[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

CN101500601A - 表达用于制备疫苗的乙型肝炎病毒表面抗原 - Google Patents

表达用于制备疫苗的乙型肝炎病毒表面抗原 Download PDF

Info

Publication number
CN101500601A
CN101500601A CNA2006800218132A CN200680021813A CN101500601A CN 101500601 A CN101500601 A CN 101500601A CN A2006800218132 A CNA2006800218132 A CN A2006800218132A CN 200680021813 A CN200680021813 A CN 200680021813A CN 101500601 A CN101500601 A CN 101500601A
Authority
CN
China
Prior art keywords
compositions
hbsag
hbv
plasmid
coded sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2006800218132A
Other languages
English (en)
Inventor
A·麦迪那-赛尔比
D·科伊特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Original Assignee
Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis Vaccines and Diagnostics Inc filed Critical Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Publication of CN101500601A publication Critical patent/CN101500601A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0016—Combination vaccines based on diphtheria-tetanus-pertussis
    • A61K39/0017—Combination vaccines based on whole cell diphtheria-tetanus-pertussis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/05—Actinobacteria, e.g. Actinomyces, Streptomyces, Nocardia, Bifidobacterium, Gardnerella, Corynebacterium; Propionibacterium
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/08—Clostridium, e.g. Clostridium tetani
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/095—Neisseria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/099—Bordetella
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

在携带含有HBsAg编码序列的质粒的酿酒酵母宿主中表达HBsAg，其中该质粒包含：(1)来自甘油醛－3－磷酸脱氢酶基因的上游启动子，用于控制HBsAg编码序列的表达；和(2)位于HBsAg编码序列下游的ARG3转录终止子。该质粒也可包含：(3)LEU2选择标记物；(4)2μ质粒序列；和(5)在大肠杆菌中有功能的复制起点。可以在此宿主中表达HBsAg，并可将其纯化以用于生产疫苗，具体是生产含有非明矾佐剂的组合疫苗和新型单价HBV疫苗。

Description

表达用于制备疫苗的乙型肝炎病毒表面抗原
将本文引用的所有文献以全文纳入本文作参考。
技术领域
本发明属于蛋白质表达领域，具体说，表达用于制备疫苗的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)。
背景技术
乙型肝炎疫苗已经使用了许多年(参见例如参考文献1的第16章)，其活性成分是乙型肝炎病毒(HBV)的表面抗原(HBsAg)。最初的HBV疫苗采用从人血中纯化的HBsAg，但在20世纪90年代开始广泛采用基于重组表达的HBsAg的疫苗。从那时起，HBsAg也作为多价疫苗(即含有来自一种以上病原体的免疫原的混合物的疫苗)的组分掺入其中，以便在给予疫苗的同时用一种以上病原体免疫对象。这些多价疫苗一般包含HBsAg和至少′DTP′(白喉、破伤风和百日咳)抗原。
最初的单价重组HBV疫苗ENGERIX BTM包含氢氧化铝佐剂。近年来，已经出现基于更现代的佐剂的单价HBV疫苗，例如采用′AS04′佐剂[2]的GSK的FENDRIXTM产品，采用RC-529佐剂的Berna Biotech的SUPERV AXTM产品，或来自ColeyPharmaceuticals的CpG寡核苷酸佐剂如CPG7909[3]。
在HBsAg的重组表达中，描述了各种系统。已经采用的表达宿主包括细菌、酵母(包括酿酒酵母(Saccharomyces)、汉逊酵母(Hanensula)和毕赤酵母(Pichia))、哺乳动物细胞培养物(包括CHO细胞、COS细胞、Bu3细胞)、昆虫细胞(采用杆状病毒载体)和植物细胞(如′可食用疫苗′)。
本发明的目的是提供其它改进的HBsAg重组表达系统，具体用于制备组合疫苗(如含有DTP抗原的疫苗)或新型单价HBV疫苗所用的HBsAg。
发明内容
重组HBsAg表达的早期报道集中于大肠杆菌(E.coli)[4-6]、小鼠细胞[7]、人细胞[8]、猴细胞[9]和酵母[10-12]。然而近年来，在重组植物中表达引起了广泛关注[13-24]，在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)[25，26]和多形汉逊酵母(Hanensulapolymorpha)[27，28]中的表达也一样。
尽管向这些现代表达系统靠近，但本发明在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主中表达HBsAg。采用基于酵母表达HBsAg时有各种选择，包括选择酵母种类和菌株、培养条件、用于控制表达的启动子、基因终止序列、密码子使用等。按照本发明，在携带含有HBsAg编码序列的质粒的酿酒酵母宿主中表达HBsAg，其中所述质粒包含：(1)甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的上游启动子，用于控制HBsAg编码序列的表达；和(2)位于HBsAg编码序列下游的ARG3转录终止子。所述质粒一般也含有：(3)LEU2选择标记物；(4)2μ质粒序列；和(5)在大肠杆菌(Escherichia coli)中有功能的复制起点。
可以在此种酿酒酵母宿主中表达HBsAg，并可将其纯化用于生产疫苗，具体是生产组合疫苗和新型单价HBV疫苗。这种酵母表达材料适用于这些复合疫苗，尽管参考文献29的报道称酿酒酵母-表达的HBsAg可能具有免疫抑制潜能。
多价疫苗
因此，本发明提供了一种制备多价免疫原性组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在本发明的酿酒酵母宿主中表达后纯化HBsAg，从而制备HBV组件；(b)制备至少一种非HBV组件；和(c)混合所述HBV和非HBV组件，得到所述多价组合物。
本发明也提供了一种多价免疫原性组合物，其包含：(a)含有本发明酿酒酵母宿主表达的HBsAg的HBV组件；和(b)至少一种非HBV组件。该组合物一般也包含一种或多种佐剂。
这些多价组合物具体可用于同时保护儿童免受HBV和非-HBV病原体的感染。典型的患者是一岁以内的患者，在出生后6-9周接受第一个剂量的组合物。一般还以约6-8周的间隔给予两个或三个剂量。也可采用该组合物完成不同疫苗的初免方案。该组合物也可用作加强剂，如给予1-16岁的儿童。
单价疫苗
本发明也提供了一种制备单价免疫原性组合物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在本发明酿酒酵母宿主中表达后纯化HBsAg，从而制备HBV组分；(b)将所述HBsAg与佐剂混合，得到所述免疫原性组合物。该佐剂优选不是氢氧化铝佐剂，更优选不仅为铝盐佐剂。
本发明也提供了一种单价免疫原性组合物，其包含：(a)含有在本发明酿酒酵母宿主中表达的HBsAg的HBV组分；和(b)佐剂。
这些单价组合物具体可用于保护使用现有含佐剂疫苗(如ENGERIX BTM产品)无效的患者免受乙型肝炎病毒感染和/或治疗其乙型肝炎病毒感染。特别适合采用该组合物的患者亚群包括：免疫缺陷患者；血液透析患者；血液透析前的患者；肾功能不全的患者；肾衰竭患者；需要血液透析之前的早期肾衰竭患者；等待肝脏移植(如等候名单)的患者；末期肾衰竭患者；第一次给予本发明疫苗前6个月内接受过器官移植(特别是肝脏移植)的患者；正在接受(或在第一次给予本发明疫苗前6个月内接受过)乙型肝炎免疫球蛋白(HBIg)治疗的患者；具有HLA DQ2单体型的患者[30]；具有HLA DR3单体型的患者[30]；具有HLA DR7单体型的患者[30]；具有HLA等位基因DQB1*0202的患者[31]；感染了HIV的患者；慢性HBV携带者；近期接受过输血的患者；正在接受免疫抑制药物的患者；AIDS患者；有腹水的患者；肝硬化患者；脑病患者；接受干扰素治疗，尤其是ifn-α治疗的患者；吸烟患者；吸雪茄烟的患者；体重指数>30kg/m2的患者；和接受过HBsAg疫苗但没有发生血清转化的患者(例如标准初免方案如3个剂量的ENGERIX BTM后其血清抗-HBsAg效价<10mlU/ml)。
这些患者的肌酸酐清除率可小于30ml/分钟(正常健康范围为：男性～100-140ml/分钟，女性90-130ml/分钟)。患者优选至少15岁，如15-40岁、15-60岁、40-60岁，或者60以上。55岁以上的患者，无论患有任何疾病，均可进行治疗。
乙型肝炎表面抗原
HBV病毒颗粒由围绕着内核的外被蛋白或衣壳组成。衣壳的主要组分是称为′HBsAg′的蛋白质。目前，所有乙型肝炎疫苗都含有HBsAg，当这种抗原给予正常的疫苗接受者时，它能刺激产生抗-HBsAg抗体，保护其免受HBV感染。
在疫苗生产中，可以用两种方式制备HBsAg。第一种方法包括从慢性乙型肝炎携带者的血浆中纯化颗粒形式的抗原，因为在HBV感染过程中大量HBsAg在肝脏中合成，并释放到血流中。第二种方式包括用重组DNA方法表达该蛋白。用于本发明的HBsAg是用酿酒酵母重组表达的。
不像天然HBsAg(即血浆纯化产物中的HBsAg)，本发明所用的HBsAg是非糖基化的。优选此种形式的HBsAg，因为它的免疫原性高，并且其制备没有血液产品污染的风险。
酵母表达的HBsAg优选为基本呈球形的颗粒(平均直径约为20nm)的形式，包括含有磷脂的脂质基质。不像血浆衍生的HBsAg颗粒，酵母表达的颗粒可能包含磷脂酰肌醇。而且，脂质基质可包含非离子表面活性剂，如聚山梨酯20，在纯化该来自酵母表达宿主的抗原的过程中可将其掺入该基质。在HBsAg纯化开始时破坏重组酵母细胞期间采用聚山梨酯20是可将其引入HBsAg颗粒的一种方式。聚山梨酯20的重量比一般为每100μgHBsAg至少5μg。
所有已知的HBV亚型都含有共同的决定簇′a′。与其它决定簇和亚决定簇联合，鉴定到九种亚型：ayw1、ayw2、ayw3、ayw4、ayr、adw2、adw4、adrq-和adrq+。除了这些亚型，已经出现其它变体，如在免疫个体中检测到的HBV突变体(＂逃逸突变体＂)。虽然一些研究发现，大部分非应答者(如血液透析患者)的血清被adw4或ayw3亚型感染(参见例如参考文献32，其中75％血清是adw4，在血液透析患者中提高到88％；以及参考文献33，其中58％来自血液透析患者的亚型样品是ayw3)，但用于本发明的最优选的HBV亚型是adw2。此种亚型发现于一例血液透析患者(参考文献32)，以及1994年加利福尼亚和内布拉斯加州[34]以及随后在巴西[35，36]暴发的血液透析患者HBV感染中的少数病例，但它在超过98％的血液透析患者中免疫原性高并且有效。
优选的HBsAg含有以下226-个氨基酸的序列(SEQ ID NO：3)：
MENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGSPVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYR
WMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSTTTNTGPCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGN
CTCIPIPSSWAFAKYLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSAIWMMWYWGPSLYSIVSPFIPLLPIF
FCLWVYI
本发明可采用SEQ ID NO：3，或与SEQ ID NO：3的差异在于至多10(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个单氨基酸取代的序列。
HBsAg-编码序列可以是以下678-个核苷酸的序列(SEQ DD NO：4)：
atggagaacatcacatcaggattcctaggacccctgctcgtgttacaggcggggtttttcttgttgacaagaa
tcctcacaataccgcagagtctagactcgtggtggacttctctcaattttctagggggatcacccgtgtgtct
tggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcactcaccaacctcctgtcctccaatttgtcctggttatcgc
tggatgtgtctgcggcgttttatcatattcctcttcatcctgctgctatgcctcatcttcttattggttcttc
tggattatcaaggtatgttgcccgtttgtcctctaattccaggatcaacaacaaccaatacgggaccatgcaa
aacctgcacgactcctgctcaaggcaactctatgtttccctcatgttgctgtacaaaacctacggatggaaat
tgcacctgtattcccatcccatcgtcctgggctttcgcaaaatacctatgggagtgggcctcagtccgtttct
cttggctcagtttactagtgccatttgttcagtggttcgtagggctttcccccactgtttggctttcagctat
atggatgatgtggtattgggggccaagtctgtacagcatcgtgagtccctttataccgctgttaccaattttc
ttttgtctctgggtatacatt
HBsAg-编码序列的最后一个密码子优选后接TAA终止密码子(赭石密码子)。
除′S′序列以外，表面抗原可包含所有或部分前-S序列，如所有或部分前-S1和/或前-S2序列。然而，优选仅采用S序列，如上所示。
GAPDH启动子
根据本发明，在携带含有甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因，尤其是酵母GAPDH的上游启动子的质粒的酿酒酵母宿主中表达HBsAg[37-40]。将该启动子连接于HBsAg-编码序列，以调节其转录。
甘油醛-3-磷酸脱氢酶是糖酵解酶，发现其启动子特别适合控制HBsAg在酿酒酵母中的表达[41]。参考文献41中公开的GAPDH启动子含有以下1061-个核苷酸的序列(SEQ ID NO：5)：
aagcttaccagttctcacacggaacaccactaatggacacaaattcgaaatactttgaccctattttcgagga
ccttgtcaccttgagcccaagagagccaagatttaaattttcctatgacttgatgcaaattcccaaagctaat
aacatgcaagacacgtacggtcaagaagacatatttgacctcttaactggttcagacgcgactgcctcatcag
taagacccgttgaaaagaacttacctgaaaaaaacgaatatatactagcgttgaatgttagcgtcaacaacaa
gaagtttaatgacgcggaggccaaggcaaaaagattccttgattacgtaagggagttagaatcattttgaata
aaaaacacgctttttcagttcgagtttatcattatcaatactgccatttcaaagaatacgtaaataattaata
gtagtgattttcctaactttatttagtcaaaaattagccttttaattctgctgtaacccgtacatgcccaaaa
tagggggcgggttacacagaatatataacatcgtaggtgtctgggtgaacagtttatccctggcatccactaa
atataatggagctcgcttttaagctggcatccagaaaaaaaaagaatcccagcaccaaaatattgttttcttc
accaaccatcagttcataggtccattctcttagcgcaactacagagaacaggggcacaaacaggcaaaaaacg
ggcacaacctcaatggagtgatgcaacctgcctggagtaaatgatgacacaaggcaattgacccacgcatgta
tctatctcattttcttacaccttctattaccttctgctctctctgatttggaaaaagctgaaaaaaaaggttg
aaaccagttccctgaaattattcccctacttgactaataagtatataaagacggtaggtattgattgtaattc
tgtaaatctatttcttaaacttcttaaattctacttttatagttagtcttttttttagttttaaaacaccaag
aacttagtttcgaataaacacacataaacaaacaagctt
可按照本发明使用此启动子，但优选采用含有以下1060-个核苷酸的序列(SEQID NO：1)的启动子：
aagcttaccagttctcacacggaacaccactaatggacacacattcgaaatactttgaccctattttcgagga
ccttgtcaccttgagcccaagagagccaagatttaaattttcctatgacttgatgcaaattcccaaagctaat
aacatgcaagacacgtacggtcaagaagacatatttgacctcttaacaggttcagacgcgactgcctcatcag
taagacccgttgaaaagaacttacctgaaaaaaacgaatatatactagcgttgaatgttagcgtcaacaacaa
gaagtttactgacgcggaggccaaggcaaaaagattccttgattacgtaagggagttagaatcattttgaata
aaaaacacgctttttcagttcgagtttatcattatcaatactgccatttcaaagaatacgtaaataattaata
gtagtgattttcctaactttatttagtcaaaaaattagccttttaattctgctgtaacccgtacatgcccaaa
atagggggcgggttacacagaatatataacatcgtaggtgtctgggtgaacagtttattcctggcatccacta
aatataatggagcccgctttttaagctggcatccagaaaaaaaaagaatcccagcaccaaaatattgttttct
tcaccaaccatcagttcataggtccattctcttagcgcaactacagagaacaggggcacaaacaggcaaaaaa
cgggcacaacctcaatggagtgatgcaacctgcctggagtaaatgatgacacaaggcaattgacccacgcatg
tatctatctcattttcttacaccttctattaccttctgctctctctgatttggaaaaagctgaaaaaaaaggt
tgaaaccagttccctgaaattattcccctacttgactaataagtatataaagacggtaggtattgattgtaat
tctgtaaatctatttcttaaacttcttaaattctacttttatagttagtcttttttttagttttaaaacacca
agaacttagtttcgaataaacacacataaacaaacaaa
此序列与SEQ ID NO：5的差异如下：(1)核苷酸42上的A/C取代；(2)核苷酸194上的T/A取代；(3)核苷酸301上的C/A突变；(4)核苷酸471上插入A；(5)残基569上的C/T取代；(6)残基597上的T/C取代；(7)核苷酸604上插入T(用五个T代替四个T)；和(8)用一个A取代3′GCTT序列。
本发明可采用SEQ ID NO：1启动子序列，或与SEQ ID NO：1的差异在于至多20(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)个点突变的序列，各点突变是缺失、取代或插入一个核苷酸。
1060个核苷酸的序列优选恰好位于编码HBsAg的N末端的ATG起始密码子上游(SEQ ID NO：2)，如：
aagcttaccagttctcacacggaacaccactaatggacacacattcgaaatactttgaccctattttcgagga
ccttgtcaccttgagcccaagagagccaagatttaaattttcctatgacttgatgcaaattcccaaagctaat
aacatgcaagacacgtacggtcaagaagacatatttgacctcttaacaggttcagacgcgactgcctcatcag
taagacccgttgaaaagaacttacctgaaaaaaacgaatatatactagcgttgaatgttagcgtcaacaacaa
gaagtttactgacgcggaggccaaggcaaaaagattccttgattacgtaagggagttagaatcattttgaata
aaaaacacgctttttcagttcgagtttatcattatcaatactgccatttcaaagaatacgtaaataattaata
gtagtgattttcctaactttatttagtcaaaaaattagccttttaattctgctgtaacccgtacatgcccaaa
atagggggcgggttacacagaatatataacatcgtaggtgtctgggtgaacagtttattcctggcatccacta
aatataatggagcccgctttttaagctggcatccagaaaaaaaaagaatcccagcaccaaaatattgttttct
tcaccaaccatcagttcataggtccattctcttagcgcaactacagagaacaggggcacaaacaggcaaaaaa
cgggcacaacctcaatggagtgatgcaacctgcctggagtaaatgatgacacaaggcaattgacccacgcatg
tatctatctcattttcttacaccttctattaccttctgctctctctgatttggaaaaagctgaaaaaaaaggt
tgaaaccagttccctgaaattattcccctacttgactaataagtatataaagacggtaggtattgattgtaat
tctgtaaatctatttcttaaacttcttaaattctacttttatagttagtcttttttttagttttaaaacacca
agaacttagtttcgaataaacacacataaacaaacaaaATG...
ARG3终止子
根据本发明，在携带含有ARG3的下游转录终止子的质粒的酿酒酵母宿主中表达HBsAg。将该终止子连接于HBsAg编码序列，以调节其转录。
酵母的ARG3基因编码鸟氨酸氨甲酰基转移酶[42]，其转录终止序列已被用于数种酵母重组表达系统[43-45]。可用它控制HBsAg在酵母中的表达，尤其是与GAPDH启动子联用时。
恰好位于ARG3终止密码子下游的序列(如GenBank条目GI：171076所示)是以下450-个核苷酸的序列(SEQ ID NO：6)：
tccttctttcgtgttcttaataactaatatataaatacagatatagatgcatgaataatgatatacattgatt
attttgcaatgtcaattaaaaaaaaaaaatgttagtaaaactatgttacattccaagcaaataaagcacttgg
ttaaacgaaattaacgtttttaagacagccagaccgcggtctaaaaatttaaatatacactgccaacaaattc
cttcgagttgtccaatttcaccacttttatattttcatcaacttcagcagattcaaccttctcacatagaaca
ttggaataaacagccttaacaccactttcaagtttgcacagcgtaatatgaggaattttgttttgacaacaca
accctttaattttctcattgttttcatcaattatgcatccatctttatctttagacagttccactacaatagc
aatagttttttc
如果向编码序列中延伸250个核苷酸，ARG3基因包含以下700个核苷酸的序列(SEQ ID NO：7)：
agaatttgcgaaacaggccaagctgaaacaattcaaaggttttcaaatcaatcaagaacttgtctctgtggct
gatccaaactacaaatttatgcattgtctgccaagacatcaagaagaagttagtgatgatgtcttttatggag
agcattccatagtctttgaagaagcagaaaacagattatatgcagctatgtctgccattgatatctttgttaa
taataaaggtaatttcaaggacttgaaaTAAtccttctttcgtgttcttaataactaatatataaatacagat
atagatgcatgaataatgatatacattgattattttgcaatgtcaattaaaaaaaaaaaatgttagtaaaact
atgttacattccaagcaaataaagcacttggttaaacgaaattaacgtttttaagacagccagaccgcggtct
aaaaatttaaatatacactgccaacaaattccttcgagttgtccaatttcaccacttttatattttcatcaac
ttcagcagattcaaccttctcacatagaacattggaataaacagccttaacaccactttcaagtttgcacagc
gtaatatgaggaattttgttttgacaacacaaccctttaattttctcattgttttcatcaattatgcatccat
ctttatctttagacagttccactacaatagcaatagttttttc
SEQ ID NO：7的转录终止发生在有下划线的SacII位点区域。
用于本发明的优选终止子包含此ARG3区域的编码序列和下游序列的部分，具体包含以下689-个核苷酸的序列(SEQ ID NO：8)，它的3′末端与SEQ ID NO：7相同：
cgaattccaagctgaaacaattcaaaggttttcaaatcaatcaagaacttgtctctgtggctgatccaaacta
caaatttatgcattgtctgccaagacatcaagaagaagttagtgatgatgtcttttatggagagcattccata
gtctttgaagaagcagaaaacagattatatgcagctatgtctgccattgatatctttgttaataataaaggta
atttcaaggacttgaaataatccttctttcgtgttcttaataactaatatataaatacagatatagatgcatg
aataatgatatacattgattattttgcaatgtcaattaaaaaaaaaaaatgttagtaaaactatgttacattc
caagcaaataaagcacttggttaaacgaaattaacgtttttaagacagacagaccgcggtctaaaaatttaaa
tatacactgccaacaaattccttcgagttgtccaatttcaccacttttatattttcatcaacttcagcagatt
caaccttctcacatagaacattggaataaacagccttaacaccactttcaagtttgcacagcgtaatatgagg
aattttgttttgacaacacaaccctttaattttctcattgttttcatcaattatgcatccatctttatcttta
gacagttccactacaatagcaatagttttttc
此序列的5′末端包含有用的EcoRI位点(下划线)，该位点有利于将终止子插入所需位置。
也可存在ARG3的其它下游终止子序列。可包含ARG3的至多1500个核苷酸(即至多再包含SEQ ID NO：7下游的800个核苷酸)，如至多1200个核苷酸，或约1150个核苷酸。
本发明可采用SEQ ID NO：8终止子序列，或者与SEQ ID NO：8的差异为多达30(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40)个点突变的序列，各点突变为缺失、取代或插入一个核苷酸。
689-个核苷酸的序列优选恰好位于HBsAg的C末端的终止密码子区下游(SEQID NO：9)，如：
...TAAcgaattccaagctgaaacaattcaaaggttttcaaatcaatcaagaacttgtctctgtggctgatcc
aaactacaaatttatgcattgtctgccaagacatcaagaagaagttagtgatgatgtcttttatggagagcat
tccatagtctttgaagaagcagaaaacagattatatgcagctatgtctgccattgatatctttgttaataata
aaggtaatttcaaggacttgaaataatccttctttcgtgttcttaataactaatatataaatacagatataga
tgcatgaataatgatatacattgattattttgcaatgtcaattaaaaaaaaaaaatgttagtaaaactatgtt
acattccaagcaaataaagcacttggttaaacgaaattaacgtttttaagacagccagaccgcggtctaaaaa
tttaaatatacactgccaacaaattccttcgagttgtccaatttcaccacttttatattttcatcaacttcag
cagattcaaccttctcacatagaacattggaataaacagccttaacaccactttcaagtttgcacagcgtaat
atgaggaattttgttttgacaacacaaccctttaattttctcattgttttcatcaattatgcatccatcttta
tctttagacagttccactacaatagcaatagttttttc
质粒
编码HBsAg的基因、GAPDH启动子和ARG3终止子都作为同一质粒的一部分操作性连接在一起。本发明质粒一般也包含1、2或(优选)所有3个以下元件：LEU2选择标记物；2μ质粒序列；和在大肠杆菌中有功能的复制起点。以前在用于HBsAg表达的质粒中描述过这三个元件[45]。
LEU2选择标记物常常用于酵母遗传学。LEU2编码3-异丙基苹果酸脱氢酶，它是亮氨酸生物合成途径中的第三种酶。质粒上的LEU2标记物产生由代谢前体合成亮氨酸的能力，并用于作为亮氨酸营养缺陷型如LEU2无效突变体的宿主细胞。因此，LEU2标记物允许通常在不供给亮氨酸时无法正常生长的亮氨酸营养缺陷型在没有亮氨酸的条件下生长。
2μ质粒序列也是酵母基因组中常见的[46]，被用来提高质粒的拷贝数。任何合适的2μ质粒序列均可用于本发明质粒中。所述质粒包括酵母复制起点，一般由2μ序列提供。
包含在大肠杆菌中有功能的复制起点的质粒可用作酵母和大肠杆菌之间的穿梭载体，从而能够利用大肠杆菌系统操作质粒。
因此，本发明提供了含有以下元件的质粒：(1)HBsAg编码序列；(2)位于HBsAg编码序列上游并控制其表达的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子；和(3)位于HBsAg编码序列下游的ARG3转录终止子。该质粒也可包含以下元件：(4)LEU2选择标记物；(5)2μ质粒序列；和(6)在大肠杆菌中有功能的复制起点。HBsAg编码序列优选编码氨基酸序列SEQ ID NO：3或与SEQ ID NO：3的差别为至多10(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)个单氨基酸取代的序列的HBsAg。GAPDH启动子序列优选包含SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1的差异在于至多20(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)个点突变的序列。ARG3终止子优选包含SEQ ID NO：8或与SEQ ID NO：8的差异在于至多20(即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)个点突变的序列。可以用酿酒酵母宿主维持该质粒，该质粒可用于表达HBsAg。
优选14500-15000bp，如14600-14700bp的质粒。
酿酒酵母宿主
酿酒酵母是广泛用于重组表达的酵母宿主。本发明可采用任何合适的酿酒酵母宿主。然而，优选采用亮氨酸营养缺陷型宿主，以致于LEU2选择标记物可用于该质粒。宿主细胞可以是leu2-3 leu2-112突变体。
优选酵母宿主的其它特征是his3和/或canl-11。最优选的酵母宿主是leu2-3leu2-112 his 3 canl-11，如DC5菌株。
本发明提供了携带本发明质粒的酵母。本发明也提供了这种酵母在制备本发明组合物中的应用。
HBsAg表达和纯化
培养酵母以表达重组蛋白的技术是本领域熟知的。可以用合成培养基，如含有纯化氨基酸(在采用LEU2标记物时一般省去亮氨酸)、维生素、盐等的培养基培养酵母。然后，可通过包括(例如)沉淀、离子交换色谱和超滤等步骤的方法纯化HBsAg。纯化过程中可采用的其它步骤包括凝胶渗透层析和氯化铯超速离心。
整个纯化过程中特别优选包含的步骤是用非离子去污剂，如Triton-X100或聚氧乙烯山梨聚糖醇的脂肪酸酯，如聚氧乙烯山梨聚糖醇单油酸酯(也称为聚山梨酯80)或更优选的聚氧乙烯山梨聚糖醇单月桂酸酯(也称为聚山梨酯20)破坏细胞的步骤。接着，可离心破坏的细胞得到发现有HBsAg的上清液。然后用参考文献47所述的方法纯化上清液中的该蛋白。
纯化后，可对HBsAg进行透析(如用半胱氨酸)，透析可用于去除任何含汞的防腐剂如在HBsAg制备期间有可能采用的硫柳汞[48]。
按照本发明表达和纯化的HBsAg可与其它非HBV抗原混合，以得到多价疫苗，或者可与新型佐剂混合，以制备改进的单价疫苗。
单价免疫原性组合物
按照本发明表达和纯化的HBsAg可与新型佐剂混合，以制备改进的单价疫苗。用于单价HBV疫苗的三种特别感兴趣的佐剂是：CpG寡核苷酸；氨基烷基氨基葡糖苷磷酸衍生物；3d-MPL与铝盐的混合物。
CpG寡核苷酸佐剂是免疫刺激性寡核苷酸，它包含含有CpG基序(未甲基化的胞嘧啶二核苷酸序列，后接鸟苷)的核苷酸序列。含有回文或聚(dG)序列的细菌双链RNA或寡核苷酸也显示出免疫刺激性。CpG可包括核苷酸修饰/类似物如硫代磷酸酯修饰，并且可以是双链或单链。任选地，鸟苷可被类似物如2′-脱氧-7-脱氮鸟苷取代。参考文献49-51给出了可能的类似物取代的例子。参考文献52-57中进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂效应。
CpG序列可以导向TLR9，如基序GTCGTT(SEQ ID NO：11)或TTCGTT(SEQID NO：12)[58]。CpG序列可以特异性诱导Th1免疫应答，如CpG-A ODN，或者它可以更特异地诱导B细胞应答，如CpG-B ODN。参考文献59-61中讨论了CpG-A和CpG-B ODN。CpG优选是CpG-A ODN。
优选地，构建CpG寡核苷酸以使5′端可接触到受体。优选地，构建CpG寡核苷酸以使5′端可被受体识别。任选地，两种CpG寡核苷酸序列可在其3′端连接，以形成＂免疫聚体＂。参见例如，参考文献58和62-64。
氨基烷基氨基葡糖苷磷酸(AGP)衍生物包括RC-529[65-68]，它是CorixaCorporation出售的氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸。
AS04是铝盐佐剂和3D-MPL佐剂的混合物[69]。采用AS04时，优选将HBsAg吸附到铝盐上，如参考文献70所述。铝盐优选为磷酸铝，全部HBsAg的至少50重量％，如≥60％、≥70％、≥80％、≥90％、≥95％、≥98％或更多吸附于磷酸铝。可通过(例如离心，其中铝-吸附抗原容易形成沉淀，而未吸附抗原保持在上清液中)分离吸附材料与未吸附的材料，从而方便地测定吸附的百分数。可用组合物中的HBsAg总量减去上清液中的HBsAg含量(如用抗-HBsAg ELISA测定)，然后计算吸附百分数。优选的是，HBsAg全部吸附，即上清液中检测不到HBsAg。
3D-MPL佐剂也可吸附到磷酸铝上。优选地，至少50重量％，如≥60％、≥70％、≥80％、≥90％、≥95％、≥98％或更多的3D-MPL吸附。可通过与HBsAg相同的方式测定吸附百分数。在3D-MPL总浓度为50μg/ml的组合物中，未吸附3D-MPL的浓度应小于25μg/ml，例如≤20μg/ml、≤15μg/ml、≤10μg/ml、≤5μg/ml、≤20μg/ml、≤1μg/ml等。
下面开始更详细地描述磷酸铝佐剂。
3-O-脱酰基化的单磷酰基脂质A(3D-MPL)也被称为3脱-O-酰基化的单磷酰基脂质A或3-O-脱酰基-4′-单磷酰基脂质A。该名称表明，单磷酰基脂质A中的还原端葡糖胺的3位被脱酰基化。它可由明尼苏达沙门菌(Salmonella minnesota)的无庚糖突变体制备，在化学上类似于脂质A，但缺少酸-不稳定性磷酰基和碱-不稳定性酰基。它能激活单核细胞/巨噬细胞谱系的细胞，并刺激释放几种细胞因子，包括IL-I、IL-12、TNF-α和GM-CSF。最初在参考文献71中描述了3D-MPL的制备，该产品由CorixaCorporation生产并以商品名MPLTM出售。其它详情可参见参考文献72-75。3D-MPL可与三乙醇胺、三乙铵或三乙胺离子联用。
3D-MPL可以取酰基化不同的相关分子(如具有3、4、5或6个酰基链，它们的长度可以不同)的混合物的形式。两个2-脱氧-2-氨基-葡萄糖单糖在其2-位(即2和2′位)碳上N-酰基化，3′位上也有O-酰基化。连接于碳2的基团具有下式：
-NH-CO-CH2-CR1R1′。
连接于碳2′的基团具有下式：-NH-CO-CH2-CR2R2′。连接于碳3′的基团具有下式：-O-CO-CH2-CR3R3′。代表性结构见下：
Figure A200680021813D00171
基团R1、R2和R3各自独立地是-(CH2)n-CH3。n值优选为8-16，更优选为9-12，最优选为10。
基团R1′、R2′和R3′各自独立地是：(a)-H；(b)-OH；或(c)-O-CO-R4，其中R4是-H或-(CH2)m-CH3，其中m值优选为8-16，更优选为10、12或14。在2位上，m优选为14。在2′位上，m优选为10。在3′位上，m优选为12。因此基团R1′、R2′和R3′优选为来自十二烷酸、十四烷酸或十六烷酸的-O-酰基。
R1′、R2′和R3′均为-H时，3D-MPL仅含有3条酰基链(2、2′和3′位置上各有一条)。R1′、R2′和R3′中仅有两个是-H时，3D-MPL可含有4条酰基链。R1′、R2′和R3′中仅有一个是-H时，3D-MPL可含有5条酰基链。R1′、R2′和R3′中没有一个是-H时，3D-MPL可含有6条酰基链。本发明所用的3D-MPL佐剂可以是含有3-6条酰基链的这些形式的混合物，但混合物中优选包含具有6条酰基链的3D-MPL，具体说，保证6条酰基链的形式占3D-MPL总重的至少10％，例如≥20％、≥30％、≥40％、≥50％或更多。发现具有6条酰基链的3D-MPL是佐剂活性最高的形式。
因此，本发明组合物包含的3D-MPL的最优选形式具有下式(II)。
在水性条件下，3D-MPL可形成不同大小，如直径<150nm或>500nm的胶束聚集体或颗粒。其中一种或两种可用于本发明，可通过常规实验选择更好的颗粒。据报道最好是较小颗粒(如小到足以产生澄清的3D-MPL水悬液)[76]，本发明使用这种颗粒。优选颗粒的平均直径小于220nm，更优选小于200nm，小于150nm，或小于120nm。它们的直径甚至可以小于100nm。然而在大多数情况下，平均直径不小于50nm。
当3D-MPL吸附于磷酸铝时，可能不能直接测定3D-MPL的粒度，但可以在发生吸附之前测定粒度。
可用揭示平均粒径的常规技术动态光散射评价粒径。据称颗粒的平均直径为xnm时，粒径通常分布在此平均值附近，但至少50数量％(例如≥60％、≥70％、≥80％、≥90％或更多)颗粒的直径在x±20％的范围内。
Figure A200680021813D00181
多价免疫原性组合物
按照本发明表达和纯化的HBsAg可与一种或多种非HBV抗原混合，以制备多价疫苗。所述非HBV抗原可包括细菌和/或病毒抗原。用于本发明的非HBV组分一般包括但不限于：
·白喉类毒素(′D′)
·破伤风类毒素(T′)
·百日咳抗原(T′)，可以是细胞(′wP′)或非细胞(′aP′)的抗原
·甲型肝炎病毒(HAV)抗原
·偶联的B型流感嗜血杆菌荚膜糖(′Hib′)
·灭活的脊髓灰质炎病毒(IPV)
·偶联的脑膜炎奈瑟球菌血清组C荚膜糖(′MenC′)
·偶联的脑膜炎奈瑟球菌血清组A荚膜糖(′MenA′)
·偶联的脑膜炎奈瑟球菌血清组W135荚膜糖(′MenW135′)
·偶联的脑膜炎奈瑟球菌血清组Y荚膜糖(′MenY′)
·偶联的肺炎链球菌荚膜糖
·麻疹病毒抗原
·腮腺炎病毒抗原
·风疹病毒抗原
·水痘带状疱疹病毒抗原
·流感病毒抗原
可采用这些非HBV抗原中一种以上。特别优选以下抗原组合：
·二价疫苗：HBV-HAV；HBV-Hib。
·三价疫苗：HBV-D-T。
·四价疫苗：HBV-D-T-P。
·五价疫苗：HBV-D-T-P-Hib；HBV-D-T-P-IPV。
·六价疫苗：HBV-D-T-P-Hib-IPV。
·七价疫苗：HBV-D-T-P-Hib-MenA-MenC；HBV-D-T-P-Hib-IPV-MenC。
参考文献1的第13章更详细地公开了白喉类毒素(′D′)。优选的白喉类毒素是经过甲醛处理的毒素。用可以补充牛提取物的生长培养基(如Fenton培养基，或Linggoud和Fenton培养基)培养白喉棒杆菌(C.diphtheriae)，接着进行甲醛处理、超滤和沉淀，从而获得白喉类毒素。通过包括无菌过滤和/或透析的方法处理此类毒素化物质。可用国际单位(IU)表示白喉类毒素的量。例如，NIBSC提供了′吸附的白喉类毒素的第三国际标准1999′[77，78]，其含有160IU/安瓿。作为IU系统的替代形式，′Lf′单位(＂絮凝单位＂或＂边界絮凝剂量＂)定义为与一个国际单位的抗毒素混合时，产生最优絮凝混合物的类毒素量[79]。例如，NIBSC提供了′白喉类毒素，Plain′[80]，其含有300LF/安瓿，也提供了′用于絮凝试验的白喉类毒素的第一国际参比试剂′[81]，其含有900Lf/安瓿。
参考文献1的第27章更详细地公开了破伤风类毒素(′T′)。优选的破伤风类毒素是通过甲醛处理制备的。用生长培养基(如衍生自牛酪蛋白的Latham培养基)培养破伤风梭菌(C.tetani)，然后进行甲醛处理、超滤和沉淀，从而获得破伤风类毒素。通过包括无菌过滤和/或透析的方法处理此物质。可用国际单位(IU)表示破伤风类毒素的量。例如，NIBSC提供了′吸附的破伤风类毒素的第三国际标准2000′[82，83]，其含有469IU/安瓿。作为IU系统的替代形式，′Lf单位(＂絮凝单位＂或＂边界絮凝剂量＂)定义为与一个国际单位的抗毒素混合时，产生最优絮凝混合物的类毒素量[79]。例如，NIBSC提供了′用于絮凝试验的破伤风类毒素的第一国际参比试剂′[84]，其含有1000Lf/安瓿。
百日咳抗原(′P′)可以是细胞(′wP′)或无细胞(′aP′)的抗原。细胞百日咳抗原一般是灭活的百日咳博德特菌(B.pertussis)细胞的形式。已经详尽记录了细胞百日咳抗原的制备(参见例如参考文献1的第21章)，例如，可通过加热灭活百日咳博德特菌的I期培养物获得该抗原。可用国际单位(IU)表示wP抗原的量。例如，NIBSC提供了′百日咳疫苗的第三国际标准′[85]，其含有46IU/安瓿。各安瓿含有用8升M/15Sorensen缓冲液pH7.0稀释的10升细菌悬液(根据美国不透明标准，等同于180不透明单位)的水溶液的2.0ml等份的冻干残留物。作为IU系统的替代形式，也采用′OU′单位(＂不透明单位＂)(如4OU可以约为1IU)。目前用于疫苗的无细胞百日咳抗原包括百日咳类毒素(PT)、丝状血细胞凝集素(FHA)、百日咳杆菌粘附素(也称为′69千道尔顿外膜蛋白′)和菌毛(如凝集原2和3)。本发明优选采用PT、FHA和百日咳杆菌粘附素中的至少两种，优选全部三种(即不采用菌毛)。优选从改良的Stainer-Scholte液体培养基培养的百日咳博德特菌培养物中分离制备这三种抗原。可从发酵肉汤中(如通过吸附于羟基磷灰石凝胶)分离PT和FHA，但可通过加热处理和絮凝(如采用氯化钡)从细胞中提取百日咳杆菌粘附素。可用连续的色谱和/或沉淀步骤纯化抗原。可通过疏水性层析、亲和层析和大小排阻层析纯化PT和FHA。可通过离子交换层析、疏水性层析和大小排阻层析纯化百日咳杆菌粘附素。在用于本发明之前，可用甲醛处理FHA和百日咳杆菌粘附素。优选通过甲醛和/或戊二醛处理使PT脱毒。作为这种化学脱毒方法的替代形式，PT可以是通过诱变降低了酶活性的突变PT[86]，但优选用化学处理脱毒。无细胞百日咳抗原的量一般用微克表示。
参考文献1的第15章公开了甲型肝炎病毒(HAV)疫苗。优选的HAV组分组分基于灭活病毒，可通过甲醛处理实现灭活。可以在人胚肺双倍体成纤维细胞，如MRC-5细胞上培养病毒。优选的HAV毒株是HM175，但也可采用CR326F。可以在允许病毒生长的条件下培养细胞。裂解细胞，可通过超滤和凝胶渗透层析纯化得到的悬液。
参考文献1的第14章更详细地公开了B型流感嗜血杆菌荚膜糖(′Hib′)偶联物。将Hib荚膜糖偶联于载体蛋白，以提高其免疫原性，尤其是在儿童中的免疫原性。可采用各种载体蛋白，包括白喉类毒素、CRM197、脑膜炎球菌血清组B的外膜蛋白复合物、流感嗜血杆菌蛋白D或破伤风类毒素。破伤风类毒素是优选的载体，产品中采用的统称为′PRP-T′。用溴化氰激活Hib荚膜多糖，将活化的糖偶联于己二酸接头(如(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)，一般是盐酸盐)，然后将该接头-糖与破伤风类毒素载体蛋白反应，从而制备PRP-T。Hib偶联物的糖部分可含有由Hib细菌制备的全长聚核糖基核醣醇磷酸(PRP)，和/或该部分可以含有全长PRP的片段。可采用糖∶蛋白之比(w/w)为1:5(即蛋白过量)至5:1(即糖过量)的偶联物，如该比例为1:2-5:1，该比例为1:1.25-1:2.5。在优选的偶联物中，糖与载体蛋白的重量比为1:2.5-1:3.5。在破伤风类毒素以抗原和载体蛋白的形式存在的疫苗中，偶联物中糖与载体蛋白的重量比可以是1:0.3-1:2[87]。给予Hib偶联物优选导致抗-PRP抗体浓度≥0.15μg/ml，更优选≥1μg/ml，这些是标准的可接受的应答阈值。
在参考文献1的第24章更详细地公开了灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗(IPV)。可以在细胞培养物中培养脊髓灰质炎病毒，优选的培养采用衍生自猴肾的Vero细胞系。Vero细胞可方便地培养成小载体。培养后，可用诸如超滤、渗滤和层析纯化病毒颗粒。给予患者前，脊髓灰质炎病毒必须被灭活，可通过甲醛处理实现这种灭活。脊髓灰质炎可能由三种类型的脊髓灰质炎病毒之一引起。这三种类型相似，并且引起相同的症状，但它们的抗原性差异很大，被一种类型感染后并不能保护其免受其它类型的感染。因此，本发明优选采用三种脊髓灰质炎病毒抗原：1型脊髓灰质炎病毒(如Mahoney毒株)、2型脊髓灰质炎病毒(如MEF-1毒株)和3型脊髓灰质炎病毒(如Saukett毒株)。优选单独培养、纯化和灭活病毒，然后合并形成批量三价混合物，用于本发明。一般用′DU′单位(＂D-抗原单位＂[88])表示IPV量。
偶联的脑膜炎球菌抗原含有偶联于载体蛋白的脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)的荚膜糖抗原。针对血清组C的偶联疫苗已被批准用于人，其包含MENJUGATETM[89]、MENINGITECTM和NEISVAC-CTM。已知血清组A+C的偶联物的混合物[90，91]，已报道了血清组A+C+W135+Y的偶联物的混合物[92-95]，并于2005被批准作为MENACTRATM产品上市。用于本发明的脑膜炎球菌糖可以来自血清组A、C、W135和Y中的一种或多种，如A+C、A+W135、A+Y、C+W135、C+Y、W135+Y、A+C+W135、A+C+Y、C+W135+Y、A+C+W135+Y。优选至少采用血清组C的糖，优选采用来自血清组A和C的糖。MENJUGATETM和MENINGITECTM产品采用CRM197载体蛋白，这种载体也可用于本发明。NEISVAC-CTM产品采用破伤风类毒素载体蛋白，如白喉类毒素一样，这种载体也可用于本发明。用于脑膜炎球菌偶联物的特别优选的载体蛋白是流感嗜血杆菌的蛋白D，它不存在于任何目前批准的偶联物疫苗中。该偶联物的糖部分可含有由脑膜炎球菌制备的全长糖，和/或它可包含全长糖的片段。可由OAc+或O Ac-菌株制备血清组C糖。就血清组糖而言，优选至少50％(如至少60％、70％、80％、90％、95％或更多)的甘露糖胺残基的C-3位置上被O-乙酰基化。可采用糖:蛋白之比(w/w)为1:10(即蛋白过量)至10:1(即糖过量)的脑膜炎球菌偶联物，如该比例为1:5-5:1，1:2.5-2.5:1，或者是1:1.25-1.25:1。给予偶联物优选导致对相关血清组的血清杀菌试验(SBA)效价增加至少4倍，优选至少8倍。可用小兔补体或人补体测定SBA效价[96]。
偶联的肺炎球菌抗原包含偶联于载体蛋白的肺炎链球菌(S.pneumoniae)的荚膜糖抗原[例如，参考文献97-99]。优选包含来自肺炎链球菌一种以上血清型的糖：广泛采用23种不同血清型的多糖的混合物，如同采用5-11中不同血清型的多糖的偶联疫苗[100]。例如，PrevNarTM[101]含有来自7种血清型(4、6B、9V、14、18C、19F和23F)的抗原，其中各糖通过还原胺化单独偶联于CRM197，每0.5ml剂量(4μg血清型6B)含有2μg各糖，偶联物吸附于磷酸铝佐剂。本发明组合物优选至少包含血清型6B、14、19F和23F。其它血清型优选选自：1、3、4、5、7F、9V和18C。
提供针对麻疹、腮腺炎和风疹病毒的保护的抗原一般是活病毒，正如已知的单价和三价(′MMR′)疫苗那样。参考文献1的第19章更详细地描述了麻疹病毒疫苗。参考文献1的第20章更详细地描述了腮腺炎病毒疫苗。参考文献1的第26章更详细地描述了风疹病毒疫苗。典型的麻疹病毒毒株包括：Moraten；Connaught；Schwarz；Edmonston-Zagreb；CAM-70；AIK-C；TD97；Leningrad-16；Shanghai-191；等。在美国和欧洲Schwarz和Moraten毒株不是最常用的毒株。典型的腮腺炎病毒毒株包括：Jeryl Lynn；RIT 4385；Urabe；Hoshino；Rubini；Leningrad-3；Leningrad-Zagreb；Miyahara；Torii；NK M-46；S-12；等。Jeryl Lynn、RIT 4385、Urabe和Leningrad-Zagreb毒株是世界上最常见的毒株。典型的风疹病毒毒株包括：RA27/3；Matsuba；TCRB 19；Takahashi；Matsuura；TP-336；等。RA27/3毒株是西方最常用的毒株。
提供针对水痘的保护的VZV抗原一般是活病毒，根据该病毒Oka毒株。参考文献1的第28章更详细地描述了VZV疫苗。
参考文献1的第17和18章更详细地描述了流感病毒抗原。广泛来看，流感病毒疫苗可以基于活病毒或灭活病毒，灭活疫苗可以基于完整病毒、′分裂′病毒或纯化的表面抗原(包括血凝素和神经氨酸酶)。可以在鸡蛋或细胞培养物上培养用于制备疫苗的病毒。流感病毒的疫苗株随季节而变。在目前的大流行间期，疫苗一般包括两种A型流感毒株(H1N1和H3N2)和一种B型流感毒株，一般是三价疫苗。本发明也可采用大流行毒株(即疫苗接受者和普通人群没有与其发生过免疫接触的毒株)的病毒，如H2、H5、H7或H9亚型毒株(聚体是A型流感病毒)，大流行毒株的流感疫苗可以是单价疫苗，或者可以基于补充有大流行毒株的正常三价疫苗。流感病毒可以是再分类毒株，并可通过逆向遗传学技术获得。可使该病毒减毒。该病毒可以是温度敏感型。该病毒可以是冷适应性病毒。
制备多价组合疫苗时，抗原可以连续单独混合，或者可以将它们预混或加在一起。例如，可通过包括将HBsAg、D、T和P抗原连续加入容器，或通过预先混合D、T和P抗原，接着混合HBsAg与DTP混合物的方法制备4价DTP-HBsAg疫苗。
可以任何合适顺序混合抗原组分。
本发明组合物中包含白喉和破伤风类毒素时，优选在与HBsAg混合前将它们预先混合。因此，本发明方法包括将含有HBsAg的第一组分与含有D和T抗原的第二组分混合。因此，优选采用预先混合的D-T组分。此二价组分可用于本发明方法，如可将该二价组分与HBsAg混合，以制备三价D-T-HBV组分。或者，可将预先混合的D-T组分与其它非HBV抗原(如非细胞百日咳抗原)混合，然后将该组分与HBsAg混合，等。
类似地，组合物中包含白喉类毒素、破伤风类毒素和完整细胞百日咳抗原时，优选将它们预先混合，因此本发明方法包括将含有HBsAg的第一组分与含有D、T和Pw抗原的第二组分混合。
因此，优选采用预先混合的D-T-Pw组分，然后在本发明方法中采用这种组分。
当本发明组合物中包含佐剂时，可以在任何阶段加入佐剂。一般地，在用于本发明方法之前将抗原与佐剂混合(如在用于本发明方法之前将二价D-T混合物吸附于铝盐佐剂)，但也可能在混合抗原之后加入佐剂，或者将抗原加入佐剂(如以水性佐剂开始，然后加入抗原，可以是单独加入或预先混合)。如下所述，优选使HBsAg组分吸附于磷酸铝佐剂，然后与非HBV抗原性组分混合。
HBsAg融合蛋白
除用于表达HBsAg外，本发明可用于表达在同一多肽中含有HBsAg序列和非-HBsAg序列的杂交抗原。可将非-HBsAg序列插入HBsAg序列，或者可将其融合于HBsAg序列的N末端或C末端。
已知将HBsAg序列融合于异源抗原，以利用HBsAg的能力组合成颗粒。例如，参考文献102报道了HIV-1gp120与HBsAg融合得到能自发性组装成颗粒的蛋白质，所述颗粒的大小和密度类似于天然HBsAg颗粒，脂质组分约占25％，gp120含量约为每颗粒100个。gp120能够在融合物中折叠成天然构型，并限制其生物学活性。相似地，通过与HBsAg发生内部融合改进HIV gp41表位，该融合蛋白在酵母中自身组装成22nm脂蛋白颗粒[103]。
此方法也被用于疟疾疫苗。参考文献104报道了将来自疟疾gp190抗原的至多61aa的表位插入HBsAg序列，表达的杂交颗粒可在动物中引发抗-gp190免疫应答。参考文献105报道了含有16个重复的环孢子体蛋白4-单体序列的蛋白质，表达为HBsAg的融合蛋白。参考文献106报道了在酵母中产生由融合于HbsAg的Pfs16组成的病毒样颗粒。参考文献107公开了环孢子体蛋白融合于HBsAg的杂交抗原。参考文献108公开了间日疟原虫(P.vivax)的裂殖子表面1蛋白的C末端区的融合物，它形成的免疫原性颗粒的大小为20-45nm。因此，本领域熟知采用HBsAg以自身组装颗粒形式递呈疟疾抗原。
此方法特别适用于将HBsAg序列与HIV、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、三日疟原虫(Plasmodium malaria)或卵圆疟原虫(Plasmodium ovale)的抗原融合。适用于制备HBsAg杂交子的HIV抗原包括包膜糖蛋白gp120或其抗原性片段[102]。适用于制备HBsAg杂交子的恶性疟原虫抗原可以基于环孢子体表面抗原(＂CSP＂)的亚基，例如它们可包含3-20个重复的NANP基序(SEQID NO：14)，和/或它们可包含CSP的C末端区(但一般不包含C末端的最后12个氨基酸)。例如，本发明可采用称为＂RTS＂的抗原，其含有恶性疟原虫NF54或7G8分离物的CSP的C末端的一大部分(氨基酸210-398，其含有19个NANP重复和氨基酸367-390的T细胞表位区)，该部分通过HBsAg的前S2部分四个氨基酸融合于HBsAg的N末端。在酵母中表达时，RTS形成颗粒，该颗粒除蛋白质以外还含有脂质(主要是磷脂)。因此，如SEQ ID NO：15所示，RTS的序列含有：(i)N-末端甲硫氨酸残基；(ii)Met-Ala-Pro；(iii)对应于恶性疟原虫7G8的CS蛋白的氨基酸210-398或恶性疟原虫NF54的CS蛋白的氨基酸207-395的189个氨基酸；(iv)Arg或Gly；(v)来自乙型肝炎前-S2蛋白的Pro-Val-Thr-Asn；和(vi)HBsAg。参考文献109的SEQ IDNO：1给出了从7G8分离物得到的全长RTS的序列(也参见参考文献110的图5)：
MMAPDPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNANPNAN
PNANPNANPNKNNQGNGQGHNMPNDPNRNVDENNANNAVKNNNNEEPSDKHIEQYLKKIKNSISTEWSPCSVT
CGNGIQVRIKPGSANKPKDELDYENDIEKKICKMEKCSSVFNVVNSRPVTNMENITSGFLGPLLVLQAGFFLL
TRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGSPVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLL
VLLDYQGMLPVCPLIPGSTTTNTGPCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGNCTCIPIPSSWAFAKYLWEWASV
RFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSAIWMMWYWGPSLYSIVSPFIPLLPIFFCLWVYI
可以在酵母中用编码SEQ ID NO：15的序列表达此杂交抗原。优选在酵母中与正常HBsAg共同表达此杂交蛋白。以前将此方法用于RTS，共同表达产物称为＂RTS，S＂。可以采用约为1:4的RTS:S之比。
因此，本发明的有用方面是共同表达(i)HBsAg和(ii)RTS。可以用上述质粒表达这些抗原中的一种或两种。共同表达的蛋白质形成颗粒抗原，可用作疟疾疫苗的活性成分。
用于多价疫苗的佐剂
上面描述了包含CpG、AGP和AS04的′现代′佐剂。虽然它们可用于本发明多价组合物，但优选采用铝盐。它们包括称为氢氧化铝和磷酸铝的佐剂。这些名称是常规名称，但仅为方便使用，因为它们都不是所代表的实际化合物的准确描述[例如参见参考文献111的第9章]。本发明可采用通常用作佐剂的任何＂氢氧化物＂或＂磷酸盐＂佐剂。
称为＂氢氧化铝＂的佐剂一般是羟基氧化铝盐(通常至少部分为晶体)。可采用红外(IR)光谱将式AlO(OH)代表的羟基氧化铝与其它铝化合物，如氢氧化铝Al(OH)3区别开，具体区别是1070cm-1处存在吸收条带和3090-3100cm-1处存在强肩[参考文献111的第9章]。
称为＂磷酸铝＂的佐剂一般是羟基磷酸铝，也常常含有少量硫酸盐(即羟基磷酸硫酸铝)。它们可通过沉淀获得，沉淀期间的反应条件和浓度都会影响该盐中磷酸取代羟基的程度。羟基磷酸盐的PO4/Al摩尔比通常为0.3-1.2。可以通过是否存在羟基将羟基磷酸盐与严格的AlPO4区别开。例如，3164cm-1处的IR谱带(例如加热到200℃)表明存在结构羟基[参考文献111的第9章]。
磷酸铝佐剂的PO4/Al3+摩尔比通常为0.3-1.2，优选为0.8-1.2，更优选为0.95±0.1。磷酸铝通常是无定形的，尤其是羟基磷酸盐。典型的佐剂是PO4/Al摩尔比为0.84-0.92的无定形的羟基磷酸铝，包含0.6mg Al3+/ml。磷酸铝通常是颗粒。抗原吸附后颗粒直径一般是0.5-20μm(如约5-10μm)。
磷酸铝的PZC与磷酸对羟基的取代程度逆相关，这种取代程度可能取决于用于通过沉淀制备盐的反应条件和反应物浓度。也通过改变溶液中游离磷酸根离子的浓度(更多磷酸根＝更多酸性PZC)或加入缓冲液如组氨酸缓冲液(使PZC碱性更强)改变PZC。本发明所用的磷酸铝的PZC通常为4.0-7.0，更优选为5.0-6.5，例如约为5.7。
用于制备本发明组合物的磷酸铝溶液可以，但不一定含有缓冲液(如磷酸盐或组氨酸或Tris缓冲液)。磷酸铝溶液优选为无菌和无热原。磷酸铝溶液可含有游离的水性磷酸根离子，如浓度为1.0-20mM，优选5-15mM，更优选约10mM的磷酸根离子。磷酸铝溶液也可含有氯化钠。氯化钠浓度优选为0.1-100mg/ml(如0.5-50mg/ml，1-20mg/ml，2-10mg/ml)，更优选约为3±1mg/ml。NaCl的存在有助于在抗原吸附前正确测定pH。
铝盐可用于吸附任何HBV和非HBV抗原。HBsAg优选吸附于磷酸铝佐剂[70]。白喉类毒素优选吸附于氢氧化铝佐剂。破伤风类毒素优选(但不一定)吸附于氢氧化铝佐剂(如可采用吸附0-10％的破伤风类毒素)。无细胞百日咳抗原，具体是69kDa抗原，优选吸附于氢氧化铝佐剂。偶联的Hib抗原可吸附于磷酸铝[112，113]或可以不吸附。以此种方式吸附的Hib特别可用于含有D-T-Pw-Hib-HBsAg抗原的疫苗。其它偶联抗原(如脑膜炎球菌、肺炎球菌)可类似地吸附于铝盐(如磷酸盐)，或者可以不吸附[114]。IPV抗原在用于本发明方法之前一般不吸附于任何佐剂，但它们可吸附于用其它组分产生的铝佐剂。
就HBsAg吸附而言，磷酸铝佐剂优选以加入HBsAg的水溶液形式使用(NB：将水性磷酸铝称为＂溶液＂是标准称法，但从严格的物理化学观点来看，钙盐是不溶的，形成了悬液)。优选在加入HBsAg之前将磷酸铝稀释至所需浓度，并保证形成均一溶液。加入HBsAg之前Al3+的浓度通常为0-10mg/ml。优选的Al3+浓度为2-6mg/ml。
用于本发明方法的两种优选组分是：(1)二价D-T组分，含有氢氧化铝佐剂；和(2)三价D-T-Pw组分，含有氢氧化铝和磷酸铝佐剂。
药物组合物
除佐剂和抗原组分以外，本发明组合物可包含其它组分。这些组分可来自各种来源。例如，它们可存在于生产过程中使用的抗原或佐剂组分之一中，或者可与抗原性组分分别添加。
优选的本发明组合物包含一种或多种药物载体和/或赋形剂。
为了控制张力，优选包含生理性盐如钠盐。优选氯化钠(NaCl)，它的浓度可以是1-20mg/ml。
组合物的渗透压通常为200mOsm/kg-400mOsm/kg，优选为240-360mOsm/kg，更优选为290-300mOsm/kg。虽然以前报道过渗透压对疫苗接种引起的疼痛无影响[115]，但优选将渗透压保持在此范围内。
本发明组合物可含有一种或多种缓冲液。缓冲液一般包括：磷酸盐缓冲液；Tris缓冲液；硼酸盐缓冲液；琥珀酸盐缓冲液；组氨酸缓冲液；或柠檬酸缓冲液。包含的缓冲液的浓度一般是5-20mM。
本发明组合物的pH通常为5.0-7.5，更一般为5.0-6.0(最佳稳定性)，或者为6.0-7.0。因此，本发明方法可包括在包装前调整混合疫苗pH的步骤。
本发明组合物优选为无菌组合物。
本发明组合物优选无热原，如每剂量含有<1EU(内毒素单位，标准量度)，优选每剂量<0.1EU。
本发明组合物优选不含谷蛋白。
任何水性包装疫苗材料的pH优选为5-8，例如5.5-6.5。
由于HBsAg的吸附特性，最终疫苗产品可以是看上去混浊的悬浮液。这种外观意味着不容易观察到微生物污染，因此该疫苗优选含有抗微生物剂。当疫苗包装在多剂量容器中时这点尤其重要。所包含的抗微生物剂优选为2-苯氧基乙醇和硫柳汞。然而，在本发明方法中优选不用含汞防腐剂(如硫柳汞)。然而，如果在用于制备本发明组合物之前用这种防腐剂处理HBsAg则无法避免存在痕量的这种防腐剂。但是，出于安全性考虑，优选最终组合物含有的汞少于约25ng/ml。更优选地，最终疫苗产品所含的硫柳汞无法检测到。通常通过在加入本发明方法之前去除抗原制剂中的含汞防腐剂或在用于制备组合物的组分的制备过程中避免采用硫柳汞来实现此目的。
在本发明方法中使用二价D-T混合物时，应该不含硫柳汞。在一些实施方式中，D-T混合物可含有2-苯氧基乙醇，但在其它情况下不含硫柳汞和2-苯氧基乙醇。在本发明方法中使用三价D-T-Pw混合物时，可以不含2-苯氧基乙醇，但可包含硫柳汞。
在生产过程中，通常用WFI(注射用水)稀释组分以得到所需的终浓度。
表示为Al3+的本发明组合物中的磷酸铝浓度优选小于5mg/ml，例如≤4mg/ml、≤3mg/ml、≤2mg/ml、≤1mg/ml等。
本发明组合物中任何3D-MPL的浓度优选小于200μg/ml，例如≤150μg/ml、≤125μg/ml、≤110μg/ml、≤100μg/ml等。
本发明组合物中的HBsAg浓度优选小于60μg/ml，例如≤55μg/ml、≤50μg/ml、≤45μg/ml、≤40μg/ml等。浓度一般约为20μg/ml。
本发明组合物中的白喉类毒素浓度一般至少为50IU/ml。
本发明组合物中的破伤风类毒素浓度一般至少为100IU/ml。
本发明组合物中白喉类毒素与破伤风类毒素的比例通常为2:1-3:1(以Lf单位计)，优选为2.4:1-2.6:1，更优选为2.5:1。
采用细胞百日咳抗原时，一般至少为8IU/ml；采用无细胞抗原时，一般为每剂量25-75μg PT、25-75μg FHA和约10-20μg百日咳杆菌粘附素。
以糖计，本发明组合物中Hib偶联物的含量一般为10-30μg/ml。
以EU(Elisa单位)计，HAV抗原的含量一般为至少600EU/ml。
IPV抗原的含量取决于毒株血清型。就1型病毒而言，组合物一般含有约80DU/ml。就2型病毒而言，组合物一般含有约16DU/ml。就3型病毒而言，组合物一般含有约65DU/ml。以糖计，本发明组合物中脑膜炎球菌各血清组偶联物的含量一般为5-25μg/ml。
以糖计，本发明组合物中肺炎球菌各血清组偶联物的含量一般为2-20μg/ml。
优选以0.5ml剂量给予患者本发明组合物。应理解，0.5ml剂量含有正常差异，如0.5ml±0.05ml。
本发明可提供适合包装到单个剂量中的混合物质，随后可分配给予患者。上述浓度一般是最终包装剂量中的浓度，因此混合疫苗中的浓度可能更高(如通过稀释降低至最终浓度)。
本发明组合物通常是水性形式。
包装本发明组合物
混合HBsAg和佐剂后，本发明方法可包括将0.5ml混合物样品提取和包装到容器中的步骤。在多剂量的情况下，可将多个剂量提取和包装到一个容器中。
本发明可包括将疫苗包装到容器中待用的其它步骤。合适的容器包括药瓶和一次性注射器(优选无菌注射器)。
将本发明组合物包装到药瓶中时，药瓶优选由玻璃或塑料制成。在将组合物加入药瓶之前，优选对其进行消毒。为了避免胶乳敏感型患者的问题，优选用无胶乳的塞子密封药瓶。药瓶可包括单一剂量的疫苗，或者可以包括一个以上剂量(′多剂量′药瓶)，如10个剂量。采用多剂量药瓶时，应用无菌针头和注射器在严格无菌的条件下取出各剂量，小心避免污染药瓶内容物。优选的药品由无色玻璃制成。
药瓶可以有适合的帽(如Luer锁)，以便将预填装注射器插入该帽，可以将注射器的内容物推入药瓶(如在其中重建冻干物质)，可以将药瓶的内容物吸回注射器中。从药瓶中拔出注射器后，可连上针头，将该组合物给予患者。该帽优选位于封口或盖子内侧，以便在封口或盖子打开后才能接触到该帽。
将组合物包装到注射器中时，注射器通常不会连接有针头，但可提供单独的针头与注射器组装和使用。优选安全性针头。一般是1-英寸23-号、1-英寸25-号和5/8-英寸25-号针头。可提供有剥离标签的注射器，该标签上可打印上批号和过期日期，以帮助记录保存。注射器的活塞优选带有抑止装置，以防止活塞在吸出时偶然脱出。注射器可以有胶乳橡胶帽和/或活塞。一次性注射器含有单一剂量的疫苗。注射器通常带有顶帽，以在连接针头前密封顶端，顶帽优选由丁基橡胶制成。如果注射器和针头分开包装，那么针头优选装有丁基橡胶护罩。优选灰色丁基橡胶。优选的注射器是以商品名＂Tip-Lok＂TM出售的注射器。
采用玻璃容器(如注射器或药瓶)时，优选采用由硼硅酸盐玻璃，而非钠钙玻璃制成的容器。
将组合物包装到容器中后，可将容器密封到用于分销的箱子，如纸板箱中，该箱子标上该疫苗的详细情况，例如其商品名、疫苗所含抗原的列表(如′乙型肝炎重组物′等)、提供的容器(如′一次性预填充Tip-Lok注射器′或′10 x 0.5ml单剂量药瓶′)、其剂量(如′各自含有一个0.5ml剂量′)、警告(如′仅用于成年人′或′仅用于儿童′)、过期日期、说明(如′激活对所有已知亚型引起的乙型肝炎病毒(HBV)感染的免疫，用于肾功能不全(包括血液透析前和血液透析)、年龄为15岁以上的患者等)、专利号等。各箱含有一个以上的包装疫苗，例如5-10个包装疫苗(具体是药瓶)。如果疫苗包含在注射器中，那么该包装可显示注射器的照片。
可将疫苗与单页宣传品包装在一起(在同一个箱子中)，所述单页宣传品包括疫苗的详细情况如给药说明书、疫苗内所含抗原的详情等。说明书也可包含警告，(例如)准备好肾上腺素溶液以应对疫苗接种后发生过敏反应的情况等。
包装疫苗优选保存于2℃-8℃。不应被冷冻。
在生产过程中可以全液体形式提供疫苗(即所有抗原性组分都在水溶液或悬液中)，或者可以一些组分是液体形式、另一些组分是冻干形式的形式制备。因此，可以在使用时通过混合以下两种组分当场制备最终疫苗：(a)含有水性抗原的第一种组分；和(b)含有冻干抗原的第二种组分。这两种组分优选装在不同的容器(如小瓶和/或注射器)中，本发明提供了包括组分(a)和(b)的药盒。这种形式特别可用于包含偶联物组分，特别是Hib和/或脑膜炎球菌偶联物的疫苗，因为它们可能在冻干形式中更稳定。因此，可在用于本发明之前将偶联物冻干。也可在冻干前加入其它组分，如稳定剂。所包含的稳定剂优选为乳糖、蔗糖和甘露醇，及其混合物，如乳糖/蔗糖混合物、蔗糖/甘露醇混合物等。因此，最终疫苗可含有乳糖和/或蔗糖。采用蔗糖/甘露醇混合物可加速干燥过程。
因此，本发明提供了制备双容器组合疫苗的方法，所述方法包括以下步骤：
-如上所述制备组合疫苗水溶液，但其中所述一种或多种抗原不包括偶联的荚膜糖抗原；
-将所述组合疫苗包装到第一种容器(如注射器)中；
-制备冻干形式的偶联荚膜糖抗原；
-将所述冻干抗原包装到第二种容器(如药瓶)中；和
-将所述第一种容器和第二种容器一起包装到药盒中。
然后可将该药盒分配给医生。
D、T、P和HBsAg组分优选为液体形式。
治疗方法和疫苗的给药
本发明组合物适合给予人类患者，本发明提供了在患者中产生免疫应答的方法，包括将本发明组合物给予患者的步骤。
本发明也提供了用于药物的本发明组合物。
本发明也提供了将(i)按照本发明表达的HBsAg和(ii)一种或多种非-HBV抗原用于制备给予患者的药物的应用。
本发明也提供了将(i)按照本发明表达的HBsAg和(ii)除氢氧化铝外的佐剂用于制备给予患者的药物的应用。所述药物优选为单价疫苗。接受此种疫苗的优选患者群体如上所述。
本发明免疫原性组合物优选用于预防和/或治疗至少乙型肝炎病毒感染的疫苗。在第一次免疫后6周测定时，接受本发明组合物的患者的血清抗-HBsAg GM效价优选≥500mIU/ml。更优选地，在12个月后测定时，该效价≥500mIU/ml。
为了达到完全效能，典型的儿童免疫方案可包括给予一个以上的剂量。例如，剂量可以是：0和6个月(时间0点为第一个剂量)；0、1、2和6个月；第0天、第21天，然后在6-12个月给予第三个剂量；或者是0、1、2、6和12个月。
可通过肌肉内注射到(例如)手臂或腿中给予本发明组合物。
本发明生产的疫苗可与单独肺炎球菌偶联疫苗如PrevnarTM同时给予患者。
当本发明组合物包含铝基佐剂时，在储存期间可能发生成分沉淀。因此，在给予患者之前应该振荡该混合物。振荡过的组合物是混浊的白色悬液。
优选疫苗
本发明的具体多价免疫原性组合物包括：
·含有HBsAg和HAV的二价组合物。该疫苗为水性形式。它包含氢氧化铝和磷酸铝佐剂。HBsAg吸附于磷酸铝。HAV吸附于氢氧化铝。每毫升含有：约720ELISA单位HAV；约20μg HBsAg。剂量：约1ml。可以在预填充注射器中提供。
·含有HBsAg、D、T、Pa和IPV的五价组合物。该疫苗为水性形式。它包含氢氧化铝和磷酸铝佐剂。HBsAg吸附于磷酸铝。D、T和Pa吸附于氢氧化铝。每毫升含有：约50Lf白喉类毒素；约20Lf破伤风类毒素；约50/Ag PT；约50μgFHA；约16μg百日咳杆菌粘附素；约20μg HBsAg；约80DU1型脊髓灰质炎病毒；约16DU2型脊髓灰质炎病毒；约64DU3型脊髓灰质炎病毒。剂量：约0.5ml。可以在预填充注射器中提供。
·含有HBsAg、D、T、Pa和IPV的五价组合物。该疫苗为水性形式。它包含氢氧化铝和磷酸铝佐剂。HBsAg吸附于磷酸铝。D、T和Pa吸附于氢氧化铝。每毫升含有：至少60IU白喉类毒素；至少80IU破伤风类毒素；约50μg PT；约50μgFHA；约16μg百日咳杆菌粘附素；约20μg HBsAg；约80DU1型脊髓灰质炎病毒；约16DU2型脊髓灰质炎病毒；约64 DU 3型脊髓灰质炎病毒。剂量：约0.5ml。可以在预填充注射器中提供。
·含有HBsAg、D、T和Pw的四价组合物。这些组分是水性形式。它包含氢氧化铝和磷酸铝佐剂。HBsAg吸附于磷酸铝。D和T吸附于氢氧化铝。该组合物包含硫柳汞，但优选不含2-苯氧基乙醇。每毫升含有：至少60IU白喉类毒素；至少120IU破伤风类毒素；至少8IU Pw；约20μg HBsAg。剂量：约0.5ml。
·含有HBsAg、D、T、Pw和Hib-T偶联物的五价组合物。HBsAg、D、T和Pw组分是水性形式；Hib-T是冻干形式。它包含氢氧化铝和磷酸铝佐剂。D和T吸附于氢氧化铝。HBsAg和Hib-T吸附于磷酸铝。冻干的Hib-T包含乳糖。水性组分可含有硫柳汞。每毫升含有：至少60IU白喉类毒素；至少120 IU破伤风类毒素(以及5-25μg破伤风类毒素作为Hib-T中的载体)；至少8 IU Pw；约20μg HBsAg；约5μgHib-T(以糖计)。剂量：约0.5ml。
这些组合物可单独使用，或者作为其它疫苗的组分。例如，本发明提供了含有上述五价HBsAg-D-T-Pa-IPV组合物和冻干Hib-T偶联物的六价组合物。冻干的Hib-T优选不吸附于铝盐。本发明也提供了含有上述四价HBsAg-D-T-Pw组合物和冻干Hib-T偶联物的五价组合物。本发明也提供了含有上述四价HBsAg-D-T-Pw组合物以及Hib-T偶联物、MenA偶联物和MenC偶联物的冻干混合物的七价组合物。最终疫苗可通过在使用时用含HBsAg的含水物质重建冻干物质制备，优选将冻干组分和含水组分一起包装在药盒中，如上所述。
本发明的具体单价免疫原性组合物是：
·与磷酸铝佐剂和3D-MPL佐剂混合的HBsAg，其中HBsAg和3D-MPL都吸附于磷酸铝。每剂量含有：约20μg HBsAg，约50μg3D-MPL，约0.5mg Al3+。
本发明的具体方法包括以下步骤：
·按照本发明表达后纯化HBsAg；将HBsAg吸附于磷酸铝佐剂；获得不含硫柳汞的二价D-T与氢氧化铝佐剂的混合物；获得用于Pa组分的PT、FHA和百日咳杆菌粘附素；以1、2和3型混合物的形式获得IPV抗原，优选不含铝盐佐剂；以任何顺序混合D-T、Pa、IPV和HBsAg，得到最终五价混合物；任选地，包装到注射器中。
·按照本发明表达后纯化HBsAg；将HBsAg吸附于磷酸铝佐剂；获得不含2-苯氧基乙醇、含硫柳汞的三价D-T-Pw与氢氧化铝和磷酸铝佐剂的混合物；混合D-T-Pw与HBsAg，得到最终的四价混合物；任选地，包装到注射器中；任选地，与冻干偶联物组分如Hib-T、MenA、MenC一起包装。
·按照本发明表达后纯化HBsAg；将HBsAg吸附于磷酸铝佐剂；获得不含2-苯氧基乙醇、含硫柳汞的三价D-T-Pw与氢氧化铝和磷酸铝佐剂的混合物；获得冻干的Hib-T偶联物；混合D-T-Pw与HBsAg，得到含水的四价组分；将含水的四价组分包装到玻璃药瓶中；将冻干的Hib-T包装到玻璃药瓶中；将这两个药瓶合并到一个药盒中，以重建得到五价组合疫苗。玻璃药瓶可以是I型玻璃并装有丁基橡胶塞。
·按照本发明表达后纯化HBsAg；将HBsAg吸附于磷酸铝佐剂；获得不含2-苯氧基乙醇、含硫柳汞的三价D-T-Pw与氢氧化铝和磷酸铝佐剂的混合物；以1、2和3型混合物的形式获得IPV抗原，优选不含铝盐佐剂；以任何顺序混合D-T-Pw、IPV和HBsAg，得到最终的五价混合物；任选地，包装到注射器中；任选地，与冻干偶联物组分如Hib-T、MenA、MenC一起包装。
在任何阶段可加入其它组分，如氯化钠、佐剂、防腐剂等。可采用这些方法(例如)来制备上述疫苗。
不同的方法步骤可以在基本相同的时间进行，或者可以分别进行。可以在相同位置或不同位置，甚至在不同国家进行，例如，HBsAg表达可能发生在不同于Hib-T偶联物冻干的地点。
偶联物的载体蛋白
偶联的糖抗原包含直接或通过接头共价连接于糖的载体蛋白。关于偶联的普通信息可参见参考文献116。
已知各种蛋白质可用作载体，优选的载体蛋白是细菌毒素或类毒素，如白喉类毒素或破伤风类毒素。其它合适的载体蛋白包括但不限于：白喉毒素的CRM197突变体[117-119]、脑膜炎奈瑟球菌外膜蛋白[120]、合成肽[121，122]、热激蛋白[123，124]、百日咳蛋白[125，126]、细胞因子[127]、淋巴因子[127]、激素[127]、生长因子[127]、含有各种病原体衍生抗原的多种人CD4+T细胞表位的人工蛋白[128]如N19[129]、流感嗜血杆菌的蛋白D[130，131]、肺炎球菌表面蛋白PspA[132]、肺炎链球菌溶血素[133]、摄铁蛋白[134]、艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B[135]、无乳链球菌(S.agalactiae)蛋白[136]等。
优选通过-NH2基团，如载体蛋白的赖氨酸残基侧链中或精氨酸残基侧链中的-NH2基团将糖连接于载体。也可能连接于-SH基团(如半胱氨酸侧链中的-SH基团)。
优选糖:蛋白质之比(w/w)为1:5(即蛋白质过量)-5:1(即糖过量)的偶联物。
组合物可包含少量游离的载体。如果不考虑作为单独抗原包含的任何载体，在整个组合物中，未偶联载体优选不超过载体蛋白总量的5％，更优选占2重量％以下。
组合物中可能包含一种以上类型的载体蛋白，(例如)以降低载体抑制的风险。
用于脑膜炎奈瑟球菌偶联物的载体蛋白可以是流感嗜血杆菌的蛋白D。参考文献137和138中详细描述了此蛋白，参考文献139中描述了将其用作偶联物中的载体蛋白。术语＂蛋白D＂包括如参考文献139所述的天然全长蛋白的片段，以及含有全长蛋白D或这些片段的融合蛋白(如流感病毒NS1蛋白的片段和蛋白D的片段的融合物)。与该片段偶联时仍然能够将T-非依赖性糖抗原转变为T-依赖性抗原。典型片段至少包含蛋白D的N-末端1/3。可在大肠杆菌中方便地表达该蛋白[138]，本发明优选采用此重组物质[139]。
概述
术语“含有”包括“包含”以及“由...组成”，例如“含有”X的组合物可仅由X组成或可包含其它物质，例如X+Y。
术语＂基本上＂不排除＂完全＂，如＂基本上不含＂Y的组合物可能完全不含Y。必要时，可从本发明定义中删去术语＂基本上＂。
与数值x相关的术语“约”表示，例如x±10％。
除非另有说明，包括混合两种或多种组分的步骤的方法不需要任何特定的混合顺序。因此，可以任何顺序混合这些组分。有三种组分时，两种组分可以相互混合，然后将混合的组分再与第三种组分混合等。
将抗原抗原描述为＂吸附＂于佐剂时，优选至少吸附了50重量％的该抗原，例如50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或更多。优选的是，白喉类毒素和破伤风类毒素均完全吸附，即上清液中检测不到。也优选HBsAg完全吸附。
应理解，可离子化的基团可以本文式中所示的中性形式存在，或者可以带电形式存在，这取决于pH。因此，磷酸基团可以是-P-O-(OH)2，此式仅代表中性磷酸基团，本发明也包括其它带电形式。相似地，糖环可以是开放或闭合形式，虽然本文结构式中显示的是闭合形式，但本发明也包括开放形式。
将动物(具体是牛)材料用于培养细胞时，它们应获自未患传染性海绵状脑病(TSE)，特别是未患牛海绵状脑病(BSE)的来源。
序列表详述
 
SEQ ID NO： 详述
1 优选的GAPDH启动子核苷酸序列
2 SEQ ID NO：1，后接启动子
3 优选的HBsAg氨基酸序列
4 优选的HBsAg核苷酸序列
5 已知的1061-单体的启动子序列[41]
6 ARG3终止密码子下游的已知核苷酸(GI：171076)
7 SEQ ID NO：6，向编码序列中反向延伸250个核苷酸
8 HBsAg编码序列下游所用的优选序列
9 SEQ ID NO：8和上游ochre终止密码子
10 已知的HBsAg氨基酸序列(CAA84792.1)
11 TLR佐剂
12 TLR佐剂
13 含有启动子、HBsAg编码序列和终止子序列的组合序列
本发明的实施方式
质粒制备
构建含有以下顺序的各种元件的质粒：酵母GAPDH启动子；HBsAg编码序列；
含有酵母ARG3转录终止子的区域；大肠杆菌载体pBR327的DNA；含有LEU2标记物的酵母DNA；大肠杆菌载体pBR327的DNA；酵母2μ质粒序列；大肠杆菌载体pBR327的DNA。pBR327序列包含在大肠杆菌中有功能的ori。该质粒总长为14600-14700bp。
GAPDH启动子序列包含以下1060-个核苷酸(SEQ ID NO：1)：
aagcttaccagttctcacacggaacaccactaatggacacacattcgaaatactttgaccctattttcgagga
ccttgtcaccttgagcccaagagagccaagatttaaattttcctatgacttgatgcaaattcccaaagctaat
aacatgcaagacacgtacggtcaagaagacatatttgacctcttaacaggttcagacgcgactgcctcatcag
taagacccgttgaaaagaacttacctgaaaaaaacgaatatatactagcgttgaatgttagcgtcaacaacaa
gaagtttactgacgcggaggccaaggcaaaaagattccttgattacgtaagggagttagaatcattttgaata
aaaaacacgctttttcagttcgagtttatcattatcaatactgccatttcaaagaatacgtaaataattaata
gtagtgattttcctaactttatttagtcaaaaaattagccttttaattctgctgtaacccgtacatgcccaaa
atagggggcgggttacacagaatatataacatcgtaggtgtctgggtgaacagtttattcctggcatccacta
aatataatggagcccgctttttaagctggcatccagaaaaaaaaagaatcccagcaccaaaatattgttttct
tcaccaaccatcagttcataggtccattctcttagcgcaactacagagaacaggggcacaaacaggcaaaaaa
cgggcacaacctcaatggagtgatgcaacctgcctggagtaaatgatgacacaaggcaattgacccacgcatg
tatctatctcattttcttacaccttctattaccttctgctctctctgatttggaaaaagctgaaaaaaaaggt
tgaaaccagttccctgaaattattcccctacttgactaataagtatataaagacggtaggtattgattgtaat
tctgtaaatctatttcttaaacttcttaaattctacttttatagttagtcttttttttagttttaaaacacca
agaacttagtttcgaataaacacacataaacaaacaaa
HBsAg编码序列如下(SEQ ID NO：4)，后接赭石终止密码子：
atggagaacatcacatcaggattcctaggacccctgctcgtgttacaggcggggtttttcttgttgacaagaa
tcctcacaataccgcagagtctagactcgtggtggacttctctcaattttctagggggatcacccgtgtgtct
tggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcactcaccaacctcctgtcctccaatttgtcctggttatcgc
tggatgtgtctgcggcgttttatcatattcctcttcatcctgctgctatgcctcatcttcttattggttcttc
tggattatcaaggtatgttgcccgtttgtcctctaattccaggatcaacaacaaccaatacgggaccatgcaa
aacctgcacgactcctgctcaaggcaactctatgtttccctcatgttgctgtacaaaacctacggatggaaat
tgcacctgtattcccatcccatcgtcctgggctttcgcaaaatacctatgggagtgggcctcagtccgtttct
cttggctcagtttactagtgccatttgttcagtggttcgtagggctttcccccactgtttggctttcagctat
atggatgatgtggtattgggggccaagtctgtacagcatcgtgagtccctttataccgctgttaccaattttc
ttttgtctctgggtatacatt
此序列编码含有以下氨基酸序列SEQ ID NO：3的多肽：
MENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGSPVCLGQNSQSPTSNHSPTSCPPICPGYR
WMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSTTTNTGPCKTCTTPAQGNSMFPSCCCTKPTDGN
CTCIPIPSSWAFAKYLWEWASVRFSWLSLLVPFVQWFVGLSPTVWLSAIWMMWYWGPSLYSIVSPFIPLLPIF
FCLWVYI
ARG3序列包含以下689-个核苷酸序列(SEQ ED NO：8)，其中含有ARG3下游区域的其它序列：
cgaattccaagctgaaacaattcaaaggttttcaaatcaatcaagaacttgtctctgtggctgatccaaacta
caaatttatgcattgtctgccaagacatcaagaagaagttagtgatgatgtcttttatggagagcattccata
gtctttgaagaagcagaaaacagattatatgcagctatgtctgccattgatatctttgttaataataaaggta
atttcaaggacttgaaataatccttctttcgtgttcttaataactaatatataaatacagatatagatgcatg
aataatgatatacattgattattttgcaatgtcaattaaaaaaaaaaaatgttagtaaaactatgttacattc
caagcaaataaagcacttggttaaacgaaattaacgtttttaagacagccagaccgcggtctaaaaatttaaa
tatacactgccaacaaattccttcgagttgtccaatttcaccacttttatattttcatcaacttcagcagatt
caaccttctcacatagaacattggaataaacagccttaacaccactttcaagtttgcacagcgtaatatgagg
aattttgttttgacaacacaaccctttaattttctcattgttttcatcaattatgcatccatctttatcttta
gacagttccactacaatagcaatagttttttc
因此，该质粒的表达盒包含以下2430-个核苷酸(SEQ ID NO：13)：
aagcttaccagttctcacacggaacaccactaatggacacacattcgaaatactttgaccctattttcgagga
ccttgtcaccttgagcccaagagagccaagatttaaattttcctatgacttgatgcaaattcccaaagctaat
aacatgcaagacacgtacggtcaagaagacatatttgacctcttaacaggttcagacgcgactgcctcatcag
taagacccgttgaaaagaacttacctgaaaaaaacgaatatatactagcgttgaatgttagcgtcaacaacaa
gaagtttactgacgcggaggccaaggcaaaaagattccttgattacgtaagggagttagaatcattttgaata
aaaaacacgctttttcagttcgagtttatcattatcaatactgccatttcaaagaatacgtaaataattaata
gtagtgattttcctaactttatttagtcaaaaaattagccttttaattctgctgtaacccgtacatgcccaaa
atagggggcgggttacacagaatatataacatcgtaggtgtctgggtgaacagtttattcctggcatccacta
aatataatggagcccgctttttaagctggcatccagaaaaaaaaagaatcccagcaccaaaatattgttttct
tcaccaaccatcagttcataggtccattctcttagcgcaactacagagaacaggggcacaaacaggcaaaaaa
cgggcacaacctcaatggagtgatgcaacctgcctggagtaaatgatgacacaaggcaattgacccacgcatg
tatctatctcattttcttacaccttctattaccttctgctctctctgatttggaaaaagctgaaaaaaaaggt
tgaaaccagttccctgaaattattcccctacttgactaataagtatataaagacggtaggtattgattgtaat
tctgtaaatctatttcttaaacttcttaaattctacttttatagttagtcttttttttagttttaaaacacca
agaacttagtttcgaataaacacacataaacaaacaaaATGgagaacatcacatcaggattcctaggacccct
gctcgtgttacaggcggggtttttcttgttgacaagaatcctcacaataccgcagagtctagactcgtggtgg
acttctctcaattttctagggggatcacccgtgtgtcttggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcact
caccaacctcctgtcctccaatttgtcctggttatcgctggatgtgtctgcggcgttttatcatattcctctt
catcctgctgctatgcctcatcttcttattggttcttctggattatcaaggtatgttgcccgtttgtcctcta
attccaggatcaacaacaaccaatacgggaccatgcaaaacctgcacgactcctgctcaaggcaactctatgt
ttccctcatgttgctgtacaaaacctacggatggaaattgcacctgtattcccatcccatcgtcctgggcttt
cgcaaaatacctatgggagtgggcctcagtccgtttctcttggctcagtttactagtgccatttgttcagtgg
ttcgtagggctttcccccactgtttggctttcagctatatggatgatgtggtattgggggccaagtctgtaca
gcatcgtgagtccctttataccgctgttaccaattttcttttgtctctgggtatacattTAAcgaattccaag
ctgaaacaattcaaaggttttcaaatcaatcaagaacttgtctctgtggctgatccaaactacaaatttatgc
attgtctgccaagacatcaagaagaagttagtgatgatgtcttttatggagagcattccatagtctttgaaga
agcagaaaacagattatatgcagctatgtctgccattgatatctttgttaataataaaggtaatttcaaggac
ttgaaataatccttctttcgtgttcttaataactaatatataaatacagatatagatgcatgaataatgatat
acattgattattttgcaatgtcaattaaaaaaaaaaaatgttagtaaaactatgttacattccaagcaaataa
agcacttggttaaacgaaattaacgtttttaagacagccagaccgcggtctaaaaatttaaatatacactgcc
aacaaattccttcgagttgtccaatttcaccacttttatattttcatcaacttcagcagattcaaccttctca
catagaacattggaataaacagccttaacaccactttcaagtttgcacagcgtaatatgaggaattttgtttt
gacaacacaaccctttaattttctcattgttttcatcaattatgcatccatctttatctttagacagttccac
tacaatagcaatagttttttc
质粒元件的序列分析
GAPDH启动子序列(SEQ ID NO：1)与参考文献41公开的GAPDH启动子序列(SEQ ID NO：5)在几个位置上不同：
0    [AAGCTTACCAGTTCTCACACGGAACACCACTAATGGACACA]a[ATTCGAAATACT
0    [AAGCTTACCAGTTCTCACACGGAACACCACTAATGGACACA]c[ATTCGAAATACT
54   TTGACCCTATTTTCGAGGACCTTGTCACCTTGAGCCCAAGAGAGCCAAGATTTAAATTTT
54   TTGACCCTATTTTCGAGGACCTTGTCACCTTGAGCCCAAGAGAGCCAAGATTTAAATTTT
114  CCTATGACTTGATGCAAATTCCCAAAGCTAATAACATGCAAGACACGTACGGTCAAGAAG
114  CCTATGACTTGATGCAAATTCCCAAAGCTAATAACATGCAAGACACGTACGGTCAAGAAG
174  ACATATTTGACCTCTTAAC]t[GGTTCAGACGCGACTGCCTCATCAGTAAGACCCGTT
174  ACATATTTGACCTCTTAAC]a[GGTTCAGACGCGACTGCCTCATCAGTAAGACCCGTT
230  GAAAAGAACTTACCTGAAAAAAACGAATATATACTAGCGTTGAATGTTAGCGTCAACAAC
230  GAAAAGAACTTACCTGAAAAAAACGAATATATACTAGCGTTGAATGTTAGCGTCAACAAC
290  AAGAAGTTTA]a[TGACGCGGAGGCCAAGGCAAAAAGATTCCTTGATTACGTAAGGGA
290  AAGAAGTTTA]c[TGACGCGGAGGCCAAGGCAAAAAGATTCCTTGATTACGTAAGGGA
346  GTTAGAATCATTTTGAATAAAAAACACGCTTTTTCAGTTCGAGTTTATCATTATCAATAC
346  GTTAGAATCATTTTGAATAAAAAACACGCTTTTTCAGTTCGAGTTTATCATTATCAATAC
406  TGCCATTTCAAAGAATACGTAAATAATTAATAGTAGTGATTTTCCTAACTTTATTTAGTC
406  TGCCATTTCAAAGAATACGTAAATAATTAATAGTAGTGATTTTCCTAACTTTATTTAGTC
466  ].[AAAAATTAGCCTTTTAATTCTGCTGTAACCCGTACATGCCCAAAATAGGGGGCGG
466  ]a[AAAAATTAGCCTTTTAATTCTGCTGTAACCCGTACATGCCCAAAATAGGGGGCGG
521  GTTACACAGAATATATAACATCGTAGGTGTCTGGGTGAACAGTTTAT]c[CCTGGCAT
522  GTTACACAGAATATATAACATCGTAGGTGTCTGGGTGAACAGTTTAT]t[CCTGGCAT
577  CCACTAAATATAATGGAGC]tcgc.[TTTTAAGCTGGCATCCAGAAAAAAAAAGAATC
578  CCACTAAATATAATGGAGC]ccgct[TTTTAAGCTGGCATCCAGAAAAAAAAAGAATC
632  CCAGCACCAAAATATTGTTTTCTTCACCAACCATCAGTTCATAGGTCCATTCTCTTAGCG
634  CCAGCACCAAAATATTGTTTTCTTCACCAACCATCAGTTCATAGGTCCATTCTCTTAGCG
692  CAACTACAGAGAACAGGGGCACAAACAGGCAAAAAACGGGCACAACCTCAATGGAGTGAT
694  CAACTACAGAGAACAGGGGCACAAACAGGCAAAAAACGGGCACAACCTCAATGGAGTGAT
752  GCAACCTGCCTGGAGTAAATGATGACACAAGGCAATTGACCCACGCATGTATCTATCTCA
754  GCAACCTGCCTGGAGTAAATGATGACACAAGGCAATTGACCCACGCATGTATCTATCTCA
812  TTTTCTTACACCTTCTATTACCTTCTGCTCTCTCTGATTTGGAAAAAGCTGAAAAAAAAG
814  TTTTCTTACACCTTCTATTACCTTCTGCTCTCTCTGATTTGGAAAAAGCTGAAAAAAAAG
872  GTTGAAACCAGTTCCCTGAAATTATTCCCCTACTTGACTAATAAGTATATAAAGACGGTA
874  GTTGAAACCAGTTCCCTGAAATTATTCCCCTACTTGACTAATAAGTATATAAAGACGGTA
932  GGTATTGATTGTAATTCTGTAAATCTATTTCTTAAACTTCTTAAATTCTACTTTTATAGT
934  GGTATTGATTGTAATTCTGTAAATCTATTTCTTAAACTTCTTAAATTCTACTTTTATAGT
992  TAGTCTTTTTTTTAGTTTTAAAACACCAAGAACTTAGTTTCGAATAAACACACATAAACA
994  TAGTCTTTTTTTTAGTTTTAAAACACCAAGAACTTAGTTTCGAATAAACACACATAAACA
1052 AACAA]gctt
1054 AACAA]a...
在2005年4月7日用SEQ ID NO：1去查询＂所有GenBank+EMBL+DDBJ+PDB序列(但不含EST，STS，GSS，环境样品或0、1或2期HTGS序列)＂，没有过滤。此搜索中的最高命中条目与SEQ ID NO：1的比对如下：
>gi|1323342|emb|Z72978.1|SCYGR193C酿酒酵母染色体VII阅读框ORF YGR193c
长度＝2262
评分＝2085位(1052)，预计值＝0.0
相同性＝1058/1060(99％)
链＝+/-
Figure A200680021813D00381
Figure A200680021813D00391
因此，SEQ ID NO：1与最接近匹配的反向互补物相比在两个核苷酸上不同。
通过相同方式用GenBank序列分析HBsAg编码序列(SEQ ID NO：4)。SEQ IDNO：4与最接近数据库匹配(AY576426.1)相比仅在核苷酸350上不同(A/G)。此差异导致密码子由Ser改变为Asn。
在2005年4月4日用＂非冗余GenBank CDS翻译+PDB+SwissProt+PIR+PRF，不含环境样品＂数据库通过BLASTP分析编码序列(SEQ ID NO：3)，没有过滤。SEQID NO：3与最接近数据库匹配在氨基酸117上不同，SEQ ID NO：3含有Asn残基而非Ser。最高命中是CAA84792.1(SEQ ID NO：10)
>gi|527444|emb|CAA84792.1|表面蛋白S[乙型肝炎病毒]
gi|7429123|pir||JQ1575主要表面抗原-乙型肝炎病毒
长度＝400
评分＝494位(1271)，预计值＝e-139
相同性＝225/226(99％)，阳性＝226/226(100％)
Figure A200680021813D00401
ARG3下游序列(SEQ ID NO：8)的BLASTN分析揭示出与数据库条目M28301.1100％匹配，然而是从SEQ ID NO：8的核苷酸7开始的683个核苷酸的重叠。这两个序列(包括SEQ ID NO：8的5′端的7个核苷酸)的CLUSTALW比对见下：
HBsAg表达和吸附
用该质粒转化酿酒酵母leu2-3 leu 2-112 his 3 can1-11菌株(DC5)。用含有纯化氨基酸(但不含亮氨酸)、维生素和合适盐的合成培养基培养该酵母。通过包括细胞回收、沉淀、超滤、凝胶渗透、离子交换、超速离心和脱盐的方法纯化表达的HBsAg。
纯化抗原是非-糖基化抗原，可以观察到是基本呈球形的颗粒(平均直径～20nm)。
将磷酸铝在等渗盐水中的悬液与纯化的HBsAg浓缩物混合。将pH调整到5.2-6.0后，使该混合物在室温下搅拌1天。在这段时间抗原吸附于佐剂。
单价疫苗
为了制备单价疫苗，将3D-MPL加入吸附的HBsAg中，用注射用水和无菌盐水稀释，使HBsAg终浓度为20μg/ml。然后，将大量产生的疫苗包装到药品或一次性注射器中，形成单个剂量。
多价疫苗
为了制备组合疫苗，从德国马尔堡的Chiron Behring获得DTPw抗原混合物。将此混合物与吸附的HBsAg混合，得到四价疫苗产物。此四价产物本身即可使用，或者可用于重建(a)吸附于磷酸铝佐剂的冻干Hib-T偶联物，或(b)Hib、MenA和MenC的冻干偶联物的三价混合物。
应理解，仅以举例的方式描述了本发明，可在本发明的范围和构思内进行修改。
参考文献(将其内容纳入本文作参考)
[1]Vaccines(疫苗)(Plotkin和Orenstein编)，第4版，2004，ISBN：0-7216-9688-0。
[2]Desombere等(2002)Vaccine20：2597-602。
[3]Cooper等(2004)J Clin Immunol24：693-701。
[4]Pasek等(1979)Nature 282：575-9。
[5]MacKay等(1981)PNAS USA 78：4510-4。
[6]Fujisawa等(1983)Nucleic Acids Res 11：4645-54。
[7]Dubois等(1980)PNAS USA 77：4549-53。
[8]Hirschman等(1980)PNAS USA 77：5507-11。
[9]Liu等(1982)DNA1：213-21。
[10]Valenzuela等(1982)Nature 298：347-50。
[11]Harford等(1983)Dev Biol Stand 54：125-30。
[12]McAleer等(1984)Nature 307：178-80。
[13]Smith等(2002)Biotechnol Prog 18：538-50。
[14]Shulga等(2004)Biochemistry(Mosc)69：1158-64。
[15]Valdes等(2004)BBRC 310：742-7。
[16]Smith等(2003)Vaccine 21：4011-21。
[17]Sojikul等(2003)PNAS USA 100：2209-14。
[18]Smith等(2002)Biotechnol Bioeng 80：812-22。
[19]Kong等(2001)PNAS USA 98：11539-44。
[20]Richter等(2000)Nature Biotechnol18：1167-71。
[21]Kapusta等(1999)FASEB J 13：1796-9。
[22]Mason等(1992)PNAS USA 89：11745-9。
[23]Huang等(2005)Vaccine 23：1851-8。
[24]Thanvala等(2005)PNAS USA 102：3378-82。
[25]Valdes等(2003)BBRC 310：742-7。
[26]Hardy等(2000)J Biotechnol 17：157-67。
[27]Lepetec等(2003)Vaccine 21：4481-5。
[28]Heijtink等(2002)Vaccine 20：2191-6。
[29]Vanlandschoot等(2003)J Med Virol 70：513-9。
[30]Desombere等(1998)Tissue Antigens 51：593-604。
[31]McDermott等(1997)Tissue Antigens 50：8-14。
[32]Blitz等(1998)J Clin Microbiol 36：648-51。
[33]Teles等(2002)J MedVirol 68：41-9。
[34]MMWR April12，1996/45(14)；285-9。
[35]Teles等(1999)ArtifOrgans23)：1074-8。
[36]Lewis-Ximeneza等(2001)Nephron87：19-26。
[37]Holland和Holland(1979)J.Biol.Chem.254：5466-74。
[38]Holland和Holland(1979)J.Biol.Chem.254：9839-45。
[39]Holland和Holland(1980)J.Biol.Chem.255：2596-605。
[40]Holland等(1983)J.Biol.Chem.258：5291-9。
[41]欧洲专利0460716；美国专利5,349,059。
[42]Crabeel等(1983)Proc Natl Acad Sci USA 78：5026-30。
[43]
Figure A200680021813D0044114949QIETU
等(1984)Proc Natl Acad Sci USA 81：6594-8。
[44]van der Straten等(1986)DNA 5：129-36。
[45]Harford等(1987)Postgraduate MedicalJournal 63(增刊2)：65-70。
[46]Ludwig和Bruschi(1991)Plasmid 25：81-95。
[47]美国专利4,683,294。
[48]WO03/066094。
[49]Kandimalla等(2003)Nucleic Acids Research 31：2393-2400。
[50]WO02/26757。
[51]WO99/62923。
[52]Krieg(2003)Nature Medicine 9：831-835。
[53]McCluskie等(2002)FEMSImmunologyandMedicalMicrobiology32：179-185。
[54]WO98/40100。
[55]美国专利6,207,646。
[56]美国专利6,239,116。
[57]美国专利6,429,199。
[58]Kandimalla等(2003)Biochemical Society Transactions 31(第3部分)：654-658。
[59]Blackwell等(2003)JImmunol 170：4061-4068。
[60]Krieg(2002)Trends Immunol 23：64-65。
[61]WO01/95935。
[62]Kandimalla等(2003)BBRC 306：948-953。
[63]Bhagat等(2003)BBRC 300：853-861。
[64]WO03/035836。
[65]Johnson等(1999)Bioorg Med Chem Lett 9：2273-2278。
[66]Evans等(2003)Expert Rev Vaccines 2：219-229。
[67]Baldridge等(2002)J Endotoxin Res 8：453-8。
[68]Persing等(2002)Trends Immunol 10：S32-S37。
[69]Boland等(2004)Vaccine23：316-20。
[70]美国专利6,013,264。
[71]英国专利申请2220211。
[72]Myers等(1990)Cellular and molecular aspects of endotoxin reactions(内毒素反应的细胞和分子机理)，第145-156页。
[73]Ulrich(2000)Vaccine Adjuvants：Preparation Methods and ResearchProtocols(疫苗佐剂：制备方法和研究方法)(Methods in Molecular Medicine series(分子药物方法系列)，第42卷)的第16章(第273-282页)。ISBN：1-59259-083-7，O′Hagan编。
[74]Johnson等(1999)J Med Chem 42：4640-9。
[75]Baldrick等(2002)Regulatory Toxicol Pharmacol 35：398-413。
[76]WO 94/21292。
[77]Sesardic等(2001)Biologicals 29：107-22。
[78]NJJBSC码：98/560。
[79]WHO的The immunological basis for immunization series(免疫的免疫学基础系列)的模块1(Galazka)。
[80]NJESC码：69/017。
[81]NBBSC码：DJPT。
[82]Sesardic等(2002)Biologicals 30：49-68。
[83]NJJBSC码：98/552。
[84]NJJBSC码：TEFT。
[85]NJJBSC码：66/303。
[86]Rappuoli等(1991)TIBTECH9：232-238。
[87]WO96/40242。
[88]WHO的The immunological basis for immunization series(免疫的免疫学基础系列)的模块6(Robertson)
[89]Jones(2001)Curr Opin Investig Drugs 2：47-49。
[90]Costantino等(1992)Vaccine 10：691-8。
[91]Lieberman等(1996)JAMA 275：1499-503。
[92]WO02/058737。
[93]WO03/007985。
[94]Rennels等(2002)Pediatr Infect Dis J 21：978-979。
[95]Campbell等(2002)J Infect Dis 186：1848-1851。
[96]W.H.O.Tech.Rep.Ser.594：51，1976。
[97]Watson(2000)Pediatr Infect Dis J 19：331-332。
[98]Rubin(2000)Pediatr Clin North Am 47：269-285，v。
[99]Jedrzej as(2001)Microbiol Mol Biol Rev 65：187-207。
[100]Zielen等(2000)Infect.Immun.68：1435-1440。
[101]Darkes和Plosker(2002)Paediatr Drugs 4：609-630。
[102]Berkower等(2004)Virology 321(1)：75-86。
[103]Eckhart等(1996)J Gen Virol 77：2001-8。
[104]von Brunn等(1991)Vaccine 9(7)：477-84。
[105]Vreden等(1991)Am J Trop Med Hyg 45(5)：533-8。
[106]Moelans等(1995)Mol Biochem Parasitol 72(1-2)：179-92。
[107]Stoute等(1997)N EnglJ Med 336(2)：86-91。
[108]Wunderlich和del Portillo(2000)Mol Med 6(3)：238-45。
[109]美国专利5,928,902
[110]WO93/10152。
[111]Vaccine Design：The Subunit and Adjuvant Approach(疫苗设计：亚基和佐剂方法)(Powell和Newman编)Plenum Press 1995(ISBN 0-306-44867-X)。
[112]EP-A-0833662。
[113]美国专利6,756,040。
[114]WO02/00249。
[115]Nony等(2001)Vaccine 27：3645-51。
[116]Conjugate Vaccine(偶联疫苗)(Cruse等)ISBN 3805549326，具体是第10卷：48-114。
[117]Anonymous(Jan 2002)Research Disclosure，453077。
[118]Anderson(1983)Infect Immun 39(1)：233-238。
[119]Anderson等(1985)J Clin Invest 76(1)：52-59。
[120]EP-A-0372501。
[121]EP-A-0378881。
[122]EP-A-0427347。
[123]WO93/17712
[124]WO94/03208。
[125]WO98/58668。
[126]EP-A-0471177。
[127]WO91/01146
[128]Falugi等(2001)Eur JImmunol 31：3816-24。
[129]Baraldo等(2004)Infect Immun 72：4884-87。
[130]EP-A-0594610。
[131]WO00/56360。
[132]WO02/091998。
[133]Kuo等(1995)Infect Immun 63：2706-13。
[134]WO01/72337
[135]WO00/61761。
[136]WO2004/041157。
[137]WO91/18926和美国专利5858677、5888517、5989828、6025484和6139846
[138]Janson等(1991)Infect Immu n59：119-25。
[139]WO00/56360。
序列表
<110>启龙公司(CHIRON CORPORATION)
<120>表达用于制备疫苗的乙型肝炎病毒表面抗原
<130>PP028084.0002
<140>PCT/US2006/014240
<141>2006-04-14
<150>US60/672838
<151>2005-04-18
<160>15
<170>SeqWin99，version 1.02
<210>1
<211>1060
<212>DNA
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400>1
Figure A200680021813D00481
<210>2
<211>1063
<212>DNA
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400>2
Figure A200680021813D00482
<210>3
<211>226
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>3
<210>4
<211>678
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>4
Figure A200680021813D00492
<210>5
<211>1061
<212>DNA
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400>5
Figure A200680021813D00501
<210>6
<211>450
<212>DNA
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400>6
Figure A200680021813D00502
<210>7
<211>700
<212>DNA
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400>7
<210>8
<211>689
<212>DNA
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400>8
Figure A200680021813D00504
<210>9
<211>692
<212>DNA
<213>酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400>9
Figure A200680021813D00512
<210>10
<211>226
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>10
Figure A200680021813D00521
<210>11
<211>6
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CpG佐剂序列
<400>11
<210>12
<211>6
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CpG佐剂序列
<400>12
Figure A200680021813D00523
<210>13
<211>2430
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>CpG佐剂序列
<400>13
Figure A200680021813D00524
Figure A200680021813D00531
<210>14
<211>4
<212>PRT
<213>恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)
<400>14
Figure A200680021813D00532
<210>15
<211>423
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>RTS抗原
<400>15
Figure A200680021813D00541

Claims (54)

1.一种制备多价免疫原性组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)通过在携带含有HBsAg编码序列的质粒的酿酒酵母宿主中表达后纯化HBsAg制备HBV组分，其中所述质粒包含：(1)甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的上游启动子，用于控制HBsAg编码序列的表达；和(2)位于HBsAg编码序列下游的ARG3转录终止子；
(b)制备至少一种非HBV组分；和
(c)混合所述HBV和非HBV组分，以得到所述多价组合物。
2.一种多价免疫原性组合物，其包含：
(a)包含在携带含有HBsAg编码序列的质粒的酿酒酵母宿主中表达的HBsAg的HBV组分，其中所述质粒包含：(1)甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的上游启动子，用于控制HBsAg编码序列的表达；和(2)所述HBsAg编码序列下游的ARG3转录终止子；
(b)至少一种非HBV组分。
3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含一种或多种佐剂。
4.如前述任一项权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述非HBV组分包含白喉类毒素。
5.如前述任一项权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述非HBV组分包含破伤风类毒素。
6.如前述任一项权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述非HBV组分包含细胞百日咳抗原。
7.如权利要求1-5中任一项所述的方法或组合物，其特征在于，所述非HBV组分包含非细胞百日咳抗原。
8.如前述任一项权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述非HBV组分包含甲型肝炎病毒抗原。
9.如前述任一项权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述非HBV组分包含偶联的B型流感嗜血杆菌荚膜糖。
10.如前述任一项权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述非HBV组分包含灭活的脊髓灰质炎病毒。
11.如前述任一项权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述非HBV组分包含偶联的脑膜炎奈瑟球菌血清组C荚膜糖。
12.如前述任一项权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述非HBV组分包含偶联的脑膜炎奈瑟球菌血清组A荚膜糖。
13.如前述任一项权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述非HBV组件包含偶联的脑膜炎奈瑟球菌血清组W135荚膜糖。
14.如前述任一项权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述非HBV组件包含偶联的脑膜炎奈瑟球菌血清组Y荚膜糖。
15.如前述任一项权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述组合物是二价HBV-HAV组合物。
16.如前述任一项权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述组合物是二价HBV-Hib组合物。
17.如前述任一项权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述组合物是三价HBV-D-T组合物。
18.如前述任一项权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述组合物是四价HBV-D-T-Pa组合物。
19.如前述任一项权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述组合物是四价HBV-D-T-Pw组合物。
20.如前述任一项权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述组合物是四价HBV-HAV组合物。
21.如前述任一项权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述组合物是五价HBV-D-T-Pa-IPV组合物。
22.如前述任一项权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述组合物是五价HBV-D-T-Pw-Hib组合物。
23.如前述任一项权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述组合物是五价HBV-D-T-Pa-Hib组合物。
24.如前述任一项权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述组合物是六价HBV-D-T-Pa-Hib-IPV组合物。
25.如前述任一项权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述组合物是七价HBV-D-T-Pw-Hib-MenA-MenC组合物。
26.如前述任一项权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述组合物是七价HBV-D-T-Pa-Hib-IPV-MenC组合物。
27.如前述任一项权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述组合物含有氢氧化铝佐剂和磷酸铝佐剂。
28.如前述任一项权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述HBsAg包括聚山梨酯20。
29.如前述任一项权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述HBsAg包括磷脂酰肌醇。
30.一种制备单价免疫原性组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)通过在携带含有HBsAg编码序列的质粒的酿酒酵母宿主中表达后纯化HBsAg制备HBV组分，其中所述质粒包含：(1)甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的上游启动子，用于控制HBsAg编码序列的表达；和(2)位于HBsAg编码序列下游的ARG3转录终止子；和
(b)将所述HBsAg与佐剂混合，得到所述免疫原性组合物，限制条件是所述佐剂不是氢氧化铝佐剂。
31.一种制备单价免疫原性组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)通过在携带含有HBsAg编码序列的质粒的酿酒酵母宿主中表达后纯化HBsAg制备HBV组分，其中所述质粒包含：(1)甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的上游启动子，用于控制HBsAg编码序列的表达；和(2)位于HBsAg编码序列下游的ARG3转录终止子；和
(b)将所述HBsAg与佐剂混合，得到所述免疫原性组合物，限制条件是所述佐剂不仅由铝盐组成。
32.一种单价免疫原性组合物，其包含：
(a)包含在携带含有HBsAg编码序列的质粒的酿酒酵母宿主中表达的HBsAg的HBV组分，其中所述质粒包含：(1)甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的上游启动子，用于控制HBsAg编码序列的表达；和(2)位于HBsAg编码序列下游的ARG3转录终止子；和
(b)不是氢氧化铝的佐剂。
33.一种单价免疫原性组合物，其包含：
(a)包含在携带含有HBsAg编码序列的质粒的酿酒酵母宿主中表达的HBsAg的HBV组分，其中所述质粒包含：(1)甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的上游启动子，用于控制HBsAg编码序列的表达；和(2)位于HBsAg编码序列下游的ARG3转录终止子；和
(b)不仅由铝盐组成的佐剂。
34.如权利要求30或31所述的方法，或权利要求32或33所述的组合物，其特征在于，所述佐剂包含磷酸铝佐剂和3D-MPL佐剂的混合物。
35.如权利要求34所述的方法或组合物，其特征在于，所述3D-MPL和HBsAg都吸附于磷酸铝。
36.如权利要求30-35中任一项所述的方法或组合物，其特征在于，所述HBsAg包含聚山梨酯20。
37.如权利要求30-36中任一项所述的方法或组合物，其特征在于，所述HBsAg包含磷脂酰肌醇。
38.如权利要求30-37中任一项所述的方法或组合物，其特征在于，所述组合物用于血液透析患者或血液透析前的患者。
39.如前述任一项权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述质粒也包含：(3)LEU2选择标记物；(4)2μ质粒序列；和(5)在大肠杆菌中有功能的复制起点。
40.如权利要求39所述的方法或组合物，其特征在于，所述酿酒酵母宿主是亮氨酸营养缺陷型，但所述质粒LEU2标记物能使宿主在没有亮氨酸来源的情况下生长。
41.如前述任一项权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述上游启动子包含核苷酸序列SEQ ID NO：1。
42.如权利要求41所述的方法或组合物，其特征在于，SEQ ID NO：1直接后接HBsAg的起始密码子。
43.如前述任一项权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述HBsAg含有氨基酸序列SEQ ID NO：3。
44.如前述任一项权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述质粒中由核苷酸序列SEQ ID NO：4编码所述HBsAg。
45.如权利要求44所述的方法或组合物，其特征在于，SEQ ID NO：4直接后接赭石终止密码子。
46.如前述任一项权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述ARG3终止子包含核苷酸序列SEQ ID NO：8。
47.如权利要求46所述的方法或组合物，其特征在于，SEQ ID NO：8恰好位于所述HBsAg编码序列的终止密码子的下游。
48.如前述任一项权利要求所述的方法或组合物，其特征在于，所述组合物的渗透压为200mOsm/kg-400mOsm/kg。
49.一种在患者中产生免疫应答的方法，所述方法包括将前述任一项权利要求所述的组合物给予患者的步骤。
50.(i)在携带含有HBsAg编码序列的质粒的酿酒酵母宿主中表达的HBsAg，其中所述质粒包含：(1)甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的上游启动子，用于控制HBsAg编码序列的表达；和(2)位于HBsAg编码序列下游的ARG3转录终止子；和(ii)一种或多种非-HBV抗原，在生产给予患者的药物中的应用。
51.(i)在携带含有HBsAg编码序列的质粒的酿酒酵母宿主中表达的HBsAg，其中所述质粒包含：(1)甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的上游启动子，用于控制HBsAg编码序列的表达；和(2)位于HBsAg编码序列下游的ARG3转录终止子；和(ii)除氢氧化铝外的佐剂，在生产给予患者的药物中的应用。
52.一种质粒，其包含：
(1)编码氨基酸序列SEQ ID NO：3的HBsAg编码序列；
(2)位于HBsAg编码序列上游并控制其表达的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子，其中所述启动子包含核苷酸序列SEQ ID NO：1；和
(3)位于HBsAg编码序列下游的ARG3转录终止子，其中所述终止子包含SEQ IDNO：8。
53.如权利要求52所述的质粒，其含有14500-15000个碱基对。
54.一种携带权利要求52或权利要求53所述的质粒的酵母。
CNA2006800218132A 2005-04-18 2006-04-14 表达用于制备疫苗的乙型肝炎病毒表面抗原 Pending CN101500601A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US67283805P 2005-04-18 2005-04-18
US60/672,838 2005-04-18

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101500601A true CN101500601A (zh) 2009-08-05

Family

ID=37115773

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2006800218132A Pending CN101500601A (zh) 2005-04-18 2006-04-14 表达用于制备疫苗的乙型肝炎病毒表面抗原

Country Status (9)

Country Link
US (1) US8119146B2 (zh)
EP (2) EP1871411A4 (zh)
JP (1) JP2008536515A (zh)
CN (1) CN101500601A (zh)
BR (1) BRPI0610297A2 (zh)
CA (1) CA2605179A1 (zh)
RU (1) RU2442825C2 (zh)
SG (1) SG175456A1 (zh)
WO (1) WO2006113528A2 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104004671A (zh) * 2014-05-13 2014-08-27 江南大学 一种表达乙肝表面抗原的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用
CN104043120A (zh) * 2013-03-13 2014-09-17 江苏先声药业有限公司 乙型肝炎疫苗
CN104873969A (zh) * 2015-04-16 2015-09-02 江苏赛锘威生物医药有限公司 基于HBV PreS-S、C抗原及新型佐剂CpG的治疗性乙型肝炎疫苗

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA014314B1 (ru) * 2005-08-02 2010-10-29 Новартис Вэксинес Энд Дайэгностикс Срл Пониженная интерференция между маслосодержащими адъювантами и антигенами, содержащими поверхностно-активные вещества
CA2621023C (en) 2005-09-01 2019-07-02 Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh & Co. Kg Multiple vaccination including serogroup c meningococcus
GB0522765D0 (en) * 2005-11-08 2005-12-14 Chiron Srl Combination vaccine manufacture
GB2495341B (en) 2011-11-11 2013-09-18 Novartis Ag Fermentation methods and their products
CN103333938B (zh) * 2013-07-19 2016-12-28 深圳康泰生物制品股份有限公司 重组酿酒酵母表达的乙肝表面抗原及其生产方法、乙肝疫苗及其生产方法
BR112017026343A2 (pt) * 2015-06-08 2019-11-19 Serum Inst Of India Private Ltd métodos para aperfeiçoar a adsorção de conjugados de proteína-polissacarídeo e formulação de vacina multivalente assim obtida
EP3503917B1 (en) * 2016-08-26 2024-07-03 Serum Institute Of India Private Limited Multivalent vaccine composition

Family Cites Families (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1341116C (en) 1983-02-22 2000-10-17 Rae Lyn Burke Yeast expression systems with vectors having gapdh or pyk promoters and synthesis or foreign protein
US4876197A (en) 1983-02-22 1989-10-24 Chiron Corporation Eukaryotic regulatable transcription
US4683294A (en) 1985-04-03 1987-07-28 Smith Kline Rit, S.A. Process for the extraction and purification of proteins from culture media producing them
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
DE3841091A1 (de) 1988-12-07 1990-06-13 Behringwerke Ag Synthetische antigene, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
US6306625B1 (en) 1988-12-30 2001-10-23 Smithkline Beecham Biologicals, Sa Method for obtaining expression of mixed polypeptide particles in yeast
CA2006700A1 (en) 1989-01-17 1990-07-17 Antonello Pessi Synthetic peptides and their use as universal carriers for the preparation of immunogenic conjugates suitable for the development of synthetic vaccines
CA2063271A1 (en) 1989-07-14 1991-01-15 Subramonia Pillai Cytokine and hormone carriers for conjugate vaccines
EP0414374B1 (en) * 1989-07-25 1997-10-08 Smithkline Biologicals S.A. Novel antigens and methods for their preparation
PL168408B1 (pl) 1989-08-03 1996-02-29 Smithkline Beecham Biolog Sposób wytwarzania stransformowanego mikroorganizmu PL
IT1237764B (it) 1989-11-10 1993-06-17 Eniricerche Spa Peptidi sintetici utili come carriers universali per la preparazione di coniugati immunogenici e loro impiego per lo sviluppo di vaccini sintetici.
US5639637A (en) 1990-03-29 1997-06-17 Imperial College Of Science, Technology & Medicine Hepatitis B vaccine
GB9007024D0 (en) * 1990-03-29 1990-05-30 Imperial College Novel vaccine
SE466259B (sv) 1990-05-31 1992-01-20 Arne Forsgren Protein d - ett igd-bindande protein fraan haemophilus influenzae, samt anvaendning av detta foer analys, vacciner och uppreningsaendamaal
EP0471177B1 (en) 1990-08-13 1995-10-04 American Cyanamid Company Filamentous hemagglutinin of bordetella pertussis as a carrier molecule for conjugate vaccines
SG48390A1 (en) * 1991-11-16 1998-04-17 Smithkline Beecham Biolog Hybrid protein between cs from plasmodium and hbs ag
US6169171B1 (en) * 1992-02-27 2001-01-02 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Hybrid protein between CS from plasmodium and HBSAG
US5928902A (en) 1992-02-27 1999-07-27 Smithkline Beecham Biologicals (S.A.) Hybrid protein between CS from plasmodium and HBsAg
IT1262896B (it) 1992-03-06 1996-07-22 Composti coniugati formati da proteine heat shock (hsp) e oligo-poli- saccaridi, loro uso per la produzione di vaccini.
KR100287083B1 (ko) 1992-05-23 2001-04-16 장 스테판느 B형 간염 표면 항원 및 다른 항원을 포함하는 조합 백신
IL102687A (en) 1992-07-30 1997-06-10 Yeda Res & Dev Conjugates of poorly immunogenic antigens and synthetic pepide carriers and vaccines comprising them
ES2109685T5 (es) 1993-03-23 2005-09-01 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Composiciones para vacunas que contienen monofosforil-lipido a 3-o-desacilado.
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6239116B1 (en) 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
US6429199B1 (en) 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
DE69637597D1 (de) 1995-06-07 2008-08-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Vakzine mit einem Polysaccharide Antigen-Trägerprotein Konjugat und freiem Trägerprotein
US20020054884A1 (en) 1995-06-23 2002-05-09 Smithkline Beecham Biologicals, Sa Vaccine composition comprising a polysaccharide conjugate antigen adsorbed onto aluminium phosphate
CZ288908B6 (cs) 1995-06-23 2001-09-12 Smithkline Beecham Biologicals S. A. Kombinovaná vakcína, tato vakcína ve formě sady, způsob její výroby a její použití
RU2088664C1 (ru) * 1996-01-26 1997-08-27 Акционерное общество закрытого типа Научно-производственная компания "Комбиотех Лтд." Рекомбинантная плазмидная днк pdes20, кодирующая поверхностный антиген вируса гепатита в (hbsag/ayw), штамм дрожжей saccharomyces cerevisiae, содержащий рекомбинантную плазмидную днк pdes20 - продуцент поверхностного антигена вируса гепатита в (hbsag/ayw)
EP1005368B1 (en) 1997-03-10 2009-09-02 Ottawa Hospital Research Institute Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide in combination with alum as adjuvants
GB9713156D0 (en) 1997-06-20 1997-08-27 Microbiological Res Authority Vaccines
US6562798B1 (en) 1998-06-05 2003-05-13 Dynavax Technologies Corp. Immunostimulatory oligonucleotides with modified bases and methods of use thereof
EP1162998B1 (en) 1999-03-19 2010-03-03 GlaxoSmithKline Biologicals SA Vaccine against streptococcus pneumoniae capsular polysaccharides
CA2365914A1 (en) 1999-04-09 2000-10-19 Techlab, Inc. Recombinant clostridium toxin a protein carrier for polysaccharide conjugate vaccines
WO2001095935A1 (en) 2000-01-20 2001-12-20 Ottawa Health Research Institute Immunostimulatory nucleic acids for inducing a th2 immune response
GB0007432D0 (en) 2000-03-27 2000-05-17 Microbiological Res Authority Proteins for use as carriers in conjugate vaccines
UA85853C2 (uk) 2000-06-29 2009-03-10 Глаксосмітклайн Байолоджікалз С.А. Полівалентна імуногенна композиція
KR100894767B1 (ko) 2000-09-26 2009-04-24 이데라 파마슈티칼즈, 인코포레이티드 화학적인 위치 변화에 의해 면역자극 올리고누클레오티드유사체의 면역자극 활성을 조절하는 방법
IL157060A0 (en) 2001-01-23 2004-02-08 Aventis Pasteur Multivalent meningococcal polysaccharide-protein conjugate vaccine
WO2002091998A2 (en) 2001-05-11 2002-11-21 Aventis Pasteur, Inc. Novel meningitis conjugate vaccine
GB0115176D0 (en) 2001-06-20 2001-08-15 Chiron Spa Capular polysaccharide solubilisation and combination vaccines
WO2003035836A2 (en) 2001-10-24 2003-05-01 Hybridon Inc. Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5' ends
GB0202901D0 (en) 2002-02-07 2002-03-27 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel vaccine
EP1551357B1 (en) 2002-09-13 2014-07-16 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Group b streptococcus vaccine

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104043120A (zh) * 2013-03-13 2014-09-17 江苏先声药业有限公司 乙型肝炎疫苗
CN104043120B (zh) * 2013-03-13 2017-05-31 南京赛威信生物医药有限公司 乙型肝炎疫苗
CN104004671A (zh) * 2014-05-13 2014-08-27 江南大学 一种表达乙肝表面抗原的酿酒酵母工程菌及其构建方法和应用
CN104873969A (zh) * 2015-04-16 2015-09-02 江苏赛锘威生物医药有限公司 基于HBV PreS-S、C抗原及新型佐剂CpG的治疗性乙型肝炎疫苗
CN104873969B (zh) * 2015-04-16 2018-06-19 南京赛威信生物医药有限公司 基于HBV PreS-S、C抗原及新型佐剂CpG的治疗性乙型肝炎疫苗

Also Published As

Publication number Publication date
WO2006113528A2 (en) 2006-10-26
WO2006113528A3 (en) 2009-04-16
US8119146B2 (en) 2012-02-21
EP1871411A2 (en) 2008-01-02
US20090175904A1 (en) 2009-07-09
RU2442825C2 (ru) 2012-02-20
JP2008536515A (ja) 2008-09-11
EP1871411A4 (en) 2010-07-21
EP2329843A2 (en) 2011-06-08
CA2605179A1 (en) 2006-10-26
SG175456A1 (en) 2011-11-28
RU2007142383A (ru) 2009-05-27
EP2329843A3 (en) 2011-09-14
BRPI0610297A2 (pt) 2010-06-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101500601A (zh) 表达用于制备疫苗的乙型肝炎病毒表面抗原
RU2444374C2 (ru) Получение вакцин, содержащих поверхностный антиген вируса гепатита в и поверхностно-активное вещество
KR102657910B1 (ko) 개선된 안정성, 강화된 면역원성과 감소된 반응원성을 갖는 면역원성 조성물 및 그의 제조 방법
CN101287488A (zh) 含血清群c脑膜炎球菌的多价疫苗
US20100226937A1 (en) Combination vaccines with 1-hydroxy-2-phenoxyethane preservative
SK142194A3 (en) Combined vaccines comprising hepatitis b surface antigen and other antigens
US9040058B2 (en) Fermentation media free of animal-derived components for production of diphtheria toxoids suitable for human vaccine use
EP2529749A1 (en) Combination vaccine with acellular pertussis
CN103394082B (zh) 多价免疫原性组合物
CN102196817B (zh) 具有全细胞百日咳的联合疫苗
JP2022502469A (ja) 低減用量の不活化ポリオウイルスを含む混合ワクチン組成物およびそれを調製するための方法
US20120121714A1 (en) Compositions with antigens adsorbed to calcium phosphate
EP2592137A1 (en) Fermentation media free of animal-derived components for production of diphtheria toxoids suitable for human vaccine use
GB2498112A (en) Preparation of a diphtheria toxoid by incubating toxin concentrate with an amino acid and formaldehyde
AU2013203663A1 (en) Fermentation media free of animal-derived components for production of diphtheria toxoids suitable for human vaccine use

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20090805