CN101489543A

CN101489543A - 提高受试者的学习和/或记忆能力的3-羟基脂肪酸及其衍生物

Info

Publication number: CN101489543A
Application number: CNA2007800264258A
Authority: CN
Inventors: 陈国强; 邹湘辉
Original assignee: Shantou University
Current assignee: Amicogen China Biopharm Co Ltd
Priority date: 2007-03-14
Filing date: 2007-03-14
Publication date: 2009-07-22
Also published as: WO2008110034A1

Abstract

本发明提供了一种用于提高受试者的学习和/或记忆能力的药物组合物，其包含作为活性成分的3－羟基脂肪酸及其衍生物。本发明还提供了一种用于提高受试者的学习和/或记忆能力的方法，包括对所述受试者施用有效量的本发明化合物。本发明还提供了所述化合物在制备用于提高受试者的学习和/或记忆能力的药物中的用途。

Description

提高受试者的学习和 /或记忆能力的 ³-羟基脂肪酸及其衍生物技术领域

本发明涉及羟基脂肪酸及其衍生物在提高受试者的学习和 /或记忆能力中的用途。本发明还涉及包含所迷化合物作为活性成分的药物组合物。背景技术学习和记忆的相关知识

学习和记忆是动物改变自身行为或产生新行为以适应环境的必要过程，而人类的学习和记忆是认识和改造客观世界以及参加社会实践活动的基础。生理学家们称学习主要是指神经系统接受外界环境信息而影响自身行为的过程。记忆则包含记与忆两个方面：记指的是大脑从外界纷繁复杂的信息中，提取部分有用的信息形成感受印记，再从感受印记中选择部分信息形成短时记忆，最后从短时记忆中选定部分信息形成长时记忆这样的一个过程；忆则指的是大脑根据当前外界传入信息的情况，迅速提取大脑贮存的相关的信息经验，结合外界传入信息，生成某种心理行为反应或应答的过程。

学习的类型可以分为三种 ( Schunk, 1996 ) 。

第一种学习为非联合型学习，又称为简单学习，它不需要在刺激和反应之间形成某种明确的联系，习惯化和敏感化即属于这种类型的学习。

笫二种学习为联合型学习，它包括经典条件反射和操作式条件反射。经典条件反射是动物学习判断环境关系的途径，例如巴甫洛夫 ( Pavlov, 1927 )在动物实验中，先给光然后给动物肉食，经过几次反复后，动物对光的反应与对肉的反应是相同的：光也能引起唾液分泌。操作式条件反射的一个典型例子：实验人员将饥饿的大鼠放到一侧墙壁上有凸出的压杆的测试箱中，大鼠因偶然的机会压了杆，然后很快就获得了食物，它接下来压杆的机率比自发性的高起来，这样说明了动物学会用食物加以奖励的反射，掌握了这种信息后，动物一旦处于饥饿状态，它就会到这个箱内产生相应的反应而得到食物（ Ferster and Skinner, 1957 ) 。

笫三种学习为复合学习，复合学习又包括潜伏学习、替代学习等。潜伏学习是指潜在的经验对学习效果的影响，例如，曾经进入过迷宫训练环境的动物，尽管并未受到某种训练，但再次进入接受训练时总比从未进入该环境的动物更容易学习；替代学习是指某些动物具有模仿其它动物的动作、声音等行为的能力，这种学习形式在高等动物和人类中是普遍存在的（Ormrod, 1999 ) 。

记忆的形成由获得、巩固和再现三个过程组成。获得是通过感觉系统向脑内输入信号的过程，这一过程易受外界因素的干扰；巩固是获得的信息在脑内编码储存和保持的阶段，长久储存的信息总是对生物个体具有重要的意义和经常反复出现的信息；再现是将脑内储存的信息提取出来使之再现于意识中的过程（韩太真、吴馥梅， 1998 ) 。

按照记忆时程的长短可以将人类记忆分为三个阶段。笫一阶段为感觉记忆，当外界刺激出现后，一定数量的信息从感官进入相庶系统内储存起来称为感觉记忆，又称瞬时记忆，持续时间几百亳秒到一秒左右（温旭初等， 1995 ) 。

第二阶段为短时记忆，又称第一级记忆。短时记忆是在感觉记忆的基础上，对词语、数字、文字或其它信息的进一步加工的结果。短时记忆的持续时间一般在几秒到一分钟左右（ Miller, 19⁵6 ) 。

第三阶段为长时记忆，又称长期记忆。是由短时记忆反复加工的结果。它保持的时间从几分钟、几天到几年，甚至终生。长期记忆通常又进一步分为两种类型，即第二级记忆和笫三级记忆。第二级记忆是一种用弱的或稍强的记忆痕迹所储存的长期记忆，容易被忘掉。第三级记忆是一种深深刻在脑海中的记忆，有很强的记忆痕迹，使储存的信息随时被调用（ Schweickert, 1993 ) 。增强记忆力药物的开发情况

在遗传学家和神经科学家对人类基因、大脑结构和神经化学物质的研究取得突破的基础上，通过某一措施人为提高智力将成为可能。目前，世界上有不少 "提高记忆力药物"正处于临床实验中，一些能改善记忆的认知增强剂已经在市场上出现（表 1 ) , 这些认知增强剂也被称作为"聪明药"，如由 Warner Lambert公司研制的中枢神经性可逆 AchE抑制剂他克林 ( Hakansson, 1993 ) ；同时一些供记忆障碍患者使用的药物，经临床实践证明也可以增强健康人群的智力，很多人服用这类药物来改善因衰老而引起的健忘，如加兰他敏（Sanda , 1995 )和美曲磷脂（Morris et al, 1998 ) ；利他林一类治疗精神疾病的药物也可用于增强某些有规律性的大脑功能，它能够提高患好动症儿童的学习成缋，对正常儿童也有类似的效果（焦鹏涛等 2006 ) 。表 1 已经开发或正在开发的有关增强记忆的药物

表注： AchE: (乙酰胆碱酯酶) 美国哥伦比亚大学教授埃里克.坎德尔（Eric Kandel )是记忆增强剂研究的先行者，他通过对海蛞蝓的研究，找到记忆的奥秘，而获得诺贝尔奖（Kandel, 2001 ) 。他发现学习通过若干方式发生在两个神经元之间的突触上：当神经细胞内的 CREB蛋白（cAMP response element binding protein, cAMP反应元件结合蛋白）被激活时，该突触便被强化，并且 CREB 蛋白也在果蝇和小鼠的记忆形成中发挥作用。

在一个神经元自然地增加 CREB之前，神经细胞膜上的 NMDA ( N-methyl-D-aspartate, N-甲基天门冬氨酸）通道必须打开，让正离子能通过 NMDA 通道流入该神经细胞，然后这些正离子触发一连串导致 CREB激活的级联反应（Arumugam, et al 2005 )。 Shimuzu 等 (2000 )发现，增加小鼠海马区中 NMDA 受体的数量，会导致小鼠在一种空间记忆实验中取得更好的成绩。 i己忆相关疾病及其治疗

目前有许多疾病会降低患者的学习和记忆能力，从而造成记忆障碍或衰退，对人们的 EI常生活带来极大的影响，这类疾病包括：脑部各种变性病（如阿尔茨海,默氏病， Alzheimer's disease, 简称 AD ) 、脑外伤和拳击手痴呆；皮质下动脉硬化性脑病、脑梗塞和脑出血等脑血管病后遗症；脑炎后遗症；一氧化碳中毒等脑缺氧后遗症；营养缺乏性脑病（如 Wernicke脑病（ Reuler et al 1985 ) ) ；酒精中毒和生化代障碍性脑病；精神疾病等。这类疾病可以统称为记忆相关疾病。

这些疾病中以发生于老年和老年前期的阿尔茨海默氏病最为严重。该病由德国神经科医生 Alois Alzheimer 首先发现，是一种进行性认知障碍和记忆力损坏为主的中枢神经系统退行性疾病 ( Muhamamad et al 1999 ) ，随着年龄的增长而增加。据统计 65 岁左右的老人中 AD 发病率为 4~12%， 85 岁以上的老年人中发病率为 20〜40% (施安国等， 2000 ) 。记忆障碍或者衰退是一个复杂的病理过程，凡是引起额叶、颞叶、海马回、丘脑、扣带回、间脑和中脑网状结构等脑部异常均会降低患者的记忆力（ Andrew et al 2005 ) 。

目前尚无有效的方法治疗记忆障碍。虽然卵磷脂食品、神经递质的前体、利他林、双氢麦角碱类的扩血管药等药物有一定的疗效，同时对记忆功能的训练也有一定帮助（ Wilson et al l997 ) ，但是还不能达到人们期待的理想效果。随着人们生活水平的改善和平均寿命的增加，世界上老年人口日益增多，社会也随之进入老龄化社会，因此对这些疾病及其治疗的研究显得至关重要。同时人们在学习任何科学知识时，都离不开记忆，而学习的最大障碍莫过于记忆力差。增强记忆力能够迅速地、准确地、持久地掌握学习过的知识和技能，也能比较好地理解、运用这些知识和技能。

3-羟基脂肪酸简要说明

聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates, 简称 PHA ) 的结构单元具有多样性，目前已经发现 PHA有至少 125种不同的单体结构，并且新的单体被不断地发现出来；碳链长度在 4 - 14个碳之间的 PHA 结构单元也已经可以用化学方法来合成，并且可以修饰支链上的基团。由于 PHA 的降解方法不同，可以得到更多种类的单体结构以及衍生物，丰富了这些产物在生物学方面的研究应用，其中 3-羟基丁酸作为生物有机代谢产物酮体的一部分，它的各方面生理功能得到广泛的研究（ Chen and Wu， 2005 ) 。

酮体是脂肪酸分解代谢过程中的产物，仅在肝内形成，它包括 3 - 羟基丁酸、乙酰乙酸和丙酮，其中 3-羟基丁酸含量较多。肝含有合成酮体的酶体系，故能生成酮体，但缺乏利用酮体的酶，因此不能氧化酮体，产生的酮体需经血液运输到肝外组织进一步氧化分解。肝脏输出酮体为肝外组织提供了能源，对低血糖时保证脑的供能，以维持其正常生理功能方面起着重要作用（Amiel et al，l l ) 。

利用 3-羟基丁酸（ 3-hydroxybutyric acid或 3HB )和其它代谢前体作为药物组合，可以增强心肌效率从而提高心脏的葡萄糖利用效率 ( Cross et al, 1995 ) ；也可以为糖尿病和抗胰岛素疾病的病人提供能源（ Rackley et al， 1981 ) ；这些组合药物还能够延緩或阻止与记忆相关的脑部损害（ Reger et al， 2004 ) 。

3-羟基脂肪酸（ 3-hydroxyalkanoic acid, 简称 3HA )单体及其衍生物具有非常特别的优点：

3HA单体及其衍生物无色透明，且具有轻微的芳香味，可以制成大多数食品的添加剂 , 也适合口服（ Plecko et al, 2002 ) ；

肝脏中没有 3HA 的代谢酶，所有作为正常饮食的添加剂，被吸收后不会被肝脏代谢，而是直接运输到能够利用它的肝外组织中，从而快速产生作用（ Rasmussen et al, 1998 ) ；

它们能够直接穿越血脑屏障，直接到达于大脑神经组织，提供营养并且可以保护和延緩神经细胞的衰老和死亡（ Tieu et al， 2003 ) 发明内容

本发明部分地基于如下发现：本发明的 3-羟基脂肪酸及其衍生物能够显著促进神经细胞的增殖，延緩或抑制神经细胞的凋亡和死亡，并提高细胞分裂周期中的 S期和 G2/M期细胞数量；在小鼠试验中，本发明化合物明显缩短了学习过程中的潜伏期，显著增强了小鼠的学习能力和空间探索能力，并使小鼠的记忆能力得到显著加强。

因此，本发明一方面提供 c了一种用于提高受试者的学习和 /或记忆能力的药物组合物，其包含作为活性成分的式 (I)化合物，

0

OH- CH_; C— OR,

(I)

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、对映异构体、或前体药物，其中，

选自由 H、 C C₉的烷基或环烷基、芳基和无毒金属离子构成的组；

R₂选自由 H、 C₉的烷基或环烷基、的烷氧基和芳基构成的组；以及药学上可接受的载体。

不受任何特定理论的约束，认为当本发明化合物为两亲性分子时，对于跨越血脑屏障有利。当本发明化合物为盐或酸时，跨越血脑屏障的效果可能略差，但仍然有良好的效果。

因此，本发明化合物中的取代基！^和 R₂所包含的碳原子数一般不超过 9 个。在本发明的一个优选实施方案中，选自由 H、 C_rC₇ 的烷基和无毒金属离子构成的组；更优选地，选自由 H、 C₅的烷基和无毒金属离子构成的组；更进一步优选地，选自由 H、 C_rC₃ 的烷基和无毒金属离子构成的组。

在本发明的另一个优选实施方案中， R₂选自由 H、 C C₇的烷基、 C C₇的烷氧基和芳基构成的組；更优选地， R₂选自由 H、 C₅的烷基、 C C₅的烷氧基构成的组；更进一步优选地， R₂选自由 H、 C_rC₃ 的烷基、 C₃的烷氧基构成的组。

本发明化合物中，优选的无毒金属离子为 Na+、 K+和 Ca²⁺。

特别优选的具体的本发明化合物为： 3-羟基丁酸甲酯； 3-羟基丁酸乙酯； 3-羟基丁酸； D-3-羟基丁酸钠； DL-3-羟基丁酸钠。

本发明另一方面提供了一种用于提高受试者的学习和 /或记忆能力的方法，包括对所述受试者施用有效量的上述化合物。

本发明再一方面提供了上述化合物在制备用于提高受试者的学习和 /或记忆能力的药物中的用途。

根据本发明的一个优选实施方式，本发明的化合物可以用于治疗受试者中的记忆相关疾病，包括但不限于：脑部变性病（如阿尔茨海默氏病）、脑外伤和拳击手痴呆；皮质下动脉硬化性脑病、脑梗塞和脑出血等脑血管病后遗症；脑炎后遗症；脑缺氧后遗症；营养缺乏性脑病（如 Wernicke脑病）；酒精中毒和生化代谢障碍性脑病；精神疾病。附图的简要说明

图 1为 3-羟基丁酸乙酯红外分析图： Magna 750型傅里叶变换近红外光谱仪， KBr压片，扫描谱区为 4 000 ~ 500cm-¹, 扫描次数为 20次，分辨率为 4 cm- 图 2 为 3-羟基丁酸乙酯 GC-MS 分析图： Shimadzu 气质联用仪 ( GC-MSQP5050A )；程序升温（60Ό保持 5 min, 60 ~ 240 ， 2。C/ 分钟， 240 - 290 Ό ， 23。C/分钟， 290 "C保持 5分钟）；进样温度 280 V , 分流比 20:1，载气： He, 1 ml/分钟；电离方式 EI，电离能 70 eV，离子源温度： 180 , 离子流： 20 A,全扫描采集方式 (扫描范围 (M/ Z)33 ~ 300amu)。

图 3为 3-羟基丁酸甲酯红外分析图： Magna 750型傅里叶变换近红外光傳仪， KBr压片，扫描谱区为 4 000 - 500 cm ¹, 扫描次数为 20次，分辨率为 (：！^¹。

图 4为柱状图，示出了 3-羟基丁酸、 3-羟基丁酸甲酯和 3-羟基丁酸乙酯对兔大脑皮层神经胶质细胞的增值的影响。（a): 各物质作用 24 小时； (b): 各物质作用 4S小时。图 5为荧光显微镜照片，示出了 3-羟基丁酸乙酯对兔大脑皮层神经胶质细胞的凋亡和死亡的影响：细胞培养条件为 37Ό， 5% C0₂, 2 %FBS DMEM培养液； Annexin-V-FITC细胞凋亡检测试剂盒染色细胞爬片（将 0.13-0.17 mm厚的盖玻片置于 12孔板中，加入 ΙΟΟμΙ 1x10^s个 /ml的细胞悬液；细胞贴壁培养 4 小时后，再加入 ⁹00μ1 2 % FBS DMEM培养液继续培养 ²0 小时） , NIKON TE2000-E荧光显微镜观察拍照。（_a): 对照； (b): 0.004 g/1³-羟基丁酸乙酯作用细胞 48小时。

图 6为流式细胞术检测结果，示出了 3-羟基丁酸乙酯对兔神经胶质细胞周期的影响。（a): 对照；（b): 0.005 _g/l 3-羟基丁酸乙酯处理细胞。

图 7显示了 MWM实验中小鼠学习与记忆行为学的变化。（a): 定位航行实验测量小鼠对水迷宫学习的能力；（b): 空间探索实验测量小鼠空间位置记忆的能力；（c): 空间探索试验的 48 小时后检测小鼠记忆保留情况；（d): 空间探索试验的 45天后检测小鼠记忆保留情况。

图 8显示了小鼠肝脏粗脂肪含量的测定结果。

图 9显示了小鼠血清胆固醇含量的测定结果。

图 10显示了小鼠股骨骨髓有核细胞数。

图 11 显示了免疫组织化学法鉴定原代鼠脑神经胶质细胞。

图 12为流式细胞技术检测 D-3-羟基丁酸钠、 DL-3-羟基丁酸钠和 3- 羟基丁酸甲酯对鼠神经胶质细胞凋亡的影响，分别为：阴性对照组 ) , D-3-羟基丁酸钠处理组（b ) 、 DL-3-羟基丁酸钠处理组（c )和 3-羟基丁酸甲酯处理组（d ) 。

图 13为流式细胞技术检测 D-3-羟基丁酸钠、 DL-3-羟基丁酸钠和 3- 羟基丁酸甲酯对鼠神经胶质细胞凋亡的影响。

图 14为荧光显微镜原位观察 D-3-羟基丁酸钠、 DL-3-羟基丁酸钠和 3-羟基丁酸甲酯对鼠神经胶盾细胞凋亡的影响。（a)、（b)、（c)、（d)分别为阴性对照组、 D-3-羟基丁酸钠、 DL-3-羟基丁酸钠和 3-羟基丁酸甲酯处理组。

图 15 为钙成像法检测 D-3-羟基丁酸钠、 DL-3-羟基丁酸钠和 3-羟基丁酸甲酯对鼠神经胶质细胞胞内钙离子浓度的影响。（a)为激光共聚焦显微照相结果，从左至右分别为阴性对照组、 D-3-羟基丁酸钠、 DL-3-羟基丁酸钠和 3-羟基丁酸甲酯处理组。（b)为各对照组胞内钙离子浓度的统计结果。图 16 为钙成像法检测不同浓度 3-羟基丁酸甲酯对神经胶质细胞胞内钙离子浓度的影响。

图 17 为钙成像法检测在不同条件下，不同浓度 D-3-羟基丁酸钠和 DL-3-羟基丁酸钠对神经胶质细胞胞内钙离子浓度的影响。（_a): 使用含有 Ca²⁺和 M ^的 NPM; (b): 使用不含有 Ca²⁺和 Mg^的 NPM。

图 18 为钙成像法检测钙离子类似物 nitredipine (尼群地平）对 D- 3-羟基丁酸钠、 DL-3-羟基丁酸钠和 3-羟基丁酸甲酯引起的胞内钙离子变化产生的影响。具体实施方式

本发明一方面提供了一种用于提高受试者的学习和 /或记忆能力的药物组合物，其包含：

作为活性成分的式 (I)化合物，

0

(I)

R₂选自由 H、 C_rC₉的烷基或环烷基、 C 的烷氧基和芳基构成的组；以及药学上可接受的载体。

优选的具体的式 (I)化合物包括： 3-羟基丁酸甲酯、 3-羟基丁酸乙酯、 3-羟基丁酸 (包括其盐，例如钠盐、钙盐、钾盐）、 3-羟基己酸甲酯、 3-羟基己酸乙酯、 3-羟基己酸 (包括其盐，例如钠盐、钙盐、钾盐）。

本发明人发现，式 (I)化合物（以下简称 "本发明化合物" ）容易被机体吸收和起作用，药效显著而无副作用。式 (I)化合物在细胞学实验中表现出能够显著促进神经细胞的增殖，提高了细胞分裂周期中的 S期和 G2 M期细胞数量。在水迷宫实验（Morris Water Maze ) 实验中，式 (I)化合物明显缩短了学习过程中的潜伏期，显著增强了小鼠的学习能力和空间探索能力，在记忆保留步骤中则体现出小鼠的记忆能力得到显著加强。小鼠在服用该类新型药物时体重增加较快，但其肝脏粗脂肪含量和血清胆固醇含量都没有明显变化，体重的增加则体现在小鼠的骨密度的增加。

本发明化合物在神经细胞培养过程中，经过 MTT 分析结果显示这些小分子在低浓度时能够显著提高神经细胞的增殖（图 4a， 4b ) , 同时它们能够延緩或抑制神经细胞的凋亡和死亡（图 5a， 5b ) ；流式细胞仪分析结果则表明了这些小分子促进神经细胞的增殖是它们增强了神经细胞的分裂能力，具体表现在细胞周期中的 S期和 G₂/M期细胞的明显增加（图 6a， 6b ) 。

本发明化合物喂食小鼠一个月后，通过 Morris Water Maze

( Morris 水迷宫）来检测对比小鼠的学习记忆能力（Morris et al, 1984 ) 。定位航行实验结果显示各组的 EL 随着试验次数的增多逐渐缩短，各给药实验组小鼠的 EL 都比对照组短，且具有显著差异性

( P<0.05 ) ；空间探索实验中，各浓度 3-羟基丁酸甲酯组小鼠在 60 秒内跨平台次数都比对照组多，具有统计学差异（P<0.05 ) 。空间探索实验结束 48 h 后进行记忆保留试验，结果表明和各浓度 ³-羟基丁酸甲酯组小鼠的 EL 与对照组相比具有显著差异性（P<0.05 ) ，其中 30 mg/kg/天 3-羟基丁酸甲酯组小鼠表现最为明显（图 7a， 7b ) 。

喂食本发明化合物的小鼠在 Morris Water Maze行为学实验中表现出学习能力和空间定位能力的明显增强，记忆保留更长久，容易通过增强的记忆力和空间定位能力迅速寻找到并爬上隐匿于水下的平台

(图 7c， 7d ) 。

小鼠在喂食本发明化合物过程中，体重与对照组相比增加较快，且比对照组小鼠健康活跃，体重的增加体现在骨髓细胞以及骨密度的增加（图 10 ) 。

通过血清胆固醇含量的测定实验，给药组小鼠血清中的胆固醇含量与对照組相似，而肝脏粗脂肪含量的测定实验中，给药组小鼠肝脏粗脂肪的含量要略低于对照组小鼠，但没有显著差异性（图 8和 9 ) 。因此服用本发明化合物不会增加血液中的胆固醇含量，也不会增加肝脏中粗脂肪的含量，避免了患心血管疾病以及脂肪肝的危险。本发明另一方面提供了一种用于提高受试者的学习和 /或记忆能力的方法，包括对所述受试者施用有效量的式 (I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、对映异构体、或前体药物。

本发明再一方面提供了式 (I)化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、对映异构体、或前体药物在制备用于提高受试者的学习和 /或记忆能力的药物中的用途。

本文所用的术语 "3-羟基脂肪酸及其衍生物" 具有式 (I)的结构通式，包括 ³-羟基脂肪酸及其酯、盐等。除非另有陈述或明显与上下文不符，本文所用的术语 "3-羟基脂肪酸及其衍生物" 通常可以与术语 "式 (I)化合物" 或 "本发明化合物" 互换使用。

本发明化合物可以通过各类聚羟基脂肪酸酯的水解和醇解等多种方法得到（Chen and Wu, 2005 ) ，经过蒸馏纯化，通过 FOR和 GC-

MS分析确认纯度极高，没有双键等危害细胞生长的副产物。

本文中使用的术语 "受试者" ，指任意哺乳动物，例如，小鼠、大鼠、兔子、狗、牛，以及灵长类动物，如猴和人。 "受试者，，可以指患病的哺乳动物，例如患有记忆力减退或阿尔茨海默氏病的哺乳动物，特别是人；也可以指未患病的健康的哺乳动物。本领域技术人员可以理解，出于某些目的，例如提高学习成缋或改善工作表现，健康的受试者也可能需要提高学习和 /或记忆能力。

除非另有陈述，本文中使用的术语 "药学上可接受的盐" 包括化合物的无毒的酸和碱加成盐。可接受的无毒的酸加成盐包括那些衍生自本领域已知的有机和无机酸或碱的盐。酸包括：例如，盐酸、磷酸、硫酸、乙酸、乳酸、琥珀酸、柠檬酸、苹果酸、马来酸等。本质上是酸性的化合物能够与各种药学上可接受的碱形成盐。可用于制备药学上可接受的碱加成盐的碱，是那些形成无毒的碱加成盐的碱，即，所述的盐含有药理学可接受的阳离子，例如但不局限于，碱金属或碱土金属盐，尤其是钙、镁、钠或钾盐。合适的有机碱包括，但不局限于，

N，N-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、赖氨酸和普鲁卡因。

除非另有陈述，本文中使用的术语"水合物"是指本发明化合物进一步通过非共价的分子间作用力与一定量的水相结合。

除非另有陈述，本文中使用的术语 "前体药物" 是指：可以在生物学条件 (体外或体内）下通过水解、氧化或其他反应提供本发明的化合物的衍生物。前体药物的例子包括，但不局限于，本发明化合物的衍生物，该衍生物包括生物可水解的部分，例如生物可水解的酰胺、生物可水解的酯或生物可水解的氨基甲酸酯部分。前体药物的其它的例子包括：包含 -NO、 -N0₂、 -ONO 或 -ON0₂部分的本发明的式 (I)化合物的衍生物。前体药物典型地可以使用熟知的方法制备，例如在 Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery , 172-178 , 949- 982(Manfred E. Wolff主编，笫五版， 1995、和 Design of Prodrugs Ά. Bundgaard主编， Elsdvier, New York 1985)中所描述的。

除非另有陈迷，本文中使用的术语 "生物可水解的酰胺" 、 "生物可水解的酯" 、 "生物可水解的氨基甲酸酯" 分别指化合物的酰胺、酯或氨基甲酸酯可以： 1)不防碍化合物的生物活性，但可以给予化合物有益的体内性质，例如摄取、作用时间或作用开始；或 2)是生物学非活性的，但可以体内转化为生物学活性化合物。生物可水解的酯的例子包括，但不局限于，低级垸基酯，低级酰氧基烷基酯 (例如乙酰氧基甲基、乙酰氧基乙基、氨基羰基氧基甲基、戊酰氧基曱基和戊酰氧基乙酯），胆碱酯，和酰胺基烷基酯 (例如乙酰胺基甲基酯）。生物可水解的酰胺的例子包括，但不局限于，低级烷基酰胺， α -氨基酸酰胺，烷氧基酰胺，和烷基氨基烷基羰基酰胺。生物可水解的氨基甲酸酯的例子包括，但不局限于，低级烷基胺，取代的乙二胺，氨基酸，羟基烷基胺，和聚醚胺。

本发明化合物的 "对映异构体" 包括外消旋的、对映异构富集的或对映异构纯的化合物。本文中所使用的术语 "对映异构纯的" ，除非另有陈述，是指包括化合物的一种对映异构体，且基本上不含该化合物的其它对映异构体。典型的对映异构纯的化合物包括按重量大于约 95%的该化合物的一种对映异构体，例如 D-型或 L-型对映异构体。本文中所使用的术语 "对映异构富集的" ，除非另有陈述，是指包括按重量大于约 50% , 优选大于约 70% , 更优选大于约 80%的该化合物的一种对映异构体。本文中所使用的术语 "外消旋的" 或 "外消旋体" ，除非另有陈述，是指由等量的左旋体和右旋体组成的没有旋光性的混合物。例如， 3-羟基丁酸的外消旋体可以表示为 DL-³-羟基丁酸。式 (I)的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、对映异构体、或前体药物（活性成分)可以以其自身形式被使用，但是通常将以药物组合物的形式给药，在所说的组合物中，将活性成分与可药用的载体相结合。根据给药方式，所说的药物组合物将优选地包含 0.05至 99 wt % (重量百分比)，更优选 0.05至 80 wt %，更优选 0.10至 70 wt %，并且更优选 0.10至 50 wt %的活性成分，所有的重量百分比都是以总组合物的重量为基的。

本文所用的术语"烷基"是指带有给定数量的碳原子的支链和直链的饱和脂族烃基。例如，的烷基 "定义为直链或支链的带有 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8或 9个碳的基团。例如， "C 的烷基" 特别包括甲基、乙基、正-丙基、异-丙基、正-丁基、叔-丁基、异-丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基等。

本文所用的术语"环烷基 "指的是带有给定数量碳原子的单环饱和脂族烃基。例如， "C₃-C₉的环烷基"包括环丙基、甲基-环丙基、 2，2- 二甲基-环丁基、 2-乙基-环戊基、环己基等。

本文所用的术语"烷氧基 "表示通过氧桥连接的指明碳原子数的垸基或环烷基。 "烷氧基，，由此包括上述烷基和环烷基的定义。

本文所用的术语"芳基，，是指包含 5 到 10个环原子的碳环芳基。代表性的例子包括但不限于苯基、甲苯基、蒽基、芴基、茚基、吡啶基和萘基、以及包括 5， 6， 7， 8 -四氢化萘的苯并稠合碳环部分。碳环芳基可为未被取代的或被取代的。在一个实施方案中，碳环芳基为苯基。

本文所用的术语"无毒金属离子 "指对于受试者没有明显毒性的金属离子，例如但不限于 Na⁺、 K U Ca²\ Mg² Zn²⁺、 Fe²⁺、 Fe³⁺ 等。

本文所用的术语 "有效量" 指的是足以在动物或人体内引起兽医或临床医师所寻找的生物或医学反应的活性化合物的量。本发明化合物的 "有效量" 可由本领域技术人员根据给药途径、受试者的体重、年龄、病情等因素而确定。

本发明还提供了制备本发明药物組合物的方法，其包括将上文所定义的式 (I)的化合物或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、对映异构体、或前体药物与可药用的载体进行混合。

该药物组合物可以以例如乳膏、溶液、混悬液、气雾剂和干粉制剂的形式局部给药 (例如给药于皮肤或肺和 /或气道)；或者例如可以通过以片剂、胶嚢、糖浆剂、粉末或颗粒的形式口服而全身给药；或者可以以溶液或混悬液的形式胃肠外给药；或者可以皮下给药。

本发明的组合物可以用现有技术中众所周知的常规载体通过常规方法获得。因此，用于口服应用的组合物可包含例如一种或多种着色剂、甜味剂、矫味剂和 /或防腐剂。

用于片剂的适宜的可药用载体包括：例如，惰性稀释剂如乳糖、碳酸钠、磷酸钙或碳酸钙；制粒剂和崩解剂如玉米淀粉或藻酸；粘合剂如淀粉；润滑剂如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉；防腐剂如对-羟基苯甲酸乙酯或丙酯；和抗氧化剂，如抗坏血酸。片剂可不包衣或包衣以改变其崩解和随后活性成分在胃肠道内的吸收，或者改善其稳定性和 / 或外观，在任何一种情况中，都使用常规包衣剂和现有技术中众所周知的方法。

用于口服应用的组合物可以为硬明胶胶嚢或软明胶胶嚢形式。在硬明胶胶嚢中，将活性成分与惰性固体稀释剂，例如，碳酸钙、磷酸钙或高岭土进行混合；在软明胶胶嚢中，将活性成分与水或油如花生油、液体石蜡、或橄榄油进行混合。

水性混悬液通常包含细粉形式的活性成分和一种或多种混悬剂，如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶；分散剂或润湿剂如卵磷脂或氧化烯与脂肪酸的缩合产物 (例如聚氧化乙烯硬脂酸酯）。所说的水性混悬液还可包含一种或多种防腐剂（如对-羟基苯甲酸乙酯或丙酯)、抗氧化剂 (如抗坏血酸)、着色剂、矫味剂、和 /或甜味剂（如蔗糖、糖精或阿司帕坦）。

油性混悬液可以通过将活性成分混悬于植物油（如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油）或矿物油 (如液体石蜡）中来进行制备。该油性混悬液还可包含增稠剂如蜂蜡、固体石蜡或鲸蜡醇。可以加入甜味剂如上述这些物质、以及矫味剂来提供一种适口的口服制剂。可以通过加入抗氧化剂如抗坏血酸来对这些组合物进行防腐处理。

适用于通过加入水来制备水性混悬液的可分散的粉末和颗粒通常包含活性成分和分散剂或润湿剂、混悬剂和一种或多种防腐剂。用上述的这些物质对适宜的分散剂或润湿剂和混悬剂如上文所述。还可以存在另外的赋形剂如甜味剂、矫味剂和着色剂。

本发明的药物组合物还可以为水包油乳剂的形式。其油相可以是植物油如橄榄油或花生油，或矿物油例如液体石蜡，或这些物质中任何物质的混合物。适宜的乳化剂可以是例如天然存在的树胶如阿拉伯胶或黄蓍胶、天然存在的磷脂如大豆磷脂、卵磷脂、得自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯 (例如脱水山梨聚糖单油酸酯)和所说偏酯与氧化乙烯的缩合产物如聚氧化乙烯脱水山梨聚糖单油酸酯。该乳剂还可包含甜味剂、矫味剂和防腐剂。

糖浆剂和酏剂可以用甜味剂如甘油、丙二醇、山梨醇、阿司帕坦或蔗糖来进行制备，并且还可以包含緩和剂、防腐剂、矫味剂和 /或着色剂。

该药物组合物还可以为可注射的无菌水性或油性混悬液形式，且可以根据已知的方法用一种或多种上面已经提及的适宜的分散剂或润湿剂和混悬剂来进行制备。可注射的无菌制剂还可以是位于胃肠外可接受的无毒稀释剂或溶剂中的可注射的无菌溶液或混悬液，例如位于

1，3-丁二醇中的溶液。

局部制剂，如乳膏、软膏、凝胶和水性或油性溶液或混悬液通常可以通过用本领域众所周知的常规方法，用常规的可局部施用的赋形剂或稀释剂对活性成分进行配制来进行制备。

通过吹入法给药的组合物可以为包含平均直径为例如 30 μιη或更低的颗粒的分割得很细的粉末形式，该粉末本身仅包含活性成分或者还具有一种或多种生理学可接受的载体如乳糖。然后，用于吹入法的粉末可方便地被保持在包含例如 1至 50 mg活性成分的胶嚢中，用涡轮吸入器 (turbo-inhaler)装置来使用该胶嚢。

用于通过吸入给药的组合物可以为常规的加压气雾剂形式，所说的气雾剂被安排用来将活性成分以包含分割得很细的固体或液体小滴的气雾剂的形式进行分配。可以使用常规气雾剂推进剂如挥发性氟化烃或烃类并且可以方便地安排用该气雾剂装置来分配所计量数量的活性成分。

应当意识到给药剂量将随着所用的化合物、给药方式、所需的治疗和病情而变化。有待治疗的哺乳动物接受的典型的日剂量范围为每 kg体重 0.05 mg至 75 mg活性成分。对于人，优选的日剂量为，例如 l-10mg/kg。如果需要的话，该日剂量可以以分割剂量的形式给药。根据本领域众所周知的原则，所给予的活性成分的精确数量和给药途径取决于被治疗受试者的体重、年龄、性别以及被治疗的特定状况。

为了更加详细地解释本发明，下面将结合附图给出本发明的实施例。这些实施例仅仅是出于解释和说明的目的，不应该被理解为是对本发明范围的限制。实施例 1: 3-羟基丁酸乙酯的制备将 5 g PHB和 50 ml的氯仿加入圆底烧瓶中。安装上水浴冷凝管，并放入油浴锅中，緩慢加热搅拌溶解。另取 100 ml 乙醇放入 150 ml 锥形瓶中，加入 2 ml 浓硫酸常温搅拌混合，将上述的乙醇-浓硫酸溶液加入到 PHB氯仿溶液的圆底烧瓶中，混合。温度控制在 80Ό左右。反应时间 48 小时。结束反应后，抽滤除杂。将滤液转移至 250 ml分液漏斗中，加入 25 ml蒸馏水，静置分层，收集下层有机相，加入 25 ml NaHC0₃中和一次， 25 ml 蒸馏水洗潦一次，用分液漏斗分离，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤出硫酸钠。有机相用旋转蒸发仪蒸发氯仿并干燥，减压蒸餾 ( 110±10 , 2900 Pa )得 ².8 g产物，通过傅立叶红外光谱（FTIR )和气相色镨-质谱连用（GC-MS )分析确定产物为高纯度 3-羟基丁酸乙酯（图 1，图 2 ) 。实施例 2: 3-羟基丁酸甲酯的制备将 5 g PHB和 50 ml氯仿加入圆底烧瓶中。安装上水浴冷凝管，并放入油浴锅中，緩慢加热搅拌溶解。另取 100 ml 甲醇放入 150 ml 锥形瓶中，加入 2 ml浓硫酸常温搅拌混合，将上述的甲醇-浓硫酸溶液加入到 PHB氯仿溶液的圆底烧瓶中，混合。温度控制在 80Ό左右。反应时间 48 小时。结束反应后，抽滤除杂。将滤液转移至 250 ml分液漏斗中，加入 25 ml蒸馏水，静置分层，收集下层有机相，加入 25 ml NaHC0₃中和一次， 25 ml 蒸馏水洗涤一次，用分液漏斗分离，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤出硫酸钠。有机相用旋转蒸发仪蒸发氯仿并干燥，减压蒸馏 (80±10°C，4800 Pa)得 3.0 g产物，通过 FTIR分析确定产物为 3-羟基丁酸甲酯（图 3 ) 。实施例 3: 兔大脑皮层神经胶盾细胞的制备用无菌剪刀取白兔大脑组织后，仔细剥除脑膜和血管等纤维成分，剪碎后放入 Hanks液（含 100 U/mL 青霉素 +100 mg/L 链霉素）中漂洗 1-2次，置于 30-50倍体积的 Hanks液中，反复吹打即可制成细胞悬液（脑组织比较柔软）；把悬液注入离心管中，室温静置 5-10 分钟，细胞或细胞团块自然下沉，脂肪等杂物漂浮于悬液表层，吸除上清，反复 2-3 次，获得较多细胞成分；向末次沉淀物中加入适量含 20 % FBS(胎牛血清）的 DMEM培养液（ Dulbecco's Minimum Eagle's Medium ) ，通过 300 目网筛过滤，计数细胞并调整好细胞浓度，接种入培养瓶中， 37Ό， 5% C0₂培养；待细胞生长汇合后，用 0.²5 %胰蛋白酶消化传代处理。实施例 4: MTT (噻唑兰）法检测 3-羟基丁酸乙酯对兔神经胶盾细胞增殖的影响生长状况良好的细胞（实施例 3得到的细胞，经过 3次传代培养）用胰酶消化液处理 2分钟，吸除消化液，加入新鲜培养液制成单细胞悬液。血球计数板检测细胞数量。接种于 96孔板中（ 5xl0³个细胞 /孔）， 37V , 5% C0₂细胞贴壁培养 24 小时。去掉培养液， PBS (磷酸緩冲液 pH 7.2 )清洗 2遍。加入过滤灭菌的 DMEM培养液（含 10 % FBS )，其中含有一系列浓度梯度（0、 0.00025、 0.0005、 0.001、 0.005、 0.01、 0.05 g/1 )的 3-羟基丁酸乙酯，每一浓度做 6个平行实验。继续培养 24 小时和 48 小时后， MTT检测细胞活性。 96孔板中每孔加入 MTT ( 5.0 _δ/1 ) 10 μ1， 37 °C温育 4 小时。弃上清，加入 DMSO (二甲基亚砜）100μ1，振荡数分钟， 30分钟内在全自动酶标仪上读取 570 nm 处吸光,值。

0.00025-0.01 g/1 的 3-羟基丁酸乙酯处理兔神胶质经细胞 24小时后， MTT 吸光值分别为 0.11 ± 0.01、 0.09±0·01、 0.12±0·01、 0.14±0.02、 0.12±0.02 , 与对照组（0.06±0.01 )相比具有显著差异（Ρ<0·05 ) (图 4a ) ； 0.00025-0.01 g/1的 3-羟基丁酸乙酯处理兔神胶质经细胞 48 小时后， MTT 吸光值分别为 0·16±0·01、 0·19±0.01、 0.2 0.01 与对照组（0·1²±0·01)相比具有显著差异（Ρ<0·0⁵) (图 4b) ；说明了低浓度的 3-羟基丁酸乙酯能够显著促进兔神经胶质细胞的增殖。实施例 5: MTT法检测 3-羟基丁酸甲酯对兔神经胶质细胞增殖的影响生长状况良好的细胞（实施例 3得到的细胞，经过 3次传代培养）胰酶消化液处理 2分钟，吸除消化液，加入新鲜培养液制成单细胞悬液。血球计数板检测细胞数量。接种于 96孔板中（5xl0³个细胞 /孔）， 37 , 5% C0₂细胞贴壁培养 24 小时。去掉培养液， PBS清洗 2遍。加入过滤灭菌的 DMEM培养液（含 10%FBS) ，其中含有一系列浓度梯度 (0、 0.00025、 0.0005、 0.001、 0.005、 0.01、 0.05 g/1) 的 3-羟基丁酸甲酯，每一浓度做 6个平行实验。继续培养 24 小时和 48 小时后， MTT检测细胞活性。 96孔板中每孔加入 MTT (5.0g/l) 10μ1， 37°C温育 4 小时。弃上清，加入 DMSO lOO l, 振荡数分钟， 30分钟内在全自动酶标仪上读取 570 nm处吸光值。各浓度的 3-羟基丁酸曱酯处理兔神胶质经细胞 24小时后，所有浓度组的 MTT吸光值（0.1³

±0.03、 0·15±0·02、 0.12±0.01、 0,12±0·01、 0.11±0.01、 0.10±0.02 ) 与对照组（0.06±0.01 )相比都具有显著差异（Ρ<0·0⁵) (图；同样，各浓度的 3-羟基丁酸甲酯处理兔神胶质经细胞 ⁴⁸ 小时后，所有浓度组的 MTT 吸光值（0.15 ±0.01、 0.17±0.01、 0·18±0.01、 0.16±0.01、 0.15±0.01、 0.15±0.01 ) 与对照组 ( 0·12±0·01 ) 相比都有显著性差异

( Ρ<0.05 ) (图 4b) 。结果表明了实验中所有浓度的 ³-羟基丁酸甲酯均能显著促进兔神经胶质细胞的增殖。实施例 6: MTT法检测 DL-3-羟基丁酸对兔神经胶质细胞增殖的影响生长状况良好的细胞（实施例 3得到的细胞，经过 3次传代培养）胰酶消化液处理 2分钟，吸除消化液，加入新鲜培养液制成单细胞悬液。血球计数板检测细胞数量。接种于 96孔板中（5xl0³个细胞 /孔）， 37 °C, 5% C0₂细胞贴壁培养 24 小时。去掉培养液， PBS清洗 2遍。加入过滤灭菌的 DMEM培养液（含 10%FBS) ，其中含有一系列浓度梯度（0、 0.00025、 0.0005、 0.001、 0.005、 0.01, 0.05 g/1 ) 的外消旋的 DL-3-羟基丁酸，每一浓度做 6个平行实验。继续培养 24 小时和 48 小时后， MTT检测细胞活性。96孔板中每孔加入 MTT( 5.0 g/l ) 10 μΐ, 37°C温育 4 小时。弃上清，加入 DMSO 100 μΐ, 振荡数分钟， 30分钟内在全自动酶标仪上读取 570 nm处吸光值。 0.001、 0.005 g/1 的 DL-3-羟基丁酸处理兔神胶质经细胞 24 小时后， MTT 吸光值分别为 0.09±0.01 0.12 ± 0.03 , 与对照组（ 0.06±0.01 ) 相比具有显著差异 ( P<0.05 ) (图 4a ) ; DL-3-羟基丁酸处理兔神胶质经细胞 48小时后，仅有 0.005 g/1 浓度组的 MTT吸光值（ 0·20±0·03 )与对照组（ 0.12±0.01 ) 相比具有显著差异（Ρ<0.05 ) (图 4b ) 。结果显示低浓度的 DL-³-羟基丁酸能够促进神经细胞的增殖，但是不如 3-羟基丁酸甲酯和 3-羟基丁酸乙酯效果明显。实施例 7: 荧光显微镜原位观察 3-羟基丁酸乙酯对兔神经胶盾细胞凋亡的影响细胞样片的制备：生长状况良好的细胞（实施例 3得到的细胞，经过 3次传代培养）经过胰酶消化液处理 1分钟，吸除消化液，加入新鲜培养液制成单细胞悬液。血球计数板检测细胞数量。将 0.1；3-0.1⁷ mm 厚的盖玻片置于 12孔板中，加入 ΙΟΟμΙ lxlO⁵个 /ml的细胞悬液； 37Ό, 5% C0₂细胞贴壁培养 4 小时后，再加入 900μ1 含 2 % FBS的 DMEM培养液继续培养 20小时。弃去培养液， PBS清洗 ²次。加入 1 ml含 0.004 g/1 ³- 羟基丁酸乙酯的 DMEM培养液，培养 ⁴⁸ 小时。弃去培养液， 1 ml水冷的 PBS洗涤细胞 2次（轻轻贴壁加入和倒出液体）。 Annexin-V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒染色：加入 500 μΐ Binding Buffer (结合緩沖液）， ΙΟμΙ Annexin-V-FITC, 5μ1 ΡΙ (碘化丙锭），轻轻摇匀，室温黑暗中反应 15 分钟。取出盖玻片，置于载波片上上机（NIKON 倒置显微镜 TE2000-E )观察。荧光显微镜照片表明， 3-羟基丁酸乙酯显著延緩和抑制神经细胞的凋亡与死亡，对照处理的细胞基本上处于死亡期，较多的细胞都被 PI 染色呈红色荧光，少部分细胞被 annexin 染色呈绿色荧光（图 5a ) 。而 0.004 g/1 3-羟基丁酸乙酯处理的细胞基本上处于凋亡期，大部分细胞都被 aimexin染色呈绿色荧光，极少部分细胞被 PI染色呈红色荧光（图 5b ) 。实施例 8 流式细胞技术检测 3-羟臬丁酸乙酯对兔神经胶质细胞周期的

流式细胞仪细胞样本的制备和染色：生长状况良好的细胞（实施例 3得到的细胞，经过 3次传代培养）用胰酶消化液处理 2分钟，吸除消化液，加入新鲜培养液制成单细胞悬液。血球计数板检测细胞数量。接种于玻璃细胞培养瓶中（5xl0⁴个细胞 /ml ) ， 37 , 5% C0₂细胞贴壁培养 24 小时。去掉培养液， PBS (磷酸緩冲液 pH 7.2 )清洗 2遍。加入过滤灭菌的 DMEM培养液（含 10 % FBS )，其中含有 0.005 g/1的 3-羟基丁酸乙酯。胰酶消化细胞， 1 ml培养液吹匀， 1000 rpm 离心 10 分钟。弃去上清， PBS清洗 2次， 0.5 ml PBS吹匀。 5ml注射器将细胞吸起并吹入 5 ml 70 %预冷的乙醇中， 4 °C固定过夜。 1000 rpm离心 10分钟收集固定细胞， PBS清洗 2次。 0.5 ml PBS重悬细胞并轻轻吹匀（防止细胞破碎 ) 。加入 1.5 μΐ RNase A至终浓度为 60 g/ml， 37Ό消化 30分钟。加入 0.25 ml PI溶液至终浓度为 20 g/ml，水浴中避光染色 30分钟。上机（BECKMAN Coulter Epics XL流式细胞仪）检测。

通过软件分析流式细胞仪收集到的细胞群体，显示出 3-羟基丁酸乙酯提高了 S期以及 G₂/M期的细胞比例。 S期细胞数和 G₂/M期细胞数占整个细胞群体数目的比率能够反应细胞的分裂程度。神经胶质细胞经过 0.005 g/1的 3-羟基丁酸乙酯处理后， S期细胞数和 G₂/M期细胞数分别增加了 9.1%和 9.6%，说明了 3-羟基丁酸乙酯较大地促进了神经胶质细胞分裂进入 S期和 G₂/M期，提高了细胞的分裂程度，从而促进细胞的增殖（图 6a， 6b ) 。实施例 9: Morris水迷宫（Morris Water Maze, MWM)实验小鼠饲养条件及其分组情况

KM小鼠：体重 20±2 g; 雌性和雄性各半；清洁级。祠养：清洁级小鼠实验饲养室；温度： 25±2 °C ; 湿度： 40-60 % ; 光照： 12 小时明暗交替；饮水：超纯水，自由饮用；饲料：鼠用全价营养颗粒饲料；饲养方式：笼养。

实验小鼠分组情况如下：

阴性对照组： 11只小鼠，自然喂养，连续 30天。

阳性对照组： 9 只小鼠，灌喂左旋乙酰肉毒碱水溶液（ 30 mg/ g/d ) ，连续 30天。

样品实验组： 30只小鼠（每一浓度组 10只，共三组），灌喂 3- 羟基丁酸甲酯水溶液（20、 30、 40mg/Kg/d ) ，连续 30天。实施例 10: Morris水迷宫观察小鼠学习行为学的变化定位航行实验 ( Place navigation ) 用于测量小鼠对水迷宫学习的能力。实验历时 5天，每天训练 4次（4次训练小鼠分别从四个不同象限的入水点入水；如果小鼠在 60 秒内未找到平台，需将其引至平台，这时潜伏期记为 60秒，每次训练间隔 60秒），训练时随机选择一个入水点，将小鼠面向池壁放入水中，观察并记录：小鼠寻找并爬上平台的路线图和潜伏期（Escape Latency, EL ) 。结果显示实施例 9 中各组的 EL 随着试验次数的增多逐渐缩短，阳性对照组和样品实验组小鼠的 EL都比阴性对照组短。对各组结果分别进行单因素方差分析，笫五天时 30mg/kg/天左旋乙酰肉毒碱组和低浓度（20、 30 mg/kg.d ) 3-羟基丁酸甲酯组的 EL值分别为 12.63±4.58秒、 11.24±3.14 秒和 8.45±2.09秒，与阴性对照组（19.55±4·94 秒)相比具有显著差异性（Ρ<0.05 ) ，并且爬上平台的路线也比阴性对照组简单。这说明小鼠的学习能力得到了显著提高。 40 mg/kg.d 3-羟基丁酸甲酯组的 EL 值为 12.21±3.05秒与阴性对照组相比无统计学差异（P>0.05 ) (图 7a )。

空间探索实验（Spatial Probe Test ) 用于测量小鼠学会寻找平台后，对平台空间位置记忆的能力。定位航行试验第 5天后撤去水平台，然后任选一个入水点将小鼠面向池壁放入水中，分三次进行测量数据： 60秒内穿越原平台位置的次数；记录小鼠在 60秒内搜索平台的路线图结果表明各浓度（20、 30、 40 mg/kg.d ) 3-羟基丁酸甲酯组在 60秒内跨平台次数分别为 6.07±2.22> 8.13±2.83、 5.85±2.19，都比阴性对照组（4.20±1.16 ) 多，其中 30 mg/kg.d 3-羟基丁酸甲酯组最为明显，且都具有统计学差异（Ρ<0·0⁵ ) 。左旋乙酰肉毒碱组 60 秒内跨平台次数为 5.52±1.94, 略高于阴性对照组，但差异不显著（Ρ>0.05 ) (图 7b ) 。

所有进行 Morris水迷宫试验的小鼠于空间探索试验的 48 小时后进行记忆保留试验（Retention Test ) 。分三次进行，间隔 5分钟。小鼠从背对平台的固定位置入水，以 60 秒为时限计从入水到爬上平台的时间为 EL。小鼠爬上平台后迅速将其移走至笼中，直至下一个试验。结果显示左旋乙酰肉毒碱組和各浓度 ( 20 、 30、 40mg/kg.d ) 3- 羟基丁酸甲酯组小鼠的 EL值分别为 20.05±4.25秒、 19.01±4.41秒、 15.51±6.17秒和 19.45±7.52秒，与阴性对照组（ 28.08±10.84秒）相比具有显著差异性（Ρ<0.05 ) , 其中 30 mg/kg.d 3-羟基丁酸甲酯组的 EL 与阴性对照组相比具有非常显著差异性（Ρ<0·01 ) (图 7c )。 30 mg/kg.d 3-羟基丁酸甲酯组和阴性对照组小鼠自然饲养 45天后继续进行记忆保留实验，该组小鼠的 EL 值为 8.78±3.21 秒，仍然比阴性对照组 ( 18.98±7.52 秒）低很多，记忆保留效果明显好于阴性对照组（差异极显箸 Ρ<0·01 ) (图 7d ) 。实施例 11: 小鼠肝脏粗脂肪的定量测定将洗净的索氏提取器小烧瓶于 103-105 供干 2 小时，干燥器冷却，称重（该重量记为 B ) 。称取一定量的样品（取实施例 9 中各组小鼠的肝脏组织， 103-105°C高温烘干至恒重）（该重量记为 C ) ，研碎，用滤纸包好，放入浸提管内。向小烧瓶内加入 1/2体积石油醚，连接好索氏提取器各部分， ⁸0°C水浴中加热蒸馏 14-20 小时。提取完毕，等石油醚完全流入小烧瓶时取出滤纸包，再回流一次，洗涤浸提管并继续加热，待浸提管内石油醚液面接近虹吸管上端而未流入小烧瓶前，倒出浸提管中石油醚。如果小烧瓶中留有石油醚，则继续加热蒸发到溶剂蒸尽。将小烧瓶于 103-105'C烘干 0.5 小时，取出并置于干燥器中冷至室温，称重（该重量记为 A" ) 。计算方法：粗脂肪含量％ = (A-B)/Cxl00% ( A: 小烧瓶及粗脂肪共重； B: 小烧瓶重； C: 样品重量）。结果显示阴性对照组小鼠的粗脂肪含量为 9.71±1.46 %，左旋乙酰肉毒碱组和各浓度 ( 20 、 30、 40 mg/kg.d ) 3-羟基丁酸甲酯组小鼠的粗脂肪含量分别为 10.24±3.35 %、 9.85±2.76 % , 10.86±0.79 %、 8.00±1.28 % , 实验各组的小鼠肝脏粗脂肪的含量没有显著性差异（图 8 ) 。实施例 12: 血清胆固醇的定量测定溶液试剂： 10 %三氯化铁溶液： 10g FeCl₃.6H₂0溶于磷酸，定容至 100 ml,保存于棕色瓶中；磷硫铁试剂：取 10 %三氯化铁溶液 1.5 ml 于 100 ml棕色容量瓶中，加浓硫酸至刻度；胆固醇标准储液：胆固醇 80 mg, 溶于无水乙醇，定容至 100 ml; 胆固醇标准溶液：将储液用无水乙醇稀释 10倍，此标准液每 ml含 0.08 mg胆固醇。

实验步驟：取实施例 9 中各组小鼠血清 75 L置于离心管内，先加 0.3 ml无水乙醇摇匀后，再加无水乙醇 1.5 ml摇匀， 10 min后 3000 rpm 离心 5 min, 取上清液备用（乙醇提取液）。另取离心管编号，空白管： 0.75 ml无水乙醇；标准管： 0.75 ml胆固醇标准溶液；样品管： 0.75 ml乙醇提取液。各管皆加入磷硫铁试剂 0.75 ml摇勾， 10 分钟后，分光光度计测 OD₅₆₍₎。结果显示阴性对照组小鼠的血清胆固醇含量为 0.154±0.03 % , 左旋乙酰肉毒碱组和各浓度（20 、 30、 40 mg/kg.d ) 3-羟基丁酸甲酯组小鼠的血清胆固醇含量分别为 0.154±0.05 %、 0·125±0·03 %、 0·158±0.02 %、 0.102±0.01 % , 其中 40mg/kg.d 3- 羟基丁酸甲酯组的小鼠血清胆固醇的含量显著低于阴性对照组，但是其它各实验组与对照组相比则没有显著性差异（图 9 ) 。血清中胆固醇的水平与冠心病患病率有明显的关系，如果血清中胆固醇的含量升高的话，无疑会增加哺乳动物得冠心病的几率。我们实验中使用的 ³- 羟基丁酸甲酯和左旋乙酰肉毒碱没有增加小鼠的血清胆固醇含量，因此不会引起动物得冠心病的危险。实施例 13: 骨髓细胞计数将实施例 9中各组小鼠颈推脱位处死，每只小鼠均取 2根股骨，每根股骨用 10 ml 3 %醋酸溶液冲出骨髓细胞，在血细胞计数器上计数 4个大方格的细胞数，所得细胞数乘以 2.5x100 000，即为 1根股骨中骨髓有核细胞数。实验结果显示左旋乙酰肉毒碱组小鼠每根股骨的骨髓有核细胞数为 8·125±1.24χ10⁶个， 20 mg/kg.d, 30 mg/kg.d 和 40 mg/kg.d ³-羟基丁酸甲酯组小鼠每根股骨的骨髓有核细胞数为 8·5±0·89、 8.95±1·22、 8·7±1·06χ10⁶个，而阴性对照组小鼠每根股骨的骨髓有核细胞数仅为 ⁵·⁹⁷⁵±1·³⁹ <10^δ个，左旋乙酰肉毒碱组和各浓度 3-羟基丁酸甲酯组小鼠每根股骨的骨髓有核细胞数与阴性对照组相比具有明显差异（Ρ<0·01 ) (图 10 ) 。实施例 14: 鼠脑神经胶质细胞的制备取新生 1 天的 Bal/c 小鼠，使用乙醚麻醉并在无菌条件下斩首处死。取完整鼠脑部并在冷冻条件下保存于无菌 D-Hanks 液中（含 50 U/mL 青霉素 +50 mg/L 链霉素）。在解剖镜下用无菌剪刀仔细剥除脑膜和血管等纤维成分，将脑组织转移至无菌塑料培养亚中，加入 6 ml 经 37°C预热的含有 20 %胎牛血清（FBS ) 的 DMEM培养液。用无菌手术刀将脑组织切碎为 15 mm³左右的小块并通过 0.05 mm孔径的滤膜过滤。过滤得到的细胞在 1200 rpm下离心 10分钟。弃上清后加入含有 20 % FBS 的 DMEM培养液重悬。重复上述离心步骤，将最终收集到的细胞悬浮于含有 20 % FBS 的 DMEM培养液中，细胞计数并调整好细胞浓度，接种入培养瓶中， 37O， ⁵% C0₂培养。待细胞生长汇合后，用 0.25 %胰蛋白酶消化传代处理。实施例 15: 免疫细胞化学法客定鼠脑神经胶质细胞生长状况良好的细胞（实施例 14得到的细胞，经过 3 次传代培养）用胰酶消化液处理 2 分钟，吸除消化液，加入新鲜培养液制成单细胞悬液。血球计数板检测细胞数量。接种于 96孔板中（5xl0³个细胞 /孔）， 37Ό， 5% C0₂细胞贴壁培养 24 小时后更换培养液，继续培养 48小时。吸除培养液后，用 0.1 M PBS (磷酸緩冲液 ρΗ 7·² )清洗培养板 2遍， 4 %多聚甲醛溶液固定细胞 30分钟。移除固定液，用 0.1 M PBS溶液清洗培养板 2遍。通过检测细胞是否含有胶质纤维酸性蛋白（GFAP )进行神经胶质细胞的鉴定。一级抗体采用兔抗 GFAP 抗体，以 1: 100比例稀释于含有 0.3 % Triton X-100和 5 %羊血清的 PBS 溶液中。二级抗体采用羊抗兔 Cy3- IgG抗体，以 1: 30比例稀释于含有 0.³ % Triton X-100的 PBS溶液中。一级抗体在 4。C条件下过夜反应，反应后用 0.1 M PBS清洗；二级抗体在室温下反应 2小时，反应后用 0.1 M PBS清洗。使用 DAPI复染细胞核，室温下染色 30分钟； PBS清洗三次。荧光倒置显微镜下（NIKON Elipse TE2000 )观察免疫细胞化学检测结果（放大倍数： 10 x 20 ) 。随机选取的荧光显微照片结果显示，一级抗体与 GFAP 结合，带有 Cy3 荧光发光基团的二级抗体与一级抗体结合，荧光倒置显微镜下可观测到红色荧光（Cy3 发出荧光），细胞核被 DAPI染色，发出绿色荧光（图 11 ) 。免疫细胞化学结果证明，实施例 14中分离的细胞为鼠脑神经胶质细胞。实施例 16: 流式细胞技术检测 D-3-羟基丁酸钠、 DL-3-羟基丁酸钠和

3-羟基丁酸甲酯对鼠神经胶质细胞凋亡抑制的影响生长状况良好的细胞（实施例 14得到的细胞，经过 3 次传代培养）用胰酶消化液处理 2分钟，吸除消化液，加入新鲜培养液制成单细胞悬液。血球计数板检测细胞数量，接种于 6 孔板中（1 x10^s个细胞 /孔）。分别设置阴性对照组，以及 D-3-羟基丁酸钠、 DL-3-羟基丁酸钠和 3-羟基丁酸甲酯处理组（浓度均为 10 mM ) 。使用 DMEM+20%FBS培养液， 37。 (， 5% C0₂细胞贴壁培养 24 小时，吸除培养液， PBS (磷酸緩冲液 pH 7.2 ) 清洗 2遍，加入无血清 DMEM 培养液培养 24小时后，分别向 D-³-羟基丁酸钠、 DL-³-羟基丁酸钠和 3-羟基丁酸甲酯处理组中加入 10 mM D-3-羟基丁酸納、 10 mM DL-3- 羟基丁酸钠和 10 mM 3-羟基丁酸甲酯继续培养 48小时。

使用 Annexin-V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒对细胞进行染色并进行流式细胞术检测：胰酶消化细胞， 1 ml培养液吹勾， 1000 rpm 离心 10分钟。弃去上清， PBS清洗 2次， 0.5 ml PBS吹匀。 5ml注射器将细胞吸起并吹入 5 ml 70 %预冷的乙醇中， 4 固定过夜。 1000 rpm 离心 10分钟收集固定细胞， PBS清洗 2次。 0.5 ml PBS重悬细胞并轻轻吹匀（防止细胞破碎 )。加入 1.5μ1 RNase A至终浓度为 60 g/ml， 37°C消化 30分钟；加入 0.25 ml PI溶液至终浓度为 20 g/inl, 水浴中避光染色 30分钟；上机（BECKMAN Coulter Epics XL流式细胞仪 )检测。

流式细胞技术检测结果显示：阴性对照组的细胞凋亡比例为 94.3% , D-3-羟基丁酸钠、 DL-3-羟基丁酸钠和 3-羟基丁酸甲酯处理组的细胞凋亡比例分别为 84.3 %、 86.1%和 87.9% (图 12a， 12b, 12c, 12d ) ， D-3-羟基丁酸钠、 DL-3-羟基丁酸钠和 3-羟基丁酸甲酯处理组的细胞凋亡比例均比阴性对照组均有降低（图 13 ) 。实施例 17: 荧光显微镜原位观察 D-3-羟基丁酸钠、 DL-3-羟基丁酸钠和 3-羟基丁酸甲酯对鼠神经胶盾细胞凋亡的影响细胞培养条件和对照组设定与实施例 16 中相同。培养后的 6孔板用 PBS溶液清洗 3次，按照 DAPI反应试剂盒的说明，分别向培养板内加入 100 DAPI Binding Buffer (结合緩冲液）和 5 μΐ DAPI ( 2-(4-amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride ) 染液。染色结束后移除染液， PBS溶液清洗 3次，使用荧光倒置显微镜对细胞培养板进行观察（NIKON Elipse荧光倒置显微镜 TE2000 ) 。随机选取的荧光显微照片结果显示，凋亡细胞的细胞核会被 DAPI 染色而发出蓝色荧光， D-3-羟基丁酸钠、 DL-3-羟基丁酸钠和 3-羟基丁酸甲酯处理组与阴性对照组相比，凋亡细胞数目有所减少，其中 3-羟基丁酸甲酯处理组凋亡细胞数目明显少于对照组（图 14 ) 。实施例 18: 钙成像法检测 D-3-羟基丁酸钠、 DL-3-羟基丁酸钠和 3-羟基丁酸甲酯对鼠神经胶质细胞胞内钙离子浓度的影响生长状况良好的细胞（实施例 14得到的细胞，经过 3 次传代培养）经过胰酶消化液处理 1 分钟，吸除消化液，加入新鲜培养液制成单细胞悬液；血球计数板检测细胞数量；将 0.1：3-0.17 mm厚经过聚赖氨酸（ poly-L-lysine ) 包被的盖玻片置于 6 孔板中，向培养板中加入 1x10^s个 /ml的细胞悬液和 DMEM+20%FBS培养液， 5% C0₂ 细胞贴壁培养 24 小时。对照组设置与实施例 16相同。移除培养液后，加入 2 mM钙离子特异性染剂 fura-4/AM, 37°C条件下染色 20 分钟；普通生理溶液（ΝΡΜ, 45 mM NaCl, 5 mM KC1, 1.8 mM CaCl₂, 0.8 mM MgCl₂, 10 mM葡萄糖，和 10 mM Hepes pH 7.4 )清洗；用 NPM 制备 D-3-羟基丁酸钠、 DL-3-羟基丁酸钠和 3-羟基丁酸甲酯溶液；三种溶液分别以 1 ml/min的速度扩散通过细胞，并通过控制溶液流速控制溶液浓度 ( 10 mM D-3-羟基丁酸钠、 10 mM DL-3-羟基丁酸钠和 10 mM 3-羟基丁酸甲酯）。使用激光共聚焦显微镜 ( Zeiss LSM 510 ) 记录钙成像结果。

钙成像检测结果显示， D-3-羟基丁酸钠、 DL-3-羟基丁酸钠和 3- 羟基丁酸甲酯均能引起细胞胞内钙离子浓度的突然升高，与阴性对照组相比具有统计学显著性差异（P<0.05 ) ，提高量分别为羟基丁酸钠处理组提高 60单位，羟基丁酸钠处理组提高 120 单位， 3-羟基丁酸甲酯处理组提高 160单位（图 15 ) 。另外，与 DL-3-羟基丁酸钠和 D-3-羟基丁酸钠相比， 3-羟基丁酸甲酯的作用浓度仅为前两者的千分之一，因而具有更加显著的作用（图 15b ) 。另外，细胞内钙离子浓度的提高与 3-羟基丁酸甲酯浓度具有对应关系， 10 mM 3-羟基丁酸甲酯可引起胞内钙离子浓度提高 240 单位，而 5 mM 3-羟基丁酸甲酯仅可引起胞内钙离子浓度提高约 100 单位（图 16 ) 。可以得出结论， 3-羟基丁酸甲酯对胞内钙离子浓度的影响具有浓度依赖性。

为研究 D-3-羟基丁酸钠、 DL-3-羟基丁酸钠和 3-羟基丁酸甲酯引起胞内钙离子浓度升高的机理，研究胞内增加的钙离子是否来源于胞外的 NPM溶液，或来源与胞内钙库的释放，分别使用含有 Ca²⁺和 Mg²⁺ 的 NPM 以及不食有这两种阳离子的 NPM 进行实验。结果显示，在使用含有 Ca²⁺和 Mg²⁺的 NPM时， 5 mM、 10 mM D-3-羟基丁酸钠和 5 mM、 10 mM DL-3-羟基丁酸钠均能引起胞内钙离子浓度突然升高：与阴性对照相比， 5 mM D-3-羟基丁酸钠（简称为 (D)-3-HBNa或 D-3- HBNa )， 69.7秒时，钙离子浓度最大增加量为 111 单位， 5 mM DL-3- 羟基丁酸钠（简称为（DL)-3-HBNa 或 DL-3-HBNa ) ， 59.2 秒时，钙离子浓度最大增加量为 142.5单位， 10 mM D-3-羟基丁酸钠， 57.4秒时，钙离子浓度最大增加量为 96单位， 10 mM D-3-羟基丁酸钠， 61.⁵ 秒时，钙离子浓度最大增加量为 1⁵³.4 单位（图 17a ) 。可以得出， DL-3-羟基丁酸钠的作用强于 D-3-羟基丁酸钠，且具有统计学差异 ( P<0.05 )，而同种物质的不同浓度，其作用效果无明显差异（ P<0.05 )。在使用不含有 Ca²⁺和 Mg²⁺的 NPM时， 5mM、 10 mM D-3-羟基丁酸钠和 5 mM、 10 mM DL-3-羟基丁酸钠同样均能引起胞内钙离子浓度突然升高：与阴性对照相比， 5 mM D-3-羟基丁酸钠， 53.3秒时，钙离子浓度最大增加量为 6³.4单位， 5 mM DL-3-羟基丁酸钠， 36秒时，钙离子浓度最大增加量为 ³6.⁵单位， 10 mM D-3-羟基丁酸钠， 73.8 秒时，钙离子浓度最大增加量为 91 单位， 10 mM DL-3-羟基丁酸钠， 7⁵·⁹秒时，钙离子浓度最大增加量为 54.1 单位（图 17b ) 。因此可以得出，在使用不含有 Ca²⁺和 M_g ²⁺的 NPM时，两种物质引起胞内钙离子浓度升高的作用均有所下降。

结合上述分析，可以得出结论， D-3-羟基丁酸钠、 DL-3-羟基丁酸钠和 3-羟基丁酸甲酯不仅能够通过促进胞外钙离子内流引起胞内钙离子升高，也能够通过引起胞内钙库的释放升高胞内钙离子浓度。

为进一步研究 D-3-羟基丁酸钠、 DL-3-羟基丁酸钠和 3-羟基丁酸甲酯（简称为 M(D)-3-HB或 M-3-HB ) 引起胞内钙离子浓度升高的机理，选用钙离子类似物 Nitredipine 竟争性抑止钙离子通道。结果显示，加入 10 μΜ Nitredipine后， D-3-羟基丁酸钠、 DL-3-羟基丁酸钠和 3-羟基丁酸甲酯引起的胞内钙离子浓度升高现象分别明显减小， 10 mM3-羟基丁酸甲酯引起的钙离子浓度升高最大值由 250 单位下降为 120 单位， 3 mM D-3-羟基丁酸钠引起的钙离子浓度升高最大值由 ⁷0 单位下降为 42 单位， 3 mM DL-³-羟基丁酸钠引起的钙离子浓度升高最大值由 90单位下降为 4⁵.²单位（图 1 ， 18b, 18c ) 。结果显示， Nitredipine 竟争性抑制了 L-型电压门控型钙离子通道，引起三种物质作用的降低。因此，可以得出结论，三种物质是通过影响 L-型电压门控型钙离子通道从而进一步引起细胞内钙离子浓度升高。

本文中所涉及的参考文献，包括专利文件、学术论文、出版物等，均以引用的方式将其全部内容包括在本文中。

应当理解，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域的普通技术人员可以在形式和细节上对其做出各种改变和改进，而这些均被认为落入了本发明的保护范围。参考文献：

韩太真，吴馥梅. 《学习与记忆的神经生物学》。北京医科大学和中国协和医科大学联合出版社。（1998) 3-4

焦鹏涛，金恒善，付立晶. 利他林和感觉统合训练对儿童多动症的远期疗效研究. 国际医药卫生导报， 08 ( 2006 ) 78-79

金伟秋. Neotrofin 在阿尔茨海默氏病试验中失分. 国外药讯， 8 (2002) 13-13

温旭初，陈双双，匡培梓. 小鸡一次性被动回避模型行为特点的研究. 心理学动态， 3 (1995) 51-55

施安国，费艳秋，安富荣.老年痴呆症的药物治疗进展.药学进展，

6(2000):338

Aarum J, Sandberg K, Haeberlein SLB, et al. Migration and differentiation of neural precursor cells can be directed by microglia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of the America 100 (2003) 15983-15988

Amiel SA, Archibald HR， Chusney G， Williams AJ， Gale EA. Ketone infusion lowers hormonal responses to hypoglycaemia: evidence for acute cerebral utilization of a non-glucose fuel. Clin Sci, 81 (1991) 189-194

Andrew E, Budson M D, Bruce H， Price M D. Memory Dysfunction. The New England Journal of Medicine, 352(2005):692- 699

Arumugam H, Liu XH, Colombo PJ, Corriveau RA, Belousov AB. NMDA receptors regulate developmental gap junction uncoupling via CREB signaling. Nature Neuroscience, 8 (2005) 1720 - 1726

Chen GQ, Wu Q. Microbial Production and Applications of Chiral Hydroxyalkanoates. Appl Microbiol Biotechnol, 67 (2005) 592 - 599

Cheng S, Guo-Qiang C, Leski M, et al. The effect of D,L-beta- hydroxybutyric acid on cell death and proliferation in L929 cells. Biomaterials 27 (2006)： 3758-3765.

Cross HR, Clarke K, Opie LH， Radda GK. Is lactate-induced myocardial ischaemic injury mediated by decreased pH or increased intracellular lactate. J Mol Cell Cardiol, 27 (1995) 1369-1381

Daikhin Y， Yudkoff M Ketone bodies and brain glutamate and GABA metabolism. Dev Neurosci 20(1998):358-364.

Doi T， Yoshimatsu H， Katsuragi I， Kurokawa M， Takahashi H，

Motoshio A, Sakata T Alpha-amylase inhibitor increases plasma 3- hydroxybutyric acid in food-restricted rats. Experientia 51 (1995):585-588

Ferster C, Skinner BF. Schedules of reinforcement. New York: Appleton-Century-Crofts. (1957)

Hakansson L. Long-term treatment with tacrine (THA) in Alzheimerc's disease evaluation of neuropsychological data. Acta Neurol Scand, 88 (1993) Supplement 55-55

Holzwarth JA, Gibbons SJ, Brorso JR, et al. Glutamate-receptor agonists stimulate diverse calcium responses in different types of cultured rat cortical glial-cells. Journal of Neuroscience 14 (1994): 1879-1891.

Kandel ER. The Molecular Biology of Memory Storage: A Dialog between Genes and Synapses. Science, 294 (2001) 1030-1038

Kashiwaya Y， Takeshima T， Mori N, Nakashima , Clarke K， Veech RL. D-beta-hydroxybutyrate protects neurons in models of Alzheimer's and Parkinson's disease. Proc Natl Acad Sci USA 97(2000):5440-5444.

Ma W, Pancrazio JJ， Andreadis JD, et al. Ethanol blocks cytosolic Ca²⁺ responses triggered by activation of GABA(A) receptor/Cl- channels in cultured proliferating rat neuroepithelial cells. Neuroscience 104 (2001): 913-922

McCarthy. KD, deVellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J. Cell Biol. 85,890. 1980.

Miller OA. The magical number seven, plus or minus two: Some limits on our capacity for processing information. Psychological Rev, 63 (1956) 81-97.

Morris JC, Cyrus PA, Orazem J Mas J， Bieber F, Ruzicka BB, Gulanski B. Metrifonate benefits cognitive, behavioural, and global function in patients with Alzheimer's disease. Neurology, 50(1998)1222-1230

Morris R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat, J. Neurosci. Methods, 11 (1984) 47-60.

Muhamamad F, Siddiqui, Allan J L. Cholinegic therapies in Alzheimer's disease. Drugs Fut , 24(1999)417-424

Ormrod JE. Human Learning (3rd ed.) Upper Saddle River, NJ: Merrill/Prentice Hall. (1999)

Pavlov, IP. Conditioned Reflexes. London: Oxford University Press. (1927)

Plecko B, Stoeckler-Ipsiroglu S, Schober E, Harrer G, Mlynarik V， Gruber S, Moser E, Moeslinger D, Silgoner H， Ipsiroglu O. Oral β- Hydroxybutyrate Supplementation in Two Patients with Hyperinsulinemic Hypoglycemia: Monitoring of β-Hydroxybutyrate Levels in Blood and Cerebrospinal Fluid, and in the Brain by In Vivo Magnetic Resonance Spectroscopy. Pediatric Research, 52(2002) 301- 306

Rackley CE, Russell RJ， Rogers WJ, Mantle JA, McDaniel HG, Papapietro SE. Clinical experience with glucose-insulin-potassium therapy in acute myocardial infarction. Am Heart J， 102(1981) 1038- 1049

Rasmussen HS, McNair P， Goransson L, Balslav S， Larsen OG,

Aurup P. Magnesium deficiency in patients with ischemic heart disease with and without acute myocardial infarction uncovered by an intravenous loading test. Arch Intern Med 148 (1988) 329-332.

Reger MA, Henderson ST, Hale C, Cholenon B, Baker LD, Watson GS, Hyde K, Chapman D, Craft S. Effects of β- hydroxybutyrate on cognition in memory-impaired adults. Neurobiology of Aging, 25 (2004) 311-314 Reuler J B, Girard D E, Cooney T G. Current concepts: Wernicke's encephalopathy. N Engl J Med, 312(1985):1035-1039.

Sanda M. Galanthamine: The new treatment of choice on Alzheimer's disease. Inpharma, 1002， (1995) 3

Schunk DH. Learning Theories: An educational perspective. (2nd ed). Englewood Cliffs, N.J.: Merrill/Prentice Hall. (1996)

Sch eickert, R.. Amultinomial processing tree model for degradation and redintegration in immediate recall. Memory & Cognition, 21 (1993) 168-175.

Shimizu E， Tang YP， Rampon C， Tsien JZ. NMDA Receptor- Dependent Synaptic Reinforcement as a Crucial Process for Memory Consolidation. Science, 290 (2000) 1170-1174

Tieu K， Perier C, Caspersen ：， Teismann P, Wu DC, Yan SD, Naini A, Vila M， Jackson-Lewis V, Ramasamy R, Przedborski S. D- beta-hydroxybutyrate rescues mitochondrial respiration and mitigates features of Parkinson disease. J Clin Invest, 112(2003) 892-901

Wilson B A, Evans J J， Emslic H et al. Evaluation of Neuro Page: a new memory aid. J Neurol Neurosurg Psychiatry, 63(1997):113-115

Claims

' ·，'"，"

1. 一种用于提高受试者的学习和 /或记忆能力的药物组合物，其包含：

作为活性成分的式 (I)化合物，

0

0H— C —CH₂— C— 0R】

(I)

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、对映异构体、或前体药物，其中，

选自由 H、 C_rC₉的烷基、 C₃-C₉的环烷基、芳基和无毒金属离子构成的组；

R₂选自由 H、 C C₉的烷基、 C₃-C₉的环烷基、 C_rC₉的烷氧基和芳基构成的組；以及

药学上可接受的载体。

2. 根据权利要求 1的药物组合物，其中选自由 H、 C C₇的烷基和无毒金属离子构成的组。

3. 根据权利要求 2的药物組合物，其中选自由 H、 C C₅的烷基和无毒金属离子构成的组。

4. 根据权利要求 3的药物组合物，其中选自由 H、（ C₃的烷基和无毒金属离子构成的组。

5. 根据权利要求 4的药物组合物，其中所述无毒金属离子为 Na+、 K+和 Ca²⁺。

6. 根据权利要求 1-5之任一项的药物组合物，其中 R₂选自由 H、 c₇的烷基、 c_rc₇的烷氧基和芳基构成的组。

7. 根据权利要求 6的药物组合物，其中 R₂选自由 H、的坑基、 c c₅的烷氧基构成的组。

8. 根据权利要求 7的药物組合物，其中 R₂选自由 H、 C C₃的烷基、 c c₃的烷氧基构成的組。

9. 根据权利要求 1的药物组合物，其中选自由 H、 C₂的烷基、 Na⁺和 K+构成的组，并且 R₂逸自由 C₂的烷基构成的组。

10. 根据权利要求 1 的药物组合物，其中式 (I)化合物选自由以下成员构成的组：

3-羟基丁酸曱酯；

3-羟基丁酸乙酯；

3-羟基丁酸；

D-3-羟基丁酸钠；

DL-3-羟基丁酸钠。

Π.根据权利要求 1-10之任一项的药物组合物，其中所述药物组合物用于治疗受试者中的记忆相关疾病。

12. —种用于提高受试者的学习和 /或记忆能力的方法，包括对所述受试者施用有效量的式 (I)化合物，

OH— CH— CH₂— C— OR

R₂

(I)

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、对映异构体、或前体药物，其中，

选自由 H、（广^的烷基、 C₃-C₉的环烷基、芳基和无毒金属离子构成的组；

R₂选自由 H、（：广^的烷基、 C C₉的环烷基、 C C₉的烷氧基和芳基构成的组。

13. 根据杈利要求 12的方法，其中选自由 H、 C₇的烷基和无毒金属离子构成的组。

14. 根据权利要求 13的方法，其中 R选自由 H、 C Cs的烷基和无毒金属离子构成的组。

15. 根据权利要求 14的方法，其中选自由 H、（^-( ₃的烷基和无毒金属离子构成的组。

16. 根据权利要求 15的方法，其中所述无毒金属离子为 Na+、 K⁺ 和 Ca²⁺。

17.根据权利要求 12-16之任一项的方法，其中 R₂选自由 H、CVC₇ 的烷基、 c c₇的烷氧基和芳基构成的组。

18. 根据权利要求 17的方法，其中 R₂选自由 H、（：广^的烷基、 c_s的垸氧基构成的组。

19. 根据权利要求 18的方法，其中 R₂选自由 H、的烷基、 C C₃的烷氧基构成的组。

20. 根据权利要求 12的方法，其中选自由 H、（ ^的烷基、 Na⁺和 K⁺构成的组，并且 R₂选自由 C₂的烷基构成的组。

21. 根据权利要求 12的方法，其中式 (I)化合物选自由以下成员构成的组：

3-羟基丁酸甲酯；

3-羟基丁酸乙酯；

3-羟基丁酸；

D-3-羟基丁酸钠；

DL-3-羟基丁酸钠。

22. 根据权利要求 12-21 之任一项的方法，其中所述方法用于治疗受试者中的记忆相关疾病。

23. 式 (I)化合物

OH— CH— C¾— C— OR,

R，

(I)

或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物、对映异构体、或前体药物在制备用于提高受试者的学习和 /或记忆能力的药物中的用途，其中，

选自由 H、（广( ₉的烷基、 C₃-C₉的环烷基、芳基和无毒金属离子构成的组；

R₂选自由 H、的烷基、 C₃-C₉的环垸基、 C₉的烷氧基和芳基构成的组；以及药学上可接受的载体。

24. 根据权利要求 23的用途，其中选自由 H、 C_rC₇的烷基和无毒金属离子构成的组。

25. 根据权利要求 24的用途，其中选自由 H、（： ^的烷基和无毒金属离子构成的组。

26. 根据权利要求 25的用途，其中选自由 H、（ C₃的烷基和无毒金属离子构成的组。

27. 根据权利要求 26的用途，其中所述无毒金属离子为 Na+、 K⁺ 和 Ca²⁺。

28. 根据权利要求 23-27之任一项的用途，其中 R₂选自由 H、 C₇ 的烷基、的烷氧基和芳基构成的组。

29. 根据权利要求 28的用途，其中 R₂选自由 H、（^-(^的烷基、 C₅的烷氧基构成的组。

30. 根据权利要求 29的用途，其中选自由 H、（^-< ₃的烷基、 c c₃的烷氧基构成的组。

31. 根据权利要求 23的用途，其中选自由 H、 C C₂的烷基、 Na+和 K+构成的组，并且 R₂选自由 C C₂的烷基构成的组。

32. 根据权利要求 23的用途，其中式 (I)化合物选自由以下成员构成的组：

3-羟基丁酸甲酯；

3-羟基丁酸乙酯；

3-羟基丁酸；

D-3-羟基丁酸钠；

DL-3-羟基丁酸钠。

33. 根据权利要求 23-32之任一项的用途，其中所述药物用于治疗受试者中的记忆相关疾病。