CN101787393B

CN101787393B - 骨桥蛋白三个转录本快速诊断试剂盒及其使用方法

Info

Publication number: CN101787393B
Application number: CN 200910200727
Authority: CN
Inventors: 杨敏; 逄淑召; 高博; 郑梅珍; 曹跃琼
Original assignee: SHANGHAI GENECHEM CO Ltd
Current assignee: Shanghai Jikai Gene Medical Technology Co ltd
Priority date: 2009-12-24
Filing date: 2009-12-24
Publication date: 2013-01-09
Anticipated expiration: 2029-12-24
Also published as: CN101787393A

Abstract

本发明公开一种特异快速检测OPN三个转录本的试剂盒，包括试剂盒制备、组成及使用方法。该试剂盒能精确对OPN三个转录本进行定量，1.5h即可出结果。该试剂盒适用于临床及科研中对各种标本包括外周血、肿瘤组织、分泌液等进行OPN三个转录本的快速定量检测；以期通过此试剂盒检测结果判断肿瘤的生物特性，指导肿瘤诊断和治疗及愈后判断。

Description

骨桥蛋白三个转录本快速诊断试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及骨桥蛋白三个转录本快速诊断试剂盒。

背景技术

选择性剪接(Alternative splicing)是基因的一种基本而又重要的调控机制；基因选择性剪接与许多人类疾病密切相关，目前对基因选择性剪接现象的研究已经成为后基因组研究的重要组成部分。

人类基因组中有70％以上的基因存在不同剪接变异体，即同一个基因由于选择性剪接机制作用产生不同mRNA，这些mRNA表达的蛋白或者缺失或增加某一段氨基酸，导致某些功能区域丢失或增加，使得不同剪接变异体具有不同的功能。例如，p63转录本(亚型)：ΔNP63主要参与肿瘤的发生发展；TAP63通过激活p53诱导细胞周期阻遏和引发细胞凋亡。可见需要对基因尤其是疾病相关基因各个转录本进行特异性检测分析，才能精确判断与疾病相关的转录本，真正对疾病诊断和治疗提供准确、精细的基因靶标。

骨桥蛋白(osteopontin，OPN)是一种分泌性钙结合糖磷酸化蛋白，通过与与整合素、CD44等多种受体因子结合进而促进细胞趋化、粘附、迁移、增殖和血管生成。研究均表明在乳腺癌、胶质瘤、肝癌等多种人类恶性肿瘤中OPN呈现高表达。OPN被RNA干扰沉默后肿瘤细胞生长和侵袭能力明显减弱，说明OPN在肿瘤发生发展中扮演着重要的角色。另外发现OPN在人体内的功能呈“双刃剑”：即可诱导巨噬细胞发挥抗肿瘤免疫作用同时又可抑制巨噬细胞而抑制抗肿瘤免疫作用。究其原因可能是由于OPN基因不同剪接变异体(转录本)存在所致。

NCBI上报道OPN含有三个转录本：OPN-a(版本1，NM_001040058.1)涵盖全部的6个外显子；OPN-b(版本2，NM_000582.2)第4个外显子缺失，缺少72个氨基酸，216个核苷酸；OPN-c(版本3，NM_001040060.1)第3个外显子缺失，缺失58个氨基酸，175个核苷酸。

在乳腺癌组织中发现OPN-c呈现高表达，且其表达量与病人愈后呈现负相关。再次表明基因转录本的研究对于肿瘤的精确诊断、治疗均具有重大的价值和意义。针对转录本的特异抗体制备无论在技术和时间上均受到限制，而Real-time PCR技术是基因mRNA进行定量的快速方法，而且能间接反映蛋白水平。近年来Real-time PCR技术被用于肿瘤检测，敏感性比免疫组化提高10~100倍，在基因表达水平分析和定量检测等方面被广泛应用。该技术的关键是要获得特异性引物，由于基因不同转录本之间核苷酸差异不会很大，所以设计针对不同转录本的引物，获得特异性强的引物相对困难。

我们实验室通过专业软件和丰富的real-time PCR引物设计经验获得针对OPN三个转录本的特异性引物。结合SYBR-Green法获得特异检测OPN三个转录本的real-time PCR试剂盒，SYBR-Green是一种荧光染料，溶液中的SYBR-Green几乎不发任何荧光，但它嵌入到双链DNA分子中，构象发生变化，能够吸收497nm的激发光并发出520nm的荧光。SYBR-Green几乎不影响PCR反应，它在延伸阶段嵌合到DNA上，由于每个双链DNA分子能够结合的数目是一定的，所以通过荧光的增加可以反映PCR产物的增加。

发明内容

本发明的目的在于提供一套快速定量检测肿瘤OPN三个转录本的诊断试剂盒，通过对OPN三个转录本的定量，鉴定不同肿瘤中OPN三个转录本的表达水平，既为肿瘤早期诊断和愈后提供重要的辅助指标，又可根据肿瘤当前的主要生物特征指导肿瘤用药，提高药效、减少毒副作用。

本发明的另外目的在于提供OPN三个转录本定量检测试剂盒的使用方法及其应用。

本发明一方面提供了一种OPN三个转录本快速定量试剂盒，包括OPN三个转录本的特异性引物组。

所述OPN三个转录本的特异性引物组包括OPN三个转录本OPN-a、OPN-b和OPN-c的特异性引物。

所述OPN-a的特异性引物优选：正向引物：5’-GCTTTACAACAAATACCCAGATGC-3’(SEQ IDNO：1)；反向引物：5’-TGGACTTACTTGGAAGGGTCTC-3’(SEQ ID NO：2)。

所述OPN-b的特异性引物优选：正向引物：5’-AGGCTGATTCTGGAAGTTCTG-3’(SEQ IDNO：3)；反向引物：5’-TGGACTTACTTGGAAGGGTCTG-3’(SEQ ID NO：4)。

所述OPN-c的特异性引物优选：正向引物：5’-TGAGGAAAAGCAGAATGCTG-3’(SEQ IDNO：5)；反向引物：5’-GTCAATGGAGTCCTGGCTGT-3’(SEQ ID NO：6)。

OPN三个转录本的特异性引物组是本发明试剂盒的关键，基于试剂盒采用的是实时定量PCR来进行定量检测，所以试剂盒中还可以包括其他一些试剂，如：总RNA抽提试剂、RNA逆转录试剂、标准品、内参基因引物以及以SYBR-Green为染料的Real-time PCR反应试剂中的一种或多种。具体需要将那些试剂装配入试剂盒，可以根据实际需要配置。

所述总RNA抽提试剂可采用各种常规的抽提RNA的试剂，优选Trizol总的RNA抽提液，该抽提液可市购获得。

所述RNA逆转录试剂可选用常规的用于RNA逆转录的试剂，包括：逆转录酶、逆转录引物、dNTP、RNasin等，所述逆转录酶优选M-MLV，该酶可市购获得。所述逆转录引物优选OligodT。

所述以SYBR-Green为染料的Real-time PCR反应试剂主要包括Taq酶、缓冲体系及Sybr-Green荧光染料，此类反应试剂为已知技术，如可采用SYBR premix ex Tag，此产品可由TAKARA公司购得。

所述内参基因引物为任一管家基因的引物，内参基因引物的设计可采用公知技术，如人的β-Actin的引物：正向引物：5’-TCGTGCGTGACATTAAGGAG-3’(SEQ ID NO：7)；反向引物：5’-AAGGTAGTTTCGTGGATGCC-3’(SEQ ID NO：8)。

所述标准品包括分别用OPN三个转录本质粒配置的不同稀释浓度的溶液。标准品还可包括用内参基因质粒配置的不同稀释浓度的溶液。优选的，标准品的浓度为1×10²-1×10¹⁰拷贝/ml。OPN三个转录本质粒可经市购途径获得，如由上海吉盛生物科技有限公司购得。

所述试剂盒中还含有阴性对照。阴性对照为不含OPN任何转录本的样品(标准品的空载体)。

本发明第二方面，公开了上述试剂盒的使用方法，包括下列步骤：

1)采用总RNA抽提液抽提样本总RNA；

2)以步骤1)获得的样本总RNA为模板，用逆转录酶及逆转录引物逆转录获得cDNA；

3)Real-time PCR：分别以步骤2)获得的cDNA及标准品为模板，分别加入OPN三个转录本的特异性引物及内参基因引物后，再与以SYBR-Green为染料的Real-time PCR反应试剂混合进行Real-time PCR及检测；

4)对步骤3)的检测结果进行数据分析。根据绘制的标准曲线得到OPN三个转录本及内参对应管家基因表达的相对浓度，以OPN三个转录本和管家基因的相对浓度的比值反映OPN三个转录本的相对表达量。

较佳的，上述步骤3Real-time PCR的反应条件为：95℃变性15秒；95℃5秒；60℃，30秒，共40循环；每个循环后自动读数1次，72℃30秒处采集荧光信号。

较佳的，上述步骤3 Real-time PCR的反应体系为：SYBR premix ex tag 10μl；正反引物各0.25μl；模板1.0μl；总体积20μl；其余用灭菌双蒸水补平。

较佳的，步骤4采用2-ΔΔCt分析；制图软件为GraphPad PRISM 4.0。

所述样本可为人的组织、血液或细胞。OPN在大多数肿瘤中高表达，通过对肿瘤患者的外周血、肿瘤组织、分泌液等标本进行OPN三个转录本的表达检测，结合随访资料获得三个转录本与肿瘤生物特征的相关性，可以辅助肿瘤的诊断和愈后治疗。

本发明优点：

1、本试剂盒具有极高的特异性

2、可以对肿瘤生物特性进行辅助鉴别(肿瘤生物特征与OPN三个转录本表达量相关)

3、该检测方法灵敏度高、定量准确

4、该检测方法步骤简单、耗时短

5、用于检测的样品量极少

6、可检测多种样品(肿瘤组织、外周血、分泌液等均适用)

7、可同时高通量对样品进行检测

附图说明

图1为OPN三个转录本mRNA的差异比较图

图2为OPN三个转录本对应引物PCR产物琼脂糖电泳图

标注为：1.opn-a扩增产物；2.opn-b扩增产物；3.opn-c扩增产物；M.DNA marker

图3为OPN三个转录本对应引物溶解曲线图

图4为试剂盒制备及使用流程

图5为OPN三个转录本PCR扩增opn三转录本片段琼脂糖电泳图

具体实施方式

以下列举具体实例以进一步阐述本发明，应理解，实例并非用于限制本发明的保护范围。

实施例1：OPN三个转录本定量检测试剂盒制备

1、OPN三个转录本特异引物设计、合成、检测

针对OPN三个转录本mRNA的差异序列(图1及下表)进行引物设计及合成；

opn	ACCESSION	mRNA	分子量(kDa)
				版本1(a)	NM_001040058	1641bp	35
版本3(c)	NM_001040060	1560bp	32
				版本2(b)	NM_000582	1616bp	33

以opn三个转录本的质粒混合液为模板进行PCR扩增，产物进行琼脂糖电泳确定引物的特异性(图2)，由图可见三对引物扩增条带单一，即只能以各自针对的转录本为模板扩增出单一产物，说明引物特异性高。

三个转录本特异引物信息如下：

上述引物合成后，分别置于密闭容器中或配对混合后分别置于密闭容器中即获得OPN三个转录本的特异性引物组，装配获得试剂盒。也可按需要与其他独立置于密闭容器中的试剂一起装配入试剂盒。

内参Actin引物信息：

上述两引物合成后，分别置于密闭容器中或等量混合后置于密闭容器，装配入上述试剂盒。

2、OPN三个转录本检测试剂盒反应体系和条件确定

反应体系：

试剂	体积(μl)
		Sybr premix ex Tag	10
正向引物+反向引物	0.25+0.25

[0061]

cDNA	1.0
		ddH₂O	8.5
总体积	20

针对OPN三个转录本的三对引物和针对内参基因如β-Actin-的一对引物分别进行PCR。

以待测样品的cDNA和标准品为模板分别进行PCR。

反应条件：

制作熔解曲线：(结果如图3所示)

实施例2：OPN三个转录本快速定量试剂盒检测组织样本

1、样品准备

微量样品即可，可以是新鲜肿瘤组织或液氮保存的肿瘤组织，也可以是外周血；每次均设阴性对照组和阳性对照组，标准品用灭菌双蒸水稀释为1×10²~1×10⁹拷贝/ml。

待测样本：组织样品

阴性对照：质粒空载体

阳性对照：标准品

2、总RNA抽提(根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书进行)

1)将全部组织块用机械匀浆器彻底匀浆，溶解于Trizol中，室温静置5min，然后转移至新的1.5ml eppendorf管中

2)每管加入200μl氯仿，用手上下颠倒eppendorf管15s，室温静置10min

3)4℃，12000rpm，离心15min

4)吸取上清移至新的1.5ml eppendorf管，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后4℃沉淀10min

5)4℃，12000rpm离心10min后，去上清

6)加入至少1ml 75％乙醇(用DEPC处理过的水新鲜配制)，洗涤沉淀

7)4℃，10000rpm离心5min，弃去大部分上清

8)4℃，10000rpm再次离心5min，吸去上清

9)室温干燥

10)待RNA基本透明时，加入20μl RNase-free水，至完全溶解，紫外分析测定所抽提RNA的浓度

3、cDNA获得(逆转录反应)

RNA逆转录获得cDNA(根据Promega公司的M-MLV操作说明书进行)

M-MLV逆转录酶和dNTP购自Promega公司，Oligo dT购自上海生工，RNase-free的物品都购自Axygen，具体步骤如下：

1)将1μl Oligo dT(0.5μg/μl)和2.0μg Total RNA加入到PCR小管中，补充RNase-freeH₂O至9ul；混匀后离心，70℃温浴10min；之后立即置于0℃冰水混合物中冰浴，使OligodT和模板退火

2)按下表的比例配制反应体系(冰上进行)，混匀，短暂离心

试剂	每管加入量
		5×RT buffer	4μl
10mM dNTPs	2μl
		RNasin	0.5μl
M-MLV-RTase	1μl
		RNA-free H₂O	3.5μl

3)上述体系在42℃反应1h，然后在70℃水浴锅中水浴10min使RT酶失活

4)将得到的RT产物--cDNA置于-80℃保存备用

4、SYBR Green Real-time PCR(按实施例1中的“OPN三个转录本检测试剂盒反应体系和条件确定”中的反应体系及方法进行)

5、统计方法

Real-time PCR数值分析采用2-ΔΔCt分析法

制图软件：GraphPad PRISM 4.0

6、OPN三个转录本表达的相对定量分析

标准品的制备：将从吉盛生物技术有限公司购得的质粒用灭菌双蒸水稀释为1×10²~1×10⁹拷贝/ml。

每次使用1份标准品分别对OPN三个转录本和Actin进行定量扩增，制作标准曲线。根据绘制的标准曲线回归公式得到OPN三个转录本及Actin基因表达的相对浓度，以二者的比值来反映OPN转录本的表达量，每个样品均设3个复孔。

检测结果：

目的基因	Ct(三复孔)	Ct 平均值	标准曲线回归公式 (y：每ul模板溶液中的模板拷贝数的 Lg值；X：Ct值)	y值，即 Lg(copy/ul)	Z值：每ul 模板溶液中的模板拷贝数 (copy/ul)	每ul样本cDNA原液中的copy数＝Z*待测模板稀释倍数(此处为4.4)
							ACTIN	18.5	18.4	y＝-0.241x+12.95	8.52	3.33E+08	1.47E+09
	18.26
								18.34
OPN-A	21.63	21.4	y＝-0.282x+11.98	5.96	9.05E+05	3.98E+06
								21.43
	21.01
							OPN-B	22.12	22.2	y＝-0.319x+13.53	6.44	2.73E+06	1.20E+07
	22.15
								22.45
OPN-C	27.06	27.1	y＝-0.313x+13.22	4.75	5.59E+04	2.46E+05
								26.87
	27.27

实施例3试剂盒特异性检验

以实施例2中的组织样本cDNA为模板，用opn三转录本引物PCR扩增opn三转录本片段，扩增产物琼脂糖电泳，结果见图5：(标注说明：1.opn-a扩增产物；2.opn-b扩增产物；3.opn-c扩增产物。)

该结果说明，在opn三个转录本都有表达的组织样本中(参照实施例2的结果)，三个转录本引物只能特异性扩增出对应转录本的片段，而不能扩增出其他2个转录本的片段，表明该试剂盒对opn三转录本的表达是特异性的。

序列表

<110>上海吉凯基因化学技术有限公司

<120>骨桥蛋白三个转录本快速诊断试剂盒及其使用方法

<130>081182

<160>8

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>1

gctttacaac aaatacccag atgc 24

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>2

tggacttact tggaagggtc tc 22

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>3

aggctgattc tggaagttct g 21

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>4

tggacttact tggaagggtc tg 22

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>5

tgaggaaaag cagaatgctg 20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>6

gtcaatggag tcctggctgt 20

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>7

tcgtgcgtga cattaaggag 20

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>引物

<400>8

aaggtagttt cgtggatgcc 20

Claims

1.一种OPN三个转录本快速定量试剂盒，包括OPN三个转录本的特异性引物组，所述OPN三个转录本的特异性引物组包括OPN三个转录本OPN-a、OPN-b和OPN-c的特异性引物，所述OPN-a的特异性引物为：正向引物：5’-GCTTTACAACAAATACCCAGATGC-3’；反向引物：5’-TGGACTTACTTGGAAGGGTCTC-3’；所述OPN-b的特异性引物为：正向引物：5’-AGGCTGATTCTGGAAGTTCTG-3’；反向引物：5’-TGGACTTACTTGGAAGGGTCTG-3’；所述OPN-c的特异性引物为：正向引物：5’-TGAGGAAAAGCAGAATGCTG-3’；反向引物：5’-GTCAATGGAGTCCTGGCTGT-3’。

2.如权利要求1所述OPN三个转录本快速定量试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括：总RNA抽提试剂、RNA逆转录试剂、标准品、内参基因引物、阴性对照以及以SYBR-Green为染料的Real-time PCR反应试剂中的一种或多种。

3.如权利要求2所述OPN三个转录本快速定量试剂盒，其特征在于，所述总RNA抽提试剂为Trizol总的RNA抽提液。

4.如权利要求2所述OPN三个转录本快速定量试剂盒，其特征在于，所述RNA逆转录试剂包括逆转录酶M-MLV，及逆转录引物Oligo dT。

5.如权利要求2所述OPN三个转录本快速定量试剂盒，其特征在于，所述以SYBR-Green为染料的Real-time PCR反应试剂为SYBR premix ex Tag。

6.如权利要求2所述OPN三个转录本快速定量试剂盒，其特征在于，所述内参基因引物为人的β-Actin的引物。