA A1、A3、和/或A11类型表位：

A1：229-236和/或

A3：101-110、154-163、156-163、376-386和/或

A11：101-110、311-319、311-320、312-319、374-382。

在该甚至更优选的实施方案中，表位A1：229-236、A3：154-163、156-163和/或A11：374-382是最优选的，因为其中每一种也显示出低至中等的MHC结合亲和力。

在一个实施方案中，p53肽不由HLA-A2.1类型表位组成或者不包含HLA-A2.1类型表位。在该实施方案中，p53肽优选不由显示低至中等MHC结合亲和力的表位组成或者不包含该表位。

在更优选的实施方案中，当蛋白为p53时，所述肽选自以下的肽，每种肽包含任意以下序列或由其组成或与其重叠：p5386-115、p53102-131、p53142-171、p53157-186、p53190-219、p53224-248、p53225-254、p53257-286、p53273-302、p53305-334、p53353-382和p53369-393。

甚至更优选地，当蛋白为p53时，所述肽选自以下的肽，每种肽包含任意以下序列或由其组成或与其重叠：p53142-171、p53157-186、p53190-219、p53224-248、p53225-254、p53241-270、p53257-286和p53273-302。

在本发明上下文中，重叠指所述肽的序列部分地或全部地与给出序列重叠。优选地，重叠指部分重叠。部分地优选指在该肽序列的N末端和/或C末端处一个或多个氨基酸的重叠，更优选N末端和/或C末端处两个或更多个氨基酸的重叠，或更多个氨基酸的重叠。还优选该重叠为该肽序列的N末端处一个或多个氨基酸和/或C末端处两个或更多个氨基酸的重叠，反之亦然。技术人员会理解，所有类型的重叠都包括在本发明中，只要获得的肽表现出如本文前面定义的期望活性。

甚至更优选地，所述肽不由p53102-137、p53106-137、p53149-169、p53129-156、p53187-212、p53187-220、p53187-205、p53187-234、p53226-243或p53226-264组成。这些p53肽的每一种在现有技术中都已知表现出高MHC结合亲和力和/或被蛋白酶体有效加工。

组合物

在本发明的第二方面，提供了包含上文定义的一种或多种肽的组合物。优选地，该组合物包含这些肽中的至少两种或至少三种或至少四种，或者至少5种，或者至少6种或更多种。

优选的组合物包含以下肽的至少两种或至少三种：p53142-171、p53157-186、p53190-219、p53224-248、p53225-254、p53241-270、p53257-286和p53273-302、p53305-334、p53353-382和p53369-393。更优选的组合物还包括p5386-115和/或p53102-131。

在其它的优选实施方案中，该组合物包含以下肽池的至少一种，其中每种肽包含以下序列或由其组成或与其重叠：

池1：p53190-219、p53206-235、p53224-248，

池2：p53142-171、p53157-186、174-203，

池3：p53225-254、p53241-270、p53257-286、p53273-302、p53289-318、p53305-334、p53321-350、p53337-366、p53353-382和p53369-393，

池4：p53102-131、p53126-155，

池5：p5370-90、p5386-115。

现有技术已知很多种生成肽的方式。本发明不限于生成肽的任何形式，只要所生成的肽包含任意给定序列、由其组成或与其重叠且具有前文定义的所需活性。举例而言，存在于组合物中的肽可以从蛋白(优选p53)获得，在体外合成或通过细胞合成，例如通过编码核酸。肽可以作为单一肽存在或者被并入融合蛋白中。还可以通过删除或置换一个或多个氨基酸、通过另外氨基酸或官能团在N和/或C末端的延伸对肽进行修饰，这可以改善生物利用度、靶向T细胞、或包含或释放提供佐剂或(共)刺激功能的免疫调节物质。该在N和/或C末端任选的另外氨基酸优选不存在于其来源蛋白氨基酸序列、优选p53氨基酸序列的相应位置中。

相应地，在另一方面，这里定义的本发明的肽和本发明的组合物用作药物。

在另一优选的实施方案中，肽或肽组合物还包含药物赋形剂和/或免疫调节剂。任何已知的惰性药物可接受载体和/或赋形剂都可以添加至该组合物中。药物的配制以及药物可接受赋形剂的使用在本领域中是已知的和常规的，例如在Remington；The Science and Practice of Pharmacy(制药科学与实践)，21^nd Edition 2005，University of Sciences in Philadelphia中有描述。本发明的肽优选在生理上可接受的水溶液(例如PBS)中是可溶的，该水溶液包含不超过35降至0％；35、20、10、5或0％的DMSO。在这种溶液中，肽优选以每毫升至少0.5、1、2、4或8mg肽的浓度可溶。更优选地，本发明的一种以上不同肽的混合物在这类溶液中以每毫升至少0.5、1、2、4或8mg肽的浓度可溶。

任何已知的免疫调节剂都可以添加至该组合物中。优选地，该免疫调节剂为佐剂。更优选地，该组合物包含前文定义的肽和至少一种佐剂。更优选地，该佐剂为水包油型乳剂如不完全弗氏佐剂，MontanideISA51(Seppic，France)，Montanide 720(Seppic，France)。这种类型的药物可以作为单次给药被给予。可选择地，如果需要，前文定义的肽和/或佐剂可以重复给药，和/或不同的肽和/或不同的佐剂可以顺序给药。

尤其优选的佐剂为已知通过Toll样受体起作用的那些。能够激活固有免疫系统的佐剂可通过包括TLR’s 1-10在内的Toll样受体(TLR’s)和/或通过RIG-1(视黄酸可诱导基因1)蛋白和/或通过内皮素受体特别良好地激活。能够激活TLR受体的化合物及其修饰和衍生物在本领域中有广泛记载。TLR1可以被细菌脂蛋白及其乙酰化形式激活，TLR2还可以被革兰氏阳性细菌糖脂类、LPS、LPA、LTA、菌毛、外膜蛋白、来自细菌或其它宿主的热休克蛋白以及分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖激活。TLR3可以被dsRNA(尤其是病毒来源的)或者被化合物聚(I:C)激活。TLR4可以被革兰氏阴性LPS、LTA、来自该宿主或细菌来源的热休克蛋白、病毒外壳或包膜蛋白、紫杉醇或其衍生物、含有寡糖的透明质酸以及纤粘蛋白激活。TLR5可以被细菌鞭毛或鞭毛蛋白激活。TLR6可以被分枝杆菌脂蛋白和B组链球菌热不稳定可溶因子(GBS-F)或葡萄球菌调控蛋白激活。TLR7可以被咪唑喹啉类和衍生物激活。TLR9可以被未甲基化的CpG DNA或染色质-IgG复合物激活。尤其是TLR3、TLR7和TLR9在介导抗病毒感染的固有免疫反应中起重要作用，因而能够激活这些受体的化合物尤其优选用于本发明中。特别优选的佐剂包括但不限于合成产生的化合物，包括触发TLR3和TLR9受体的dsRNA、聚(I:C)、未甲基化的CpG DNA、TLR 9激动剂IC31、TLR 4激动剂IMSAVAC。在另一优选的实施方案中，所述佐剂物理上连接至前文定义的肽。佐剂和共刺激化合物或官能团与包含I类HLA和II类HLA表位的肽的物理连接通过同时刺激内化、代谢和展示抗原的抗原呈递细胞、尤其是树突细胞而提供增强的免疫反应。另一优选的免疫调节化合物为T细胞粘附抑制剂，更优选内皮素受体抑制剂，例如BQ-788(Buckanovich RJ et al，，Ishikawa K，PNAS(1994)91：4892)。BQ-788为N-顺式-2，6-二甲基哌啶基羰基-L-γ-甲基亮氨酰-D-1-甲氧基羰基色氨酰基-D-正亮氨酸。但是，BQ-788的任何衍生物或经修饰的BQ-788化合物也包括在本发明范围内。

另外，优选将WO99/61065和WO03/084999中指出的APC(共)刺激分子与本发明中使用的药物内存在的肽联合使用。特别地，4-1-BB和/或CD40配体、激动性抗体或其功能性片段和衍生物、以及具有类似激动活性的合成化合物的使用优选与药物中存在的肽分别地或联合给予待治疗个体，以便进一步刺激该个体内固定最佳免疫反应。

在优选的实施方案中，所述佐剂包含外来体(exosome)、树突细胞、单磷酰基脂A和/或CpG核酸。

因此在优选的实施方案中，药物包含前文定义的肽或组合物以及选自以下物质的佐剂：水包油型乳剂(Montanide ISA51、Montanide ISA720)，已知通过Toll样受体起作用的佐剂、APC-共刺激分子、外来体、树突细胞、单磷酰基脂A和CpG核酸。

在另一优选的实施方案中，为了促进专职抗原呈递细胞或树突细胞呈递肽，包含肽的所述药物还包含DC激活剂。

给药方式在本领域中是已知和常规的，例如在Remington；TheScience and Practice of Pharmacy(制药科学与实践)，21^nd Edition 2005，University of Sciences in Philadelphia中有描述。本发明的肽、肽组合物和药物组合物以及药物优选配制为适合于静脉内或皮下、或肌内给药，尽管可以想到其它的给药途径，例如黏膜给药或皮内(intradermal)给药和/或皮内(intracutaneous)给药，例如通过注射。本文中皮内给药为优选的。特异与皮内给药相关的优点和/或优选实施方案随后在标题为“皮内给药”的单独部分定义。

本发明的至少一种肽和/或至少一种组合物的给药可以作为单次给药进行，这也包括在本发明内。可选择地，如果需要，至少一种肽和/或至少一种组合物可以重复给药，和/或本发明的不同的肽和/或组合物可以顺序给药。

可以使用本发明组合物或药物的任何给药方式。本发明的组合物或药物可以被配制为适合于静脉内或皮下、或肌内给药，尽管可以想到其它的给药途径，例如黏膜给药或皮内给药和/或皮内给药，例如通过注射。

另外，优选的实施方案包括在诸如矿物油(例如，Montanide ISA 51)或PLGA的缓释媒介中递送肽，连同或没有另外的免疫刺激物，例如TLR配体和/或抗CD40/抗4-1BB抗体。可选择地，本发明的肽可以通过皮内递送，例如通过注射，连同或者没有免疫刺激物(佐剂)。对于皮内递送，本发明的肽优选在由肽和一种或多种免疫学上惰性的药物可接受载体组成的组合物中给药，该载体例如为生理离子强度和/或渗透压下的缓冲水性溶液(例如PBS)。

肽的用途

在本发明的另一方面，提供了前文定义的肽在制备用于治疗或预防肿瘤的药物中的用途，所述肽源于已知与癌症相关的普遍表达自体抗原，显示出低至中等的形成稳定的细胞表面表达I类MHC复合物的能力和/或不被蛋白酶体有效加工和/或显示低至中等的MHC结合亲和力。优选地，所述蛋白为p53。优选地，肽显示出低至中等的形成稳定的细胞表面表达I类MHC复合物的能力和/或不被蛋白酶体有效加工。

用于治疗或预防癌症的优选肽在前文中已有定义。

所制备的这种用途的药物的所有优选特征在前文中已有定义。在优选的实施方案中，所使用的药物还包含惰性的药物可接受载体和/或佐剂。在优选的实施方案中，作为疫苗的所述药物被给予人或动物。在更优选的实施方案中，所述人或动物患有癌症或者有患癌症的风险，其中作为所述肽来源的蛋白与该癌症相关。更优选地，所述蛋白为p53，甚至更优选人p53。甚至更优选地，与p53相关的癌症选自以下清单：肺癌、结肠癌、食道癌、卵巢癌、胰腺癌、皮肤癌、胃癌、头颈癌、膀胱癌、肉瘤、前列腺癌、肝细胞癌、脑癌、腺癌、乳腺癌、子宫内膜癌、间皮瘤、肾癌、甲状腺癌、血液血癌症、类癌、黑素瘤、副甲状腺癌、宫颈癌、神经母细胞瘤、Wilms癌、睾丸癌、垂体癌和嗜铬细胞瘤。

其它优选的蛋白已经在本文中有叙述。

优选地，诸如癌症的所述疾病可至少部分地通过使用本发明的肽诱导和/或增强所述免疫反应来治疗或预防。

本发明的方法因此非常适合于向个体提供针对已知与癌症相关的普遍表达自体蛋白的免疫和/或增强所述免疫。本发明的方法适合于其它免疫策略的任何使用目的。原来的免疫是用于接种目的，例如预防癌症。但是，本发明的方法不仅适用于预防癌症。方法还可用来治疗现有的癌症，当然限制是该癌症可通过诱导和/或增强抗原特异T细胞免疫来治疗。

方法

在另一方面，本发明提供了设计源于作为普遍表达自体抗原并已知与癌症相关的蛋白的肽的方法，所述肽包含显示出低至中等的形成稳定的细胞表面表达I类MHC复合物的能力的表位和/或不被蛋白酶体有效加工和/或显示低至中等的MHC结合亲和力，以及所述肽适合于制备用于治疗或预防癌症的药物。优选的肽包含显示出低至中等的形成稳定的细胞表面表达I类MHC复合物的能力的表位和/或不被蛋白酶体有效加工。

该方法的所有特征在本文中已有阐述。

为了鉴定这种肽，技术人员可以遵循在实施例中阐述的策略：显示低至中等MHC结合亲和力的表位可以通过测量前文定义的相对结合亲和力来鉴定。表位形成低/中等稳定的细胞表面表达I类MHC复合物的能力可以按前文定义进行测量。最后，蛋白酶体不有效加工肽可以按前文定义进行评估。

皮内给药

在优选的实施方案中，都按本文定义的用在本发明中的肽或包含肽的组合物或药物被配制为适合于皮内给药或使用。皮内为技术人员所知。在本发明上下文中，皮内(intradermal)与皮内(intracutaneous)同义，与皮下(subcutaneous)不同。物质的最表面使用为皮上(皮肤上)，然后是皮内使用(皮肤内或进入皮肤)，接着是皮下使用(紧接皮肤下面的组织内)，然后是肌内使用(进入肌肉实体内)。通常通过注射来皮内使用。通常进行物质的皮内注射来测试可能的反应、过敏和/或对其的细胞免疫。皮下使用一般也通过注射进行：针注射进皮肤下的组织。

在另一更优选的实施方案中，用在本发明中的药物或组合物或肽不包含任何诸如Montanide ISA-51的佐剂，这意味着该药物(或组合物或肽)的配制更简单：基于油-水的乳剂优选不存在于所使用的药物(或组合物或肽)中。相应地，用在本发明中的药物(或组合物或肽)不包含诸如Montanide ISA-51的佐剂和/或不包含基于水包油的乳剂。因此，在优选的实施方案中，用在本发明中的药物(或组合物或肽)为生理离子强度和/或渗透压下的缓冲水性溶液，例如包含前文定义的一种或多种肽或由其组成的PBS(磷酸盐缓冲盐水)。技术人员知道如何制备这种溶液。

用在本发明中的药物(或组合物或肽)具有另一优点：通过皮内给予少量的前文定义的肽，仍可实现免疫原性效果。所使用的每种肽的量优选在1至1000μg、更优选5至500μg、甚至更优选10至100μg的范围内。

在另一优选的实施方案中，药物(或组合物)包含前文定义的肽和至少一种佐剂，所述佐剂不配制为基于水包油的乳剂和/或不为前文定义的水包油乳剂类型。这种类型的药物可以作为单次给药给予。可选择地，如果需要，可以重复给予前文定义的肽和/或佐剂和/或可以顺序给予不同的肽和/或不同的佐剂。本发明还包括，本发明的肽皮内给药，而这里定义的佐剂是顺序给药。该佐剂可以是皮内给药。但是，任何其它方式的给药也可以用于该佐剂。

肽的皮内给药是非常有吸引力的，因为疫苗注射在疾病部位或者尽可能接近疾病部位实现，导致局部激活疾病引流淋巴结，产生更强的免疫系统局部激活。在优选的实施方案中，直接在病变或疾病部位进行皮内给药。在病变部位在这里理解为在病变部位少于5、2、1、0.5、0.2或0.1cm以内。

在皮内给予本文定义的药物后，不仅Th2，还有Th1反应都被触发。这是出乎意料的，因为已经发现经由基因枪的皮肤抗原致敏(priming)导致选择性Th2免疫反应(Alvarez D，et al，2005)。另外，所观察到的免疫反应并不仅限于基于Alvarez D.等人，2005可预料到的皮肤。我们证实，分泌IFNγ的特异T细胞循环流经次级淋巴系统，因为它们在攻毒后(post-challenged)的外周血中被检测到。

本发明药物(或组合物或肽)的另一决定性优点在于可以在一次注射中以简单制剂使用相对少量的肽，并且没有任何已知会产生不希望的副作用的佐剂，如Montanide ISA-51。不希望被任何理论所束缚，我们认为本发明中使用的皮内肽特异地和直接地靶向存在于上皮中的表皮朗格汉斯细胞(LC)。朗格汉斯细胞为DC的特定亚型，其表现出起始初级免疫反应的出色能力(Romani N.，et al，1992)。这些LC可以被看作用在本发明中的药物募集的天然佐剂。

在另一优选的实施方案中，本发明涉及本文定义的肽在制备治疗或预防本文定义的疾病的药物中的用途，其中所述药物用于前文定义的皮内给药，以及，另外，本文定义的该相同和/或不同肽还被用于制备用于治疗或预防该相同疾病的药物，其中该药物被用于皮下给药。

用于皮内给药的药物在本文中已有定义。用于皮下给药的肽可以与用于皮内给药的相同，并且在本文中已有定义。技术人员知道如何配制适合于皮下给药的药物。优选地，适合于皮下给药的药物包含与佐剂联合的本文已经定义的肽。本文中已经提到了优选的佐剂。其它优选的佐剂为水包油型乳剂，例如不完全弗氏佐剂或IFA、Montanide ISA-51或Montanide ISA 720(Seppic France)。在另一优选的实施方案中，适合于皮下给药的药物包含前文定义的一种或多种肽和佐剂，以及惰性的药物可接受载体和/或赋形剂，都如前文所定义的。药物的配制以及药物可接受的赋形剂的使用在本领域中是已知的和常规的，例如在Remington；The Science and Practice of Pharmacy(制药科学与实践)，21^nd Edition 2005，University of Sciences in Philadelphia中有描述。用在本发明中的第二药物配制为适合于皮下给药。

在该优选的实施方案中，适合于皮内给药的药物可以与适合于皮下给药的药物同时给药。可选择地，两种药物可以按顺序地皮内和随后皮下给药，或反之(先皮下给药，接着皮内给药)。在这种优选的实施方案中，如同在用于皮内给药的较早优选实施方案中，如果需要，前文定义的肽和/或佐剂的皮内和/或皮下给药可以重复进行，和/或不同肽和/或不同佐剂可以按顺序地皮内和/或皮下给药。本发明还包括，本发明的肽皮内和/或皮下给药，而本文定义的佐剂是顺序给药。该佐剂可以是皮内和/或皮下给药。但是，任何其它方式的给药也可以用于该佐剂。

我们预期本发明药物(或组合物或肽)的皮内和皮下给药的组合是有利的。表皮中的DC显然不用于真皮内和皮下组织内的DC。皮内(皮内)免疫会引起抗原加工并激活通过其树枝状网络与角质形成细胞紧密接触的表皮DC(Langerin阳性朗格汉斯细胞)。这也将最佳地激活朗格汉斯细胞和角质形成细胞之间相互作用中的炎性途径，随后是负载了抗原并被激活的朗格汉斯细胞向皮肤引流淋巴结的移动。

皮下给药将激活其它DC亚类，它们也将负载抗原并独立地迁移至皮肤引流淋巴结。可想像的是，可以皮内和皮下给药的药物的使用可以导致经由不同DC亚类协同刺激这些引流淋巴结中的T细胞。

在本文及其权利要求书中，动词“包含”及其词形变化以其非限制性意义使用，指该词语之后的项目包括在内，但是并不排除未明确提及的项目。另外，动词“由...组成”可以被“主要由...组成”替换，并指本文定义的肽或组合物可以包含不同于明确指出组分的其它组分，所述其它组分不改变本发明的特有特征。另外，通过不定冠词“a”或“an”对元素的涉及不排除存在一个以上该元素的可能性，除非上下文明确要求该元素中的一个并仅有一个。因此不定冠词“a”或“an”一般指“至少一个”。

通过参考将本说明书中引用的所有专利和参考文献以其整体并入本文。提供以下实施例仅出于阐释目的，无意以任何方式限制本发明的范围。

附图简要说明

图1.蛋白酶体切割产物

图2.对蛋白酶体切割产物的形成机制的解释。

图3.实施例2所述卵巢癌患者中以及实施例3所述结肠癌患者中的I和II期临床试验流程图。对于卵巢癌患者，使用四次疫苗注射，而对于结肠癌患者，使用两次疫苗注射。对于结肠癌患者，在第二次疫苗位点进行皮肤活检。

图4.通过增殖测定测量的卵巢癌患者临床试验中p53肽特异反应(n＝8)。A-F)疫苗诱导的反应(^*)，如果接种后样品≥1000cpm且增殖指数≥3，以及如果接种后cpm值≥2×接种前cpm值。G)对记忆唤起混合物(MRM)的反应。浅灰条：接种前，黑条：接种后。

图5.通过增殖测定和细胞因子生成测量的结肠癌患者临床试验中p53肽特异反应。显示了2名男性结肠直肠癌患者以p53长肽疫苗接种前后的p53特异增殖能力(A和C)和细胞因子生成(B和D)。以覆盖氨基酸序列70-248的重叠p53肽(以二肽的肽池表示：V70-115、V102-155、V142-203、V190-248)接种患者两次。也针对p53的N末端区(aa 1-78)和p53的C末端区(aa 241-393)测试患者PBMC。

图6.通过IFN-γELISPOT(n＝7)在卵巢癌患者中测量p53肽特异反应。A-F)疫苗诱导的反应(^*)，如果{平均斑点数-(培养基中平均斑点数+2SD)＞10斑点}且接种后值≥2×接种前值。浅灰条：接种前，黑条：接种后。

图7.从卵巢癌患者获得的接种部位的皮肤活检块中p53肽特异反应，其通过增殖测定(n＝7)而测量。在最后一次接种3周后，后从最后的注射部位获取活检组织。A-D)疫苗诱导的反应(^*)，如果每分钟记数≥1000且增殖指数≥3。

图8.疫苗诱导的p53特异T细胞可以迁移进p53抗原存在的区域并识别天然加工并呈递的p53蛋白。从结肠直肠癌患者的第二次接种部位获取活检组织，并扩增浸润皮肤的T细胞。针对几种p53肽的肽池(通过所使用的肽池覆盖的p53蛋白氨基酸序列的最前和最后氨基酸的编号表示)以及p53蛋白和对照蛋白测试了浸润皮肤的T细胞。条表示三重复孔的均值和标准差。

图9.以p53-SLP疫苗接种在结肠直肠癌患者中诱导T细胞记忆反应和抗原扩展。

在增殖测定中测试了接种前、2次接种后和接种后6个月(#1)或9个月(#2)时分离的PBMC是否存在p53特异T细胞，其通过以几种p53肽的肽池(通过所使用的肽池覆盖的p53蛋白氨基酸序列的最前和最后氨基酸的编号表示)刺激PBMC 6天进行。条表示8孔的均值和标准差。

图10.4次免疫后通过增殖测定测量的卵巢癌患者对单个p53合成长肽的反应。阳性反应(^*)，如果≥1000cpm且增殖指数≥2。

图11.通过增殖测定测量的从卵巢癌患者接种部位获得的皮肤活检组织内的P53肽特异反应。

在最后一次接种三周后，从17名卵巢癌患者获得来自最后注射部位的活检组织。从两活检组织(015和020)中未能培养足够量的淋巴细胞用于增殖测定。阳性反应(^*)，如果每分钟记数≥1000且增殖指数≥3。

图12.在卵巢癌患者中通过增殖测定测量的第一次接种前和最后一次接种后以及在随后的化疗后的p53特异T细胞反应。分别在最后一次接种后的12个月(009)和9个月(019)以及在最后一次化疗后至少一个月，获得化疗后样品。疫苗诱导的反应(^*)，如果cpm≥1000且S.I.≥3以及如果接种/化疗后cpm≥2接种前的值。

图13.接种之前、期间和之后卵巢癌患者中的血清CA-125水平。漏测值：04访问4/5/FU；05访问3/4/5/FU；11访问FU。

图14：19名健康供者(HD)组中数量、出现日和注射的诱导阳性皮肤反应的抗原概览。当注射后不少于两天，丘疹直径大于2mm时，认为皮肤反应为阳性的。所给出的配置图是用于8肽池，指出了所用肽池的蛋白中第一和最后的氨基酸。以粗体印刷的配置图表明该时间表内至少一个阳性反应；实心方块代表针对指出的肽池的新出现的阳性皮肤反应。

图15.通过IFNγELIspot对健康供者的攻毒前(pre-challenge)血液样品中HPV16特异T细胞的检测与针对所识别肽池的早(＜13天)阳性皮肤反应的出现显著相关(p＝0.0003，双尾Fisher精确检验)。通过从试验孔内平均斑点数减去培养基对照的平均斑点数+2×SD计算特异反应。给出了每100.000PBMC的特异斑点数量。如果肽池特异T细胞频率在100.000PBMC中≥5，则反应被认为是阳性的。

图16.A.阳性皮肤反应的出现和同时在健康供者的攻毒后血液样品中检测(IFNγELIspot)到循环HPV16特异T细胞之间的关联性(p＜0.0001，双尾Fisher精确检验)。总共88个皮试中，39个是阳性的。这39个反应中25个与ELIspot中的阳性反应(T细胞频率，100.000PBMC中≥5)相关联。对于49个没有显示皮肤反应的皮试部位，10个与阳性ELIspot相关联。

图17.

A.通过IFNγELIspot在显示阳性皮肤反应的健康供者攻毒后血液样品中检测的HPV16特异T细胞反应。显示了每100.000PBMC的平均斑点数量。将记忆反应混合物(MRM)用作阳性对照。实心条表示取得钻取活检块并进行培养的阳性皮肤反应部位。

B.在14至28天的细胞因子驱动的增殖之后，测试从钻取活检块渗出的T淋巴细胞在经肽(10μg/ml)或蛋白(20μg/ml)加载的单核细胞刺激下增殖的能力，所用的肽与皮试中所注射的相同。植物凝集素(PHA)用作阳性对照。通过[³H]胸苷掺入来测量增殖，刺激指数(SI)≥3时，增殖反应定义为特异的。健康供者17(HD17)为由非特异T细胞组成的阳性皮肤反应部位的实例。

C.通过流式微珠阵列法(cytometric bead array)分析B中增殖反应的上清液中IFNγ、白介素4(IL4)、IL5和肿瘤坏死因子α、IL2、IL10(未示出)的存在。临界值基于不同细胞因子(100pg/ml IFNγ，剩下的细胞因子为20pg/ml)的标准曲线。抗原特异的细胞因子生成定义为细胞因子浓度高于临界值且＞2×培养基对照的浓度。健康供者15(HD15)显示了高背景水平的IL5，但是在抗原刺激后增加＞2×。

图18.健康供者15(HD15)的肽池4(E6_41-65，E6_55-80，E6_71-95)的皮肤活检组织的T细胞培养物由HPV16特异的CD4+和CD8+T细胞构成。在针对对应皮试注射中的蛋白(20μg/ml)和肽(10μg/ml)的胞内细胞因子染色(ICS)中测试培养物的特异性。值得注意的是，4个活检组织中的3个检测到CD8+HPV16特异T细胞。

实施例

实施例1：HLA结合、蛋白酶体消化和耐受之间的关系

某些I类MHC限制性肽的适度表面表达可通过几种非互斥机制来实现：1)细胞中蛋白的低表达或低周转，其导致不产生足量的CTL可识别的表位(Vierboom MP et al)，2)对MHC仅有弱结合能力的肽可能失去与具有较好MHC结合性能的肽的竞争力，这样就几乎不在细胞表面表达，以及3)蛋白酶体生成的CTL表位可能不足以产生有效量的MHC-肽复合物。

作为正常细胞调节的一部分，p53蛋白靶向蛋白酶体介导的降解，因此，进入蛋白酶体的蛋白的不足不太可能在逃避负选择中起重要作用。因而，我们分析了p53衍生肽的结合能力以及免疫蛋白酶体和看家蛋白酶体在体外生成这些肽的能力。

结果和讨论

从基于存在用于HLA-A*0101、HLA-A*0301、HLA-A*1101和HLA-A*2401的所谓主要锚定残基而选择的一大组肽中，43种肽被发现以中等至高亲和力结合(表1)。进一步在体外分析了这些肽和7种HLA-A*0201结合肽(Houbiers JG et al，Nijman HW et al，Theobald M et al 1995)的结合稳定性van der Burd SH et al 1995 and 1996)以及通过免疫蛋白酶体和看家蛋白酶体释放准确的C末端(Kessler JH et al 2001)(表1)。总体而言，以两种类型的蛋白酶体所得到的结果是可比的。除了肽p53_110-120、p53_111-120、p53_112-120、和p53_113-120结合至HLA-A*0301和/或HLA-A*1101并带有相同的C末端赖氨酸之外，没有检测到看家和免疫蛋白酶体之间在表位产生方面的差异(表1)。

现在，在p53中已经鉴定了5种不同的CTL表位(表2)。这些表位中的4种由HLA-A*0201限制，1种由HLA-A*2401限制。肽结合分析揭示，肽p53_264-272显示了中等结合亲和力，肽p53_149-157显示了弱的形成稳定肽-HLA-A*0201复合物的能力，而其它4种肽显示了对它们的限制性HLA分子良好和稳定的结合。有趣的是，对30残基的长前体肽的蛋白酶体切割分析证实，这5种肽中仅两种(p53_149-157和p53_187-197)通过看家和免疫蛋白酶体有效生成(图1)。对于肽p53_264-272，在4小时的消化后发现了对应C末端切割后的部分的片段，但是没有检测到肽本身或N末端延伸的前体(图1)。最近，证实了该前体肽在体外被20S蛋白酶体消化后可检测到，尽管是痕量的(Theobald M et al 1998)。合起来，两种表位p53_65-73和p53_125-134显示了良好的结合能力但不被20S蛋白酶体加工/有效加工，而第三种肽(p53_149-157)为两种类型的蛋白酶体良好加工但显示了弱的形成稳定肽-HLA复合物的能力。此外，p53_264-272以中等亲和力结合HLA-A*0201，但不被蛋白酶体良好加工(表2)。更可能地，这些肽在胸腺APC表面形成的MHC-肽复合物的数量不足以清除对应的p53特异CTL，使得这些细胞能离开而进入外周。如所预期的，显示对HLA-A*0201的良好结合能力、形成稳定的肽-HLA复合物并被免疫蛋白酶体和看家蛋白酶体良好生成的一种肽(p53_187-197)诱导了T细胞耐受(Theobald M et al 1997)。记住这一点，会有趣地发现显示在表1中的其它未有效加工肽(它们结合HLA-A*0101、HLA-A*0301、HLA-A*1101或HLA-A*2401)是否形成真正的CTL表位。

我们最近报道了在癌症相关自体抗原PRAME中鉴定CTL表位(Kessler JH et al 2001)。比较p53和PRAME衍生肽结合能力和通过蛋白酶体对C末端的释放，揭示PRAME肽被良好加工，而p53衍生的CTL表位不是如此(表2)。PRAME在多种肿瘤、睾丸中表达，在正常子宫内膜中以低水平表达，但是不在胸腺中表达，结果PRAME特异的CTL未在胸腺中被清除。这些数据合起来提示，稳定的肽结合和蛋白酶体释放准确C末端的联合可以导致精确预测针对其可获得CTL的CTL表位(例如，病毒抗原，肿瘤抗原如PRAME)，而对于普遍表达的抗原如p53，则可以揭示将会对其存在肽耐受。

现在已公认，可以通过可变加工途径生成CTL表位(Benham AM etal，Glas R et al，Geier E et al，Reimann J et al)，这产生含有具有不同羧基末端并且来自分散在整个细胞中的蛋白的肽的I类HLA分子(Luckey CJet al 1998)。由于p53基因或p53调节途径的其它基因内的突变，作为降低的蛋白酶体消化的结果，很多种肿瘤显示增强的p53表达水平(HondaR et al)。有趣的是，当以蛋白酶体抑制剂处理细胞时，占优势的HLA-A*0201限制性流感病毒基质蛋白CTL表位的表达增强了(Luckey CJ et al1998)。另外还证实，尽管存在有蛋白酶体抑制剂，在表面也重现了HLA-A*0201分子的正常表达水平的50-60％(Luckey CJ et al 2001)。这提示，不被蛋白酶体降解/良好降解的蛋白更可能通过其它方式被加工。这可能意味着，p53的过表达导致通过其它不同于蛋白酶体的途径产生增强的(HLA-A*0201限制性以及其它)CTL表位表达(图2)。p53特异CTL的激活可以在外周APC摄取肿瘤衍生的p53之后发生。这导致在II类MHC途径中呈递p53肽(van der Brug SH et al 2001 and Tilkin AF etal)，并且也可以导致在I类MHC中呈递(Reimann J et al)(图2)。

总结性评述

我们最近证实，20S蛋白酶体有效释放存在于25-30氨基酸的长前体肽中的推测CTL表位的准确C末端，精确地鉴定了天然加工肽，针对其在外周血中存在有CTL(Kessler JH et al 2001)。对于作为它们正常调节的一部分被蛋白酶体降解的普遍表达抗原而言，应该进行某些必要的区分。高的形成稳定MHC肽复合物的能力与通过蛋白酶体消化的有效释放的联合使得肽能诱导耐受。相反，被这二者中的任一种阻碍的肽可以形成CTL的天然靶，使其到达外周。

材料与方法

肽、肽结合和稳定性测定法

基于用于HLA-A*0101、A*0301、A*1101和HLA-A*2401的典型锚定残基(Rammensee HG et al)选择长8-11残基的肽。在基于竞争的细胞结合测定中测试肽的结合能力，如前所描述(van der Burg SH et al1995)。将FL标记的参照肽合成为Cys衍生物(van der Burg SH et al1995)。所用的荧光标记参照肽为：YLEPAC(FL)AK(HLA-A*0101)和KVFPC(FL)ALINK(HLA-A*1101)(Sette A et al)、KVFPC(FL)ALINK(HLA-A*0301)(van der Burg SH et al 1995)以及RYLKC(FL)QQLL(A*2401)(Dai LC et al)。所用的B细胞系为：CAA(A*0101)、EKR(A*0301)、BVR(A*1101)、VIJF(A*2401)。肽的相对结合能力表述为抑制50％(IC₅₀)的参照肽结合的肽浓度。亲和力分类如下：良好IC₅₀＜5μM，中等IC₅₀＝5-15μM，低IC₅₀＞15-50μM。用于HLA-A*0201的肽稳定性如之前所述(van der Burg SH et al，1996)进行。在2小时内大于50％的起始复合物的肽损失被认为是不稳定的。其它肽-HLA复合物的稳定性如下确定。在4℃和20℃进行肽结合，并确定IC₅₀。稳定的肽在20℃显示的IC₅₀偏离4℃时的IC₅₀小于2倍。在20℃时显示的IC₅₀大于4℃时IC₅₀的两倍但IC₅₀＜15μM的肽认为是以中等稳定性结合。剩下的指定为不稳定的肽结合。

体外蛋白酶体介导的消化和质谱分析

按所描述的(Kessler JH et al 2001)，从小鼠B细胞系(RMA)和人B-LCL细胞系(JY)纯化20S免疫蛋白酶体，从人肿瘤细胞系(HeLa)纯化20S看家蛋白酶体。为了评估动力学，按指出的不同孵育时期进行消化。简言之，含有(潜在的)CTL表位的肽(30聚体，20μg)与1μg纯化的蛋白酶体在300μl的蛋白酶体消化缓冲液中于37℃孵育1h、4h和24h，添加三氟乙酸(30μl)来终止消化，并在质谱分析之前保存在-20℃。如所描述的(Kessler JH et al 2001)，在配备了在线纳电喷雾接口的杂种四极杆飞行时间质谱仪Q-TOF(Micromass)上，以约250nL/min的流速进行电喷雾电离质谱分析。采用随质谱仪配备的Biolynx/蛋白软件(Micromass)在经消化的前体肽中搜索质谱图中的峰。将质谱图中峰的密度用于建立蛋白酶体消化后产生的肽的相对量。给出的肽的相对量为指定孵育时间时被蛋白酶体消化的肽的总量的百分比。主要切割位点定义为第一小时内＞1％的全部被消化肽。

实施例2：在卵巢癌患者中以p53肽进行的接种研究-7名接种患者中的免疫学结果

试验目的

2.1总体目标

主要目标：

-评估与已知作用模式的明确佐剂(Montanide ISA)联合的p53特异“长肽”疫苗的安全性和耐受性(研究的I期部分)

-评估与已知作用模式的明确佐剂(Montanide ISA)联合的p53特异“长肽”疫苗的免疫原性(研究的II期部分)

2.2终点

I期研究的主要终点是安全性和耐受性

II期研究的主要终点是免疫原性(p53特异T细胞反应)

2.3.试验设计

采用与具有持续树突细胞激活能力的佐剂(Montanide-ISA-51)联合的10种重叠p53肽，在卵巢癌患者中进行了I/II期接种研究。在图3中给出了阶段流程图。

2.4.患者选择标准

2.4.1.入选标准

-组织学上证实的卵巢上皮癌

-一线治疗(大块切除术和基于铂的化疗)结束后至少4周

-一线治疗后升高CA125血清水平且根据RECIST(实体瘤反应评价标准)标准(Therasse P et al)无可测量疾病。

-一线治疗后升高CA125血清水平且根据RECIST(实体瘤反应评价标准)标准(Therasse P et al)有可测量疾病，但是不愿或其它原因不适合接受二线化疗。

CA125的升高已知为卵巢癌的预后标志物(Ferrandina G et al，Goonewardene et al和Rustin et al)。

-年龄18岁或以上，预期寿命至少3个月

-不存在任何可能阻碍研究方案顺从性以及随访时间表的心理、家庭、社会或地理情况；这些情况应该在登记进入该试验之前与患者讨论

-在患者登记/随机化之前，必须根据临床试验规范(GCP)和国家/地区法规获得书面知情同意书。

-表现状态0至2(WHO评分)

-足够的肝、肾和骨髓功能，如所定义的：

-INR＜1.5；WBC＞3.0×109/L；血小板＞100×109/L；血红蛋白＞60mmol/l。

2.4.2.排除标准

-怀孕和/或母乳喂养

-其它恶性肿瘤(以前的或现在的)，除了皮肤的基底或鳞状细胞癌。

-高剂量的免疫抑制剂

-以前以生物反应调节剂治疗

-不受控制的高血压、不稳定型心绞痛、需要治疗的心率失常或之前的三个月内的心肌梗死。

-不受控制的充血性心力衰竭或严重心肌病。

-CNS转移的迹象或症状。

-严重神经学或精神病学病症。

2.4.3退出标准

-必需其它形式抗肿瘤治疗的进行性疾病

-不可接受的毒性(由于接种，gr 3-4毒性持续2周以上)

-患者拒绝

-失访

2.5.治疗方案，预期毒性。

大部分Th和CTL反应识别p53蛋白的残基70-251内的肽。因此，疫苗包括p53蛋白的这个区域。所用的肽在表3中给出。

在莱顿大学医学中心临床药学和毒理学系IGFL部门的肽实验室(Peptide Laboratory，section IGFL，department of Clinical Pharmacy andToxicology，Leiden University Medical Center)制备了用于疫苗的临床级肽。在相关的IMPD中描述了生产方法的技术细节或产物。所述p53肽为9种30聚体，1种25聚体，彼此重叠15残基(见表3)。这10种肽的组预期含有可能的用于所有I类等位基因的CTL表位以及可能的用于所有II类等位基因的T辅助表位。

Montanide-ISA-51被用作佐剂：Montanide ISA 51或纯化的不完全弗氏佐剂由90±2％(w/w)Drakeol 6VR(一种药物级的矿物油)中的10±2％(w/w)二缩甘露醇油酸脂(Montanide 80)构成。Montanide ISA 51由Seppic(Paris，France)作为用于人体的无菌、无热源佐剂销售。长期(35年)监测接受不完全弗氏佐剂疫苗的18000患者和22000对照，对于含或不含佐剂的疫苗在癌症死亡率(分别为2.18％和2.43％)方面没有显示出显著差异。

2.6.剂量和治疗概述

I期接种研究首先在5例具有升高的CA125水平的患者中进行。肽的剂量由300μg/肽组成。这种剂量是基于之前的肽接种临床试验(Rosenberg SA et al，Hersey P et al)而选择的，产生自在LUMC进行的I/II期HPV E6/E7长肽试验(未发表数据)。以3周的间隔接种4次，期间进行临床和免疫学评估。在四个不同部位，以DMSO/20mM磷酸盐缓冲液pH 7.5/Montanide ISA-51佐剂中每种肽300μg的剂量皮下深度注射疫苗。第一次注射在右上臂，第二次注射在左上臂，第三次在左上腿，第四且最后一次在右上腿。接种前，分离单核血细胞(PBMC；保存在液氮中的10％DMSO内)和血清，用于评估接种前针对p53的基线免疫状态。在第二次和最后一次(加强)接种2周后获取的PBMC和血清样品中测试接种对p53免疫的影响。测量了针对疫苗内单种肽的T细胞反应。另外，在接种2周后，从第四次接种部位获取皮肤活检组织以分离浸润T细胞。测试这些T细胞的特异性和极化。

如果在5名进入I期研究的患者中没有一名出现3或4级毒性，则开始II期接种研究。如果1名患者经历的意外的3或4级毒性，则I期中的患者数量增加到10。应注意到在之前的肽接种研究中没有出现毒性或仅有小的毒性。由于在这些患者中一般遇到相对良好的整体状况，该患者组对于在经典II期试验中测试疫苗的免疫原性是理想的。最先有14名患者进入该II期研究。比较了接种前后p53特异的T细胞反应。如果在最先的19名患者中没有发现应答者(反应任意地定义为p53特异T细胞反应＞30％的增加)，则终止研究，因为疫苗显然缺乏免疫原性。对于反应的情形，研究中患者总数取决于所观察到的反应的数量。

在最后的一线化疗过程后3个月开始I/II期研究中的接种，并在3周的跨度继续总共4次接种。如果II期接种就阳性T细胞反应而言没有结果，就终止这种方法。

2.7.毒性情况下的支持性护理

对于皮肤毒性的情况，允许全身抗组胺药或局部类固醇。让患者接受用于骨髓抑制的生长因子。允许使用止痛剂。

2.8.伴随治疗

研究期间患者不允许接受其它化疗、免疫治疗、激素药物(不包括用于皮疹的局部类固醇)、放疗(radiation therapy)、实验性药物、放疗(radiotherapy)和/或手术。必需其它形式的抗肿瘤治疗的任何疾病进展都为患者退出研究的原因。研究期间不允许使用全身性皮质类激素。患者应接受充分的支持性护理。

2.9临床评估、实验室测试和随访

2.9.1治疗前

在登记进入试验前少于14天，需要记录以下参数：

-相关病史，包括首次诊断日、组织学类型、同时存在的疾病和任何同时使用的药物。

-身体检查，包括WHO表现、身高、体重、生命体征、基线临床症状。

-心电图(ECG)和尿分析以排除无症状膀胱炎

-血液学：血红蛋白、血小板、WBC。

-生物化学：血清肌苷、INR、胆红素、ASAT、ALAT、LDH、INR。

当患者登记进入试验，研究治疗在入选后7天内开始。

2.9.2.治疗期间

在开始接种之前小于28天(300ml)、接种期间(3×50ml)和最后一次接种后约14天(300ml)，收集PBMC以测量p53特异T细胞反应。

最后一次接种后两周，从第四次接种部位处获得钻取活检块。

在每次接种给药之前立即地，以及在最后的疫苗给药后10至14天，进行以下检查：(1)每次接种前以及接种3至4小时后的身体检查，包括神经学评估、生命体征、O₂饱和度以及ECG。(2)评估所有的不良事件(应该记录该接种期间发生的最严重级别的事件)以及体重和WHO表现，(3)血液学和生物化学，包括血红蛋白、血小板、WBC、血清肌苷、INR、胆红素、ASAT、ALAT、LDH和INR。(4)任何同时使用的药物。

2.9.3.治疗结束后(随访)

如果患者在接种后无进展，则按治疗期间的相同程序每3个月记录疾病程度。对于有进展的情况，每3个月跟踪患者存活率。记录任何形式的其它抗肿瘤治疗的起始。表4总结了整个接种和分析过程。

在接种期间记录毒性评估。血液学和生物化学，包括血红蛋白、血小板、WBC、血清肌苷、INR、胆红素、ASAT、ALAT、LDH和INR。

2.10.免疫监测

在研究期间的5个不同时间点收集PBMC：接种前(300ml)、每次接种后(3×50ml)以及最后一次接种后(300ml)。分离PMBC和血清。

如下对I/II期研究的接种个体中p53特异T细胞反应进行评估：

接种后阳性CD4+辅助细胞反应定义为：

a)显著增加的(当接种后样品的增殖指数至少为接种前样品的增殖指数的2倍高且接种后样品的增殖指数应至少为2时，认为接种诱导的反应是阳性的和/或b)在体内以肽刺激两次的PBMC显著增加的针对p53肽的IFNγ生成，其如培养1天后通过ELISA所测量，和/或c)brefeldinA存在下，在体外以p53肽刺激6小时，显著增加的产生IFNγ的CD4+PBMC百分比，其采用以针对CD4、早期激活标志物CD69和IFNγ的抗体进行的三色细胞内FACS染色，和/或d)显著增加数量的产生IFNγ、IL-4或IL-10的抗原特异T细胞，其如ELISPOT测定法中所测量，其中≥1/10,000PBMC的频率被认为是阳性的，接种前和接种后之间斑点数量的两倍增加选作对疫苗的阳性反应。

2.11.统计学考虑

2.11.2.分析

不满足入选标准的患者是不被入选的。清楚地指明了因为退出或其它原因(例如患者拒绝、失访、破坏协议)而没有评估的患者。总共19名可充分评估患者需要进入该研究，同时最大20％退出，该数字可能增加至23名患者。

接种前后测量的疫苗的p53特异免疫反应将通过Sign检验(2侧，5％显著性水平)比较。将评估接种期间遇到的反应比例和3-4级毒性比例，并计算95％精确置信限。通过Kaplan-Meier曲线计算进展时间，并通过logrank检验与历史对照组比较。

2.12.平移研究

进行以下的分析：

采用新分离的用于p53特异增殖的PBMC，分析p53特异T细胞反应。通过细胞因子微球阵列(根据制造商Becton-Dickinson的规程)测试这种抗原刺激后特异产生的细胞因子(IFNγ、TNFα、IL-10、IL-5、IL-4、IL-2)。测试第四次接种之前、期间和之后新分离的PBMC。反应分类为Th1(IFNγ、TNFα)、Th2(IL-4、IL-5、IL-10)、Th0(IFNγ、IL-4、IL-5、IL-10)或相对于细胞因子产生而言被削弱(没有产生)。在外周血中存在大量的p53特异T细胞并非在所有情况下都可以导致这些T细胞迁移至疫苗注射部位，尽管存在有肽抗原。T细胞能否成功迁移进皮肤可以反映疾病部位的状况。因此，在最后一次接种后的2周，从第四接种部位处取得活检组织。从活检组织分离浸润接种部位的T细胞。通过细胞因子微珠阵列(制造商规程)和通过FACS测试浸润性T细胞的特异性、极性和类型。

2.13.结果

2.13.1.增殖测定

图4显示了按所述进行的增殖测定。其证实，含有包含p53_70-248的肽的疫苗能够在多数患者中诱导免疫反应。显然，源自区域p53_102-248的肽在接种后最有效诱导T细胞反应，其如疫苗肽池体外刺激后通过增殖所测量(图4b-d)。包含p53_70-101的第一疫苗肽池在体外刺激后几乎不诱导T细胞增殖(图4a)。也用不存在于疫苗中的肽刺激从接种患者分离的T细胞。这涉及包含p53蛋白的N末端和C末端区的肽。如图4f所示，N末端区能够在一些卵巢癌患者中诱导T细胞反应。这可以说明该疫苗在诱导杀伤T细胞方面非常有效，最终导致表位扩展。另一方面，p53的C末端区不在这些患者中诱导可测量的T细胞反应。

2.13.2.IFNγELISPOT

疫苗被认为诱导阳性反应，如果：

-平均斑点数量-(培养基中平均斑点数+2SD)＞10斑点

-接种后SI＞＝接种前SI的2倍。结果显示在图6中。

该测定显示了与增殖测定类似的结果：源于p53_102-248区域的疫苗肽诱导了对该区域内含有的表位特异的T细胞(图6b-d)，而源于p53_70-101区域的肽并非如此(图6a)。此外，该测定还证实，在一些患者中可能发生主要的表位扩展(图6f)。

实施例3：结肠直肠癌患者中以p53肽进行的接种研究-2名接种患者中的免疫学结果

研究原理与实施例2类似(还参见图3)。差异在于，这项研究中患者仅接受两次接种(而不是4次)。

显示了p53长肽疫苗接种前后，2名男性结肠直肠癌患者的p53特异增殖能力(图5A和图5C)和细胞因子生成(图5B和图5D)。用包含氨基酸序列70-248的重叠p53肽(通过2肽的肽池指出：V70-115、V102-155、V142-203、V190-248)接种患者两次。还针对p53的N末端区(aa 1-78)和C末端区(aa 241-393)测试了患者PBMC。值得注意的是，在这两个病例中，接种也导致激活T细胞对C末端区(疫苗之外)的反应性，表明了接种后免疫反应的表位扩展。p53特异增殖与IFNγ、IL-10和IL-5的生成相关，其如通过细胞因子微珠阵列(CBA)所测定。

实施例4：结肠直肠癌患者中以p53肽进行的接种研究-9名接种患者中的免疫学反应

表6显示了以p53SLP疫苗接种两次的结肠直肠癌患者中p53特异T细胞反应的概况。总之，所有的患者都显示了p53特异T细胞反应。看起来最具免疫原性的肽位于如疫苗中存在的p53蛋白的最N末端部分(aa 190-248)：9名患者中的8名对这些肽有反应。但是，源于aa 102-155和142-203的肽也能够诱导p53特异反应(9名患者中的6名对源于这些区域的一种或多种肽有反应)。显然，p53的C末端部分似乎免疫原性较弱。重要的是，并非存在于p53SLP疫苗中的源于p53N末端部分的肽仍能够在体外诱导T细胞反应。这种现象被认为是抗原扩展并经由摄取了死亡肿瘤细胞释放的肿瘤衍生p53的DC刺激T细胞而发生。因为这仅在接种后观察到，所以其表明了有效的疫苗诱导的抗肿瘤反应。

为了确定p53SLP疫苗是否能够诱导可迁移至p53抗原存在的区域的p53特异T细胞，分离了疫苗部位并扩增浸润皮肤的T细胞。图8显示了来自1名结肠直肠癌患者的结果。T细胞已迁移至疫苗部位，并且主要对疫苗肽5-10(aa 142-248)特异。另外，编码p53蛋白的N末端部分(aa 241-393)的肽也可被浸润性T细胞识别，尽管蛋白的这个部分并不存在于p53-SLP疫苗中。又是有效接种后抗原扩展的证据。重要的是，这些结果还证实，疫苗诱导的迁移至抗原呈递区域的T细胞也可识别加工了整个p53蛋白的细胞。这表明，天然加工途径将p53蛋白加工为可被疫苗诱导的T细胞识别的表位。这暗示也以天然方式加工完整p53蛋白的肿瘤细胞也可被这些T细胞识别并裂解。

为了确定接种的结肠癌患者也能够诱导记忆T细胞反应，测试了2次接种之前和之后以及6或9个月后分离的PBMC是否存在p53特异T细胞。图9显示了在接种前不存在且在2次接种后诱导的p53特异T细胞反应在接种后6-9个月仍存在于测试患者的循环中，这指示p53特异的记忆T细胞反应。另外，两患者都在2次接种后以及甚至在6个月随访(#1)时显示了对p53蛋白的氨基酸241-393的反应，表明作为表位扩展结果的诱导的T细胞也仍然存在。

实施例5：在卵巢癌患者中以p53肽进行的接种研究-所有(18)接种患者中的免疫学结果

表7总结了经p53-SLP疫苗治疗的所有卵巢癌患者的免疫学和临床反应。

免疫学反应

在100％的接受了所有四次免疫的卵巢癌患者(N＝18)中，通过IFN-γELISPOT测量，疫苗诱导的针对疫苗肽的p53特异反应存在于免疫后的两个或更多个时间点(I-IV)(表8)。所有卵巢癌患者中疫苗诱导的p53特异反应直接针对疫苗肽池中的至少两种。在四次免疫后，可在61.1％(11/18)的患者中检测到循环的分泌IFN-γ的p53特异T细胞。

在82.4％(14/17)的卵巢癌患者中观察到针对疫苗肽的疫苗诱导p53特异增殖反应(表9)。如图12中所显示的，在最后一次免疫后的9-12个月，尽管患者经过化疗治疗仍可显示针对疫苗肽的增殖反应。另外，也在卵巢癌患者中，在四次免疫后分别在11.8％(2/17)和23.5％(4/17)的患者中观察到针对未被疫苗肽覆盖的p53蛋白的最前(aa 1-78)和最后(aa241-393)部分的p53特异反应(表9)。图10显示了四次免疫后在7名卵巢癌患者中所分析的PBMC应答单次疫苗肽离体(ex-vivo)刺激的增殖能力。除了疫苗肽1(aa70-99)之外，对于所有肽都观察到反应。

为了分析p53特异T细胞迁移至p53抗原存在的部位的能力，用从取自第四注射部位的皮肤活检组织培养的淋巴细胞进行了增殖测定(n＝17)。从两名患者(P15和P20)的皮肤活检组织不能培养足量的淋巴细胞。在52.9％(9/17)的患者中，在从皮肤活检组织培养的淋巴细胞中观察到p53特异反应。观察到的大多数反应是针对疫苗肽p8-p10(aa 190-248)(图11)。重要的是，在从皮肤活检组织培养的淋巴细胞中具有p53特异反应的所有患者也在通过增殖测定分析的PBMC中显示了疫苗诱导的p53特异反应(表7)，尽管反应不一定直接针对相同表位。

免疫前p53自体抗体存在于40％(8/20)的患者中。在一次或多次免疫后，p53自体抗体存在于45％(9/20)的患者中。在15％(3/20)的患者中检测到疫苗诱导的p53自体抗体滴度的增加(表7)。

临床反应

由于快速进展的疾病，两名患者仅接受了两次免疫(P04、P12)。基于CA-125水平和根据RECIST和GCIG标准的CT扫描评估，评估了剩下的18名卵巢癌患者的临床反应(表10)。通过CA-125测量，1名患者具有部分反应(P05)，6名患者具有稳定的CA-125水平(P02、P03、P06、P09、P17、P21、P23)(图13)。CT扫描上这些患者中的两名(11.1％)还具有稳定的疾病(P17、P23)。两名患者中，在PBMC中检测到疫苗诱导的p53特异反应。P23还在从皮肤活检组织培养的淋巴细胞中显示了p53特异反应。其它患者(16/18；88.9％)被分类为具有进行性疾病。具有进行性疾病的所有患者都在他们最后的CT扫描后出现了新的病变。

实施例6.证实疫苗肽的皮内给药的优势

在本实施例中，源于HPV蛋白的肽被用在皮内疫苗中。这里证实的皮内疫苗的优势可泛化至任何其它肽，包括源于作为普遍表达的自体抗原并已知与癌症相关的蛋白，例如p53。

材料与方法

研究设计

在患有子宫颈HPV相关病症的患者和健康个体中进行了代表性初步研究来分析HPV16E2、E6和E7特异T细胞反应，其通过在上臂中皮内注射临床级HPV16肽池来进行测量。由于迟发型超敏反应代表了记忆T细胞反应，因此在分析时没有HPV16阳性的前提。

个体

在提供了知情同意书后，一组19名健康个体(HD)参与了这项研究。健康个体组显示了31岁的年龄中位数(范围，20-51岁)，由80％的女性和20％的男性组成。从所有个体获得外周血单核细胞(PBMC)，然后立即进行皮试。在健康个体中，晚出现的阳性皮试导致从19名健康志愿者之中的11名分离第二血液样品。该研究设计得到莱顿大学医学中心的医学伦理委员会的批准。

DTH皮试

基于迟发型超敏反应(DTH)的皮试可被用作灵敏和简单的方法来体内测量HPV特异的细胞免疫反应(Hopfl R et al，2000；Hopfl R et al，1991)。皮试制剂由长的临床级合成肽的8个肽池组成，这些合成肽跨越全部HPV 16E6和E7蛋白以及HPV 16E2蛋白的最具免疫原性区(deJong A et al，2004)。这些临床级肽在LUMC的部门间GMP车间(interdivisional GMP-Facility)内生产。每个皮试肽池由2或3种合成肽组成，以这些肽覆盖的蛋白区域的第一和最后氨基酸表示。池1：E2_31-60，E2_46-75，池2：E2_301-330，E2_316-345，池3：E6_1-31，E6_19-50，池4：E6_41-65，E6_55-80，E6_71-95，池5：E6_85-109，E6_91-122，池6：E6_109-140，E6_127-158，池7：E7_1-35，E7_22-56，池8：E7_43-77，E7_64-98。HPV16的E2、E6和E7的序列分别由SEQ ID NO：22、23、和24表示。对于每个肽池，将0.05ml的0.2mg/ml肽皮内注射，这些肽于含有16％DMSO的20mM等渗磷酸盐缓冲液中(10μg/肽)。将肽池和阴性对照(仅溶剂)分别注射在上臂的单个皮试部位处。皮试部位至少检查三次，在注射(Hopfl R et al 2000，2001)肽后的72小时和7天，以及在最先的健康个体之一中首次报告非常晚的皮肤反应后3周进行。当注射后不少于两天，出现直径大于2mm的丘疹时，认为反应为阳性的。从阳性皮肤反应部位获得钻取活检块(4mm)，切成小片并在含有10％人AB血清、10％TCGF以及5ng/ml IL7和IL15的IMDM中培养，让淋巴细胞移出皮肤组织。在培养2至4周后，收集增殖的T细胞并测试它们的HPV特异反应性。

用于体外免疫测定的抗原

类似于皮试中使用的肽的一组肽被用于T细胞刺激测定和IFNγ-ELISPOT测定。四种HPV 16E2肽由重叠15残基的30聚体肽组成，HPV 16E6由32聚体组成，HPV 16E7由35聚体组成，二者重叠14残基。按之前所述(van der Burg SH et al，1999)合成并溶解这些肽。值得注意的是，在IFNγELISPOT测定中，肽池4和5与用于皮试中的肽池稍有不同，肽池4含有肽E6_37-68、E6_55-86、E6_73-104，肽池5含有肽E6_73- ₁₀₄、E6_91-122。

将由破伤风类毒素(0,75 Limus flocculentius/ml；National Institute ofPublic Health and Environment，Bilthoven，The Netherlands)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)超声裂解物(5μg/ml；由Dr.P.Klatser，Royal Tropical Institute，Amsterdam，The Netherlands惠赠)和白色念珠菌(Candida albicans)(0.15mg/ml，HAL Allergenen Lab.，Haarlem，TheNetherlands)的混合物组成的记忆反应混合物(MRM 50×)用作阳性对照。如之前所述(van der Burg SH et al，2001)，在重组大肠杆菌(Escherichiacoli)中产生重组HPV 16E2、E6和E7蛋白。

通过IFNγELISPOT分析抗原特异的Th细胞

通过ELISPOT分析HPV 16特异Th细胞的存在，如之前所述(vander Burg SH et al，2001)。简言之，将新鲜PBMC以2×10⁶细胞/孔的密度接种在24孔板(Costar，Cambridge，MA)的1ml IMDM(Bio Whittaker，Verviers，Belgium)中，该IMDM富含10％人AB血清，存在或不存在指出的HPV 16E2、E6和E7肽池。肽以5μg/ml/肽的浓度使用。37℃孵育4天后，收集PBMC，洗涤并以4重复孔和每孔10⁵细胞的密度接种在Multiscreen 96孔板(Millipore，Etten-Leur，The Netherlands)的富含10％FCS的100μl IMDM中，该板被IFNγ捕获抗体(Mabtech AB，Nacha，Sweden)包被。其它的抗体孵育和ELISPOT显示按制造商(Mabtech)说明书进行。以全自动的计算机辅助视频图像分析系统(Bio Sys)对斑点记数。通过从试验孔中的平均斑点数减去培养基对照的平均斑点数+2×SD而计算特异斑点(van der Burg SH et al，2001)。

T细胞增殖测定

在3天的增殖测定中测试皮肤活检组织的T细胞培养物对特定肽和蛋白的识别(van der Burg SH et al，2001)。简言之，37℃下在X-vivo 15培养基(Cambrex)中，通过粘附至平底96孔板在2小时内从PBMC分离自体单核细胞。将这些单核细胞用作APC，让其负载10μg/ml肽和20μg/ml蛋白过夜。将皮试浸润淋巴细胞以2-5×10⁴细胞/孔的密度接种在补加了10％AB血清的IMDM中。将单独的培养基用作阴性对照，将植物凝集素(0,5μg/ml)用作阳性对照。通过[³H]胸苷(5μCi/mmol)掺入来测量增殖。刺激指数(SI)≥3时，增殖性反应定义为特异的。在孵育48小时后收集增殖测定的上清液，用于分析抗原特异的细胞因子生成。

分析与HPV16特异增殖性反应相关的细胞因子

根据制造商的说明，采用流式微珠阵列法(Becton Dickinson)进行六种不同的Th1和Th2细胞因子的同时检测：IFNγ、肿瘤坏死因子α、白介素2(IL2)、IL4、IL5和IL10。临界值基于不同细胞因子(100pg/mlIFNγ，剩下的细胞因子为20pg/ml)的标准曲线。抗原特异的细胞因子生成定义为细胞因子浓度高于临界值且＞2×培养基对照的浓度(de Jong A etal，2004)。

细胞内细胞因子染色(ICS)

按之前的报道(de Jong A et al，2005)，通过ICS测试源于阳性皮肤反应部位的T细胞培养物的特异性和特征。简言之，收集皮试浸润淋巴细胞、洗涤并悬浮在IMDM+10％AB血清中，并将2-5×10⁴细胞添加至在X vivo培养基中以50μl肽(10μg/ml)或蛋白(20μg/ml)过夜加载的自体单核细胞。将单独的培养基用作阴性对照，将植物凝集素(0,5μg/ml)用作阳性对照。用FITC标记的小鼠抗人IFNγ(0.5g/ml，BD PharMingen)、PE标记的小鼠抗人IL5(0,2mg/ml，BD PharMingen)、APC标记的抗CD4(BD Bioscience)和PerCP标记的抗CD8(BD Bioscience)同时对样品染色。4℃孵育后，清洗细胞，以1％低聚甲醛固定，并以流式细胞术(FACSscan，BD Biosciences)进行分析。

统计分析

将Fisher精确检验(双尾)用于分析PBMC中产生IFNγ的HPV特异T细胞的检测与皮试反应的存在或皮肤活检组织中HPV特异T细胞的存在之间的关系，以及这些组内皮肤反应的大小或数量方面在患者和健康对照之间的差异。采用Graphpad Instat软件(版本3.0)和Graphpad Prism4进行统计分析。

结果

对HPV 16E2、E6和E7肽的皮内注射的皮肤反应

我们研究了皮内注射HPV16E2、E6和E7肽后，健康个体中的皮肤反应。阳性皮肤反应表现为直径2至20mm的扁平红色丘疹，在注射后2至25天内出现。健康志愿者中在152个皮试的46个中检测到阳性皮肤反应。大体上，皮试中的每个肽池都会引起阳性皮肤反应。在对照组中观察到最高频率的针对E2_31-75(19个体中10个)、E6_37-104(9/16)和E7_43-98(7/19)的反应。该反应模式类似于我们之前在PBMC中观察到的(de Jong A et al，2002；Welters et al，2003)(图14)。这些皮肤反应对应于肽特异T细胞反应的存在，其如在这些个体的PBMC中所检测(数据未显示)。

健康供者中的皮肤反应与外周血中更高频率的HPV 16特异T细胞相关。

为了将皮试结果与循环的HPV16特异1型T细胞的存在进行比较，在给予皮内肽攻毒之前，以收集的PBMC进行IFNγELIspot测定。通过IFNγ-ELIspot能够在19名健康志愿者的5名中检测到HPV16特异免疫反应。在健康个体的攻毒前血液样品中每100.000PBMC检测到≥5个循环HPV16特异T细胞与对相同肽序列的早(≤13天)阳性皮肤反应相关(p＝0.0003，双尾Fisher精确检验；图15)。在健康供者的攻毒前血液样品中，没有检测到针对诱导晚的阳性皮肤反应(14至25天)的肽的HPV16特异循环T细胞。这提示循环的抗原特异细胞的频率决定了出现皮肤反应的延迟时间。

为了评估晚的皮肤反应出现时HPV特异T细胞的频率，收集了另外的来自11名健康志愿者的血液样品。在这些个体中，88个皮试中的39个为阳性的。对于39个阳性皮肤反应中的25个以及49个阴性皮肤反应中的10个，每100.000PBMC检测到≥5HPV16特异T细胞。这时，在攻毒后血液样品中检测到循环的HPV特异的IFNγ生成T细胞和皮肤反应的存在之间有显著关联性(p＜0.0001，Fisher精确检验；图16)。这显示以HPV16肽皮内攻毒后，健康志愿者的血液中HPV16特异T细胞的频率显著更高，表明皮内注射肽抗原增加了健康志愿者的血液中HPV16特异T细胞的数量。

阳性皮肤反应部位的活检组织由Th1/Th2-CD4+和CD8+HPV16特异T细胞两者组成。

大约25％的健康志愿者的阳性皮肤反应不与血液中检测到HPV16特异的IFNγ生成T细胞相关，提示皮内注射HPV16肽后，其它的非IFNγ生成类型的T细胞可以浸润皮肤。

为了表征阳性皮肤反应部位的细胞，进行了钻取活检。总计从7名健康对照的不同阳性皮肤反应部位获取8个活检组织，并与细胞因子鸡尾酒(cocktail)培养，所述鸡尾酒使得T细胞能在无抗原性刺激物下体外生长。在8例中的7个中，在3-4周内T细胞渗出组织并增殖。在短期增殖测定中测试了增殖的T细胞的特异性。图17显示了用经肽池加载、也在皮试期间注射进该部位(HD2，HD10，HD15)的自体单核细胞以及经HPV16E6蛋白加载的单核细胞刺激后，特异增殖的T细胞培养物的实例(图17AB)。这表明在抗原被天然加工并呈递后，这些T细胞能够识别它们的同源HLA-肽复合物。对这些增殖性T细胞培养物的上清液的分析揭示了混合的Th1/Th2细胞因子特征(profile)，由于HPV16特异的T细胞产生IFNγ、IL-4和IL-5(图17C)。

对于在活检培养物中检测到HPV特异的T细胞(8个中的4个)的每种情况，其都与通过ELIspot在攻毒后的血液样品中检测到循环的HPV16特异的IFNγ生成T细胞一致(比较图17A和图17B)。在另外的4个阳性皮肤反应活检的3个(HD2，HD17，HD18)中，T细胞对HPV16肽无反应(图17；HD17)，并且在一例中完全没有T细胞渗出组织(HD13)。在所述4例中，我们未能在攻毒后的血液样品中检测到循环的HPV16特异IFNγ生成T细胞。

通过CD4和CD8细胞表面标志物对活检组织T细胞的共染色显示，在HPV16肽皮内攻毒后，不仅HPV16特异的CD4⁺还有HPV16特异的CD8⁺T细胞都浸润皮肤部位(图18)。总体而言，在HPV16特异T细胞浸润的4个活检组织的3个中，我们能够检测HPV16特异的CD8⁺T细胞。从HD2的活检组织(肽池6)分离的CD8⁺T细胞对注射皮试的重叠肽都有反应：HPV16E6_109-140和E6_127-158(数据未显示)，而两个体HD15和HD16的CD8⁺T细胞对HPV16E6_37-68有反应(见对于HD15的实施例，图18)。

综上所述，在以HPV16肽皮内攻毒后，迁移进皮肤的免疫细胞群包括HPV16-特异的CD4⁺Th1-、Th2-和CD8⁺细胞毒性T细胞。这种浸润与血液中循环的HPV16特异IFNγ生成T细胞的出现平行。

讨论

皮试通常被用作对细胞介导的免疫的体内测量的简单测定法。我们验证了使用皮试测定法来测量体内针对E2、E6和E7早期抗原的HPV16特异的细胞免疫反应，所述测量通过将这些结果与体外测定法对T细胞反应性的平行测量进行比较来进行。

健康志愿者组中，在皮内抗原攻毒后的4至12天，出现早的皮肤反应。在已知在体外显示HPV16特异的1型T细胞反应(de Jong A et al，2002；Welters et al，2003)的这些个体中，早的皮肤反应的出现(13天内)与以每20.000PBMC至少1个的频率检测到IFNγ生成HPV16特异T细胞显著相关(图15，p＜0.001)。Jeffries等人(Jeffries DJ et al，2006)推荐了相同的IFNγELIspot测定中阳性反应的临界标准，他们采用数学工具来定义与Mantoux试验相关的ELISPOT的适当临界值。较低的循环的记忆T细胞的数量(图15)可以解释为什么皮肤反应看起来与经典的DTH试验相比有某种程度的延迟。T细胞需要被增强或再活化并开始分裂，直至产生足够的细胞而引起局部炎症反应：阳性皮试。实际上，在阳性皮肤反应出现时，可在外周血中检测到较高频率的HPV16特异Th1反应(图16)。

在过去，假定Th1细胞诱导DTH反应，但是现在几项研究已经证实Th2细胞也浸润皮试部位(Wang S et al，1999；Woodfolk JA et al，2001)。类似地，这项研究显示，健康志愿者的阳性皮试部位含有Th1和Th2类型的HPV16特异T细胞两者(图17和图18)。另外，阳性皮肤反应也可以为非特异T细胞内流的结果，从用于测定肾细胞癌或黑素瘤患者接种后特异免疫反应的两项阳性皮试部位的深入研究(Bleumer I et al，2007)来看，这是明显的。这项研究还显示，健康个体的很多阳性皮试部位有对注射的HPV16抗原无反应的T细胞的浸润。迄今为止，仍不清楚特异的阳性皮肤反应的原因。出人意料的是，我们观察到健康个体中大多数的皮肤反应在皮内注射抗原后2至3周出现。但是，这些迟的阳性皮肤反应不与攻毒前血液中检测到循环的HPV特异CD4⁺记忆T细胞相关联(图15)，这些皮试部位的免疫学构成类似于经典DTH试验(PlattJL et al，1983；Poulter LW et al，1982)，由HPV16特异CD4⁺Th1和Th2细胞以及HPV16特异CD8⁺T细胞构成(图17和图18)。我们设想这些反应可能是T细胞致敏的结果。这也在29％的患者中注意到，这些患者接受了2步骤的结核菌素皮试方案并且仅在第二轮测试中为阳性(Akcay Aet al，2003)。一般而言，疫苗诱导的T细胞反应高峰在接种后的10至14天，而不是三周时。但是，我们应考虑到，在这个方案中注射了较高的抗原剂量以及强力佐剂。因此，有理由相信通过皮内攻毒诱导的T细胞反应出现地更慢且在较晚时期出现高峰。由于健康志愿者的皮内肽攻毒导致诱导HPV16特异的CD4⁺和CD8⁺T细胞，因此这应被认为是单次、低剂量接种。本项初步研究的主要目的是验证HPV16特异的皮试在检测体内1型免疫反应中的用途。对于健康志愿者，13天内的阳性皮肤反应的确与通过IFNγELIspot在体外检测的循环IFNγ生成记忆T细胞的存在相关。重要的是，我们还观察到通过皮试和ELIspot获得的结果之间的差异。在很多例中，在攻毒后的血液样品中检测到HPV16特异的循环IFNγ生成T细胞，但是没有伴随的皮肤反应，反之亦然(图16)，这可以认为是假阴性或假阳性结果。为了充分了解这对解释针对HPV的1型免疫检测的影响，我们已在印度尼西亚开始在HPV阳性患者和健康志愿者大群体中进行现场实验(field trial)。

表1HLA结合和蛋白酶体对潜在CTL表位的C末端切割。

¹肽结合亲和力分类如下：良好IC₅₀＜5μM，中等IC₅₀＝5-15μM，低IC₅₀＞15-50μM。为了确定肽-MHC复合物的稳定性，在4℃和20℃进行肽结合，并确定IC₅₀。稳定的肽在20℃显示的IC₅₀偏离4℃时的IC₅₀小于2倍。在20℃时显示的IC₅₀大于4℃时IC₅₀的两倍但IC₅₀＜15μM的肽被认为是以中等稳定性结合。

剩下的指定为不稳定的肽结合。

²C末端的蛋白酶体切割。通过小鼠(RMA细胞)和人(B-LCL JY)来源的免疫蛋白酶体(IP)和人(HeLa细胞)来源的看家(HH)蛋白酶体消化30残基长肽。

³HLA-A*0201结合肽。肽结合能力通过(16，24，25)事先确定。肽稳定性

表2肽结合、蛋白酶体消化和耐受之间的关系。

表3I/II期接种研究中使用的10种p53肽

氨基酸	序列	编号
氨基酸	序列	编号	70-99	APPVAPAPAAPTPAAPAPAPSWPLSSSVPS	1
86-115	APAPSWPLSSSVPSQKTYQGSYGFRLGFLH	2	70-99	APPVAPAPAAPTPAAPAPAPSWPLSSSVPS	1

氨基酸	序列	编号
氨基酸	序列	编号	102-131	TYQGSYGFRLGFLHS GTAKSVTCTYSPALN	3
126-155	YSPALNKMFCQLAKTCPVQLWVDSTPPPGT	4	102-131	TYQGSYGFRLGFLHS GTAKSVTCTYSPALN	3
126-155	YSPALNKMFCQLAKTCPVQLWVDSTPPPGT	4	142-171	PVQLWVDSTPPPGTRVRAMAIYKQSQHMTE	5
157-186	VRAMAIYKQSQHMTEVVRRCPHHERCSDSD	6	142-171	PVQLWVDSTPPPGTRVRAMAIYKQSQHMTE	5
157-186	VRAMAIYKQSQHMTEVVRRCPHHERCSDSD	6	174-203	RRCPHHERCSDSDGLAPPQHLIRVEGNLRV	7
190-219	PPQHLIRVEGNLRVEYLDDRNTFRHSVVVP	8	174-203	RRCPHHERCSDSDGLAPPQHLIRVEGNLRV	7
190-219	PPQHLIRVEGNLRVEYLDDRNTFRHSVVVP	8	206-235	LDDRNTFRHSVVVPYEPPEVGSDCTTIHYN	9
224-248	EVGSDCTTIHYNYMCNSSCMGGMNR	10	206-235	LDDRNTFRHSVVVPYEPPEVGSDCTTIHYN	9

表4：卵巢癌患者中的整个接种和分析过程

表5：分析表位对HLA结合的亲和力和稳定性以及一些优选肽的蛋白酶体加工

表6：以p53-SLP疫苗接种两次的结肠直肠癌患者的p53特异T细胞反应总结。

患者		1-78¹	70-115	102-155	142-203	190-248	241-393
患者		1-78¹	70-115	102-155	142-203	190-248	241-393	1	ELISPOT	-	-	-	+²	+	-
	LST	-	-	+	+	+	+	1	ELISPOT	-	-	-	+²	+	-
	LST	-	-	+	+	+	+
2	ELISPOT	-	-	-	+	+	-
2	ELISPOT	-	-	-	+	+	-		LST	-	-	-	+	+	+
									LST	-	-	-	+	+	+
								3	ELISPOT	-	+	-	-	-	-
	LST	-	-	-	-	+	-	3	ELISPOT	-	+	-	-	-	-
	LST	-	-	-	-	+	-
4	ELISPOT	+	+	+	+	+	+
4	ELISPOT	+	+	+	+	+	+		LST	-	-	-	+	-	-
									LST	-	-	-	+	-	-
								5	ELISPOT	-	-	-	-	-	-
	LST	-	-	-	-	-	-	5	ELISPOT	-	-	-	-	-	-
	LST	-	-	-	-	-	-
7	ELISPOT	-	-	-	-	-	+
7	ELISPOT	-	-	-	-	-	+		LST	-	-	+	-	+	-
									LST	-	-	+	-	+	-
								8	ELISPOT	-	-	+	+	+	-
	LST	-	-	-	-	-	-	8	ELISPOT	-	-	+	+	+	-
	LST	-	-	-	-	-	-
9	ELISPOT	-	+	+	+	+	-
9	ELISPOT	-	+	+	+	+	-		LST	-	-	-	-	+	-
									LST	-	-	-	-	+	-
								10	ELISPOT	-	-	-	-	-	-
	LST	-	-	+	+	+	-	10	ELISPOT	-	-	-	-	-	-
	LST	-	-	+	+	+	-	阳性总数pts		1	3	6	6	8	4

¹显示了被所使用肽池覆盖的p53蛋白氨基酸序列的最前和最后氨基酸的编号。最前和最后氨基酸为粗体的列显示了用在疫苗中的p53蛋白的部分。

²加号表示该患者显示了针对该p53肽池的疫苗诱导p53特异T细胞反应。

表7.卵巢癌患者中针对p53-SLP疫苗的细胞和体液的疫苗诱导T细胞反应和临床反应

¹4次免疫后通过IFN-γELISPOT测量的疫苗诱导T细胞反应。-无疫苗诱导的反应，+疫苗诱导的反应。²4次免疫后通过增殖测定测量的疫苗诱导T细胞反应。-无疫苗诱导的反应，+疫苗诱导的反应。³培养自皮肤活检组织的淋巴细胞通过增殖测定测量的p53特异反应。-无p53特异T细胞反应性，+p53特异T细胞反应性。⁴免疫后通过定量ELISA测量的血清p53IgG滴度。-无p53特异抗体，+p53特异抗体。⁵疫苗诱导的p53特异抗体滴度增加的倍数。⁶根据GCIG标准评估的CA-125水平。⁷根据RECIST标准评估的CT扫描。⁸由于临床上明显的快速进行性疾病而未通过CA-125水平或CT扫描评估的患者。na＝不可得，nt＝未终结的。

表9.经p53-SLP疫苗免疫的卵巢癌患者的新分离PBMC在四次免疫后的疫苗诱导p53特异T细胞反应，通过增殖测定进行分析。

¹通过增殖测定分析四次免疫之前和之后的p53特异反应的患者。²用于在体外刺激来自患者的PBMC 6天的p53肽池(疫苗肽或非疫苗肽)。通过³H胸苷掺入测量增殖。³反应描述为四次免疫后p53诱导增殖的均值除以免疫前p53诱导增殖的均值。＞2的反应被认为是疫苗诱导的反应。其它反应被认为是阴性的(-)。nt＝未测试。

表10.四次免疫后卵巢癌患者中根据血清CA-125水平和CT扫描的针对p53-SLP免疫治疗的临床反应。

¹根据RECIST标准评估的；²根据GCIG标准评估的

PD＝进行性疾病；SD＝稳定疾病；PR＝部分反应；ND＝未完成

^*2次免疫后临床上有进展的

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序列表

<110>莱顿教学医院

<120>p53肽疫苗

<130>P6014030PCT

<150>EP 07109802.4

<151>2007-06-07

<150>US 60/942,483

<151>2007-06-07

<150>EP 07109287.8

<151>2007-05-31

<150>US 60/941,070

<151>2007-05-31

<160>24

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>393

<212>PRT

<213>人

<400>1

Met Glu Glu Pro Gln Ser Asp Pro Ser Val Glu Pro Pro Leu Ser Gln

1 5 10 15

Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu

20 25 30

Ser Pro Leu Pro Ser Gln Ala Met Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp

35 40 45

Asp Ile Glu Gln Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro Asp Glu Ala Pro

50 55 60

Arg Met Pro Glu Ala Ala Pro Pro Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro

65 70 75 80

Thr Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser

85 90 95

Val Pro Ser Gln Lys Thr Tyr Gln Gly Ser Tyr Gly Phe Arg Leu Gly

100 105 110

Phe Leu His Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro

115 120 125

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130 135 140

Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val Arg Ala Met

145 150 155 160

Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val Val Arg Arg Cys

165 170 175

Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala Pro Pro Gln

180 185 190

His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val Glu Tyr Leu Asp Asp

195 200 205

Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu Pro Pro Glu

210 215 220

Val Gly Ser Asp Cys Thr ThrIle His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser

225 230 235 240

Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr

245 250 255

Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val

260 265 270

Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn

275 280 285

Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr

290 295 300

Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys

305 310 315 320

Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu

325 330 335

Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp

340 345 350

Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His

355 360 365

Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met

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<210>2

<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>肽

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Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser Val Pro Ser Gln Lys

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<210>3

<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>肽

<400>3

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1 5 10 15

Thr Ala Lys Ser Val Thr Cys Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Asn

20 25 30

<210>4

<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>4

Pro Val Gln Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr Arg Val

1 5 10 15

Arg Ala Met Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu

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<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>肽

<400>5

Val Arg Ala Met Ala Ile Tyr Lys Gln Ser Gln His Met Thr Glu Val

1 5 10 15

Val Arg Arg Cys Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp

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<210>6

<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>肽

<400>6

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1 5 10 15

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<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>肽

<400>7

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1 5 10 15

Ser Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg

20 25

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<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>肽

<400>8

Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn Tyr Met Cys Asn Ser

1 5 10 15

Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu ThrIle

20 25 30

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<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>肽

<400>9

Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe Glu Val

1 5 10 15

Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu

20 25 30

<210>10

<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>肽

<400>10

Arg Val Cys Ala Cys Pro Gly Arg Asp Arg Arg Thr Glu Glu Glu Asn

1 5 10 15

Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly

20 25 30

<210>11

<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>肽

<400>11

Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro Lys Lys

1 5 10 15

Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly

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<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>肽

<400>12

Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His

1 5 10 15

Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys

20 25 30

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<211>25

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>肽

<400>13

Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gln Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met

1 5 10 15

Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp

20 25

<210>14

<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>肽

<400>14

Leu Asp Asp Arg Asn Thr Phe Arg His Ser Val Val Val Pro Tyr Glu

1 5 10 15

Pro Pro Glu Val Gly Ser Asp Cys Thr Thr Ile His Tyr Asn

20 25 30

<210>15

<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>肽

<400>15

Arg Arg Cys Pro His His Glu Arg Cys Ser Asp Ser Asp Gly Leu Ala

1 5 10 15

Pro Pro Gln His Leu Ile Arg Val Glu Gly Asn Leu Arg Val

20 25 30

<210>16

<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>肽

<400>16

Ser Cys Met Gly Gly Met Asn Arg Arg Pro Ile Leu Thr Ile Ile Thr

1 5 10 15

Leu Glu Asp Ser Ser Gly Asn Leu Leu Gly Arg Asn Ser Phe

20 25 30

<210>17

<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>肽

<400>17

Leu Arg Lys Lys Gly Glu Pro His His Glu Leu Pro Pro Gly Ser Thr

1 5 10 15

Lys Arg Ala Leu Pro Asn Asn Thr Ser Ser Ser Pro Gln Pro

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<210>18

<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>肽

<400>18

Lys Pro Leu Asp Gly Glu Tyr Phe Thr Leu Gln Ile Arg Gly Arg Glu

1 5 10 15

Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu

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<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>肽

<400>19

Arg Phe Glu Met Phe Arg Glu Leu Asn Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp

1 5 10 15

Ala Gln Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser

20 25 30

<210>20

<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>肽

<400>20

Tyr Ser Pro Ala Leu Asn Lys Met Phe Cys Gln Leu Ala Lys Thr Cys

1 5 10 15

Pro Val Gln Leu Trp Val Asp Ser Thr Pro Pro Pro Gly Thr

20 25 30

<210>21

<211>30

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>肽

<400>21

Ala Pro Pro Val Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Thr Pro Ala Ala Pro

1 5 10 15

Ala Pro Ala Pro Ser Trp Pro Leu Ser Ser Ser Val Pro Ser

20 25 30

<210>22

<211>365

<212>PRT

<213>病毒

<400>22

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50 55 60

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Thr Ile Tyr Asn Ser Gln Tyr Ser Asn Glu Lys Trp Thr Leu Gln Asp

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Val Ser Leu Glu Val Tyr Leu Thr Ala Pro Thr Gly Cys Ile Lys Lys

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115 120 125

Met His Tyr Thr Asn Trp Thr His Ile Tyr Ile Cys Glu Glu Ala Ser

130 135 140

Val Thr Val Val Glu Gly Gln Val Asp Tyr Tyr Gly Leu Tyr Tyr Val

145 150 155 160

His Glu Gly Ile Arg Thr Tyr Phe Val Gln Phe Lys Asp Asp Ala Glu

165 170 175

Lys Tyr Ser Lys Asn Lys Val Trp Glu Val His Ala Gly Gly Gln Val

180 185 190

Ile Leu Cys Pro Thr Ser Val Phe Ser Ser Asn Glu Val Ser Ser Pro

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Glu Ile Ile Arg Gln His Leu Ala Asn His Pro Ala Ala Thr His Thr

210 215 220

Lys Ala Val Ala Leu Gly Thr Glu Glu Thr Gln Thr Thr Ile Gln Arg

225 230 235 240

Pro Arg Ser Glu Pro Asp Thr Gly Asn Pro Cys His Thr Thr Lys Leu

245 250 255

Leu His Arg Asp Ser Val Asp Ser Ala Pro Ile Leu Thr Ala Phe Asn

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275 280 285

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290 295 300

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Trp Thr Gly His Asn Val Lys His Lys Ser Ala Ile Val Thr Leu Thr

325 330 335

Tyr Asp Ser Glu Trp Gln Arg Asp Gln Phe Leu Ser Gln Val Lys Ile

340 345 350

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355 360 365

<210>23

<211>158

<212>PRT

<213>病毒

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1 5 10 15

Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp

20 25 30

Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu

35 40 45

Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly

50 55 60

Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile

65 70 75 80

Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu

85 90 95

Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn

100 105 110

Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys

115 120 125

Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met

130 135 140

Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu

145 150 155

<210>24

<211>98

<212>PRT

<213>病毒

<400>24

Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln

1 5 10 15

Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser

20 25 30

Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp

35 40 45

Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr

50 55 60

Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu

65 70 75 80

Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln

85 90 95

Lys Pro

Claims

1.源于已知与癌症相关的普遍表达自体蛋白的肽在制备用于治疗或预防所述疾病的药物中的用途，所述肽显示低至中等的形成稳定的细胞表面表达I类MHC复合物的能力，和/或不被蛋白酶体有效加工，和/或显示低至中等的MHC结合亲和力。

2.如权利要求1所述的肽的用途，其中所述肽显示低至中等的形成稳定的细胞表面表达I类MHC复合物的能力和/或不被蛋白酶体有效加工。

3.如权利要求1所述的用途，其中所述包含在所述肽内的表位的MHC结合亲和力包含于5μM至50μM。

4.如权利要求1或3所述的用途，其中包含在所述肽内的所述表位显示低至中等的形成稳定的I类MHC复合物的能力，其定义为20℃的IC₅₀大于4℃的IC₅₀的两倍但是IC₅₀＜15μM的表位的MHC结合亲和力，所述MHC结合亲和力在如实施例1中所述的基于竞争的细胞结合测定法中评价。

5.如权利要求1至4中任一项所述的用途，其中在蛋白酶体消化所述肽1小时后发现少于1％的经消化肽。

6.如权利要求1至5中任一项所述的用途，其中所述蛋白为癌蛋白，优选p53，且所述疾病优选癌症。

7.如权利要求6所述的用途，其中所述肽包含任意以下序列或由其组成或与其重叠：p5386-115、p53102-131、p53142-171、p53157-186、p53190-219、p53224-248、p53225-254、p53241-270、p53257-286和p53273-302。

8.如权利要求7所述的用途，其中所述肽包含任意以下序列或由其组成或与其重叠：p53142-171、p53157-186、p53190-219、p53224-248。

9.如权利要求7或8所述的用途，其中存在其它的肽，所述肽包含任意以下序列或由其组成或与其重叠：p5370-90、p53126-155、p53174-203、p53206-235。

10.如权利要求1至9中任一项所述的用途，其中所述药物还包含惰性的药物可接受载体和/或佐剂。

11.源于作为普遍表达的自体蛋白并已知与癌症相关的蛋白的肽，所述肽显示低至中等的形成稳定的细胞表面表达I类MHC复合物的能力，和/或不被蛋白酶体有效加工，和/或显示低至中等的MHC结合亲和力。

12.如权利要求11所述的肽，其中所述肽显示低至中等的形成稳定的细胞表面表达I类MHC复合物的能力和/或不被蛋白酶体有效加工。

13.如权利要求11所述的肽，其中包含在所述肽内的表位的MHC结合亲和力包含于5μM至50μM。

14.如权利要求11至13中任一项所述的肽，其中包含在所述肽内的所述表位显示低至中等的形成稳定的I类MHC复合物的能力，其定义为20℃的IC₅₀大于4℃的IC₅₀的两倍但是IC₅₀＜15μM的表位的MHC结合亲和力，所述MHC结合亲和力在如实施例1中所述的基于竞争的细胞结合测定法中评价。

15.如权利要求11至14中任一项所述的肽，其中在蛋白酶体消化所述肽1小时后发现少于1％的经消化肽。

16.如权利要求11至15中任一项所述的肽，其中所述蛋白为癌蛋白，优选p53，且所述疾病优选癌症。

17.如权利要求16所述的肽，其中所述肽包含选自p5386-115、p53102-131、p53142-171、p53157-186、p53190-219、p53224-248、p53225-254、p53241-270、p53257-286和p53273-302的肽或由其组成或与其重叠。

18.如权利要求17所述的肽，其中所述肽包含选自p53142-171、p53157-186、p53190-219和p53224-248的肽或由其组成或与其重叠。

19.肽组合物，其包含至少两种如权利要求17或18所述的肽，以及任选地包含选自p5370-90、p53126-155、p53174-203和p53206-235的肽的、或由其组成或与其重叠的任何肽。

20.如权利要求19所述的肽组合物，其中所述肽组合物还包含药物赋形剂和/或免疫调节剂。

21.如权利要求11至18中任一项所述的肽或如权利要求19或20所述的肽组合物用作药物。

22.设计源于作为已知与癌症相关的普遍表达自体蛋白(抗原)的蛋白的肽的方法，所述肽显示低至中等的形成稳定的细胞表面表达I类MHC复合物的能力，和/或不被蛋白酶体有效加工，和/或显示低至中等的MHC结合亲和力，且所述肽适合于制备用于治疗或预防癌症的药物。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述肽显示低至中等的形成稳定的细胞表面表达I类MHC复合物的能力和/或不被蛋白酶体有效加工。