CN101555283B - 针对非功能性p2x7受体的抗体及其在癌症和其它病情的诊断和治疗中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及了大范围的疾病和病情，包括癌症。本发明提供了一种用于检测这种疾病或病情的探针。该探针能区别功能性P2X₇受体和非功能性P2X₇受体。该探针可通过多种途径实现这种功能，其中之一是检测同ATP与受体的结合相关的变化。本发明还提供了用该探针检测疾病或病情的方法。本发明扩展到用抗体或能产生该抗体的表位对疾病或病情进行治疗，该抗体能区别功能性P2X₇受体和非功能性P2X₇受体，并与非功能性受体结合。本发明还包括治疗方法，药物组合物以及探针和抗体的应用。

Description

针对非功能性P2X7受体的抗体及其在癌症和其它病情的诊断和治疗中的用途

本申请是2002年01月17日提交的02805078.9号发明专利申请“针对非功能性P2X₇受体的抗体及其在癌症和其他病情的诊断和治疗中的用途”的分案申请。

技术领域

本发明涉及疾病的诊断和治疗，包括肿瘤。本发明所涉及的疾病类型包括来自于上皮细胞的肿瘤和恶性淋巴瘤。本发明还涉及其它病情，如癌前状态、肠道易激综合症以及病毒和其它感染。很有可能本发明还适用于其它疾病和病情。

背景技术

三磷酸腺苷(ATP)能活化配体门控的嘌呤源受体，已知为P2X受体。受体亚型从P2X₁到P2X₇已被识别。已知不同的P2X受体亚型存在于许多细胞中，包括上皮细胞和白细胞、淋巴细胞、胸腺细胞、巨噬细胞和树突状细胞。

P2X受体能透过钙离子和一些其它阳离子，如钾离子和钠离子。钙离子流通过P2X受体进入细胞可能与细胞死亡相联系。

在许多细胞型中，P2X₇亚型被认为与细胞凋亡或程序化细胞死亡有关。当存在ATP时，表达于细胞表面上的P2X₇受体能在1秒钟内打开钙离子通道，通过细胞膜。继续暴露在ATP中可在几秒钟到几十秒钟内导致大孔的形成，这些大孔可使细胞淹没在过量的钙中，诱导细胞凋亡。

例如在上皮癌细胞中，暴露给ATP通常并不导致细胞凋亡。已经发现某些细胞表达不能形成孔的P2X₇受体。这些受体被认为是非功能性受体。

在人类癌细胞系，如前列腺PC3和乳腺MCF7，以及在动物细胞系包括啮齿动物杂交瘤中，P2X₇受体被发现在细胞表面上以非功能构象存在。

恶性淋巴瘤患者的B细胞可表达非功能性P2X₇受体。淋巴瘤由逃避细胞溶解破坏的恶性克隆发展而成。该过程导致恶性B淋巴细胞渐渐积累并最终导致淋巴结病和/或脾肿大。

发明简述

本发明的第一方面提供了一种可用于检测疾病或者病情的探针，该探针适用于区别功能性P2X₇受体和非功能性P2X₇受体。优选的，该探针通过测定ATP与受体结合后的变化或者测定结合P2X₇受体中的孔形成所必需的一种或多种蛋白后的变化来区别功能性和非功能性P2X₇受体。在一种可替代的具体示例中，该探针可检测在不存在结合ATP时暴露的P2X₇受体的一个或多个部分。该受体部分可能包括P2X₇单体。

本发明还提供了一种检测疾病或病情的方法，该方法包括以下步骤：用本发明的探针区别功能性P2X₇受体和非功能性P2X₇受体；提供一种受体表达谱图；和比较该受体表达谱图与正常谱图。可以像例如前面就探针本身所提到的那样检测变化。

该探针可以是天然的或者是人工的。优选的，该探针是一种抗体，该抗体可以是多克隆、单克隆、重组的、人源化抗体或者是它们的合适片段。该抗体优选地针对于位于与ATP结合位点相邻的胞外域内的表位。

在人P2X₇受体的情况下，该探针优选适于区别功能性受体和非功能性受体，该功能性受体具有其中Pro210位于反式构象的序列；该非功能性受体具有其中Pro210位于顺式构象的序列。

该探针可用任何一种合适的技术制备，该技术很容易为本领域中的熟练技术人员理解。

在本发明的范围内还包括该探针能通过检测发生在ATP结合位点的其它构象变化来区别功能性和非功能性受体。例如，所测定的变化可以是不同于上面所指的脯氨酸的氨基酸。这种氨基酸的示例之一是Pro199。在另一个示例中，所测定的变化可以是其它方面。

该探针也可适用于检测不受功能状态改变的P2X₇受体的其它区域。当选择的表位可特异地检测只有在未结合ATP时才易于接近的受体表面区域的形状时，缺乏结合型ATP的单体亚基的构象可用该探针测定。该探针可检测孔形成所必需的一种或多种蛋白如附属蛋白或其它蛋白结合的变化。这种蛋白的非限制性示例为层粘连蛋白，整联蛋白，β-肌动蛋白，α-辅肌动蛋白和supervillin。

本发明中，P2X₇亚型特异性抗体可用于特异地检测或结合非功能性P2X₇受体，该非功能性P2X₇受体表达在形成部分癌前组织，非常早期的癌组织，发展的癌组织的细胞内或细胞上，以及任何表达非功能性P2X₇受体的肿瘤细胞上。因此，只有处于紧密门控(close-gated)或非功能构象时才能检测或结合P2X₇受体，尽管该P2X₇受体通常可以在细胞膜中表达，或者可部分地作为通道发挥功能。此外，缺乏结合型ATP的单体亚基的构象也可用抗体检测，因为所选择的表位可特异地检测只有在不结合ATP时才易于接近的表面区域的形状。

本发明中，该非功能性P2X₇受体能够用一种抗体检测或与该抗体结合，该抗体针对于能够由功能性受体内存在的结构发生构象变化的表位。已经发现非功能性受体的氨基酸序列可与功能性受体的氨基酸序列一致，因此受体的构象变化的原因与受体和ATP的反应相关。正如上面所展示的，ATP分子可作为受体激动剂，因此当ATP结合到受体上时，它们能够打开通过细胞膜的通道，使钙离子流入。因此，非功能性是由于缺乏ATP激动剂与受体的适当结合而导致的，其原因可能包括由于生产不足或降解速率提高而减少了ATP局部可利用性。如果ATP与受体的结合被打断，受体构象就会发生改变。这种构象改变可用一种特异地设计用来结合受ATP结合影响的蛋白质区域的抗体来检测。

在人P2X₇受体的情况下，涉及构象变化的特异序列可包括Pro210，它在不存在结合的ATP时构象会从反式变为顺式。因此，在人受体的情况下，必须就此产生抗体的适当表位序列可包含Pro210，且可向该残基的另一端延伸到诱导抗体反应所必须的合适范围。作为一个非限制性实例，该表位序列可包括从Gly200延伸到Thr215的片段也可使用。而且，若可与人组织发生交叉反应，来自其它哺乳动物如大鼠的同源片段。例如，可利用大鼠的从Gly200到Thr215的相同片段，虽然与人的序列相比，在大鼠序列中有两个氨基酸取代。

在非人类受体的情况下，该特异序列可用合适的实验确定。

根据本发明，非功能性P2X₇受体的检测可呈现一种其中功能性受体(因此正常细胞)可保持基本未被标记的分布图谱。但是，P2X₇受体的非功能性构象可以在肿瘤发生前的非常早期的阶段检测到，最初是在细胞核和细胞质中。例如，在上皮细胞癌的情况下，利用本发明的方法，有可能比用普通苏木素和伊红染色的活检组织切片检测的标准肿瘤病理外观相比更早几年检测到癌前病变。因此，用本发明的方法，可以比用现行的方法更早检测到肿瘤如前列腺癌，皮肤癌和乳腺癌，有益于早期治疗的介入。

能够用本发明的探针和方法检测的疾病和病情的全部范围并没有确定。但是，已知这些疾病和病情包括上皮细胞癌，如前列腺癌、乳腺癌、皮肤癌、肺癌、宫颈癌、子宫癌、胃癌、食管癌、膀胱癌、结肠癌和阴道癌，和其它血液癌症包括恶性淋巴瘤，肠道易激综合症和病毒如HIV或者其它病原生物如结核分枝杆菌的感染。感染可直接通过抑制功能性所需要的辅因子或者通过上调抑制上皮或其它细胞上的P2X₇功能的辅因子而引起非功能性受体表达，从而使被感染的细胞不易受到凋亡损伤。

除非另有说明，本发明中用的术语“疾病或病情”包括所有那些在上面段落中出现的特殊的疾病和病情。

在肠道易激综合症(“IBS”)的特殊情形中，已经发现，患有这种病情的患者，通常在位于上皮组织下面的基质中存在的大范围分布的淋巴细胞中表达P2X₇受体的肠粘膜发生上调。在被感染的患者中，可在从十二指肠到直肠粘膜中发现这种提高的表达。这种提高的表达可在分离的区域中发现，或者在更极端的病例中一般可以在肠道的全长中均得到提高。

在最轻微感染的病例中，总P2X₇受体上调，但这些受体都是功能性受体，它们不能穿透到上皮组织中。在更严重的病例中，总P2X₇受体的表达更高，肠道的受感染最深的部位出现非功能性受体。例如，它们可能局限于盲肠的粘膜，并可穿透到上皮组织中。最严重的病例是那些总P2X₇受体的表达进一步提高，且大部分受体是非功能性受体并伴随有上皮细胞穿透增加。

如上所述，P2X₇受体的非功能性是由于缺乏ATP激动剂与受体的适当结合。其原因可能包括因生产不足或经表面ATP酶酶促降解ATP的速率提高而减少了ATP的局部可利用性。如果ATP与受体的结合被打断，如前所述，受体构象就会发生改变，这种构象变化可用本发明的探针检测。但是，总P2X₇受体分布的检测最好用不受ATP结合影响的P2X₇受体胞外域的其它区域的表位来达到。

在本发明的范围内还包括用一种或两种P2X₇亚型特异性抗体来特异区别总P2X₇的分布和在肠粘膜中表达的非功能性受体的比例。因此这两种抗体一起用时能检测总受体水平和那些只以紧密门控(close-gated)或非功能构象存在的受体通道。第一抗体适用于检测总P2X₇受体的表达。本发明中包含或附着了抗体的探针可提供用来检测IBS的第二抗体，它不仅能区别功能性和非功能性P2X₇受体，而且可检测受体中不受功能状态改变的其它区域。这两种抗体可以分开使用也可以一起使用。优选的是，它们结合在一起使用。

分别检测总P2X₇受体和非功能性P2X₇受体可确定病情的严重性。胃肠粘膜中的非功能性P2X₇受体的表达以正常细胞保持基本未被标记的方式进行。随后，P2X₇的非功能构象最初在上皮组织下面的基质中被检测到，范围包括从这种综合症的轻病例中的分散小块到遍及胃肠道全长的大范围表达(伴随着非功能性受体的分散小块浸润进入到上皮组织中)。

本发明还提供了一种诊断肠道易激综合症的方法，包括检测细胞和/或组织的P2X₇表达谱图和比较该谱图与预先确定的正常细胞和/或组织的表达谱图。优选的，P2X₇表达谱图的检测包括使用一种或多种抗体。而且，优选的是这种或这些抗体与本发明的探针不同，即它们不能检测和ATP与P2X₇受体的结合相关的变化。这些抗体的制备对于本领域中的熟练技术人员来说将很容易理解。

本发明还包括一种或多种抗体在诊断肠道易激综合症中的应用。

该诊断方法可被用于利用标准的免疫组化技术的标准显微术中。

这种病情的治疗连同本发明的第三个部分在下面讨论。

用本发明的探针和方法进行疾病或病情的诊断可用原位成像技术检测在机体组织的分布来实现。另外，可应用标准显微术，共聚焦显微术和荧光激活细胞分选术。测定淋巴、前列腺、乳腺、皮肤、肺、宫颈、膀胱、子宫、胃、食管和相似的活检组织，以及乳腺和其它组织穿刺物以及细胞涂片(例如用于检测宫颈癌的细胞涂片)的普通免疫组化技术也可应用。其它技术可与本发明的探针和方法一起应用。

本发明提供了一种用于治疗疾病或病情的抗体，该抗体适用于区别功能性P2X₇受体和非功能性P2X₇受体，且仅适于结合非功能性受体。优选的是，该抗体通过检测同ATP与受体的结合相关的变化或者测定P2X₇受体的孔形成所需的并仅适于结合非功能性受体的一种或多种蛋白结合方面的变化来区别功能性和非功能性P2X₇受体。在另一个具体示例中，该抗体通过测定不存在结合型ATP时暴露的受体的部分来区别功能性和非功能性受体。

用于治疗疾病和病情的抗体可以与作为探针用来诊断疾病和病情的抗体相同。例如，该抗体可用来局部治疗皮肤癌。为了对癌症进行系统的治疗，抗体或其活性片段必需人源化以便将不合乎需要的免疫反应副作用减少到最小。

本发明的抗体可用于治疗哺乳动物，包括人类的疾病或病情。疾病或病情的示例与本发明的探针一起已经在上面出现过。

本发明还提供了一种能导致产生本发明第二方面所述的抗体的表位。该表位优选的包含Pro210，并涵盖从Gly200到Thr215的区段(存在于人受体的P2X₇序列中)。该表位优选附着了C末端Cys残基，该Cys残基通过化学交联剂马来酰亚胺己酰基-N-羟基琥珀酰亚胺(MCS)交联了白喉毒素，因此被连接的表位肽段采取的构象占据稳定的顺式脯氨酸构型。

该特异肽构象旨在递呈给患有一种或多种疾病或病情的人类或动物，特别是上皮细胞癌，如前列腺癌、乳腺癌、皮肤癌、肺癌、宫颈癌、子宫癌、胃癌、食管癌、膀胱癌、结肠癌和阴道癌，以及恶性淋巴瘤，肠道易激综合症和病毒如HIV或者其它病原生物体如结核分枝杆菌的感染。优选患者将对所施用的缀合表位产生免疫反应，从而产生识别被感染细胞表面上的非功能性P2X₇受体的抗体，并与它们相结合，激发合适的免疫细胞去破坏复合的细胞。也可影响受到细胞死亡引发的其它细胞。

应当理解本发明的范围并不局限于上述序列，还包括那些同样能产生特异免疫应答的替代序列、载体和交联物。这些物质可产生特异性免疫应答优选地产生只针对非功能性P2X7受体的免疫应答，并优选地忽略表达于细胞表面上的所有功能性受体，从而能避免发生副作用。

本发明的第二方面还提供了本发明的抗体作为治疗患者中疾病或者病情的治疗载体的应用。其中通过靶向于细胞表面表达的异常或者非功能性P2X₇受体，而使表达正常(功能性)受体的所有细胞不受影响，由此来调节患者体内的程序性细胞死亡。本发明还涉及用本发明的表位产生抗体的应用，如上所述。

本发明还提供一种用于治疗或预防患者疾病或病情的药物组合物，该组合物包含药用有效量的抗体，或者能产生该有效量的表位，所述抗体能调节表面上表达有异常或者非功能性P2X₇受体的细胞的程序性细胞死亡。

该抗体或表位的药用有效量因患者和疾病或病情的特征而变化。这些变量可由本领域中的熟练技术人员所确定。

本发明的药物组合物可与合适的药用载体一起给药，该载体可以是本领域中所熟知的那些载体中的任何一种，或者可以是将来设计的且适用于目的用途的类型。除载体外，本发明的药物组合物还可包含有其它成份，例如染料，防腐剂，缓冲液和抗氧化剂。

本发明的药物组合物可制备成任何想要的形式、且可以软膏、乳膏、溶液、悬浮液、粉末、片剂、胶囊、栓剂或子宫托的形式给药。

本发明的药物组合物可通过任何一种合适的方式给药，这些方式可包括口服、肠胃外、静脉内、肌内、皮下或局部给药。

本发明还提供了治疗或预防患者疾病或病情的方法，该方法包括对患者给与本发明的药物组合物。

本发明还提供了本发明的药物组合物在治疗或预防患者疾病或病情中的应用。

对于本领域中的熟练技术人员来说，显然，为了达到最好的疗效，本发明药物组合物的应用的方式可能需要改变。这就可能需要把疾病或者病情的特征及其严重性考虑在内。

本发明的第三个方面集中在控制向P2X₇受体提供ATP的ATP酶的表达，例如在患有恶性淋巴瘤的患者的B细胞中的表达。白细胞上的P2X₇受体的通道打开由于胞外ATP酶和胞外ATP二磷酸水解酶(ecto-ATPDases)使ATP激动剂迅速水解而被中止。这些酶调节许多需要依赖于ATP的生理过程。淋巴细胞上的ATPase和ATPDases活性的底物特异性显示在淋巴细胞的表面存在不止一种类型，包括CD39。一种或多种这些ATPase或ATPDases的增殖可限制对控制P2X₇孔形成所需的ATP的供应和限制对调节B细胞数目所需的后续程序性细胞死亡。

同样，在IBS病例中，ATPase的增殖也被认为与激动剂ATP与P2X₇受体的适当结合的缺乏有关。

根据第三个方面，本发明提供了一种治疗或预防患者疾病或病情的制剂，该制剂包含一种或多种物质，该物质适用于调节能控制患者细胞或组织中将ATP提供给P2X₇受体的ATPase的表达。本发明还提供了治疗或预防患者疾病或病情的方法，该方法包括对患者给予制剂这一步骤，该制剂包含适用于调节能控制患者细胞或组织中将ATP提供给P2X₇受体的ATPase的表达的一种或多种物质。

这种ATPase的示例可以是CD39或CD73。

这样的物质可以是ATP类似物的形式。优选的是不可水解，并且是P2X₇特异性的，或者能够抑制局部ATPase作用的其它物质，所述ATPase能使供给P2X₇结合位点的ATP的利用性缺损。该制剂可能是特异针对非功能性P2X₇受体产生的人源化抗体的形式。

该类疾病或病情优选的是恶性淋巴瘤或IBS，但本发明还可扩展到其它疾病或病情，包括其它上皮细胞癌或血液癌症或者病毒和其它病原性感染。

在恶性淋巴瘤病例中，ATPase可控制ATP向P2X₇受体的局部供给，从而减少可供P2X₇受体结合的ATP的浓度，去除它们的活性，导致大量地减少程序性B细胞死亡。这些ATPase可能B细胞表面上特异表达，在恶性淋巴瘤中似乎上调。优选施用特异的ATPase抑制剂用来调节P2X₇受体上ATP的可利用性，从而调节程序性B细胞死亡。

对于恶性淋巴瘤的治疗，该物质可能包括能阻断ATPase或ATPDases的合成激动剂，该激动剂可以是不可水解的P2X₇激动剂的形式。

关于肠道易激综合症，本发明的制剂的给药方式目的在于恢复受体的功能，该功能可能由于粘膜被感染区域下面的肌肉的活动过度而被耗尽。本发明的制剂可作用于粘膜，直接除去这些非功能性受体，从而恢复局部正常胃肠分泌机制。治疗的目的在于恢复ATP对非功能性受体的局部供应，以便恢复正常受体功能。控制受体功能的结果包括恢复胃肠的分泌和蠕动的正常控制。这可通过应用合成P2X₇特异性激动剂的肠内或系统性供应来实现(该激动剂优选的是不可被ATPase水解)，或者通过系统性应用针对非功能性P2X₇受体产生的抗体来实现，优选的是小的人源化特异性抗体，以除去非功能性受体，只留下功能性受体。

如果其下平滑肌的蠕动异常导致了供正常P2X₇受体结合的ATP的局部可利用性缺损，那么治疗可能包括恢复这种激动剂的正常供给，这可通过施加处理以暂时性限制肠道运动、由此限制平滑肌摄取或利用ATP来实现。

本发明还提供了治疗疾病或病情的药物组合物，该组合物包含药用有效量的一种或多种适用于调节控制将ATP供给P2X₇受体的ATPase的表达的物质。

本发明的所有方面可扩展到其它一些医学状况中可实施的相似应用中，在所述医学状况中，由于病毒感染的结果而牵涉到了异常的P2X₇受体，其中，被感染的细胞中该病毒通过上调非功能性P2X₇受体而得到保护，或者这类受体从正常细胞状况得到上调。

本发明还提供了一种治疗肠道易激综合症的方法，包括向患者提供如上面定义的药物组合物。

本发明还提供该种药物组合物在治疗肠易激综合症中的应用。

一种或多种上述药用有效制剂的应用方式可能需要改变以获得最佳的效果。

另外，本发明提供了一种治疗肠易激综合症的方法，该方法包括给予适用于恢复P2X₇受体功能的组合物。受体的功能可能通过粘膜中受感染区域下面的肌肉的过度活动而已经被耗尽。该组合物可能与上面就包含在本发明制剂中的物质相同所述的相同。

在进一步的方面，本发明提供了一种用于区别蛋白质的不同构象的方法，其中利用能够引起抗体产生的表位或抗体本身，从而由与具有所选择构象的所有蛋白质成员的结合获得特定的药学效果(主动以及被动免疫接种)。它的一个示例是具有可导致vCJD病情的构象的朊病毒。该蛋白的异常形式是特异抗体或能产生该抗体的表位的靶点，优选该抗体是人源化的并为了达到最佳的药用效果而尺寸减小。

发明详述

诊断应用

此处用实施例来描述，其中用动物特异的非功能性P2X₇抗体，以证实本发明的探针和方法在诊断大量人类和其它哺乳动物肿瘤的普遍应用。

在人类和哺乳动物如猫和狗的前列腺组织中，当本发明的抗体用来诊断时，在不存在癌症或癌前病灶时并不出现标记。但是，本发明的诊断方法显示了瘤性变化的最初征兆，而此时用H & E染色仍不能检测到有关的形态学变化。

在这一阶段，需要对最初出现在上皮细胞核中的受体单位进行染色。这些受体单位在疾病的后期迁移到细胞质中，在整个前列腺中发挥场效应，因此，仅需活检更少组织以确定肿瘤的存在。在疾病的后期，染色更加局限在顶端的上皮组织中。

相同地，在其它组织中不再有明显的场效应时，这些其它上皮细胞癌如人类和哺乳动物如猫和狗的乳腺、肺、结肠和皮肤癌可检测到，并显示边缘。

相同阶段的发展可在这些其它组织中看到，如乳腺和宫颈，其中核染色早于细胞质染色，而正常组织不被染色。乳腺组织中被感染的导管和小叶能根据乳腺个别被感染的导管系统的局部场效应而容易被检测到，甚至在普通形态学揭示不存在癌症时即可如此。邻近的未被感染的导管显现未被染色。相似地，直接对含有肿瘤的组织进行引流的被感染的淋巴结通过被感染的淋巴细胞的场效应显示肿瘤征兆。因此，守卫的淋巴结可在没有向淋巴结进行任何转移性细胞扩散时就可检测到。

皮肤癌，如基底细胞癌和鳞状细胞癌以及恶性黑素瘤在角质细胞和黑素细胞层中显示非功能性受体和通道成员(单体)的阳性染色，并且具有明显的边缘，在边缘之外正常皮肤在表皮的两面和深入到真皮里面并没有被标记。

所有实验用的哺乳动物肿瘤细胞系如人前列腺(PC3)和乳腺(MCF7)以及啮齿类杂交瘤对细胞表面上的非功能性受体是阳性的，因此这些肿瘤细胞的凋亡被抑制。这种诊断法的通常应用由小鼠杂交瘤细胞上的相同标记而可见一斑，显示除了人类以外，还在其它类型的动物中普遍存在该受体。正常人B淋巴细胞显示功能性P2X₇受体在细胞表面表达，因此在必要的时候能导致凋亡，但是恶性淋巴瘤患者的人B淋巴细胞显示在细胞表面表达非功能性P2X₇受体，因此减少了细胞凋亡。

治疗应用

以这种明显普遍存在的表达于癌细胞表面的P2X₇非功能异构体为靶点、试图导致凋亡的策略可用于治疗人类和其它哺乳动物的大部分肿瘤。实施例如下：

实施例1

小鼠杂交瘤细胞在存在和不存在非功能P2X₇的亲和纯化抗体的情况下生长在巨噬细胞基质上。细计数显示，在4天中，细胞在只有纯化的普通IgG中生长时由1×10⁴增殖到7×10⁴，而非功能性P2X₇抗体的存在使细胞计数维持在仅1.5×10⁴。

将杂交瘤细胞与作为对照的普通IgG或非功能P2X₇的亲和纯化抗体一起注射到小鼠体内。10⁶个杂交瘤细胞与针对非功能性(ATP-耗尽的)P2X₇产生的抗体(G蛋白纯化而不是亲和纯化)或IgG在0.5ml体积中以相同浓度一起预孵育6小时，然后注射到小鼠组中。第二天进行相同的第二次注射。

肿瘤的重量在第十一天测量。10只对照组小鼠的平均肿瘤重量为4.0g，10小鼠有9只长肿瘤，但在10只注射P2X₇抗体的小鼠组中，平均肿瘤重量只有1.1g，该组中也有9只长有肿瘤。

实施例2

特异性亲和纯化的抗体(以便大大地提高特异性)被施用于3例人基底细胞癌(BCC)，其或者以保持7天的液体形式，或者以悬浮在二甲聚硅氧烷乳状基质中的形式给药。治疗后，没有检测到BCC病灶的痕迹，对照皮肤则完全不受影响，因为不存在蛋白靶点。

已知通常对患者的应用将涉及人源单克隆抗体(如herceptin)的生产，以便内部癌症能以与局部给药相同的功效得到治疗。所有表达在细胞如淋巴细胞表面的正常功能性P2X₇需要存在该抗体以保持不受影响从而避免副效应。因此抗体需只结合表达于试图但不能开始凋亡的细胞表面上的蛋白。故所有靶向的细胞只是那些试图通过程序性细胞死亡而杀死自身的细胞，包括癌细胞。这些细胞特别是癌细胞上的P2X₇受体必需处于一种非功能性或ATP-耗尽的状态。

主动免疫

主动免疫可用于治疗的目的。这种情况中，人或其它哺乳动物需要针对特定的表位进行免疫接种，所述表位处于模拟只被细胞表面的非功能性(ATP-耗尽的)形状的受体采取的构象。应当避免包括存在于功能性受体的表位形状部分暴露的构象灵活性。例如，表位Gly200-Thr215的顺式构型必需在经合适的方法使用之前固定。证明这个观念比较合理的另一证据是观察到大量用来产生抗体的动物(包括小鼠、兔子和羊)并没有受到免疫损害。这些动物没有一种曾经产生过任何肿瘤。

工业应用

本发明的所有方面可应用于人和兽类医药和健康领域，具有能早期和准确诊断疾病和有效治疗的可能性，在许多情况中，与现有技术中可获得的技术相比，其侵入性或创伤性小得多。

本说明书还包括以下内容：

1、一种用于检测疾病或者病情的探针，该探针适用于区别功能性P2X₇受体和非功能性P2X₇受体。

2、项目1的探针，其中所述探针适用于通过检测同ATP与受体的结合相关的变化来区别功能性P2X₇受体和非功能性P2X₇受体。

3、项目1的探针，其中所述探针适用于通过检测P2X₇受体中孔形成所必需的一种或多种蛋白质结合方面的变化来区别功能性P2X₇受体和非功能性P2X₇受体。

4、项目3的探针，其中所述探针适用于通过检测在没有结合的ATP时暴露的受体的一个或多个部分来区别功能性P2X₇受体和非功能性P2X₇受体。

5.项目4的探针，其中所述部分包括P2X₇单体。

6、项目1到5中任一项的探针，它是天然的或者是人造的探针。

7、项目1到5任一项的探针，其中所述疾病或病情选自下组：前列腺癌、乳腺癌、皮肤癌、肺癌、宫颈癌、子宫癌、胃癌、食管癌、膀胱癌、结肠癌和阴道癌，其它上皮细胞癌，恶性淋巴瘤，其它血液癌症，肠道易激综合症和病毒或者其它病原生物体的感染。

8、项目7的探针，其中所述抗体针对的是每一受体位于邻近ATP结合位点的胞外域内的表位。

9、项目1到5任一项的探针，其中所述受体是哺乳动物的P2X₇受体，所述探针适用于区别功能性受体和非功能性受体，该功能性受体具有其中Pro210位于反式构象的序列；该非功能性受体具有其中Pro210位于顺式构象的序列。

10、项目1到5任一项的探针，其中所述受体是哺乳动物P2X₇受体，所述探针适用于区别功能性受体和非功能性受体，该功能性受体具有其中Pro199位于反式构象的序列；该非功能性受体具有其中Pro199位于顺式构象的序列。

11、项目9的探针，其中所述探针是或者包含一种抗体，该抗体是针对P2X₇受体中从Gly200延伸到Thr215的表位序列产生的。

12、项目1到11任一项的探针，其中所述疾病或病情选自下组：前列腺癌、乳腺癌、皮肤癌、肺癌、宫颈癌、子宫癌、胃癌、食管癌、膀胱癌、结肠癌和阴道癌，其它上皮细胞癌，恶性淋巴瘤，其它血液癌症，肠道易激综合症和病毒或者其它病原生物体的感染。

13、项目12的探针，其中所述病毒或生物体是HIV或结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。

14、项目7的探针，其中所述病情为肠道易激综合症，所述抗体也能够检测P2X₇受体中不受功能状态改变的其它区域。

15、项目7或14的探针，其中所述病情为肠道易激综合症，所述抗体与能检测总P2X₇表达的二抗结合使用。

16、一种用于检测疾病或者病情的方法，该方法包括以下步骤：

1)用项目1到10中任何一项所述探针区别功能性P2X₇受体和非功能性P2X₇受体；

2)提供受体表达谱图，和

3)比较该受体表达图谱与正常谱图。

17、项目16的方法，其中所述受体表达谱图是非功能性受体的表达谱图。

18、项目16的方法，其中所述探针适用于通过检测同ATP与受体的结合相关的变化来区别功能性P2X₇受体和非功能性P2X₇受体。

19、项目16的方法，其中所述探针适用于通过检测P2X₇受体上孔形成所必需的一种或多种蛋白质结合方面的变化来区别功能性P2X₇受体和非功能性P2X₇受体。

20、项目16的方法，其中所述探针适用于通过检测所述受体在没有结合的ATP时暴露的一个或多个部分来区别功能性P2X₇受体和非功能性P2X₇受体。

21、项目16的方法，其中所述部分包括P2X₇单体。

22、项目16到21任一项的方法，其中所述受体表达谱图是由原位成像技术提供的。

23、项目16到21中任一项的方法，其中所述受体表达谱图是由显微术、共聚焦显微术或荧光激活细胞分选技术提供的。

24、项目1到15中任何一项所述探针在检测疾病或病情中的应用。

25、一种与项目1到15中任何一项所述探针复合的分离的细胞或组织样品。

26、一种诊断肠道易激综合症的方法，该方法包括检测细胞和/或组织的P2X₇表达谱图，和将该谱图与正常细胞和/或组织的预先测定的表达谱图相比较。

27、项目26的方法，其中P2X₇表达谱图的检测包括一种或多种抗体的应用。

28、一种或多种抗体在诊断肠道易激综合症中的应用。

29、一种治疗肠道易激综合症的方法，该方法包括用适用于恢复P2X₇受体功能的组合物进行给药。

30、一种用于治疗或预防疾病或病情的抗体，该抗体适用于区别功能性P2X₇受体和非功能性P2X₇受体，且只与非功能性受体结合。

31、项目30的抗体，其中所述抗体适用于通过检测同ATP与受体的结合相关的变化来区别功能性P2X₇受体和非功能性P2X₇受体。

32、项目30的抗体，其中所述抗体适用于通过检测P2X₇受体上孔形成所必需的一种或多种蛋白质结合方面的变化来区别功能性P2X₇受体和非功能性P2X₇受体。

33、项目30的抗体，其中所述抗体适用于通过检测受体中在没有结合的ATP时暴露的一个或多个部分来区别功能性P2X₇受体和非功能P2X₇受体。

34、项目30的抗体，其中所述部分包括P2X₇单体。

35、项目30到34中任何一项所述的抗体，它是多克隆的，单克隆的，重组的，人源化抗体或者是它们的合适片段。

36、项目30到34中任何一项所述的抗体，其中所述受体是哺乳动物P2X₇受体，所述抗体适用于区别功能性受体和非功能性受体，该功能性受体具有其中Pro210位于反式构象的序列；该非功能性受体具有其中Pro210位于顺式构象的序列。

37、项目36的抗体，该抗体是针对P2X₇受体的从Gly200延伸到Thr215的表位序列产生的。

38、项目30到34中任何一项所述的抗体，其中所述受体是哺乳动物P2X₇受体，所述抗体适用于区别功能性受体和非功能性受体，该功能性受体具有其中Pro199位于反式构象的序列；该非功能性受体具有其中Pro199位于顺式构象的序列。

39、项目30到37中任何一项所述的抗体，其中所述疾病或病情选自下组：前列腺癌、乳腺癌、皮肤癌、肺癌、宫颈癌、子宫癌、胃癌、食管癌、膀胱癌、结肠癌和阴道癌，其它上皮细胞癌，恶性淋巴瘤，其它血液癌症，肠道易激综合症和病毒或者其它病原生物体的感染。

40、项目39的抗体，其中所述病毒或生物体是HIV或结核分枝杆菌。

41、一种适于引起项目30到40中任何一项所述抗体产生的表位。

42、项目41的表位，该表位附着了C末端Cys残基，该Cys残基通过化学交联剂马来酰亚胺己酰基-N-羟基琥珀酰亚胺(MCS)交联了白喉毒素，从而被连接的表位肽采取的构象采取稳定的顺式脯氨酸构型。

43、项目30到40中任何一项所述的抗体作为治疗载体用于治疗患者疾病或者病情以调节程序性细胞死亡的应用，该抗体通过靶向于表达在细胞表面上的异常或者非功能性P2X₇受体，而使表达正常(功能性)受体的所有细胞不受影响来起作用。

44、项目41或42的表位在引起项目30到40中任何一项所述抗体的产生中的应用。

45、一种用于治疗或预防患者疾病或病情的药物组合物，该组合物包含药学有效量的项目30到40中任何一项所限定的抗体，或者能产生这种量的表位，它们能调节细胞表面上表达有异常或者非功能性P2X₇受体的细胞的程序性细胞死亡。

46、一种治疗或预防患者的疾病或病情的制剂，该制剂包含一种或多种物质，所述物质适用于调节能控制向患者细胞或组织中的P2X₇受体供给ATP的ATPase的表达。

47、一种治疗或预防患者疾病或病情的方法，该方法包括对患者施用包含一种或多种物质的制剂这一步骤，所述物质适用于调节能控制向患者细胞或组织中的P2X₇受体供给ATP的ATPase的表达。

48、项目46的制剂，其中所述疾病或病情选自下组：前列腺癌、乳腺癌、皮肤癌、肺癌、宫颈癌、子宫癌、胃癌、食管癌、膀胱癌、结肠癌和阴道癌，其它上皮细胞癌，恶性淋巴瘤，其它血液癌症，肠道易激综合症和病毒或者其它病原生物体的感染。

49、项目47的方法，其中所述疾病或病情选自下组：前列腺癌、乳腺癌、皮肤癌、肺癌、宫颈癌、子宫癌、胃癌、食管癌、膀胱癌、结肠癌和阴道癌，其它上皮细胞癌，恶性淋巴瘤，其它血液癌症，肠道易激综合症和病毒或者其它病原生物体的感染。

Claims (14)

1.结合具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列、且其中Pro210处于顺式构象的P2X7受体的胞外域的抗体，且其中所述抗体不结合Pro210位于反式构象的具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的P2X7受体的胞外域。

2.权利要求1的抗体，其中所述抗体结合包括SEQ ID NO：1的Pro210的P2X7受体的表位。

3.权利要求1或2的抗体，其中所述抗体结合包含SEQ IDNO：1的氨基酸序列Gly200-Thr215的表位。

4.权利要求1或2的抗体，其中所述抗体选自多克隆抗体、单克隆抗体、重组抗体、人源化抗体、人抗体和抗体片段。

5.权利要求3的抗体，其中所述抗体选自多克隆抗体、单克隆抗体、重组抗体、人源化抗体、人抗体和抗体片段。

6.用于产生以上权利要求中任一项的抗体的肽，其中所述肽包含SEQ ID NO：1的氨基酸片段，其特征在于，所述肽包括位于顺式构象的Pro210。

7.权利要求6的肽，其中所述氨基酸片段包含SEQ ID NO：1的Gly200-Thr215。

8.权利要求1-5中任一项的抗体在制备用于检测癌前病变的药物中的用途。

9.权利要求1-5中任一项的抗体在制备用于检测上皮细胞癌的药物中的用途。

10.权利要求9的用途，其中所述上皮细胞癌选自前列腺癌、乳腺癌、皮肤癌、肺癌、宫颈癌、子宫癌、胃癌、食管癌、膀胱癌、结肠癌和阴道癌。

11.权利要求1-5中任一项的抗体在制备用于检测血液癌症的药物中的用途。

12.权利要求11的用途，其中所述血液癌症是恶性淋巴瘤。

13.权利要求1-5中任一项的抗体在制备用于检测肠道易激综合征的药物中的用途。

14.权利要求1-5中任一项的抗体在制备用于检测HIV或结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)感染的药物中的用途。