CN101553246B - 蛋白质基质疫苗及这种疫苗的制备和给药方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有载体蛋白和包载在复合物中的目标抗原的疫苗组合物、制备这种疫苗的方法和给予疫苗的方法。

Description

蛋白质基质疫苗及这种疫苗的制备和给药方法

相关申请的交叉引用

该申请要求保护来自2006年8月7日提交的美国临时申请顺序号60/835,944和2007年6月8日提交的美国临时申请顺序号60/933,764的益处，其说明书通过引用结合到本文中。

关于联邦资助研究的声明

本发明是在国家健康研究所(National Institutes of Health)(NIH)授予的Grant No U54AI057159下由政府资助完成的。政府在本发明中拥有某些权利。

发明背景

本发明涉及疫苗组合物、疫苗制备方法和疫苗给予方法。

很多抗原特别是那些与病原体荚膜层相关的抗原对免疫应答刺激很小或不刺激，并使生成针对那些抗原的有效疫苗的努力变得复杂。荚膜是微生物的表面成分，通常由有机化合物如糖类、氨基酸或醇类的聚合物(polymer)组成。荚膜在化学上差异很大。构成荚膜的单体单位(例如糖类)可以各种分子构型连接在一起并进一步用磷酸基(phosphate)、氮、硫酸基(sulfate)和其它化学修饰基团取代。这些化学变化允许荚膜将众多的抗原靶标呈递到微生物表面，从而允许避免宿主免疫系统靶向这些靶标。荚膜还可以为防止微生物被宿主巨噬细胞和多核白细胞吞噬和杀死的毒力因子。针对荚膜的抗体通过使补体固定于微生物表面来提供针对荚膜生物有效的防御，补体可导致微生物溶解或其调理作用以及被有吞噬作用的宿主免疫细胞吸收并杀死。针对荚膜最有效的抗体是IgG抗体。不能诱导显著水平IgG的荚膜叫做非 T细胞依赖性抗原。蛋白质与荚膜的共价偶联致使其成为“T依赖性的”并且这种抗原可引发IgG应答。

存在着对安全、易合成、具有成本效益的、针对荚膜和其它不会引发强烈免疫应答或IgG抗体的非T细胞依赖性抗原疫苗的需求。需要这样的疫苗预防各种由炭疽杆菌、肺炎球菌、乙型流感、脑膜炎球菌和链球菌感染所致的传染病。

发明概述

本发明涉及含有被复合物中的载体蛋白包载的目标抗原的疫苗组合物、制备这种疫苗的方法和疫苗的给予方法。

因此，第一方面，本发明描述了含有目标抗原和载体蛋白的疫苗组合物，其中(i)不超过50％的目标抗原与载体蛋白交联，并且(ii)其中所述抗原被载体蛋白包载形成复合物。

在本发明第一方面期需的实施方案中，所述复合物直径在10nm-100μm之间。在本发明第一方面更期需的实施方案中，所述复合物直径在约100nm-100μm之间。在本发明第一方面还更期需的实施方案中，所述复合物直径在约100nm-10μm之间。

在本发明第一方面其它期需的实施方案中，当将复合物给予哺乳动物时，引发哺乳动物中T-细胞依赖的免疫应答。

在本发明第一方面另外期需的实施方案中，抗原与载体蛋白的摩尔比在1∶10和10∶1之间。理想地，所述载体蛋白是多聚体(multimer)，例如，包含至少5个亚基的多聚体。在其他期需的实施方案中，所述多聚体是同多聚体。

在本发明第一方面进一步期需的实施方案中，所述载体蛋白与至少一个其它载体蛋白共价连接。理想地，所述共价连接包括在赖氨酸侧链的伯氨基和天冬酰胺或谷氨酰胺侧链的羧基之间的肽键。在其它期需的实施方案中，所述共价连接包括式 的化合物，其中R_n是1-12个碳原子的直连或支链烷基、1-12个原子的直连或支链杂烷基(heteroalkyl)、2-12个碳原子的直连或支链烯烃、2-12个碳原子的直连或支链炔烃、5-10个碳原子的芳族残基、3-10个原子的环状体系、-(CH₂CH₂O)_qCH₂CH₂-其中q为1-4、或连接两个醛基的化学键。在另外期需的实施方案中，所述共价连接含有戊二醛、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester)、碳二亚胺或双偶氮联苯胺。还有在其它期需的实施方案中，所述共价连接包括双功能交联剂(cross linker)。理想地，所述双功能交联剂是戊二醛、双[磺酸基琥珀酰亚胺基]辛二酸酯(bis[sulfosuccinimidyl]suberate)或己二亚氨酸二甲酯。

在本发明第一方面其它期需的实施方案中，所述载体蛋白是非共价连接的。在期需的实施方案中，所述非共价连接包括疏水作用、离子作用、范德华作用或氢键。

在本发明第一方面另外期需的实施方案中，所述载体蛋白是白喉毒素或其突变体、白喉类毒素、破伤风毒素或其突变体、破伤风类毒素、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)外毒素A或其突变体、霍乱毒素B亚基、破伤风毒素片段C、细菌鞭毛蛋白(例如霍乱弧菌(Vibriocholerae)鞭毛蛋白)、肺炎球菌溶血素、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriamenningitidis)外膜蛋白、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)Hcp1蛋白、大肠杆菌(Escherichia coli)热不稳定肠毒素、志贺样毒素(例如志贺氏菌(Shigella)SltB2蛋白)、人LTB蛋白、肺炎球菌溶血素、李斯特菌溶素O(或相关蛋白)、完整细菌细胞(例如铜绿假单胞菌(Peudomonas aeruginosa)或链球菌(Streptococcal)细胞)的蛋白质提取物、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)保护抗原的显性负突变体(DNI)、或大肠杆菌(Escherichia coli)β-半乳糖苷酶。在具体期需的实施方案中，所述载体蛋白是肺炎球菌溶血素、李斯特菌溶素O、白喉毒素、白喉类毒素、破伤风毒素或破伤风类毒素。

在本发明第一方面其它期需的实施方案中，所述目标抗原是多 糖、多元醇或聚氨基酸。理想地，所述多糖包含至少18个残基。在其它期需的实施方案中，所述多糖是肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)多糖、土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)多糖、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)多糖、流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)多糖、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)多糖、沙门氏菌(Salmonella species)多糖、志贺氏菌(Shigella)多糖或脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria menningitidis)多糖。在具体期需的实施方案中，所述肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)多糖是1-48型荚膜中的任何一种，例如3、4、6B、7A、7B、7C、7F、9A、9L、9N、9V、12A、12B、12F、14、15A、15B、15C、15F、17、18B、18C、19F、23F、25A、25F、33F、35、37、38、44或46。在其它具体期需的实施方案中，所述土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)多糖是O抗原。

在本发明第一方面进一步期需的实施方案中，所述目标抗原是微生物荚膜聚合物。理想地，所述微生物荚膜聚合物是来自炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)的聚-γ-D-谷氨酸。

在本发明第一方面其它期需的实施方案中，所述目标抗原是由具有至少三个原子的单体组成的有机聚合物，其中每个原子独立地选自碳、氧、氢、磷酸基、氮和硫酸基。理想地，所述有机聚合物源自于微生物。在其它期需的实施方案中，所述有机聚合物不是天然存在的。

在另外期需的实施方案中，所述疫苗组合物进一步包含第二目标抗原。理想地，所述疫苗组合物还包含第三目标抗原。

在第二方面，本发明描述了制备疫苗组合物的方法。该方法包括(i)将目标抗原与载体蛋白混合形成抗原和载体蛋白混合物并且(ii)以载体蛋白包载目标抗原，其中不超过50％的目标抗原与疫苗组合物中的载体蛋白交联。

在本发明第二方面期需的实施方案中，所述疫苗组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。

在本发明第二方面其它期需的实施方案中，所述包载包括从混合 物中沉淀抗原和载体蛋白。理想地，所述沉淀包括：使混合物的pH变化；往混合物中加三氯乙酸(TCA)或硫酸铵；通过增加或减少混合物中无机盐的浓度改变混合物的离子强度；加热混合物使载体蛋白和/或抗原凝结；或者用足够通量的电离辐射辐照混合物引起交联。

在本发明第二方面期需的实施方案中，所述疫苗组合物的抗原与载体蛋白的摩尔比在1∶10-9∶10之间。

在本发明第二方面另外期需的实施方案中，所述载体蛋白是多聚体。理想地，多聚体包含至少5个亚基。在其它期需的实施方案中，所述多聚体是同多聚体。

在本发明第二方面进一步期需的实施方案中，所述载体蛋白非共价连接。理想地，所述非共价连接包括疏水作用、离子作用、范德华作用或氢键。

在本发明第二方面另外期需的实施方案中，所述载体蛋白是白喉毒素或其突变体、白喉类毒素、破伤风毒素或其突变体、破伤风类毒素、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)外毒素A或其突变体、霍乱毒素B亚基、破伤风毒素片段C、细菌鞭毛蛋白(例如霍乱弧菌(Vibriocholerae)鞭毛蛋白)、肺炎球菌溶血素、李斯特菌溶素O、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria menningitidis)外膜蛋白、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)Hcp1蛋白、大肠杆菌(Escherichia coli)热不稳定肠毒素、志贺样毒素(志贺氏菌(Shigella)SltB2蛋白)、人LTB蛋白、来自完整细菌细胞(例如铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa)或链球菌(Streptococcal)细胞)的蛋白质提取物、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)保护性抗原的显性负性突变体(DNI)、或大肠杆菌(Escherichia coli)β-半乳糖苷酶。在具体期需的实施方案中，所述载体蛋白是肺炎球菌溶血素、李斯特菌溶素O、白喉毒素、白喉类毒素、破伤风毒素或破伤风类毒素。

在本发明第二方面其他期需的实施方案中，所述目标抗原是多糖、多元醇或聚氨基酸。理想地，所述多糖包含至少18个残基。在 其它期需的实施方案中，所述多糖是肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)多糖、土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)多糖、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)多糖、流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)多糖、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)多糖、志贺氏菌(Shigella)多糖、沙门氏菌(Salmonella species)多糖或脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)多糖。在具体期需的实施方案中，所述肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)多糖是1-48型荚膜中的任何一种，例如3、4、6B、7A、7B、7C、7F、9A、9L、9N、9V、12A、12B、12F、14、15A、15B、15C、15F、17、18B、18C、19F、23F、25A、25F、33F、35、37、38、44或46。在其它具体期需的实施方案中，所述土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)多糖是O抗原。

在本发明第二方面另外期需的实施方案中，所述目标抗原是微生物荚膜聚合物。理想地，微生物荚膜聚合物是来自炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)的聚-γ-D-谷氨酸。

在本发明第一方面其它期需的实施方案中，所述目标抗原是由含有至少三个原子的单体组成的有机聚合物，其中每个原子独立地选自碳、氧、氢、磷酸基、氮和硫酸基。理想地，所述有机聚合物来源于微生物。在其它期需的实施方案中，所述有机聚合物不是自然存在的。

在本发明第二方面进一步期需的实施方案中，步骤(i)中的混合包括第二目标抗原乃至第三目标抗原。

在第三方面，本发明描述了另一个制备疫苗组合物的方法。该方法包括(i)将目标抗原与载体蛋白混合并且(ii)加入使载体蛋白交联的接头(linker)，其中不超过50％的目标抗原与疫苗组合物中的载体蛋白交联。

在本发明第三方面期需的实施方案中，所述疫苗组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。在本发明第三方面其它期需的实施方案中，所述疫苗组合物中抗原与载体蛋白的摩尔比在1∶10和10∶1之间。在本发明第三方面另外期需的实施方案中，所述载体蛋白是多聚体。 理想地，所述多聚体包含至少5个亚基。在其它期需的实施方案中，所述多聚体是同多聚体。

在本发明第三方面进一步期需的实施方案中，所述方法包括还原载体蛋白中的席夫碱。在本发明第三方面更进一步期需的实施方案中，所述载体蛋白与至少一种其它载体蛋白共价连接。理想地，所述共价连接包括在赖氨酸侧链的伯氨基和天冬酰胺或谷氨酰胺侧链的羧基之间的肽键。在其它期需的实施方案中，所述共价连接包括双功能交联剂。理想地，所述双功能交联剂是戊二醛、双[磺酸基琥珀酰亚胺]辛二酸酯或己二亚氨酸二甲酯。

在本发明第三方面另外期需的实施方案中，所述接头是式 的化合物，其中R_n是1-12个碳原子的直连或支链烷基、1-12个原子的直连或支链杂烷基、2-12个碳原子的直连或支链烯烃、2-12个碳原子的直连或支链炔烃、5-10个碳原子的芳族残基、3-10个原子的环状体系、-(CH₂CH₂O)_qCH₂CH₂-其中q是1-4、或者连接两个醛基的化学键。

在本发明第三方面其它期需的实施方案中，所述接头是戊二醛、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺基酯、碳二亚胺或双偶氮联苯胺。

在本发明第三方面另外期需的实施方案中，所述载体蛋白是白喉毒素或其突变体、白喉类毒素、破伤风毒素或其突变体、破伤风类毒素、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)外毒素A或其突变体、霍乱毒素B亚基、破伤风毒素片段C、细菌鞭毛蛋白(霍乱弧菌(Vibriocholerae)鞭毛蛋白)、肺炎球菌溶血素、李斯特菌溶素O、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria menningitidis)外膜蛋白、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)Hcp1蛋白、大肠杆菌(Escherichia coli)热不稳定肠毒素、志贺样毒素(志贺氏菌(Shigella)SltB2蛋白)、人LTB蛋白、来自完整细菌细胞(铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或链球菌(Streptococcal)细胞)的蛋白质提取物、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis) 保护性抗原的显性负性突变体(DNI)或大肠杆菌(Escherichia coli)β-半乳糖苷酶。

在本发明第三方面进一步期需的实施方案中，所述目标抗原是多糖、多元醇或聚氨基酸。理想地，所述多糖包含至少18个残基。在其它期需的实施方案中，所述多糖是肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)多糖、土拉热弗朗西丝氏菌(Francisellatularensis)多糖、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)多糖、流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)多糖、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)多糖、志贺氏菌(Shigella species)多糖、沙门氏菌(Salmonella species)多糖或脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)多糖。在具体期需的实施方案中，所述肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)多糖是1-48型荚膜中的任何一种，例如3、4、6B、7A、7B、7C、7F、9A、9L、9N、9V、12A、12B、12F、14、15A、15B、15C、15F、17、18B、18C、19F、23F、25A、25F、33F、35、37、38、44或46。在其它具体期需的实施方案中，所述土拉热弗朗西丝氏菌(Francisellatularensis)多糖是O抗原。

在本发明第三方面其它期需的实施方案中，所述目标抗原是微生物荚膜聚合物。理想地，所述微生物荚膜聚合物来自炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)的聚-γ-D-谷氨酸。

还有在本发明第三方面其它期需的实施方案中，所述目标抗原是由具有至少三个原子的单体组成的有机聚合物，其中每个原子独立选自碳、氧、氢、磷酸基、氮和硫酸基。理想地，所述有机聚合物来源于微生物。在另外期需的实施方案中，所述有机聚合物不是自然存在的。

在本发明第三方面进一步期需的实施方案中，步骤(i)中的混合包括第二目标抗原乃至第三目标抗原。

在第四个方面，本发明描述了对受试对象进行接种疫苗抵抗传染性病原体的方法。该方法包括给予受试对象足够量的本发明第一方面的疫苗组合物，以诱导受试对象产生抗体。在本发明第四方面期需的 实施方案中，所述方法包括第二个给予步骤，其中将足够量的本发明第一方面的疫苗组合物给予受试对象，以加强受试对象产生抗体。理想地，在本发明第四方面，抗体的产生是T细胞依赖性的。在本发明第四方面其它期需的实施方案中，所述抗体的产生足以预防或减少传染性病原体对受试对象的感染。理想地，所述传染性病原体是肺炎球菌、脑膜炎球菌、乙型流感嗜血菌(Haemophilus influenza Type B)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)、志贺氏菌(Shigella species)、沙门氏菌(Salmonella species)、不动杆菌(Acinetobacter species)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia species)或大肠杆菌(Escherichia coli)。

在本发明第四方面其它期需的实施方案中，所述方法包括第二给予步骤，其中将足够量的含有目标抗原的第二疫苗组合物提供给受试对象加强受试对象产生抗体。理想地，所述抗体的产生足以预防或减少第二传染性病原体对受试对象的感染。

在本发明第四方面期需的实施方案中，所述抗体是IgG抗体。在本发明第四方面进一步期需的实施方案中，所述受试对象是人。

在本发明任何一个方面期需的实施方案中，所述肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)多糖是在Kong等(J.Med.Microbiol.54：35-356，2005)中所描述的荚膜类型之一。例如，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)多糖荚膜类型期需的是1(例如，1-g或1-q)、2(例如，2-g、2-q或2-41A)、3(例如，3-g、3-q、3-c或3-nz)、4、5(例如5-q、5-c、5-qap或5-g)、6A(例如，6A-g、6A-c1、6A-c2、6A-n、6A-qap、6A-6B-g、6A-6B-q或6A-6B-s)、6B(例如，6B-c、6A-6B-g、6A-6B-q或6A-6B-s)、7F(例如，7F-7A)、7A(例如7A-cn或7F-7A)、7B(例如，7B-40)、7C(例如，7C-19C-24B)、8(例如，8-g或8-s)、9A(例如，9A-9V)、9L、9N、9V(例如，9A-9V)、9V和14、10F(例如，10F-q、10F-ca或10F-10C)、10A(例如，10A-17A或10A-23F)、10B(例如，10B-10C)、11F、11A(例如，11A-nz或11A-11D-18F)、 11B(例如，11B-11C)、11C(例如，11B-11C或11C-cn)、11D(例如，11A-11D-18F)、12F(例如，12F-q或12F-12A-12B)、12A(例如，12A-cn、12A-46、或12F-12A-12B)、12B(例如，12F-12A-12B)、13(例如，13-20)、14(例如，14-g、14-q、14-v或14-c)、15F(例如，15F-cn1或15F-cn2)、15A(例如，15A-ca1、15A-ca2、或15A-chw)、15B (例如，15B-c、15B-15C、15B-15C-22F-22A)、15C(例如，15C-ca、15C-q 1、15C-q2、15C-q3、15C-s、15B-15C或15B-15C-22F-22A)、16F(例如，16F-q或16F-nz)、16A、17F(例如，17F-n和17F-35B-35C-42)、17A (例如，17A-ca或10A-17A)、18F(例如，18F-ca、18F-w或11A-11D-18F)、18A(例如，18A-nz或18A-q)、18B(例如，18B-18C)、18C(例如，18B-18C)、19F(例如，19F-g1、19F-g2、19F-g3、19F-q、19F-n或19F-c)、19A(例如，19A-g、19A-或19A-ca)、19B、19C(例如，19C-cn1、19C-cn2或7C-19C-24B)、20(例如，13-20)、21(例如，21-ca或21-cn)、22F(例如，15B-15C-22F-22A)、23F(例如，23F-c，10A-23F或23F-23A)、23B(例如，23B-c或23B-q)、24F(例如，24F-cn1、24F-cn2或24F-cn3)、24A、24B(例如，7C-19C-24B)、25F(例如，25F-38)，25A，27，28F(例如，28F-28A或28F-cn)、28A(例如，28F-28A)、29(例如，29-caor29-q)、31、32F(例如，32F-32A)、32A(例如，32A-cn或32F-32A)、33F(例如，33F-g、33F-q、33F-chw、33F-33B或33F-33A-35A)、33A(例如，33F-33A-35A)、33B(例如，33B-q、33B-s或33F-33B)、33D、34(例如，34-ca或34s)、35F(例如，35F-47F)、35A(例如，33F-33A-35A)、35B(例如，17F-35B-35C-42)、36、37(例如，37-g or37-ca)、38(例如，25F-38)、39(例如，39-cn1或39-cn2)、40(例如，7B-40)、41F(例如，41F-cn或41F-s)、41A(例如，2-41A)、42(例如，17B-35B-35C-42)、43、44、45、46(例如，46-s或12A-46)、47F(例如，35F-47F)、47A、48(例如，48-cn1或48-cn2)、或GenBank登陆号AF532714或AF532715。

定义

本文中与疫苗结合使用的“给药”，意指为受试对象提供足够剂量的疫苗诱导受试对象体内的免疫应答，其中所述免疫应答导致与疫苗所含抗原特异结合的抗体的产生。期需给药包括肌肉注射、皮内注射或经皮注射，并且期需包括给予适当的免疫佐剂。给药可包括疫苗的单次给药或多剂量给药。理想地，设计第二次给药加强受试对象产生抗体，预防传染性病原体的感染。疫苗给药的频率和量依赖于疫苗的比活性并且很容易通过常规试验确定。

“交联”意指在两个分子、大分子或分子组合例如载体蛋白之间的共价键的形成，所述共价键的形成通过使用“零长度”接头来直接实现，或者利用第三个分子即化学接头来实现，所述化学接头具有两个官能团，每个能够与两个单独的分子之一形成共价键，或在同一分子的两个单独基团之间形成共价连接(即它们将形成能够环绕聚合物的“环”)。例示性的接头包括能够交联两个载体蛋白的双功能接头。交联还可发生在抗原和载体蛋白之间。

本文所使用的“抗原”意指任何与抗体或抗体片段特异性结合的分子或分子组合。

本文所使用的“双功能接头”意指有两个官能团的化合物，每个官能团能分别与两个单独的分子、原子或分子集合形成共价键。例如，G.T.Hermanson(BioconjugateTechniques，Academic Press，1996)和Dick和Beurret(Conjugate Vaccines.Contribu.Microbiol.Immunol.，Karger，Basal 10：48-114，1989)描述了例示性的双功能接头。理想地，双功能接头是戊二醛、双[磺酸基琥珀酰亚胺]辛二酸酯或己二亚氨酸二甲酯。

本文所使用的“接头”意指共价地连接两个或多个分子的化合物或化学键。理想地，接头是戊二醛或式 的化合物，其中R_n是1-12个碳原子的直连或支链烷基、1-12个原子的直连或支链杂烷基、2-12个碳原子的直连或支链烯烃、2-12个碳原子的直连或支链炔烃、5-10 个碳原子的芳族残基、3-10个原子的环状体系、-(CH₂CH₂O)_qCH₂CH₂-其中q为1-4、或连接两个醛基的化学键。可不使用连接分子直接进行连接。例如，可用碳二亚胺化学或用催化这种交联反应的转谷氨酰胺酶酶促作用，来使蛋白质的羧基与其氨基直接连接。

“加强抗体产生”意指发生在第二次暴露于抗原过程中的记忆B细胞的活化，称为“加强应答”，表明寿期长的“二次”记忆免疫应答，导致寿期长的抗体产生。

“载体蛋白”意指用于疫苗的蛋白质，其引起对其自身和/或对与载体蛋白复合的抗原的免疫应答。理想地，所述抗原通过被载体蛋白包载在复合物中来与载体蛋白非共价缔合。虽然如此，抗原和载体蛋白也可以彼此共价结合。理想地，所述载体蛋白包含被T-细胞识别的表位。作为分支肽的多抗原肽(MAP)也被“载体蛋白”的定义所包含。理想地，MAP包括赖氨酸。例示性的期需载体蛋白包括毒素和类毒素(化学的或基因的)，可以是突变体。理想地，载体蛋白是白喉毒素或其突变体、白喉类毒素、破伤风毒素或其突变体、破伤风类毒素、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A或其突变体、霍乱毒素B亚基、破伤风毒素片段C、细菌鞭毛蛋白、肺炎球菌溶血素、李斯特菌溶素O(和相关分子)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria menningitidis)外部膜蛋白、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)Hcp1蛋白、大肠杆菌(Escherichia coli)热不稳定肠毒素、志贺样毒素、人LTB蛋白、来自完整细菌细胞的蛋白质提取物、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)保护性抗原的显性负性突变体(DNI)、或大肠杆菌(Escherichia coli)β-半乳糖苷酶、或任何其它可被接头交联的蛋白质。

“DNI”意指显性负性突变体(DNI)蛋白，是炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)保护性抗原(PA)的突变形式，如Benson等(Biochemistry37：3941-3948，1998)所描述的。

本文所使用的有关抗原的“包载”意指在生理条件下保留在与载体蛋白所形成的复合物中的抗原。理想地，所述抗原包载于与载体蛋白 所形成的复合物中，在抗原和载体蛋白之间不存在显著共价连接。如在本文所使用的，不存在显著共价连接是指不超过50％的抗原与载体蛋白共价结合。理想地，不超过40％、30％、10％或5％的抗原与载体蛋白共价连接。

“感染”意指受试对象被微生物如细菌、真菌、寄生虫或病毒侵袭。感染可包括，例如，通常存在于受试对象体内或体表的微生物的过度增殖或通常不存在于受试对象中或表面的微生物的过度增殖。当过量的微生物群体存在于受试对象体内或体表或者当微生物群体的存在伤害细胞或引起受试对象的组织出现病理症状时，受试对象遭受微生物的感染。

“传染性病原体”意指引起感染的微生物。

“免疫原性的”意指在受试对象体内诱导免疫应答的化合物。理想地，所述免疫应答是T-细胞依赖的免疫应答，包括IgG抗体的产生。

“微生物”是指能够引起受试对象感染的细菌、真菌、寄生虫或病毒。

“微生物荚膜聚合物”是指存在于微生物荚膜外衣内部或表面的聚合物。理想地，微生物荚膜聚合物是有机聚合物如多糖、磷酸多糖、具有N-乙酰基取代的氨基糖的多糖、含有磺胺酰糖(sulfanylated sugar)的多糖、其它硫酸基修饰的糖或磷酸基修饰的糖、多元醇、聚氨基酸、磷壁质酸和脂多糖O侧链。

“单体”是指能够与相同单体形成两个或多个键的分子结构，当作为“聚合物”的一部分时，经常产生重复单体结构的链或一系列分支的、连接的链。

“有机聚合物”是指由共价连接的单体组成的聚合物，每个单体含有三个或更多个下列原子：碳、氧、氢、磷酸基、氮和硫酸基。理想地，所述有机聚合物是多糖、磷酸多糖、具有N-乙酰基取代的氨基糖的多糖、含有磺胺酰糖的多糖、其它硫酸基修饰的糖或磷酸基修饰的糖、糖、多元醇、聚氨基酸、磷壁质酸和脂多糖O侧链。

“多元醇”是指碳水化合物的氢化形式，其羰基被还原成伯羟基或仲羟基。例示性的多元醇是聚环氧烷烃(PAO)，如聚亚烷基乙二醇(PAG)，包括聚亚甲基乙二醇、聚乙二醇(PEG)、甲氧基聚乙二醇(mPEG)和聚丙二醇；聚乙烯醇(PVA)；乙烯-马来酸酐共聚物；苯乙烯-马来酸酐共聚物；包括羧甲基葡聚糖在内的葡聚糖；纤维素包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羧乙基纤维素和羟丙基纤维素；壳聚糖水解产物；淀粉如羟乙基淀粉和羟丙基淀粉；糖原；琼脂糖及其衍生物；瓜尔胶；支链淀粉；菊淀粉；黄原胶；卡拉胶；果胶；海藻酸水解产物；山梨醇；葡萄糖醇、甘露醇、半乳糖醇、阿拉伯糖醇、古洛糖醇、木糖醇、苏糖醇、山梨醇、果糖醇、甘油、麦芽糖醇、纤维二糖的醇、蔗糖的醇、支链淀粉的醇、支链淀粉的醇；或单丙二醇(MPG)。

“聚氨基酸”是指由肽键连接的至少两个氨基酸。理想地，所述聚氨基酸是含有重复氨基酸序列或相同氨基酸链的肽(即同聚物)。

“还原席夫碱”是指将甲亚胺或式R₁R₂C＝N-R₃化合物(R₁、R₂和R₃是化学结构，通常含有碳原子)暴露于用氢原子饱和席夫碱双键的还原剂。还原的方法为本领域技术人员所了解。

本文所使用的关于抗体或其片段的“特异性结合”是指抗体或抗体片段对相对于等量的任何其它蛋白质而言的特定蛋白质如抗原所增加的亲和力。理想地，根据使用标准方法如酶联免疫吸附测定法(ELISA)所测定，抗体或抗体片段对其抗原的亲和力至少2倍、5倍、10倍、30倍或100倍大于任何等量的其它抗原，包括相关抗原在内。

“受试对象”是指可被微生物感染的动物。期需受试对象是哺乳动物，如人、猴子、狗、猫、小鼠、大鼠、母牛、绵羊、山羊或马。在期需的实施方案中，所述受试对象是人，如小孩。理想地，所述受试对象是婴儿、学步儿童或青春期前儿童。

“T-细胞非依赖性抗原”是指在没有T淋巴细胞协作下导致抗体生成的抗原。理想地，所述T-细胞非依赖性抗原直接刺激B淋巴细胞而 无需T淋巴细胞的协作。例示性的期需T-细胞非依赖性抗原包括荚膜抗原聚-γ-D-谷氨酸(PGA)、藻酸酸(藻酸盐)、葡聚糖、多糖(PS)、聚氨基酸、多元醇和核酸。

优点

与现有的疫苗技术相比，本发明的疫苗制备简单，不易有化学问题，不易有免疫问题，便宜，比缀合技术更适应于不同的目标抗原和载体蛋白，更加灵活地用于生成多价疫苗(抵御多种抗原的疫苗)。

本发明疫苗不需要在载体蛋白和旨在诱发免疫应答的抗原之间的共价连接，因而与缀合疫苗技术相比简化了其制备方法并减少了制备成本。多糖(PS)-蛋白缀合疫苗由于过于昂贵而无法在发展中国家生产和销售；由于每种疫苗所需的高度专业的化学以及PS和载体蛋白的生产和纯化成本，传统缀合疫苗很难便宜地生产。

本发明的疫苗也表明了对可安全诱导免疫性对抗先前难处理抗原的疫苗的需求。这些疫苗可以是单价的(具有单种抗原诱导免疫应答)或多价的(具有多种抗原诱导多种免疫应答)。业已显示含有TLR(Toll样受体)配体的疫苗诱发对另外的难处理抗原的免疫应答，但它们与本发明疫苗相比具有不安全的倾向，因为TLR配体常常促发炎症，即使小剂量也有毒，具反应原性，并且可能引起不良症状。

本发明的其它特征和优点根据下面详述、附图和权利要求将是显而易见的。

附图简述

图1是关于缀合疫苗(PS和载体蛋白破伤风类毒素之间制备的缀合物)诱导抗PSIgG免疫应答的非限制性提议性途径的流程图。在该模型中，只有展示识别PS的抗体受体的B细胞与PS蛋白缀合物结合。因此，载体蛋白被结合到展示正确PS结合特异性的B细胞表面。

图2是PCMV和对照制剂的蛋白印迹分析图，通过SDS聚丙烯 酰胺凝胶电泳和用抗PA抗血清的蛋白印迹监测交联情况。DNI蛋白在戊二醛交联之前移动到84kDa处。正如条带迁移到分子量大于220kDa处所证实的一样，PCVM1-PCMV3(泳道1-3)显示DNI蛋白的广泛交联。不存在PGA下单独交联的DNI也显示同样的高分子量种类(species)(泳道5)。相反，与PGA混合但不用戊二醛处理的DNI显示与DNI共同迁移的条带或较低的分子量种类(泳道4)。

图3显示用来测量经过三个PCMV制剂(PCMV1-PCMV3，制剂1-3)和两个抗原对照制剂4和5免疫接种的小鼠体内IgM和IgG特异性抗DNI免疫应答的ELISA测定结果。DNI蛋白在除了不与戊二醛(glut)交联的对照制剂4之外的所有制剂中都具有高度的免疫原性。然而，这些特异的DNI免疫应答是唯一基于IgG的。虽然甚至在免疫接种的第7天也没有检测出抗DNI IgM，但在用PCMV制剂免疫接种17天的老鼠和仅用交联的DNI(制剂5)免疫接种的老鼠中可检测出显著的抗DNI IgG应答。在第30天注意到用所有制剂包括制剂4诱导的针对DNI的强烈的加强应答。

图4显示用来测量经过三个PCMV制剂(PCMV1-PCMV3，制剂1-3)和两个抗原对照制剂4和5免疫接种的小鼠体内IgM特异性抗PGA免疫应答的ELISA测定结果。抗PGA IgM应答显示了典型的荚膜聚合物模式。对照制剂4在第7天产生可检测的抗PGA IgM应答，但该应答在第17天或第30天没有加强。所有PCMV制剂在第7天均诱导抗PGA IgM应答，然后在第17天和30天唯独产生更强的抗PGAIgM应答。如所期望的，对照制剂5(仅为交联的DNI)不产生基于IgM或基于IgG的抗PGA应答。

图5显示用来测量经过三个PCMV制剂(PCMV1-PCMV3；制剂1-3)和两个抗原对照制剂4和5免疫接种的小鼠体内IgG特异性抗PGA免疫应答的ELISA测定结果。PCMV1-3产生强烈的基于IgG的抗PGA应答，其在第17天出现，然后在第30天明显得到加强。

图6显示免疫前和经过含有DNI和藻酸盐的PCMV(DNI-ALG C， DNI ALG A)及含有与藻酸盐(ALG)、葡聚糖(DEX)和PGA复合的DNI的“一锅”(“one pot”)三价PCMV制剂免疫接种后30天的混合血清IgM抗体效价。

图7显示经过含有DNI和藻酸盐的PCMV(DNI-ALG C，DNIALG A)及含有与藻酸盐(ALG)、葡聚糖(DEX)和PGA复合的DNI的“一锅”三价PCMV制剂免疫接种之后60天的抗原特异血清IgG抗体效价。

图8显示经过含有DNI和藻酸盐的PCMV(DNI-ALG C，DNIALG A)及含有与藻酸盐(ALG)、葡聚糖(DEX)和PGA复合的DNI的“一锅”三价PCMV制剂免疫接种后128天抗PS IgG抗体效价。

图9A和9B是用获自美国典型培养物保藏中心并由Merck制备的肺炎链球菌(S.pneumoniae)多糖(pss)或获自Serum Institute of India(SII)的pps进行的IL-6测定图。

图10是显示获自SII的pss 6B中的杂质可用处理2(trt 2；在1MNaOH中80℃保温1小时)去除的图。处理1(trt 1)是一连串5步苯酚提取，以将蛋白质从多糖中去除。

图11显示含有pss 6B的PCMV在诱导IgG产生上比 更有效。BSA＝牛血清白蛋白；DT＝白喉毒素；DTx＝白喉类毒素；TTx＝破伤风类毒素。

图12显示含有pss 6B的PCMV在诱导IgM产生上与 一样有效。

图13显示含有pss 6B的PCMV在诱导IgG产生上比 更有效。

图14-16显示含有pss 14的PCMV在诱导IgG产生上大约相当于 (DTx＝白喉类毒素；TTx＝破伤风类毒素)。

详述

本发明描述了疫苗组合物、所述组合物的制备方法和给药方法，以提供免疫性对抗T细胞不依赖性抗原或通常引起微弱免疫应答的抗 原如多糖(PS)、多元醇、聚氨基酸和其它有机聚合物。本发明的疫苗具有典型PS蛋白缀合疫苗的有效的免疫特性，但又期需地不同于缀合疫苗，不同点在于无需显著的共价原子连接来将目标抗原如PS或荚膜有机聚合物连接到载体蛋白。相反，用载体蛋白包载目标抗原如PS或荚膜有机聚合物。例如，可在可溶性抗原如PS或荚膜有机聚合物的存在下通过载体蛋白分子自身共价交联形成蛋白质基质：这些疫苗被称作蛋白质基质疫苗。彼此高度交联的载体蛋白可形成能够捕获抗原并促进抗原吸收和对免疫细胞内产生抗体的刺激作用的基质。载体蛋白基质可为封住抗原的“网格”形式或其中的抗原是“绳”而蛋白质或交联蛋白复合物是“珠”的一系列“串珠”的形式。如果载体蛋白围绕抗原形成环绕抗原的环或缠结抗原的三维网，则可使载体蛋白包载抗原。另外，所述载体和抗原可以是交联的，例如通过使抗原链与载体蛋白进行链内交联。在期需的实施方案中，所述抗原和载体蛋白是非共价连接的。这种非共价连接可包括疏水作用、离子作用、范德华作用或氢键。非共价连接可包括抗原与蛋白质复合物非共价缔合的物理几何结构(见以上“串珠”的比喻)。

载体蛋白无需自身进行交联来包载抗原。例如也可通过在水溶液中混合载体蛋白和抗原并沉淀载体蛋白，由此使抗原与蛋白共沉淀来包载抗原。也可通过沉淀来自抗原和载体蛋白混合物的化合物(例如明矾、六偏磷酸钠、聚磷嗪或由疏水或离子作用驱动的对蛋白质有亲和力的其他聚合物)来用载体蛋白包载抗原。沉淀蛋白质的方法在本领域是标准化的并且其中包括，例如，(1)改变混合物的pH，(2)通过增加或减少混合物中无机盐的浓度改变溶液的离子强度，(3)或者往混合物加入三氯乙酸(TCA)或硫酸铵，(4)加热混合物造成蛋白质凝固(即形成沉淀或凝胶)，(5)以一定方式化学修饰混合物中的蛋白质使其不能溶解，和(6)以足够通量的电离辐射(紫外线、γ射线或β射线)辐照蛋白质溶液引起蛋白质的交联和/或沉淀。

当使用病原体荚膜蛋白时，这种疫苗叫做蛋白荚膜基质疫苗 (PCMV)。如在实施例中所描述的，制备出PCMV，其包括基于模式T细胞非依赖性荚膜抗原：聚-γ-D-谷氨酸(PGA)以及海藻酸(藻酸盐)和葡聚糖；和例示性载体蛋白DNI的PCMV。PGA PCMV易于大量制备并且发现其诱导典型于PGA蛋白缀合疫苗的免疫应答。可在任何目标抗原存在下用任何很多可能的接头对任何很多可能的载体蛋白进行交联来制备本发明的疫苗。本文讨论了例示性和优选的接头、载体蛋白和目标抗原。

多糖(PS)是糖的聚合物。来源于荚膜的PS是涉及针对荚膜细菌病原体的保护性免疫的初次抗原组分(primary antigenic component)，这些细菌病原体例如有脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidi)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)和乙型流感嗜血菌(Haemophilus influenzae Type B)。用基于微生物PS的疫苗的免疫接种青少年和成年人在减少疾病困扰方面已经成功，但已证明对于提供幼龄儿童(即24个月以下的儿童)保护性免疫方面效果较低。幼龄儿童的适应性免疫系统全部还没有发育成熟，而T细胞非依赖性抗原如荚膜PS的免疫原性弱且不能在这些年轻的疫苗受者中引起长期的保护性免疫应答(即免疫记忆应答)。

T细胞非依赖性抗原如PS可通过PS与蛋白质的化学偶联被转化为T细胞依赖性抗原；这一化学偶联过程称作“缀合”且涉及PS结构中的原子和存在于“载体”蛋白氨基酸的侧链原子之间的共价连接形成。这种“缀合疫苗”更有效地促进诱导B细胞成熟和同种型转换，引发具有正确的抗PS保护性概况(profile)的水平高得多的抗体。保护性抗体对其PS抗原有着高亲和力，通常是免疫球蛋白G(IgG)亚类、具有补体固定活性和调理素效应子活性的寿期长的抗体。

图1显示了关于PS和载体蛋白破伤风类毒素之间的缀合物诱导抗PS IgG免疫应答的例示性非限制性途径。在该模型中，只有展示可识别PS的抗体受体的B细胞与PS蛋白缀合物结合。因此，载体蛋白被结合至显示正确PS结合特异性的B细胞表面。蛋白-PS复合物被这些B细胞吸收到分子内液泡区室，在这里载体受到蛋白质降解作用加工。得自蛋白质载体的肽被转运并负载到MHC II类受体(MHC-II)的呈递沟(presentation groove)中。该MHC-II-载体肽复合物展示于B细胞的表面。当MHC-II-肽复合物被T细胞受体(TCR)识别时，T细胞受激活并分泌为诱导B细胞分化提供“辅助”的细胞因子。B细胞在数量上得到扩大并分化成现成分泌抗体的“浆细胞”。最初免疫球蛋白M(IgM)由浆细胞生成但最终T细胞的辅助致使浆细胞进行类别转换并生成其它同种型类别的抗体如IgG。这一过程随着浆细胞经历突变而继续，导致产生对PS蛋白缀合物有更高亲和力的抗体受体。当抗原被清除时，只有高亲和力的浆细胞被保留在循环中残余的PS蛋白缀合物激活。浆细胞的T细胞依赖的成熟过程的继续，导致浆细胞群的扩张，产生高亲和力的IgG类抗体。通过测量经免疫接种的受试对象如人血清内抗PS IgG抗体的水平，可以很容易地监测到扩张情况。

最终成熟和转换过程导致寿期长的并对PS特异的记忆B细胞的生成。记忆B细胞具有独特的特性，即如果暴露于PS则立即被激活。激活引起记忆B细胞增殖并快速产生抗PSIgG。发生在第二次暴露于PS抗原过程中的记忆B细胞的激活称作“加强应答”并表现出寿期长的“二次”记忆免疫应答。初次免疫可刺激IgM抗体和一些IgG抗体的产生。在二次免疫，即“加强”注射时，已经被初次免疫程序化的记忆细胞受到刺激而产生大量的IgG，即记忆免疫应答。

T细胞非依赖性抗原通常不刺激持久性免疫，即IgG抗体的产生，但可刺激较低效的更为临时性的IgM抗体的产生。因而，PS抗原通常不单独产生IgG加强应答。然而，如果用PS蛋白缀合物进行初次免疫，PS就会产生加强应答，因为由缀合物诱导的记忆细胞已经被程序化产生IgG。的确，在被经接种疫苗的动物或人体内的加强应答被认为是模拟由于暴露于展示PS的微生物而产生的保护性反应；这种长期的记忆对于用缀合疫苗免疫接种数年后在保护免疫对象方面起作用的疫苗是很关键的。因此，PS蛋白缀合物的价值在于(1)它们诱导抗PS抗原的高水平IgG的能力，(2)它们诱导针对PS抗原的记忆免疫应答的能力。PS抗原通常不显示这些特性因而是次等的抗原。在合成缀合抗原方面的困难以及它们的生产成本致使针对很多细菌疾病(其中对PS的免疫应答可能是保护性)的缀合疫苗的开发进展缓慢。

其它T细胞非依赖性抗原包括氨基酸同聚物，如聚-γ-D-谷氨酸(PGA)和多元醇。的确，大多数生物聚合物是T细胞非依赖性抗原。聚合物由于其化学结构(表位)的重复特性可与识别它们的B细胞免疫球蛋白(Ig)受体交联。因此聚合物可以与多糖同样的方式激活B细胞产生抗聚合物的IgM。例如，氨基酸同聚物，炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)的聚-γ-D-谷氨酸(PGA)，是免疫原性弱和T细胞非依赖性抗原的荚膜聚合物。由与蛋白质载体缀合的PGA组成的疫苗是高度免疫原性的，能够诱导抗PGA IgG并且对PGA有免疫记忆。因此。大多数聚合物在它们的免疫原性方面像PS一样起反应，因为它们不能够在MHC-II背景下被加工和展示，因此不能募集T细胞的辅助。在一些天然存在的与另一个类称作Toll样受体(TLR)的受体相互作用的聚合物中发现例外。一旦被激活，TLR可通过宿主细胞来诱导细胞因子产生并使适应性免疫应答产生改变。一些PS与TLR配体共价连接或受到这种配体污染(contaminate)。例如，脂多糖(LPS)是高度免疫原性的、诱导IgG和记忆应答的PS；LPS的脂A部分是TLR配体，可负责免疫学特性。

在另一个实例中，已经发现少数肺炎球菌PS即使它们不与蛋白载体相连也展现缀合疫苗的某些免疫学特性，即它们诱导向IgG的同种型转换。最近，商业多糖疫苗Pneumovax-23，以及来自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)不同菌株的个别PS，发现被TLR配体污染(Sen等，J.Immunol.175：3084-3091，2005)。这一发现可以解释为什么这些PS制剂在不存在蛋白缀合下能够诱导向IgG的同种型转换。这些肺炎球菌PS诱导巨噬细胞分泌IL-6和TNF-α。然而，通过苯酚萃取提取经进一步纯化的PS则不能诱导巨噬细胞分泌细胞因子。在免 疫研究中，经苯酚提取的PS免疫原性弱且不再诱导抗PS IgG。因此，苯酚提取除去负责该PS制剂的这些异常免疫学特性的污染分子。污染分子似乎是提供激活巨噬细胞TLR依赖性细胞因子应答能力的TLR配体。通过苯酚提取对PS的进一步纯化除去了所述污染TLR配体并且致使PS完全成为T细胞依赖性。

以上实例说明PS抗原可以起到如PS-蛋白缀合抗原一样的作用而无需蛋白质与碳水化合物的共价连接。不幸的是，TLR配体通常是促炎症的。例如，LPS即使是很小的剂量也是有毒的。因此，虽然将TLR配体与PS混合可能扩大对PS的免疫应答，但这一方法还可能产生具反应原性的或引起疫苗受者不良症状的疫苗。缀合疫苗技术保留了用于制备具有所需免疫原性谱和安全性的PS疫苗的可选方法。

随PS-蛋白缀合疫苗的开发已经大大地减少了由侵袭性细菌病原体引起的儿童疾病负担。为数较少的这些疫苗包括抗乙型流感嗜血菌(Haemophilus influenzae B Type)疫苗和某些脑膜炎球菌和链球菌菌株在发达国家是市面可售的。这些PS-蛋白缀合疫苗在发展中国家由于过于昂贵而无法在发展中国家生产和销售。例如，商业可售的七价肺炎球菌缀合疫苗价值约每剂$58(2006年时的美元)，并且需要服用四剂。单单价格就使这些疫苗为那些在发展中国家承担疾病负担的人们力所不及。

由于所涉及的化学和PS和载体蛋白的生产及纯化成本，传统的缀合疫苗难以进行低价生产。通常在缀合前二者都需要具有相当的纯度，化学反应才得以以合理的偶联效率来进行。通常，偶联化学必须对在所选PS和载体蛋白的化学方面独特的各种PS奏效。这种偶联化学在PS中引入官能团，后者其后可经过赖氨酸的ε氨基侧链与载体蛋白连接。引入这些偶联基团的PS化学修饰可破坏PS上的表位并引入新的表位(例如，与接头或修饰的糖基相关的表位)，其显著性只有通过认真仔细的免疫学分析才能评估。此外，对于传统的PS-蛋白缀合疫苗，PS的大小、每个蛋白载体分子所连接的PS分子数目、所选 载体的性质以及连接化学的类型都可以影响缀合疫苗的免疫原性。因此，例如在肺炎球菌病(其中每种90+已知血清型都具有不同的PS结构(Bentley等，PLOS Genetics 2(3)：e31262-269，2006))的情况下，一种单一的缀合方法可能不适合所有的血清型。重复合成(reproduciblysynthesize)具有重复免疫学特性(reproducible immunological property)的缀合疫苗涉及：对PS的大小、每个载体蛋白分子所连接的PS分子数目、所选载体的性质以及连接化学的类型进行仔细控制，而这又显著地增加了制造缀合疫苗的成本。

抗生素抗性的出现使对开发安全有效的疫苗迫切性更为突出。制造广泛可用的疫苗，尤其是对于发展中国家而言，还需要制造节省成本的疫苗。使针对来自一个或多个细菌种类不同血清型的多种多糖抗原的缀合联苗，合并到儿童期的免疫方案中，这将简化高危人群的疫苗给药。然而，现有的缀合疫苗技术是不划算的，因此缀合联苗(combinationconjugate vaccine)几乎不可能在发展中国家普及。的确，甚至在已建立了强大市场的发达国家，最近Wyeth 7-价缀合肺炎球菌疫苗的供应短缺说明了生产和储存需要复杂缀合疫苗合成技术的疫苗是多么困难。

在期需的实施方案中，本发明的疫苗是多价荚膜基质疫苗(PCMV)，其中一种或多个细菌荚膜组分被包载到多价载体蛋白基质中。制备PCMV很容易，因为作为起始材料之一的目标抗原，例如荚膜，仅仅需要适当的纯度。例如，Vedan聚γ-D-谷氨酸(PGA)也是不纯的(它在DNI上携带蛋白酶活性)，如在本文所描述的，其行为完全如同所料想的T细胞非依赖性抗原(实施例1)。在所有三种PCMV制剂(蛋白质与PGA比率在其7倍以上范围有所不同)中的PGA向PCMV的参入是成功的。

因为制备本发明疫苗的方法不需要任何目标抗原例如荚膜多糖的化学知识，该方法不依赖开发与目标抗原和载体蛋白化学可容的交联化学的需要。虽然某些抗原仍可能与接头相互作用，但这不应减损 疫苗的效能，因为目标抗原和载体蛋白的无意交联无论如何将可料到是具有免疫原特性的。在本发明的疫苗中，目标抗原与载体蛋白的交联不是使疫苗有效所必需的。这与传统缀合疫苗形成鲜明对比，因此在其制备和开发中受到阻碍。本发明的疫苗期需具有至少，例如1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％乃至100％交联的载体蛋白，并且不超过，例如1％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的目标抗原与载体蛋白交联。理想地，不超过10％的抗原与载体蛋白交联且至少50％的载体蛋白被交联。

本文所描述的制备疫苗的方法没有导致目标抗原例如荚膜聚合物被广泛修饰。抗原通常保持同样的状态，可能的修饰是例如对于在聚合物链的末端携带这种基团的PS荚膜而言还原糖的还原(reduction)。这种微小的修饰不可能影响到大多数荚膜PS的免疫原性，因为聚合物内部残基比末端糖丰富100-1000倍。相反，对于传统的缀合疫苗，通常需要将接头基团引入抗原例如荚膜聚合物，用作载体蛋白的共价连接点。需要使用接头，因为很多抗原例如荚膜聚合物没有作为其结构的一部分的反应基例如羧基或氨基。例如，将接头化学引入PS可导致荚膜表位的破坏和由于其与宿主自身表位未知的免疫交叉反应性而在疫苗制品中产生不期望的新的表位。

本文所描述的疫苗制备方法不如缀合疫苗技术复杂，因为其化学仅依赖载体蛋白(例如DNI，霍乱毒素B亚基，白喉毒素、破伤风毒素片段C或大肠杆菌(Escherichia coli)β-半乳糖苷酶)的交联化学。例如，当与DNI混合时荚膜聚合物虽然影响交联率，但并不影响交联的模式或程度，这两者更多地受控于所使用的蛋白质、浓度和所加入的交联剂(例如戊二醛)浓度。可以容易地调整这些参数，从而减少制备疫苗所需的时间和努力，节省费用。

可使用本文所描述的制备PCMV的方法，连同任何抗原例如任何荚膜聚合物或任何带有少数氨基或无氨基的聚合物、和任何可被交联 的载体蛋白例如没有可被硼氢化物还原作用破坏的关键表位的载体蛋白。在本文所描述方法中使用的载体蛋白期需具有至少2个赖氨酸残基或开放的(unblocked)并经化学修饰可进行交联的其它残基。破伤风类毒素是一种可能的载体蛋白。该毒素通过使用甲醛进行解毒，甲醛是与蛋白质的氨基反应的试剂。其它期需的载体蛋白包括霍乱毒素B亚基(购自SBL Vaccin AB)、白喉毒素、破伤风毒素片段C(购自SigmaAldrich)、DNI或来自大肠杆菌(Escherichia coli)的β-半乳糖苷酶(购自Sigma Aldrich)。

当前多价缀合疫苗通过首先合成个别的缀合疫苗，随后将它们混合产生“混合物”缀合疫苗来制备(例如，Wyeth七价肺炎球菌疫苗， )。通过将化学不同的抗原例如荚膜有机聚合物混合到一起随后用例如戊二醛使载体蛋白交联，或者通过将分别合成的本发明特定疫苗混合，可以使用本发明制备疫苗的方法制备多价的疫苗。该灵活性为本发明制备多价疫苗的方法提供了显著优势。

在实施例中所讨论的本发明例示性疫苗PCMV疫苗#1-3，其性能有如缀合疫苗，尽管事实上这些疫苗经过不预期产生任何共价键的方法来合成，所述共价键在构成PGA分子的原子和构成DNI蛋白的原子之间形成。戊二醛专一地与由赖氨酸残基的ε氨基所代表的蛋白质氨基侧链起反应。PGA聚合物没有游离氨基且仅具有不与戊二醛反应的羧基侧链。因此，由PCMV产生的类似缀合物所产生的免疫应答表明长的PGA分子被分子地包载在DNI蛋白质分子交联基质内部。

按照非限制性模式，所述包载的作用是携带DNI蛋白和PGA进入B细胞，而B细胞借助免疫识别PGA的Ig受体与这种基质结合。一旦被这些B细胞吸收，所述基质以与传统的缀合疫苗相似的方式被降解，这会导致在相应B细胞的MHC-II分子上展示的DNI衍生肽的产生。这随即募集T细胞的附助从而导致这种B细胞的扩增和成熟，成为产生对PGA特异的产IgG浆细胞和记忆细胞。因此，根据非限制性模式，PCMV在免疫上起类似于蛋白-缀合荚膜疫苗的作用却又截然不同，因为 PCMV缺乏载体蛋白和荚膜聚合物之间的显著共价连接。

包括PCMV在内的本发明的疫苗可用于组合，例如用于儿科疫苗。另外，本发明的疫苗可用于接种对抗，例如，肺炎球菌感染、(A组和B组)链球菌感染、乙型流感嗜血菌(Haemophilus influenzae Type B)(“HiB”)感染、脑膜炎球菌(例如，脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitides))感染，并可用作来自革兰氏阴性细菌(例如，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、土拉热弗朗西丝氏菌(Francisellatularensis)(Thirumalapura等，J.Med.Microbiol.54：693-695，2005；Vinogradov和Perry，Carbohydr.Res.339：1643-1648，2004；Vinogradov等，Carbohydr.Res.214：289-297，1991)、志贺氏菌(Shigella species)、沙门氏菌(Salmonella species)、不动杆菌(Acinetobacter species)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia species)和大肠杆菌(Escherichia coli))的O抗原疫苗。

本发明疫苗可通过以下方式制备：在一种或多种例如在本文所描述的目标抗原的存在下，使用任何例如那些在本文所描述的接头使任何例如那些在本文所描述的载体蛋白交联。如果使用一种目标抗原，本发明蛋白基质疫苗则被认为是单价疫苗。如果使用多于一种目标抗原，本发明的蛋白基质疫苗则被认为是多价疫苗。如果微生物荚膜聚合物是目标抗原，本发明蛋白基质疫苗则被认为是蛋白荚膜基质疫苗(PCMV)。

接头

载体蛋白交联在本技术领域已为人熟知，包括戊二醛、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺基酯、碳二亚胺和双偶氮联苯胺。

使用同质双功能或异质双功能接头直接交联载体蛋白的一般方法和部分已有描述，例如在G.T.Hermanson in Bioconjugate Techniques，Academic Press，1996和Dick和Beurret in Conjugate Vaccines.Contribu.Microbiol.Immunol.，Karger，Basal 10：48-114，1989中。例如，对于具有 数目为n的赖氨酸部分的载体蛋白而言，理论上，有n+1个伯胺(包括末端胺)可用于与例示性交联剂的羧基反应。因此，若使用该直接缀合方法，产物仅限于具有所形成的n+1个酰胺键。

在本发明期需的实施方案中所使用的接头，最简单不过，是连接两个载体蛋白的键。所述接头可以是直链、环状或支链的分子骨架，带有与两个载体蛋白(A)和(B)共价连接的侧基。任何给定的载体蛋白都可与多于一个载体蛋白连接，从而产生可封闭(enclose)抗原的互联的载体蛋白基质。

术语连接基团是指由接头(L)的反应部分与官能团(A)和(B)结合所产生的共价键。所述连接基团的实例包括但不限于：酯、氨基甲酸酯、硫酯、亚胺、二硫化物、酰胺、醚、硫醚、磺酰胺、异脲、异硫脲、亚氨酸酯、脒、氨基磷酸酯、磷酸二酯、硫醚和腙。

(A)与(B)的连接通过共价的方式实现，包括与位于(A)和(B)上的一个或多个官能团形成键(连接基团)。可用于此目的的化学反应官能团的实例包括但不限于：氨基、羟基、巯基、羧基、羰基、硫醚(thioether)、胍基(guanidinyl)、咪唑基和酚基，所有这些基团都存在于许多载体蛋白中的天然氨基酸中。

因此可用含有反应部分的接头(L)影响(A)与(B)的共价连接，该反应部分能与存在于(A)和(B)的所述官能团反应。该反应的产物是连接基团，其含有连接(L)与(A)以及连接(L)与(B)的新形成的键。例如，羟基(A)可与(L)羧基或其活化的衍生物反应，参见下文，导致酯连接基团的形成。

能够与巯基反应的部分的实例包括XCH₂CO-型(其中X＝Br，Cl，或I)的α-卤代乙酰基化合物，其显示与巯基特定的反应性，但还可用于修饰咪唑基、硫醚(thioether)、苯酚和氨基，这正如例如Gurd，MethodsEnzymol.11：532，1967所描述。N-马来酰亚胺衍生物被认为对巯基具有选择性，但在特定条件下可另外用于偶联氨基。如果连接通过形成 二硫桥进行，那么例如通过氨基转换引入巯基的2-亚氨基硫杂环戊烷的试剂(Traut等，Biochemistry 12：3266，1973)可考虑作为巯基试剂。

能够与氨基反应的反应部分的实例包括，例如，烷化和酰化试剂。具代表性的烷化试剂包括：

(i)α-卤代乙酰基化合物，在活性巯基不存在时显示对氨基的特异性并且为XCH₂CO-型(其中X＝Cl，Br或I)，这正如Wong(Biochemistry 24：5337，1979)所描述；

(ii)N-马来酰亚胺衍生物，可通过Michael反应或通过加入环羰基的酰化作用与氨基反应，这正如Smyth等(J.Am.Chem.Soc.82：4600，1960和Biochem.J.91：589，1964)所描述；

(iii)芳基卤，例如反应性硝基卤芳族化合物；

(iv)烷基卤，如例如McKenzie等(J.Protein Chem.7：581，1988)所描述的；

(v)能够与氨基反应形成席夫碱的醛和酮，通常通过还原得到稳定的胺使形成的加成物稳定；

(vi)环氧衍生物，如环氧氯丙烷和双环氧乙烷，可与氨基、巯基或酚羟基反应；

(vii)s-三嗪的含氯衍生物，与亲核试剂如氨基、巯基和羟基有很强的反应活性；

(viii)上述s-三嗪化合物的氮丙啶，如Ross(J.Adv.Cancer Res.2：1，1954)所描述，通过开环与亲核试剂如氨基反应；

(ix)如Tietze(Chem.Ber.124：1215，1991)所描述的方酸二乙酯；和

(x)α-卤代烷醚，是比一般的烷基卤更具反应性的烷化试剂，因为醚氧原子产生活化作用，这正如例如Benneche等(Eur.J.Med.Chem.28：463，1993)所描述。

具代表性的氨基反应酰化试剂包括：

(i)异氰酸酯和异硫氰酸酯，尤其是芳族衍生物，分别形成稳定的脲和硫脲衍生物；

(ii)磺酰氯，已由Herzig等(Biopolymers 2：349，1964)作描述；

(iii)酰基卤；

(iv)活性酯，例如硝基苯酯或N-羟基琥珀酰亚胺酯；

(v)酸酐，如混合酸酐、对称酸酐或N-羧酸酐；

(Vi)其它对于酰胺键形成有用的试剂，如M.Bodansky(Principlesof PeptideSynthesis，Springer-Verlag，1984)所描述的；

(vii)酰基叠氮化合物，例如用亚硝酸钠由预制的酰肼衍生物生成的叠氮基，如Wetz等(Anal.Biochem.58：347，1974)所描述；和

(viii)亚氨酸酯，其与氨基反应形成稳定的脒，这如例如Hunter和Ludwig(J.Am.Chem.Soc.84：3491，1962)所描述。

醛类例如戊二醛和酮可与胺反应形成席夫碱，可通过还原胺化作用有利地进行稳定。烷氧氨基部分易于与酮和醛反应产生稳定的烷氧基胺(alkoxamine)，这如例如Webb等(Bioconjugate Chem.1：96，1990)所描述的。

能够与羧基反应的活性部分的实例包括重氮化合物如重氮基乙酸酯和重氮基乙酰胺，它们以高度特异性进行反应产生酯基，如Herriot(Adv.Protein Chem.3：169，1947)所描述。也可使用羧酸修饰试剂例如碳化二亚胺，其通过O-酰基脲的形成再通过酰胺键的形成进行反应得到。

在(A)和/或(B)中的官能团，如有需要，可在反应前转化成其它官能团，例如以赋予另外的反应性或选择性。用于此目的的方法实例包括：使用如二元羧酸酐的试剂使胺转换成羧酸；使用试剂如N-乙酰高半胱氨酸硫内酯、S-乙酰巯基琥珀酸酐、2-亚氨基硫杂环戊烷达到或含有硫羟基的琥珀酰亚胺基衍生物来使胺转换成硫醇；使用例如α-卤乙酸酯的试剂使硫醇转换成羧酸；使用例如氮丙啶或2-溴乙胺的试剂使硫醇转换成胺；使用例如碳二亚胺的试剂随后使用二胺使羧酸转换 成胺；使用例如对甲苯磺酰氯的试剂随后用硫代乙酸酯进行酯交换作用并用乙酸钠水解成硫醇来使醇转换成硫醇。

若有需要，可依照本发明使用所谓的零长接头，其涉及活性化学基团(A)与活性化学基团(B)在不引入另外连接材料的情况下直接进行共价连接。实例所包括的化合物，其中(L)代表连接(A)上的氧原子和存在于(B)上的羰基或硫代羰基部分的化学键，致使连接基团是酯或硫酯。例如，可通过使用碳二亚胺化学产生A-L-B，使氨基(A)连接到羧基(B)，其中L是酰胺键或连接到N-R的R-C＝O，其中R是来自同一个或两个不同蛋白质分子的氨基酸侧链的碳链。

然而，最常见的是，所述接头包括由上述间隔元件连接的两个或更多个活性部分。间隔物的存在允许双功能接头与(A)和(B)中的特定官能团反应，产生这两个化合物之间的共价连接。接头(L)中的活性部分可以相同(同质双功能接头)或者不同(异质双功能接头、或者其中存在几个相异活性部分的异质多功能接头)，这提供多种可在(A)和(B)之间产生共价连接的潜在试剂。

间隔元件通常由链组成，这些链通过以下基团有效地分离(A)和(B)：1-10个碳原子的直连或支链烷基、1-10个原子的直连或支链杂烷基、2-10个碳原子的直连或支链烯烃、2-10个碳原子的直连或支链炔烃、5-10个碳原子的芳族残基、3-10个原子的环状体系或-(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂-(其中n为1-4)。

连接剂所引入的外来材料的性质可能对最终疫苗制品的药物动力学和/或活性有影响。因此，期需引入可裂解的接头，它含有可生物降解或化学敏感的或掺入酶切位点的间隔臂。

这些可裂解的接头，例如在PCT公开WO 92/17436(通过引用结合到本文中)中所描述的，在体内易被生物降解。在某些情况下，连接基团在酯酶的存在下被裂解，在这种酶不存在的情况下则保持稳定。因此，可有利地将(A)和(B)连接以允许它们通过患病部位附近活跃的酶而缓慢释放。

接头可形成具有式I的可生物降解的二酯、二酰胺或二氨基甲酸酯基团的连接基团：

--(Z¹)_o-(Y¹)_u-(Z²)_s-(R₁₁)-(Z³)_t-(Y²)_v-(Z⁴)_p-

I

其中，Z¹、Z²、Z³和Z⁴中的每一个独立选自O、S和NR₁₂(其中R₁₂是氢或烷基)；Y¹和Y²中的每一个独立选自羰基、硫代羰基、磺酰基、磷酰基或类似的酸形成基团；o、p、s、t、u和v中的每一个都独立为0或者1；R₁₁是1-10个碳原子的直连或支链烷基、1-10个原子的直连或支链杂烷基、2-10个碳原子的直连或支链烯烃、2-10个碳原子的直连或支链炔烃、5-10个碳原子的芳族残基、3-10个原子的环状体系、-(CH₂CH₂O)_qCH₂CH₂-其中q为1-4、或者将-(Z¹)_o-(Y¹)_u-(Z²)_s-连接到-(Z³)_t-(Y²)_v-(Z⁴)_p-的化学键。

本发明所使用的例示性的期需接头(L)可用式II-III中的任何一个分子来描述：

其中所述接头与氧原子(A)和氧原子(B)共价连接。因此，式II-III的接头(L)通过二吡喃、酯或氨基甲酸酯连接基团与载体蛋白(A)和(B)连接。在这些实施方案中，R₁₃代表1-10个碳原子的直连或支链烷基、1-10个原子的直连或支链杂烷基、2-10个碳原子的直连或支链烯烃、2-10个碳原子的直连或支链炔烃、5-10个碳原子的芳族残基、3-10个原子的环状体系、其中n为1-4的-(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂-或连接两个氮或两个羰基的化学键。

为形成腙键而设计的接头具有化学式IV：

其中Z⁵选自O、S或NR₁₆；R₁₆是氢或烷基；R₁₅选自氢、烷基或杂烷基；Y³选自羰基、硫代羰基、磺酰基、磷酰基或与氧原子(A)共价连接的类似的酸形成基团；w是0或1；R₁₄是1-10个碳原子的直连或支链烷基、1-10个原子的直连或支链杂烷基、2-10个碳原子的直连或支链烯烃、2-10个碳原子的直连或支链炔烃、5-10个碳原子的芳族残基、3-10个原子的环状体系、n是1-4的-(CH₂CH₂O)_nCH₂CH₂-、或者将-(Y³)-(Z⁵)_w-连接到 的化学键；而X₄是腙，由含有酰肼基的(B)和接头II前体的缩合反应产生，其中X₄是酮或醛基的氧原子。

载体蛋白

一般而言，任何可以在生理条件下与抗原包载的载体蛋白可在本发明中可使用。理想地，所述抗原与载体蛋白包载在复合物中，而在抗原和载体蛋白之间不存在显著的共价连接时。不存在显著的共价连接，意指不超过50％的抗原与载体连接。在期需的实施方案中，不超过40％、30％、10％或5％的抗原与载体蛋白共价连接。所述抗原/载体蛋白复合物可含有另一种化合物如明矾，并且这另一种化合物，在期需的实施方案中，可以包载抗原和载体蛋白。

理想地，用于本发明疫苗的载体蛋白是那些单独的或与抗原结合的蛋白质，其引起受试对象的免疫应答。理想地，所述载体蛋白含有至少一个被T细胞识别的表位。理想地，所述表位能够诱导受试对象的T细胞应答，并诱导B细胞产生针对整个目标抗原的抗体。用于描述本发明的表位，包括负责与抗体分子或其片段进行特异反应的抗原上的任何决定簇。表位决定簇通常由诸如氨基酸或糖侧链的分子的化学活性表面簇(grouping)组成，具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。为了具有免疫原性，蛋白质或多肽通常能够刺激T细胞。然 而，缺乏被T细胞识别的表位的载体蛋白也可具有免疫原性。

通过对已知引起强烈免疫应答的载体蛋白进行选择，可以用本文所述的PCMV治疗不同群体的受试对象。载体蛋白期需与引起对疫苗的强烈免疫应答完全无关(sufficiently foreign)。典型地，所使用的载体蛋白是能够赋予目标抗原免疫原性的分子。在一个期需的实施方案中，载体蛋白本来具有高度免疫原性。因此，具有高度的免疫原性并能使针对与其复合的抗原的抗体产量最大化的载体蛋白是理想的。

本发明的各种载体蛋白包括，例如，毒素和类毒素(化学的或遗传的)，其可以是或者不是突变体，如炭疽热毒素、PA和DNI(PharmAthene，Inc.)、白喉类毒素(MassachusettsState BiologicalLabs；Serum Institute of India，Ltd.)或CRM 197、破伤风毒素、破伤风类毒素(Massachusetts State Biological Labs；Serum Institute of India，Ltd.)、破伤风毒素片段Z、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A或外毒素A突变体、细菌鞭毛蛋白、肺炎球菌溶血素、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)外膜蛋白(菌株由ATCC提供(美国典型培养物中心，Manassas，VA))、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)Hcp1蛋白、大肠杆菌(Escherichia coli)热不稳定肠毒素、志贺样毒素、人LTB蛋白、来自完整细菌细胞的蛋白提取物、可通过接头进行交联的任何其它蛋白。理想地，所述载体蛋白是霍乱毒素B亚基(由SBL Vaccin AB提供)、白喉毒素(Connaught，Inc.)、破伤风毒素片段C(由Sigma Aldrich提供)、DNI、或来自大肠杆菌(Escherichiacoli)的β-半乳糖苷酶(由Sigma Aldrich提供)。其它期需的载体蛋白包括牛血清白蛋白(BSA)、P40和鸡核黄素。(除非另外指出，例示性载体蛋白从Sigma Aldrich购得)其它例示性载体蛋白是作为分支肽的MAP(多抗原肽)。通过使用MAP，交联密度由于多个分支的氨基酸残基而达到最大化。可用于形成MAP的例示性氨基酸为但不限于赖氨酸。

BSA和匙孔血蓝蛋白(KLH)在用动物进行试验的疫苗开发中通常 都被用作载体。已用于制备治疗疫苗的载体蛋白包括，但不限于许多致病菌毒素和它们的类毒素。实例包括白喉和破伤风毒素以及它们医学上可接受的相应的类毒素。其它候选载体蛋白是抗原上与称为交叉反应材料(CRM)的细菌毒素类似的蛋白质。本发明的载体蛋白还可包括任何非人源的和任何人类食物中不存在的蛋白。

在本发明期需的实施方案中，形成环样结构的蛋白质用于制备PCMV。这些蛋白包括铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的Hcp1蛋白、霍乱毒素的无毒“B亚基”、大肠杆菌(Escherichia coli)热不稳定肠毒素和志贺样毒素。这种环样蛋白复合物可形成“串珠”，其中线性的PS链穿透这些环形蛋白复合物的中央槽。在蛋白发生交联后，预测这种复合物特别稳定。蛋白的结构数据显示这些中央槽对于PS链来说足够大以至可使其轻易进入。例如，Hcp1六聚体环的中央槽为42埃(A)，其足够宽以至可轻易地容纳若干个宽度为5.5埃的多糖链(Mougous等，Science 312(5779)：1526-1530，2006)。或者，蛋白环可环绕PS进行装配(例如，在特定的物理化学条件下，从天然装配的单体载体蛋白亚基进入环)。这种可装配进环的单体蛋白在本技术领域为人所知并且包括，例如，肺炎球菌溶血素(Walker等，Infect.Immun.55(5)：1184-1189，1987；Kanclerski和Mollby，J.Clin.Microbiol.25(2)：222-225，1987)、李斯特菌溶素O(Kayal和Charbit，FEMSMicrobiol.Rev.30：514-529，2006；Mengaud等，Infect.Immun.55(12)：3225-3227，1987)、DNI、炭疽热PA、Hcp1、霍乱毒素B亚基、志贺毒素B亚基、鞭毛蛋白和无数在本领域所熟知的由各种微生物制备的相关分子。

在另一个期需的实施方案中，用Toll样受体(TLR)激动剂作为载体蛋白。Toll样受体(TLR)活化在形成获得性免疫应答方面是重要的，在抗体应答的亲和力成熟、同种型转换和免疫记忆方面发挥作用。霍乱弧菌(Vibrio cholerae)鞭毛蛋白(FLA)是TLR激动剂。超过20mg的FLA蛋白已从重组大肠杆菌(Escherichia coli)中纯化得到，在本文所述 的IL-6巨噬细胞诱导分析中显示为有效的TLR活化剂。另外，称作“肺炎球菌溶血素”的高度保守的肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)蛋白也显示能激活TLR4，而且还是保护性抗原。因此，该蛋白也可用作PCMV载体蛋白。

此外，外膜蛋白(OMP)混合物(例如，脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)的OMP)被用作由Merck生产的HIB缀合疫苗的载体蛋白，而来自完整肺炎链球菌链球菌(Streptococcal pneumoniae)细菌细胞的蛋白提取物在动物感染模型中显示为具有至少部分保护性。在本发明期需的实施方案中，这些蛋白混合物是PCMV载体蛋白的来源。

在期需的实施方案中，所述PCMV方法与载体蛋白一起使用，所述载体蛋白具有，例如，至少2个赖氨酸残基或开放的并经化学修饰可进行交联的其它残基。在另一个期需的实施方案中，所述载体蛋白是多聚体(例如，含有至少5个亚基的多聚体)。理想地，所述多聚体是同多聚体。

在另一个实施方案中，用DNI作为载体蛋白，因为它是无毒的，不必在使用前将蛋白去毒。此外，DNI的使用是理想的，因为DNI除诱导对目标抗原的保护性免疫应答之外，还可诱导对炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)的免疫应答。此外，DNI没有内部二硫键。这种键对氢硼化物还原作用敏感，后者能够使蛋白变性并导致诱导炭疽毒素中和抗体的表位的丧失。

目标抗原

本发明的疫苗组合物和制备及给予这种疫苗的方法适用于任何目标抗原，例如，多糖、多元醇或聚氨基酸。理想地，所述目标抗原不携带可以被疫苗制备方法所采用的化学反应破坏的初级基团(primary group)，所述化学反应例如，通过氢硼化物还原作用破坏抗原二硫键引起抗原的变性。例示性目标抗原包括有机聚合物如多糖(例如有至少18个残基的多糖)、磷酸多糖、具有N-乙酰基取代的氨基糖的 多糖、含有磺胺酰糖的多糖、其它硫酸基修饰的糖或磷酸基修饰的糖、多元醇、聚氨基酸、磷壁质酸和脂多糖O侧链。例示性目标抗原包括那些由微生物如细菌、真菌、寄生虫、病毒合成的并用标准方法从这种生物来源提纯的荚膜有机聚合物。例示性目标抗原包括微生物荚膜有机聚合物，包括从以下微生物中纯化的那些荚膜有机聚合物：细菌生物体，例如芽孢杆菌(Bacillus species)(包括炭疽芽孢杆菌(B.anthracis))(Wang和Lucas，Infect.Immun.72(9)：5460-5463，2004)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)(Bentley等，PLoS Genet.2(3)：e31，Epub 2006；Kolkman等，J.Biochemistry 123：937-945，1998；和Kong等，J.Med.Micorbiol.54：351-356，2005)、志贺氏菌(Shigella)(Zhao等，Carbohydr.Res.342(9)：1275-1279，Epub 2007)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureu)、伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)(Zhao等，Carbohydr.Res.342(9)：1275-1279，Epub 2007)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；真菌生物体如隐球酵母和假丝酵母；以及很多其它微生物(见，例如Ovodov，Biochemistry(Mosc.)71(9)：937-954，2006；Lee等，Adv.Exp.Med.Biol.491：453-471，2001；和Lee，Mol.Immunol.24(10)：1005-1019，1987)。例示性目标抗原还包括非天然存在的和非生物来源的聚合物。

疫苗组合物

包括PCMV在内的本发明疫苗可用于组合，例如用于儿科疫苗。另外，本发明的疫苗可用于接种对抗例如肺炎球菌感染、乙型流感嗜血菌(Haemophilus influenzae Type B)(“HiB”)感染、(组A和组B)链球菌感染、脑膜炎球菌(例如脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitides))感染，并可用作来自革兰氏阴性细菌(例如铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)、志贺氏菌(Shigella species)、沙门氏菌(Salmonella species)、不动杆菌(Acinetobacterspecies)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderia species)和大肠杆菌(Escherichia coli))的O抗原疫苗。

疫苗制剂期需包含至少一种载体蛋白、一或多种目标抗原以及药学上可接受的载体或赋形剂(例如磷酸铝、氯化钠和无菌水)。疫苗组合物还可包括用于增强制剂免疫原性的佐剂体系，例如水包油体系和在本领域已知的其它体系或药学上可接受的其它赋形剂。在生理条件下不溶的载体/抗原复合物期需在给予受试对象后缓慢地释放抗原。这种复合物期需释放到含有药学上可接受的赋形剂的混悬液中。然而，载体/抗原复合物在生理条件下还可能是可溶性的。

通常用于皮下注射的疫苗的体积约为0.5mL，皮内注射为0.1mL，经皮给药为0.002-0.02mL。0.5mL剂量的疫苗可含有用约2-500μg载体蛋白包载的约2-500μg的抗原。在期需的实施方案中，在0.5mL的剂量中，用约10μg载体蛋白包载约10μg的抗原。抗原与载体蛋白的摩尔比期需在1∶10(例如，1份抗原对2份载体或1份抗原对3份载体)到10∶1(例如，3份抗原对1份载体或2份抗原对1份载体)之间。在期需的实施方案中，抗原与载体的摩尔比是1∶1。或者，抗原与载体蛋白的干重比理是在1∶10到10∶1之间(例如1∶1干重)。

因为肽或缀合物在胃中可受到降解，因此所述疫苗期需经胃肠外给药(例如，通过皮下注射、肌内注射、静脉内注射、皮内注射)。当期需通过物理渗透真皮层的方法进行递药(例如，针、喷雾器或擦破)时，本发明的疫苗还可通过透皮吸收进行给药。

特别地，本发明疫苗可以连同合适的免疫佐剂通过例如肌肉注射、皮内注射或经皮免疫接种来给予受试对象。本发明疫苗可经一次或多次给药，往往包括设计以促进受试对象抗体产生的二次给药，以防止传染性病原体感染。疫苗给药的频率和量取决于疫苗的特定活性，并可以通过常规实验容易地确定。

例如，对于婴儿来说，接种疫苗计划可为：三个0.5mL剂量每个 剂量以约4-8周为间隔(从两月龄开始)，接着在约12-15月龄用第四个0.5mL的剂量。对于一些疫苗来说，期需在四岁到六岁之间用第五个剂量。

虽然第一次给药的年龄通常是两个月，但是可在6周龄时将疫苗给予婴儿。对于超出常规婴儿接种计划年龄的儿童，可根据以下例示性的计划表给予本发明的疫苗。

首次给药年龄	接种计划
		7-11个月	总共三个0.5mL剂量；头两个至少间隔四周，第三个在第二个之后至少两个月
12-23个月	总共两个0.5mL剂量，每个至少相隔两个月
		24个月到9岁	一个0.5mL剂量

对于成年人，间隔2-8周的两个或多个的0.5mL剂量通常足以提供长期的保护。对于先前经免疫接种的成年人和11岁以上的儿童，期需每十年给一次加强剂量。

所述制剂可存放于单剂量或多剂量的容器里例如密封的安瓿和小瓶，可在冻干(冷冻干燥)条件下保存，使用前只需立即加入无菌的液体载体。本发明的疫苗可以配制在药学上可接受的载体中，所述载体例如氢氧化铝凝胶、佐剂制剂、或盐水，然后通过例如肌肉注射、皮内注射、或利用合适免疫佐剂的透皮免疫接种来进行给药。

本发明还包括含有本文所述疫苗(例如，PCMV)的药盒。本发明药盒还包括本文所述接种方法的药盒使用说明书。

用标准方法通过测定受试对象的抗体效价可确定免疫接种计划的功效。一般而言，认为约1μg/mL的平均抗体效价(期需为IgG效价)表明有长期保护作用。

用于本文所述疫苗组合物的抗原/载体蛋白复合物的直径期需在10nm-100μm之间。病毒直径可为100nm并具有免疫原性。完整细菌的直径是1-10μm并且也具有免疫原性。一小团细菌的直径可约为100μm。在具体的实施方案中，所述疫苗组合物的抗原/载体蛋白复合物的直径期需在100nm-10μm之间。该复合物可以是可溶性的或者不可溶性的。

通过参照特定的实施例、实施方案和附图，下文对本发明作出描述。以下实施例不解释为限制性。

实施例

实施例1.疫苗和对照制剂

荚膜聚γ-D-谷氨酸(PGA)购自Vedan(台湾)或通过Rhie等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：10925-10930，2003)的方法进行纯化得到。显性负性突变体(DNI)是炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)保护抗原(PA)的突变形式，用Benson等的方法(Biochemistry 37：3941-3948，1998)从大肠杆菌(Escherichia coli)制得。PGA和DNI蛋白在使用前用0.05M、pH 7.4磷酸钠缓冲液(SP7.4)进行彻底透析。DNI储备液浓度为30mg/mL。PGA储备液浓度为134mg/mL。接头戊二醛购自Pierce，为25％的储备液。蛋白荚膜基质疫苗(PCMV)和对照汇集(assemble)在表1的反应中。

表1.用于制备PCMV制剂1-3和对照4和5的反应的汇集(assembly)

反应# DNI PGA dH₂O 25％戊二醛

mL mL mL mL 名称

1 20 1 3 0.8 PCMV1

2 12 4 8 0.8 PCMV2

3 16 2 6 0.8 PCMV3

4 16 2 6 0 P+C对照

5 16 0 8 0.8 P仅对照

在没有戊二醛的情况下于室温下对五个反应进行装入。在T＝0时，所示的反应中加入0.1mL 25％的戊二醛(G25)。其后每30秒加入另外0.1mL的G25并重复，直到每个所示反应达到总共0.8mL的G25。通过双功能戊二醛分子进行的DNI分子交联情况可通过肉眼观察到，这根据产生不同浊度和依照下列顺序排列的不溶性粒子样“凝胶”(“gel”likeparticle)来判断：浊度最高和凝胶形成情况，反应1＞2＞3＞4，反应5保持完全透明和可溶。1小时之后，将2mL含1M硼氢化钠的0.5M硼酸钠缓冲液pH 9.3(SBH)加入到所有六个反应中，以还原在DNI分子氨基侧链和双功能戊二醛分子之间形成的席夫碱。将有机硅消泡剂(0.01mL)加入到每个反应以控制反应过程中的泡沫形成。反应物于4℃保存72小时。然后将所有反应物用SP7.4充分透析48小时。将最终产物离心除去不溶性物质并于4℃保存待用。

通过使用水溶性的碳二亚胺、EDAC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺)将PGA的羧基与BSA的氨基偶联，以合成在牛血清白蛋白(BSA)和PGA之间的传统缀合物，步骤如下：使5mL含30mg/mL BSA的水与1mL含134mg/mL PGA的NP7.5混合，加入50mg EDAC，允许反应在室温下进行3个小时。使反应于4℃用含有1mM甘氨酸的SP7.4透析18小时阻断活性基团，然后只在SP7.4中于4℃透析24小时。终产物被称为PGA-BSA缀合物。

在合成并透析PCMV和对照制剂之后，检查DNI蛋白的分子状态以证实无论是否存在不同含量PGA，戊二醛确实与蛋白发生了分子交联。通过SDS(十二烷基磺酸钠)聚丙烯酰胺凝胶电泳和用抗PA抗血清的蛋白印迹监测PCMV和对照制剂的所述交联情况。如图2所示，在戊二醛交联之前，DNI蛋白移动到84kDa处。如分子量大于220kDa的迁移带所证实，PCVM1-PCMV3(泳道1-3)显示DNI蛋白广泛的交联。不存在PGA下独自交联的DNI蛋白也显示同样的高分子量种类(泳道5)。 相反，与PGA混合但不用戊二醛处理的DNI显示与DNI共迁移的条带或较低的分子量种类(泳道4)。因此，来自Vedan(台湾)的PGA制剂似乎受到对DNI的蛋白酶活性污染。Vedan PGA样品在泳道6中进行电泳，然而没有显示高水平的与抗PA抗血清反应的污染蛋白，表明所观察的条带是各个反应的DNI衍生产物。

此外，将PGA和一或多种作为抗原的肺炎球菌PS用来探究是否FLA(霍乱弧菌(Vibrio cholerae)鞭毛蛋白)是一种在PCMV背景下比DNI更好的载体蛋白。通过测量用各种PCMV免疫接种所得到的针对PS和PGA的IgG水平、以及载体蛋白基于蛋白重量计算的载体蛋白效能，来评价这些载体蛋白的效果。

还可以通过不使用双功能交联剂直接使氨基与羧基进行交联的方法制备PCMV。具体而言，用碳二亚胺化学通过交联载体蛋白的氨基和羧基制备PCMV。该化学使赖氨酸侧链的伯氨基和天冬酰胺和谷氨酰胺侧链的羧基之间形成肽键。虽然氨基大部分受到经甲醛处理的类毒素封闭，但甲醛完全不与羧基反应。因此，碳二亚胺化学可用于用甲醛类毒素来制备PCMV，所述甲醛类毒素可以对戊二醛交联有抗性。通过SDS-PAGE很容易对交联情况进行检测。依赖于交联剂(如戊二醛)加入的高分子量蛋白“污斑”的存在表明发生了交联。

表2.由SDS-PAGE分析法确定的载体蛋白交联

戊二醛 否 是 是 是 是

荚膜聚合物 -PGA -PGA +PGA +PS 6B +PS 23F

BSA	-	+	+	+	+
						白喉毒素	-	+	+	n.d.	n.d.
白喉类毒素	-	-	-	n.d.	n.d.
						破伤风类毒素	-	+	+	n.d.	n.d.

+号表示通过SDS-PAGE检测到交联，-号表示蛋白迁移在无戊二 醛对照中所见到的情况无异。n.d.-(not determined)没有测定(没有进行分析)。

对于表2所示的实验，在50mM HEPES pH 7.5中进行200微升反应并使其在室温下保温2小时。用120mM硼氢化钠焠灭反应。添加戊二醛至64mM，以15mg/mL使用牛血清白蛋白(BSA)，以约5mg/mL使用白喉毒素、白喉类毒素和破伤风类毒素至，以13.4mg/mL加入PGA，以4mg/mL加入6B和23F型肺炎球菌PS。

如表2所示，一些经甲醛处理的蛋白(例如，白喉类毒素)不能与戊二醛很好地交联，因此，需要使用其它交联化学来制备PCMV。其它的蛋白载体像破伤风类毒素能够与戊二醛交联，但与未修饰蛋白如白喉毒素和牛血清白蛋白的交联程度不一样。

实施例2.免疫接种和抗DNI和抗PGA免疫应答的分析

调整表1所述5个反应的可溶性产物至同样的蛋白质浓度(基于其280nm处的吸光率)。将来自Charles River的约5-7周龄的BALB/c小鼠用于图2所描述的所有免疫接种研究。在第0天通过腹膜内注射用PCMV疫苗1-3和抗原制剂对照4和5以20μg DNI蛋白的剂量免疫接种小鼠。在第7天对所有小鼠进行放血，然后在第10天用同样大小剂量的抗原制剂对其进行加强免疫。在第17天再次对小鼠放血，然后在第20天再次对其加强免疫。在第30天再对小鼠进行放血并在这一次将其处死。待血液凝结后从血样收集血清并于-20℃储存。使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)分析抗PGA血清抗体和抗DNI血清抗体的水平。简而言之，对Immulon 2HB ELISA(VWR)微量滴定板包被体积为100μL/孔的含0.5μg/孔BSA-PGA或DNI的0.1M碳酸钠缓冲液(pH9.6)。于4℃保温过夜之后，通过用3％BSA(w/v)(溶解在TBS-0.1％吐温(TBST))于室温1小时或4℃过夜孵育，来封闭包被有抗原的板。将在每个加强免疫后的时间点时合并自四小鼠组别的血清样品用TBST 进行系列稀释，将其加入到包被有抗原的板中，孵育至少1小时。用针对与碱性磷酸酶(Zymed)缀合的鼠IgG或IgM的兔抗血清，测定抗DNI抗体应答和抗PGA抗体应答。将底物磷酸对硝基苯酯(PNPP)加到每个孔中并于405nm处用分光光度法来测定每个反应的吸光率。数据以终点效价倒数的形式报道，后者定义为获得的OD₄₀₅读数超过阴性对照读数两个标准偏差的的最大稀释度。

用ELISA测定法测量在经三种PCMV制剂1-3和两个抗原对照制剂4和5(图3-5)免疫接种的小鼠体内的IgM和IgG特异的抗DNI和抗PGA免疫应答。如图3所示，除了未经戊二醛交联(无戊二醛)的对照制剂4之外，在所有制剂中的DNI蛋白具有高度免疫原性。然而，这些DNI特异性免疫应答是唯独以IgG为基础的。虽然甚至在免疫接种的第7天也检测不到抗DNIIgM，但在第17天，在经PCMV制剂免疫接种的小鼠和那些只用交联的DNI(制剂5)免疫接种过的小鼠体内可检测到显著的抗DNI IgG应答。在第30天观察到经接种包括制剂4在内的所有制剂后针对DNI的强烈加强应答。

抗PGA IgM应答显示了典型荚膜聚合物模式(图4)。对照制剂4在第7天产生可检测的抗PGA IgM应答，但在第17或30天该应答没有被加强。所有PCMV制剂在第7天诱导抗PGAIgM应答，然后在第17天和第30天产生独有的甚至更强的抗PGA IgM应答。不出所料，对照制剂5(只有交联的DNI)不产生基于IgM或基于IgG的抗PGA应答。形成鲜明对比的是，PCMV1-3(制剂1-3)产生强烈的基于IgG的抗PGA应答，该应答在第7天表现明显随后在第30天显著得到加强(图5)。所见针对PCMV1-3的基于IgG抗PGA应答明显类似于：Aulinger等报道观察到的传统PGA-DNI缀合疫苗所诱导的对PGA的免疫应答(Infect.Immun.73：3408-3414，2005)和Rhie等)描述的PA-PGA缀合疫苗所诱导的应答(Proc.Natl.Acad.Sci.USA100：10925-10930，2003。因此在诱导针对荚膜PGA(已知的T细胞非依赖性的炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)保护抗原(Wang等，Infect.Immun. 72：5460-5463，2004))的IgG应答方面，PCMV疫苗#1、#2和#3都具有与传统缀合PGA疫苗一样好的性能。含有与PGA混合的DNI(非交联的)的对照制剂5不诱导可检测的针对PGA的IgG，表明DNI在刺激PCMV制剂1-3的IgG抗PGA应答中不充当TLR配体的作用。该结果也证实了文献中的观察，即PGA是低免疫原性的T细胞非依赖性免疫原，除非它通过共价连接与蛋白质偶联(Rhie等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA100：10925-10930，2003)。PCMV方法显然将PGA转化成T细胞依赖性的免疫原，尽管事实上该方法没有导致DNI蛋白直接与PGA分子进行交联。

这些数据支持PCMV方法能够制备出特性与传统缀合疫苗类似的免疫原。用本文所述的方法容易制备出PGA PCMV，并发现其诱导PGA-蛋白缀合疫苗的典型免疫应答。表1中详述的小规模反应制备出基于图3描述的剂量方案足够对1000只小鼠进行免疫接种的PCMV。这些数据支持由PGA和DNI制备的PCMV可以用作疫苗预防由炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)引起的炭疽热。

实施例3.附加PCMV的制备和表征

PCMV技术可应用于各种结构和离子电荷的荚膜抗原。23种类型肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)PS购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)并由Merck，Inc制造。这些PS在其分子结构上有很大的不同，包括强阴离子型的、部分阳离子型的、中性电荷的、磷酸化的、线性的、有分支结构的和经各种其它方式修饰的PS。在预实验中，取对应于Wyeth产品Prevnar中7个荚膜型的这些PS子集(4、6B、9V、14、18C、19F和23F)，测定其诱导小鼠巨噬细胞产生IL-6的能力。4型的PS在测定中是活跃的；脂多糖(LPS)是TLR激动剂的对照。还测定了其它PS(例如，3型)、PGA和来自土拉热弗朗西丝氏菌(F.tularensis)的O抗原PS、以及由PGA-DNI制备而成的PCMV疫苗和无交联的对照。该实验显示了3型肺炎球菌PS(比PGA的程度较小) 也受到TLR激动剂污染。来自土拉热弗朗西丝氏菌(F.tularensis)的PS和PCMV在测定中同等干净。苯酚萃取和乙醇沉淀可在两次连续处理之后“清洁”(除去残余的未知TLR激动剂)肺炎链球菌(S.pneumoniae)PS 3型。因此，发现6种肺炎链球菌(S.pneumoniae)PS和土拉热弗朗西丝氏菌(F.tularensis)O抗原PS对于IL6的产生而言已清洁干净，这些已经在本文所述的实验中进行了探究。

通过类似于在实施例1中所描述的方法利用DNI作为载体蛋白，已经对对于IL6产生而言已清洁干净的7种PS进行了PCMV合成。初步免疫原性测定表明所有七种PCMV都有不同程度的免疫原性。发现肺炎链球菌(S.pneumoniae)PS14的基于DNI的“单价”PCMV(14-PCMV)在第三次免疫之后诱导显著增强的高效价抗PPS14IgG。显然，当14-PCMV与其它六种PCMV混合产生“混合”抗原时，可见到同样的免疫应答。因为 吸附明矾的“佐剂化”疫苗，所以对六价PCMV混合物是否也能够被明矾佐剂吸附进行确定。通过免疫测定来定性测量在暴露于PCMV或对照混合物(相同的PS与DNI蛋白混合但不进行戊二醛交联)之后吸附于明矾的肺炎链球菌PS的量，结果显示，在PCMV背景下吸附于明矾的PS比对照(PS+非交联的DNI蛋白)要多得多(这正如的在免疫分析中进一步稀释的PCMV的免疫反应性水平更高所表明)。

对小鼠进行免疫，以评价有或无吸附于明矾佐剂的七价PCMV的免疫原性。明矾佐剂改善对PS14的免疫应答动力学，与比无佐剂疫苗诱导针对这种PS的IgG要早7天。然而，在不存在明矾的七价PCMV比存在明矾的非交联PS+DNI组合对照更具免疫原性。该结果证实了PCMV方法使PS对于小鼠更具免疫原性，并支持了PCMV方法可以用来制备免疫性能类似于缀合疫苗混合物的抗原混合物。

在另外的实验中，使用苯酚萃取和乙醇沉淀以将污染性TLR激动剂从23种肺炎球菌多糖商业制剂中除去。用标准的方法根据诱导腹膜巨噬细胞产生IL-6来对经经处理的PS进行测试，以证实污染物的 去除情况。缺乏IL-6诱导活性的PS用于制备PCMV。用于PCMV的其它多糖包括从土拉热弗朗西丝氏菌(F.tularensis)纯化的O抗原PS和来自炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)的PGA荚膜。检验了总共25个荚膜类型(23个肺炎球菌型，土拉菌病型和炭疽热型各一个)。25种荚膜型的每一种基本通过实施例1所描述的方法，用DNI蛋白来制备PCMV。将1∶1比例的PS：蛋白用于(约1∶1干重)这些初始PCMV制剂。通过SDS-PAGE对每种制剂进行表征，以证实蛋白的交联情况，蛋白交联情况与预实验中各种PCMV制剂的免疫原性完全相关。对于某些荚膜型(例如6B和23F)，使用其它载体蛋白来制备PCMV。对于同样的这些荚膜型(例如6B和23F)，可使用备选的交联化学。对证实了蛋白交联(例如在SDS-PAGE中)的所有PCMV制剂的免疫原性进行试验。

例如，以下用5种不同的基质蛋白和2种不同的抗原制备10种不同的PCMV。5种基质蛋白的选择基于：它们当前用于FDA批准的疫苗，或者允许其作为示踪物用于测量PCMV制剂稳定性的其它特性。使用了以下基质蛋白：(1)霍乱毒素B亚基(SBL Vaccin AB提供)，(2)白喉毒素，(3)破伤风毒素片段C，“Frag C”(Sigma Aldrich提供)，(4)DNI，和(5)来自大肠杆菌(Escherichia coli)的β-半乳糖苷酶(SigmaAldrich提供)。作为荚膜抗原，使用了来自炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)的荚膜抗原聚-D-谷氨酸和14型肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)荚膜(Suarez等，Appl.Environ.Micobiol.67：969-971，2001)。当与作为基质蛋白的DNI用于相应的PCMV中时，这两种荚膜抗原均具有高度免疫原性。每种荚膜抗原与5种经选择的基质蛋白中的每一种组合，制成10种不同的PCMV。

如在传统的缀合疫苗中所观察到的，在小鼠体内可以测试PCMV诱导同种型抗体转换成IgG的能力。可以使所有抗原吸附于明矾然后典型地使用每种PCMV制剂对应5只小鼠的组别。预先给小鼠放血获得针对受试抗原的免疫应答基线。然后通过标准的腹膜内注射方案对 小鼠三次免疫几种(于第0、7、14天)，并于初次免疫之后的第10、20、30和60天收集血液。通过标准的ELISA测定方法，根据针对所用PS和载体蛋白的IgG的情况对小鼠血清进行分析。在这些实验中，将只接受PS免疫接种的对照组小鼠包括在内，用来评价各种PCMV制剂与应该无免疫原性或免疫原性低的非缀合PS相比诱导抗PS IgG的能力。使有前景的PCMV(即诱导高水平抗PS IgG)经过仔细的免疫学分析，设法建立小鼠对PCMV免疫应答的动力学和剂量反应状况。

或者，将有前景的PCMV和其相应的对照可送至商家以生产兔抗血清。进行类似的免疫分析来评价免疫原性、所诱导的抗体的类别、兔的免疫应答动力学。在这些实验中，对照是市售产品 它是与CRM197偶联的7种不同传统缀合PS疫苗的吸附于明矾的混合物，CRM197为与白喉毒素相关的无毒蛋白突变体。

可以对用PCMV诱导的抗体应答功能性进行评价。例如，可以通过测量抗PS抗体调理荚膜肺炎链球菌(S.pneumococcus)并致使巨噬细胞通过吞噬作用杀死细菌的能力，来对功能性进行评价。保护动物免受荚膜肺炎链球菌(S.pneumococcus)的致死攻击是证明疫苗在经PCMV免疫的动物中的功效的另一种方法。

实施例4.PCMV与 的比较

测定通过Merck获自ATCC或直接来自Serum Institute of India(SII)的肺炎链球菌(S.pneumoniae)多糖(pps)6B、14和23F的相对清洁度。用IL-6表达作为pps清洁度的指示剂，用LPS作为“不洁”的阳性对照。如图9A所示，Merck pps 6B、14和23F是洁净的，而如图9B所示，来自SII的pps 6B是“不洁的”。如图10所示，处理2(在1M NaOH中80℃保温1小时)使SII pps 6B清洁。洁净的pps 6B用于比较缀合物和PCMV的免疫特性。如表3所示，污染物不是LPS。

表3.多糖内毒素水平测定

多糖	内毒素单位/mg多糖
		SII pps 6B-未处理	0.75
SII pps 23F-未处理	0.85
		SII pps 23F-处理2	0.24
各种Merck pps-未处理	0.1-0.4

图11和13显示 (以明矾为佐剂)诱导抗pps 6B IgG抗体，并且以明矾为佐剂的PCMV(BSA和pps 6B；白喉毒素和pps 6B；白喉类毒素和pps 6B；破伤风类毒素和pps6B)所诱导的IgG应答比用 所观察到的IgG应答更好。同样，如图12所示，以明矾为佐剂的PCMV所诱导的IgM应答与用 所见的相近。

另外，对于pps 14( 最具免疫原性的pps)，如图14-16所示，含有白喉类毒素和pps 14或破伤风类毒素和pps 14的吸附于明矾的PCMV在诱导IgG应答方面几乎等效于

实施例5.多价PCMV

多价免疫原通过以下PCMV方法来制备：化学地将不同荚膜有机聚合物混合，之后用戊二醛使DNI载体蛋白交联(“一锅合成反应”)。用DNI作为载体，以三种有机聚合物：PGA、藻酸盐和葡聚糖制备这类三价免疫原。这些三价疫苗具有免疫原性并且产生针对三种荚膜有机聚合物的免疫应答，该结果根据以下附图中的指标所示：免疫前和30天后所分析的混合血清IgM(图6)，免疫接种后60天出现的抗原特异性血清IgG抗体效价(图7)，免疫接种后128天出现的抗PS血清抗体效价(图8)。此外如图6-8所示，单价藻酸盐PCMV制剂也在小鼠中产生免疫应答。还可通过混合特定的PCMV来配制多价PCMV免疫原，PCMV先经过分开合成最后再混合在一起制成“混合物”疫苗。

本说明书中所引用或涉及的所有专利、专利申请、专利申请公开和其它出版物通过引用合并到本文中，其类似程度有如每个专利、专 利申请、专利申请公开或出版物逐一或单独地指明通过引用合并到本文中。

Claims (16)

1.制备疫苗组合物的方法，所述组合物包括被载体蛋白基质包载的抗原，所述抗原与所述蛋白基质非共价缔合，所述方法包括：

(ⅰ)将选自多糖、多元醇和聚氨基酸同聚物的目标抗原与载体蛋白混合；其中所述多元醇是碳水化合物的氢化形式，其羰基已被还原成伯羟基或仲羟基；和

(ⅱ)加入通过载体蛋白分子的巯基、氨基或羧基使所述载体蛋白交联的接头，和

（iii）交联所述载体蛋白形成载体蛋白基质。

2.权利要求1的方法，其中所述疫苗组合物进一步包含药学上可接受的赋形剂。

3.权利要求1的方法，其中在所述疫苗组合物中，所述抗原对所述载体蛋白的摩尔比在1:10-10:1之间。

4.权利要求1的方法，其中所述载体蛋白是多聚体，其中所述多聚体包含至少5个亚基，或其中所述多聚体是同多聚体。

5.权利要求1的方法，其中所述方法包括还原所述载体蛋白中的席夫碱。

6.权利要求1的方法，其中所述载体蛋白共价交联到至少一种其他的载体蛋白，其中所述共价交联包括在赖氨酸侧链的伯氨基和天冬酰胺或谷氨酰胺侧链的羧基之间的肽键，或其中所述共价连接包括双功能交联剂，其中所述双功能交联剂是戊二醛、双[磺酸基琥珀酰亚胺基]辛二酸酯或己二亚氨酸二甲酯。

7.权利要求1的方法，其中所述接头是式化合物，其中R_n 是1-12个碳原子的直连或支链烷基、1-12个原子的直连或支链杂烷基、2-12个碳原子的直连或支链烯烃、2-12个碳原子的直连或支链炔烃、5-10个碳原子的芳族残基、3-10个原子的环状体系、-(CH₂CH₂O)_qCH₂CH₂-其中q是1-4，或其中所述接头是戊二醛、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、碳二亚胺或双偶氮联苯胺。

8.权利要求1的方法，其中所述载体蛋白是：白喉毒素或其突变体、白喉类毒素、破伤风毒素或其突变体、破伤风菌类毒素、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A或其突变体、霍乱毒素B亚基、破伤风毒素片段C、细菌鞭毛蛋白、肺炎球菌溶血素、李斯特菌溶素O、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria menningitidis)外膜蛋白、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa) Hcp1蛋白、大肠杆菌(Escherichia coli)热不稳定肠毒素、志贺样毒素、人LTB蛋白、来自完整细菌细胞的蛋白提取物、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)保护性抗原的显性负性突变体(DNI)或大肠杆菌(Escherichia coli) β-半乳糖苷酶。

9.权利要求8的方法，其中所述完整细菌细胞是铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)或链球菌(Streptococcal)细胞，或其中所述细菌鞭毛蛋白是霍乱弧菌(Vibrio cholerae)鞭毛蛋白。

10.权利要求1的方法，其中所述志贺样毒素是志贺氏菌(Shigella) SltB2蛋白。

11.权利要求1的方法，其中所述多糖包含至少18个残基，或其中所述多糖是肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)多糖、土拉热弗朗西丝氏菌(Francisella tularensis)多糖、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)多糖、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)多糖、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)多糖、志贺氏菌(Shigellaspecies)多糖、沙门氏菌(Salmonella species)多糖或脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)多糖。

12.权利要求11的方法，其中所述肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)多糖是荚膜型3、4、6B、7A、7B、7C、7F、9A、9L、9N、9V、12A、12B、12F、14、15A、15B、15C、15F、17、18B、18C、19F、23F、25A、25F、33F、35、37、38、44或46，或其中所述土拉热弗朗西丝氏菌(Francisellatularensis)多糖是O抗原。

13.权利要求1的方法，其中所述聚氨基酸同聚物是微生物荚膜聚合物。

14.权利要求13的方法，其中所述微生物荚膜聚合物是来自炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)的聚-γ-D-谷氨酸。

15.权利要求1的方法，其进一步包含第二目标抗原。

16.权利要求1的方法，其进一步包含第三目标抗原。