CN101686993B - 卡介菌多糖核酸提取物在制备治疗病毒性皮肤病的药物中的应用及其注射剂和制备方法 - Google Patents

Abstract

一种卡介菌多糖核酸提取物在制备治疗病毒性皮肤病的药物中的应用。一种含有多糖0.32mg/ml-0.38mg/ml，核酸50μg/ml-100μg/ml，卡介菌菌体蛋白0μg/ml-2.5μg/ml，苯酚残留量和杂菌数为零的卡介菌多糖核酸注射剂。以及一种由卡介菌多糖核酸提取物制备卡介菌多糖核酸注射剂的方法。

Description

卡介菌多糖核酸提取物在制备治疗病毒性皮肤病的药物中的应用及其注射剂和制备方法

技术领域

本发明涉及生物制药领域。具体说，本发明涉及一种卡介菌多糖核酸提取物在制备治疗病毒性皮肤病的药物中的应用，以及由该卡介菌多糖核酸提取物制备的卡介菌多糖核酸注射剂及其制备方法。

背景技术

卡介苗(Bacilli Calmette Guerin，BCG)是一种弱化的牛型分枝杆菌，是目前预防结核病最有效的疫苗。自1948年以来，全球已有30亿人接种，其安全性已被证实。BCG除了用于预防结核病以外，还可以用于多种疾病的治疗，如变态反应性疾病及肿瘤。但是由于其成分复杂，副作用如皮疹、瘙痒等发生率较高。因此，对BCG进行纯化、提取其中的有效成分有助于减少其副作用的发生率。卡介菌多糖核酸注射剂是卡介菌多糖核酸提取物配以灭菌生理盐水制成的免疫调节剂。临床及实验资料均显示，具有广泛的免疫调节及抗炎作用，在改善免疫功能、抗过敏、抗感染方面具有良好的疗效，临床用于多种免疫失调或免疫水平下降及过敏性疾病，如难治性肺结核、支气管哮喘、支气管炎、病毒感染性疾病及皮肤变态反应疾病等。自从卡介菌多糖核酸注射剂上市后，其作用机制一直是医学研究的热点，目前研究的成果表明：

卡介菌的主要成分包括脂类、多糖、蛋白和核酸，其中多糖(包括脂类)和核酸组分发挥着重要的生理功能。在卡介菌中，多糖(主要包括肽聚糖、阿拉伯半乳糖聚糖和分支菌酸)和脂类常结合在一起，构成细胞壁的主要成分。目前的研究还表明：BCG细胞壁和其他细胞器上存在可结合人和动物Toll受体(TLR)的配体，这些配体至少可结合5种Toll受体(TLR1、TLR2、TLR4、TLR6、TLR9)，当它们同TLR结合促进树突状细胞(DC)的成熟，并且诱导IL-12的分泌，IL-12对促进Th0细胞向Th1细胞亚群转化和IFN-γ分泌，从而产生Th1占优势的非特异性免疫反应。

同样，在卡介菌的核酸中含有丰富的CpG基序，CpG基列在体内外均能激活多种免疫活性细胞，包括树突状细胞(DC)、单核/巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK)、B细胞和T细胞，刺激免疫活性细胞分泌多种细胞因子并能上调某些表面分子、趋化因子、粘附分子和共刺激分子等，诱导机体天然免疫系统活化，并产生抗原特异性的获得性免疫应答。

综上所述，BCG及卡介菌多糖核酸注射剂主要是其核酸和多糖通过识别和结合人体的Toll受体(TLR1、TLR2、TLR4、TLR6、TLR9)，激活DC、T细胞、B细胞及巨噬细胞等多种免疫活性细胞，刺激多种免疫活性细胞分泌免疫活性分子(细胞因子、趋化因子、粘附分子和共刺激分子)而发挥抗微生物感染、抗肿瘤及调节Th1/Th2平衡的作用。

近十年来的体内、体外研究表明：卡介菌多糖核酸注射剂可以特异性增强机体的Th1型细胞免疫反应，抑制Th2细胞免疫反应，进而调节Th1/Th2平衡的作用。

研究表明，卡介菌多糖核酸注射剂可增加T细胞及脾细胞膜上IL-2的表达，促进T细胞克隆增殖及T细胞集落形成，此外卡介菌多糖核酸注射剂还能增加活化T细胞IFN-γ的分泌，增强巨噬细胞功能。卡介菌多糖核酸注射剂还能抑制多种过敏反应，稳定嗜碱性和肥大性细胞的功能，减少IgE的产生。因而，卡介菌多糖核酸注射剂在预防和治疗微生物感染(细菌、病毒等)、肿瘤的免疫治疗或辅助治疗及纠正Th1/Th2细胞失衡的变态反应疾病中将具有非常广阔的应用前景。

目前已上市的卡介菌多糖核酸注射剂是通过从卡介菌培养经热酚法提取的卡介菌多糖核酸提取物配制而成，现行的卡介菌多糖核酸提取物、卡介菌多糖核酸注射剂的质量标准和工艺按2000版《中国生物制品规程》执行。2000版《中国生物制品规程》规定的卡介菌多糖核酸提取物质量标准为：该制剂为多糖、核酸及蛋白混合物，其中多糖为70％～80％左右，核酸为10％～20％，卡介菌菌体蛋白含量小于1％，杂菌数不超过为100个/克。2000版《中国生物制品规程》规定的卡介菌多糖核酸注射剂质量标准为：1ml/支，含卡介菌多糖0.28-0.42mg/ml，核酸不低于30μg。

现行的卡介菌多糖核酸提取物、卡介菌多糖核酸注射剂的质量标准存在一些问题，主要表现为：(1)卡介菌多糖核酸提取物的多糖和核酸的范围较宽，造成卡介菌多糖核酸注射剂批次间多糖和核酸的含量不一致，从而使卡介菌多糖核酸注射剂批次间疗效不稳定；(2)卡介菌多糖核酸提取物中杂质的含量比较高，特别是卡介菌菌体蛋白、杂菌数和苯酚的残留量。例如由于原卡介菌多糖核酸提取物中含有较高比例的卡介菌菌体蛋白和杂菌，造成卡介菌多糖核酸注射剂中卡介菌菌体蛋白和杂菌较高，按2000版《中国生物制品规程》规定生产的每支卡介菌多糖核酸注射剂中含有5μg的卡介菌菌体蛋白，同时可能数量不等的杂菌物质。相对人体而言，卡介菌菌体蛋白和杂菌是异源抗原或毒性物质，可引起较强的免疫排斥反应和毒性反应(因为要连续使用3个月)，表现为临床上使用该制剂时常出现病人注射部位发生严重溃烂，同时约有5-10％的病人出现发烧现象，少数病人出现严重的过敏反应；(3)现有的卡介菌多糖核酸注射剂中只规定了核酸含量的下限，但在长期的临床应用中却发现，当每只注射剂中核酸的含量大于110μg时，约有90％的患者表现为注射部位红肿、疼痛、甚至严重肿胀影响日常生活。

扁平疣等病毒性皮肤病可能是由人类乳头瘤病毒(HPV)等病毒引起，其发生、发展与患者细胞免疫功能异常有关。研究发现，卡介菌多糖核酸注射剂可以特异性增强机体的Th1型细胞免疫反应，诱导释放IFN-γ、IL-2等细胞因子、破坏溶解病毒靶细胞，增强单核-巨噬细胞系统的免疫功能，恢复NK等免疫细胞的活性，因此可能在由HPV等病毒引起的病毒性皮肤病的治疗中发挥作用。

发明内容

本发明一方面提供一种卡介菌多糖核酸提取物在制备治疗病毒性皮肤病的药物中的应用，其中该卡介菌多糖核酸提取物含有多糖、核酸、残留的卡介菌菌体蛋白和质量百分含量小于10％的水分，其中多糖质量百分含量为70-78％，核酸质量百分含量为12-20％，残留的卡介菌菌体蛋白质量百分含量为0-0.5％，苯酚的残留量为零，杂菌数为0-20个/克。

其中，所述卡介菌多糖核酸提取物通过以下步骤制备：

(a).对卡介菌进行培养，并收获卡介菌培养物；

(b).采用物理方法对上述卡介菌培养物进行破碎，得到卡介菌多糖核酸混悬液；

(c).利用加入30-100℃苯酚结合高速离心法对上述卡介菌多糖核酸混悬液进行处理，得到卡介菌多糖核酸混合物；

(d).通过凝胶柱层析法对上述卡介菌多糖核酸混合物进行分离，得到卡介菌多糖核酸提取液，从该卡介菌多糖核酸提取液中进一步分离得到卡介菌多糖核酸提取物。

上述病毒性皮肤病可以与患者的免疫功能失衡有关，或者与机体被病毒感染有关。该病毒性皮肤病可以由人乳头瘤病毒引起，包括扁平疣、尖锐湿疣等。

上述用于治疗病毒性皮肤病的药物包括卡介菌多糖核酸注射剂。该注射剂优选含有多糖、核酸、残留的卡介菌菌体蛋白和药学上可接受的辅料，其中多糖含量为0.32mg/ml～0.38mg/ml，核酸含量为50μg/ml～100μg/ml，卡介菌菌体蛋白含量为0μg/ml～2.5μg/ml，苯酚的残留量和杂菌数为零。上述卡介菌多糖核酸注射剂中的药学上可接受的辅料可以包括氯化钠，其含量优选为9mg/ml。

另一方面，为了克服原卡介菌多糖核酸注射剂批间疗效差异大，副反应大等问题，本发明提供一种由卡介菌多糖核酸提取物制备的卡介菌多糖核酸注射剂，该卡介菌多糖核酸注射剂中含有卡介菌多糖、核酸、残留的卡介菌菌体蛋白和药学上可接受的辅料，其中多糖含量为0.32mg/ml～0.38mg/ml、核酸含量为50μg/ml～100μg/ml、卡介菌菌体蛋白含量为0μg/ml～2.5μg/ml，苯酚的残留量为零。该卡介菌多糖核酸注射剂中的杂菌数优选为零。上述药学上可接受的辅料可以包括氯化钠，其含量优选为9mg/ml。

本发明还提供制备上述用于治疗病毒性皮肤病的卡介菌多糖核酸注射剂的方法，其包括以下步骤：

(a).培养卡介菌，并收获卡介菌培养物；

(b).采用物理方法破碎所述卡介菌培养物，得到卡介菌多糖核酸混悬液；

(c).利用加入30-100℃苯酚结合高速离心法处理所述卡介菌多糖核酸混悬液，得到卡介菌多糖核酸混合物；

(d).通过凝胶柱层析法分离所述卡介菌多糖核酸混合物，得到卡介菌多糖核酸提取液，并对所述卡介菌多糖提取液进行醇沉，收集沉淀物，沉淀物洗涤后干燥，干燥物即为卡介菌多糖核酸提取物；

(e).将卡介菌多糖核酸提取物稀释于含药学上可接受的辅料的注射用水中，混匀，使最终溶液中的多糖含量为0.32mg/ml～0.38mg/ml，核酸含量为50μg/ml～100μg/ml，卡介菌菌体蛋白含量为0μg/ml～2.5μg/ml，将该溶液过滤后湿热灭菌分装，即得卡介菌多糖核酸注射剂。

其中，上述步骤(e)中所述的药学上可接受的辅料可以包括氯化钠，其在所得卡介菌多糖核酸注射剂中的含量优选为9mg/ml。

另外，上述步骤(e)还可以包括在过滤前用pH值调节剂将pH值调节至6.0～7.2。其中所述pH值调节剂优选为氢氧化钠和盐酸。

上述卡介菌多糖核酸注射剂可通过激活机体的树状突细胞(DC)，促使Th0细胞向Th1细胞亚群转化和IFN-γ分泌，从而产生Th1占优势的非特异性细胞免疫反应。同时，可诱导机体释放IFN-γ、IL-2等细胞因子、破坏溶解病毒靶细胞，增强单核-巨噬细胞系统的免疫功能，恢复NK等免疫细胞的活性。

本发明提供的卡介菌多糖核酸注射剂的主要药效学研究表明：在氢化可的松所致免疫功能低下小鼠间日肌内注射卡介菌多糖核酸注射剂(0.15、0.3、0.60mg/kg)3周，可增强单核巨噬细胞系统对碳粒的廓清能力，升高空斑形成数以及总T细胞、Th细胞、Ts细胞数、IFN-γ水平。在豚鼠生殖器疱疹模型，间日肌内注射卡介菌多糖核酸注射剂(0.1、0.2、0.4mg/kg)3周，可明显减少皮损的复发天数，升高血浆IFN-γ水平。这些结果提示，卡介菌多糖核酸注射剂可以提高机体细胞免疫功能，激活单核-巨噬细胞并诱生白介素、干扰素等，从而调节细胞和体液免疫，最终达到抗病毒、排斥疣病变组织的目的，因此可应用于治疗扁平疣等病毒性皮肤病。

本发明提供的卡介菌多糖核酸注射剂的主要药效学研究也表明：卡介菌多糖核酸注射剂做为一个免疫调节剂，单独或同其它药物(或方法)联合作用可以在治疗扁平疣等病毒性皮肤病发挥作用。

具体实施方式

以下通过具体实施例和试验结果详细介绍本发明的创新和应用意义所在，以帮助阅读者更好地理解利用的精神和实质，但不构成对本发明实施范围的限定。

实施例一卡介菌的培养和收获

1.菌体培养：将液体低温保藏的菌种(中国卡介苗制备用卡介菌株D2PB302，中国药品生物制品检定所)室温下溶解，接种于马铃薯苏通培养基，37℃连续培养14-20天；或在37℃连续培养15天后转种于改良的液体苏通培养基，37℃连续培养14-20天。

其中，马铃薯苏通培养基的制备方法可以是：

(1)取洗净新鲜土豆(1个)，用穿刺器穿成圆柱，再用刀切成4公分长斜面；用流动饮用水冲洗土豆斜面1小时，再用纯化水冲洗土豆斜面块；用苏通培养基冲洗斜面块，取苏通培养基20ml，加入100ml灭菌大管中；

(2)将冲洗后的土豆斜面放入装有苏通培养基的灭菌大管中；

(3)0.11MPa的大气压121℃，灭菌20分钟。放冷至室温待接种。

苏通培养基配制比例：

每1000ml：

硫酸镁      0.5g    磷酸氢二钾      1.04g

味精        8.0g    枸橼酸          2.0g

甘油        60ml    10％柠檬酸铁铵  0.5ml

加纯化水至  1000ml  氨水调至pH8.0左右

2.菌体收集：待菌体生长至对数期时，对培养瓶逐瓶检查后，收集菌膜，加入适量去离子蒸馏水洗涤，压干后称重。

实施例二卡介菌多糖核酸混合物的制备

1.菌体破碎和热酚处理：将收集的菌体按10∶1的比例加入纯化水，以组织捣碎匀浆机(12000rpm/min)破碎菌体，3min×3次，将菌体捣碎，然后再加入破碎菌悬液0.5-2.0倍体积量的热苯酚(30～100℃)，在低速搅拌中保温30分钟～1小时。

2.卡介菌多糖核酸混合物的提取：将热酚好的混合液自然沉淀1～10天，吸取上清液，管式离心机高速离心后，上清经0.45um无菌滤器过滤，即为卡介菌多糖核酸混合物。

实施例三精制卡介菌多糖核酸提取物的制备

采用美国密里博(MILLIPORE)公司制造的K-PRIME 40II凝胶层析过滤系统和GH-25凝胶介质进行卡介菌多糖核酸、苯酚及卡介菌蛋白的分离。具体的制备过程如下：

1.平衡：用0.9％生理盐水以1000mL/分钟经柱正向流动，直至柱前柱后电导、PH一致时结束平衡过程。

2.上样：将卡介菌多糖核酸混合物经上样系统进行上样，上样速度为600mL/分钟。

3.洗脱：上样结束后，用0.9％生理盐水以800mL/分钟速度进行洗脱，采用紫外分光仪(波长采用260nm或280nm)检测流出液，收集目的峰，将收集的目的峰通过0.45μm无菌滤器过滤，即为精制卡介菌多糖核酸提取液。

4.精制：将所收集的精制卡介菌多糖核酸提取液进行醇沉，在精制卡介菌多糖核酸提取液中加入药用乙醇进行醇沉，含醇量为70-75％。自然沉淀4天后，收集沉淀物。沉淀物通过无水乙醇充分搅拌均匀、离心洗涤3次，然后用乙醚洗涤离心3次后，放至干燥器干燥，干燥物即为卡介菌多糖核酸提取物。

实施例四卡介菌多糖核酸提取物的检测

通过本方法制备的九批精制卡介菌多糖核酸提取物按照2000版《中国生物制品规程》和2005版《中国药典》进行检测，结果如下表1、表2、表3所示。

表1三批卡介菌多糖核酸提取物检测结果

注*表示按2005版《中国药典》检测结果为阴性

表2三批卡介菌多糖核酸提取物检测结果

注*表示按2005版《中国药典》检测结果为阴性

表3三批卡介菌多糖核酸提取物检测结果

注*表示按2005版《中国药典》检测结果为阴性

实施例五卡介菌多糖核酸注射剂的制备和检测

1.溶解：

准确称取处方量的卡介菌多糖核酸提取物，加入适量注射用水用磁力搅拌器溶解，未溶解的部分继续加注射用水用磁力搅拌器溶解，直至完全溶解为止，再离心，取上清液。

2.配液：

先加入注射用水至接近批量刻度线，再将上清液和每批量所需的氯化钠加入稀配罐，加入注射用水至刻度线后搅拌均匀，取样检验多糖、核酸含量，并用NaOH或HCl调pH值于6.0～7.2之间，通过过滤器滤过，打入贮液罐，运至灌封间灌封。

应该理解，虽然上述步骤中只加入了氯化钠和NaOH及HCl作为辅料，但是所属技术领域的技术人员应该能够认识到，所属技术领域的其它公知注射剂用药用辅料也可以根据需要加入其中，例如抗氧化剂、稳定剂、等渗调节剂等等。

3.灌封：

在万级保护的局部百级层流罩下进行。

(1)洗瓶：操作人员在十万级区使用安瓿超声波清洗机洗瓶，依次经循环水，喷淋水，新鲜水三次用压缩空气加压淋洗，新鲜水为注射用水，洗涤后的安瓿用杀菌干燥机干燥灭菌。

(2)灌封：使用洗灌封联动线灌装封口，灌装前检查设备是否正常，管道是否淋洗干净，调节装量至规定范围。检查熔封质量是否封口完整光滑。

4.灭菌：

使用安瓿检漏灭菌柜，将安瓿放在安瓿推车上，于检漏灭菌柜内高压蒸汽灭菌(121℃、0.11MPa、F0：20)。

5.检测：

按照2000版《中国生物制品规程》和2005版《中国药典》对卡介菌多糖核酸注射剂进行检测，结果如下表4、表5、表6所示。

表4三批卡介菌多糖核酸注射剂检测结果

注*表示按2005版《中国药典》检测结果为阴性

表5三批卡介菌多糖核酸注射剂检测结果

注*表示按2005版《中国药典》检测结果为阴性

表6三批卡介菌多糖核酸注射剂检测结果

注*表示按2005版《中国药典》检测结果为阴性

实施例六卡介菌多糖核酸注射剂抗病毒的主要药效学试验研究

1.对免疫功能的影响

以下试验均在免疫功能低下小鼠模型(氢化可的松，100mg/kg，ic，每日1次，共7天，0.1ml/10g体重)进行。

1.1影响非特异性免疫功能的试验----小鼠碳粒廓清法

1.1.1药物与材料

药物：卡介菌多糖核酸注射剂(以0.5mg精制卡介菌多糖核酸提取物溶于1ml生理盐水)，临用时用生理盐水配制成相应浓度的溶液。5％盐酸左旋咪唑注射剂由江苏省东台市动物药厂生产，规格：10ml/支，临用时用生理盐水稀释成所需浓度。注射用氢化可的松琥珀酸钠由天津市生物化学制药厂生产，规格：50mg/支，临用时用生理盐水配制成相应浓度的溶液。

1.1.2方法

试验分为六组：正常动物对照组、免疫功能低下模型组、盐酸左旋咪唑阳性对照组(2.5mg/kg)、三个剂量(0.15，0.30，0.60mg/kg)的卡介菌多糖核酸注射剂组(n＝10)。

印度墨水用生理盐水稀释1倍，超声处理，离心，弃沉淀物，上清备用。取小鼠尾静脉注射印度墨水生理盐水溶液(0.1ml/10g体重)，于1(t₁)和5(t₅)min后分别从眼眶静脉采血20μl，加入0.1％Na₂CO₃溶液2ml，摇匀，680nm波长下测定光密度值(OD)。按下式计算廓清指数(K)和吞噬指数(α)。

卡介菌多糖核酸注射剂组小鼠在造模前2周至造模期间，后肢股部肌内注射卡介菌多糖核酸(0.1ml/10g体重)，间日一次，末次给药后24小时进行碳粒廓清试验。盐酸左旋咪唑对照组碳粒廓清试验前皮下注射盐酸左旋咪唑，每日1次，连续用药7日，给药体积为0.1ml/10g。

1.1.3结果

小鼠连续皮下注射氢化可的松(100mg/kg，1次/日)7天，可显著降低廓清指数和吞噬指数；高剂量(0.60mg/kg)卡介菌多糖核酸可明显升高廓清指数和吞噬指数，中、低剂量对其无明显影响；盐酸左旋咪唑也可明显升高廓清指数和吞噬指数(表7)。

表7卡介菌多糖核酸注射剂对小鼠碳粒廓清的影响(n＝10)

^**P＜0.01vs正常动物对照组；⁺P＜0.05，⁺⁺P＜0.01vs免疫功能低下组。

1.2影响特异性体液免疫功能的试验----小鼠抗体形成细胞测定法

1.2.1药物与动物

药物：卡介菌多糖核酸注射剂(1.0ml/支，以0.5mg精制卡介菌多糖核酸提取物溶于1ml生理盐水)，临用时用生理盐水配制成相应浓度的溶液。5％盐酸左旋咪唑注射剂由江苏省东台市动物药厂生产，规格：10ml/支，临用时用生理盐水稀释成所需浓度。注射用氢化可的松琥珀酸钠由天津市生物化学制药厂生产，规格：50mg/支，临用时用生理盐水配制成相应浓度的溶液。

1.2.2方法

试验分为六组：正常动物对照组、免疫功能低下模型组、盐酸左旋咪唑阳性对照组(2.5mg/kg)、三个剂量(0.15，0.30，0.60mg/kg)的卡介菌多糖核酸注射剂组(n＝10)。

①免疫：用20％SRBC 0.2ml腹腔注射免疫小鼠。免疫后第4天处死供实验。

②制备脾细胞混悬液：脱颈处死经SRBC免疫的小鼠，立即剖腹取脾脏，在冰浴中将脾置于100目尼龙网纱布上，加少许Hank′s液，轻轻挤压出脾细胞。细胞计数时用0.4％台盼蓝染色观察活细胞应在90％以上。将脾细胞悬液配成10⁷个/ml浓度。

③制备琼脂底层：平皿中加入用Hank′s液配成的溶化的1.4％琼脂3ml，制备琼脂底层。

④加样：取脾细胞悬液和5％SRBC各0.1ml及原补体0.05ml混合加入保温于45℃水浴的、含0.4％琼脂糖0.8ml的试管中，摇匀后倒入平皿，旋转平皿使混合物均匀平铺于底层琼脂上，凝固后将平皿装入湿盒并置于37℃温箱中孵育4小时后计数空斑形成数(PFC)。

⑤计数：以每10⁶个脾细胞所含空斑数表示结果。

卡介菌多糖核酸注射剂组小鼠在造模前2周至造模期间，后肢股部肌内注射卡介菌多糖核酸(0.1ml/10g体重)，间日一次，末次给药后24小时进行空斑试验。盐酸左旋咪唑对照组空斑试验前皮下注射盐酸左旋咪唑，每日1次，连续用药7日，给药体积为0.1ml/10g。

1.2.3结果

小鼠连续皮下注射氢化可的松(100mg/kg，1次/日)7天，可显著降低空斑形成数；在此基础上使用卡介菌多糖核酸注射剂和盐酸左旋咪唑，均可明显升高空斑形成数(表8)。

表8卡介菌多糖核酸注射剂对小鼠空斑形成数的影响(n＝10)

^*P＜0.05vs正常动物对照组；⁺⁺P＜0.01，⁺⁺⁺P＜0.001vs免疫功能低下组。

1.3影响特异性细胞免疫功能的试验-检测小鼠T淋巴细胞亚群

1.3.1药物与动物

药物：卡介菌多糖核酸注射剂(规格：1.0ml/支，以0.5mg精制卡介菌多糖核酸提取物溶于1ml生理盐水)，临用时用生理盐水配制成相应浓度的溶液。5％盐酸左旋咪唑注射剂由江苏省东台市动物药厂生产，规格：10ml/支，临用时用生理盐水稀释成所需浓度。注射用氢化可的松琥珀酸钠由天津市生物化学制药厂生产，规格：50mg/支，临用时用生理盐水配制成相应浓度的溶液。

1.3.2方法

试验分为六组：正常动物对照组、免疫功能低下模型组、盐酸左旋咪唑阳性对照组(2.5mg/kg)、三个剂量(0.15，0.30，0.60mg/kg)的卡介菌多糖核酸注射剂组(n＝10)。

①总T细胞％：常规制备淋巴细胞悬液，并用RPMI1640完全培养液调细胞浓度至4×10⁹个/L。用生理盐水将SRBC洗3次，并用培养液调至1％浓度。在1ml塑料离心管中，每管加入淋巴细胞悬液和培养液各50μl，37℃水浴中保温1小时。再加入SRBC悬液100μl混匀，37℃水浴保温10分钟。离心(800rpm，5分钟)水浴2小时。将细胞轻轻悬起，加100μl4％戊二醛固定液(用锌酸缓冲液配制)混匀。计数前将上清液全部移除，加生理盐水100μl和20倍稀释的1％美蓝染色液100μl染色，20分钟后计数，即得总T细胞％。

②茶碱抵抗细胞花环％：在50μl淋巴细胞悬液中加入含100mmol/L茶碱的培养液50μl混匀，其余步骤同上。

③Th、Ts细胞％：按下式计算。

Ts细胞％＝100％-Th细胞％

④IFN-γ：用ELISA方法，按试剂盒说明书进行。

卡介菌多糖核酸注射剂组小鼠在造模前2周至造模期间，后肢股部肌内注射卡介菌多糖核酸(0.1ml/10g体重)，间日一次，末次给药后24小时进行试验。盐酸左旋咪唑对照组试验前皮下注射盐酸左旋咪唑，每日1次，连续用药7日，给药体积为0.1ml/10g。

1.3.3结果

小鼠连续皮下注射氢化可的松(100mg/kg，1次/日)7天，可显著降低总T细胞、Th细胞、Ts细胞数以及血浆IFN-γ水平；卡介菌多糖核酸注射剂和盐酸左旋咪唑，均可明显升高总T细胞、Th细胞、Ts细胞数以及血浆IFN-γ水平(表9)。

表9卡介菌多糖核酸注射剂对小鼠细胞免疫功能的影响(n＝9-10)

^*P＜0.05，^**P＜0.01vs正常动物对照组；⁺P＜0.05，⁺⁺P＜0.01，⁺⁺⁺P＜0.001vs免疫功能低下组。

2.对豚鼠生殖器单纯疱疹病毒(HSV-2)感染的影响

2.1药物与材料

药物：卡介菌多糖核酸注射剂(规格：1.0ml/支，以0.5mg精制卡介菌多糖核酸提取物溶于1ml生理盐水)，临用时用生理盐水配制成相应浓度的溶液。5％盐酸左旋咪唑注射剂由江苏省东台市动物药厂生产，批号：020418，规格：10ml/支，临用时用生理盐水稀释成所需浓度。

2.2方法

造模方法：生理盐水清洗外阴，干棉签磨擦阴道数次，造成阴道粘膜损伤，然后用接有灌胃针头的注射器吸取HSV-2(效价为10^-4～-6TCID₅₀，由中国科学院武汉病毒研究所提供)0.1ml，将针头插入豚鼠阴道内约3～4cm将病毒注入阴道穹窿后缓慢退出，用明胶海绵塞入阴道以维持毒液，针头上少许毒液滴在外阴，用玻璃棒轻轻涂抹均匀，使病毒渗入皮肤。

注入病毒14天后根据皮损程度分层随机分为五组：模型组、盐酸左旋咪唑阳性对照药(2.5mg/kg)组、三个剂量(0.1，0.2，0.4mg/kg)的卡介菌多糖核酸注射剂组(n＝15-16)。第15天开始，卡介菌多糖核酸注射剂组和模型组分别后肢股部肌内注射卡介菌多糖核酸和生理盐水(给药容积均为0.1ml/100g体重)，间日1次，共3周；阳性对照组皮下注射盐酸左旋咪唑，间日1次，共3周，给药容积为0.1ml/100g体重。观察给药期间复发率(出现皮损的次数和天数)和皮损情况，末次给药后24h采血测定血清γ-IFN水平。

皮损程度参考文献方法进行评分：

0，无症状；0.5，微红；1.0，红肿无水疱；1.5，单个小水疱(≤2mm)；2.0，单个大水疱(＞2mm)；2.5，多个小水疱和(或)阴道溃疡(出血)；3.0，多个大水疱；3.5，严重外阴肿胀；4.0，多个小(大)水疱融合；4.5，后肢瘫痪；5.0，外阴溃疡。

2.3结果

接种HSV-2后，豚鼠均出现类似于人类外阴生殖器疱疹的症状，主要表现为外阴红肿、水疱、溃疡，部分动物甚至后肢瘫痪。皮损症状多在按种后2～3天开始出现，首先表现为分散的红肿性小水疱，第4-10天发展为水疱-溃疡性皮损，第8-12天开始结痂，第13-15天痂皮脱落。第7-12天有8只动物出现后肢瘫痪，该症状第12-14天消失。

HSV-2接种14天后，根据皮损程度把豚鼠分层随机分为五组，给予卡介菌多糖核酸注射剂和盐酸左旋咪唑治疗3周。结果发现，高剂量(0.4mg/kg)卡介菌多糖核酸注射剂和盐酸左旋咪唑均可明显减少皮损的复发天数，并可显著升高血浆IFN-γ水平(表10)。

表10卡介菌多糖核酸注射剂对豚鼠生殖器疱疹复发天数和血浆IFN-γ水平的影响(n＝15-16)

^*P＜0.05，^**P＜0.01vs模型组

通过已完成的卡介菌多糖核酸注射剂对小鼠免疫功能、豚鼠生殖器单纯疱疹病毒(HSV-2)感染的影响等主要药效学试验的研究表明：卡介菌多糖核酸注射剂可增强单核巨噬细胞系统对碳粒的廓清能力，升高空斑形成数以及总T细胞、Th细胞、Ts细胞数和血清IFN-γ的水平，减少由于生殖器单纯疱疹病毒引发的动物皮损的复发天数。这些结果提示，卡介菌多糖核酸注射剂可以提高机体细胞免疫功能，激活单核-巨噬细胞并诱生干扰素等免疫活性物质，从而提高机体的整体免疫功能，达到抗病毒、排斥疣病变组织的目的。

Claims (9)

1.一种卡介菌多糖核酸提取物在制备治疗HSV-2引起的生殖器疱疹的药物中的应用，其中该卡介菌多糖核酸提取物含有多糖、核酸、残留的卡介菌菌体蛋白和质量百分含量小于10％的水分，其中多糖质量百分含量为70-78％，核酸质量百分含量为12-20％，残留的卡介菌菌体蛋白质量百分含量为0-0.5％，苯酚的残留量为零，杂菌数为0-20个／克，所述卡介菌多糖核酸提取物通过以下步骤制备：

(a).对卡介菌进行培养，并收获卡介菌培养物；

(b).采用物理方法对上述卡介菌培养物进行破碎，得到卡介菌多糖核酸混悬液；

(c).利用加入30-100℃苯酚结合高速离心法对上述卡介菌多糖核酸混悬液进行处理，得到卡介菌多糖核酸混合物；

(d).通过K-PRIME40II凝胶层析过滤系统和GH-25凝胶介质的凝胶柱层析法对上述卡介菌多糖核酸混合物进行分离，得到卡介菌多糖核酸提取液，从该卡介菌多糖核酸提取液中进一步分离得到卡介菌多糖核酸提取物。

2.根据权利要求1所述的卡介菌多糖核酸提取物在制备治疗HSV-2引起的生殖器疱疹的药物中的应用，其特征在于所述的治疗生殖器疱疹的药物包括卡介菌多糖核酸注射剂。

3.根据权利要求2所述的卡介菌多糖核酸提取物在制备治疗HSV-2引起的生殖器疱疹的药物中的应用，其特征在于所述的卡介菌多糖核酸注射剂含有多糖、核酸、残留的卡介菌菌体蛋白和药学上可接受的辅料，其中多糖含量为0.32mg／ml～0.38mg／ml，核酸含量为50μg／ml～1(0μg／ml，卡介菌菌体蛋白含量为0μg／ml～2.5μg／ml，苯酚的残留量和杂菌数为零。

4.根据权利要求3所述的卡介菌多糖核酸提取物在制备治疗HSV-2引起的生殖器疱疹的药物中的应用，其特征在于所述卡介菌多糟核酸注射剂中的药学上可接受的辅料包括氯化钠，其中氯化钠含量为9mg／ml。

5.一种用于治疗HSV-2引起的生殖器疱疹的卡介菌多糖核酸注射剂，含有卡介菌多糖、核酸、残留的卡介菌菌体蛋白和药学上可接受的辅料，其特征在于其中多糖含量为0.32mg／ml～0.38mg／ml、核酸含量为50μg／ml～100μg／ml、卡介菌菌体蛋白含量为0μg／ml～2.5μg／ml，苯酚的残留量为零，杂菌数为零，所述的卡介菌多糖核酸注射剂的制备包括以下步骤：

(a).培养卡介菌，并收获卡介菌培养物；

(b).采用物理方法破碎所述卡介菌培养物，得到卡介菌多糖核酸混悬液；

(c).利用加入30-100℃苯酚结合高速离心法处理所述卡介菌多糖核酸混悬液，得到卡介菌多糖核酸混合物；

(d).通过凝胶柱层析法分离所述卡介菌多糖核酸混合物，得到卡介菌多糖核酸提取液，并对所述卡介菌多糖提取液进行醇沉，收集沉淀物，沉淀物洗涤后干燥，干燥物即为卡介菌多糖核酸提取物；

(e).将卡介菌多糖核酸提取物稀释于含药学上可接受的辅料的注射用水中，混匀，使最终溶液中的多糖含量为0.32mg／ml～0.38mg/ml，核酸含量为50μg／ml～100μg／ml，卡介菌菌体蛋白含量为0μg／ml～2.5μg／ml，将该溶液过滤后湿热灭菌分装，即得卡介菌多糖核酸注射剂。

6.根据权利要求5所述的用于治疗HSV-2引起的生殖器疱疹的卡介菌多糖核酸注射剂，其特征在于所述药学上可接受的辅料包括氯化钠，其中氯化钠含量为9mg／ml。

7.根据权利要求5所述的制备用于治疗HSV-2引起的生殖器疱疹的卡介菌多糖核酸注射剂的方法，其特征在于步骤(e)中所述的药学上可接受的辅料包括氯化钠，其中氯化钠在所得卡介菌多糖核酸注射剂中的含量为9mg／ml。

8.根据权利要求5所述的制备用于治疗HSV-2引起的生殖器疱疹的卡介菌多糖核酸注射剂的方法，其特征在于步骤(e)还包括在过滤前用pH值调节剂将pH值调节至6.0～7.2。

9.根据权利要求5所述的制备用于治疗HSV-2引起的生殖器疱疹的卡介菌多糖核酸注射剂的方法，其特征在于所述pH值调节剂包括氢氧化钠和盐酸。