CN101500603A

CN101500603A - 节省佐剂的多剂量流感疫苗接种方案

Info

Publication number: CN101500603A
Application number: CNA2007800273327A
Authority: CN
Inventors: G·德尔古迪斯; R·曼尼蒂
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics AG
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics AG
Priority date: 2006-06-15
Filing date: 2007-06-15
Publication date: 2009-08-05
Also published as: AU2007258874B2; JP2014098038A; EA200970013A1; PT2032163E; US20140370053A1; PL2032163T3; JP5566687B2; US20120039934A1; HK1129205A1; WO2007144772A2; EA017441B1; US20090220545A1; ZA200810582B; EP2032163B1; JP2009539965A; BRPI0713150A2; DK2032163T3; AU2007258874A1; US8808686B2; EP2032163A2

Abstract

通过多剂量方案施用的流感疫苗，其中，(i)第一剂量与佐剂一起施用，而(ii)随后剂量不与佐剂一起或与不同佐剂一起施用。因此，本发明在无需加倍提供特定佐剂的情况下便可提供两次剂量方案的益处。

Description

节省佐剂的多剂量流感疫苗接种方案

本文引用的所有文件全文纳入本文作为参考。

技术领域

本发明属于保护以免遭流感病毒感染的疫苗领域。

背景技术

接受流感疫苗的患者目前需要每年接种一次，但首次接种疫苗时年龄在8岁或以下的儿童除外，他们要间隔至少4周接受两次剂量。

考虑过(例如见参考文献1)在大流行状态也需要两次剂量方案，此时的人群对于新的流感病毒毒株没有免疫力。

需要两次剂量意味着，当抗原供应量固定时，可制备的药剂数量将是一次剂量方案下可制备的数量的一半。因此提出每剂使用较低量的抗原并采用佐剂补偿这种减少。

如果添加佐剂的疫苗的单次剂量方案不能引起充分的免疫应答，则无论如何都将需要两次剂量方案，而添加足量佐剂的附带缺点也将显露出来。当制造数亿添加佐剂的疫苗剂量时这一问题将非常重要，对于合成佐剂而言尤其重要。

本发明的目的是减轻或避免这些缺点。

发明内容

根据本发明，流感疫苗是通过一种多剂量方案施用的，其中，(i)第一剂量与佐剂一起施用，而(ii)随后剂量不与佐剂一起或与不同佐剂一起施用。因此，本发明在无需加倍提供特定佐剂的情况下便可提供两次剂量方案的益处。第一剂量和随后剂量优选通过相同给药途径给予(例如都通过肌内注射)，而参考文献2的研究采用未添加佐剂的粘膜加强剂(booster)作为三剂量方案的第三剂量，以便确定小鼠中的肠胃外初免途径(背部和颈部)是否会影响添加佐剂的疫苗的免疫原性。

因此，本发明提供了一种免疫患者免遭流感病毒感染的方法，该方法包括以下步骤：(i)施用与第一佐剂组合的流感病毒疫苗剂量；和(ii)施用不含该佐剂的流感病毒疫苗的进一步剂量。所述进一步剂量可以不包含佐剂或者可包含不同于第一佐剂的第二佐剂。

本发明还提供了一种试剂盒，其中装有：(i)与第一佐剂组合的第一流感病毒疫苗；和(ii)不含该佐剂的第二流感病毒疫苗。本发明还提供了(i)与第一佐剂组合的第一流感病毒疫苗；和(ii)不含该佐剂的第二流感病毒疫苗在制造多剂量流感疫苗中的应用。所述第二疫苗可以不包含佐剂或者可包含不同于第一佐剂的第二佐剂。

本发明还提供了一种完成对患者进行免疫，以免遭流感病毒感染的方法，其中，所述患者之前已接受与第一佐剂组合的流感病毒疫苗剂量，且其中所述方法包括给患者施用不含该佐剂的流感病毒疫苗的进一步剂量的步骤。所述进一步剂量可以不包含佐剂或者可包含不同于第一佐剂的第二佐剂。

本发明还提供了未添加佐剂的流感病毒疫苗在制造用于免疫患者免遭流感病毒感染的药物中的应用，其中，所述患者之前已接受添加佐剂的流感病毒疫苗。本发明还提供了添加佐剂的第二流感病毒疫苗在制造用于免疫患者免遭流感病毒感染的药物中的应用，其中，所述患者之前已接受添加佐剂的第一流感病毒疫苗，其中第一和第二流感病毒的佐剂是不同的。

如果两次免疫接种时的血凝素剂量低于15μg/毒株/剂的标准值，这些方法、试剂盒和应用将特别有利，这是由于本发明允许放松对抗原和佐剂的要求。

流感病毒抗原

本发明组合物包含流感病毒抗原。通常可从流感病毒粒子制备这些抗原，或者可在重组宿主(例如，利用杆状病毒载体的昆虫细胞)中表达诸如血凝素和神经氨酸酶等抗原并以纯化形式使用[3，4，5]。然而，抗原一般来自病毒粒子。

抗原可采用活病毒，或者更优选灭活病毒的形式。灭活病毒的化学方法包括用有效量的一种或多种以下试剂处理：洗涤剂、甲醛、福尔马林、β-丙内酯或紫外光。灭活的其它化学方法包括用亚甲基蓝、补骨脂素、羧基富勒烯(C60)或它们任何的组合处理。本领域知道灭活病毒的其它方法，例如二元乙胺(binary ethylamine)、乙酰基乙亚胺或γ射线。INFLEXAL^TM产品是完整的病毒粒子灭活疫苗。

如果使用灭活病毒，疫苗可包含完整的病毒、裂解病毒或纯化的表面抗原(包含血凝素，通常还包含神经氨酸酶)。

通常，多剂量方案中的每种疫苗将采用相同的抗原形式，例如，不会第一剂量采用裂解病毒粒子疫苗而第二剂量采用全病毒粒子疫苗。

可通过各种方法从含病毒的液体收集病毒粒子。例如，纯化方法可包括利用线性蔗糖梯度溶液的区带离心，所述蔗糖溶液含有洗涤剂以使病毒粒子破裂。任选稀释后，可通过渗滤纯化抗原。

用洗涤剂(例如，乙醚、聚山梨醇酯80、脱氧胆酸盐、磷酸三-N-丁酯、曲通X-100、曲通N101、溴化十六烷基三甲铵、Tergitol NP9，等等)处理病毒粒子，包括“吐温-醚”裂解方法来产生亚病毒粒子制品，从而获得了裂解病毒。本领域熟知裂解流感病毒的方法，例如参见参考文献6-11等。通常利用破裂浓度(disrupting concentration)的裂解剂(splitting agent)使感染性或非感染性的完整病毒破裂或破碎来进行病毒的裂解。破裂造成病毒蛋白质完全或部分溶解，从而改变了病毒的完整性。优选的裂解剂是非离子和离子性(例如，阳离子)表面活性剂，例如烷基糖苷、烷基硫苷、酰基糖、磺基甜菜碱、甜菜碱、聚氧乙烯烷基醚、N，N-二烷基-葡糖酰胺(Glucamides)、海克麦格(Hecameg)、烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、季铵化合物、十二烷基肌氨酸钠、CTAB(溴化十六烷基三甲铵)、磷酸三丁酯(tri-N-butyl-phosphate)、塞太弗伦(Cetavlon)、肉豆蔻基三甲基铵盐、脂转染试剂、脂转染胺、和DOT-MA、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(例如，曲通表面活性剂，如曲通X-100或曲通N101)、聚氧乙烯失水山梨糖醇酯(吐温表面活性剂)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。一种有用的裂解方法利用脱氧胆酸钠和甲醛的连续作用，裂解发生在最初的病毒粒子纯化期间(例如，在蔗糖密度梯度溶液中)。因此裂解方法可包括使含病毒粒子的物质澄清(以除去非病毒粒子物质)，浓缩收集的病毒粒子(例如，采用吸附法，如CaHPO₄吸附)，分离完整病毒粒子与非病毒粒子物质，在密度梯度离心步骤中利用裂解剂裂解病毒粒子(例如，利用含有裂解剂，如脱氧胆酸钠的蔗糖梯度(溶液))，然后过滤(例如，超滤)以除去不需要的物质。可将裂解的病毒粒子有用地重悬在磷酸钠缓冲的等渗氯化钠溶液中。BEGRIVAC^TM、FLUARIX^TM、FLUZONE^TM和FLUSHIELD^TM产品是裂解疫苗。

纯化的表面抗原疫苗包含流感表面抗原血凝素，通常还包含神经氨酸酶。本领域熟知制备纯化形式的这些蛋白质的方法。FLUVIRIN^TM、AGRIPPAL^TM和INFLUVAC^TM产品是亚单位疫苗。

流感抗原还可以病毒体形式存在[12](不含核酸的病毒样脂质体颗粒)，如INFLEXAL V^TM和INVAVAC^TM产品那样，但本发明优选不施用病毒体。因此，在一些实施方式中，流感抗原不采取病毒体的形式。

流感病毒可以是减毒的。流感病毒可以对温度敏感。流感病毒可以是冷适应的。这三种可能性特别适用于采用活病毒作为抗原。

用于疫苗中的流感病毒毒株每季不同。在目前的流行间期，疫苗通常包含两种甲型流感毒株(H1N1和H3N2)和一种乙型流感毒株，一般是三价疫苗。本发明还用这些疫苗，但特别有用的是来自流行毒株(即，对疫苗受者和普通人群而言免疫原初的毒株)的病毒，例如H2、H5、H7或H9亚型毒株(特别是甲型流感病毒)，流行毒株的流感疫苗可以是单价疫苗，或者可以添加了流行毒株的普通三价疫苗为基础。然而，取决于季节和疫苗所含抗原的性质，本发明可起保护作用以抵御以下一种或多种甲型流感病毒血凝素亚型：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16。本发明可起保护作用以抵御以下一种或多种甲型流感病毒NA亚型：N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9。

可有用地包含在组合物中的其它毒株是耐受抗病毒治疗的毒株(例如，耐受奥塞米韦[13]和/或扎那米韦)的毒株，包括耐药性流行毒株[14]。

本发明特别适用于免疫接种以抵御大流行毒株。能导致大流行爆发的流感毒株的特征在于：(a)与目前流行的人毒株中的血凝素相比，其含有新的血凝素，即，未在人群中出现超过10年的毒株(例如，H2)，或者以前根本未在人群中见到的毒株(例如，通常只在鸟群中发现的H5、H6或H9)，从而使得人群对该毒株的血凝素而言在免疫学上是原初的；(b)其能在人群中水平转移；和(c)其对人具有致病性。对于免疫接种抵御流行性流感，优选具有H5血凝素类型的毒株，例如H5N1毒株。其它可能的毒株包括H5N3、H9N2、H2N2、H7N1和H7N7，及任何其它可能出现的流行毒株。在H5亚型内，病毒可能属于HA进化枝1、HA进化枝1’、HA进化枝2或HA进化枝3[15]，其中进化枝1和3特别相关。

通常，多剂量方案中的每种疫苗将共用至少一种常见血凝素亚型，例如本发明将不会第一剂量采用单价H5N1疫苗而第二剂量采用单价H9N2疫苗。

本发明组合物可包含一种或多种(例如，1、2、3、4或更多种)流感病毒毒株，包括甲型流感病毒和/或乙型流感病毒的抗原。如果疫苗包含多种流感毒株，通常分别培养不同的毒株，收集病毒后混合来制备抗原。因此，本发明方法可包括混合多种流感毒株的抗原的步骤。然而对于大流行情况，单价疫苗是优选的。

流感病毒可以是重配毒株，可通过反向遗传学技术获得。反向遗传学技术[例如，16-20]能利用质粒在体外制备含所需基因组区段的流感病毒。该技术通常涉及表达(a)例如能从polI启动子编码所需病毒RNA分子的DNA分子，和(b)例如能从polII启动子编码病毒蛋白质的DNA分子，从而使得在细胞中表达两种类型的DNA能装配完整的感染性病毒粒子。DNA优选能提供所有病毒RNA和蛋白质，但也可能利用辅助病毒提供所述RNA和蛋白质中的一些。优选质粒方法，从而能用不同质粒产生各病毒RNA[21-23]，这些方法还包括利用质粒来表达所有病毒蛋白质或其中一些(例如，PB1、PB2、PA和NP蛋白质)，一些方法利用了12种质粒。

为减少所需的质粒数，最近的方法[24]在同一质粒上组合了多个RNA聚合酶I转录盒(对于病毒RNA合成)(例如，编码1、2、3、4、5、6、7或所有8个甲型流感vRNA区段的序列)，在另一质粒上组合了含RNA聚合酶II启动子的多个蛋白质编码区(例如，编码1、2、3、4、5、6、7或所有8个甲型流感mRNA转录物的序列)。参考文献24所述方法的优选方面包括：(a)一个质粒上的PB1、PB2和PA mRNA编码区；和(b)一个质粒上的所有8个vRNA编码区段。包含一个质粒上的NA和HA区段和另一质粒上的6个其它区段也是有利的。

除了用polI启动子编码病毒RNA区段，还可能用细菌噬菌体聚合酶启动子[25]。例如，可方便地使用SP6、T3或T7聚合酶的启动子。由于polI启动子的种类特异性，细菌噬菌体聚合酶启动子对于许多细胞类型(例如，MDCK)更方便，虽然还必须用编码外源性聚合酶的质粒转染细胞。

其它技术可能采用双重polI和polII启动子来同时编码一个模板的病毒RNA和可表达的mRNA[26，27]。

因此，甲型流感病毒可包含A/PR/8/34病毒的一个或多个RNA区段(通常是A/PR/8/34的6个区段，其中HA和N区段来自疫苗毒株，即6:2重配株)，特别是用卵培养病毒时。还可包含用于生产疫苗制备用重配病毒的A/WSN/33病毒或任何其它病毒毒株的一个或多个RNA区段。通常，本发明保护抵御能人向人传播的毒株，因此毒株的基因组一般包含源自哺乳动物(例如人)流感病毒的至少一个RNA区段。其可包含源自禽流感病毒的NS区段。

可用卵或细胞培养物培养用作抗原来源的病毒。目前培养流感病毒的标准方法利用无特定病原体(SPF)的含胚鸡蛋以及从鸡蛋内含物(尿囊液)中纯化病毒。然而，近年来用动物细胞培养物培养病毒，出于速度和患者变态反应的原因，优选该培养方法。如果采用鸡蛋培养病毒，则可将病毒与一种或多种氨基酸一起引入鸡蛋的尿囊液中[11]。

当采用细胞培养物时，病毒生长物质将通常是哺乳动物细胞系。合适的哺乳动物细胞来源包括但不限于：仓鼠、牛、灵长类(包括人和猴)和犬细胞。可利用各种细胞类型，例如肾细胞、成纤维细胞、视网膜细胞、肺细胞等。合适的仓鼠细胞的例子是名为BHK21或HKCC的细胞系。合适的猴细胞是，例如非洲绿猴细胞，例如Vero细胞系中的肾细胞。合适的犬细胞是，例如MDCK细胞系中的肾细胞。因此，合适的细胞系包括但不限于：MDCK；CHO；293T；BHK；Vero；MRC-5；PER.C6；WI-38；等等。用于培养流感病毒的优选哺乳动物细胞系包括：源自马-达二氏犬肾的MDCK细胞[28-31]；源自非洲绿猴(Cercopithecus aethiops)肾脏的Vero细胞[32-34]；或源自人胚胎成视网膜细胞的PER.C6细胞[35]。这些细胞系可广泛购自，例如美国模式培养物保藏所(ATCC)[36]、寇里尔细胞保藏中心(Coriell Cell Repositories)[37]或欧洲细胞培养物保藏所(ECACC)。例如，ATCC提供目录号为CCL-81、CCL-81.2、CRL-1586和CRL-1587的各种不同Vero细胞，目录号为CCL-34的MDCK细胞。PER.C6可以保藏号96022940购自ECACC。作为哺乳动物细胞系的次选替代，可用禽细胞系培养病毒[例如，参考文献38-40]，包括源自鸭(例如，鸭视网膜)或母鸡的细胞系。禽细胞系的例子包括禽胚胎干细胞[38，41]和鸭视网膜细胞[39]。合适的禽胚胎肝细胞包括源自鸡胚胎干细胞的EBx细胞系、EB45、EB14和EB14-074[42]。也可使用鸡胚胎干细胞(CEF)。

培养流感病毒的最优选细胞系是MDCK细胞系。原始MDCK细胞系可以CCL-34购自ATCC，但也可使用该细胞系的衍生物。例如，参考文献28披露了适应于在悬浮培养基中生长的MDCK细胞系(“MDCK 33016”，以DSMACC2219保藏)。类似地，参考文献43披露了生长在无血清培养悬液中的MDCK衍生细胞系(“B-702”，以FERM BP-7449保藏)。参考文献44披露了非致瘤性MDCK细胞，包括“MDCK-S”(ATCC PTA-6500)、“MDCK-SF101”(ATCCPTA-6501)、“MDCK-SF102”(ATCC PTA-6502)和“MDCK-SF103”(PTA-6503)。参考文献45披露了对感染高度敏感的MDCK细胞系，包括“MDCK.5F1”细胞(ATCC CRL-12042)。可使用任何这些MDCK细胞系。

如果利用哺乳动物细胞系培养病毒，则组合物优选不含卵蛋白质(例如，卵白蛋白和卵类黏蛋白)和鸡DNA，从而能降低变应原性。

如果用细胞系培养病毒，则生长培养基以及用于启动培养的病毒接种物优选不含(即，经测试得到污染的阴性结果)单纯疱疹病毒、呼吸道合胞体病毒、副流感病毒3、SARS冠状病毒、腺病毒、鼻病毒、呼肠病毒、多瘤病毒、双RNA病毒、环病毒和/或细小病毒[46]。特别优选不含单纯疱疹病毒。

对于用细胞系，例如MDCK细胞培养，可用悬液培养[47-49]或贴壁培养的细胞来培养病毒。用于悬液培养的一种合适的MDCK细胞系是MDCK33016(保藏号为DSMACC 2219)。或者，可采用微载体培养。

优选用无血清的培养基和/或无蛋白质的培养基培养支持流感病毒复制的细胞系。本发明将其中不含人或动物来源的血清添加剂的培养基称为无血清培养基。无蛋白质应理解为表示发生细胞增殖的培养基中不含蛋白质、生长因子、其它蛋白质添加剂和非血清蛋白质，但可包含病毒生长所需的蛋白质，例如胰蛋白酶或其它蛋白酶。在这种培养基中生长的细胞自身可天然含有蛋白质。

在病毒复制期间，支持流感病毒复制的细胞系优选在37℃以下生长，例如30-36℃[50]。

在培养的细胞中繁殖病毒的方法通常包括以下步骤：给培养的细胞接种待培养的毒株，将受感染的细胞培养病毒繁殖所需的时间，例如通过病毒滴度或抗原表达测定的(如，接种后24-168小时)，收集繁殖的病毒。以病毒和细胞之比为1:500-1:1，优选1:100-1:5，更优选1:50-1:10(通过PFU或TCID₅₀检测)接种培养的细胞。可将病毒加入细胞悬液中，或施加于细胞单层，病毒于25-40℃，优选28-37℃，在细胞上吸附至少60分钟，但通常少于300分钟，优选在90-240分钟之间。可通过冻融或酶促作用除去感染的细胞培养物(例如，单层)，从而增加了收集的培养上清液中的病毒含量。然后使收集的液体灭活或冷冻保存。以约0.0001-10，优选0.002-5，更优选0.001-2的感染复数(“m.o.i.”)感染培养的细胞。更优选以约0.01的m.o.i.感染细胞。感染后30-60小时收集感染的细胞。优选在感染后34-48小时收集细胞。更优选在感染后38-40小时收集细胞。通常在细胞培养期间加入蛋白酶(通常是胰蛋白酶)以释放病毒，可在培养期间的任何合适阶段加入蛋白酶。

血凝素(HA)是灭活流感疫苗中的主要免疫原，参考HA水平使疫苗剂量标准化，一般通过单向辐射状免疫扩散(SRID)试验检测。疫苗通常含有约15μgHA/毒株，虽然在例如儿童，或流行情况下还可使用较低的剂量。与较高剂量(例如，3×或9×剂量[53，54])一样，已使用了部分剂量，例如1/2(即，7.5μg HA/毒株)、1/4和1/8[51，52]。因此，疫苗可包含0.1-150μg HA/流感毒株，优选0.1-50μg，例如0.1-20μg、0.1-15μg、0.1-10μg、0.1-7.5μg、0.5-5μg，等等。具体的剂量包括，例如约45、约30、约15、约10、约7.5、约5、约3.8、约1.9、约1.5，等等。与本发明一样，当疫苗中存在佐剂时，这些较低的剂量最有用。

对于活疫苗，通过中值组织培养感染剂量(TCID₅₀)而不是HA含量来检测给药，每种毒株的TCID₅₀一般在10⁶-10⁸之间(优选10^6.5-10^7.5)。

本发明所用的HA可以是病毒中发现的天然HA，或者可经修饰。例如，已知可修饰HA以除去致使病毒在禽类中高度致病的决定簇(例如，围绕HA1和HA2之间的切割位点的超碱性区域(hyper-basic region))，否则这些决定簇可阻止病毒在卵中生长。

本发明试剂盒的抗原组分可包含洗涤剂，例如聚氧乙烯失水失水山梨糖醇酯表面活性剂(称为“吐温”)，辛苯聚醇(例如，辛苯聚醇-9(曲通X-100)或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)，溴化十六烷基三甲铵(CTAB)，或脱氧胆酸钠，特别是对于裂解或表面抗原疫苗。可以只存在痕量的洗涤剂。因此，疫苗中所含的辛苯聚醇-10、α-生育酚半琥珀酸酯(α-tocopheryl hydrogen succinate)和聚山梨醇酯80各自低于1mg/ml。其它痕量的残留组分可以是抗生素(例如，新霉素、卡那霉素、多粘菌素B)。

灭活但非全细胞的疫苗(例如，裂解病毒疫苗或纯化的表面抗原疫苗)可包含基质蛋白，从而受益于位于该抗原内的其它T细胞表位。因此，包含血凝素和神经氨酸酶的非全细胞疫苗(特别是裂解疫苗)还可包含M1和/或M2基质蛋白。如果存在基质蛋白，优选包含可检测水平的M2基质蛋白。还可存在核蛋白。

宿主细胞DNA

当用细胞系培养病毒时，标准方法是使最终疫苗中残余细胞系DNA的量最小化，以便使DNA的致癌活性最小化。因此，当用细胞系培养病毒，则每剂组合物优选含有少于10ng(优选少于1ng，更优选少于100pg)的残留宿主细胞DNA，虽然可以存在痕量的宿主细胞DNA。优选任何残余宿主细胞DNA的平均长度小于500bp，例如小于400bp、小于300bp、小于200bp、小于100bp，等等。总之，本发明组合物中的宿主细胞DNA不能长于100bp。

现在，检测残留的宿主细胞DNA是生物制品的常规要求，属于技术人员的普通能力。用于检测DNA的试验通常是确认试验[55，56]。可利用数学和可定量的术语描述确认试验的性能特征，已鉴定了其可能的误差来源。已总体上检验了该试验的诸如准确度、精密度、特异性等特征。一旦校验(例如，用已知标准量的宿主细胞DNA)及检验好某试验，可常规进行定量DNA检测。可采用三种主要的DNA定量技术：杂交方法，例如Sourthern印迹或槽印迹[57]；免疫测定方法，例如Threshold^TM系统[58]；和定量PCR[59]。技术人员熟知这些方法，虽然各方法的精确特征取决于所研究的宿主细胞，例如杂交探针的选择，扩增用引物和/或探针的选择，等等。分子装置公司(Molecular Devices)的Threshold^TM系统是用于皮克水平总DNA的定量试验，其已用于监测生物药品中的污染DNA水平[58]。典型的试验包括在生物素化的ssDNA结合蛋白、脲酶偶联的抗-ssDNA抗体和DNA之间非序列特异性地形成反应复合物。所有试验组分均装入购自生产商的完整的总DNA测定试剂盒(Total DNAAssay Kit)中。各种商品化生产商提供检测残留宿主细胞DNA的定量PCR试验，例如AppTec^TM实验室服务公司(AppTec^TM Laboratory Services)、BioReliance^TM、亚瑟技术公司(Althea Technologies)，等等。检测人病毒疫苗中宿主细胞DNA污染的化学发光杂交试验和总DNA Threshold^TM系统的比较见参考文献60。

可采用标准纯化方法，例如层析等在疫苗制备期间除去污染性DNA。通过核酸酶处理，例如用DNA酶可促进除去残留的宿主细胞DNA。参考文献59和60披露了减少宿主细胞DNA污染的便利方法，其涉及两步处理，首先可在病毒培养期间使用DNA酶(例如，Benzonase)，然后可在病毒粒子破裂期间使用阳离子洗涤剂(例如，CTAB)。用烷化剂，例如β-丙内酯处理也可用于除去宿主细胞DNA，该方法还可优选用于灭活病毒粒子[63]。

优选在每15μg血凝素中含有<10ng(例如，<1ng、<100pg)宿主细胞DNA的疫苗，例如每0.25ml体积含有<10ng(例如，<1ng、<100pg)宿主细胞DNA的疫苗。更优选在每50μg血凝素中含有<10ng(例如，<1ng、<100pg)宿主细胞DNA的疫苗，例如每0.5ml体积含有<10ng(例如，<1ng、<100pg)宿主细胞DNA的疫苗。

佐剂

本发明涉及首先施用添加佐剂的疫苗。之后的疫苗可以是未添加佐剂的，或者可以是添加佐剂的，但该佐剂与初次施用时的佐剂不同。佐剂的功能可以是增强在接受组合物的患者中引起的免疫应答(体液免疫和/或细胞免疫)。

适用于第一疫苗并可任选用于之后的疫苗剂量的佐剂包括但不限于：

·含矿物质的组合物，包括钙盐和铝盐(或其混合物)。钙盐包括磷酸钙(例如参考文献64中所述的＂CAP＂颗粒)。铝盐包括氢氧化物、磷酸盐、硫酸盐等等，该盐可采取任何合适形式(例如凝胶、结晶、无定形，等等)。优选吸附在这些盐上。含矿物质的组合物也可被制成金属盐颗粒[65]。铝盐佐剂将在下文中更详细地描述。

·水包油乳液，如下文中更加详细地描述。

·免疫刺激性寡核苷酸，如下文中更加详细地描述。

·3-O-脱酰基单磷酰脂质A(‘3dMPL’，也称为‘MPL^TM，)，如下文中更加详细地描述。

·咪唑并喹啉化合物，例如咪喹莫特(“R837”)[66，67]、瑞喹莫德(“R-848”)[68]和它们的类似物；和它们的盐(例如，盐酸盐)。免疫刺激性咪唑并喹啉的其它细节见参考文献69-73。

·缩氨基硫脲化合物，例如参考文献74披露的那些。参考文献74还描述了配制、制造和筛选活性化合物的方法。缩氨基硫脲对于刺激人外周血单核细胞产生细胞因子如TNF-α尤其有效。

·核苷类似物，例如：(a)艾沙托拉滨(Isatorabine)(ANA-245；7-硫杂-8-氧代鸟苷)及其前药：

(b)ANA975；(c)ANA-025-1；(d)ANA380；(e)参考文献75-77所述的化合物；(f)下式所示化合物：

式中：

R₁和R₂各自独立为H、卤素、-NR_aR_b、-OH、C_1-6烷氧基、取代的C_1-6烷氧基、杂环基、取代的杂环基、C_6-10芳基、取代的C_6-10芳基、C_1-6烷基或取代的C_1-6烷基；

R₃不存在，或是H、C_1-6烷基、取代的C_1-6烷基、C_6-10芳基、取代的C_6-10芳基、杂环基或取代的杂环基；

R₄和R₅各自独立为H、卤素、杂环基、取代的杂环基、-C(O)-R_d、C_1-6烷基、取代的C_1-6烷基，或结合在一起形成5元环，如R_4-5：

在所示键处实现结合。

X₁和X₂各自独立为N、C、O或S；

R₈是H、卤素、-OH、C_1-6烷基、C_2-6烯基、C_2-6炔基、-OH、-NR_aR_b、-(CH₂)_n-O-R_c、-O-(C_1-6烷基)、-S(O)_pR_e或-C(O)-R_d；

R₉是H、C_1-6烷基、取代的C_1-6烷基、杂环基、取代的杂环基或R_9a，其中R_9a是：

在所示键处实现结合。

R₁₀和R_u各自独立为H、卤素、C_1-6烷氧基、取代的C_1-6烷氧基、-NR_aR_b或-OH；

R_a和R_b各自独立为H、C_1-6烷基、取代的C_1-6烷基、-C(O)R_d、C_6-10芳基；

R_c各自独立为H、磷酸酯基、二磷酸酯基、三磷酸酯基、C_1-6烷基或取代的C_1-6烷基；

R_d各自独立为H、卤素、C_1-6烷基、取代的C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、取代的C_1-6烷氧基、-NH₂、-NH(C_1-6烷基)、-NH(取代的C_1-6烷基)、-N(C_1-6烷基)₂、-N(取代的C_1-6烷基)₂、C_6-10芳基或杂环基；

R_e各自独立为H、C_1-6烷基、取代的C_1-6烷基、C_6-10芳基、取代的C_6-10芳基、杂环基或取代的杂环基；

R_f各自独立地为H、C_1-6烷基、取代的C_1-6烷基、-C(O)R_d、磷酸酯基、二磷酸酯基或三磷酸酯基；

n各自独立为0、1、2或3；

p各自独立为0、1或2；或者

(g)(a)-(f)中任一项的药学上可接受的盐，(a)-(f)中任一项的互变异构体，或该互变异构体的药学上可接受的盐。

·色胺酮化合物，例如参考文献78披露的那些。参考文献78还描述了配制、制造和筛选活性化合物的方法。缩氨基硫脲对于刺激人外周血单核细胞产生细胞因子如TNF-α尤其有效。

·罗唑利宾(Loxoribine)(7-烯丙基-8-氧代鸟苷)[79]。

·参考文献80披露的化合物，包括：酰基哌嗪化合物、吲哚二酮(Indoledione)化合物、四氢异喹啉(THIQ)化合物、苯并环二酮(Benzocyclodione)化合物、氨基氮杂乙烯基(Aminoazavinyl)化合物、氨基苯并咪唑喹啉酮(Aminobenzimidazole quinolinone)(ABIQ)化合物[81，82]、羟邻苯二甲酰胺(Hydrapthalamide)化合物、二苯甲酮化合物、异噁唑化合物、固醇化合物、喹唑酮(Quinazilinone)化合物、吡咯化合物[83]、蒽醌化合物、喹喔啉化合物、三嗪化合物、吡唑嘧啶(Pyrazalopyrimidine)化合物和氮茚(Benzazole)化合物[84]。

·参考文献85披露的化合物，包括3，4-二(1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2，5-二酮、星形孢菌素类似物、衍生的哒嗪、色烯-4-酮、吲哚酮、喹唑啉和核苷类似物。

·氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸盐衍生物，如RC-529[86，87]。

·磷腈，例如参考文献88和89中描述的聚[二(羧基苯氧基)磷腈](“PCPP”，poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazene])。

·小分子免疫增强剂(SMIP)，例如：

N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

N2，N2-二甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

N2-乙基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

1-(2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

N2-丁基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

N2-丁基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-戊基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-丙-2-烯基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

1-(2-甲基丙基)-2-[(苯基甲基)硫]-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺；

1-(2-甲基丙基)-2-(丙硫基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺；

2-[[4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙醇；

2-[[4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙基乙酸酯；

4-氨基-1-(2-甲基丙基)-1，3-二氢-2H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2-酮；

N2-丁基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

N2-丁基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

N2，N2-二甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-双(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；

1-{4-氨基-2-[甲基(丙基)氨基]-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基}-2-甲基丙-2-醇；

1-[4-氨基-2-(丙基氨基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-1-基]-2-甲基丙-2-醇；

N4，N4-二苄基-1-(2-甲氧基-2-甲基丙基)-N2-丙基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺。

·皂苷[参考文献131第22章]，皂苷是甾醇糖苷类(glycoside)和三萜系糖苷类的异种类型，其存在于众多植物种类的树皮、叶、茎、根以及甚至花中。已对作为佐剂的从皂树皮(Quillaia saponaria Molina)中分离的皂苷进行了广泛的研究。皂苷还可从商业途径获自丽花菝葜(Smilax ornata)(墨西哥菝葜，sarsaprilla)、满天星(Gypsophilla paniculata)(brides veil)和肥皂草(Saponariaofficianalis)(皂根，soap root)。皂苷佐剂制剂包括纯化的制剂，例如QS21，以及脂质制剂，例如ISCOM。QS21的商品名为Stimulon^TM。已通过HPLC和RP-HPLC纯化了皂苷组合物。已对用这些技术获得的特定纯化部分进行了鉴别，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。优选地，所述皂苷是QS21。生产QS21的方法描述于参考文献90。皂苷制剂还可包括甾醇，例如胆固醇[91]。可将皂苷和胆固醇的组合用于形成被称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒[参考文献131第23章]。ISCOM通常还包括磷脂，例如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。可将任何已知的皂苷用于ISCOM中。优选地，ISCOM包括Quil A、QHA和QHC中的一种或多种。ISCOM在参考文献91-中有进一步的描述。任选地，ISCOMS可不含一种或多种其它去污剂[94]。有关皂苷基佐剂的发展可见参考文献95和96。

·细菌ADP-核糖基化毒素(例如大肠杆菌不耐热肠毒素“LT”、霍乱毒素“CT”、或百日咳毒素“PT”)以及它们的解毒衍生物，如称为LT-K63和LT-R72的突变体毒素[97]。将解毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐剂描述于参考文献98，用作肠胃外佐剂描述于参考文献99。

·生物粘附剂和粘膜粘着剂，如酯化的透明质酸微球[100]或脱乙酰壳多糖及其衍生物[101]。

·由生物可降解和无毒性材料形成的微粒(即直径为约100nm到约150μm，更优选约200nm到约30μm，或者约500nm到约10μm的颗粒)，所述材料例如聚(α-羟酸)、聚羟丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚已酸内酯等等，其中优选聚(丙交酯-共-乙交酯)，任选地对其处理，使其具有带负电荷表面(例如用SDS处理)或带正电荷表面(例如用阳离子型去污剂，例如CTAB)处理。

·脂质体(参考文献131第13和14章)。适合用于佐剂的脂质体制剂的例子描述于参考文献102-104。

·聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[105]。此类制剂还包括与辛苯聚醇(octoxynol)组合的聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂[106]，以及与至少一种其它非离子型表面活性剂(例如辛苯聚醇)组合的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂[107]。优选的聚氧乙烯醚选自下组：聚氧乙烯-9-月桂醚(月桂醇聚醚9)、聚氧乙烯-9-硬脂酰基(steoryl)醚、聚氧乙烯-8-硬脂酰基醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。

·胞壁酰肽，例如N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(“thr-MDP”)、N-乙酰基-去甲胞壁酰-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(“nor-MDP”)、N-乙酰基葡糖胺-N-乙酰基胞壁酰-L-A1-D-异谷-L-Ala-二棕榈酰丙酰胺(N-acetylglucsaminyl-N-acetylmuramyl-L-A1-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxypropylamide)(“DTP-DPP”，或“Theramide^TM”)或N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(“MTP-PE”)。

·从第一种革兰氏阴性菌制备的外膜蛋白蛋白体制品与衍生自第二种革兰氏阴性菌的脂多糖(LPS)制品的组合，其中所述外膜蛋白蛋白体和LPS制品形成稳定的非共价佐剂复合物。这种复合物包括“IVX-908”(包含脑膜炎奈瑟氏球菌外膜和LPS的复合物)。它们已被用作流感疫苗的佐剂[108]。

·polyoxidonium聚合物[109，110]或其它N-氧化的聚乙烯-哌嗪衍生物。

·甲基肌苷5′-单磷酸酯(“MIMP”)[111]。

·多羟基化吡咯双烷(pyrrolizidine)化合物[112]或其药学上可接受的盐或衍生物，例如下式所示：

其中R选自下组：氢，直链或支链、未取代或取代的、饱和或不饱和的酰基、烷基(例如，环烷基)、烯基、炔基和芳基。例子包括但不限于：木麻黄素(casuarine)、木麻黄素-6-α-D-吡喃型葡萄糖、3-表-木麻黄素、7-表-木麻黄素、3，7-二表-木麻黄素，等等。

·CD1d配体，如α-糖基神经酰胺[113-120](例如α-半乳糖苷神经酰胺)、含有植物鞘氨醇的α-糖基神经酰胺、OCH、KRN7000[(2S，3S，4R)-1-O-(α-D-半乳糖苷吡喃糖基)-2-(N-二十六烷基氨基)-1，3，4-十八烷三醇]、CRONY-101、3＂-O-磺基-半乳糖苷神经酰胺，等等。

·γ菊粉[121]或其衍生物，如algammulin。

·式I、II或III所示化合物，或它们的盐：

如参考文献122所述，如′ER 803058′、′ER 803732′、′ER 804053′、′ER804058′、′ER 804059′、′ER 804442′、′ER 804680′、′ER 804764′、ER 803022或‘ER 804057’，例如：

·大肠杆菌脂质A衍生物，如OM-174(描述于参考文献123和124)。

·阳离子脂质和(通常是中性的)辅脂质(co-lipid)形成的制剂，如氨基丙基-二甲基-肉豆寇基氧基-丙基溴化铵-二植烷基磷脂酰基-乙醇胺(＂Vaxfectin^TM＂)或氨基丙基-二甲基-双-十二烷基氧基-丙基溴化铵-二油酰基磷脂酰基-乙醇胺(“GAP-DLRIE：DOPE”)。优选含(±)-N-(3-氨基丙基)-N，N-二甲基-2，3-双(合-9-十四烷基氧基)-1-丙基铵盐的制剂[125]。

·含有连接于含磷酸无环主链的脂质的化合物，例如TLR4拮抗剂E5564[126、127]：

这些佐剂和其他佐剂活性物质更加详细描述于参考文献131和132。

用于本发明的佐剂可以是Toll样受体(TLR)调节剂和/或激动剂。例如，它们可以是人TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和/或TLR9蛋白中的一种或多种的激动剂。优选的免疫增强剂是TLR7的激动剂(例如，咪唑并喹啉类)和/或更优选TLR9的激动剂(例如，CpG寡核苷酸)。这些免疫增强剂可用于活化先天免疫途径。

一种疫苗可包含两种或多种所述佐剂。

组合物中的抗原和佐剂通常是掺合在一起的。

铝盐佐剂

合适的铝盐包括称为氢氧化铝和磷酸铝的佐剂。这些名称是惯常的，但只是为方便而使用，并未精确描述所存在的实际化学构成[例如，见参考文献131的第9章]。本发明可用常规用作佐剂的任何“氢氧化物”或“磷酸盐”佐剂。

称为“氢氧化铝”的佐剂一般是羟基氧化铝盐，其通常至少部分结晶。羟基氧化铝以分子式AlO(OH)表示，其与其它铝化合物，例如氢氧化铝Al(OH)₃的区别在于红外(IR)光谱，特别是在1070cm^-1处存在吸收带和在3090-3100cm^-1处存在强烈的肩峰[参考文献131的第9章]。半峰高处衍射带的宽度(WHH)反映了氢氧化铝佐剂的结晶程度，结晶不佳的颗粒因晶体尺寸较小而显示更强的谱线增宽。表面积随WHH的增加而增加，WHH值较大的佐剂显示吸附抗原的能力较强。氢氧化铝佐剂呈典型的纤维形态(例如，电子透射显微照片所见的)。氢氧化铝佐剂的pI通常约11，即在生理pH下佐剂本身具有表面正电荷。据报道，pH7.4时，氢氧化铝佐剂的吸附能力在每mg Al⁺⁺⁺ 1.8-2.6mg蛋白质之间。

称为“磷酸铝”的佐剂一般是羟基磷酸铝，这些佐剂也常含有少量硫酸根(即，羟基磷酸硫酸铝)。可通过沉淀获得这些佐剂，沉淀期间的反应条件和浓度影响磷酸根取代该盐中羟基的程度。羟基磷酸盐中PO₄/Al摩尔比通常在0.3-1.2之间。羟基磷酸盐因存在羟基而有别于严格的AlPO₄。例如，3164cm^-1的IR光谱带(例如，当加热至200℃时)表明存在结构性羟基[参考文献131的第9章]。

磷酸铝佐剂的PO₄/Al³⁺摩尔比通常在0.3-1.2之间，优选在0.8-1.2之间，更优选0.95±0.1。磷酸铝通常是无定形的，特别是羟基磷酸盐。典型的佐剂是PO₄/Al³⁺摩尔比在0.84-0.92之间，含0.6mg Al³⁺/ml的无定形羟基磷酸铝。磷酸铝通常是颗粒状的(例如，电子透射显微照片中所见的平板样形态)。这些颗粒在吸附任何抗原后的典型直径是0.5-20μm(例如，约5-10μm)。据报道，pH7.4时，磷酸铝佐剂的吸附能力在每mgAl⁺⁺⁺0.7-1.5mg蛋白质之间。

磷酸铝的零电荷点(PZC)与磷酸根取代羟基的程度成反比，而该取代程度依据沉淀制备该盐所用的反应条件和反应物浓度而不同。也可通过改变溶液中游离磷酸根离子的浓度(磷酸根越多＝PZC酸性越高)或通过添加例如组氨酸缓冲液(使得PZC更具碱性)等缓冲液来改变PZC。本发明所用磷酸铝的PZC通常在4.0-7.0之间，更优选在5.0-6.5之间，例如约5.7。

本发明所用的铝盐悬液可含有缓冲液(例如，磷酸或组氨酸或Tris缓冲液)，但不一定。这些悬液优选无菌、无热原。悬液可含有游离的水性磷酸根离子，例如浓度在1.0-20mM之间、优选在5-15mM之间、更优选约10mM。这些悬液也可含有氯化钠。

本发明可使用佐剂包含氢氧化铝和磷酸铝的混合物。在这种情况中，磷酸铝可能多于氢氧化铝，例如重量比至少为2:1，例如≥5:1、≥6:1、≥7:1、≥8:1、≥9:1，等等。

给予患者的组合物中Al⁺⁺⁺的浓度优选低于10mg/ml，例如≤5mg/ml、≤4mg/ml、≤3mg/ml、≤2mg/ml、≤1mg/ml，等等。优选的范围在0.3-1mg/ml之间。优选最大<0.85mg/剂。

水包油乳液佐剂

已发现水包油乳液特别适用于佐剂配制的流感病毒疫苗中。已知各种这样的乳液，它们通常包含至少一种油和至少一种表面活性剂，其中一种或多种油和一种或多种表面活性剂是生物可降解(可代谢)和生物相容的。乳液中的油滴通常直径低于5μm，甚至可具有亚微米直径，用微流化仪可实现这些小尺寸，从而能提供稳定的乳液。优选尺寸小于220nm的油滴，因为能对它们进行过滤灭菌。

本发明可使用诸如动物来源(例如鱼)或植物来源的油。植物油来源包括坚果、种子和谷物。坚果油的例子是最常购得的花生油、大豆油、椰油和橄榄油。例如，可利用从霍霍巴豆(jojoba bean)获得的霍霍巴油。种子油包括红花油、棉籽油、葵花籽油、芝麻油等。在谷物油中，玉米油是最易购得的，但其它谷物如小麦、燕麦、黑麦、大米、画眉草(teff)、黑小麦等的油也可利用。通过水解、分离和酯化合适的坚果和种子油起始物质可制备种子油中天然不存在的甘油和1，2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯。哺乳动物乳汁的脂肪和油类是可代谢的，因此可用于实施本发明。本领域熟知从动物来源获得纯油所需的分离、纯化、皂化和其它方法。大多数鱼含有不难回收的可代谢油。例如，本发明可用的几种鱼油的例子是鳕鱼肝油、鲨鱼肝油和鲸油，如鲸蜡。可以5-碳异戊二烯单位通过生物化学方法合成许多支链油，这些支链油通常称为类萜。鲨鱼肝油含有称为角鲨烯(2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四己烯(tetracosahexaene))的支链不饱和类萜，这是本发明特别优选的。角鲨烷是角鲨烯的饱和类似物，其也是优选的油。包含角鲨烯和角鲨烷的鱼油不难从商业来源购得，或可通过本领域已知的方法获得。其它优选的油是生育酚(参见下文)。可利用油的混合物。

可根据表面活性剂的“HLB”(亲水/亲油平衡)将其分类。优选的本发明表面活性剂的HLB至少为10，优选至少15，更优选至少16。本发明可用的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯失水山梨糖醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80；环氧乙烷(EO)、环氧丙烷(PO)和/或环氧丁烷(BO)的共聚物，以DOWFAX^TM为商品名出售，例如线形EO/PO嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧-1，2-乙二基)基团数目可能不同的辛苯聚醇，其中特别感兴趣的是辛苯聚醇-9(曲通X-100或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂，例如磷脂酰聚胆碱(卵磷脂)；壬基苯酚乙氧基化物，例如Tergitol^TMNP系列；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(称为Brij表面活性剂)，例如三乙烯乙二醇单月桂基醚(triethyleneglycol monolauryl ether)(Brij 30)；和失水山梨糖醇酯(通常称为司盘(SPAN))，例如失水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和失水山梨糖醇单月桂酸酯。优选非离子型表面活性剂。乳液中所含的优选表面活性剂是吐温80(聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯)、司盘85(失水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-100。

可利用表面活性剂的混合物，例如吐温80/司盘85混合物。聚氧乙烯失水山梨糖醇酯，例如聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯(吐温80)和辛苯聚醇，例如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(曲通X-100)的混合物也适用。另一有用的混合物包含月桂醇聚醚9加上聚氧乙烯失水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。

表面活性剂的优选用量(重量％)是：聚氧乙烯失水山梨糖醇酯(例如，吐温80)0.01-1％，特别是约0.1％；辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(例如曲通X-100或曲通系列的其它洗涤剂)0.001-0.1％，特别是0.005-0.02％；聚氧乙烯醚(例如月桂醇聚醚9)0.1-20％，优选0.1-10％，特别是0.1-1％或约0.5％。

本发明所用的具体水包油乳液佐剂包括但不限于：

·角鲨烯、吐温80和司盘85的亚微米乳液。以体积计，所述乳液的组成可以是约5％角鲨烯，约0.5％聚山梨醇酯80和约0.5％司盘85。以重量计，这些比例可以是4.3％角鲨烯，0.5％聚山梨醇酯80和0.48％司盘85。该佐剂称为“MF59”[8-10]，如参考文献11的第10章和参考文献12的第12章所详述的。MF59乳液优选包含柠檬酸离子，例如10mM柠檬酸钠缓冲液。

·角鲨烯、生育酚和吐温80的乳液。该乳液可包含磷酸缓冲盐水。其还可包含司盘85(例如，1％)和/或卵磷脂。这些乳液可具有2-10％角鲨烯、2-10％生育酚和0.3-3％吐温80，角鲨烯：生育酚的重量比优选≤1，因为这能提供更稳定的乳液。角鲨烯和吐温80的体积比可以约为5:2。可将吐温80溶解于PBS中获得2％的溶液，然后将90ml该溶液与(5g DL-α-生育酚和5ml角鲨烯)的混合物混合，随后微流化该混合物来制备这样一种乳液。得到的乳液可具有亚微米油滴，例如平均直径在100-250nm之间，优选约180nm。

·角鲨烯、生育酚和曲通洗涤剂(例如，曲通X-100)的乳液。该乳液还可包含3d-MPL(见下文)。该乳液可包含磷酸缓冲液。

·含有聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯80)、曲通洗涤剂(例如，曲通X-100)和生育酚(例如，α-生育酚琥珀酸酯)的乳液。该乳液所包含的这三种组分的质量比约为75:11:10(例如，750μg/ml聚山梨醇酯80，110μg/ml曲通X-100和100μg/mlα-生育酚琥珀酸酯)，这些浓度应包括这些组分与抗原的任何比例。该乳液还可包含角鲨烯。该乳液还可包含3d-MPL(见下文)。水相可含有磷酸缓冲液。

·角鲨烷、聚山梨醇酯80和泊洛沙姆401(＂Pluronic^TM L121＂)的乳液。可以用磷酸缓冲盐水，pH7.4配制该乳液。该乳液是一种有用的胞壁酰二肽递送载体，已与用＂SAF-I＂佐剂(0.05-1％Thr-MDP、5％角鲨烯烷、2.5％ Pluronic L121和0.2％聚山梨醇酯80)配制的苏氨酰-MDP联用[133]。也可不与Thr-MDP联用，例如用＂AF＂佐剂(5％角鲨烷、1.25％ Pluronic L121和0.2％聚山梨醇酯80)配制[134]。优选微流体化。

·包含角鲨烯、水性溶剂、聚氧乙烯烷基醚亲水性非离子型表面活性剂(例如聚氧乙烯(12)鲸蜡基/硬脂基醚)和疏水性非离子型表面活性剂(例如失水山梨糖醇酯或二缩甘露醇酯，如失水山梨糖醇单油酸酯或‘司盘80’)的乳液。乳液优选是热致可逆的和/或至少90％油滴(按体积计)的大小小于200nm[135]。乳液中还可包含以下一种或多种：醛醇；冷冻保护剂(例如糖，如十二烷基麦芽苷和/或蔗糖)；和/或烷基聚糖苷。这种乳液可被冻干。

·乳液可具有0.5-50％的油、0.1-10％磷脂和0.05-5％非离子表面活性剂。如参考文献15所述，优选的磷脂组分是磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。优选亚微米液滴大小。

·不可代谢的油(例如，轻质矿物油)和至少一种表面活性剂(例如，卵磷脂、吐温80或司盘80)的亚微米水包油乳液。可包含添加剂，例如QuilA皂苷、胆固醇、皂苷-亲脂偶联物(例如，参考文献137所述的GPI-0100，通过将脂族胺通过葡糖醛酸的羧基加成到脱酰基皂苷上制备)、二甲基二(十八烷基)溴化铵和/或N，N-二(十八烷基)-N，N-二(2-羟乙基)丙二胺。

·其中皂苷(例如，QuilA或QS21)和固醇(例如，胆固醇)结合成螺旋状胶束的乳液[138]。

·包含矿物油、非离子亲脂性乙氧基化脂肪醇和非离子亲水性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[139]。

·包含矿物油、非离子亲脂性乙氧基化脂肪醇和非离子亲脂性表面活性剂(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[139]。

这些乳液优选在递送之时与抗原临时混合。因此，在包装或分发的疫苗中，佐剂和抗原通常分开存放，最后在使用时即时配制。抗原一般存在水性形式，从而最终可通过混合两种液体来制备疫苗。用于混合的两种液体的体积比可以不同(例如，在5:1和1:5之间)，但通常是约1:1。

抗原和佐剂混合后，血凝素抗原通常维持在水溶液中，但其自身可能分配在油/水界面附近。进入乳液的油相的血凝素通常极少(如果有的话)。

如果组合物包含生育酚，α、β、γ、δ、ε或ξ生育酚均可用，但优选α-生育酚。生育酚可采取几种形式，例如不同的盐和/或异构体。盐包括有机盐，例如琥珀酸盐、乙酸盐、烟酸盐等等。D-α-生育酚和DL-α-生育酚均可用。老年患者(例如，60岁或更大)所用的疫苗中优选包含生育酚，因为据报道维生素E在该患者组中对免疫应答有正面影响[140]。它们还具有抗氧化特性，从而有助于稳定溶液[141]。优选的α-生育酚是DL-α-生育酚，该生育酚的优选盐是琥珀酸盐。现已发现琥珀酸盐在体内能与TNF-相关的配体协作。此外，已知α-生育酚琥珀酸盐与流感疫苗相容，是替代汞化合物的有用防腐剂[10]。

免疫刺激性寡核苷酸

免疫刺激性寡核苷酸可包含核苷酸修饰/类似物，如硫代磷酸酯修饰，可以是双链或(除了dsRNA)单链。参考文献142、143和144披露了可能的类似取代，例如用2’-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献145-150进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂作用。CpG序列可涉及TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[151]。CpG序列可特异性诱导Th1免疫应答，例如CpG-A ODN(寡聚脱氧核苷酸)，或更特异地诱导B细胞应答，例如CpG-B ODN。参考文献152-154讨论了CpG-A和CpG-B ODN。CpG优选CpG-A ODN。优选将CpG寡核苷酸构建为5’端易于为受体识别。任选将两条CpG寡核苷酸序列在它们的3’端相连以形成“免疫聚体”(immunomer)。参见，例如参考文献151和155-157。有用的CpG佐剂是CpG7909，其也称为ProMune^TM(格雷药物有限公司(ColeyPharmaceutical Group，Inc.))。

除使用CpG序列以外，还可使用TpG序列[158]。这些寡核苷酸可不含未甲基化的CpG基序。

免疫刺激性寡核苷酸可以富含嘧啶。例如，其可包含多个连续的胸苷核苷酸(例如，参考文献158所述的TTTT)，和/或其核苷酸组成可含有>25％的胸苷(例如，>35％、>40％、>50％、>60％、>80％，等等)。例如，其可包含多个连续的胞嘧啶核苷酸(例如，参考文献158所述的CCCC)，和/或其核苷酸组成可含有>25％的胞嘧啶(例如，>35％、>40％、>50％、>60％、>80％，等等)。这些寡核苷酸可不含未甲基化的CpG基序。

免疫刺激性寡核苷酸通常包含至少20个核苷酸。它们可包含少于100个核苷酸。

3脱-O-酰化单磷酰基脂质A

3dMPL(也称为3脱-O-酰化单磷酰基脂质A或3-O-脱酰基-4′-单磷酰基脂质A)是单磷酰基脂质A中还原端葡糖胺的3位被脱酰化的佐剂。3dMPL从明尼苏达沙门菌(Salmonella minnesota)的无庚糖突变体(heptoseless mutant)制备，其在化学上类似于脂质A但缺乏酸不稳定的磷酰基和碱不稳定的酰基。它活化单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞，刺激几种细胞因子释放，包括IL-1、IL-12、TNF-α和GM-GSF(还可见参考文献159)。参考文献160最先描述了3dMPL的制备。

3dMPL可采取酰化程度不同的相关分子混合物的形式(例如，具有长度可能不同的3、4、5或6条酰基链)。两个葡糖胺(也称为2-脱氧-2-氨基-葡萄糖)单糖的2-位碳(即，2和2’位)被N-酰基化，3’位也被O-酰基化。与碳2相连的基团如式-NH-CO-CH₂-CR¹R^1′所示。与碳2’相连的基团如式-NH-CO-CH₂-CR²R²所示。与碳3’相连的基团如式-O-CO-CH₂-CR³R^3′所示。代表性的结构是：

基团R¹、R²和R³各自独立为-(CH₂)_n-CH₃。n值优选在8-16之间，更优选在9-12之间，最优选10。

基团R^1’、R^2’和R^3’各自独立为：(a)-H；(b)-OH；或(c)-O-CO-R⁴，其中R⁴是-H或-(CH₂)_m-CH₃，其中m值优选在8-16之间，更优选10、12或14。在2位，m优选14。在2′位，m优选10。在3′位，m优选12。因此基团R^1’、R^2’和R^3’优选十二烷酸、十四烷酸和十六烷酸的-O-酰基。

当R^1’、R^2’和R^3’均是-H时，3d-MPL只有3条酰基链(2、2′和3′位上各有一条)。当R^1’、R^2’和R^3’中只有两个是-H时，3d-MPL可具有4条酰基链。当R^1’、R^2’和R^3’中只有一个是-H时，3d-MPL可具有5条酰基链。当R^1’、R^2’和R^3’中无一是-H时，3d-MPL可具有6条酰基链。本发明所用3d-MPL佐剂可以是具有3-6条酰基链的这些形式的混合物，但优选混合物中包含具有6条酰基链的3d-MPL，特别是要确保以重量计6酰基链形式至少占总3d-MPL的10％，例如≥20％、≥30％、≥40％、≥50％或更高。发现具有6条酰基链的3d-MPL是最有活性的佐剂形式。

因此，本发明组合物包含的3dMPL最优选形式是：

当采用混合物形式的3dMPL时，提及本发明组合物中3dMPL的用量或浓度指该混合物中混合的3dMPL诸种类。

在水性条件下，3dMPL可形成大小不同，例如直径<150nm或>500nm的胶束凝聚物或颗粒。本发明可使用任一种或二者，通过常规试验可选择较佳的颗粒。较小的颗粒因其较佳的活性而优选用于本发明(例如，足够小从而能得到3dMPL的透明水性混悬液)[161]。优选颗粒的平均直径小于220nm，更优选小于200nm或小于150nm或小于120nm，平均直径甚至可以小于100nm。然而，在大多数情况中，平均直径不会小于50nm。这些颗粒足够小，从而适于过滤灭菌。可通过动态光散射的常规技术评估颗粒直径，该技术能揭示平均颗粒直径。当说到颗粒的直径为xnm时，颗粒分布一般在该平均值附近，但以数量计至少50％(例如，≥60％、≥70％、≥80％、≥90％或更多)的颗粒的直径在x±25％范围内。

3dMPL与水包油乳液组合使用是有利的。最好基本上所有3dMPL位于乳液的水相中。

可单独使用3dMPL，或与一种或多种其它化合物联用。例如，可将3dMPL与下述物质联用：QS21皂苷[162](包含在乳液中[163])、免疫刺激性寡核苷酸、QS21和免疫刺激性寡核苷酸、磷酸铝[164]、氢氧化铝[165]、或者磷酸铝和氢氧化铝。

优选的佐剂添加方案

本发明的给药方案包括首先施用添加佐剂的流感疫苗。用于这种首次疫苗的优选佐剂是水包油乳液。

两剂量方案的第二剂量优选是未添加佐剂的。或者，它可以是添加佐剂的，但采用与第一剂量不同的佐剂。当第一剂量中添加有水包油乳液作为佐剂时，添加佐剂的第二剂量的优选佐剂包括铝盐。

药物组合物

本发明组合物是药学上可接受的且通常为含水形式。除了抗原(以及合适的佐剂)，它们通常包含一种或多种药物载体和/或赋形剂。对这些组分的充分讨论见参考文献166。

组合物可包含一种或多种防腐剂，例如硫柳汞或2-苯氧基乙醇。然而，这些疫苗优选基本上不含(即，少于5μg/ml)汞物质，例如不含硫柳汞[10,167]。更优选不含汞的疫苗。特别优选不含防腐剂的疫苗。

优选包含生理盐，例如钠盐以控制张力。优选1-20mg/ml之间的氯化钠(NaCl)。可存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、脱水磷酸氢二钠(disodiumphosphate dehydrate)、氯化镁、氯化钙等。

组合物的重量克分子渗透浓度通常在200mOsm/kg-400mOsm/kg之间，优选240-360mOsm/kg之间，更优选处于290-310mOsm/kg范围内。以前有报道说重量克分子渗透浓度对疫苗接种所致的疼痛没有影响[168]，但最好将重量克分子渗透浓度维持在该范围内。

组合物可包含一种或多种缓冲液。典型的缓冲液包括：磷酸缓冲液；Tris缓冲液；硼酸缓冲液；琥珀酸缓冲液；组氨酸缓冲液；或柠檬酸缓冲液。所含的缓冲液范围一般是5-20mM。

组合物的pH通常在5.0-8.1之间，更常见在6.0-8.0之间，例如6.5和7.5之间，或7.0-7.8之间。因此，本发明方法可包括先调节散装疫苗的pH再包装的步骤。

组合物优选无菌。组合物优选无热原，例如每剂量含有<1EU(内毒素单位，标准量度)，优选每剂量<0.1EU。组合物优选无谷蛋白。

组合物可包含一次免疫的物质，或可包含多次免疫的物质(即，“多剂量”试剂盒)。在多剂量配置中，优选包含防腐剂。除了在多剂量组合物中包含防腐剂以外，还可将组合物置于装有用于转移物质的无菌适配器的容器中。

一般给予的流感疫苗剂量体积是约0.5ml，但可将半剂量(即，约0.25ml)给予儿童(例如36个月以上的儿童)。

组合物和试剂盒优选保存在2℃-8℃之间。不应冷冻它们。最好避免有光直射。

本发明的试剂盒

本发明包括装有第一流感疫苗和进一步的流感疫苗的试剂盒。一种试剂盒组分将是添加佐剂的第一疫苗，而另一种试剂盒组分将是任选添加佐剂的进一步的疫苗。这两种组分将单独放置，从而可在完全不同的时间将它们给予患者。

试剂盒中的各个疫苗可以是立即可用的，或者可以在给药时临时制备。这种临时制备的安排要将佐剂可抗原单独存放直到使用，当使用水包油乳液佐剂时这将特别有利。

当疫苗是临时制备时，其组分在试剂盒内相互物理隔开，且这种分离可通过各种途径实现。例如，两个组分可处于两个单独容器如小瓶内。然后可取出一个小瓶的内含物并将其加入另一小瓶，或者分别取出两小瓶的内含物并在第三容器中混合而混合两小瓶的内含物。在优选的配置中，试剂盒诸组分之一存于注射器中，其它组分存于容器，例如小瓶中。可利用注射器(例如，装有针头)将其内含物注入第二容器中进行混合，然后将混合物抽入该注射器中。随后将该注射器中的混合内含物给予患者，通常利用新的无菌针头。将一种组分包装在注射器中无需利用另一注射器来给予患者。在另一优选配置中，将两种试剂盒组分分别保存在同一注射器，例如双室注射器中，如参考文献169-176等所披露的。使用该注射器(例如，给予患者期间)之时即混合了该两室中的内含物。该配置在使用时无需单独的混合步骤。

当疫苗是临时制备时，其组分通常处于水性形式。在一些配置中，某组分(一般是抗原组分而不是佐剂组分)处于干燥形式(例如，冻干的形式)，另一组分处于水性形式。可以混合所述两种组分以再活化干组分，从而获得给予患者的水性组合物。冻干组分通常保存于小瓶而不是注射器内。干燥的组分可以包含稳定剂，例如乳糖、蔗糖或甘露醇以及它们的混合物，例如乳糖/蔗糖混合物、蔗糖/甘露醇混合物等。一种可能的配置将水性乳液组分存于预填充注射器中，而将冻干抗原组分存于小瓶中。

组合物或试剂盒组分的包装

本发明组合物(或试剂盒组分)的合适容器包括小瓶、注射器(例如，一次性注射器)、鼻喷雾器等。这些容器应无菌。

如果将组合物/组分存于小瓶中，所述小瓶优选由玻璃或塑料材料制成。优选先将小瓶灭菌再加入组合物。为避免患者对乳胶过敏的问题，优选用无乳胶的塞子密封小瓶，所有包装材料最好均不含乳胶。小瓶可装有单剂量疫苗，或可装有多剂量(“多剂量”小瓶)，例如10份剂量。优选用无色玻璃制成小瓶。

小瓶可装有盖子(例如，Luer锁扣)，从而可将预填充的注射器插入盖子中，将注射器的内含物推入小瓶中(例如，重建其中的冻干材料)，再将小瓶的内含物抽回注射器中。将注射器从小瓶中取出后，装上针头，将组合物给予患者。优选使盖子位于封口或覆盖物内，从而要先除去封口或覆盖物再接触盖子。小瓶可具有盖子，从而能无菌取出其内含物，特别是对于多剂量小瓶。

如果要将某组分包装入注射器，注射器可装有针头。如果未装针头，可随注射器提供单独的针头用于装配和使用。这种针头可以是有鞘的。优选安全针头。常见的是1英寸23号、1英寸25号和5/8英寸25号针头。注射器可装有可剥离标签，其上打印了批号、流感季节和内含物的有效期，从而有助于记录保管。注射器的柱塞优选具有塞子，从而能防止柱塞在抽吸期间意外掉出。注射器可装有乳胶橡胶盖子和/或柱塞。一次性注射器可含有单剂量疫苗。在装上针头之前，注射器一般装有针帽以密封顶端，所述针帽优选由丁基橡胶制成。如果注射器和针头分开包装，则优选给针头装有丁基橡胶罩。优选的注射器是以“Tip-Lok”^TM为商品名投入市场的那些。

可给容器做上显示半剂量体积的标记，例如以有助于递送给儿童。例如，含有0.5ml剂量的注射器可具有显示0.25ml体积的标记。

如果使用玻璃容器(例如，注射器或小瓶)，则优选使用硼硅酸玻璃而不是钠钙玻璃制成的容器。

可随试剂盒或组合物装有(例如，装在同一盒子中)插页，该插页包括疫苗的细节，例如给药的使用说明书，疫苗中抗原的细节等。使用说明书还可包括警告，例如准备肾上腺素溶液以防疫苗接种后的过敏反应，等等。

治疗方法和疫苗的施用

本发明组合物适合给予人类患者。按照本发明引起的免疫应答将通常包括抗体反应，优选保护性抗体反应。本领域熟知评估流感病毒疫苗接种后的抗体应答、中和能力和保护作用的方法。人类研究证明针对人流感病毒血凝素的抗体滴度与保护作用有关(血清样品血凝反应-抑制滴度约30-40时，对同源病毒感染的保护作用约为50％)[177]。一般通过血凝反应抑制、微量中和、单辐射免疫扩散(SRID)和/或单向辐射状溶血(SRH)检测抗体应答。本领域熟知这些试验技术。

可以各种方法给予本发明组合物。最优选的免疫途径是肌肉内注射(例如，注射入手臂或腿中)，但其它可用的途径包括皮下注射、鼻内[178-180]、口服[181]、真皮内[182，183]、透皮、经皮[184]等。

本发明制备的疫苗可用于治疗儿童和成年人。流感疫苗目前推荐用于儿科和成年人免疫接种，年龄自6个月起。因此，患者可以小于1岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁、或至少55岁。接受疫苗的患者优选老年人(例如，≥50岁，≥60岁，优选≥65岁)，年轻人(例如，≤5岁)，住院患者，卫生保健人员、军队和军事人员，怀孕的妇女，慢性病、免疫缺陷患者，在接受疫苗前7天中服用抗病毒化合物(例如，奥塞米韦或扎那米韦化合物；例如磷酸奥塞米韦，参见下文)的患者，和出国的人。然而，这些疫苗不仅适用于这些团体，还可应用于更广泛的人群中。对于流行毒株，优选给予所有的年龄组。

本发明的优选组合物满足效力的CPMP标准的1、2或3条。在成年人(18-60岁)中，这些标准是：(1)≥70％血清保护作用；(2)≥40％血清转化；和/或(3)GMT增加≥2.5-倍。在老年人(>60岁)中，这些标准是：(1)≥60％血清保护作用；(2)≥30％血清转化；和/或(3)GMT增加≥2-倍。这些标准依据至少50位患者的标签公开研究(open label study)。

治疗通过多剂量方案进行。如上所述，不同剂量将通常采用相同的抗原形式并共享至少一种常见血凝素亚型。优选所有剂量都在肠胃外给予或者都通过粘膜给予。各剂量通常将通过相同给药途径给予，例如通过相同的肠胃外途径，如肌内注射。

多剂量通常可间隔至少一周(例如，约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16周，等等)给予。

优选的本发明的剂量方案是两剂量方案。进一步的剂量可在随后的流感季节施用，通常采取常规的单剂量方式，但根据本发明，一个周期内(例如在6个月内或在12个月内)的标准免疫接种将包括2次剂量。由于需要额外的抗原，因此方案(例如3-剂量或4-剂量方案)中的额外剂量并不优选。然而，如果方案包括第三次剂量，则第三剂量可以是对第一剂量的重复，然后是进一步的剂量，或者可以是进一步剂量的重复，例如‘添加佐剂的、添加佐剂的、未添加佐剂的’方案，或‘添加佐剂的、未添加佐剂的、添加佐剂的’方案。

可将本发明疫苗与其它疫苗基本上同时(例如，可在医疗保健专家或疫苗接种中心的同一次用药咨询或就诊期间)给予患者，例如与以下疫苗基本上同时：麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、偶联的乙型流感嗜血杆菌疫苗、灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗、乙肝病毒疫苗、脑膜炎球菌偶联物疫苗(例如，四价A-C-W135-Y疫苗)、呼吸道合胞体病毒疫苗、肺炎球菌偶联物疫苗，等等。与肺炎球菌疫苗和/或脑膜炎球菌疫苗基本上同时给予在老年患者中特别有用。

类似地，可将本发明疫苗与抗病毒化合物，特别是有效抵御疫流感毒的抗病毒化合物(例如，奥塞米韦和/或扎那米韦)基本上同时(例如，可在医疗保健专家的同一次用药咨询或就诊期间)给予患者。这些抗病毒(化合物)包括神经氨酸酶抑制剂，例如(3R，4R，5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸或5-(乙酰基氨基)-4-[(氨基亚氨基甲基)-氨基]-2，6-脱水-3，4，5-三脱氧-D-丙三基-D-半乳糖壬(galactonon)-2-烯酸(enonic acid)，包括它们的酯(例如乙酯)和它们的盐(例如磷酸盐)。优选的抗病毒化合物是(3R，4R，5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸、乙酯、磷酸酯(1:1)，也称为磷酸奥塞米韦(TAMIFLU^TM)。

概述

术语“含有”包括“包含”以及“由...组成”，例如“含有”X的组合物可仅由X组成或可包含其它物质，例如X+Y。

词语“基本上”不排除“完全”，例如“基本上无”Y的组合物可完全无Y。该词语“基本上”可视需要从本发明定义中省去。

与数值x有关的术语“约”表示，例如x±10％。

除非有专门表述，包括混合两种或多种组分的步骤的某方法不要求任何具体混合顺序。因此，可以任何顺序混合诸组分。如果有三种组分，则可先将两种组分彼此混合，再将该混合物与第三种组分混合，等等。

如果利用动物(特别是牛)材料培养细胞，这些材料应从不含可传染海绵样脑病(TSE)，特别是不含牛海绵样脑病(BSE)的来源获得。总体上，优选在完全不含动物来源的材料中培养细胞。

如果将化合物作为组合物的一部分给予身体，或可用合适的前药替代该化合物。

如果将细胞物质用于重配或反向遗传学方法，优选批准用于人疫苗生产的细胞物质，例如欧洲药典概述章节5.2.3中的。

附图简述

图1显示了用不同流感疫苗免疫的小鼠产生的抗-HAIgG ELISA反应。

本发明的实施方式

血凝素从H5N1禽流感毒株制备并制成每剂0.2μg(每剂50μl)的肌内注射形式。制备两种疫苗：第一种是未添加佐剂的；第二种以1：1添加MF59乳液作为佐剂。在第0和28天将疫苗给予四组8周龄的雌性Balb/c小鼠。在第14和42天采集小鼠血液并通过ELISA评价抗-HA免疫应答。

结果如下(同时见图1)：

组	A	B	C	D
组	A	B	C	D	第0天	无佐剂	MF59	无佐剂	MF59
第28天	无佐剂	无佐剂	MF59	MF59	第0天	无佐剂	MF59	无佐剂	MF59
第28天	无佐剂	无佐剂	MF59	MF59	效价(第14天)	13	313	6	271
有反应的	3/10	10/10	3/10	10/10	效价(第14天)	13	313	6	271
有反应的	3/10	10/10	3/10	10/10	效价(第42天)	7125	75922	42219	148831
有反应的	10/10	10/10	10/10	10/10	效价(第42天)	7125	75922	42219	148831

因此，佐剂能显著提高第一次免疫接种后有反应小鼠的数量(比较组A和B)。一次或两次剂量中包含佐剂能使抗-HA特异性抗体反应明显高于两次未添加佐剂的疫苗剂量所诱导的反应(将组B、C和D与组A进行比较)。此外，用添加佐剂的疫苗初免的动物可用未添加佐剂的疫苗加强免疫，获得的效价高于用未添加佐剂的疫苗初免并用添加佐剂的疫苗加强免疫(比较组B和C)。尽管组B的绝对效价低于组D，但反应已经足够了。因此，仅在两剂量方案的第一剂量中使用佐剂就能维持佐剂的效力。

应理解，仅通过实施例描述了本发明，可对该实施例进行修改而不超出本发明的范围和精神。

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Claims

1.一种免疫患者免遭流感病毒感染的方法，该方法包括以下步骤：(i)施用与第一佐剂组合的流感病毒疫苗剂量；和(ii)施用不含该佐剂的流感病毒疫苗的进一步剂量。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述进一步剂量通过与第一剂量相同的途径施用。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述进一步剂量是未添加佐剂的。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述进一步剂量添加了不同于第一佐剂的佐剂。

5.一种试剂盒，其中装有：(i)与第一佐剂组合的第一流感病毒疫苗；和(ii)不含该佐剂的第二流感病毒疫苗。

6.(i)与第一佐剂组合的第一流感病毒疫苗；和(ii)不含该佐剂的第二流感病毒疫苗在制造多剂量流感疫苗中的应用。

7.一种完全免疫患者免遭流感病毒感染的方法，其中，所述患者之前已接受与第一佐剂组合的流感病毒疫苗剂量，且其中所述方法包括给患者施用不含该佐剂的流感病毒疫苗的进一步剂量的步骤。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述进一步剂量通过与之前剂量相同的途径施用。

9.未添加佐剂的流感病毒疫苗在制造用于免疫患者免遭流感病毒感染的药物中的应用，其中，所述患者之前已接受添加佐剂的流感病毒疫苗。

10.添加佐剂的第二流感病毒疫苗在制造用于免疫患者免遭流感病毒感染的药物中的应用，其中，所述患者之前已接受添加佐剂的第一流感病毒疫苗，其中第一和第二流感病毒的佐剂是不同的。

11.如上述任一权利要求所述的方法、试剂盒或应用，其特征在于，所述疫苗所含的血凝素低于15μg/毒株/疫苗。

12.如上述任一权利要求所述的方法、试剂盒或应用，其特征在于，所述流感病毒疫苗包含H1、H2、H3、H5、H7或H9甲型流感病毒亚型的流感病毒抗原。

13.如上述任一权利要求所述的方法、试剂盒或应用，其特征在于，所述第一佐剂包含水包油乳液。