CN101701039B

CN101701039B - Fmu-epcam-2a9单克隆抗体的轻链和重链可变区

Info

Publication number: CN101701039B
Application number: CN2009102187952A
Authority: CN
Inventors: 金伯泉; 杨琨; 张葵; 宋朝君; 孙元杰; 谢鑫; 朱参胜
Original assignee: Fourth Military Medical University FMMU
Current assignee: Fourth Military Medical University FMMU
Priority date: 2009-11-06
Filing date: 2009-11-06
Publication date: 2011-10-26
Anticipated expiration: 2029-11-06
Also published as: CN101701039A

Abstract

本发明公开了FMU-EPCAM-2A9单克隆抗体的轻链和重链的可变区，单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。通过重组人EPCAM免疫BALB/c小鼠，制备了一组小鼠抗人EPCAM单克隆抗体，筛选出能稳定分泌高亲和力抗人EPCAM单克隆抗体的杂交瘤细胞株，制备腹水获得高亲和力的抗人EPCAM单克隆抗体。确认该基因序列和相应蛋白序列的惟一性及其CDR序列；为抗人EPCAM嵌合或人源化基因工程抗体提供支持。

Description

FMU-EPCAM-2A9单克隆抗体的轻链和重链可变区

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种单克隆抗体，特别涉及一种抗人EPCAM的FMU-EPCAM-2A9单克隆抗体的轻链和重链可变区，包括其氨基酸序列和核苷酸序列。

背景技术

上皮细胞黏附分子(EPCAM)最初是作为结肠癌的优势表位被发现，当时认为其作用是细胞黏附和治疗用抗体的可靠结合位点。目前研究认为，EPCAM是糖基化的I型跨膜糖蛋白，分子量为30到40kD，其结构包括有一个表皮生长因子样和一个甲状腺球蛋白样的胞膜外区，一段跨膜区和一段26个氨基酸的胞浆区。在正常细胞中EPCAM主要位于上皮细胞间隙的紧密连接处。由EPCAM表达的强度和频率显示，其基本上高表达于所有人类腺癌、部分鳞状细胞癌、视网膜母细胞瘤和肝细胞癌。

2007年以前对EPCAM功能方面的研究发现：EPCAM在细胞增殖、迁移和信号转导中具有重要作用。例如：EPCAM在人和啮鼠动物细胞的增强表达，增强了细胞锚定和血清生长因子非依赖的增殖并且增加了如c-myc和cyclins在内的各种靶基因的表达；在乳腺癌细胞系，EPCAM信号经RNA干涉，可造成细胞增殖、迁移和侵袭能力的降低。

最近的研究证实：EPCAM可以作为一些实体肿瘤干细胞的表面标志物之一，也可以作为正常干细胞表面标志物的组成部分。同时，研究结果还很好地解释了EPCAM在肿瘤细胞高表达的原因，并且发现其与一些肿瘤患者预后较差和生存率较低有关；并进一步解释了EPCAM与肿瘤的关系。此外，小鼠胚胎干细胞实验证实，EPCAM在肿瘤干细胞、正常干细胞上的高表达和其自身正反馈的上调，对确保维持这些正常干细胞及以恶性干细胞的增殖非常重要。

抗EPCAM抗体用于肿瘤治疗的研究一直是抗体治疗研究的热点。早在1979年开发的鼠源性的抗EPCAM抗体17-1A，于1982年就用于对肿瘤的临床治疗。但是鼠源性抗体药物在人体使用时，由于其具有免疫原性，会引起人体的免疫反应，从而造成对抗体药物的清除或免疫复合物介导的超敏反应。对鼠源性抗体基因改造可以部分解决其免疫原性问题，如构建嵌合抗体或人源化抗体等。

抗体单体分子是由两条相同的重链(H链)和两条相同的轻链(L链)，通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。H链和L链包括氨基(N)端和羧基(C)端，靠近N端的可变区(V区)由高变区/互补决定区(HVR/CDR)和骨架区(FR)组成；靠近C端为恒定区(C区)。重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)形成的蛋白质折叠是抗原结合部位，其中的CDR/HVR是抗体与抗原决定基互补结合的部位，C区引发抗原抗体识别后的反应。抗体根据FR/C区不同可分为人源、鼠源等，鼠源性抗体在人体内使用时具有免疫原性，易引起人体的免疫反应，这些免疫反应可引起对鼠源性抗体的清除以及免疫复合物介导的超敏反应。为了克服鼠源性抗体的缺陷，需要构建高亲和力的特异性的嵌合抗体、单链抗体或人源化抗体。

在改造过程中，最为重要的是首先必须获得具有良好特异性和亲和力鼠源性亲本抗体，克隆其轻链和重链可变区基因，然后将这两条基因进行改造，构建重组抗体基因。针对这些问题，抗EPCAM治疗性抗体的研发不断取得进展，抗EPCAM的大鼠和小鼠双特异性抗体Catumaxomab，单链抗体Proxinium，人源化抗体ING-1，人源化的融合抗体EMD和完全人源化抗体Adecatumumab(MT201)等先后进入临床治疗肿瘤的研究。目前在临床试验中，通过改造的抗体Adecatumumab治疗乳腺癌取得了良好的效果。因此，筛选出高亲和力鼠源性抗人EPCAM单克隆抗体，从中克隆出轻、重链可变区基因，对进一步改善以EPCAM为靶点的药物的制备和对肿瘤的治疗具有非常重要的意义。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种抗人EPCAM的FMU-EPCAM-2A9单克隆抗体的轻链和重链可变区，包括其氨基酸和核苷酸序列，为构建高亲和力的抗EPCAM嵌合或人源化基因工程抗体提供支持。

本发明是通过以下技术方案来实现：

FMU-EPCAM-2A9单克隆抗体的轻链和重链可变区，所述轻链可变区的3个互补决定区(CDR)序列分别为：

CDRl：Gln-Ser-Leu-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Lys-Thr-Tyr；

CDR2：Val-Val-Ser-Lys-Leu-Asp-Ser；

CDR3：Trp-Gln-Gly-Thr-His-Phe-Pro-Trp-Thr；

所述重链可变区的3个互补决定区(CDR)序列分别为：

CDR1：Gly-Tyr-Ser-Phe-Thr-Ser-Tyr-Trp；

CDR2：Ile-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ser-Ala；

CDR3：Ile-Arg-Gly-Gly-Asn-Tyr。

所述的单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的编码单克隆抗体轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.3所示，编码单克隆抗体重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.4所示。

所述的单克隆抗体应用于构建以人EPCAM为靶点的基因工程抗体或诊断试剂的制备。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

1、本发明提供的FMU-EPCAM-2A9单克隆抗体是一种抗人EPCAM的高亲和力的单克隆抗体，经过间接ELISA检测、流式细胞仪检测及病理切片免疫组织化学检测证实该单克隆抗体能够特异性地结合人EPCAM；

克隆该单克隆抗体轻链、重链可变区基因和氨基酸序列，序列分析证实了该抗体序列的惟一性。

2、分析获得轻链、重链可变区的CDR区，在此基础上为构建高亲和力的抗人EPCAM嵌合或人源化基因工程抗体提供支持。

附图说明

图1是抗人EPCAM的FMU-EPCAM-2A9单克隆抗体与COLO205和SKBr-3细胞系表面表达的EPCAM结合的流式细胞仪检测结果图；图1a为与COLO205细胞系结合检测结果图，图1b为与SKBr-3细胞系结合检测结果图；其中，FITC：异硫氰酸荧光素，横轴为荧光强度，纵轴为相对细胞计数，M1表示阳性细胞范围；

图2是抗人EPCAM的FMU-EPCAM-2A9单克隆抗体与结肠癌标本中表达的EPCAM结合的免疫组织化学染色检测结果图；图2a为200倍镜检观测，图2b为400倍镜检观测；

图3是抗人EPCAM的FMU-EPCAM-2A9单克隆抗体轻链可变区基因同源性序列检测结果图；

图4是抗人EPCAM的FMU-EPCAM-2A9单克隆抗体重链可变区基因同源性序列检测结果图；

图5是抗人EPCAM的FMU-EPCAM-2A9单克隆抗体轻链可变区氨基酸同源性序列检测结果图；

图6是抗人EPCAM的FMU-EPCAM-2A9单克隆抗体重链可变区氨基酸同源性序列检测结果图。

具体实施方式

申请人用重组人EPCAM免疫BALB/c小鼠，制备了一组小鼠抗人EPCAM单克隆抗体，筛选出能稳定分泌高亲和力抗人EPCAM的FMU-EPCAM-2A9单克隆抗体的杂交瘤细胞株，制备腹水获得高亲和力的抗人EPCAM单克隆抗体。确认该基因序列和相应蛋白序列的惟一性及其CDR序列；为抗人EPCAM嵌合或人源化基因工程抗体提供支持。

下面结合附图对本发明做详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明具体按以下步骤实施：

1小鼠抗人EPCAM高亲和力抗体的制备

1.1单克隆抗体的制备、纯化

参照GENBANK NM_002354序列设计引物，并扩增编码人EPCAM胞膜外区蛋白的基因；然后将此基因克隆入pGEX-4T-3载体中，构建原核表达载体并转染宿主细胞；再通过IPTG诱导，冻融加超声裂解法获得重组人EPCAM胞膜外区的可溶蛋白。

按单克隆抗体制备方法(细胞和分子免疫学实验技术第一版，P9-P17)，用重组人EPCAM胞膜外区蛋白免疫BALB/c小鼠(购自第四军医大学实验动物中心)；初次免疫，使用福氏完全佐剂，后续免疫使用福氏不完全佐剂，每次间隔3周，均为皮下多点注射，共免疫4次。末次免疫7-10天后采血测其效价，检测免疫效果。间隔2-3周后，经静脉注射抗原再加强免疫，3天后处死动物取脾进行细胞融合。

取对数生长的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0计数，同时制备免疫脾细胞悬液。将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10比例混合进行细胞融合。融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，37℃、5％CO₂孵箱培养。待克隆出现后，间接ELISA检测，挑选阳性克隆。对含有阳性克隆孔的细胞采用有限稀释法进行克隆化，直至获得能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞系(体外连续培养超过6个月)，并对其进行常规核型鉴定和Ig亚类测定(结果为IgG2a亚类)。

在获得能够稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株后，按小鼠腹水制备方法制备包含单克隆抗体的腹水(细胞和分子免疫学实验技术第一版，P9-P17)。腹水经40％饱和硫酸铵沉淀后，采用QFF阴离子交换层析法纯化。用SDS-PAGE鉴定纯化抗体的纯度，纯化的单克隆抗体FMU-EPCAM-2A9纯度达到95％。

1.2抗人EPCAM单克隆抗体效价测定

用间接ELISA方法测定纯化前腹水以及纯化后mAb的相对亲和力。其中包被抗原为重组人EPCAM胞膜外区的可溶蛋白，待测样品为系列稀释的腹水以及纯化后mAb，检测抗体为羊抗鼠-HRP酶标记抗体，底物使用ABTS。所筛选出的高亲和力FMU-EPCAM-2A9mAb，腹水效价为1×10^-7，纯化后效价为0.5ng/ml，而一般采用间接ELISA检测腹水效价达1×10^-5以上的抗体即可使用。

1.3流式细胞术荧光染色检测抗人EPCAM单克隆抗体FMU-EPCAM-2A9与细胞表面EPCAM结合的活性

以SEDmAb作为阴性抗体对照，流式细胞术检测FMU-EPCAM-2A9mAb与COLO205和SKBr-3细胞系表面表达的EPCAM的结合；

COLO205和SKBr-3细胞系用10％FCS-RPMI1640培养基培养至对数生长期，调整细胞浓度为5×10⁶～1×10⁷/ml；取50μl细胞悬液并加入特异性FMU-EPCAM-2A9mAb腹水1μl，再加1μl灭活正常兔血清，4℃孵育30min；同样的方法制备阴性对照组。

用洗涤液(5％FCS-PBS-4％NaN₃)洗涤细胞2次，每次加洗涤液2ml，1000rpm×5min离心后弃上清；加入100μl工作浓度的羊抗鼠荧光标记抗体，充分振摇，4℃孵育30min；

用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml，1000rpm×5min离心后弃上清；加一定量的固定液，然后进行流式细胞术分析FMU-EPCAM-2A9mAb与细胞表面的EPCAM结合情况；

结果如图1所示，在COLO205细胞系：与阴性对照相比，结合了FMU-EPCAM-2A9mAb而落入M1阳性细胞范围的COLO205细胞达46％；

在SKBr-3细胞系：与阴性对照相比，结合了FMU-EPCAM-2A9mAb而落入M1阳性细胞范围的SKBr-3细胞达24％；

以上流式细胞术荧光染色检测表明FMU-EPCAM-2A9mAb可以识别并结合COLO205和SKBr-3细胞表面表达的天然EPCAM。

1.4免疫组织化学染色检测FMU-EPCAM-2A9mAb与结肠癌标本中EPCAM的结合

结肠癌石蜡切片(第四军医大学病理教研室提供)，分别通过二甲苯I、II，100％酒精I、II，95％、90％、80％和70％酒精各10min，使脱蜡至水；0.3％甲醇-H₂O₂作用切片30min以灭活内源性过氧化物酶；0.01M PBS(pH7.3)漂洗10min，漂洗3遍；95℃抗原修复液(购自福州迈新生物技术开发有限公司)作用20min；封闭30min(封闭液为1％正常兔血清或5％正常羊血清)；

加一抗(1∶100稀释的FMU-EPCAM-2A9mAb腹水)，4℃湿盒孵育18h以上；0.01M PBS(pH7.3)漂洗10min×3遍；加入HRP标记的羊抗鼠二抗，室温湿盒孵育2h～3h；

0.01M PBS(pH7.3)漂洗10min×3遍；DAB显色7～8min后PBS终止。

光镜下观察，苏木精复染10～20s；结果如图2所示，结肠癌标本上结合了FMU-EPCAM-2A9mAb的部位呈现棕色，说明可以识别结肠癌标本表达的EPCAM。

通过上述3种FMU-EPCAM-2A9mAb结合实验，在不同水平的鉴定结果表明，FMU-EPCAM-2A9mAb既可以识别重组表达的EPCAM(间接ELISA检测)，又可以识别细胞系和组织表面天然表达的EPCAM(免疫组织化学染色)，说明FMU-EPCAM-2A9mAb与相应抗原EPCAM结合具有良好的特异性和亲和力。

2抗人EPCAM的FMU-EPCAM-2A9单克隆抗体轻链和重链可变区基因的克隆

2.1FMU-EPCAM-2A9杂交瘤细胞的培养

按常规方法复苏(细胞培养，第一版，P88)FMU-EPCAM-2A9杂交瘤细胞，用含10％小牛血清的RPMI 1640培养基于37℃，5％CO₂孵箱中培养至对数生长期。

2.2总RNA的提取和cDNA第一链的合成

用TRIZOL Reagent(购自美国GIBCO公司)，按说明书提取总RNA。

2.3RT-PCR法扩增FMU-EPCAM-2A9mb的VL和VH基因

一步法RT-PCR扩增试剂盒购自TakaRa公司，按试剂盒说明书扩增FMU-EPCAM-2A9mAb的VL和FMU-EPCAM-2A9mAb的VH基因；

利用VL F(上游引物)和VL B(下游引物)以及VH F和VH B两对引物，以总RNA为模板进行RT-PCR；

反应体积50μl，反应条件为：94℃5min；95℃30s，58℃1min，72℃1min，循环35次；72℃7min；引物序列为：

VL F：gttagatctc cagcttggtc cc 22；

VL B：gacattcagc tgacccagtc tcca 24；

VH F：tgaggagacg gtgaccgtgg tcccttggcc ccag 34；

VH B：aggtsmarct gcagsagtcw gg 22；

(IUB标准兼并碱基代码：s:c/g；m:a/c；r:a/g；w:a/t)

2.4PCR扩增产物的克隆和筛选

PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，用小量胶回收试剂盒(购自上海华舜生物工程有限会司)回收PCR扩增片段，用DNA连接试剂盒(购自TakaRa公司)将该片段按说明书，利用加A尾插入pMD-T18载体(购自TakaRa公司)中，连接物转化E.coli(购自中国普通微生物菌种保藏中心，CGMCC，北京)，在Amp抗性LB琼脂培养平皿中37℃培养过夜。

挑取LB琼脂培养平皿中克隆，在Amp抗性LB培养基中37℃摇菌过夜，以1μl菌液为模板，通过上述针对轻链、重链可变区设计的引物，用PCR法筛选重组阳性E.coli克隆；

将所获得重组阳性E.coli克隆摇菌，菌液送交上海生物工程技术服务有限公司完成基因序列测定，轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.3所示，重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.4所示。

3FMU-EPCAM-2A9mAb轻链和重链可变区的核苷酸序列及同源性分析

3.1确定测序无误后，在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库中，进行核苷酸序列同源性分析(Blastn)。

FMU-EPCAM-2A9mAb轻链可变区基因与编号为GeneID：243420的小鼠Ig轻链可变区基因同源性最高，达292/299(97％)，如图3所示；

FMU-EPCAM-2A9mAb重链可变区基因与编号为GeneID：668469的小鼠Ig重链可变区基因同源性最高，为262/288(90％)，如图4所示。

同源性分析表明，编码FMU-EPCAM-2A9mAb的轻、重链可变区的核苷酸序列，尽管与其它基因序列有一定同源性，但未发现与本发明完全相同的基因序列，表明本发明在基因序列上具有惟一性。

3.2将可变区基因翻译成氨基酸序列，进行氨基酸序列分析

单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在non-redundant Genbank CDS translations+PDB+SwissProt+PIR+PRF蛋白质数据库中，进行氨基酸序列同源性分析(Blastp)。

分析结果表明，FMU-EPCAM-2A9mAb轻链氨基酸序列与编号为ABR32168.1GI：149799217的小鼠Igκ链同源性最高，达106/111(95％)，如图5所示；

FMU-EPCAM-2A9mAb重链氨基酸序列与编号为S55541 GI：1363159的小鼠Ig重链蛋白的同源性最高，为98/117(83％)，如图6所示。

同源性分析表明，FMU-EPCAM-2A9mAb轻、重链可变区的氨基酸序列，尽管与其它蛋白氨基酸序列有一定同源性，但未发现与本发明完全相同的氨基酸序列，表明本发明在氨基酸序列上也具有惟一性。

3.3利用IMGT/V-QUEST分析可变区结构，确定CDR区。

将测序所得FMU-EPCAM-2A9mAb抗体轻链和重链可变区序列，在IMGT/V-QUEST网站(http://imgt.cines.fr/IMGT_vquest/vquest)分析，得出其CDR区。

轻链可变区的3个互补决定区(CDR)序列，如SEQ ID NO.1划线部分所示，具体为：

CDR1：Gln-Ser-Leu-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Lys-Thr-Tyr；

CDR2：Val-Val-Ser-Lys-Leu-Asp-Ser；

CDR3：Trp-Gln-Gly-Thr-His-Phe-Pro-Trp-Thr；

所述重链可变区的3个互补决定区(CDR)序列如SEQ ID NO.2划线部分所示，具体为：

CDR1：Gly-Tyr-Ser-Phe-Thr-Ser-Tyr-Trp；

CDR2：Ile-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ser-Ala；

CDR3：Ile-Arg-Gly-Gly-Asn-Tyr。

4.基因工程抗体设计

基于抗人EPCAM单克隆抗体FMU-EPCAM-2A9的表达、纯化以及序列分析，设计构建以下生物制品

1)单链抗体的构建：可将本发明的FMU-EPCAM-2A9mAb轻、重链可变区基因通过linker连接，插入原核或真核表达载体，转化宿主菌或转染真核细胞，用于制备可对乳腺癌、结肠癌和胰腺癌等肿瘤有治疗作用的单链抗体。

2)人-鼠抗EPCAM嵌合抗体的构建：可将本发明的FMU-EPCAM-2A9mAb轻、重链可变区基因插入通用型嵌合抗体表达载体中，获得含嵌合基因的载体转染真核细胞，用于制备可望对乳腺癌、结肠癌和胰腺癌等肿瘤有治疗作用的嵌合抗体。

3)人源化抗体的构建：可将本发明的FMU-EPCAM-2A9mAb轻、重链可变区基因的CDR区移植到人源抗体可变区的骨架区(FR)中，形成互补决定区(CDR)移植抗体(CDR-grafted antibody)，也称重构抗体(reshapingantibody)或人源化抗体(humanized antibody)。

利用CDR移植技术改造抗体，可以获得既保持鼠源性亲本mAb特异性，又更加接近人抗体的新型抗体，用于制备可对乳腺癌、结肠癌和胰腺癌等肿瘤有治疗作用的人源化抗体。

4)可根据本发明的基因序列及其编码的氨基酸序列，制备针对人EPCAM功能表位的其它生物制品。

5)可利用本发明的抗人EPCAM的FMU-EPCAM-2A9特异性单抗作为区分上皮和非上皮来源组织的工具，以确诊一些易于混淆的疾病。通过采用本发明的抗人EPCAM的FMU-EPCAM-2A9特异性单抗染色，观察组织中EPCAM的表达强度，可能作为一些上皮来源肿瘤预后及分化程度的判断标志。

6)可应用本发明的高亲和力FMU-EPCAM-2A9mAb制备测定体液中EPCAM胞膜外区蛋白的ELISA试剂盒，可望在肿瘤发生、发展及预后的临床诊断中具有广泛的应用价值。

氨基酸及核苷酸序列表

<110>中国人民解放军第四军医大学

<120>FMU-EPCAM-2A9单克隆抗体的轻链和重链可变区

<160>4

<210>1

<211>111

<212>PRT

<213>人工合成

<400>1

Asp Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser

1 5 10 15 20

Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp

25 30 35 40

Leu Phe Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Val Val Ser Lys Leu Asp

45 50 55 60

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Tyr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro

85 90 95 100

Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

105 110

<210>2

<211>113

<212>PRT

<213>人工合成

<400>2

Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Thr Ser Val Lys Met

1 5 10 15 20

Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Tyr Ser Tyr Trp Leu His Trp Ile Lys Gln Arg

25 30 35 40

Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val Gly Gly Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Ala Thr Ser Tyr

45 50 55 60

Lys Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ile Arg Gly Gly

85 90 95 100

Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

105 110

<210>3

<211>333

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

gatgttgtgc tgacccagtc tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc 60

atctcttgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg gaaagacata tttgaattgg 120

ttgttccaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctgatct atgtggtgtc taaactggac 180

tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240

agtagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgct ggcaaggtac acactttccg 300

tggacgttcg gtggagggac caagctggag atc 333

<210>4

<211>339

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

gaggtgaagc tgcaggagtc tgggactgtg ctggcaaggc ctgggacttc cgtgaagatg 60

tcctgcaggg cttctggcta cagttttacc agctactggt tgcactggat aaaacagagg 120

cctggacagg gtctagaatg ggttggtggt atctatcctg gaaatagtgc tactagttac 180

aaacagaagt ttaaggacaa ggccacactg actgcagtca catccgccag tactgcctac 240

atggaactca gtagcctgac aaatgaggac tctgcggtct attactgcat aagagggggg 300

aactactggg gccaagggac cacggtcacc gtctcctca 339

Claims

1.FMU-EPCAM-2A9单克隆抗体，包括轻链和重链，其特征在于，所述轻链的可变区的3个互补决定区(CDR)序列为：

CDR1：Gln-Ser-Leu-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Lys-Thr-Tyr；

CDR2：Val-Val-Ser-Lys-Leu-Asp-Ser；

CDR3：Trp-Gln-Gly-Thr-His-Phe-Pro-Trp-Thr；

所述重链的可变区的3个互补决定区(CDR)序列为：

CDR1：Gly-Tyr-Ser-Phe-Thr-Ser-Tyr-Trp；

CDR2：Ile-Tyr-Pro-Gly-Asn-Ser-Ala；

CDR3：Ile-Arg-Gly-Gly-Asn-Tyr。

2.如权利要求1所述的FMU-EPCAM-2A9单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.1，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.如权利要求1所述的FMU-EPCAM-2A9单克隆抗体，其特征在于，编码单克隆抗体轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.3所示，编码单克隆抗体重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.4所示。

4.权利要求1所述的FMU-EPCAM-2A9单克隆抗体应用于构建以人EPCAM为靶点的基因工程抗体或诊断试剂的制备。