CN101522909A - 热循环系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于以很高的速度和特异性进行PCR－特别是实时PCR－的系统。该系统采用含有液体组合物的加热块以在其与反应容器之间快速传递热量。该系统利用液态金属的反射性能以将来自PCR的信号反射至反应容器中及顶部外。通过这种方式，信号可被光学组件实时测量而无需将反应容器从加热块上移开。

Description

热循环系统

交叉引用

本申请要求06年5月17号提交的60/801178号、06年7月22日提交的60/832492号、06年12月6日提交的60/873084号以及06年12月6日提交的60/873172号美国临时申请的优先权，这些申请通过引用在此引入。

背景技术

1983年凯利·穆利斯(Kary Mullis)发明的PCR被誉为是20世纪最重要的科学发展之一。PCR技术通过极大地扩展鉴别和再生如DNA的遗传材料的能力而使分子生物学发生了革命性的变化。如今，PCR已经在医学以及生物研究实验室中常规地用于执行各种各样的任务，如遗传性疾病的检测、基因指纹的鉴定、传染性疾病的诊断、基因的克隆、亲子鉴定和DNA计算。该方法已经通过使用热稳定DNA聚合酶和通常称为“热循环仪”的机器而实现自动化。

常规的热循环仪存在着几个固有的局限。通常常规的热循环仪包含金属加热块以进行反应样品的热循环。由于热循环仪具有大的热质量且样品槽(sample vessel)的导热性较差，因此在所需温度水平进行循环效率较低。常规热循环仪的变温速度通常不够快，因而不可避免地导致靶序列的不希望的非特异性扩增。常规热循环仪不能达到最佳性能还由于缺乏热均匀性，这在本领域内得到广泛承认。此外，常规的实时热循环仪系统携带大而昂贵的光学检测元件。在6533255号美国专利中，Mitsuhashi等人公开了一种液态金属PCR热循环仪。

因此，仍然迫切需要替代的热循环仪的设计。理想的装置允许(a)快速而均匀地传递热量以产生核酸的更特异性的扩增反应；和/或(b)实时监测扩增反应的进程。本发明满足了这些要求并同时提供了相关的优势。

发明内容

一方面，本发明提供了一种进行PCR的方法，包括：a)在样品槽内进行PCR，并在样品槽中产生指示PCR进程的信号，其中基本上所有所述信号反射回所述样品槽中，其中基本上所有所述信号从所述样品槽的一个分立位置被检测到；及b)测量从样品槽的该分立位置发射的信号。在一实施方式中，该方法包括实时测量多个PCR循环的信号。在另一实施方式中，样品槽包括对信号透明的壁，且该壁的至少一部分浸入液体组合物中，该液体组合物反射基本上所有到达该液体组合物的信号。在另一实施方式中，所述液体组合物包括金属或金属合金。在另一实施方式中，信号由标记物或染料产生。在另一实施方式中，所述样品槽包括反射所述样品中的基本上所有所述信号的材料。在另一实施方式中，所述样品槽由金属制成。在另一实施方式中，所述样品槽包括反射材料。在另一实施方式中，所述样品槽通过容器座(receptacle)与所述液体组合物隔离。

另一方面，本发明提供了一种进行PCR的方法，包括：a)在以下条件下对反应混合物中的靶核苷酸序列进行PCR反应：i)引物延伸和双链解离之间以及引物退火和引物延伸之间的温度变化速率超过每秒钟10.5℃；ii)所述PCR在包含样品槽的加热块中进行，样品槽内的温度差异小于0.5℃；及b)实时监测靶核苷酸序列的扩增。在一实施方式中，所述加热块包含液体组合物。在另一实施方式中，所述进行PCR的方法进一步包括在所述加热块的两个或多个槽孔之间测量的温度差异小于0.5℃。在另一实施方式中，在所述加热块的两个或多个槽孔之间测量的所述温度差异是0.01℃。在另一实施方式中，所述加热块为交换块。在另一实施方式中，温度的变化速率通过以下方式实现：(1)将包含反应混合物的样品槽与具有至少0.1W/M·K的传热系数的液体组合物进行热接触；其中液体组合物的温度控制反应混合物的温度。在另一实施方式中，通过诱使液体组合物运动保持温度均匀性。

另一方面，本发明提供了一种进行PCR的方法，包括：在以高于每秒5℃的速度调节样品温度的热循环仪中进行PCR反应；其中所述的热循环仪的温度由液密密封的加热块内的液体组合物调节；其中所述液体组合物的传热系数至少为0.1W/M·K。在一实施方式中，所述热循环仪提供至少约每秒10℃的变温速度。在另一实施方式中，所述热循环仪提供至少约0.01℃到0.1℃的槽孔间的和样品的温度均匀性。在另一实施方式中，所述加热块具有在所述加热块的两个或多个槽孔之间测量的0.01℃的温度差异。在另一实施方式中，所述液体组合物包含于所述加热块内。在另一实施方式中，所述加热块为交换块。

另一方面，本发明提供一种进行PCR的方法，包括：在充分地调节样品温度以使得以至少为3的信号指数对扩增进行实时检测的热循环仪中进行PCR；其中所述的检测是通过非特异性核酸标记物实现的，其中所述热循环仪以每秒钟10℃以上的速度调节样品温度。

另一方面，本发明提供一种进行实时PCR的方法，包括：a)在反应混合物中引物延伸和双链解离之间及引物退火和引物延伸之间的温度变化速率为至少每秒5℃的条件下，在反应混合液中进行靶核苷酸序列的PCR反应，其中所述PCR反应在与具有至少0.1W/m·K的传热系数的液体组合物发生热接触的情况下进行；及b)对PCR进行实时监测。在一实施方式中，所述的监测包括：a)在样品槽内进行PCR反应，并在样品槽内产生指示PCR进程的信号，其中所述信号基本上是从一个分立位置从样品槽发射的；以及b)测量从样品槽的该分立位置发射的信号。在另一实施方式中，反应混合物中的所述升温速率为至少每秒40℃。在另一实施方式中，所述的温度变化是通过珀耳帖(Peltier)元件调节的。

另一方面，本发明提供一种进行实时PCR的方法，包括：a)使PCR反应混合物的温度在双链解离、引物退火和引物延伸的温度之间进行多个循环，其中各循环不超过5秒钟；其中所述温度由密封在热循环仪中的液体组合物调节；及b)在多个循环中实时监测样品槽内的PCR进程。在一实施方式中，权利要求28的方法在步骤(a)之前进一步包括：1)使包含PCR反应混合物的样品槽的封闭端与液体组合物形成热接触，该液体组合物在60℃以上为液体并具有至少为0.1W/m·K的传热系数，从而液体组合物的温度控制PCR反应混合物的温度。在另一实施方式中，所述液体组合物反射样品槽内基本上所有的光。在另一实施方式中，所述监测是通过测量从样品槽顶部或底部发射的信号进行的。在另一实施方式中，各循环不超过3秒。在另一实施方式中，所述样品槽包括反射表面。在另一实施方式中，所述样品槽进一步用盖体覆盖。在另一实施方式中，所述盖体能够从所述的液体组合物吸热或者被所述液体组合物冷却。

另一方面，本发明提供一种进行实时PCR的方法，包括提供包含与PCR样品槽发生热接触的液体组合物的热循环仪；其中所述液体组合物进行温度调节，从而调控样品槽内的反应温度，其中从所述样品槽中发射可检测的信号；及通过包含光发射器和光学检测器的光学组件检测所述信号。在一实施方式中，所述光学组件包括针状光电二极管CCD成像仪、CMOS成像仪、行扫描仪、光电二极管、光电晶体管、光电倍增器或雪崩光电二极管。在另一实施方式中，所述样品槽进一步用盖体覆盖。在另一实施方式中，所述盖体能够从所述的液体组合物吸热或者被所述液体组合物冷却。

另一方面，本发明提供一种仪器，该仪器包括：a)温度控制组件，包括包含液体组合物的容器，所述液体组合物在60℃以上为液体并具有至少0.1瓦特/米-克氏度(W/m·K)的传热系数，所述容器有至少一个孔穴，各孔穴适于容纳样品槽的封闭端，其中容纳在孔穴内的样品槽与液体组合物形成热接触，从而液体组合物的温度控制样品槽内液体样品的温度，且其中液体组合物能够反射样品槽内基本上所有的光；b)光学组件，能够从所述样品槽上的一个分立位置检测所述样品槽内的光；及c)控制组件，其控制液体组合物的温度和光学组件的运行。在一实施方式中，液体组合物包括镓、镓铟合金或包括镓、铟、铑、银、锌、锡或亚锡的合金。在另一实施方式中，所述温度控制器包括珀耳帖元件。在另一实施方式中，所述温度控制器包括与液体组合物热接触的电阻丝。在另一实施方式中，所述温度控制器包括使液体组合物的温度在适宜于PCR的双链解离、引物退火和引物延伸的温度之间循环的装置。在另一实施方式中，所述热循环仪还包括使液体组合物中的液流循环流动的装置。在另一实施方式中，所述光学组件包括光发射器和光学检测器。在另一实施方式中，该仪器还包括包含向样品槽内添加试剂的装置的样品制备站。在另一实施方式中，所述仪器进一步包括将样品槽移动到孔穴中的装置。在另一实施方式中，该仪器还包括控制热循环仪、光学组件以及样品制备站的数字计算机。

另一方面，本发明提供一种进行实时PCR的系统，包括：a)热循环仪，包含液体组合物及用于接合样品槽并使所述样品槽与组合物形成热接触的装置；及b)光学组件，包含将光导入接合的样品槽和检测从接合的样品槽发射的光的光发射器和光学检测器。在一实施方式中，所述液体组合物包括金属或金属合金。在另一实施方式中，所述液体组合物包括镓。在另一实施方式中，所述发射的信号来自所述样品槽的可移除的盖体。在另一实施方式中，所述液体组合物通过容器座与所述样品槽隔离。在另一实施方式中，所述容器座是透明或半透明的。在另一实施方式中，所述系统包含珀耳帖元件。在另一实施方式中，所述热循环仪进一步包括与风扇和搅拌棒操作连接的电动机。在另一实施方式中，所述风扇及搅拌棒与所述电动机同轴连接。在另一实施方式中，所述热循环仪进一步包含用于所述液体组合物的热调控的电阻丝。在另一实施方式中，所述液体组合物被密封在封闭的屏障内，其中所述屏障包括具有容器座的表面，所述样品槽置于该容器座中。在另一实施方式中，所述液体组合物直接与所述样品槽接触。在另一实施方式中，所述光学组件包括针状光电二极管、CCD成像仪、CMOS成像仪、行扫描仪、光电二极管、光电晶体管、光电倍增器或雪崩光电二极管。

另一方面，本发明提供一种仪器，该仪器包括a)散热器；b)加热元件，该加热元件与所述散热器热接触；c)屏障，包含具有顶面和底面的壁，其中底面密封在所述加热元件上，由此所述密封屏障和所述加热元件形成包含液体组合物的容器；d)第一片体，包含多个槽孔，其中该第一片体密封于屏障的顶面上，且槽孔延伸到所述容器中；e)第二片体，包含多个样品槽，样品槽各具有开口端，其中样品槽可移除地插入槽孔中；f)第三片体，包含多个突起，其中突起可移除地插入样品槽的开口端。在一实施方式中，所述液体组合物包括在60℃以上为液体且具有至少为0.1M/W/K的传热系数的金属。在另一实施方式中，所述液态金属的体积能够增加约0.1到6.0％。在另一实施方式中，所述升温能力超过每秒10.5℃。在另一实施方式中，e)中所述槽孔设置为易适性的(柔性的)，从而所述槽孔能够与f)中所述样品槽形成热或光学接触。在另一实施方式中，所述设置包括在所述槽孔中利用几何构型和/或可变形材料。在另一实施方式中，所述几何构型是多边形、椭圆形或者圆形。在另一实施方式中，所述槽孔浸入所述液体组合物达到初始水平。在另一实施方式中，所述突起延伸至所述初始水平以上、所述初始水平处或所述初始水平以下。在另一实施方式中，所述第三片体能够从所述液体组合物吸收热量或被所述液体组合物冷却。在另一实施方式中，所述第一片体的槽孔是透明和易适性的(柔性的)，且所述第二片体的样品槽是透明的，从而作用在所述槽孔上的增强的压力使所述容器中的所述液体与所述样品槽中的样品形成热和光学接触。在另一实施方式中，所述第三片体的突起是透明的。在另一实施方式中，所述屏障通过垫片分别与散热体和第一片体形成密封。在另一实施方式中，所述第一片体或第二片体具有反射表面。在另一实施方式中，所述屏障通过紧固器分别与散热体及第一片体形成密闭。在另一实施方式中，所述仪器还包含与所述加热元件接触的散热体。在另一实施方式中，所述加热元件为珀耳帖元件、线元件或其组合。在另一实施方式中，所述仪器进一步包括第二加热元件，所述屏障位于所述加热元件和所述第二加热元件之间。在另一实施方式中，所述多个槽孔包括4、8、16、32、48、96、196、384或1536个槽孔。在另一实施方式中，所述仪器进一步包含风扇和搅拌棒，其中任选地所述风扇和搅拌棒与单电动机操作连接。在另一实施方式中，所述仪器由电池提供动力。在另一实施方式中，所述风扇由与所述仪器操作连接的控制元件自动开启和关闭。在另一实施方式中，所述的仪器还包含金属散热体。在另一实施方式中，所述散热体包括铜。在另一实施方式中，所述加热元件配置用于梯度PCR。

另一方面，本发明提供连续流PCR系统，其包括：样品制备模块；热循环仪，其中所述热循环仪包含用以调节所述样品的温度的液体组合物；及光学组件，用于检测所述样品的发射信号。在一实施方式中，所述的系统还包含采样器和废液收集装置。

通过引用引入

在本说明书中提到的所有出版物和专利申请在这里通过引用引入，就象各单个出版物或专利申请特别地和单独地表明通过引用引入一样。

附图简要说明

本发明的新特征在所附的权利要求中特别列出。为了更好地理解本发明的特点及优势，请参考以下对采用了本发明的原理的说明性实施方式的详细描述以及如下附图：

图1图示了采用液体组合物交换加热块的热循环仪主体。(A)描绘了滑轨上的48孔“交换块”装置。该块滑出，加载样品槽孔板和样品槽孔板盖，然后滑入热循环仪主体中并关门。热循环仪主体可包括光学组件、电子控制器、风扇及任选的电源。(B)“交换块”滑入工作位置的热循环仪主体。

图2图示了包括48个样品槽孔的交换块实施方式。在此实施方式中，此交换块从上到下包括：用作48个透明盖体的单片体；产生48个样品槽孔的单片体；具有48个反应孔的单容器座片体，其形成液态金属容器的上盖；形成液态金属容器的壁的塑料壳体；形成液态金属容器底板的金属板；用于加热和冷却的珀耳帖装置；及为珀耳帖装置散热的金属散热器。

图3是交换块实施方式的分解图。在此实施方式中，交换块从上到下包括：用作48个透明顶盖的单片体；用作48个透明盖体的单片体；产生48个样品槽孔的单片体；具有48个反应孔的单容器座片体；橡胶或者塑料垫圈或环，其形成用来容纳液态金属的液封；形成液态金属容器的壁的塑料壳体；橡胶或者塑料垫圈或环，其形成用来容纳液态金属的液封；及任选的形成液态金属室底板的金属板；用来加热和冷却的珀耳帖装置；及为珀耳帖装置散热的金属散热器。

图4是交换块实施方式的第二视图。在此实施方式中，交换块从上到下包括：用作48个透明盖体的单片体；产生48个样品槽孔的单片体；具有48个反应孔的单容器座片体；橡胶或者塑料垫圈或环，其形成容纳液态金属的液封；形成液态金属容器的壁的塑料壳体；橡胶或者塑料垫圈或环，其形成容纳液态金属的液封；形成液态金属室的底板的金属板；用于加热和冷却的珀耳帖装置；及为珀耳帖装置散热的金属散热器。

图5是热循环仪部件的夹心实施方式的视图，热循环仪包括包含液态金属的加热块。(A)该视图显示出在两个珀耳帖装置(两个大的壁)和构建为方形塑料环(四个窄壁)的棕色塑料片之间形成了液态金属室。液态金属室包括用于毛细样品管的孔。而且，各个珀耳帖装置与散热器热耦合，散热器再与风扇连接。(B)夹置在珀耳帖装置之间的加热块中央部分的特写。(C)液态金属室包括用于毛细样品管的孔。毛细管滑进孔中，并直接浸入液态金属中以进行热循环。珀耳帖装置被置于液态金属储库的两侧，以允许快速地进行加热和冷却。

图6图示了检测由包括液态金属组合物的加热块中进行循环的样品槽发出的信号的实施方式。LED用来激发包含在样品槽中的样品，且任何产生的信号由针状光电二极管来检测。

图7图示了用HBV病毒特异性引物和病人血液样品进行的PCR扩增，其中PCR在Roche Lightcycler上进行。熔解曲线的阳性峰(绿色)说明HBV测试为阳性，但是阴性对照峰(棕色)也同样显著。

图8图示了用图7中使用的相同引物和样品进行的PCR扩增，其中PCR利用包括液态金属加热块的热循环仪进行。阳性峰(绿色)说明HBV测试为阳性，而阴性对照峰(棕色，粉红)比图7低很多，这说明HBV的检测结果更加精确。

图9图示了在包括液态金属加热块的热循环仪中进行的PCR的结果，其与由Roche Lightcycler获得的结果对比。用两个样品同时建立熔解曲线：一个为在Roche Lightcycler上进行PCR获得(绿色)，一个为在本发明的仪器上进行PCR获得(棕色)。Roche PCR在表示形成引物二聚体的温度下产生了额外的峰，这说明在Roche仪器中所进行的PCR不如在包括液态金属加热块的热循环仪中所进行的PCR精确。

图10图示了采用电阻丝加热液体组合物的液体组合物加热块的实施方式。顶视图显示，电阻丝被排列为提供均匀加热，其中靠近液体组合物室边缘处电阻丝以较高密度放置，而靠近中心部分，电阻丝以较低密度放置。这种安排补偿了在常规热循环仪设计中由于热损失引起的任何可能的边缘效应。如侧视图中所示，电阻丝被悬置于液体组合物中，而不是被靠置在底部，因此液态金属从所有侧面接触电阻丝，这使得达到最大的热传递均匀性。

图11图示了液体组合物加热块用于连续PCR装置的用途。多个样品连续地通过所述装置以检测一个或者多个特定的生物样本，例如病原体或者生物污染物。

图12图示了在不锈钢样品槽中进行PCR扩增的样品的熔解曲线，其与常规的玻璃毛细管对比。两个反应的熔解曲线几乎相同，说明扩增成功。(A)用金属样品槽在常规热循环仪中进行的PCR反应的结果。PCR反应进行40个循环，然后用SYBR绿检测PCR扩增子的产生。(B)用商购的样品槽在常规热循环仪中进行的PCR反应的结果。PCR反应进行40个循环，然后用SYBR绿检测PCR扩增子的产生。

图13图示了金属样品槽的制备方法。该方法通过在一个步骤中由拉制的金属原料切割和卷曲金属样品槽而快速、廉价地生产样品槽。凹槽用来防止样品槽壁被拉平。

具体实施方式

本发明提供了一种设备，其包括用于对包含反应混合物的样品槽进行温度循环的热循环仪、用来检测来自样品槽的信号的光学组件以及用于控制热循环仪和光学组件的运行的控制装置。在特定的实施方式中，热循环仪采用包含具有高导热性的液体组合物(例如液态金属或者导热流体)的加热块以快速地使样品槽的温度进行循环。使用液态金属具有两点主要优势：第一，金属具有高的导热性，因而提供快速的热传递；第二，液体使样品槽与导热材料之间形成更紧密的接触，因而提供更均一的热传递。因此，样品槽中的温度非常均匀。快速的变温速率和温度均匀性的组合减少了非特异性杂交并显著地提高了单个样品槽内以及位于同一加热块中的多个样品槽之间的PCR反应的扩增特异性(例如信噪比)。在另一实施方式中，样品槽(单独或者与热循环仪结合)通过样品槽的一个分立部分(例如，样品槽的顶部)发射出基本上所有其中产生的信号，从而发出的光可以被光学组件收集。在再另一实施方式中，光学检测器检测基本上所有从样品槽发射的光。在某些实施方式中，液态金属或者样品槽是高反射性的，并将透过透明样品槽的壁的光反射回样品槽中。通过这种方式，样品槽内产生的光信号的大部分从样品槽的一个分立部分发射，从而可以被光学组件收集。从反应中收集更多光的能力意味着可以在装置中选用较便宜的光学器件，因而降低了成本。而且，从样品槽的分立位置收集光使得在进行实时PCR时不需要从加热块移开样品槽。因此，该加热块的配置使得能够获得快的变温速度和均匀的温度，及光学组件能够从样品槽顶部收集反射光而不需要将样品槽从加热块移开，从而使得实时PCR更快地进行。相应地，本发明的仪器经特别设置以进行PCR(聚合酶链式反应)、反转录PCR和实时PCR。包括液态金属加热块的热循环仪将比市场上现有的仪器更加快速和经济地进行PCR反应。在一个实施方式中，包括包含液体组合物的加热块的热循环仪使用电池提供动力。在另一实施方式中，包括包含液体组合物的加热块的热循环仪使用直流或者交流电提供动力。

除了PCR加热块外，本发明的液态金属加热块还可以被广泛地应用于生物技术和化学领域，例子包括但不局限于酶反应的孵育，例如限制性内切酶、生化分析和聚合酶反应，细胞培养和转化，杂交，以及任何需要精确的温度控制的处理。基于本发明的公开内容，本领域的普通技术人员可以很容易地将液态金属技术应用于各种需要精确温度控制的生物/化学样品的分析。

热循环仪

利用液体组合物(例如液态金属或者导热流体)作为加热块的加热和冷却介质获得比固体金属加热块更均匀的热传递和更快速的加热和冷却循环。在液态金属加热块用于热循环仪的实施方式中，更快速的升温和更好的热均匀性使得DNA聚合酶产生比使用常规的热循环仪时更低的出错率(图7-9)。这是由于PCR样品处于非最理想温度下的时间减少了。另外，由于热均匀性的提高，在长扩增、SNP鉴定以及测序反应过程中出错率降低。

在一个实施方式中，液态金属或者导热流体被用作加热块的加热和冷却介质，其中加热块包括至少底和壁以容纳液态金属或者导热流体。液态金属或者导热流体在整个加热块上提供比常规加热块更均匀的温度，这是因为液态金属或者导热流体内的更快的热传递和利用对流或搅拌分配热量的能力。

在另一实施方式中，加热块包括与样品槽直接接触的液态金属或者导热流体。在这一实施方式中，可以实现与样品槽的全面接触，无论什么类型、尺寸、形状的样品槽都可得到均一的热传递。不需要预先成形的槽孔。而且，可以实现加热块中温度的均匀性，因为液态金属或者导热流体很容易通过对流或者通过外部力量在加热块内循环，这些外部力量包括但不局限于搅拌棒、泵、震动装置或者磁流体(MHD)动力。

在再另一实施方式中，液态金属或者导热流体完全容纳在加热块中而不接触样品槽。在这一实施方式中，容器具有设计为容纳具有希望的形状和尺寸的样品槽的容器座。这些容器座设计为紧密配合安置在槽孔中的样品槽。在一实施方式中，容器座使用使得透射到其中的光由液态金属反射回样品槽中的基本上透明的材料制成。在替代的实施方式中，容器座由使得将基本上所有进入的光或者在容器座槽孔内的样品槽中产生的光反射回所述样品槽中的反射材料制成。在另一实施方式中，容器座由既不透光也基本上不反射的不透明材料制成。

在一实施方式中，容器座用柔性材料制作，从而容器座的槽孔适于与样品槽紧密配合。随着加热块温度增高和液态金属或者导热流体体积膨胀，容器座槽孔与样品槽之间的接触紧密性增加。容器座可以由透明、不透明、亚透明或半透明的材料制成。

在开放式或者封闭式的实施方式中，加热块可以任选地包含液态金属或者导热流体的储存库，其可以是加热块的一部分，例如在加热块的底部或者侧壁上的凹陷或者凸出部，或者用连接器(比如管)与加热块相连的单独储存库。该储存库可以任选地通过泵连接到加热块上。依赖于其设计，储存库可以用作溢流道以在液态金属或者导热流体膨胀超出加热块的容量限制时收集任何溢出的液态金属或者导热流体，以保持或者改变密封的或者封闭的加热块的内压，或者用作在使用中损失的液态金属的储蓄库。

在一实施方式中，储存库在加热块的操作过程中被用来补充液态金属或者导热流体。含有额外的液态金属或导热流体的储存库可以在损失发生时提供补充。这种补充系统可以保持液态金属在理想的水平，或者在封闭的实施方式中保持液态金属或者导热流体在理想的压力。在一实施方式中，提供了用来电监测液态金属或者导热流体的水平并且在该水平过低时向操作者报警的检测系统。这种补充系统可以采取任何方便的形式，例如配备有用于移动液态金属或者导热流体的活塞或泵、操作该活塞或泵的控制器和传感器的侧部或者底部附属储存库。例如，传感器可以包括位于确定高度位置处的电线，其在液态金属达到需要的高度时与液态金属构成回路。在另一实施方式中，传感器可以包括光束，从而如果液体水平太低，光束在装有液态金属的空腔的顶上水平照射并且照亮传感器。在另一实施方式中，传感器包括两个光束，一个在另一个上面，低的光束表示低水平而高的光束表示高水平。信号可以被传到操作者或者控制装置以指示液态金属或者导热流体的水平。信号可以提示操作者应当采取矫正行动(通过提高或者降低液态金属或者导热流体的水平)。在另一实施方式中，控制系统自动调节液态金属或者导热流体的水平以达到理想的水平。在再另一实施方式中，液态金属或者导热流体加热块包括用户可以根据需要补充液态金属或者导热流体的用户可接触的腔室。在一实施方式中，用户可接触的腔室在底部与液态金属或者导热流体加热块室相连，并且可以从顶部填注。

交换块

在一实施方式中，热循环仪主体(101；151)包括风扇(103；153)及可移动的加热块组件，或交换块(105；155)(图1)。交换块(105；155)通过任选地在滑轨(113；163)上滑动交换加热块而插入到热循环仪主体(103；153)中或从中移出。当交换块(105；155)插入到热循环仪主体(103；153)中之后，热循环仪(115；165)的门可以关闭。交换加热块(105；155)包括液体组合物容器(111；161)和散热器(107；157)以及任选加盖的样品(109；159)。在一实施方式中，交换加热块(图2)包括带有对液体组合物密封的槽孔的容器座，从而样品槽不接触液体(金属、金属合金或金属浆)。在另一实施方式中，交换块(105；155)包括具有对液体组合物容器壳体(311；411)密封的槽孔的容器座屏障(307；407)，其中密封是液密的并且可以任选地包括垫圈(309；409)(图3和图4)。另外，液体组合物容器壳体(311；411)被密封到底板(313；413)上，底板可以是金属板(如铜或铝)，其中密封是液密的并且可以任选地包括垫圈(312；412)。底板(313；413)再与珀耳帖元件(315；415)热耦合，加热和冷却液体组合物并再与散热器(417)耦合。任选地，散热体(如铜、铝或其他具有高导热性的金属或金属合金)夹置在底板(313；413)和珀耳帖元件(315；415)之间。在一些实施方式中，交换块(105；155)由紧固件如螺钉(301；401)结合在一起。在一实施方式中，交换块包括第一片体，如具有48个槽孔的容器座(307；407)，该第一片体被第二片体(例如样品槽，包括但不限于样品板(305；405)、单样品槽或者样品槽带)占据，第三片体(如透明盖板(303；403)、单盖体或者盖体带)插入第二片体中。在一实施方式中，透明盖板(303；403)、单盖体或者盖体带任选地包括突起，如光导体。

在另一实施方式中，样品槽直接置于液体中。在再另一实施方式中，容器座具有起到橡皮刮板作用以擦干净从液体中移走的样品槽及任选地起到封闭作用以将液态金属密封在内部的环(例如，O形环)。在另一实施方式中，容器座提供将样品槽置于其中的套管(如由柔韧的塑料膜形成的套管)，换句话说，套管起到样品槽与液态金属或者导热流体之间的屏障的作用。

液体组合物(如液态金属或者导热流体)加热块在整个块上保持均匀的温度。在一实施方式中，这是通过被动力实现的，比如液态金属或导热流体的对流或者被动传导。在一替代的实施方式中，通过使用如搅拌棒的方法或者利用泵或MHD力的循环系统主动混合液态金属或者导热流体来增强温度的均匀性。

在一实施方式中，用泵来循环加热块中的液态金属或者导热流体。可以移动液态金属或者导热流体的任何泵的设计都是适合的，例如正排量泵(包括但不限于旋转型泵、往复型泵、罗茨型泵、注射泵、Wendelkolben泵或螺旋盘根泵(helical twisted roots pump))、离心泵、MHD泵或动力泵。在该实施方式中，泵将由能够耐受温度差异和/或与液态金属或导热流体相关的腐蚀问题的材料制成。

在另一实施方式中，泵被用来循环液体和/或使得液态金属或导热流体(例如，增加储存库室的压力)压迫容器座壁或样品壁，这取决于热循环仪的构造(例如，开放式或封闭式)。例如，在封闭系统中，增加压力造成了液体向容器座壁施加压力，因此造成此容器座壁更紧密地压靠在样品槽壁上，从而形成接合。这种接合增强了导热性和/或光透射率。在使用开放式系统的实施方式中(例如，样品槽直接与液体组合物接触)，泵可以提高液态金属或者导热流体的水平以增加其与容器座壁接触的表面面积。

在本发明的另一方面中，样品直接放入液体(金属、金属合金或金属浆)中，这种样品槽自然受到与排开的液体相等的浮力作用。在各种实施方式中，夹子、顶盖、紧固件、重物、弹簧卡、螺纹板或此类装置用来确保样品槽稳固定位。

在一替代的实施方式中，MHD力用于循环液态金属。液态金属暴露于在一个方向上形成的磁场和在垂直于磁场方向的方向上形成的电场中。然后液态金属沿同时垂直于磁场方向和电场方向的方向流动。通过同时使用磁场和电场，可以使液态金属按照指定的方向流动而不需要物理控制(例如通过泵进行控制)。这些场特性可以用于在加热块中引入液流从而维持均匀的温度，或者用于将液态金属引入加热块中和将液态金属从加热块中排出至例如储存库中。在相关的实施方式中，由直流电或交流电形成电场，随着对频率进行调节，液态金属相对于频率变化而发生振荡，因此在整个加热块上达到温度的高均一性。

在另一实施方式中，液态金属或者导热流体可以通过搅拌棒来循环，这个搅拌棒可以与电动机相连，或者可以是磁性响应的并响应于磁场的变化进行搅拌。在一实施方式中，搅拌棒是耐快速温度变化的，或者是涂有耐快速温度变化的覆盖层。在一实施方式中，搅拌棒是简单的横杆。在替代的实施方式中，搅拌棒可以是扇叶形的或者具有多个用于搅拌液态金属或者导热流体的突出体(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11或者12个)。在一实施方式中，热循环仪(101)包括与风扇(103)和搅拌棒操作连接的电动机。在另一实施方式中，风扇和搅拌棒与同一电动机同轴相连且任选地同时转动。

在再另一实施方式中，液态金属或者导热流体可以通过振动装置循环。振动装置可以被整合到热循环仪或加热块结构中，或者可以是与加热块或者热循环仪接触的附属装置。振动装置传递振动波通过液态金属或者导热流体，有助于其对流并缩短金属达到热均匀所耗费的时间。在一实施方式中，声学装置用来振动液态金属或导热流体，如压电混合器(piezo mixer)、超声振动器、亚音振动器或其他声学装置。振动器可以包括扬声器线圈或压电装置或机械电动机。振动装置也可以振动样品槽中的样品和PCR试剂，因此使反应物混合，从而使得反应更有效地发生。

液态金属或者导热流体在热循环仪运行过程中是可流动的，而且具有高于操作温度的沸点。此外，液态金属或者导热流体优选在操作环境下是无毒的。液态金属有高的热导率以及电导率，因此可能对加热和冷却模式/循环反应非常灵敏。对于聚合酶链式反应(PCR)，高的加热和冷却速度是优选的，而液态金属或者导热流体可以满足这一点。

夹心加热块

在本发明的另一方面中，热循环仪包括夹心式液体组合物加热块(图5)。在一实施方式中，夹心式加热块包括与珀耳帖加热和冷却元件(503；553；573)热耦合的液体组合物容器(501；551；571)，珀耳帖装置再与散热器(505；555；575)热耦合并任选地与侧面风扇(507；557)耦合。在这一实施方式中，液体组合物容器(501；551；571)包括用于样品槽(如毛细管(581))的开口(559；579)。在一个实施方式中，样品槽间接与液体组合物接触。在替代的实施方式中，样品与液体组合物之间由导热的可变形管物理隔离。在一实施方式中，散热器包括管或者散热片以增加散热器的辐射表面。在另一实施方式中，用于样品槽的开口(559；579)包括橡胶或者塑料O-型环，它用于在通过此开口放入液体组合物中的样品槽周围形成密封，及用于在样品槽移出加热块时擦除可能粘附在样品槽上的液体组合物。夹心式加热块实施方式可以包括用于至少一个样品槽的开口，如用于2、3、4、5、6、7、8、10、12、16、20、24、30、36、42、48、54、60、66、72、78、84、90、96、192或384个样品槽的开口。

在另一实施方式中，在两侧都形成孔以使得样品槽的顶部和底部都是可见的。在这样的实施方式中，液体被包裹在具有穿透的孔的塑料屏障中(例如多槽孔配置)以便样品槽安置于槽孔中。在此配置中，光电二极管和光学检测器可以被排列在给定槽孔的相对的两侧。这使得能够通过诱导光信号进入样品槽的一部分(例如顶部)并从块的另一侧(例如底部)检测任何发出的信号(反之亦然)而进行实时或定量PCR。

在一实施方式中，一个或者多个导热性塑料的毛细管(581)，例如由Cool Polymers公司(333 Strawberry Field Rd.，Warwick，RI02886 USA；http://www.coolpolymers.com)提供的毛细管，被插入到包括液态金属(501；551；571)的加热块中。在一实施方式中，毛细管(581)可以透过所述加热块的相对侧，这使管的顶部和底部都是光学可及的。在这个实施方式中，管(581)中的样品可以在一端被激发，并且由此产生的任何信号可以在另一端检测到。在一实施方式中，管(581)直接接触液态金属。在替代的实施方式中，管(581)被插入包括在加热块内的液态金属中的高导热性可变形管(例如塑料管)中。在这一实施方式中，将样品槽插入到高导热性可变形塑料管中是可能的。随后，液态金属可以采用泵加压，其中压力挤压导热性塑料管以使其与样品槽形成紧密接触。

连续流加热块

在替代的实施方式中，液态金属或导热流体加热块可用于连续PCR热循环仪。连续PCR热循环仪可以在希望高灵敏的或高通量的PCR的情况中使用。许多情况下，人们可能想要在灵敏PCR分析中对空气、血液、水或其它介质连续地采样。这可用来寻找包括流感病毒、细菌病原体及任何数量的病毒或细菌病原体的各种生物污染物。连续PCR使得PCR可以以自动的方式实施而不需要人工干预。连续采样的PCR系统还可以用作建筑物、飞机、公共汽车和其它运载工具的HVAC系统中的早期预警系统，且可用于监测血液、水和其它可能的污染源。

在一实施方式中，连续PCR系统从收集装置(如空气采样器、流体采样器或其它采样器)获得样品(1101)(图11)。在其它实施方式中，空调系统冷凝单元上收集的冷凝流体被用作初始样本，或使用通过直接碰撞工作的特制气体采样装置获得样本。样品被制备(1103)，而在某些实施方式中样品制备可能包括细胞裂解、DNA或RNA纯化、过滤和/或反转录。之后通过将样品加入到PCR试剂(例如至少一种DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液和盐)和引物(例如分析特异性引物或广泛适用于多种目标病原体的引物组)中准备用于PCR(1105)。这些引物可进行选择以选择性地扩增从特定病原体(如霉菌、病毒、细菌、寄生虫或变形虫)分离的DNA或cDNA、基因、其它所需的核酸或其任意组合。

然后PCR样品/试剂混合液(1107)经管路流至热循环单元(1109)。在某些实施方式中，所述管是清澈的或透明的。在另一实施方式中，管是不透明的。在一实施方式中，管是圆柱体。在另一实施方式中，管截面包括形成如三角形、正方形、矩形、五边形、六边形、七边形、八边形、九边形、十边形或其它多边形的形状的一个或多个平面。在一实施方式中，样品(1107)的体积使得其占据样品槽内一小段离散长度的空间，其它部分被空气、气体、或如矿物油的非反应液体占据。压缩气体或液体用于将样品推入热循环仪的加热块中。在一实施方式中，加热块是液态金属或导热流体加热块，其可以被各种各样的装置加热和冷却，包括但不限于热耦合的珀耳帖热电模块、常规热电模块、热空气或热光源。在一实施方式中，热循环仪采用管外部的珀耳帖热电模块按需要加热和冷却样品。

在所需要的热循环次数完成后，样本在管中被压缩空气或液体更进一步推进，从而退出热循环区域并进入检测区(1113)，在这里可进行荧光测量、吸光度测量或其它探查测量。在一实施方式中，除检测区是清澈的或基本上透明的以外，管是不透明的。在检测区中，光源(如相干光源，包括但不限于激光)用于激发PCR样品中的荧光染料(如嵌入染料，包括但不限于溴化乙锭或Syber绿染料和相关染料)，且激发光被光电检测器(如CCD、CMOS或者其它光学检测器)检测。检测电子装置(1115)确定从检测区域(1113)发出的信号。阳性的PCR测试将比阴性的PCR测试产生更大量的检测荧光。

接下来，样品在管中进一步推进，最终作为废物被废液收集装置(1117)收集。在一实施方式中，管仅用于单次使用，然后丢弃。在替代的实施方式中，管可以用来在多个样品中扩增和检测扩增产物是否存在。样品被以一定间隔加载，并用气体或者液体的屏障隔开以防止相互混合。样品在输送管路中隔开，从而使得各个样品能被单独地循环扩增和检测。在一实施方式中，样品按以下方式隔开：在一个样品进行热循环时，另一个样品正在检测区中接受检测。在另一实施方式中，多个管可以平行使用以增加样品通量。在又另一实施方式中，当扩增发生(阳性结果)从而表明目标序列存在时，系统可以警告用户。

梯度加热块

在替代的实施方式中，液态金属或导热流体加热块设计为可以在加热块的不同区域维持不同的温度，这使得位于不同区域的槽孔中的不同样品槽能以不同的温度同时进行循环，例如在梯度PCR过程中。在一实施方式中，液态金属或导热流体加热块能够在2个或更多的区域间保持温度梯度，如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个区域。在一实施方式中，加热块在各个温度区域中包括带有一个或者多个样品槽孔的容器座，如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个槽孔。在一实施方式中，在液态金属或导热流体加热块上可以实现超过0.1℃-20℃的温度梯度。

在一实施方式中，温度梯度在液态金属或导热流体加热块的单个维度(水平或垂直)上以线性方式变化。例如在包括具有48个槽孔的容器座(307；407)的加热块中，在块上有等距离间隔的8排，每排6孔。如果在加热块的顶部水平地形成8℃的温度梯度，各排样品槽孔将会有大概1℃的温度差异。

在某些实施方式中，加热块将包含内部隔板或隔热壁，其用来将不同区域的液态金属或导热流体与其它区域隔离。各个区域可进一步包括单独的热混合器(例如泵、搅拌棒或者MHD)或者整个加热块可以连接到单个热混合器(如MHD或者振动装置)上。此外，加热块的各个区域可以包括单独的加热和/或冷却元件，例如导热元件(线、管)、薄箔片型加热器、珀耳帖元件或冷却单元。

在替代的实施方式中，加热块可以包括多个加热和冷却装置，其中一些在所有液态金属或导热流体加热区全面地发挥功能，其中一些只作用在单一区域中。例如，加热块可以在块的整个长度和宽度上采用均匀加热，而使额外的加热和/或冷却装置邻接加热块的各个区域，这样的安排可以对各个区域中的液态金属或导热流体的温度及在所述区域中的相关样品槽的反应温度进行更精确的调节。

导热性

与固体金属加热块相比，包含液态金属或导热流体的液体组合物加热块在整个块上保持更均一的温度。固体加热块在整个块上和在样品间差异两方面显示了显著的温度差异(Schoder等，J.Clin.MicroBiol.2005，43，2724-2728)。常规固体金属热循环仪的加热设备中任何给定点的温度差异都大于液态金属或导热流体加热块。常规热循环仪观察到高达+/-3.3℃的温度差异，然而液态金属或导热流体加热块温度的最大差异也要比这低许多。在一实施方式中，加热块包括具有大于0.1瓦特/米-克氏度(W/m·K)的传热系数的液态金属，如0.25-85W/M·K之间，包括但不限于0.25W/M·K、0.5W/M·K、0.75W/M·K、1W/M·K、1.5W/M·K、2W/M·K、2.5W/M·K、3W/M·K、3.5W/M·K、4W/M·K、4.5W/M·K、5W/M·K、5.5W/M·K、6W/M·K、6.5W/M·K、7W/M·K、7.5W/M·K、8W/M·K、8.5W/M·K、9W/M·K、9.5W/M·K、10W/M·K、11W/M·K、12W/M·K、13W/M·K、14W/M·K、15W/M·K、16W/M·K、17W/M·K、18W/M·K、19W/M·K、20W/M·K、21W/M·K、22W/M·K、23W/M·K、24W/M·K、25W/M·K、26W/M·K、27W/M·K、28W/M·K、29W/M·K、30W/M·K、32W/M·K、35W/M·K、37W/M·K、40W/M·K、42W/M·K、45W/M·K、47W/M·K、50W/M·K、55W/M·K、60W/M·K、65W/M·K、70W/M·K、75W/M·K、80W/M·K、85W/M·K。

在一实施方式中，液态金属或者导热流体加热块是热循环仪的部件，其在整个加热块上具有充分的热均匀性，其中加热块中任何两个样品槽之间的温度具有不超过+/-0.6℃的差异，例如不超过+/-0.59℃、+/-0.58℃、+/-0.57℃、+/-0.56℃、+/-0.55℃、+/-0.54℃、+/-0.53℃、+/-0.52℃、+/-0.51℃、+/-0.5℃、+/-0.49℃、+/-0.48℃、+/-0.47℃、+/-0.46℃、+/-0.45℃、+/-0.44℃、+/-0.43℃、+/-0.42℃、+/-0.41℃、+/-0.4℃、+/-0.39℃、+/-0.38℃、+/-0.37℃、+/-0.36℃、+/-0.35℃、+/-0.34℃、+/-0.32℃、+/-0.31℃、+/-0.3℃、+/-0.29℃、+/-0.28℃、+/-0.27℃、+/-0.26℃、+/-0.25℃、+/-0.24℃、+/-0.23℃、+/-0.22℃、+/-0.21℃、+/-0.2℃、+/-0.19℃、+/-0.18℃、+/-0.17℃、+/-0.16℃、+/-0.15℃、0.14℃、+/-0.13℃、+/-0.12℃、+/-0.11℃、+/-0.1℃、+/-0.09℃、+/-0.08℃、+/-0.07℃、+/-0.06℃、+/-0.05℃、+/-0.04℃、+/-0.03℃、+/-0.02℃、+/-0.01℃、+/-0.009℃、+/-0.008℃、+/-0.007℃、+/-0.006℃、+/-0.005℃、+/-0.004℃、+/-0.003℃、+/-0.002℃或者+/-0.001℃。在另一实施方式中，液态金属或者导热流体加热块在加热块容器座中的任何两个槽孔之间具有基本均一的温度，距理想温度的差异不超过+/-0.6℃，例如不超过+/-0.59℃、+/-0.58℃、+/-0.57℃、+/-0.56℃、+/-0.55℃、+/-0.54℃、+/-0.53℃、+/-0.52℃、+/-0.51℃、+/-0.5℃、+/-0.49℃、+/-0.48℃、+/-0.47℃、+/-0.46℃、+/-0.45℃、+/-0.44℃、+/-0.43℃、+/-0.42℃、+/-0.41℃、+/-0.4℃、+/-0.39℃、+/-0.38℃、+/-0.37℃、+/-0.36℃、+/-0.35℃、+/-0.34℃、+/-0.32℃、+/-0.31℃、+/-0.3℃、+/-0.29℃、+/-0.28℃、+/-0.27℃、+/-0.26℃、+/-0.25℃、+/-0.24℃、+/-0.23℃、+/-0.22℃、+/-0.21℃、+/-0.2℃、+/-0.19℃、+/-0.18℃、+/-0.17℃、+/-0.16℃、+/-0.15℃、0.14℃、+/-0.13℃、+/-0.12℃、+/-0.11℃、+/-0.1℃、+/-0.09℃、+/-0.08℃、+/-0.07℃、+/-0.06℃、+/-0.05℃、+/-0.04℃、+/-0.03℃、+/-0.02℃、+/-0.01℃、+/-0.009℃、+/-0.008℃、+/-0.007℃、+/-0.006℃、+/-0.005℃、+/-0.004℃、+/-0.003℃、+/-0.002℃或者+/-0.001℃。在再另一实施方式中，液态金属或导热流体加热块中的样品槽在样品槽内具有均匀的温度，距理想温度的差异不超过+/-0.6℃，例如不超过+/-0.59℃、+/-0.58℃、+/-0.57℃、+/-0.56℃、+/-0.55℃、+/-0.54℃、+/-0.53℃、+/-0.52℃、+/-0.51℃、+/-0.5℃、+/-0.49℃、+/-0.48℃、+/-0.47℃、+/-0.46℃、+/-0.45℃、+/-0.44℃、+/-0.43℃、+/-0.42℃、+/-0.41℃、+/-0.4℃、+/-0.39℃、+/-0.38℃、+/-0.37℃、+/-0.36℃、+/-0.35℃、+/-0.34℃、+/-0.32℃、+/-0.31℃、+/-0.3℃、+/-0.29℃、+/-0.28℃、+/-0.27℃、+/-0.26℃、+/-0.25℃、+/-0.24℃、+/-0.23℃、+/-0.22℃、+/-0.21℃、+/-0.2℃、+/-0.19℃、+/-0.18℃、+/-0.17℃、+/-0.16℃、+/-0.15℃、0.14℃、+/-0.13℃、+/-0.12℃、+/-0.11℃、+/-0.1℃、+/-0.09℃、+/-0.08℃、+/-0.07℃、+/-0.06℃、+/-0.05℃、+/-0.04℃、+/-0.03℃、+/-0.02℃、+/-0.01℃、+/-0.009℃、+/-0.008℃、+/-0.007℃、+/-0.006℃、+/-0.005℃、+/-0.004℃、+/-0.003℃、+/-0.002℃或者+/-0.001℃。

在某些实施方式中，液态金属或导热流体加热块的温度均匀性通过在加热块中循环液态金属或导热流体进行调节。液态金属或导热流体的循环可以通过自然对流或强制对流产生，如包括但不限于搅拌棒、泵或者MHD动力的装置的介入、通过物质力或者用交流或直流电流的MHD力产生的振动等等。

在某些实施方式中，液态金属或导热流体加热块具有快于常规金属加热块的速率的变温速率或者可以以大大快于常规金属加热块的速率改变温度，如以至少每秒5-50.5℃的速率改变温度，包括但不限于至少每秒10-40℃的范围，更具体以至少每秒5℃、5.5℃、6℃、6.5℃、7℃、7.5℃、8℃、8.5℃、9℃、9.5℃、10℃、10.5℃、11℃、11.5℃、12℃、12.5℃、13℃、13.5℃、14℃、14.5℃、15℃、15.5℃、16℃、16.5℃、17℃、17.5℃、18℃、18.5℃、19℃、19.5℃、20℃、20.5℃、21℃、21.5℃、22℃、22.5℃、23℃、23.5℃、24℃、24.5℃、25℃、25.5℃、26℃、26.5℃、27℃、27.5℃、28℃、28.5℃、29℃、29.5℃、30℃、30.5℃、31℃、31.5℃、32℃、32.5℃、33℃、33.5℃、34℃、34.5℃、35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、38℃、38.5℃、39℃、39.5℃、40℃、40.5℃、41℃、41.5℃、42℃、43.5℃、44℃、44.5℃、45℃、45.5℃、46℃、46.5℃、47℃、47.5℃、48℃、48.5℃、49℃、49.5℃、50℃和50.5℃的速率改变温度。在相关的实施方式中，所述的液态金属或导热流体加热块可以以比常规金属加热块更快的速率改变温度，同时在整个加热块上和/或在所述加热块内的样品中保持均一的温度。在一实施方式中，液态金属加热块可以以至少每秒44℃的速度升高温度。在另一实施方式中，液态金属加热块可以以至少每秒17℃的速率降低温度。在一实施方式中，液态金属或者导热流体的温度用玻璃珠热敏电阻(Betatherm)来测量。在另一实施方式中，红外照相机用来测量液态金属或导热流体的温度、或者覆盖在加热块顶部的液密容器座的温度、或者样品槽的温度。在另一实施方式中，液态金属或导热流体的温度用外部探针测量。在再另一实施方式中，液态金属或导热流体的温度用玻璃珠热电偶测量。在另一实施方式中，至少一个样品槽的温度用探针测量。

在液态金属或导热流体加热块用于热循环仪中的某些实施方式中，可以比常规固体加热块热循环仪更快地进行一系列PCR循环。单个简单的PCR循环通常包括变性步骤、杂交步骤和延伸步骤，各步骤在特定的温度下进行。在某些实施方式中，一系列的30个PCR循环(PCR操作)可以在1-20分钟内完成，例如1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟。然而，PCR操作的时间长度不仅仅取决于热循环仪的速度和温度统一性。本领域的技术人员应该非常清楚，PCR操作的时间长度可能随着所需要的PCR产物的特性发生变化。

组合物

在进行PCR的温度下是液体的导热材料使得能够将任何形状的样品槽浸入温度控制材料中并保持良好的热接触以进行热传递。因此，组合物优选至少在引物退火和双链解离之间的温度范围内是液体。引物退火通常发生在55℃左右，但可高达约70℃或低至约45℃。双链解离通常发生在94℃左右，但是可根据如扩增子中鸟嘌呤-胞嘧啶碱基配对的长度和百分比(GC含量)的因素而使温度更低。因此，在一实施方式中，液体组合物的熔解温度(即从固态到液态的相变温度)不高于70℃。在替代的实施方式中，液体组合物的熔解温度不高于60℃。在替代的实施方式中，液体组合物的熔解温度不高于50℃。在再另一实施方式中，液体组合物的熔解温度不高于40℃。

各种各样的液态金属组合物可以被用于实施所要求的本发明。在一实施方式中，液态金属组合物可以是镓或者是含镓的组合物。一些组合物也可以包含铟、铜、铑、银、亚锡、铋、锡和/或锌。在一实施方式中，液态金属是从Coollaboratory(Http://coolaboratory.com)得到的。在一些实施方式中，液态金属可包含40-80％的镓和10-50％的铟。在一些实施方式中，液态金属合金可包含1-40％的铜、铑、银、亚锡、铋、锡、锌或其组合。在一些实施方式中，液态金属合金可包括约60％的镓/约25.0％的铟/约14.0％的锡/约1.0％的锌、约62％的镓/约22％的铟/约16.0％的锡、约75％的镓/约25％的铟、约95％的镓/约5％的铟或100％的镓。在另一实施方式中，组合物可包含与铟组合的60-99％的镓，如约75％的镓和约25％的铟。约75％的镓和约25％的铟的合金在约15.7℃成为液体并具有约2000℃的沸点。这样的合金在PCR热循环过程中处于液态状态，但是从不会达到足以发生汽化的高温。因此，即使在液态金属直接接触样品槽的实施方式中，也不会由于液态金属的汽化导致毒性的问题。

在另一实施方式中，本发明可使用有毒的液态金属，如水银、水银合金或伍德合金(Woods Metal)。包括约50％的铋、25％的铅、12.5％的锡、12.5％的镉的伍德合金具有较高的工作温度范围(70-350℃)。包括液态金属(如伍德合金)的加热块可以用来加热(boil)生物样品或者用于任何其他需要稳定高温加热块的实验室技术中。

在各种实施方式中，液体组合物是液态金属、液态金属合金或包含金属的浆料。液态金属的膨胀系数将根据设想用于本发明的热循环仪的液态金属、金属合金或浆料的精确组成发生改变。在各种实施方式中，液态金属、液态金属合金或金属浆料在PCR过程中比PCR开始之前体积膨胀大约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或者6.0％。

在一实施方式中，液态金属、液态金属合金或者包含金属的浆料设计为膨胀量足以压紧容器座和样品槽之间的接合，从而形成紧密接触，这种接触增强了导热性以及光透射率(例如光反射回样品槽中)。这种紧密的接触通过减少分隔容器座和样品槽的空气间隙增加了液态金属与样品槽之间的导热性。举例来说，镓呈现了相当均一的膨胀。

表1 镓膨胀

 

起始温度	结束温度	体积膨胀
			25℃	55℃	+1.08％
55℃	72℃	+0.61％
			72℃	95℃	+0.83％
25℃	95℃	+2.54％

在另一实施方式中，加热块包括作为导热流体的液体组合物。各种各样的导热流体可以被用于本发明中。术语导热流体包括具有适用于热循环仪的工作温度范围的蜡和油。换句话说，蜡和油应该有相对较低的熔解温度，范围在30-55℃，且在至少30-110℃范围的温度下保持它们的稳定性。多种多样的蜡和油适合用作导热流体，包括如碳水化合物和硅化合物及其混合物的化合物，但是不限于此。实例包括：硅油、羧基修饰硅油、矿物油、邻苯二甲酸二丁酯、聚二乙基硅氧烷、聚二甲硅氧烷、四烷氧基硅烷、硅烃(silahydrocarbons)、聚α-烯烃、环烷基油、加氢异构化油、石蜡油、疏松石蜡(parrafin wax)、石蜡(paraffin wax)、混合氮化硼的石蜡、二十三烷石蜡、聚有机硅氧烷、聚烯烃蜡、聚乙烯蜡或聚丙烯蜡及其混合物。此外，导热流体可包括用于改进其稳定性、粘度、膨胀系数、不透明度和/或反射率的添加剂。这种添加剂包括但不限于塑料、矿物水性流体、抗冻剂或金属。

反射率

在一实施方式中，液态金属或者导热流体用于反射基本上所有其接收的光。在另一实施方式中，液态金属或者导热流体是与能够激发样品槽中的荧光分子并检测信号的光学组件连接的热循环仪的加热块中的组分。样品槽可直接浸在加热块的液态金属或导热流体中，或通过导热性的容器座与液态金属或导热流体隔离。在包括容器座的实施方式中，容器座可由基本上透明的或反射的材料制成。在这些实施方式中，液态金属或导热流体或反射的样品槽表面可以反射回基本上所有其接收的光，然后这些光可以被光检测装置检测到，光检测装置包括但不限于CCD装置、CMOS装置、LED装置、PN光电二极管、针状光电二极管或光电池。此外，在使用透明容器座的实施方式中，透明样品槽可以使用与容器座相同的塑料构成，或者用具有与容器座类似的折射率的透明材料制成。

在一实施方式中，液态金属或导热流体的水平要高于样品槽中样品的水平。换句话说，当从侧面观察时，样品槽中的样品和PCR反应混合液的体积要低于液态金属或者导热流体的水平。因而液态金属或者导热流体将基本上反射任何进入样品槽或者在样品槽中产生的光。在一实施方式中，液态金属或者导热流体加热块是包括光学组件的实时循环仪中的部件，光学组件包括多通道检测仪器，如多个针状二极管。例如，该仪器可以包括专用于检测来自容器座的单个孔的光的多个单通道。在这一实施方式中，液态金属或导热流体起到基本阻止传输到第一样品槽中的或从中传出的光被与第二样品槽相关联的检测通道检测到的光学缓冲液的作用。

样品槽

术语“样品槽”包括各种形状和结构的反应容器。在一实施方式中，样品槽被用于容纳反应混合物，例如PCR反应混合物、反转录反应混合物、实时PCR反应混合物或者任何其他需要加热、冷却或者稳定均一温度的反应混合物。在一实施方式中，样品槽是圆形或者管形的容器。在替代的实施方式中，样品槽是卵形容器。在另一实施方式中，样品槽是矩形或方形的容器。任何前述的实施方式可以进一步采用锥形底、圆形底或平底。在再另一实施方式中，样品槽是毛细管，如透明玻璃毛细管或涂层毛细管，其中涂层(如金属)提高内反射率。在另外的实施方式中，样品槽是滑片，如载玻片。在另一实施方式中，样品槽在底部密封。在一实施方式中，样品槽被涂覆(至少在外部被涂覆)抗粘附涂层(如特氟隆或硅烷)以减少液体组合物(如液态金属或导热流体)的粘附。在另一实施方式中，样品槽被涂覆(至少在内部被涂覆)防止扩增子粘连到样品槽壁的材料(如含氟聚合物或BSA)。

在一实施方式中，样品槽被制成单个的容器并以单个的容器使用。在另一实施方式中，样品槽被联结在一起成为包括多个单样品槽的横向序列，如2、4、6、10、12、14或16个管。在再另一实施方式中，样品槽联结在一起以形成为经设计配合在热循环仪的加热块顶部中的样品槽片、板或盘，从而占据一部分或全部可用的反应孔。在一实施方式中，盘或片可包括至少6孔、12孔、24孔、36孔、48孔、54孔、60孔、66孔、72孔、78孔、84孔、90孔或96孔、144孔、192孔、384孔、768孔或者1536孔。

在一实施方式中，样品槽具有通过连接元件(如任选铰接的塑料条)连接到其开口端的盖体。在另一实施方式中，样品槽没有连接的盖体。在一实施方式中，样品槽被设计为容纳最大样品体积，如10ul、20ul、30ul、40ul、50ul、60ul、70ul、80ul、90ul、100ul、200ul、250ul、500ul、750ul、1000ul、1500ul、2000ul、5ml或者10ml。

在一些实施方式中，实时聚合酶链式反应(PCR)在由根据光学清晰度和已知的与反应物的不反应性而选择的材料(例如玻璃或者塑料)制成的样品槽中进行。在一实施方式中，样品槽设计为使得光可以从样品槽的顶部进入或者离开样品槽的顶部，样品槽的顶部可以由能够透射光的盖体覆盖。在另一实施方式中，样品槽设计为使得光可以通过样品槽的底部进入或者离开样品槽。在一实施方式中，样品槽由能够透射光的透明或者半透明材料制成。在一实施方式中，样品槽设计为使得光被引导通过单独表面离开，比如顶部或者底部。

在其他的实施方式中，样品槽由基本上内部反射的材料，例如反射性的塑料、镀膜玻璃塑料(如用金属或者其他反射物质)、镀膜玻璃(如用金属或者其他反射物质)、掺杂玻璃(通过加入增加玻璃反射率的分子制造)或金属(包括但不限于不锈钢、铬或其他基本上非反应的金属)制成。金属具有高强度，使得可以有比玻璃或塑料薄得多的侧壁。这降低了反应物与外部的热/冷源之间的热障，使得有更好的热控制、更高的空间温度均匀性和更迅速的温度变化，所有这些都可以产生更快、更有效的聚合酶链式反应。在表面荧光用来监测实时荧光的实施方式中，内部金属表面的高反射率有助于荧光的收集。在一实施方式中，金属样品槽的内部是抛光的或电化学抛光的。

在一实施方式中，金属样品槽由更大的圆柱形或长方形的原料制成。首先，这个原料被拉制成理想的直径。或者可以使用注射器生产的标准方法生产。生产出来的连续管(如矩形或圆柱管)必须同时被剪切和密封以产生具有所需长度的片段，如1cM、2cM、3cM、4cM、5cM、6cM、7cM、8cM、9cM、10cM或其间的任何长度。在一实施方式中，密封端的直径不超过管本身的直径。在这一实施方式中，管随后被剪切和密封：管(1301)可以通过凹槽(1303)被送入金属块(1305)内(图13)。在一实施方式中，凹槽的宽度非常接近于金属管的外径大小。当管(1301)超出金属块(1305)时，切割刀片(1307)与金属块齐平、垂直于凹槽降低其刀刃。在一实施方式中，刀片(1307)成形为具有锥形刀刃(1309)。在另一实施方式中，刀片(1307)成形为具有同时切割和卷曲关闭金属管的末端的刀刃，且凹槽壁防止密封端拉平，从而迫使它的直径保持接近于管的直径。卷曲后，样品管可能需要进一步密封。在一实施方式中，这可以利用小的熔接或铜焊或锡焊完成。在另一实施方式中，可以通过使用金属塞而避免使用切割和卷曲。如果必要的话，最后的密封端可进行研磨以减小直径和消除粗糙边缘。

在替代的实施方式中，金属样品槽可以被拉制到需要的直径并剪切到需要的长度。然后各片段的一端被压入具有与管本身相似的直径的半球形杯中。这一动作可以修圆并卷曲封闭金属管。在相关的实施方式中，插销被插入金属管的开放顶部以利于将管的密封端冲压入接收杯中。该管可卷曲密封以产生出适合于PCR的具有一封闭端和一开放端的样品槽。

样品槽盖体

样品槽的顶部一般希望被覆盖以防止在PCR热循环过程中的蒸发。这可以通过在样品槽的顶部形成一层非反应性液体(如矿物油)层、密封样品槽(如通过热封毛细管)或通过用盖体封闭样品槽来实现。

在一实施方式中使用了盖体。盖体可以用任何合适的材料(如玻璃或塑料)制成，使得与样品槽形成密封而起到蒸汽屏障的作用。在一实施方式中，盖体是塑料盖体。盖体可以是不透明的、半透明的或基本上透明的。在一实施方式中，盖体是光学透明的，并且适用于包括液态金属或导热流体加热块的热循环仪和光学组件。在另一实施方式中，盖体部分地或者全部涂覆有不透明涂层。在再另一实施方式中，盖体部分地或者全部涂覆有反射性涂层，例如反射镜涂层。

从样品槽或者从包含有用激发波长充能时发荧光的材料的容器中提取光可能是很难完成的，尤其当加热块遮蔽该容器时。用透明的材料(如塑料或玻璃)制成的并且任选地包括光导装置的样品槽盖体(303；403)可以(通过透镜、滤波器、分束器，如图3)光耦合到光源(如光发射器)和检测器，其中光导装置的存在增加了传导到检测器的光的量。光发射器可以是相干源(如激光器)或非相干源(如LED)。

此外，本发明的一个示范性实施方式的优势是由样品槽中的标记物/染料样品发射的光基于液态金属或导热流体、液态金属合金或金属浆的反射选择性被反射回样品槽中。在进一步的实施方式中，反射量通过在样品槽和容器座槽孔之间形成更好的接触(例如，利用体积膨胀形成紧密的接合，或者通过使用泵来增加包含液体的腔室内部的压力从而液体在容器座槽孔的壁上施加额外的压力以与样品槽形成紧密接合)得到进一步提高。

在另一实施方式中，通过利用本发明的特制样品槽可以实现类似的光反射效果，其中样品槽是由不透明成分(例如不锈钢)组成或者(内部/外部)涂覆有反射性的不透明膜(例如铝)。在一实施方式中，样品槽是反射镜涂层的。在样品槽包括金属的实施方式中，金属可以进行抛光或电化学抛光以增加其反射率。

在任一情况下，在各种实施方式中，本发明的盖体器具是由光学透明的材料组成，其特点具有低的自身荧光或无自身荧光，并且与样品槽形成良好密封。此外，在某些实施方式中，盖体形成突出一定长度到样品槽中的突起(例如光导装置)。可以被用于组成盖体的材料的例子包括但不限于丙烯酸树脂、聚碳酸酯、聚苯乙烯、苯乙烯嵌段共聚物(SBCs)、苯乙烯丙烯腈(SAN)、ABS、聚砜、热塑性聚酯(如PET)、聚丙烯、丙烯酸苯乙烯共聚物(SMMA)、聚氯乙烯、尼龙、纤维素树脂、环烯烃共聚物(COC)、烯丙基二甘醇碳酸酯(ADC)、环烯烃(如TOPAS、ZEONOR和ZEONEX)及其混合物。

在各种实施方式中，盖体和/或突起可以是包括但不限于多边形、椭圆形、圆形、方形、矩形、三角形的几何形状，或任何可通过注塑(如本领域已知的)获得的形状。此外，可以认识到，样品槽以及容器座壁也可以为任何需要的形状。在一实施方式中，盖体、样品槽和容器座是相同的几何形状。在进一步的实施方式中，几何形状是矩形。在一实施方式中，几何形状基于盖体、样品槽和容器座壁各使用的材料来选择，以增强样品槽壁和容器座壁之间的接触，并且提供最佳的到样品槽外的光传递。在再进一步实施方式中，样品槽壁和容器座壁的折射系数相等或者几乎相等。

在一实施方式中，盖体和盖突起是由相同的材料组成。在一实施方式中，盖体、盖突起、样品槽和容器座各由相同的材料或者不同的材料组成，这些材料在此公开。

在一些实施方式中，盖体突起突出到样品槽中液态金属或导热流体、液态金属合金或液态金属浆(统称为“液体”)所在的水平(如线)以上、该水平处或者该水平以下的一个水平。

在一实施方式中，光将由突起传送到样品槽中，并且所获得的由样品槽中的标记物/染料样品发射的信号由突起帮助传送；该光从盖体的基本上分立的部分发射出来，在此处被光电检测器(例如光电二极管(如图6))检测到。

在一实施方式中，盖体尖端低于液态金属或者导热流体的液面水平。如果从侧面观察，盖体尖端很明显地低于样品槽所在的液态金属或者导热流体的水平，从而其收集基本上所有的光。这是用于样品槽直接浸在液态金属或导热流体中的实施方式以及样品槽置于容器座槽孔中的实施方式的情况。

盖体的形状和表面质量可以设计为使得从盖体到液体的光耦合最大化。在另一实施方式中，盖体可以用光纤束或通过自由空间方案照射。自由空间系统可以包括耦合透镜和/或分束器。光学系统可同时激发发荧光液体和检测荧光。

在一实施方式中，塑料盖体可以通过铸造塑料或者注塑制造。

在一实施方式中，盖体很容易地吸收从热循环仪/液体发射的热量，因此盖体加热到降低或消除冷凝的温度。通常，使用现有技术的PCR方法，样品槽的上部区域/盖体将比样品槽的下部有更低的温度，因此，反应液体将冷凝到较冷的表面上从而导致反应的化学性质的变化(例如，浓度的变化导致低效的反应或者错误的结果)。在另一实施方式中，样品槽设计为使得样品槽在流体液面下伸展得足够远，从而样品槽的顶部入口足够远离样品/混合液的表面以防止冷凝。在再另一实施方式中，顶盖或者盖体上的向下压力迫使样品槽与容器座形成更紧密的接触，这可以延迟蒸发。

加热和冷却组合物的装置

液态金属或者导热流体加热块可以通过使用本领域技术人员已知的各种技术来加热和冷却。在一实施方式中，加热块的加热元件选自珀耳帖装置、电阻加热器和辐射加热器。在一实施方式中，加热块冷却元件选自珀耳帖装置、散热器、制冷器、蒸发冷却器、热管、热泵以及相变材料。在一实施方式中，加热元件可以通过将管延伸到加热块中而提供。管可配备泵送热或冷的流体的泵。在一些替代的实施方式中，液态金属或导热流体加热块可以配备加热和/或冷却线圈，或配备防止边缘效应的电阻加热器。在另一实施方式中，液态金属或导热流体加热块可热耦合到珀耳帖效应热电装置。

在一实施方式中，加热块设计为使液态金属或导热流体在整个块上维持均一的温度。

多区域加热装置

在一实施方式中，液态金属或导热流体加热块热耦合到加热元件，如多区域加热和偏置冷却系统。在一实施方式中，偏置冷却系统通过附着在加热块的底部或者侧面的偏置冷却通道提供小的恒定的冷却的冷却剂流。这导致了加热块的恒定的小的热损失，由多区域加热器补偿这种热损失。加热器与用于孵育片段的样品块热耦合，其中样品块的温度保持在稳定的值。由偏置冷却系统导致的恒定的小的热损失使得控制系统能够以小的增量进行温度上升或者下降的比例控制。这意味着可由温度控制系统进行可控的、可预见的、小比率的加热和冷却以矫正加热块的温度错误。多区域加热器可由CPU进行控制。

在一实施方式中，加热元件是由一个或多个线元件如加热线圈组成的(图10)。这种线元件排列为提供最佳的加热并减少或消除边缘效应。举例来说，线元件被排列在加热块的周边。此外，在使用多个线元件的情况下，它们等距排列，或者从内部到外围以增加/减少的距离梯度排列以提供最佳的加热并减少或消除边缘效应。在一实施方式中，线元件以棋盘模式排列在块的底部。在替代的实施方式中，线元件以同心圆或者椭圆排列在加热块的底部。在另一实施方式中，线元件沿着加热块的底部和侧面排列。在再另一实施方式中，线元件以使得液态金属围绕线元件的所有侧面流动的形式排列，例如悬挂、堆叠或包括一个以上的棋盘层的三维排列。在再另一实施方式中，线元件在更接近加热块的边缘部分比在加热块的内部位置更接近(如可变间距)，以抵消加热块的外边缘以比内部更快的冷却速度冷却的倾向(图10)。在本领域中已知，边缘效应导致温度均匀性的不一致，通常是在加热单元的外周部分。

在一实施方式中，冷却剂控制系统通过经输入和输出管与加热块相连的偏置冷却通道不断循环冷却的液体冷却剂(例如汽车防冻液和水的混合物)。冷却剂控制系统还控制加热块中通过更高容量的匀变冷却液流途径的液流。匀变冷却通道用于通过以相对高的流速泵送大体积的冷却的液体冷却剂流经加热块来快速地改变加热块的温度。

在一实施方式中，用于冷却加热块的液体冷却剂主要由水和乙二醇混合物组成。液体冷却液是通过容纳液体冷却剂的热交换器来冷却的，其通过输入管从样品块提取热量。热交换器通过输入管从制冷单元接收压缩液体制冷剂(如氟利昂或乙醇)。这一制冷单元一般包括压缩机、风扇和翅管热辐射器。制冷单元压缩从热交换器中接收的制冷剂。加热的制冷剂在翅管冷凝器中被冷却并冷凝成液体。制冷剂的压力通过流量限制器毛细管在翅管冷凝器中保持高于其蒸气压。该毛细管的输出与换交热器的输入相耦合。在热交换器中，制冷剂的压力允许降低到其蒸气压以下，使得其膨胀。在此膨胀的过程中，从在热交换器中循环的升温的液体冷却剂吸收热量，且该热量传递给制冷剂从而造成制冷剂的沸腾。升温的制冷剂然后从热交换器中排出并压缩，且再次通过翅管冷凝器循环。风扇通过翅管冷凝器吹入空气，导致来自管的制冷剂中的热量与周围的空气进行交换。在一实施方式中，制冷过程在30℃时能从液体冷却剂中提取至少400瓦的热量，在10℃时能从液体冷却剂中提取至少100瓦的热量，以支持快速的温度循环。

在一实施方式，偏置冷却可以取消，或者由其他装置提供，如通过使用冷却风扇和在样品块金属中形成的冷却翅片、珀耳帖接合或者常循环水(如蒸馏水或自来水)。

珀耳帖效应热电装置

珀耳帖装置或元件，也被称为热电(TE)模块，是具有热泵功能的小的固态装置。典型的珀耳帖单元为几毫米厚和几毫米到几厘米平方。它是由两个陶瓷板和其间的小型碲化铋(Bi₂Te₃)立方体的阵列形成的夹心结构。当施加直流电时，热量从装置的一侧转移到另一侧，在此热量可以通过散热器除去。“冷”侧可用于冷却电子装置，如微处理器或光电检测器。如果电流反转，装置就改变热量移动的方向。珀耳帖装置没有移动部件，无需制冷剂，不产生噪音或振动，体积小，寿命长，而且能够实现精确的温度控制。可以通过使用温度传感器反馈(如热敏电阻或固态传感器)和闭环控制电路进行温度控制，该控制可基于通用可编程计算机。

在替代的实施方式中，热循环仪包括与加热元件(其为珀耳帖元件)热耦合的液态金属或导热流体加热块，以在液态金属或导热流体加热块中获得理想的温度分布(在规定时间段内的温度曲线)(图1-4)。在此实施方式中，取决于需要获得的温度，珀耳帖元件在一温度分布内被用作冷却或加热的元件。

在另一实施方式中，热循环仪可进一步包括组合使用的电阻加热器和珀耳帖元件，以在液态金属或导热流体加热块中获得所需要的温度变化速度和所需要的温度分布的精确性以及一致性。

在一实施方式中，热循环仪包含至少一个珀耳帖元件，其形成为用于包括液体组合物的加热块的温度循环变化的热循环仪部件。珀耳帖元件的至少一个传热表面与液态金属、加热块板或散热体形成大面积的热接触，且其他传热表面与用于散热的冷却元件形成大面积的接触。冷却元件可以是金属，例如铝或铜。热循环仪可进一步包括用于散热的风扇，其任选地是可开关的。在替代的实施方式中，液态金属或导热流体加热块与珀耳帖元件结合形成分立的单元(交换块)，其可以从热循环仪主体中移开。交换块可进一步包括与珀耳帖元件耦合的散热器和/或风扇。这种交换块可从热循环仪中拆除以进行修理或用具有不同功能元件的交换块替换，如容器座设计为容纳与先前的交换块不同大小和形状的样品槽。进一步地随着技术的进步，可以升级交换块而无需购买全新的热循环仪。

在另一实施方式中，包括液体组合物的加热块与彼此邻近地定位在所述加热块的第一侧上的多个珀耳帖元件热耦合。在替代的实施方式中，包括液体组合物(501；551；571)的加热块与多个珀耳帖装置(503；553；573)热耦合，其中至少一个珀耳帖装置位于所述储存库的第一侧上，且至少第二珀耳帖装置位于所述储存库的第二侧上。在一实施方式中，至少有一个从商业来源(如Marlow Industrries或者Nextreme Thermal Solutions)得到的珀耳帖装置与包括液体化合物的加热块热耦合(Nextreme Thermal Solutions；3040 Cornwallis Road，P.O.Box 13981，Research Triangle Park，NC 27709-39810)。

在一实施方式中，通过按压珀耳帖元件并保持珀耳帖元件与加热块相靠的中心弹簧固定装置而使珀耳帖元件避免热力学机械张力峰值的影响。珀耳帖元件可弹性地夹置在加热块的传热表面和冷却元件之间。冷却元件的接触表面可以通过例如压力弹簧或者相似的装置压靠在珀耳帖元件上。在一实施方式中，弹簧的张力可以通过螺丝、弹簧垫圈和球窝接头调节，其可更进一步提高冷却元件的自由度。

在替代的实施方式中，珀耳帖元件专门用作制冷(除热)元件。这就是说，其仅用于冷却加热器单元。这将延长珀耳帖元件的使用寿命。

在另一实施方式中，热循环仪可整合定位于加热块周围和沿加热块外壁的周边定位的电阻加热器。在这一实施方式中，珀耳帖元件可以仅用于冷却。这使珀耳帖元件减轻了机械热力的影响，从而有助于延长热循环仪中的珀耳帖元件的使用寿命。

顶盖

在一些实施方式中，液态金属或导热流体加热块是任选地包括塞(如铰接顶盖)的热循环仪的一部分。在各种实施方式中，塞子可以通过各种装置(例如，夹子、弹簧、螺丝等)固定在块上。在一实施方式中，塞子包含用于固定定位在液态金属或导热流体加热块的容器座中的密封样品槽的封闭和挤压装置。在替代的实施方式中，当塞子关闭时密封样品槽。塞子可具有弹簧保持压板，其以一定的力量将各样品槽压入液态金属或导热流体加热块的容器座槽孔中。塞子可进一步包括用于将盖体状的顶盖保持在样品槽中的凹部和/或用于与样品槽同轴的压板中的移液针穿透的开口。弹簧元件可以包括波形垫圈。在一实施方式中，安全环防止在铰接顶盖打开时压板掉落。

在另一实施方式中，塞子包括加热元件。在一替代的实施方式中，热循环仪的塞子整合了能够对光进行检测的检测机构。该塞子可进一步包括加热元件。对于一些分析，如PCR，使容器座升温到受控温度是必要的。在高温下，样品槽的内容物倾向于以更高的速率蒸发。为了减少蒸发和因此造成材料从容器座损失，容器座可以用被加热到高于容器座包含的样品槽中的样品的温度的覆盖物盖上。在一实施方式中，覆盖物的温度加热到至少比样品槽的温度高5℃。

在一实施方式中，加热的顶盖包括具有用于盖住容器座顶部的大小的覆盖物。盖子可能有至少两个刚性的、由耐热材料(如陶瓷、玻璃或硅橡胶)制成的薄板。夹置在两板之间的是电阻加热元件，在一实施方式中其可以是小直径镍铬丝的形式或通过在所述板的一个板上沉积电阻材料(如镍铬合金或氧化亚锡)形成。例如，具有12欧姆每英尺电阻率的36号镍铬丝可以用于向覆盖物提供足够热量。该加热元件可以在整个板区域上配置成蛇形线形式，以在整个覆盖物上提供均一的加热。如环氧树脂的填充材料可用来固定板和填充板之间的空隙。

在相关的实施方式中，加热元件连接到可变电源上，它可被控制以提供加热覆盖物到理想的温度的电流。电源和加热元件之间的引线可以是柔性的且配置为避免引线中的应力，从而覆盖物可以不受限制地移动，例如，在自动实验工作站中通过机器人装置移动。在覆盖物上可以提供温度传感器以测量其温度并提供控制电源以获得理想的温度的反馈。

在替代的实施方式中，设想对于样品槽的温度低于周围环境温度的情况，可能理想的是冷却覆盖物的温度低于周围环境但高于物质蒸汽的温度。这是为了保持覆盖物和物质之间的最小温度差异，从而覆盖物的温度不会影响到容器座中物质的受控温度。

光学组件

在本发明的各个方面中，本发明的装置配置为提供测量包括反应(如，实时PCR)的样品槽内的可测标记物的装置。本发明的装置的各个实施方式与检测光学部件完全相容，因而可完成快速核酸扩增/检测。本发明的热循环仪通过在PCR或相关过程中提供均一的温度、快速的变温和增加的信号反射率，能够使扩增、检测以及测量更加精确。由此，一个优势是本发明的热循环仪可与价格经济的光学组件一起使用，且仍获得同样精确或更精确的实时测量。因此，本发明的热循环仪能够利用便宜的光学部件以及常规的光学组件实现快速、精确和可靠的DNA扩增及检测。

光学测量装置在本领域内是已知的。一般来说，测量光学部件包括光源，例如其由发光二极管形成。光源射向测量区域(样品槽/管)。且该光源受控于可与包含用于控制光测量的电脑可执行程序的计算机操作连接的评价控制电路。测量光学部件还包括可从整个测量区域接收光的检测器。该检测器与评价电路/计算机相连。

可用于本发明的各种实施方式的光学组件包括含有CCD成像仪、CMOS成像仪、行扫描仪、至少一个光电二极管、至少一个光电晶体管、至少一个光电倍增器、至少一个雪崩光电二极管、微型激光器或Q-开关激光器的组件。在各种实施方式中，根据待检测的来自样品管的信号的不同，读出装置可以是反射、透射、表面荧光/荧光、化学-生物发光、磁性或电流分析读出器(或者两个或多个的组合)、针状二极管或本领域中已知的其它读出装置。

在各种实施方式中，可以耦合到本发明的光学组件中的光源包括发光二极管、激光二极管、VCSEL、VECSEL、DPSS激光器或者可随后与光源(如大的激光器系统、激光二极管或灯)耦合的光纤连接。在另一实施方式中，所述二极管为激光二极管。激光二极管可被用于照明，光电二极管检测器具有极佳的灵敏度，且大多数材料在相关的光谱区域内具有最小的自身荧光。可以使用任何常规的LED或光电二极管，例如，从Pacific Silicon Sensors(5700 Corsa Avenue，WestlakeVillage CA，91362)得到的针状光电二极管。

在本发明的各种实施方式中，光学组件配置为提供如365/460、470/510、530/555、585/610、625/660、680/712nm的波长的激发(光源)/发射(检测器)。此外，在某些实施方式中，使用+-5-20nm的各种滤波窗长。各种荧光滤波器组可从市场上购得(如，Omega Filters；Omega Optical，Inc或INTORR)，包括用于单一或多标记荧光的染料特异性滤波器。

在某些实施方式中，光学组件配置有具有表1中提供的规格的光源：

图6提供了光学组件的一个实例，其中针状光电二极管为光学检测器。例如，用于检测荧光的光学组件包括提供通过激发滤波器605的光的光源603，该光由分色反射镜/反光镜611指引，通过将光束聚焦至样品槽内的物镜609而进入样品槽中。同一透镜收集由样品成分(如，SYBR绿或Cy5；这里公开的嵌入染料)产生的荧光，该发射光通过二向性滤光器611并借助于阻挡滤波器613、聚焦透镜615引导到检测器模块针状光电二极管617中。输出被数字化并显示为电子图形、或者显示在纸上或被记录619。此外，表面荧光的使用可具有额外的优势，即不受大小的限制，这样，数值孔径非球面或球型的透镜可用做收集光学部件。

在进一步的实施方式中，可以设置额外的激发滤波器以用于增加光谱调整。在一实施方式中，光源是Cree XLamp，且光学检测器为T5或T18针状二极管。

在一实施方式中，光学组件通过样品槽的同一部分(例如盖体)发射和检测光。在另一实施方式中，光学组件光源从样品槽的一个部分发射光(如到PCR反应物中)，而从样品槽的另一部分检测光发射(例如，光源在底部而检测器在顶部，反之亦然)。

在一实施方式中，读出装置是检测荧光信号的LED读出装置。荧光信号由在光谱区域内并在信号(例如荧光标记)的吸收峰内发射的发光二极管激发。所发射的荧光信号由光电二极管检测。此外，检测信号的波长可以使用阻断杂散发射光并透射具有荧光发射标记的峰值发射波长或其以上波长的光的宽带滤波器进行限制。在其它实施方式中，宽带滤波器可由带通滤波器代替。此外，激发光可以通过带通滤波器进行限制。

在某些实施方式中，激发光源及检测器被安装在单个机械装置(如热循环仪主体)上，模制成块(如图1-2所示)，以简化样品管内产生的荧光信号的读取。

例如，Cy5为常用的具有非常高的消光系数的发红光荧光体。此类荧光体的常见形式包括其N-羟基琥珀酰亚胺酯或相关染料Cy5.5。这些染料为吲哚二碳菁类染料，通常被用于流式细胞计和自动荧光测序仪，并且可自Amersham(Pittsburg，Pa.)得到。Cy5可作为直接、自动整合到寡核苷酸中的amidites商购得到。在一实施方式中，采用本发明的装置处理用Cy5标记的样品。例如，在选择仪器使用的光学元件时，在光谱的红/红外区域工作是有利的。

另一例子中，PCR扩增的实时测量可以利用SYBR绿。但是，应该指出的是，在某些实施方式中，本领域内已知的以及此处公开的各种标记物/染料中的任何一种都可以按照需要用于本发明的热循环仪装置(例如，荧光绿，量子点等)。

在本发明的各种实施方式中，包括本发明的循环仪的系统还包括光电检测器的集合，其中各检测器提供输出信号。该系统还包括至少一个光源。光源的位置使所发射的光穿过保持在样品槽的多孔板(305；405)或带中或者相反由样品槽的多孔板(305；405)或带提供的相应的槽孔，并传送至相应的光电检测器或光电检测器的集合。该系统还包括处理器或其他用于分析从多个检测器输出的信号的装置。在替代的实施方式中，本发明的装置不需要使用昂贵的荧光染料或染料标志物，其需要系统上的大型集成光源和检测光学部件。例如，集成的实时PCR系统可能花费90000美元(Applied Biosystems ABIPRISM.RTM，7700序列检测系统)，与此相比非实时PCR检测系统(GeneAmp 9700)花费7500美元。两个系统都进行96孔板的PCR扩增，但GeneAmp 9700需要单独的分光光度计或荧光孔板阅读器进行DNA浓度测量。

由于LED或激光二极管的足迹非常小，具有不同波长的多个LED或激光器可以整合到单个包装中，或者几个成组的LED/激光器可以非常靠近地分隔放置以激发一个孔/样品管。

在一些实施方式中，LED实际上代表数个具有不同波长但间隔非常近的LED。因此，在进一步的实施方式中，检测器也进行类似配置。

在一些实施方式中，用于本发明的光学配置的光源可以是LED或激光二极管。其他光源也可以使用。此外，用于与各槽孔相关的光源的数目可以变化。在使用本发明的装置的一个非限制的例子中，LED被启动以发射第一波长或第一组波长的光，该光激发样品中的染料或标记物以发射信号。该信号被合适的检测器检测到，然后或者同时第二LED管被启动，其发射具有与第一LED不同的波长或波长组的光。该光激发样品中的不同染料或标记物，以发射被合适的检测器检测的信号。第二LED关闭，然后或同时第三LED被启动。第三LED发射具有与第一和第二LED不同的波长或波长组的光。该光激发样品中的不同染料或标记物，其发射被合适的检测器检测的信号。这些测量非常迅速地进行并由计算机处理，产生显示。紧密间隔的光源的集合可配置为如上所述顺序地发射光。

在其它实施方式中，不同的光源配置在光学组件中，并应用光学检测器独立地检测，其中检测是在同一时间进行的。

在一实施方式中，本发明的装置配置有光源和检测器的阵列。可以理解，光源阵列包括多个被安置在适当的基底或安装构件上并按特定的模式排列的光源，通常是网格式。槽孔阵列包括多个样品槽孔(图1，2)，也支持和定位在合适的保持基板上或其中。光电检测器阵列包括类似地安装和排列的多个光电检测器，以接收由样品槽(305；405)的阵列发射的光，例如通过样品槽的盖体(303；403)(图3)。

在一些实施方式中，包括多个独立的光源(具有相同或多个不同的波长)的轨道系统(rail system)可以以多行的排列方式与相应数目的检测器一起配置在一列样品之上。例如，光源和相应的检测器的数目可以是可能具有多个波长的8个独立光源，被分别能够检测激发样品发射的多个波长的8个不同的检测器装置所检测。因此，该轨道系统可进行操作以来回移动探查的样品槽的连续列。如上所述可以使用各种商用滤波器。在一实施方式中，检测器包括通过注塑便宜地制造的光学部件。

在一些实施方式中，可使用高功率LED。也可以使用雪崩光电二极管，例如碳化硅、氮化镓、砷化镓或者硅或蓝色增强硅光电二极管。雪崩光电二极管的灵敏度远远高于简单光电二极管，因为信号被雪崩过程放大了。雪崩光电二极管具有在10至10000之间的典型的增益，这意味着信号被放大了10到10000倍。使用象锁定放大器的改进的测量技术也可以扩大测量的动态范围。

在一实施方式中，PCR系统利用光源，特别是LED用于这种光的发射，提供了新的可能性以及应用。在一实施方式中，LED光源预期为基于氮化镓的紫外线LED。在另一实施方式中，光源是cree xlamp750毫瓦超亮LED。

在一实施方式中，使用单波长发射。不需要额外的光栅或滤波器或复杂的光学部件去选择所需的波长或进行光聚焦。这大大简化了实验装置，并降低了组件的成本。另一个优势是LED的成本较低。半导体LED可大规模生产，且制造成本极低。目前基于GaN的紫色、蓝色和绿色LED每个包装装置的成本为10至50美分左右，且未来大规模生产的基于GaN的LED的价格预计在类似的范围内。多波长LED可以整合为混合LED芯片，或可以开发出特殊的LED，其发射可在两个或多个波长之间切换。

再另一优势涉及LED的高输出功率。输出功率水平在10mW范围内的LED在不久的将来即可实现。此外，LED的典型足迹是200um×200um，这意味着光强度可以集中到较小区域并减少了需要用来使光集中的额外的光学器件(例如透镜)的量。这对于每板具有大量槽孔(48、96、384或1536孔)并相应地具有较小的槽孔的高通量PCR系统来说是相当大的优势。即使具有48、96或384个槽孔，槽孔尺寸仍然大到足以在槽孔板的单个槽孔区域中配合数个LED。

此外，另一优势涉及LED的阵列。多个LED也可排列成一维或二维的LED阵列。这样使得能够同时在多个槽孔中进行荧光测量。大量的平行处理明显减少了测量时间并提高处理量。这可能是PCR系统操作中的重要的成本/时间因素，特别是在倾向于更高密度槽孔的趋势下。

此外，LED的另一个优点是这些光源可以是脉冲的。为了避免DNA分子的褪色或加热，LED发光二极管可产生短而强的脉冲。LED可在很短的时间尺度上(约1纳秒至100纳秒)开关，这取决于LED的设计、大小和封装。LED的脉冲也可以利用通常的锁定技术而与光电检测器读数同步，以获得更好的信号噪声比和较高的灵敏度范围。此外，LED在获得稳定的光输出之前不需要任何预热时间。这与在稳定运行前至少需要几分钟的预热时间的氘和氙气灯相反。

使用LED发光光源的再另一优势是这类元件的相对长的使用寿命。可以相信LED的运行寿命可长达10000小时或更长。使用这种光源在大多数系统中可避免更换LED。

在一实施方式中，提供了运用荧光检测进行聚合酶链式反应分析的方法。该方法包括：提供包括多孔板、热循环仪、提供输出信号的光电检测器、定位为使光通过多孔板体并到达光电检测器的至少一个光源和用于分析光电检测器的输出信号的装置的系统。该方法还包括获得要进行聚合酶链式反应分析的样品。此外，该方法包括将样品安置在多孔板中。且该方法包括在样品中进行聚合酶链式反应。该方法还包括从光源发射光以使得光穿过样品到达光电检测器。且该方法包括分析光电检测器的输出以确定发射的荧光的吸收率和指示聚合酶链式反应的信息。

在另一实施方式中，在热循环仪中进行PCR后，对样品发射的荧光进行粗检测，该热循环仪包括包含液体组合物的加热块。在一实施方式中，粗检测不定量扩增产物或扩增子的量，而是只检测是否存在所述扩增产物。粗检测可以用便宜的光学部件或检测器进行，需要很少或不需要滤波器和/或塑料透镜。在一实施方式中，仅使用光电二极管或LED检测器。在另一实施方式中，用无滤波器系统检测荧光，如时间分辨荧光(TRF)。一方面，光源(LED或激光二极管)被关闭，而荧光分子在短的但可测量的时间内继续发光，这些发射的光可以进行测量而不是必须过滤掉LED/激光器的光。

在再另一实施方式中，检测系统采用基于FRET的探针。在一实施方式中，检测系统能够几乎同时检测两种不同的波长。利用FRET探针，两个荧光团定位在探针上。包括探针的样品用单激发光源激发。该光源具有激发第一个荧光团的波长，第一个荧光团发光，其中大部分光被邻近的第二荧光团吸收。第二荧光团以不同于第一荧光团的波长发光。随后这两个信号均被检测。

依照此示例性实施方式的再另一方面，提供了进行聚合酶链式反应分析的方法。该方法是基于应用如下所述的光。该方法包括：提供包括以下部件的系统：(i)用以保持多个样品的多孔板，(ii)热循环仪，(iii)提供输出信号的光电检测器，(iv)多个光源，其位置能够使发射的光穿过多孔板到达光电检测器，以及(v)用于通过检测紫外光而分析光电检测器的输出信号的装置。该方法还包括获得要进行聚合酶链式反应分析的样品。此外，该方法还包括将样品安置在多孔板中。该方法还包括在样品中进行聚合酶链式反应。该方法还包括从多个光源发射光以使得光穿过样品到达光电检测器。该方法还包括分析光电检测器的输出信号。

在各种实施方式中，LED的开/关时间通常是在几纳秒或几十纳秒左右。在其它实施方式中，激光二极管甚至更快，具有亚纳秒的切换时间。

在替代的实施方式中，提供了不需要使用荧光团和其它相关的检测光源以及光学部件的PCR系统和相关分析和技术。例如，LED可包含260纳米和280纳米的LED。为进行吸光度测量，首先开启260纳米的LED，且通过光电检测器检测在260纳米吸收的光。关闭260纳米的LED，然后打开280纳米的LED且通过光电检测器检测在280纳米吸收的光。这些测量可以非常迅速地一个接一个地进行，因为它们不需要样品进行任何物理运动。LED可以非常快速地开启和关闭。因此，在一个替代的实施方式中，光学装置可以省去许多实时PCR系统中采用的荧光引物和Taqman探针的费用。

在一实施方式中，发射260nm和280波长的光的便宜的紫外LED阵列组合到具有与液体介质(如液态金属或热流体)(直接/间接)热接触的槽孔板形式的PCR系统中。发射器和检测器的阵列具有可能与热循环仪的液体组合物加热块中的样品槽的排列一致的配置。例如，类似于图3中的样品槽(305，405)。因此，多个紫外发光单元，如LED相对于多个槽孔定位(图1)，从而从各个LED发射的光穿越相应的槽孔(及其中包含的样品)，并被相应的感光器或光电检测器接收。可以使用光学滤波器，或者置于光电检测器的输入端，或者置于LED/激光器的输出端，或同时置于前述两处以抑制任何不需要的光(如LED发射的中心波长峰值以外的光)(图3)。例如，有时LED由于LED活性区域中缺陷的重组或LED活性区域外的载体的重组以较长的波长显示荧光。这些不需要的荧光通常小于主荧光峰3至4级。尽管如此，还可能需要利用光学带通滤波器对该荧光进行进一步抑制。

在各种实施方式中，现有技术中已知的光学组件系统可配置为用于本发明的热循环仪装置。这种光学组件以及用于检测反应产物的试剂的例子在美国专利申请第2006/0134644、2006/0014200、2005/0255516、2005/0237524、2005/0136448、2004/0133724、2003/0059822、2002/0034746号，以及美国专利第7101509、6942971、6940598、6911327、6783934、6713297、6403037、6369893、7122799、7113624、6037130、5792610、5440388、6873417、6998598、6437345、53011059和6388799号中公开，以上各公开通过引用在此全文引入。

控制组件

在各种实施方式中，控制组件与本发明的热循环仪操作连接。例如，这样的控制组件包括可编程计算机，该可编程计算机包括用于操作本发明装置、方法和/或系统的任一方面的计算机可执行逻辑。例如，控制组件能够开启/关闭电动机、风扇、加热元件、搅拌棒、连续流装置以及光学组件。控制组件可被编程为自动处理样品、运行多个PCR循环、获取测量结果、将测量结果数字化为数据、将数据转换成图/表及报告。

用以控制仪器操作、记录信号、处理和分析信号或数据的计算机可以是个人电脑(PC)、数字计算机、基于微处理器的计算机、便携式计算机或其它类型的处理装置的任一种。一般来说，计算机包括中央处理单元、使用机器可读存储介质记载和读取信息和程序的存储或记忆单元、通讯终端(如有线通讯装置或者无线通讯装置)、输出装置(如显示器终端)和输入装置(如键盘)。显示器终端可以是触摸屏显示器，这种情况下，它可以同时用作显示装置和输入装置。可以存在不同的或附加的输入装置，例如点击装置(如鼠标或操纵杆)，且可以存在不同的或附加的输出装置，例如发声器(如扬声器)、第二显示器或打印机。计算机可以运行多种操作系统中的任一种，举例来说，比如Windows的各个版本，或者MacOS的各个版本，或者Unix的各个版本或Linux的各个版本。

在一些实施方式中，控制组件执行必要的程序以将从反应容器检测和测量的信号数字化，并把数据处理成可读的形式(例如表格、图形、网格、曲线图或其它现有技术中已知的输出形式)。这种形式可被电子显示或记录，或者以纸质形式提供。

在一些实施方式中，控制组件控制与加热元件相连接的电路，从而调节/控制本发明的热循环仪的循环温度。

在进一步的实施方式中，控制组件产生光学组件的采样选通脉冲，其速率通过编程而自动运行。当然，很清楚，这样的时序也可对于光源照射和检测器的操作进行调节以检测和测量信号(例如荧光)。

在另一个实施方式中，包括控制组件的仪器进一步包括用于将样品槽送入孔穴(例如，包含液体组合物的加热块的容器座的槽孔口)中的装置。在一实施方式中，所述装置可以是包括电动机、滚轴、夹具及其它移动样品槽所必要的结构的机器人系统。

样品制备站

在本发明的某些方面中，本发明的装置/系统与机器人样品制备和/或样品处理单元操作连接。例如，控制组件可以提供运行自动样品采集、向采集管添加试剂、从所述中处理及提取核酸、任选地将样品转移到新管内、加入后续反应(例如PCR或测序)必要的试剂和转移样品至热循环仪的程序。在各种实施方式中，样品制备可以在这里所述的连续流PCR系统(图11)中或非连续系统(图1，5)中。

进行PCR的方法

包括液态金属或导热流体加热块的热循环仪可用于疾病诊断、药物筛选、个体的基因型鉴定、系统发生的分类、环境监测、亲子鉴定以及其他用途。此外，使用液态金属或导热流体加热块可从任何实验来源获得核酸。例如，测试样品可以是生物样品和/或环境样品。生物样品可源自人类、其他动物、或植物、体液、固体组织样本、组织培养物或源自组织培养的细胞及其后代、由这些来源的任何一种制备的切片或涂片或其他任何怀疑含有目标核酸的样品。典型的生物样品为体液，包括但不限于血液、尿液、脊髓液、脑脊液、关节滑液、羊水(ammoniac fluid)、精液和唾液。其他类型的生物样品可以包括食品和配料，如蔬菜、奶制品、肉、肉类加工副产品以及废料。环境样品源自环境物质，包括但不限于土壤、水、污水、化妆品、农业及工业样品空气过滤器样品和空调样品。

包括液态金属或导热流体加热块的热循环仪可用于任何需要热循环或能够精确地保持均匀的温度的加热块的方案或实验。例如，所述热循环仪可用于聚合酶链式反应(PCR)、定量聚合酶链式反应(q PCR)、核酸测序、连接酶链聚合酶链式反应(LCR-PCR)、逆转录PCR反应(RT-PCR)、单碱基延伸反应(SBE)、多重单碱基延伸反应(MSBE)、反转录和核酸连接。

本发明的仪器允许以更高的速度和特异性进行PCR，特别是在实时PCR的情况下。采用具有高导热系数的组合物，如液态金属，使得能够以远比传统PCR快的速度进行变温(升温或降温)。这不仅增加了完成PCR的潜在速度，也通过降低引物的非特异性杂交的发生而提高了PCR的特异性。此外，在实时PCR的情况中，从测试容器的分立部分(如顶部)测量信号避免了将样品槽从加热组合物移出进行检测的需要。这也维持了温度控制并使测量在加热循环中实时进行。使用防止信号从样品槽的分立位置以外逸出的反射材料使得能够使用较不灵敏的检测器，因为可收集更多的光进行测量。

PCR反应条件通常包括两步或三步的循环。两步循环具有变性步骤，之后是杂交/延伸步骤。三步循环包括变性步骤，之后是杂交步骤，在此过程中引物与DNA链杂交，随后是单独的延伸步骤。聚合酶反应物在引物与目标序列杂交，并通过聚合酶延伸的条件下孵育。对扩增反应循环条件进行选择以使得引物与靶序列特异性地杂交并延伸。

成功的PCR扩增需要高产量、高选择性和在各步骤具有可控的反应速率。产量、选择性和反应速率一般取决于温度，而最佳温度取决于多核苷酸的组成和长度、酶以及反应体系中的其他成分。此外，不同步骤的最佳温度可能是不同的。根据靶序列和引物的组成的不同，最佳反应条件可能发生变化。热循环仪可通过选择需要保持的温度、各循环的时间长度、循环次数、温度变化速率等进行编程。

用于扩增反应的引物可根据已知的算法设计。例如，可使用在商用的或定制的软件中执行的算法来设计用以扩增需要的目标序列的引物。通常情况下，引物可能的长度为至少12个碱基，更通常是15、18或20个碱基，但长度可以达到50个碱基以上。引物通常设计为所有参与特定反应的引物彼此的解链温度差异在5℃的范围内，且更典型的是在2℃范围内。引物进一步设计为避免引物本身或彼此之间的杂交(priming)。引物浓度应足以与经扩增以提供对扩增序列的量的精确评定的目标序列量进行结合。本领域技术人员可以认识到，引物浓度值将根据引物的结合亲和力以及待结合的序列的量变化。典型的引物浓度范围是从0.01μM到0.5μM。

在一实施方式中，液态金属或导热流体加热块可用于PCR反应，或者作为热循环仪的部件，或者作为用于维持单一温度的加热块。在典型的PCR循环中，包含DNA多核苷酸和PCR反应混合液的样品通过在液态金属或导热流体加热块中在大约90-98℃处理10-90秒而变性。然后，变性的多核苷酸通过在液态金属或导热流体加热块中在约30-65℃的温度下处理1-2分钟而与寡核苷酸引物杂交。随后，通过DNA聚合酶对于与寡核苷酸引物退火的多核苷酸的作用进行链延伸。此反应在液态金属或导热流体加热块中在约为70-75℃的温度下进行30秒至5分钟。根据包括但不限于初始DNA多核苷酸的量、期望产物的长度和引物的严格性的变量，可以完成任何想要次数的PCR循环。

在另一实施方式中，PCR循环包括在94℃下约1分钟的DNA多核苷酸变性。寡核苷酸与变性多核苷酸的杂交发生在约为37-65℃的温度下，时间约一分钟。聚合酶反应在大约72℃下进行大约一分钟。所有的反应是在插入液态金属或导热流体加热块的容器座槽孔中的多孔板中进行的。执行约30个循环。上述温度范围以及其他数值并不是用于限制本发明的范围。这些范围依赖于其他因素，如酶的类型、容器或板的类型、生物样品的类型、样品的大小等。本领域技术人员可以认识到，温度、持续时间和循环次数可随需要方便地加以修改。

反转录PCR

反转录指的是通过反转录酶(如Moloney鼠白血病病毒(MMLV)转录酶、鸟类成髓细胞白血病病毒(AMV)转录酶或其变种)由mRNA复制产生cDNA的过程，包括使用寡聚dT引物或随机低聚体(如随机六聚体或八聚体)。在实时PCR中，通常使用具有内糖苷酶H(endoH)活性的逆转录酶。这消除了mRNA，使得能够形成DNA的第二链。通常反转录在PCR之前作为单一步骤进行。在一个实施方式中，RT反应在液态金属或导热流体加热块中进行，包括在大约37℃孵育RNA样品、逆转录酶、必要的缓冲液和成分大约一小时，然后在大约45℃下孵育大约15分钟，而后在大约95℃孵育。然后cDNA产物被移出并用作PCR的模板。在替代的实施方式中，RT步骤后紧跟着PCR步骤，例如在一步骤PCR方案中。在该实施方式中，所有反应成分存在于用于RT步骤和PCR步骤的样品槽中。但是，DNA聚合酶被封闭活性直至在95℃下进行5-10分钟的延长孵育而激活。在一实施方式中，DNA聚合酶由于封闭抗体的存在而封闭活性，封闭抗体在95℃的孵育步骤中永久失活。

实时PCR

在分子生物学中，实时聚合酶链式反应，也称为定量实时聚合酶链式反应(QRT-PCR)或动态聚合酶链式反应，可用来同时定量和扩增给定的DNA分子的特定部分。其用于确定特定序列是否存在于样品之中，且如果存在，还可确定样品中的拷贝数。它是定量聚合酶链反应(Q-PCR)的实时形式，其本身是聚合酶链反应的改进。

其过程遵循聚合酶链式反应的一般模式，但是在各循环的扩增后对DNA进行定量，这就是其“实时”的一面。在一个实施方式中，DNA通过使用插入双链DNA的荧光染料进行定量。在替代的实施方式中，在与互补DNA杂交时发荧光的经过修饰的DNA寡核苷酸探针被用来定量DNA。

在另一实施方式中，实时聚合酶链式反应与反转录聚合酶链式反应相结合以定量低丰度信使RNA(mRNA)，从而使研究人员能够定量在特定时间、或在特定细胞或组织类型中的相对基因表达。

在特定实施方式中，利用可检测的标记物(如荧光DNA结合染料)，扩增产物可直接被观察到。在一个实施方式中，扩增产物通过使用嵌入染料定量，这些染料包括但不限于SYBR绿、SYBR蓝、DAPI、碘化丙锭、Hoeste、SYBR金、溴化乙锭、吖啶、原黄素、吖啶橙、吖啶黄素、荧光香豆素(fluorcoumanin)、玫瑰树碱、道诺霉素、氯喹、偏端霉素D、色霉素、二胺乙基苯菲啶(homidium)、光神霉素、钌聚吡啶、氨茴霉素。例如，DNA结合染料(如SYBR绿)结合所有双链(ds)DNA，因而测量荧光强度的增加，从而能够确定初始浓度。照常制备标准的PCR反应混合液，添加荧光ds DNA染料并加入到样品中。然后反应在液体加热块热循环仪中进行，并在各次循环后用照相机对荧光的水平进行测量。当结合到ds DNA(即PCR产物)上时，染料发出强得多的荧光。由于嵌入到双链DNA分子中的染料的量通常与扩增的DNA产物的量成比例，人们可以方便地通过使用本发明的光学系统或其他现有技术中合适的仪器定量嵌入染料的荧光而确定扩增产物的量。在使用标准稀释时，可以确定PCR中双链DNA的浓度。在某些实施方式中，对于目标序列获得的结果可以针对稳定表达的基因(“看家基因”)进行标准化，如肌动蛋白、GAPDH或18srRNA。

在各种实施方式中，标记物/染料被本发明的系统或装置检测。术语“标记物”或“染料”指的是能够产生可被肉眼或仪器装置检测到的信号的任何物质。适用于本发明的各种标记物包括通过化学或物理手段而产生信号的标记物，如荧光染料、发色团、电化学结构、酶、放射性结构、磷光基团、荧光结构、化学发光结构或量子点，或更具体地说，放射性标记物，荧光团标记物，量子点标记物，发色团标记物，酶标记物，亲和性配体标记物，电磁自旋标记物，重原子标记物，用纳米粒子光散射标记或其他纳米粒子标记的探针，异硫氰酸荧光素(FITC)，TRITC，若丹明，四甲基若丹明，R-藻红蛋白，Cy-3，Cy-5、Cy-7，得克萨斯红，Phar-红，别藻蓝蛋白(APC)，如Taqman探针、TaqMan Tamara探针、TaqManMGB探针或Lion探针(Biotools)的探针，如Sybr绿I、Sybr绿II、Sybr金、CellTracker绿、7-AAD、溴乙非啶同型二聚体I、溴乙非啶同型二聚体II、溴乙非啶同型二聚体III或溴化乙锭的荧光染料，如FLAG或HA表位的抗原表位标记物，以及如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、I²-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶的酶标记物和如地谷新配基或二硝基苯的半抗原结合物，或能够形成复合物的结合对的成员，如抗生蛋白链菌素/生物素、抗生物素蛋白/生物素或者抗原抗体复合物(包括例如，兔IgG和抗兔IgG)，如伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、四甲基若丹明、曙红、绿色荧光蛋白、藻红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀绿、芪、荧光黄、级联蓝(Cascade Blue)、二氯三氮杂苯基胺(dichlorotriazinylamine)荧光素、丹磺酰氯、藻红蛋白、荧光镧系复合物(如包括铕和铽的复合物)、Cy3、Cy5、分子信标及其荧光衍生物的荧光团，如鲁米诺的发光物质，如金或银颗粒或量子点的光散射或等离子体共振材料，或包括¹⁴C、¹²³I、¹²⁴I、¹²⁵I、¹³¹I、Tc99m、³⁵S或³H的放射性物质，或球壳，以及用本领域技术人员已知的任何其它信号产生标记物标记的探针。例如，可检测分子包括但不限于荧光团以及现有技术中已知的分子，如在例如Principles of FluorescenceSpectroscopy，Joseph R.Lakowicz(编辑)，Plenum Pub Corp，第二版(1999年7月)以及Richard P.Hoagland的第六版Molecular ProbesHandbook中描述的那些。

使用本发明的装置检测嵌入染料，包括但不限于菲啶和吖啶(例如，溴化乙锭、碘化丙锭、碘化己锭(hexidium iodide)、二氢乙锭(dihydroethidium)、溴乙非啶同型二聚体-1和-2，叠氮溴化乙锭(ethidium monoazide)以及ACMA)；一些小沟结合物(minor grovebinder)，如吲哚和咪唑(例如，Hoechst 33258、Hoechst 33342、Hoechst34580和DAPI)；以及各色核酸染色剂，如吖啶橙(也能够嵌入)、7-AAD、放线菌素D、LDS751和羟芪巴脒。上述所有核酸染色剂均可从供应商处购得，如Molecular Probes，Inc。

此外，其他的核酸染色剂的例子包括以下由Molecular Probes提供的染料：花青染料，如SYTOX蓝、SYTOX绿、SYTOX橙、POPO-1、POPO-3、YOYO-1、YOYO-3、TOTO-1、TOTO-3、JOJO-1、LOLO-1、BOBO-1、BOBO-3、PO-PRO-1、PO-PRO-3、BO-PRO-1、BO-PRO-3、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TO-PRO-5、JO-PRO-1、LO-PRO-1、YO-PRP-1、YOPRO-3、PicoGreen、OliGreen、RiboGreen、SYBR金、SYBR绿I、SYBR绿II、SYBR DX、SYTO-40、-41、-42、-43、-44、-45(蓝)、SYTO-13、-16、-24、-21、-23、-12、-11、-20、-22、-15、-14、-25(绿)、SYTO-81、-80、-82、-83、-84、-85(橙)、SYTO-64、-17、-59、-61、-62、-60、-63(红)。其他可检测标志物包括化学发光和生色分子、光学或电子密度标志物等。

如上所述在特定的实施方式中，标记物包括半导体纳米晶体(如量子点，即Qdots)，如在美国第6207392号专利中描述的。Qdots可从Quantum Dot Corporation购得。可用于实施本发明的半导体纳米晶体包括II-VI族半导体的纳米晶体，如MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SrTe、BaS、BaSe、BaTe、ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、HgS、HgSe、HgTe及其混合组成物；以及III-V族半导体的纳米晶体，如砷化镓、砷化铟镓、磷化铟和砷化铟及其混合组成物。使用IV族半导体(如锗或硅)或使用有机半导体在一定条件下也是可行的。半导体纳米晶体还可包括包含从上述III-V族化合物、II-VI族化合物、IV族元素及其组合中选择的两种或多种半导体的合金。

除了各种荧光DNA结合染料外，其他发光的标记物(如序列特异性探针)可用于扩增反应，以利于扩增产物的检测和定量。基于探针的定量扩增依赖于预期扩增产物的序列特异性检测。与基于染料的定量方法不同，它采用发光的、目标特异性的探针(例如，TaqMan

探针)，增加了特异性和灵敏度。进行基于探针的定量扩增的方法在本领域内已被很好的建立起来，并且在美国第5,210,015号专利中给出。

在另一实施方式中，荧光寡核苷酸探针用于定量DNA。包含碱基连接的或者末端连接的荧光染料和猝灭剂的荧光寡核苷酸(引物或探针)是现有技术中公知的。他们可以从，例如Life Technologies(Gaithersburg，Md.)、Sigma-Genosys(The Woodlands，Tex.)、GensetCorp.(La Jolla，Calif.)或Synthetic Genetics(San Diego，Calif.)获得。碱基结合的荧光染料通过寡核苷酸的合成后修饰而并入寡核苷酸中，这些寡核苷酸有与碱基连接的反应基团。本领域技术人员都知道，可以获得大量的不同的荧光团，包括从例如Molecular Probes，Eugene，Oreg获得的，且其它荧光团是本领域技术人员已知的。可用的荧光团包括：荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、羧基四氯荧光素(TET)、NHS-荧光素、5和/或6-羧基荧光(FAM)、5-(或6-)碘乙酰胺荧光素(iodoacetamidofluorescein)、5-{[2(和3)-5-(乙酰巯基)-琥珀酰]氨基}荧光素(SAMSA-荧光素)及其他荧光素衍生物，若丹明、丽丝胺若丹明B磺酰氯、德克萨斯红磺酰氯、5和/或6羧基若丹明(ROX)和其他若丹明衍生物，香豆素、7-氨基-甲基-香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(AMCA)及其他香豆素衍生物，BODIPY^TM荧光团，如8-甲氧基芘-1，3，6-三磺酸三钠盐的Cascade Blue^TM荧光团，如3，6-二磺酸酯-4-氨基-萘酰亚胺的荧光黄荧光团，藻胆蛋白衍生物，Alexa fluor染料(可从Molecular Probes，Eugene，Oreg得到)以及其它本领域技术人员已知的荧光团。对于可用的荧光团的概括列表，也可参见Hermanson，G.T.，BIOCONJUGATE TECHNIQUES(Academic Press，San Diego，1996年)。

使用荧光示踪探针的实施方式产生了精确和可靠的结果。基于序列特异性的RNA或DNA的探针被特别地用于定量探针序列，并非针对所有的双链DNA。这也使得能够通过使用具有不同颜色标记的特异性探针在同一反应中对数个不同基因进行多重分析。

在一个实施方式中，PCR在包括含有流体组合物的液态金属或导热流体加热块的热循环仪中进行。在另一实施方式中，热循环仪进一步包括光学组件。在另一实施方式中，液态金属或导热流体加热块快速和均匀地调节包含在样品槽中的样品的温度以使能够对扩增产物进行实时检测。在另一实施方式中，检测是通过非特异性的核酸的标记物进行的，如嵌入染料，其中信号指数，或特异性扩增产物产生的阳性荧光强度信号至少是PCR对照样品产生的荧光强度的3倍，例如大约3.5、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5或11倍。在一实施方式中，热循环仪可通过每秒10℃以上的速度对样品温度进行调节，例如每秒10.5℃。

在一个实施方式中，使用了基于RNA的探针，其具有保持在邻近位置的荧光报道基团和猝灭基团。荧光报道基团与猝灭基团紧密接近阻止了其本身的荧光，只有当探针被破坏后，荧光才被检测到。这个过程依赖于PCR反应混合液中使用的聚合酶的5′-3′核酸外切酶活性。

一般，照常准备反应，在反应的开始时加入序列特异性的标记探针。DNA变性后，标记探针能够结合到模板DNA的目标区域中与其互补的序列上。当PCR反应物通过液态金属或导热流体块加热到合适的延伸温度时，聚合酶被激活且DNA开始延伸。随着聚合反应的进行，其到达结合到与DNA的互补序列上的标记探针处。聚合酶将RNA探针裂解为独立的核苷酸，并将荧光报道基团与猝灭基团分离。这导致光学组件检测到的荧光增加。随着PCR反应的进行，越来越多的荧光报道基团从其猝灭基团上释放出来，导致荧光呈现明显的几何级的增加。这样就可以精确地测定DNA的最终和初始的量。

诊断应用

在各种应用中，本发明的装置可被用于体外诊断应用，例如，检测传染物或病原体。在一实施方式中，用本发明的装置进行PCR以检测各种此类物质，其可以是包括但不限于以下病原体的任何病原体：细菌、酵母菌、真菌、病毒、真核寄生虫等；传染物，包括流感病毒、副流感病毒、腺病毒、鼻病毒、冠状病毒、甲、乙、丙、丁、戊型肝炎病毒等、HIV、肠道病毒、乳头状瘤病毒、柯萨奇病毒、单纯疱疹病毒或者爱泼斯坦-巴尔二氏(Epstein-Barr)病毒；细菌，包括分支杆菌属、链球菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、葡萄球菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、梭菌属或大肠杆菌。本领域技术人员很清楚，PCR、测序以及相关方法很容易用于本发明的装置以用于任何传染物的检测。

本发明的装置的一个优势是可进行超快PCR的能力，这为诊断应用提供了相对更快的速度。对于一些应用(比如，生物威胁剂的检测、术中诊断测试)，快速PCR是有利的。快速实时PCR的一个重要要求是热循环仪允许快速加热、冷却和热传递，且信号产生系统与伴随快速PCR的短循环时间相容。如这里所述的，本发明的热循环仪可以提供快速冷却(如，5-17℃/秒)和快速加热(如，10-44℃/秒)。例如，如果需要，本发明的装置可以提供低至2秒的循环时间。

此外，这种超快PCR方法可以通过将本发明的装置与本领域中已知在扩增以及产生可检测信号需要的时间两方面有利于更快地得到结果的试剂配合。这些试剂是现有技术中已知的，比如在美国专利申请2005/0164219号中公开的。其中我们采用的一个是快速聚合酶，如KOD。

例如，专门的标记引物可提供瞬间的信号发生(2005/0164219)。在前一循环中延伸的反应物发生内部重排，且一旦达到延伸温度，信号便产生。在具有慢的循环条件的标准PCR反应中，这种信号发生差异并不明显。然而，当在快速PCR中延伸时间缩短时，这一特征变成一个优势并转化成快速PCR。利用本发明的装置，单拷贝细菌序列可以在不到15分钟内被检测到。一个例子是使用蝎型引物(Scorpions primer)和快速PCR仪器对低水平的芽孢杆菌(Bacillus spp)进行快速检测。此外，依赖于输入的DNA的量，传染物可以在短于10分钟的时间内被检测出来，甚至更低水平的样品也可在短于14分钟的时间内检测到。

实施例

实施例1

不锈钢PCR样品槽

不锈钢PCR样品槽被证明是合适的在其中进行聚合酶链式反应的容器。用于初始测试的容器由不锈钢管制成，最终外径为0.061英寸。长两英寸的样品槽在其一端用压力配合的不锈钢塞封闭。

将相同的20μL实时聚合酶链式反应的制剂(用SYBR绿嵌入染料作为指示剂)同时放入市售的玻璃PCR毛细管和上述的金属样品槽中。然后在各容器中通过用20μL的矿物油作为上层液体层使试剂与外部空气隔绝。这些容器一起在市售的实时PCR仪中进行温度循环40个周期，然后将金属样品槽的内容物转移到市售的玻璃PCR毛细管中。对两个样品建立熔解曲线，结果表明，在玻璃和金属容器中PCR都成功完成(图12)。

实施例2

实时PCR

液态金属或导热流体加热块非常适合于实时PCR反应，因为液态金属或导热流体具有快速的变温速率、热均匀性和反射性。

通过将PCR反应成份加入样品槽内并密封容器以防止溢出或交叉污染而准备样品槽。反应成份包括缓冲液、靶核酸、适当的引物和探针、核苷酸、聚合酶以及任选的附加成份。在一个实施方式中，包括了四种荧光探针，各用于检测不同的靶序列，且特定的反应容器可包括该荧光探针的任何一种或多种。各探针有利地对具有不同入射波长的光作出反应并发射不同波长的光。

加热块上安装有检测模块。检测模块包括四个检测通道。各通道针对样品槽中包括的不同荧光探针中的一个进行优化。样品槽被置于加热块容器座槽孔内。顶盖组件进行封闭并定位于加热块上。

检测模块的各通道被校准，校准是通过操作步进电机以定位检测模块进行的，使得其通道中的至少一个与校准位置形成光通讯。各校准位置提供已知的荧光应答。因此，校准测量可用于矫正随后的对于变量的样品测量或检测器响应的波动。现有技术中已知有许多的校准技术。当使用具有多个通道的检测模块时，各个通道可以独立地校准。

进行PCR循环。热循环仪控制液态金属或导热流体加热块以调节样品槽的温度，从而使样品槽在所需要的温度下保持需要的时间以完成两步或三步的PCR循环。光学组件扫描并探查样品槽。各个通道的LED或其他光源(如激光器)被启动(闪亮短暂的时间)以激发荧光。在一实施方式中，不同通道的LED平行运行，在替代的实施方式中，它们依次运行以避免来自一个通道的反射LED光引起另一个通道的光检测器的假信号。光学组件的操作可以通过外部计算机或通过热循环仪中内置的控制器进行控制。测量与热循环仪的运行同步进行，以便测量可看作对应于PCR过程中的特定时间。在另一实施方式中，热循环仪的控制部件可以自动打开和关闭一个或多个风扇，这些风扇任选地连接在加热块上或者结合一个或多个散热器。

产生的荧光被通道的相应光电二极管或其他检测器检测到，检测器读数传送到外部计算机。该检测器可用各种方式读取。例如，可以检测信号峰值，可以累计某一时间段的信号，或可以测量LED关闭后荧光信号的衰减。

这些步骤随每次检测模块的位置发生变化而重复，使得检测模块的各个通道最终探查各个样品槽。在一个实施方式中，用4个通道扫描和探查96个样品槽孔的每一个需要大约15秒。外部的计算机可执行一个程序以使用户能够查看图形和/或表格形式的收集到的数据。

以上过程的实时荧光测量用来检测和定量各个靶序列的存在。这种测量也可用于如确定反应速率和调整反应参数以提高效率，以及在特定的实验中确定不再需要额外的反应循环的时间(例如，当已产生足够量的靶序列时)的目的。

可以理解以上过程是示例性的且多种变化和修改是可能的。顺序描述的步骤可以平行进行，步骤的顺序可以改变，且步骤可以进行修改或组合。例如，荧光测量可以在PCR循环过程中的任一时间点进行，在各PCR循环中进行多次荧光测量(包括基本上连续扫描样品槽孔)，或不进行荧光测量直到一定数目的PCR循环之后。单个反应容器中可以使用任意数目的可分辨的荧光探针，且检测模块可进行设置以包括至少与使用的探针相同数目的通道。在某些实施方式中，检测模块包括针对相同的探针优化的多个通道。这可以缩短扫描时间，因为只需要这些通道中的一个探查特定的样品槽孔。

尽管在此所提供和描述了本发明的优选实施方式，但本领域技术人员很清楚，这些实施方式仅以举例说明的方式给出。本领域技术人员可以想到许多不背离本发明的变化、修改、替换。应当理解，在实施本发明时可以采用这里描述的本发明的实施方式的各种不同替代方式。本发明的意图是下面的权利要求限定本发明的范围，且因此覆盖这些权利要求的范围中的方法和结构及其等价物。

Claims (89)

1、一种进行PCR的方法，包括：

a)在样品槽内进行PCR，并在样品槽中产生指示PCR进程的信号，其中基本上所有所述信号反射回所述样品槽中，其中基本上所有所述信号从所述样品槽的一个分立位置被检测到；及

b)测量从样品槽的该分立位置发射的信号。

2、如权利要求1所述的方法，包括实时测量多个PCR循环的信号。

3、如权利要求2所述的方法，其中所述样品槽包括对信号透明的壁，且该壁的至少一部分浸入液体组合物中，该液体组合物反射基本上所有到达该液体组合物的信号。

4、如权利要求3所述的方法，其中所述的液体组合物包括金属或金属合金。

5、如权利要求3所述的方法，其中所述的信号是由标记物或染料产生的。

6、如权利要求1所述的方法，其中所述样品槽包括反射所述样品槽内的基本上所有所述信号的材料。

7、如权利要求1所述的方法，其中所述样品槽由金属制成。

8、如权利要求1所述的方法，其中所述样品槽包括反射材料。

9、如权利要求2所述的方法，其中所述样品槽通过容器座与所述液体组合物隔离。

10、一种进行PCR的方法，包括：

a)在以下条件下对反应混合物中的靶核苷酸序列进行PCR反应：

i)引物延伸和双链解离之间以及引物退火和引物延伸之间的温度变化速率超过每秒10.5℃；

ii)所述PCR在包含样品槽的加热块中进行，样品槽内温度差异小于0.5℃；及

b)实时监测靶核苷酸序列的扩增。

11、如权利要求10所述的方法，其中所述加热块包括液体组合物。

12、如权利要求10所述的方法，进一步包括在所述加热块的两个或多个孔之间测量的温度差异小于0.5℃。

13、如权利要求12所述的方法，其中在所述加热块的两个或多个孔之间测量的所述温度差异是0.01℃。

14、如权利要求10所述的方法，其中所述加热块为交换块。

15、如权利要求10所述的方法，其中温度的变化速率通过以下方式实现：

(1)将包含反应混合物的样品槽与具有至少0.1W/M·K的传热系数的液体组合物热接触；其中液体组合物的温度控制反应混合物的温度。

16、如权利要求15所述的方法，包括通过诱使液体组合物的运动来保持温度均匀性。

17、一种进行PCR的方法，包括：在以高于每秒5℃的速度调节样品温度的热循环仪中进行PCR反应；其中所述的热循环仪的温度由液密封的加热块内的液体组合物调节；其中所述液体组合物的传热系数至少为0.1W/M·K。

18、如权利要求17所述的方法，其中所述的热循环仪提供至少约每秒10℃的变温速度。

19、如权利要求17所述的方法，其中所述热循环仪提供至少约0.01℃到0.1℃的孔与孔间的和样品的温度均匀性。

20、如权利要求18所述的方法，其中所述加热块具有0.01℃的在所述加热块的两个或多个孔之间测量的温度差异。

21、如权利要求18所述的方法，其中所述液体组合物包含于加热块内。

22、如权利要求20所述的方法，其中所述加热块为交换块。

23、一种进行PCR的方法，包括：在充分地调节样品温度以使得以至少为3的信号指数对扩增进行实时检测的热循环仪中进行PCR；其中所述的检测是通过非特异性核酸标记实现的，其中所述热循环仪以每秒10℃以上的速度调节样品温度。

24、一种进行实时PCR的方法，包括：

a)在反应混合物中引物延伸和双链解离之间及引物退火和引物延伸之间的温度变化速率为至少每秒15℃的条件下，在反应混合物中进行靶核苷酸序列的PCR反应，其中所述PCR反应在与具有至少0.1W/m·K的传热系数的液体组合物发生热接触的情况下进行；及

b)对PCR进行实时监测。

25、如权利要求24所述的方法，其中监测包括：

a)在样品槽中进行PCR，并在样品槽中产生指示PCR进程的信号，其中信号基本上是从一个分立位置从样品槽发射的；及

b)测量从样品槽的该分立位置发射的信号。

26、如权利要求24所述的方法，其中反应混合物中的升温速度为至少每秒40℃。

27、如权利要求24所述的方法，其中所述温度变化是通过珀耳帖元件调节的。

28、一种进行实时PCR的方法，包括：

a)使PCR反应混合物的温度在双链解离、引物退火和引物延伸的温度之间进行多个循环，其中各循环不超过5秒钟；其中所述温度由密闭在热循环仪中的液体组合物调节；及

b)在多个循环中实时监测样品槽内的PCR进程。

29、如权利要求28所述的方法，在步骤a)之前还包括：

1)使包含PCR反应混合物的样品槽的封闭端与液体组合物形成热接触，该液体组合物在60℃以上为液体并具有至少为0.1W/m·K的传热系数，从而液体组合物的温度控制PCR反应混合物的温度。

30、如权利要求28所述的方法，其中液体组合物反射样品槽内基本上所有的光。

31、如权利要求30所述的方法，其中监测是通过测量从样品槽顶部或底部发射的信号进行的。

32、如权利要求28所述的方法，其中各循环不超过3秒。

33、如权利要求29所述的方法，其中所述样品槽包括反射表面。

34、如权利要求29所述的方法，其中所述样品槽进一步用盖体覆盖。

35、如权利要求34所述的方法，其中所述盖体能够从所述的液体组合物吸热，或者被所述液体组合物冷却。

36、一种进行实时PCR的方法，包括提供热循环仪，该热循环仪包含与PCR样品槽发生热接触的液体组合物；其中所述液体组合物进行温度调节，从而调控样品槽内的反应温度，其中从所述样品槽中发射可检测的信号；及通过包含光发射器和光学检测器的光学组件检测所述信号。

37、如权利要求36所述的方法，其中所述光学组件包括针状光电二极管、CCD成像仪、CMOS成像仪、行扫描仪、光电二极管、光电晶体管、光电倍增器或雪崩光电二极管。

38、如权利要求36所述的方法，其中所述样品槽进一步用盖体覆盖。

39、如权利要求38所述的方法，其中所述盖体能够从所述的液体组合物吸热，或者被所述液体组合物冷却。

40、一种仪器，包括：

a)温度控制组件，包括包含液体组合物的容器，所述液体组合物在60℃以上为液体并具有至少0.1W/m·K的传热系数，所述容器有至少一个孔穴，各孔穴适于容纳样品槽的封闭端，其中容纳在孔穴内的样品槽与液体组合物形成热接触，从而液体组合物的温度控制样品槽内液体样品的温度，且其中液体组合物能够反射样品槽内基本上所有的光；

b)光学组件，能够从所述样品槽上的一个分立位置检测所述样品槽内的光；及

c)控制组件，其控制液体组合物的温度和光学组件的运行。

41、如权利要求40所述的仪器，其中液体组合物包括镓、镓-铟合金或者包含镓、铟、铑、银、锌、锡或亚锡的合金。

42、如权利要求40所述的仪器，其中温度控制器包括珀耳帖元件。

43、如权利要求40所述的仪器，其中温度控制器包括与液体组合物热接触的电阻丝。

44、如权利要求40所述的仪器，其中温度控制器包括使液体组合物的温度在适宜于PCR的双链解离、引物退火和引物延伸的温度之间循环的装置。

45、如权利要求40所述的仪器，其中热循环仪还包括使液体组合物中的液流循环流动的装置。

46、如权利要求40所述的仪器，其中所述光学组件包括光发射器和光学检测器。

47、如权利要求40所述的仪器，进一步包括：

包含向样品槽内添加试剂的装置的样品制备站。

48、如权利要求40所述的仪器，进一步包括将样品槽移动到孔穴中的装置。

49、如权利要求47所述的仪器，进一步包括控制热循环仪、光学组件以及样品制备站的数字计算机。

50、一种进行实时PCR的系统，包括：

a)热循环仪，包含液体组合物和用于接合样品槽并使所述样品槽与液体组合物形成热接触的装置；及

b)光学组件，包含光发射器和光学检测器，其将光导入接合的样品槽和检测从接合的样品槽发射的光。

51、如权利要求50所述的系统，其中所述液体组合物包括金属或金属合金。

52、如权利要求50所述的系统，其中所述液体组合物包括镓。

53、如权利要求50所述的系统，其中所述的发射信号来自所述样品槽的可移除的盖体。

54、如权利要求50所述的系统，其中所述液体组合物通过容器座与所述样品槽隔离。

55、如权利要求54所述的系统，其中所述容器座是透明的或半透明的。

56、如权利要求50所述的系统，其中所述系统包含珀耳帖元件。

57、如权利要求56所述的系统，其中所述热循环仪还包含与风扇和搅拌棒操作连接的电动机。

58、如权利要求57所述的系统，其中所述风扇和搅拌棒与所述电动机同轴连接。

59、如权利要求50所述的系统，其中所述热循环仪还包含用于所述液体组合物的热调控的电阻丝。

60、如权利要求50所述的系统，其中所述液体组合物密封在封闭屏障内，其中所述屏障包括具有容器座的表面，所述样品槽置于该容器座中。

61、如权利要求50所述的系统，其中所述液体组合物直接与所述样品槽接触。

62、如权利要求50所述的系统，其中所述光学组件包括针状光电二极管、CCD成像仪、CMOS成像仪、行扫描仪、光电二极管、光电晶体管、光电倍增器或雪崩光电二极管。

63、一种仪器，包括，

a)散热器；

b)与所述散热器热接触的加热元件；

c)包括具有顶面和底面的壁的屏障，其中底面密封于所述加热元件上，其中密封的屏障和所述加热元件形成包含液体组合物的容器；

d)包含多个槽孔的第一片体，其中该第一片体密封于屏障的顶面上且槽孔延伸入容器中；

e)包含多个样品槽的第二片体，各样品槽具有开口端，其中样品槽可移除地插入槽孔中；

f)包含多个突起的第三片体，其中突起可移除地插入样品槽的开口端。

64、如权利要求63所述的仪器，其中所述液体组合物包括在60℃以上为液体并具有至少为0.1M/W/K的传热系数的金属。

65、如权利要求63所述的仪器，其中所述液态金属的体积能够增加约0.1到6.0％。

66、如权利要求63所述的仪器，其中所述升温能力超过每秒10.5℃。

67、如权利要求63所述的仪器，其中e)中所述槽孔设置为易适性的，以使所述槽孔能与f)中所述样品槽形成热或光学接触。

68、如权利要求67所述的仪器，其中所述设置包括在所述槽孔中采用几何构型和/或可变形材料。

69、如权利要求68所述的仪器，其中所述几何构型是多边形、椭圆形或者圆形。

70、如权利要求63所述的仪器，其中所述槽孔浸入所述液体组合物至初始水平。

71、如权利要求70所述的仪器，其中所述突起延伸至所述初始水平以上、所述初始水平处或所述初始水平以下。

72、如权利要求63所述的仪器，其中所述第三片体能够从所述液体组合物吸收热量或被所述液体组合物冷却。

73、如权利要求63所述的仪器，其中所述第一片体的槽孔是透明和易适性的，且所述第二片体的样品槽是透明的，从而在所述槽孔上的增强的压力使所述容器中的所述液体与所述样品槽中的样品形成热和光学接触。

74、如权利要求63所述的仪器，其中所述第三片体的突起是透明的。

75、如权利要求63所述的仪器，其中所述屏障通过垫片密封到散热体及第一片体上。

76、如权利要求63所述的仪器，其中所述第一片体或第二片体包括反射表面。

77、如权利要求63所述的仪器，其中所述屏障利用紧固器密封到散热体及第一片体上。

78、如权利要求63所述的仪器，还包含与所述加热元件接触的散热体。

79、如权利要求63所述的仪器，其中所述加热元件是珀耳帖元件、线元件或其组合。

80、如权利要求63所述的仪器，还包含第二加热元件，其中所述屏障放置在所述加热元件和所述第二加热元件之间。

81、如权利要求63或权利要求69所述的仪器，其中所述的多个槽孔包括4、8、16、32、48、96、196、384或1536个槽孔。

82、如权利要求63或69所述的仪器，还包括风扇和搅拌棒，其中任选地所述风扇和搅拌棒与单电动机操作连接。

83、如权利要求82所述的仪器，其中所述仪器由电池提供动力。

84、如权利要求82所述的仪器，其中所述风扇由与所述仪器操作连接的控制部件自动开启和关闭。

85、如权利要求63所述的仪器，还包括金属散热体。

86、如权利要求85所述的仪器，其中所述散热体包括铜。

87、如权利要求63所述的仪器，其中所述加热元件配置为用于梯度PCR。

88、一种连续流PCR系统，包括样品制备模块；热循环仪，其中所述热循环仪包括用以调节所述样品的温度的液体组合物；及用于检测来自所述样品的发射信号的光学组件。

89、如权利要求88所述的系统，还包括采样器和废液收集装置。

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