[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

CN101535041A - 溶菌酶-壳聚糖膜 - Google Patents

溶菌酶-壳聚糖膜 Download PDF

Info

Publication number
CN101535041A
CN101535041A CNA2007800418735A CN200780041873A CN101535041A CN 101535041 A CN101535041 A CN 101535041A CN A2007800418735 A CNA2007800418735 A CN A2007800418735A CN 200780041873 A CN200780041873 A CN 200780041873A CN 101535041 A CN101535041 A CN 101535041A
Authority
CN
China
Prior art keywords
shitosan
lysozyme
film
chitosan
acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2007800418735A
Other languages
English (en)
Inventor
赵艳云
朴首一
马克·A·达埃舍尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Oregon State Oregon State University State Represented By Council For Higher Education State
Oregon State
Original Assignee
Oregon State Oregon State University State Represented By Council For Higher Education State
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Oregon State Oregon State University State Represented By Council For Higher Education State filed Critical Oregon State Oregon State University State Represented By Council For Higher Education State
Publication of CN101535041A publication Critical patent/CN101535041A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B32—LAYERED PRODUCTS
    • B32B—LAYERED PRODUCTS, i.e. PRODUCTS BUILT-UP OF STRATA OF FLAT OR NON-FLAT, e.g. CELLULAR OR HONEYCOMB, FORM
    • B32B9/00—Layered products comprising a layer of a particular substance not covered by groups B32B11/00 - B32B29/00
    • B32B9/02—Layered products comprising a layer of a particular substance not covered by groups B32B11/00 - B32B29/00 comprising animal or vegetable substances, e.g. cork, bamboo, starch
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING OR TREATMENT THEREOF
    • A23C19/00—Cheese; Cheese preparations; Making thereof
    • A23C19/06—Treating cheese curd after whey separation; Products obtained thereby
    • A23C19/063—Addition of, or treatment with, enzymes or cell-free extracts of microorganisms
    • A23C19/10—
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING OR TREATMENT THEREOF
    • A23C19/00—Cheese; Cheese preparations; Making thereof
    • A23C19/14—Treating cheese after having reached its definite form, e.g. ripening, smoking
    • A23C19/16—Covering the cheese surface, e.g. with paraffin wax
    • A23L3/3463—
    • A23L3/3481—
    • A23L3/3571—
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B32—LAYERED PRODUCTS
    • B32B—LAYERED PRODUCTS, i.e. PRODUCTS BUILT-UP OF STRATA OF FLAT OR NON-FLAT, e.g. CELLULAR OR HONEYCOMB, FORM
    • B32B27/00—Layered products comprising a layer of synthetic resin
    • B32B27/30—Layered products comprising a layer of synthetic resin comprising vinyl (co)polymers; comprising acrylic (co)polymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B32—LAYERED PRODUCTS
    • B32B—LAYERED PRODUCTS, i.e. PRODUCTS BUILT-UP OF STRATA OF FLAT OR NON-FLAT, e.g. CELLULAR OR HONEYCOMB, FORM
    • B32B27/00—Layered products comprising a layer of synthetic resin
    • B32B27/32—Layered products comprising a layer of synthetic resin comprising polyolefins
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B32—LAYERED PRODUCTS
    • B32B—LAYERED PRODUCTS, i.e. PRODUCTS BUILT-UP OF STRATA OF FLAT OR NON-FLAT, e.g. CELLULAR OR HONEYCOMB, FORM
    • B32B27/00—Layered products comprising a layer of synthetic resin
    • B32B27/34—Layered products comprising a layer of synthetic resin comprising polyamides
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B32—LAYERED PRODUCTS
    • B32B—LAYERED PRODUCTS, i.e. PRODUCTS BUILT-UP OF STRATA OF FLAT OR NON-FLAT, e.g. CELLULAR OR HONEYCOMB, FORM
    • B32B27/00—Layered products comprising a layer of synthetic resin
    • B32B27/36—Layered products comprising a layer of synthetic resin comprising polyesters
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B32—LAYERED PRODUCTS
    • B32B—LAYERED PRODUCTS, i.e. PRODUCTS BUILT-UP OF STRATA OF FLAT OR NON-FLAT, e.g. CELLULAR OR HONEYCOMB, FORM
    • B32B9/00—Layered products comprising a layer of a particular substance not covered by groups B32B11/00 - B32B29/00
    • B32B9/04—Layered products comprising a layer of a particular substance not covered by groups B32B11/00 - B32B29/00 comprising such particular substance as the main or only constituent of a layer, which is next to another layer of the same or of a different material
    • B32B9/045—Layered products comprising a layer of a particular substance not covered by groups B32B11/00 - B32B29/00 comprising such particular substance as the main or only constituent of a layer, which is next to another layer of the same or of a different material of synthetic resin
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B32—LAYERED PRODUCTS
    • B32B—LAYERED PRODUCTS, i.e. PRODUCTS BUILT-UP OF STRATA OF FLAT OR NON-FLAT, e.g. CELLULAR OR HONEYCOMB, FORM
    • B32B2307/00—Properties of the layers or laminate
    • B32B2307/70—Other properties
    • B32B2307/714—Inert, i.e. inert to chemical degradation, corrosion
    • B32B2307/7145—Rot proof, resistant to bacteria, mildew, mould, fungi
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B32—LAYERED PRODUCTS
    • B32B—LAYERED PRODUCTS, i.e. PRODUCTS BUILT-UP OF STRATA OF FLAT OR NON-FLAT, e.g. CELLULAR OR HONEYCOMB, FORM
    • B32B2307/00—Properties of the layers or laminate
    • B32B2307/70—Other properties
    • B32B2307/724—Permeability to gases, adsorption
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B32—LAYERED PRODUCTS
    • B32B—LAYERED PRODUCTS, i.e. PRODUCTS BUILT-UP OF STRATA OF FLAT OR NON-FLAT, e.g. CELLULAR OR HONEYCOMB, FORM
    • B32B2439/00—Containers; Receptacles
    • B32B2439/70—Food packaging

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Ceramic Engineering (AREA)
  • Food Preservation Except Freezing, Refrigeration, And Drying (AREA)
  • Wrappers (AREA)
  • Laminated Bodies (AREA)
  • Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)

Abstract

本公开一方面涉及一种复合膜，其包含结合在壳聚糖聚合物基质内的溶菌酶。另一方面，公开了一种膜，其包含壳聚糖和以壳聚糖重量计大约10到大约200重量％的溶菌酶。还公开了制造该膜的方法，包括将壳聚糖和溶菌酶溶解或分散在水性介质中，产生成膜溶液或分散液；将成膜溶液或分散液施加于基体表面；和使成膜溶液或分散液转变成膜。在特别有用的应用中，该膜是用于食品的抗微生物保护剂。

Description

溶菌酶-壳聚糖膜
与相关申请的交互参考
本申请要求2006年9月18日提交的美国专利申请No.11/523,112的优先权，该申请是2005年3月17日提交的PCT国际申请No.PCT/US2005/008855的部分继续申请，该国际申请指定美国并要求2004年3月18日提交的美国临时专利申请No.60/554,623的优先权。这些申请合并在此作为参考。
技术领域
本公开是特别适用于保护食品的抗微生物膜。
背景技术
在固体或半固体食品中，微生物生长主要发生在表面上。热处理和化学防腐剂是最广泛使用的保持微生物安全性和食物质量的方法。抗微生物性加强的包装膜通过抗微生物物质从载体膜结构向食物表面的受控释放，来确保食物表面的微生物安全性。此外，消费者对合成的化学性食物防腐剂的顾虑也导致对替代的更“有益于消费者”的可食用保护膜的关注日益增加。
溶菌酶是在许多自然体系中发现的裂解酶，已得到了充分研究。它是小而稳定的酶，具有已研究清楚的维度结构和序列。溶菌酶在食物防腐中具有潜在的用途，因为它在范围很广的pH和温度条件下都具有稳定性。但是，它对革兰氏阴性菌的抗微生物效用有限，限制了它在食品工业中的应用。壳聚糖是已知的也表现出抗微生物活性的成膜生物聚合物。
对于具有增强的抗微生物活性且机械性能没有明显降低的膜，存在着持续的需求。
概述
本公开的一个方面涉及一种复合膜，其包括结合在壳聚糖聚合物基质内的溶菌酶。在另一个方面，公开了一种膜，其包含壳聚糖，以及以壳聚糖的重量计大约10到大约200重量百分比的溶菌酶。
还公开了制造膜的方法，包括在产生成膜溶液或分散液的水性介质中溶解或分散壳聚糖和溶菌酶；将成膜溶液或分散液施加到基体表面；并将成膜溶液或分散液转变为膜。
在特别有用的应用中，该膜是食品的抗微生物保护剂。
附图说明
图1是描绘溶菌酶从溶菌酶-壳聚糖复合膜基质向0.15M磷酸盐缓冲液的释放模式作为时间函数的图。N＝6；L0＝0％溶菌酶(w/w壳聚糖)；L20＝20％溶菌酶(w/w壳聚糖)；L60＝60％溶菌酶(w/w壳聚糖)；L100＝100％溶菌酶(w/w壳聚糖)。膜厚度为72.6±8.2μm。
图2A和2B是描绘溶菌酶-壳聚糖复合膜对抗BHI肉汤中的大肠杆菌(E.coli)(2A)和MRS肉汤中的粪链球菌(S.faecalis)(2B)效果的图。N＝6；对照＝没有膜；L0＝0％溶菌酶(w/w壳聚糖)；L20＝20％溶菌酶(w/w壳聚糖)；L60＝60％溶菌酶(w/w壳聚糖)；L100＝100％溶菌酶(w/w壳聚糖)。
图3A-3D是在1,000X放大倍数下观察到的溶菌酶-壳聚糖复合膜表面的扫描电镜照片；L0(3A)，L20(3B)，L60(3C)，L100(3D)。L0＝0％溶菌酶(w/w壳聚糖)；L20＝20％溶菌酶(w/w壳聚糖)；L60＝60％溶菌酶(w/w壳聚糖)；L100＝100％溶菌酶(w/w壳聚糖)。
图4A-4D是在1,000X放大倍数下观察到的溶菌酶-壳聚糖复合膜横截面的扫描电镜照片；L0(4A)，L20(4B)，L60(4C)，L100(4D)。L0＝0％溶菌酶(w/w壳聚糖)；L20＝20％溶菌酶(w/w壳聚糖)；L60＝60％溶菌酶(w/w壳聚糖)；L100＝100％溶菌酶(w/w壳聚糖)。
图5是描绘壳聚糖和壳聚糖-溶菌酶(CL)复合独立膜在10℃保存期间对抗马苏里拉奶酪上的单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)效果的图(对照：未应用CL膜；L0＝0％溶菌酶(w/w壳聚糖)膜；L60＝60％溶菌酶(w/w壳聚糖)膜)。
图6是描绘壳聚糖和CL复合层合体在10℃保存期间对抗马苏里拉奶酪上的单核细胞增生李斯特菌效果的图(对照：未应用CL膜；L0＝0％溶菌酶(w/w壳聚糖)膜；L60＝60％溶菌酶(w/w壳聚糖)膜)。
具体说明
为了容易理解，下面对本文使用的下列术语加以详细描述：
“环境室内条件”是指大约10℃到大约40℃的室温，通常为大约20℃到大约25℃，压力约为1个大气压，以及含有一定量水分的气氛。
“类似物”是化学结构与母体化合物不同的分子，例如同系物(化学结构中的增量不同，例如烷基链的长度不同)、分子片段、一个或多个官能团不同的结构、或离子化的变化。
“抗微生物有效量”是抗微生物组分或组分的混合物与缺乏该抗微生物组分的对照样品相比，足以抑制至少一种微生物在样品中的生长到达统计学显著性程度的量，优选抑制至少大约25％、更优选至少大约50％和最优选完全抑制微生物的生长。
“壳聚糖”(也称为聚-(1→4)-β-D-葡糖胺)包括下面更详细描述的脱乙酰几丁质(几丁质也称为β-(1-4)-聚-N-乙酰基-D-葡糖胺)及其盐在。贝壳类和甲壳类的壳是几丁质的通常来源，而壳聚糖从几丁质衍生。
“膜”包括涂层，并且膜在其施加或在其上形成的食品表面上可以是不连续的或基本连续的。例如，“膜”包括可以包裹在食品上的独立膜以及通过喷雾、浸渍、滴落或类似的技术在食品上形成的涂层。
“抑制”意指本文公开的膜将在一定时间段内减慢或终止某些微生物的生长或增殖。
“溶菌酶”是指一类酶家族，其催化细菌细胞壁某些粘多糖的水解，特别是N-乙酰基胞壁酸与N-乙酰基葡糖胺之间的β(1-4)糖苷键，并导致细菌溶解。可以在本文中使用的溶菌酶包括以下详述的天然存在的溶菌酶，合成的溶菌酶以及重组的溶菌酶。
“微生物”用于指显微生物体或物质，包括真菌和细菌生物体，其能够感染人类或动物和/或导致食物腐败或其它有害的食物分解或变质。术语“抗微生物”因此用在这里指杀死或者抑制真菌和/或细菌有机体的物质或药剂。
以上提供的术语说明只为了帮助读者，不应解释为具有小于本领域普通技术人员所理解的范围或者作为对所附权利要求范围的限制。
单数术语包括复数指示物，除非文中明确地另有指示。同样，单词“或”旨在包括“和”，除非文中明确地另有指示。单词“包含”指的是“包括”。除非另有指示，化学命名组分的描述是指添加到说明书中指明的任何组合中时的组分，但是不必排除混合物的组分一旦混合后之间的化学相互作用。
本文中公开的膜包括至少一种壳聚糖和至少一种溶菌酶，二者都是可大量获得的可再生材料。已经发现，基于壳聚糖的膜基质能够有效携带高浓度溶菌酶，产生溶菌酶-壳聚糖复合膜。溶菌酶能够以受控的方式从聚合壳聚糖膜基质释放，并保持其对细菌细胞壁基体的溶解活性。例如抗微生物组分溶菌酶(和在某些情况下的壳聚糖)能够从膜释放并迁移到食品结构中。这样的复合膜与单用壳聚糖或单用溶菌酶相比，对于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌具有增强的协同抗微生物活性，同时不降低膜的防潮性质。在膜的某些实施例中，所有组分对于人类或动物的安全食用来说，都是可食的，并且可以从可再生来源获得。此外，该膜是可生物降解的。
溶菌酶基本均匀地分布在壳聚糖分子形成的整个聚合网络中。溶菌酶可以分布在壳聚糖网络内的微粒形式存在，其中溶菌酶分子与壳聚糖分子形成氢键和/或范德华相互作用。
壳聚糖是丰富的、可再生的和无毒的聚合物，其与许多其他物质生物相容。膜可以采用任何形式或级别(例如，食品级或医用级)的壳聚糖来制造。例如，壳聚糖的粘均分子量可以从大约20到大约2,000kDa，脱乙酰作用的程度可以从大约70到大约90％。根据生产膜的一个示例性方法，壳聚糖成分(或不同壳聚糖的混合物)起初溶解于水性酸溶液中，引起壳聚糖盐的形成。在膜中存在的形成的壳聚糖盐例子包括壳聚糖乙酸盐、壳聚糖山梨酸盐、壳聚糖丙酸盐、壳聚糖乳酸盐、壳聚糖谷氨酸盐、壳聚糖苯甲酸盐、壳聚糖柠檬酸盐、壳聚糖马来酸盐、壳聚糖乙醇酸盐、壳聚糖丙烯酸盐、壳聚糖琥珀酸盐、壳聚糖草酸盐、壳聚糖抗坏血酸盐、壳聚糖酒石酸盐、及其混合物。膜中壳聚糖的量可以根据所需的膜性质而变化。例如，以膜的固体总重量计，膜可以含有大约25到大约90、更尤其是大约35到大约65重量％的壳聚糖。
溶菌酶是天然的抗微生物多肽，其存在于各种各样生物体中，包括病毒、鸟类、哺乳动物和植物。在人类中，溶菌酶出现在脾、肺、肾、白血细胞、血浆、唾液、乳汁、泪液和软骨中。因此，溶菌酶可以从人类的乳汁、泪液、唾液和鼻粘液中分离。它出现在母牛的乳汁和初乳中。也可以从花椰菜汁中分离溶菌酶。但是，在工业规模上提取溶菌酶的最重要来源是鸡蛋清。溶菌酶还称为胞壁质酶或N-乙酰胞壁酰水解酶。人类形式的也能够以重组方式生产。在本文公开的膜中，溶菌酶的有效量可以根据溶菌酶的来源而变化。某些比其它的更有效，鸡溶菌酶的活性小于人类溶菌酶。膜中溶菌酶的抗微生物有效量也可以根据所需的膜性质而变化。尤其是，溶菌酶的最小量应当足以提供抗微生物活性。溶菌酶的最大量不应高到明显降低膜的机械或透水汽性质。例如，以壳聚糖的重量计，溶菌酶可以在膜中存在的量为大约10到大约200重量％、更特别是大约10到大约100重量％，并且最特别的是大约30到大约90重量％。换言之，膜可以包含的溶菌酶量最高为壳聚糖量的两倍。如果溶菌酶的量超过壳聚糖重量的200％，则膜可能变得非常脆并且机械性能差。
膜的任选成分是至少一种增塑剂，它可以是或不是可再生的材料。增塑剂能够降低膜的脆性，并增加膜的挠性和抗冲击性。示例性的增塑剂包括甘油、山梨糖醇、丙二醇(propylene glycol)、乙二醇、二乙二醇、三乙二醇、聚乙二醇(例如，PEG 300和PEG 400)、酒石酸二丁酯、丙二醇(propanediol)、丁二醇、乙酰化的甘油一酯、及其混合物。膜中增塑剂的量可以根据所需的膜性质而变化。特别是，由于溶菌酶的成膜性质弱，增塑剂的量应随着溶菌酶浓度的增加而增加。例如，以壳聚糖的重量计，膜可以含有大约1到大约50、更特别是大约20到大约30重量％的增塑剂。
膜的另一种任选成分是至少一种交联剂，其可以是或不是可再生的材料。交联剂能够改进膜的防水汽性质，并减低膜的水溶性。示例性的交联剂包括戊二醛、甲醛、乙二醛、双醛淀粉、含有多价离子(例如，钙和镁阳离子)的物质、及其混合物。膜中交联剂的量可以根据所需的膜性质而变化。例如，基于壳聚糖的重量，膜可以含有大约1到大约20、更特别是大约5到大约10重量％的交联剂。
其它任选成分包括抗氧化剂、其它抗微生物剂、调味剂/着色剂、疏水剂、营养剂和类似的添加剂。为了改善防水性质，疏水添加剂例如脂肪酸(即，油酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸和硬脂酸)、乙酰化的甘油酯、蜡(即，巴西棕榈蜡、蜂蜡和石蜡)、和油(即，矿物油和植物油)可以壳聚糖重量的大约20到大约100％的浓度范围掺入到膜组合物中。营养剂，例如矿物质和维生素可以掺入到膜基质以提高包裹或涂层产品的营养价值。例如，可以掺入钙、锌和维生素E以提高包裹或涂层产品的健康益处(参见，Park，S.-I.和Zhao，Y.2004.Incorporation of High Concentration of Mineral or Vitamin intoChitosan-Based Films.(将高浓度矿物质或维生素掺入到基于壳聚糖的膜中)Journal of Agricultural and Food Chemistry.2004，vol.52，pp.1933-1939)。
膜可以由任何成膜技术制造，包括流延(即，形成独立膜)、浸渍、喷雾、涂刷、降膜和类似的方法。根据一个变体，所有的膜成分在液体混合物(即，成膜混合物)中混合在一起，液体混合物接着形成膜。例如，液体混合物可以基本均匀地分布在基体表面上，然后干燥形成膜。在特定实施例中，膜的成分是水溶性的或可分散的或修饰的，以变得有水溶性或可分散(即增溶的)。成分混合在一起成为水性溶液(即，水是载体溶剂或介质)，然后在环境室温和湿度下风干，形成膜。或者，膜的成分能够在有机溶剂载体中溶解。膜的成分可以以任何次序混合在一起。
成膜混合物应当相对容易制造和使用。成膜混合物的粘度应当足够低，以允许将混合物施加和铺展到基体上，而不需要任何强力施加技术或设备。例如，成膜混合物的粘度范围可以从大约10cps到大约200cps。
壳聚糖在水性有机酸或无机酸中可溶。可溶的水性有机酸包括乙酸、山梨酸、丙酸、乳酸、谷氨酸、苯甲酸、柠檬酸、马来酸、乙醇酸、丙烯酸、琥珀酸、草酸、抗坏血酸、酒石酸及其混合物。通常，有机酸是非常稀的，例如，根据具体类型的酸，浓度为大约0.5到大约5、更特别是大约1到大约2重量％。
一般来说，预定量的壳聚糖在环境室温下溶于水性有机酸，产生壳聚糖盐溶液。混合物的pH可以是大约2.5到大约6.3，更特别是大约5.0到大约6.0。基于水的重量和根据膜终产物中壳聚糖的所需量，壳聚糖在水性酸中的溶解量可以从大约1到大约5重量％、更特别是大约2重量％。壳聚糖盐溶液也可以包含任何上述的任选成分，例如增塑剂。
然后，将溶菌酶添加到壳聚糖盐溶液中。溶菌酶可以得自不同供应商的纯净级、工业级、食品级或药品级溶液的形式添加。或者，溶菌酶储存液可以通过将预定量的溶菌酶溶解在蒸馏水中而制备。基于水的重量和根据膜终产物中溶菌酶的所需浓度，溶菌酶溶于水的量可以从大约5到大约2015重量％、更特别是大约10到大约。如果溶菌酶的量太大，成膜溶液可能变成稀得不合格，可不利地影响膜性质。溶菌酶储存液也可以包含任何上述的任选成分，例如增塑剂。
壳聚糖盐溶液和溶菌酶储存液在环境室内条件下混合在一起，产生成膜溶液。或者，可以在最高大约50℃的温度下加热成膜溶液或将其加热到该温度，以加强溶解。选择壳聚糖盐溶液的量相对于溶菌酶储存液的量，以提供所需浓度的溶菌酶。所产生的水性成膜溶液的pH可以被调整到大约5到大约6的范围，通过提供弱酸性条件来保护食物。
膜能够以任何方法施加到食品上。通过将成膜溶液施加到基体上，从成膜溶液形成膜。例如，成膜溶液能够喷雾或涂刷到表面上，以形成保护性涂层，或者可以将食品浸渍到成膜溶液中。或者，流延膜能够通过包裹或类似的方法，施加到食品表面上。溶液涂布的基体可以在大约25℃到大约65℃的温度下加热大约2小时到大约48小时，以形成膜。在涉及直接涂布食品的变体中，干燥时间通常较短(例如，强制通风下大约5到大约60分钟)。
壳聚糖-溶菌酶复合膜本身就可以作为独立膜使用，或者能够与其它膜组合形成多层的层合结构而使用。例如，壳聚糖-溶菌酶膜能够被层压或布置在用于食物包装的其他类型膜(或膜层合体)的食物接触表面上。其它类型的膜能够起到壳聚糖-溶菌酶膜的支撑体的功能。这样的层合体利用了壳聚糖-溶菌酶复合膜的抗微生物性质以及其它类型膜的阻挡和机械性质。其它食物包装膜的例子包括由聚烯烃聚合物(例如，聚乙烯(高密度PE和低密度PE))、聚酰胺聚合物、聚酯聚合物(例如，聚对苯二甲酸乙二醇酯)、和/或乙烯基聚合物(例如，乙烯乙酸乙酯，聚氯乙烯，聚偏氯乙烯)制成的单层或多层层合结构。膜的任何层可以是金属化的膜，其中Al或金属氧化物置于膜表面。
膜的抗微生物活性的持续时间取决于环境条件。在高湿条件下，涂层组分迁移到食品中的速率会增加，从而减少了抗微生物活性的有效持续时间。在某些实施例中，在环境室内条件下，膜可以保持完整(即膜保持其颜色、维度和机械强度)最多大约四个月。在其它实施例中，抗微生物活性能够保持最多大约三周。
施加于食品表面的涂层量应当足以在表面上形成基本连续的膜。该量根据各种因素而改变，包括食品的种类、施加方法和所需的性质，但是范围为大约2到大约30、更特别是大约5到大约10mg/cm2基体表面积。根据某些实施例，独立膜的厚度应当为至少大约20μm、更特别是大约30到大约80μm。低于20μm的厚度表明涂层直接在食物表面上形成(例如，通过浸渍)。
设计本文公开的膜的具体目的是为了抑制食物表面上的病原性和腐败性细菌和真菌。示例性的细菌包括植物乳杆菌(Lactobacilusplantarum)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、沙门氏菌属(Salmonella spp)和假单胞菌属(Pseudomonas spp)。示例性的真菌包括黑曲霉菌(Aspergillus niger)、核果褐腐菌(Monoilinia fructicola)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)和根霉属(Rhizopus spp.)
能够按照本文所述保护的食品通常是那些容易被微生物生长、脱水(失水)和/或由于呼吸作用而成熟导致质量劣化的食品。通常，奶酪(片状或块状)和加工过的肉制品(火腿、热狗、香肠等)可以用制成的膜包裹或用成膜溶液涂布。容易腐烂的水果和蔬菜日用品，例如浆果、樱桃、葡萄、苹果、梨、油桃、李和杏可以被涂层以增强微生物安全性并延长产品的保存期。
膜表现出适宜的透水汽性质。例如，膜的透水汽性可以从大约1到大约300、更特别是大约10到大约100gmm/m2d kPa。膜的透水汽性和机械性质可以取决于成膜过程中的相对湿度(RH)，因为水可以作为壳聚糖膜中的增塑剂。在低RH条件下(例如，低于40％)，膜是相对良好的气体阻挡材料，并具有改善的防水性质。在50％RH下，膜可以表现出中等机械性质(例如，拉伸强度10到100MPa和破裂时的延长度为10到50％)，与可商购的低密度聚乙烯(LDPE)膜相当。膜的防水性质能够通过加入液体材料加以改善。
实施例
下面描述的具体实施例是为了说明的目的，不应被视为限制了所附权利要求的范围。
实施例1
材料
使用Vanson Inc.(Redmond，WA)的虾壳聚糖，不加以进一步纯化。虾壳聚糖的特征在于1％w/w水性乙酸溶液的25℃粘度为11cps并且89.9％脱乙酰化。鸡蛋清溶菌酶从Eiprodukte GmbH und Co.(德国)获得。USP(美国药典)级甘油从EM Science(Darmstadt，德国)获得。试剂级冰乙酸从J.T.Baker(Phillipsburg，NJ)获得。
革兰氏阳性粪链球菌(Streptococcus faecalis)ATCC 14508和革兰氏阴性B型大肠杆菌用作试验生物体。从Sigma Chem.Co.(St.Louis，MO)获得冻干溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)用于测量溶菌酶释放模式。脑心浸液(BHI)肉汤、MRS肉汤和琼脂从Difco of Becton，Dickinson and Company(Sparks，MD)购买。
制备成膜溶液
成膜溶液(FFS)通过混合壳聚糖溶液与溶菌酶溶液制成。壳聚糖溶液通过将2wt％壳聚糖溶解在1wt％乙酸溶液中并加入25％甘油(w/w壳聚糖)而制备。溶菌酶溶液通过将10wt％溶菌酶溶解在蒸馏水中并加入25％甘油(w/w溶菌酶)而制备。溶菌酶溶液以0、20、60或100％(每干重壳聚糖的溶菌酶干重百分比)的浓度混合到壳聚糖溶液中。产生的混合物在Model PT 10-35(Kinematica AG，瑞士)中以3,000rpm匀化60秒。成膜溶液的pH用5N氢氧化钠调节到5.2。所有的样品溶液通过尼龙筛过滤，以除去不溶的残留物并在真空下脱气(Model0211-P204，Gast Mfg.Corp.，Benton Harbor，MI)。
膜形成
将计算好量的每种脱气的成膜溶液流延在平坦的特氟龙涂布的玻璃板上，面积为260 x 260mm，以达到大约70μm的均匀膜厚度。室内条件下(24±2℃和40±5％相对湿度)干燥2天后，将干燥的膜从板上剥离，并切成片用于分析。尺寸为25 x 25mm的膜片段进行密度和水分含量评估。尺寸为25 x 86mm的膜片段用于机械测试。尺寸为70x 70mm的膜片段用于透水汽性测试。在所有测量之前，膜片在设定为25℃和50％相对湿度的环境室中(Model T10RS，Tenney Environmental，Williamsport，PA)调节至少2天。
测量膜厚度、密度和水分含量
在25℃和50％下调节2天后，使用No.293-766-30型千分卡尺(Mytutoyo Manufacturing Co.Ltd.，日本)，在每张膜样本的5个随机部位测量膜厚度。膜密度通过膜重量除以膜体积计算。膜的水分含量通过将膜样本在强制通风炉(Precision Scientific Inc.，Chicago，IL)中于105℃干燥18小时而进行重量测定。水分含量的百分比湿基计算。
溶菌酶释放分析
溶菌酶-壳聚糖膜样本的大约0.03g样品浸没在小瓶中的20ml0.15M磷酸缓冲液(pH6.2)中，并用震荡器(New Brunswick Scientific Co.Inc.，New Brunswick，NJ)在室温下以50rpm振摇。冻干溶壁微球菌的储存底物溶液在0.15M磷酸盐缓冲溶液中制备(450nm下的吸光度为0.65)。在0、0.25、1、4、12、24和48的时间间隔取1μl混合物样品。这些样品与2.5ml溶壁微球菌底物在比色杯中混合，并立即用Shimadzu UV-Vis 2100分光光度计(Shimadzu Co.，日本)在25℃读数40秒。溶菌酶的活性率通过测量溶液在450nm处吸光度的降低而确定，这反映了细胞壁底物的水解。光密度降低表示为每分钟Mille-吸光度单位(M abs/min)的变化。根据0.15M磷酸缓冲液中标准化溶菌酶浓度的回归线，将活性单位转化为mg/l溶菌酶，接着转化为每g干燥膜释放的g溶菌酶。
抗微生物活性
大肠杆菌和粪链球菌在37℃下分别于脑心浸液(BHI)肉汤和MRS肉汤中生长过夜。1ml这些微生物的样品用99ml同样的肉汤稀释，获得大约107CFU/ml的接种物。大约0.03g的每种膜样本放在培养皿(直径85mm)中，然后向其中注入10ml接种物。不暴露于膜的接种物用作对照。培养皿在室温下以50RPM振摇。在0、6、12和24小时取样，用稀释瓶(Dilu-Lock IITM Butterfield’s Buffer，Hardy Diagnostics，SantaMaria，CA)稀释，双份铺板。BHI和MRS琼脂分别用于大肠杆菌和粪链球菌的铺板。在计数菌落数量之前，每块板在37℃下温育48小时。
测量透水汽性
按照ASTM E 96(ASTM 2000a)，透水汽性(WVP)在25℃和100/50％ RH梯度下用杯法测定。
Figure A200780041873D0017150421QIETU
制成的测试杯，内径为57mm，内部深度为15mm，每个中放入11ml蒸馏水。水和膜之间的距离为10.7mm，有效膜面积为25.5cm2。测试杯组件放在温度和湿度控制室中(25℃和50％RH)。每个杯组件用电子天平(精确度为0.0001g)每小时称重，共计6小时，以记录水分随时间的丢失。然后用WVP校正方法(Gennadios等1994)，将WVP针对膜和水表面之间的停滞空气间隙阻力进行校正。
机械性质
膜的机械性质用质构分析仪(TA.XT2i，Texture Technologies Corp.，Scarsdale，NY)来测定。在将膜样本从室中取出后，立即进行所有性质的测量，使水分变化最小。用ASTM D882法(ASTM 2000b)测量拉伸强度(TS)和破裂时的延长百分比(EL)。每个膜样本安装在质构分析仪的夹具(TA96)之间，测试时夹具(grip)最初分开50mm且十字头速度为1mm/s。TS值报告为测量到的最大负荷(N)除以膜横截面积(mm2)，单位为MPa。EL值通过记录到的破裂时的延长除以样本的最初长度并乘以100。
微结构
膜的表面和内部结构用扫描电子显微镜(AmRay 3300FE fieldemission SEM，AmRay，Bedford，MA)评估。膜片安装到铝短棒(stub)上并用溅射镀膜仪(Edwards model S150B Sputter Coater；BOC EdwardsVacuum，Ltd，UK)涂覆金-钯合金。每个涂层的样品用5kV电压和与样品呈法向方向的电子束来检查。
统计分析
所有试验都三份重复进行。在每次重复中，两种膜样本用于溶菌酶释放和抗微生物活性测量；5个膜样品用于密度、水分含量和WVP测量；以及10个膜样品用于机械性质测量。在用SAS(StatisticalAnalysis System Institute Inc.，Cary，NC)检测不同膜之间的差异时，应用一般线性模型(GLM)程序。所有的处理都进行用于方差分析(ANOVA)的PROC GLM。进行PROC REG以发现对所测量的反应的拟合回归模型。Duncan多范围检验用于多个平均值的比较。差异的显著性规定为p<0.05。
结果-膜形成和基本物理性质
当将溶菌酶掺入壳聚糖溶液中时，在任何成膜溶液中均未观察到沉淀。这表明乙酸溶解的壳聚糖溶液与水溶性溶菌酶的相容性良好。所有干燥的膜容易从流延板上剥离。通过流延计算好量的成膜溶液，所有类型膜的厚度被认真控制在72±11μm范围内。这确保了没有发现膜厚度的统计学差异(p<0.05)。
下表1显示了每个测试膜(n＝15)的密度和水分含量。纯壳聚糖膜(L0)的密度和水分含量都最高。所有膜之间的密度都没有统计学差异。随着溶菌酶浓度升高，水分含量趋于降低。尽管不受任何理论的约束，但是这可能是因为壳聚糖和溶菌酶都含有大量-OH和-NH2基团而产生的。氢键是这些基团之间主要的吸引力。向壳聚糖链中加入溶菌酶分子，通过增加壳聚糖和溶菌酶分子之间的相互作用，例如氢键和范德华相互作用，而改变了壳聚糖分子的结构构型。溶菌酶同时含有亲水和疏水氨基酸。在成膜期间，可以通过在溶菌酶折叠中发挥重要作用的相同疏水相互作用，用亲水性氨基酸侧链朝着水性成膜溶液突出而形成溶菌酶的疏水核心(Proctor和Cunningham 1988)。膜基质中的这些疏水侧链可以影响溶菌酶-壳聚糖复合膜的水分含量。
表1：溶菌酶-壳聚糖复合膜的组成和物理性质
Figure A200780041873D00191
1膜厚度＝72.6±8.2μm；L0＝0％溶菌酶(w/w壳聚糖)；L20＝20％溶菌酶(w/w壳聚糖)；L60＝60％溶菌酶(w/w壳聚糖)；L100＝100％溶菌酶(w/w壳聚糖)
2甘油的重量％是以成膜溶液中壳聚糖重量和溶菌酶重量之和计
结果-溶菌酶的释放
从膜基质释放的溶菌酶量显示在图1中。没有溶菌酶的壳聚糖膜(L0)没有显示出任何对冻干溶壁微球菌的溶胞活性，而这些活性随着结合到膜基质中的溶菌酶浓度的增加而成比例增加。当溶菌酶-壳聚糖复合膜放在磷酸盐缓冲溶液中时，由于水分子扩散进入聚合的膜结构，导致膜溶胀，引起结合的溶菌酶从膜基质释放到水性环境中。溶菌酶从膜基质随时间对数释放。溶菌酶从膜基质的释放与聚合物基质中的初始溶菌酶浓度呈线性相关。48小时后，溶菌酶从每种膜样本释放量的百分比，L20、L60和L100膜分别为大约65％、79％和76％。24小时后，溶菌酶从每种膜样本释放量的百分比，L20、L60和L100膜分别为大约48％、75％和71％。12小时后，溶菌酶从每种膜样本释放量的百分比，L20、L60和L100膜分别为大约43％、60％和56％。1小时后，溶菌酶从每种膜样本释放量的百分比，L20、L60和L100膜分别为大约14％、26％和25％。
在半潮湿食物中，微生物生长主要发生在食物表面上。因此，将食物表面上抗微生物剂的所需水平保持受控和延迟的扩散，对于延长食物的保存期是有益的。这些结果表明结合到壳聚糖膜中的溶菌酶能够以受控的方式从膜基质释放，并保持对细菌细胞壁底物的溶解活性。例如，在大约24小时后，多达大约30％的溶菌酶尚未从膜释放。在大约48小时后，多达大约20％的溶菌酶尚未从膜释放。
结果-抗微生物活性
图2A和2B显示了大肠杆菌和粪链球菌在用菌酶-壳聚糖膜处理的肉汤中的存活。溶菌酶-壳聚糖复合膜对大肠杆菌的抗微生物功效随着溶菌酶浓度的增加而增加，L100膜除外。在温育24小时后，在有L0、L20或L60膜的BHI肉汤中，细胞数量分别减少了大约1.8、2.3和2.7个对数级(log cycle)。同时，用L100膜和对照，细胞数量分别增加了大约0.1和2.3对数级。L100膜抑制生长最多6小时，然后细胞群恢复。
含有低浓度溶菌酶(L0和L20膜)的溶菌酶-壳聚糖复合膜没有有效抑制粪链球菌生长。对于L0和L20膜，在24小时暴露期间，粪链球菌菌群轻度增加。反之，在包含L60和L100膜的肉汤中，观察到粪链球菌的对数分别降低了3.3和3.8。在对照样品的24小时之后，出现大约1.1对数级的增加。对革兰氏阳性粪链球菌的抗微生物活性随着溶菌酶浓度的增加而增加，可能表示溶菌酶对于这种效应起主要作用。
壳聚糖对大肠杆菌的抗微生物活性已由Shahidi(1999)进行综述。纯壳聚糖膜(L0)显示出对革兰氏阴性的大肠杆菌的杀菌作用，但抑制革兰氏阳性粪链球菌生长的作用很少。在L60膜中观察到了对这两种细菌的最稳定的抑制趋势。L100膜恢复大肠杆菌菌群令人疑惑，可以通过溶菌酶-壳聚糖相互作用的增加来解释。从膜基质释放的壳聚糖分子可堆叠在细胞表面上，或与溶菌酶相互作用以形成溶菌酶-壳聚糖复合体。当过量的溶菌酶暴露于细胞悬液时，溶菌酶-壳聚糖相互作用的概率可能增加。这些相互作用的增加可能干扰壳聚糖与细胞表面之间的反应。
在含有最高溶菌酶浓度的壳聚糖膜(L100)中，展现出针对粪链球菌的最强抗微生物活性，而对于大肠杆菌则是带有60％溶菌酶浓度(w/w壳聚糖)的膜抗微生物活性最强。这些结果表明，通过将溶菌酶结合到壳聚糖膜基质中，能够增强壳聚糖的抗微生物活性。此外，溶菌酶与壳聚糖分子的比例是影响溶菌酶-壳聚糖复合膜的抗微生物性能的重要因素。
结果-透水汽性
膜的透水汽性(WVP)没有受到掺入试验浓度水平溶菌酶的显著影响(p<0.05)(见下表2)。虽然不受任何理论的局限，但该结果可以通过两个相反因素的作用来解释。壳聚糖膜和许多其它蛋白或多糖可食膜一样，由于它们的亲水性质，表现出相对低的防水性质。壳聚糖膜的防水性质能够通过加入疏水材料例如脂肪酸来改善。由于溶菌酶含有疏水氨基酸侧链。溶菌酶-壳聚糖复合膜的亲水性随着溶菌酶的加入而降低。但是，壳聚糖的紧凑结构，特别是其结晶部分，可能被溶菌酶分子破坏，导致透过膜基质的WVP增加。这两种相反的因素可以使带有不同溶菌酶浓度的溶菌酶-壳聚糖复合膜的WVP性质中的改变被抵消或最小化。
表2.溶菌酶-壳聚糖复合膜的透水汽性
Figure A200780041873D00211
1L0＝0％溶菌酶(w/w壳聚糖)；L20＝20％溶菌酶(w/w壳聚糖)；L60＝60％溶菌酶(w/w壳聚糖)；L100＝100％溶菌酶(w/w壳聚糖)
结果-机械性质
膜的拉伸强度(TS)和破裂时的延长百分比(EL)随着溶菌酶加入而明显降低(p>0.05)(见下表3)。随着溶菌酶浓度增加，TS和EL均降低，这能够通过下面的线性方程来描述：
TS＝-0.10·CI+16.70，R2＝0.96
EL＝-0.32·CI+59.89，R2＝0.99
其中CI是溶菌酶-壳聚糖膜基质中的溶菌酶浓度百分比(％，w/w壳聚糖)。此外，还发现EL和TS之间有线性关系：
EL＝3.07·TS+8.30，R2＝0.98。
在壳聚糖和溶菌酶比例1:1(L100)下，TS和EL值分别降低了43％和48％。但是，这种降低对于阻止使用该膜作为食物保护剂来说，还没有那么严重。
壳聚糖是带有刚性骨架结构的上好成膜线性聚合物，而溶菌酶是成膜能力较低的正电荷酶。TS和EL均降低表明掺入溶菌酶削弱了膜的结构和完整性。将溶菌酶分子导入壳聚糖膜基质可能破坏结晶结构形成和削弱壳聚糖分子之间的分子间氢键。膜基质中壳聚糖和溶菌酶分子之间的相互作用增加可能对溶菌酶-壳聚糖复合膜的TS和EL改变起作用。TS和EL值降低也可能归于溶菌酶对壳聚糖分子的降解，溶菌酶是几丁质水解酶。使用高度脱乙酰壳聚糖(例如，脱乙酰的程度至少大约95％)，能够减少溶菌酶对壳聚糖分子的降解。另外，溶菌酶-壳聚糖复合膜的机械性质和防水性可以通过在膜基质中使用交联剂例如戊二醛而加以改善。
表3.溶菌酶-壳聚糖复合膜的机械性质
Figure A200780041873D00231
1L0＝0％溶菌酶(w/w壳聚糖)；L20＝20％溶菌酶(w/w壳聚糖)；L60＝60％溶菌酶(w/w壳聚糖)；L100＝100％溶菌酶(w/w壳聚糖)
结果-微结构
壳聚糖与溶菌酶之间的出色生物相容性以及溶菌酶遍及壳聚糖基质的均匀分布被SEM显微照片所证实。图3A-3D显示了成膜期间，暴露于空气的溶菌酶-壳聚糖复合膜的外表面，放大倍数1000X。如SEM显微照片所示，膜的表面结构是紧凑和一致的。所有的膜具有均匀外观，表明是基质中没有任何孔或裂缝的连续结构。L60(3C)和L100(3D)膜的显微照片显示出膜表面上明亮的大理石样花纹。这种大理石样花纹分布均一并随着溶菌酶浓度的增加而增加。白色区域可能呈现溶菌酶微粒在壳聚糖基质中的沉积。
图4A-4D显示出溶菌酶-壳聚糖复合膜横截面的显微照片。锐缘是用液氮冷冻膜然后碎裂它们而产生的。如图4A-4D所示，壳聚糖和溶菌酶之间没有垂直的裂纹或相分离。横截面结构是紧凑而连续的，除了某些与表面平行的裂缝，这些裂缝可能是在膜碎裂时形成的。溶菌酶遍及膜基质的均一分布由具有高溶菌酶浓度的膜的均匀外观来指示(4C和4D)。L20膜(4B)的显微照片显示出可能是在干燥过程中落到膜上的外来材料。这种类型的污染可能是溶剂蒸发成膜方法的一个不利之处，尤其是如果膜在开放的空气环境中进行流延和干燥的话。
预示性实施例2
备选的成膜溶液可以通过在65℃下将2wt％壳聚糖溶解在1wt％乙酸溶液中并加入50wt％月桂酸、25wt％甘油和100wt％溶菌酶(w/w壳聚糖)而制备。然后按照实施例1中所述制备膜。向成膜溶液中加入脂肪酸(即月桂酸)，可以改善膜的防水性质且不会明显影响其抗微生物活性。
实施例3
涂层溶液通过将壳聚糖溶液与溶菌酶溶液混合而制备。壳聚糖溶液通过将3％壳聚糖溶解在1％乙酸溶液中并加入25％甘油(w/w壳聚糖)而制备。溶菌酶溶液通过将10％溶菌酶溶解在蒸馏水中并加入25％甘油(w/w溶菌酶)而制备。溶菌酶溶液混合到壳聚糖溶液中，达到60％的浓度(每干重壳聚糖的溶菌酶干重百分比)。产生的混合物用匀化器(PT 10-35，Kinematica，瑞士)以3,000rpm匀化60秒。单核细胞增生李斯特菌ATCC 15313和植物乳杆菌用作试验微生物，评价食物表面进行涂层处理的抗微生物功效。单核细胞增生李斯特氏菌和植物乳杆菌分别在脑心浸液(BHI)肉汤和MRS肉汤中37℃下生长过夜。
在无菌条件下，获得商业制造的牛肉肠(beeffranks)(Bun-Length，Oscar Mayer Foods Corp.，Madison，WI)并切成26mm长(约10g)。切片的牛肉肠浸在涂层溶液中30秒并在垂直空气层流台(100-plus，Envirco Corp.，Albuquerque，New Mexico)中干燥30分钟。将未涂层的对照和涂层的样品接种100μl单核细胞增生李斯特氏菌或植物乳杆菌(～2 x 103CFU/ml)，放入200mm x 150mm真空塑料袋(FoodSaver Rolls，Tilia，Inc.，San Francisco，CA)，并用热密封器(FoodSaver Vac 1075，Tilia，Inc.，San Francisco，CA)真空包装。
在22.5±1℃储存4天后，每个牛肉肠样品放在无菌Stomacher袋中。真空塑料袋用90ml0.1％蛋白胨水冲洗，并转移到同一个Stomacher袋中。样品用Stomacher型粉碎机(Stomacher 400 Circulator，Seward，London，UK)以230 RPM粉碎(macerated)2分钟。悬液双份计数微生物菌群。BHI琼脂和MRS琼脂分别用于单核细胞增生李斯特氏菌和植物乳杆菌。在对微生物集落数量进行计数之前，含有微生物培养基的塑料培养皿在37oC温育48小时。
涂层处理对接种到涂层或未涂层的牛肉肠表面上的单核细胞增生李斯特氏菌或植物乳杆菌生长的作用显示在表4中。溶菌酶-壳聚糖复合物涂层处理产生单核细胞增生李斯特氏菌在牛肉肠表面上的生长抑制。但是，在同样条件下，观察到植物乳杆菌细胞数量的轻度增长。
表4：涂层对接种了单核细胞增生李斯特氏菌或植物乳杆菌的牛肉肠上微生物生长的作用.
Figure A200780041873D00251
实施例4
商业制造的中等成熟的切达奶酪(cheddar cheese)(TillamookCounty Creamery Association，Tillamook，OR)用作另一个食物体系，用于证明应用溶菌酶-壳聚糖复合物涂层的抗微生物性质。奶酪块无菌切成60mm x 26mm x 5mm的尺寸(～10g)，并用实施例3所述的涂层溶液涂层。所有的步骤与实施例3一致。如表5所示，单核细胞增生李斯特氏菌和植物乳杆菌在奶酪切片表面上的生长均受到抑制。
表5.涂层对接种了单核细胞增生李斯特氏菌或植物乳杆菌的切片切达奶酪上微生物生长的作用.
实施例5
溶菌酶壳聚糖溶液按照实施例1中描述的方法制备，只是用2％壳聚糖代替3％壳聚糖。成膜溶液流延在平坦的特氟龙涂布的玻璃板上，面积为260mm x 260mm，并在环境条件下(22.5±1℃和40±5％相对湿度{RH})干燥2天。干燥的膜从板上取下，切成65 x 30mm尺寸的片。产生的膜厚度为85±9μm。膜片保存在设定为25℃和50％RH的环境室中(T10RS，Tenney Environmental，Williamsport，PA)2天。
切达奶酪(Tillamook County Creamery Association，Tillamook，OR)无菌切成尺寸为60mm x 26mm x 5mm的长方形，并接种100μl单核细胞增生李斯特氏菌或植物乳杆菌(～2 x 103CFU/ml)。每个接种的奶酪切片夹在两个同等处理的膜片之间。取来商业制造的牛肉肠(Bun-Length，Oscar Mayer Foods corp.，Madison，WI)并在无菌条件下切成26mm长(～10g)，真空包装在200mm x 150mm真空塑料袋中(FoodSaver Rolls，Tilia，Inc.，San Francisco，CA)。保存条件和微生物计数与实施例3描述的程序相同。
如表6所示，溶菌酶-壳聚糖复合膜减少奶酪表面上的微生物生长。植物乳杆菌比单核细胞增生李斯特氏菌对膜更敏感。膜处理显示出比奶酪表面实施例的涂层处理更强的抗微生物活性。
表6.膜的应用对接种了单核细胞增生李斯特氏菌或植物乳杆菌的切片切达奶酪上微生物生长的作用
Figure A200780041873D00271
实施例6
壳聚糖溶菌酶(CL)溶液通过采用与上面实施例3的描述相同的程序，将0或60％溶菌酶(固体重量)掺入到壳聚糖溶液而制备。商业马苏里拉奶酪(mozzarella cheese)切片(70 x 43 x 3mm)接种104CFU/g的单核细胞增生李斯特氏菌，然后用两种类型的CL膜包装：1)独立CL膜；2)与薄CL层层合的电晕处理膜(Saranex 15)。
至于形成独立膜，每种脱气成膜溶液(FFS)大约200ml流延在在平坦的特氟龙涂布的玻璃板上，面积为260mm x 260mm，并在垂直空气层流台(100-plus，Envirco Corp.，Albuquerque，NM)中干燥过夜。
为了制备壳聚糖或CL层合膜表面。将涂层溶液施加在多层的共挤出膜表面上(SaranexTM 15，3mil，获自Filcon，Clare，MI)，一侧施加电晕处理。SaranexTM 15是五层层合膜，具有低密度聚乙烯/乙烯-乙酸乙烯酯聚合物/聚氯乙烯聚合物/乙烯-乙酸乙烯酯聚合物/低密度聚乙烯的结构。大约50ml涂层溶液铺展到支撑膜上，面积为260mm x 260mm，并在垂直空气层流台中干燥过夜。
奶酪切片的一侧接种104CFU/g的单核细胞增生李斯特氏菌，并覆盖独立膜或薄CL层层合膜。然后该组件放入无菌stomacher袋(178mm x 305mm，VWR International，West Chester，PA)，用热密封器(FoodSaver Vac 1075，Tilia，Inc.，San Francisco，CA)真空包装，并保存在10℃。单核细胞增生李斯特氏菌在1、7和14天进行差分计数。微生物菌群的最大减少发生在保存的第一天，其中在用含有0或60％溶菌酶的独立CL膜包装的奶酪上，分别观察到大约0.63或1.26对数级的减少，如图5所示。在接下来的14天保存期间，这种减少水平没有明显改变(p>0.05)。CL层合膜具有与独立CL膜相似的抗微生物功效，如图6所示。该研究表明，使用CL复合物抗微生物处理对抗单核细胞增生李斯特氏菌的可能性。
参考几个实施例，对所公开的方法、膜和食品的原则进行了阐述和说明，显然，这些方法、膜和食品可以在细节上加以修改，同时不背离这样的原则。

Claims (18)

1.多层层合体膜结构，包括至少一层复合膜和至少一层另一种类型的膜，所述复合膜包含结合在壳聚糖聚合物基质内的溶菌酶。
2.权利要求1的多层层合体，其中所述另一种类型的膜选自聚烯烃聚合物、聚酰胺聚合物、聚酯聚合物或乙烯基聚合物。
3.权利要求1或2的多层层合体，其中另一种类型的膜邻接复合膜布置。
4.权利要求1-3任一项的多层层合体，其中壳聚糖的脱乙酰水平至少约70％。
5.权利要求1-4任一项的多层层合体，其中壳聚糖包括壳聚糖乙酸盐、壳聚糖山梨酸盐、壳聚糖丙酸盐、壳聚糖乳酸盐、壳聚糖谷氨酸盐、壳聚糖苯甲酸盐、壳聚糖柠檬酸盐、壳聚糖马来酸盐、壳聚糖乙醇酸盐、壳聚糖丙烯酸盐、壳聚糖琥珀酸盐、壳聚糖草酸盐、壳聚糖抗坏血酸盐、壳聚糖酒石酸盐，或其混合物。
6.权利要求1-5任一项的多层层合体，其中溶菌酶以抗微生物有效量存在。
7.权利要求1-5任一项的多层层合体，其中溶菌酶的量足以使得将复合膜施加于基体后大约24小时，高达大约30％的溶菌酶尚未从复合膜释放，并且在大约48小时后，高达大约20％的溶菌酶尚未从复合膜释放。
8.权利要求1-7任一项的多层层合体，其中以壳聚糖重量计，复合膜包含大约10到大约200重量％的溶菌酶。
9.膜的制造方法，包括：
将壳聚糖和溶菌酶溶解或分散在水性介质中，产生成膜溶液或分散液；
将成膜溶液或分散液施加于另一种类型的膜上；和
使成膜溶液或分散液转变成复合膜。
10.权利要求9的方法，其中壳聚糖溶解于水性有机酸中。
11.权利要求10的方法，其中水性有机酸选自乙酸、山梨酸、丙酸、乳酸、谷氨酸、苯甲酸、柠檬酸、马来酸、乙醇酸、丙烯酸、琥珀酸、草酸、抗坏血酸、酒石酸或其混合物。
12.权利要求9-11任一项的方法，其中溶菌酶溶于水产生溶菌酶溶液，然后溶菌酶溶液与壳聚糖溶液混合。
13.权利要求12的方法，其中溶菌酶溶液包括大约5到大约20重量％的溶菌酶。
14.权利要求9-13任一项的方法，其中所述另一种类型的膜选自聚烯烃聚合物、聚酰胺聚合物、聚酯聚合物或乙烯基聚合物。
15.食品，其包括在所述食品至少一部分表面上的抗微生物膜，其中抗微生物膜包含结合在壳聚糖聚合物基质内的溶菌酶，并且所述食品还包含与所述抗微生物膜相邻布置的至少一种其它膜。
16.权利要求15的食品，其中所述溶菌酶在抗微生物膜中的存在量，以壳聚糖重量计，为大约10到大约200重量％。
17.权利要求15或16的食品，其中所述另一种类型的膜选自聚烯烃聚合物、聚酰胺聚合物、聚酯聚合物或乙烯基聚合物。
18.权利要求15-17任一项的食品，其中壳聚糖包括壳聚糖乙酸盐、壳聚糖山梨酸盐、壳聚糖丙酸盐、壳聚糖乳酸盐、壳聚糖谷氨酸盐、壳聚糖苯甲酸盐、壳聚糖柠檬酸盐、壳聚糖马来酸盐、壳聚糖乙醇酸盐、壳聚糖丙烯酸盐、壳聚糖琥珀酸盐、壳聚糖草酸盐、壳聚糖抗坏血酸盐、壳聚糖酒石酸盐或其混合物。
CNA2007800418735A 2006-09-18 2007-09-17 溶菌酶-壳聚糖膜 Pending CN101535041A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11/523,112 2006-09-18
US11/523,112 US20070104836A1 (en) 2004-03-18 2006-09-18 Lysozyme-chitosan films

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101535041A true CN101535041A (zh) 2009-09-16

Family

ID=38885290

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2007800418735A Pending CN101535041A (zh) 2006-09-18 2007-09-17 溶菌酶-壳聚糖膜

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20070104836A1 (zh)
EP (1) EP2064054A1 (zh)
JP (1) JP2010504226A (zh)
CN (1) CN101535041A (zh)
AU (1) AU2007297725A1 (zh)
CA (1) CA2666996A1 (zh)
WO (1) WO2008036243A1 (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102119720A (zh) * 2010-12-31 2011-07-13 张胜勇 一种含萝卜双功能酶的果蔬保鲜剂
CN102217668A (zh) * 2011-06-24 2011-10-19 长沙理工大学 一种冷鲜鱼头的保鲜方法
CN107183148A (zh) * 2017-06-13 2017-09-22 邢夺伟 一种柿子干的制备方法
CN107484815A (zh) * 2017-08-24 2017-12-19 合肥市福来多食品有限公司 一种低盐咸鸭蛋的保鲜方法
CN110724303A (zh) * 2019-09-27 2020-01-24 扬州市华裕包装有限公司 一种多层复合膜及其制备方法
CN111011532A (zh) * 2019-12-25 2020-04-17 光明乳业股份有限公司 一种乳清奶酪及其超高压处理方法

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA103177C2 (ru) * 2007-10-12 2013-09-25 Дсм Іп Ассетс Б.В. Способ созревания сыра в фольге
KR100941800B1 (ko) * 2007-10-19 2010-02-10 배지현 쇠비름 추출물이 첨가된 항균 필름 조성물 및 이를 이용한 필름
WO2010094682A1 (en) * 2009-02-17 2010-08-26 Dsm Ip Assets B.V. Process for foil ripening of cheese
EP2451845B1 (en) * 2009-07-07 2017-03-01 Camlin Fine Sciences Limited Preservatives from chitin derivatives
US20110218472A1 (en) * 2010-03-02 2011-09-08 Iran Polymer And Petrochemical Institute (Ippi) Non drug based wound dressing polymer film and a method of producing the same
JP2015515451A (ja) 2012-03-05 2015-05-28 セラディス ベー．フェー． 殺生物剤強化用多価電解質複合体
US20160213051A1 (en) 2013-09-04 2016-07-28 Ceradis B.V. Processed edible product comprising a polyelectrolyte complex and an antimicrobial compound
CN107625990A (zh) * 2016-07-19 2018-01-26 黄青山 具有抗菌功能的复合材料及在制备婴幼儿纸尿裤中的应用
US11110645B2 (en) 2017-11-16 2021-09-07 Rlmb Group, Llc Method and systems for applying stretch films/plastic films at a controlled temperature
US20210368831A2 (en) * 2019-03-07 2021-12-02 Rlmb Group, Llc Systems and methods for appyling treatments for preservation of perishable goods
CN113045786B (zh) * 2021-04-02 2022-11-08 广西大学 多功能自契合膜及其快速定位成膜的方法和应用

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4946870A (en) * 1986-06-06 1990-08-07 Union Carbide Chemicals And Plastics Company Inc. Delivery systems for pharmaceutical or therapeutic actives
US5549919A (en) * 1988-06-09 1996-08-27 Kabushiki Kaisha Ueno Seiyaku Oyo Kenkyujo Preservation of foods by the combined action of a natural antimocrobial agent and separately packaged deoxidizing agent
US5744166A (en) * 1989-02-25 1998-04-28 Danbiosyst Uk Limited Drug delivery compositions
US4957908A (en) * 1990-01-08 1990-09-18 Olin Corporation Chitosan pyrithione as antimicrobial agent useful in personal care products
KR960016882A (ko) * 1994-11-01 1996-06-17 강재헌 치주염치료를 위한 서방출형 생분해성 제제
US6200619B1 (en) * 1996-06-17 2001-03-13 Fuji Oil Co., Ltd. Preserving agent and preserving method
US6667082B2 (en) * 1997-01-21 2003-12-23 Cryovac, Inc. Additive transfer film suitable for cook-in end use
US5993661A (en) * 1997-04-14 1999-11-30 The Research Foundation Of State University Of New York Macroporous or microporous filtration membrane, method of preparation and use
BR9912181A (pt) * 1998-06-05 2001-04-10 Biotechnology Res & Dev Revestimento biológico com um efeito protetor e curativo para o controle de apodrecimento pós-colheita
WO2001003511A1 (en) * 1999-07-13 2001-01-18 Ch20 Incorporated Method of coating food products and a coating composition
US6451365B1 (en) * 2000-07-14 2002-09-17 Rhodia Inc. Antibacterial composition for control of gram positive bacteria in food applications
KR100324164B1 (ko) * 2000-10-17 2002-02-16 김영준 키토산으로 조성된 층상 격막시트와 그 제조방법
KR100470753B1 (ko) * 2003-01-09 2005-03-10 주식회사 자광 수용성 천연필름과 그의 제조방법
CN1972602B (zh) * 2004-03-18 2011-06-22 俄勒冈州，由高等教育州委员会代表俄勒冈州立大学 溶菌酶-脱乙酰壳多糖膜
WO2005113236A2 (en) * 2004-05-12 2005-12-01 E.I. Dupont De Nemours And Company Films comprising a liquid-absorbant inner layer, an antimicrobial material and an impermeable outer layer

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102119720A (zh) * 2010-12-31 2011-07-13 张胜勇 一种含萝卜双功能酶的果蔬保鲜剂
CN102217668A (zh) * 2011-06-24 2011-10-19 长沙理工大学 一种冷鲜鱼头的保鲜方法
CN107183148A (zh) * 2017-06-13 2017-09-22 邢夺伟 一种柿子干的制备方法
CN107484815A (zh) * 2017-08-24 2017-12-19 合肥市福来多食品有限公司 一种低盐咸鸭蛋的保鲜方法
CN110724303A (zh) * 2019-09-27 2020-01-24 扬州市华裕包装有限公司 一种多层复合膜及其制备方法
CN110724303B (zh) * 2019-09-27 2022-04-08 扬州市华裕包装有限公司 一种多层复合膜及其制备方法
CN111011532A (zh) * 2019-12-25 2020-04-17 光明乳业股份有限公司 一种乳清奶酪及其超高压处理方法
CN111011532B (zh) * 2019-12-25 2022-08-05 光明乳业股份有限公司 一种乳清奶酪及其超高压处理方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2008036243A1 (en) 2008-03-27
JP2010504226A (ja) 2010-02-12
CA2666996A1 (en) 2008-03-27
EP2064054A1 (en) 2009-06-03
US20070104836A1 (en) 2007-05-10
AU2007297725A1 (en) 2008-03-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101535041A (zh) 溶菌酶-壳聚糖膜
Cooksey Effectiveness of antimicrobial food packaging materials
Lee et al. Wide‐spectrum antimicrobial packaging materials incorporating nisin and chitosan in the coating
Khalaf et al. Stability of antimicrobial activity of pullulan edible films incorporated with nanoparticles and essential oils and their impact on turkey deli meat quality
Zhao et al. Antimicrobial food packaging integrating polysaccharide-based substrates with green antimicrobial agents: A sustainable path
US7160580B2 (en) Organic acids incorporated edible antimicrobial films
Hafdani et al. A review on application of chitosan as a natural antimicrobial
CN1972602B (zh) 溶菌酶-脱乙酰壳多糖膜
Kristo et al. Thermal, mechanical and water vapor barrier properties of sodium caseinate films containing antimicrobials and their inhibitory action on Listeria monocytogenes
Duan et al. Antimicrobial chitosan‐lysozyme (CL) films and coatings for enhancing microbial safety of mozzarella cheese
Iseppi et al. Anti-listerial activity of a polymeric film coated with hybrid coatings doped with Enterocin 416K1 for use as bioactive food packaging
Woraprayote et al. Anti-listeria activity of poly (lactic acid)/sawdust particle biocomposite film impregnated with pediocin PA-1/AcH and its use in raw sliced pork
Guo et al. Antimicrobial polylactic acid packaging films against Listeria and Salmonella in culture medium and on ready-to-eat meat
Alak et al. Microbiological and chemical properties of bonito fish (Sarda sarda) fillets packaged with chitosan film, modified atmosphere and vacuum
Bagheripoor et al. Application of active edible coatings to improve the shelf-life of cheese
Wang et al. The effects of calcium propionate and cinnamaldehyde on the mechanical, physical and antimicrobial properties of composite films based on potato starch
Lee et al. Evaluation of the antimicrobial activity of sodium alginate films integrated with cinnamon essential oil and citric acid on sliced cooked ham
Duran et al. The use of chitosan as a coating material
Mauriello et al. Bacteriocins in plastics
Min et al. Edible coatings containing bioactive antimicrobial agents
Mustika et al. Nanocomposite coating based on chitosan and ZnO nanoparticles to maintain the storage quality of meatball
Zhang et al. Milk-derived antimicrobial peptides incorporated whey protein film as active coating to improve microbial stability of refrigerated soft cheese
Derelioğlu et al. Effect of chitosan combined coating on chicken and quail eggs for controlling Escherichia coli and Salmonella enteritidis
MORTAZAVIAN et al. Niloofar BAGHERIPOOR, Sadegh KHOSHGOZARAN-ABRAS 2, Sara SOHRABVANDI 3, Nasim KHORSHIDIAN 4
Yener Development of antimicrobial protective food coating materials from edible alginate films

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1137701

Country of ref document: HK

C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20090916

REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: WD

Ref document number: 1137701

Country of ref document: HK