CN101687064B - 用于制备无细胞有机组织的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及制备通过再植活细胞来实现再生的无细胞有机组织的方法，该方法包括下列步骤：在基本平坦的表面上制备无细胞组织，在该组织的表面上产生多个孔，其分布于整个所述表面上，并排布成至少穿透该组织的部分厚度。所述孔适于包含再植的活细胞。

Description

用于制备无细胞有机组织的方法

本发明涉及制备用于再生(revitalisation)的无细胞有机组织的方法。

众所周知，在医学领域中，更具体而言在外科领域中，越来越重要的是拥有可用于移植至活体的组织，以满足对置换部分器官或完整器官的日益增长的需求。

在实验室制备生物学替代物并移植至动物或人类受体是一种被称为“组织工程”的医学过程。

根据一种已知的技术，在实验室中通过将细胞植入基质中来制备用于移植的组织，所述基质由通称为“支架”的无机支持介质构成。

用于补偿受治器官的物质损失的“支架”有利于细胞的三维组织，直到完全形成新组织。

支架必须随后自然发生降解过程，直至其完全消失，并被所述支架中所植入的细胞形成的再生组织代替。

可以使用该方法获得移植物，其中使用人工或者可得自人类或动物的天然支架(即，从“供体”得到)，比如食管壁。

为了将从供体获得的天然支架移植至另一个人，该组织必须首先经过处理，以将所有存在于结缔组织纤维之间的细胞去掉，然后再植入属于该移植物预定受者(“宿主”)的人细胞，以避免排斥现象。

以从供体获得组织为起点的支架(即无细胞基质)制备技术已为人所熟知，因此不在此详细描述；简言之，它们包括将待处理的组织浸泡于包含酶类物质的液体中，这些酶类物质能够消化和破坏组织中包含的活细胞，而不损伤组织的结缔组织。

在制备了可容纳得自宿主的细胞的无细胞组织基质或支架之后，将该组织或支架在所谓的“培养皿”(或类似容器)中进行制备，所述培养皿是一种生物实验室中常用的盘，将待再生的组织置于其底部。

如下对组织进行再生：植入未来受体的干细胞，并用可培养该细胞的细胞培养液为细胞提供养分，保持它们存活，使它们能够增殖和分散。

基本上，最初放置于组织上表面的干细胞移动通过支架组织中的天然间隙——之前被供体细胞占据的间隙。

在经过给定的时间之后，在受控的温度下并在培养液中的营养物质存在下，活细胞将其自身重新安置在组织间隙中，其后该组织可用于移植入受体器官中。

必须指出，通常用于使支架再生的细胞是干细胞，其随后开始分化(或者可能已经分化)并获得移植有该再生组织之器官的特定功能。

移植通过这种方法所制备组织的成败取决于细胞在组织基质中的毛细扩散。

如果这种扩散困难，或在表面而不是向深处进行，则移植的组织未充分再生，坏死过程开始，导致移植失败。

基于上述考虑，很明显，确保组织的每一部分向深处再生(尤其是在其整个厚度上)对于成功而言即便不是必不可少，也是非常重要的。

目前，即便将制备和再生处理应用足够长的时间，仍然无法确保结果可靠到足以保证不会发生任何移植失败。

这是由于支架中所植入活细胞的穿透不足。

从实践上讲，这一缺点严重限制了制备适于移植的组织的机会，这是由于较厚的组织在移植后未完全再生，因为它们不能被穿透至足够的深度。

因此，很明显，目前的技术仅适于移植厚度非常有限的组织，比如，不超过约0.1mm。

美国专利5122354公开了骨同种异体移植物的制备，其中首先除去全部软组织，接着对表面进行加工以产生孔结构，其适于促进骨的去矿化并增加用于与其后引入的间充质发生相互作用的表面。所述孔通过激光或机械钻孔产生。

发明概述

本发明的目的是开发一种制备克服了上述缺点的无细胞组织的方法。

更具体而言，本发明的目的是开发一种用于制备无细胞有机组织的方法，使得在用干细胞对该组织进行再生时，所述细胞更易于穿透并在结缔组织纤维网络的所有可能的空间定殖，以基本上重现与组织失活之前相同的环境。

本发明的另一目的是，显著和重要地减少加入活细胞后再生无细胞支架以制备移植组织所需的处理时间。

本发明的目的通过权利要求1所述制备无细胞有机组织的方法来实现。

更准确的说，该方法包括在所制备组织的表面上产生多个孔；这些孔至少穿透部分厚度，优选地穿透该组织的全部厚度。

这些孔是通过含有针的装置来获得，其中通过适当的电流，但不在在所产生孔周围的结缔组织中诱发任何改变(撕裂、坏死、厚度减少或增加、液体含量改变或者凝固)。

可以通过多种装置和方法来产生穿入组织厚度的这些孔，只要这些孔的制备过程不对孔周围的结缔组织和支架整体产生任何损害即可。

基于以下描述，本发明的目的以及就组织中所制备孔的质量而言的最佳结果可通过以下步骤实现：对用于制备每个孔的每个针的尖端施加高频电压(一般为4MHz)，以引起弱电流通过，但其强度足以打开结缔组织中分子之间的键，从而造成孔，但不引起任何分子断裂。

这产生直径狭窄的孔，基本上与所插入针的规格相当。

重要的是使用规格非常窄(例如50μm的级别)但是足以帮助细胞穿入所述孔内而使周围组织再生的针。

合乎逻辑并且很明显的是，产生大量的孔意味着为移植细胞进入组织最深处提供了新的途径，从而保证该组织的完全再生。

应用本发明的方法，对可制备用于移植之组织的厚度实际上没有限制，因为孔可以制成贯穿组织的厚度并遍布其整个表面，从而由于再植到无细胞支架中的活细胞可以穿透整个组织而保证其完全再生。

本发明的更多特征和具体特点将在对本发明优选实施方案(在本文中作为非限制性实例提供)以及可用于该方法的设备的描述中更详细地凸显出来。

附图简述

下文借助于附图描述本发明，其中：

图1显示了包含带有针阵列之固定器的设备的横截面图，所述针阵列置于准备用于再生之组织的厚度上；

图2显示固定器中的一根针；

图3显示针阵列的布局；

图4显示用于移动针固定器的设备的示意图。

发明详述

根据本发明，将之前经处理的无细胞有机组织(所谓的支架)置于培养皿(或类似的容器)底部，以使其在一个平面上展开。

将多个针(比如图2中标记1所指的针)排列成阵列，比如形成图3中标记3所指的正方形，以确保针的有序排列，优选以相同距离分开(即，彼此距离相等)。

每根针1的头部11是电连通的，比如通过与所述针阵列的固定器20相连的金属导体盘2。

该盘2与电线21连接，从而接受发生器4的输出。

该发生器4是电压发生器，优选产生200-230伏特，但波频为4MHz，其使用电路获得，这是公知的，为了简洁起见在本文中不再描述。

在发生器4的输出41可提供的电压正弦波优选为失真正弦波，因此至少具有一次、二次和三次谐波。

将发生器4的功率调整成使每个电极1尖端的电流为2到2.5mA。

如前所述，当每个针的尖端被放置于有机组织5的表面51上时，每根针1的尖端和有机组织的接触允许通过约2-2.5mA的电流。

该电流将能量传递至周围的分子，其对应于(通过实验证明)所谓的“分子共振”。

这一能量刚好足以使电流通过所影响的分子之间的键断裂，而在周围区域不造成断裂、撕裂、坏死、厚度减少或增加、流体含量变化、凝固或其他组织变性。

基本上，这种在分子键之间造成的开口相当于产生了小孔，在实践中其直径与每根针1相等，即约50-55μm。

当然，也可以使用不同的更大或更小规格的针，只要使用者铭记针的最小规格不能小于用于再生的细胞的直径即可。

接着以足够慢的速度沿着针的指向推动针阵列3的固定器20，以使针在前进时针尖能够找到已经由于电流流过及其后分子键断裂所产生的孔。

容易看出，这样不会撕裂结缔组织，从而获得了与插入针的规格相当的窄孔。

如前所解释，这是尤其重要和有用的，因为这样再植到组织中的细胞可以完全穿透整个组织的深度并移植到孔壁上，它们在这里增殖并且非常迅速地使全部厚度的有机组织再生。

如图1所示，针1优选(但不必须)斜插到固定器5的表面51上，以增加孔的长度并且因此在支架中获得最大的通道效应。

实验证明，与垂直成60°角在再生过程中更有效，因为所产生的孔比支架的厚度更长。

实验室检测表明，含有针1的针阵列3的有用大小为1cm2，该阵列含有约200根针；在这种情况下，发生器4产生的电流不超过500mA。

穿孔步骤必须在支架表面自然地重复进行，以使孔在待移植组织的全部厚度和整个可用表面上均匀分布。

为此，本发明利用用于穿孔的设备，其有利地具有用于沿三个笛卡尔轴(即沿着垂直或倾斜轴Z，以及沿着与表面51的平面平行的笛卡尔轴X和Y轴)移动固定器20的装置30，如图4所示。

一旦在支架5的特定区域产生了孔，就可以移开固定器20，有序地重复这一过程以覆盖整个表面51。

很明显，如果携带针阵列3的固定器20与可编程的移动装置(比如由电控单元控制的步进马达)连接，就可以自动有序地重复该过程，并具有卓越的精确度。

如前述在无细胞组织5中完成一系列孔之后，很明显，可将该无细胞组织置于培养皿或相似的容器中，接着可向其中加入活细胞，通常是从准备接受移植物的宿主个体获得的干细胞。

用培养液适当地培养后，干细胞可以迅速并容易地占据所有用针1制备的孔，从而保证用于移植的整个组织完全有效的再生。

很明显，本发明的方法实现了本发明设定的所有目标，因为确保了完美有效的再生并防止了后续移植的任何失败风险。

此外，再生过程比使用已知技术时更为迅速，结果极为成功。

当任何权利要求中提到技术特征之后带有附图标记时，这些附图标记的唯一目的是使权利要求更易于理解，因此在解释这些附图标记所示例的每一要素时这些附图标记不具有任何限制作用。

Claims (18)

1.制备用于通过植入活细胞而进行再生的无细胞有机组织的方法，其包括下列步骤：

-在基本平坦的表面上制备所述无细胞组织；

-在该组织的表面上产生多个孔，其遍布整个所述表面并且至少穿透该组织的部分厚度，所述孔适于容纳再植进来的所述活细胞，其特征在于，所述多个孔是通过与电源相连的一个或多个金属针产生的，所述电源在每个针的尖端形成电流，其强度和波形使得所提供的能量足以使所述针的尖端附近的有机组织所包含分子之间的键断裂，每个孔均由所述电流产生，并且其大小足以使所述针的尖端进入由于所述分子键打开而形成的空间。

2.权利要求1的方法，其特征在于，通过基本为正弦波形且频率约4MHz的交流电为所述一个或多个金属针提供电力。

3.权利要求2的方法，其特征在于，提供给所述一个或多个金属针的电力具有至少达三次的谐波。

4.权利要求2或3的方法，其特征在于，对所述一个或多个金属针施加的电压为200-230伏特。

5.权利要求2的方法，其特征在于对每个金属针施加的电流为2-2.5mA。

6.权利要求1至3或5中任一项的方法，其特征在于，所述孔的深度对应于该有机组织的整体厚度。

7.权利要求1至3或5中任一项的方法，其特征在于，所述孔的长度大于该无细胞有机组织的厚度。

8.权利要求1至3或5中任一项的方法，其特征在于，所述多个孔以与该组织的表面基本垂直的方向排布。

9.权利要求7的方法，其特征在于，所述多个孔倾斜于该有机组织的表面。

10.权利要求1至3或5中任一项的方法，其中所述无细胞有机组织的表面上适于容纳用于再生该组织之细胞的一个或多个孔使用包含以下的设备产生：

-所述排列在固定器(20)中的一个或多个金属针(1)；

-作为所述电源并与所述一个或多个针相连的电功率源(4)，其适于向每个针的尖端传递电流，其强度和波形使得所提供的能量足以使该有机组织中与该针尖端相接触的分子之间的键打开。

11.权利要求10的方法，其特征在于该电源由产生频率约4MHz且基本为正弦波形之电压的发生器构成。

12.权利要求10的方法，其特征在于所述针包含排列在固定器(20)中的多个针，其适于形成彼此基本平行的针阵列(3)，所述针之间基本上等距。

13.权利要求10的方法，其特征在于所述至少一个针的规格为50-55μm。

14.权利要求10的方法，其特征在于所述至少一个针的规格大于再生细胞的最大尺度。

15.权利要求12的方法，其特征在于所述针与所述固定器(20)基本垂直。

16.权利要求12的方法，其特征在于所述固定器(20)定位成倾斜于待穿孔有机组织的表面。

17.权利要求10的方法，其特征在于所述设备包含装置(30)，其沿着与该组织表面交叉的至少一个轴以及沿着与该组织表面平行的至少一个轴移动所述至少一个针。

18.权利要求17的方法，其特征在于该移动装置引起沿着与该有机组织表面基本平行的两个笛卡尔轴进行移动。

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