CN101461963A

CN101461963A - 多重复合可梯度降解骨组织工程支架材料及其制备方法

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Publication number: CN101461963A
Application number: CNA2009100364793A
Authority: CN
Inventors: 叶建东; 何福坡; 王迎军; 漆小鹏; 陈晓峰; 吴刚
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2009-01-07
Filing date: 2009-01-07
Publication date: 2009-06-24
Anticipated expiration: 2029-01-07
Also published as: CN101461963B

Abstract

本发明公开了一种多重复合可梯度降解骨组织工程支架材料及其制备方法，该复合支架材料由磷酸钙骨水泥、生物相容可降解合成高分子及生物相容可降解天然高分子组成，多重复合支架材料具有较好的力学性能和梯度降解特性，同时还可以通过载入骨生长因子诱导体内干细胞分化为成骨细胞，达到骨组织缺损再生修复的目的，可显著提高支架材料的初期强度和韧性，保障在操作和植入过程中支架材料有足够的强度和韧性；由于复合高分子材料后支架具有的良好的柔韧性，可进行一定的切割等机械加工。

Description

多重复合可梯度降解骨组织工程支架材料及其制备方法

技术领域

本发明属于生物医学工程领域的组织工程材料技术，特别涉及多重复合可梯度降解骨组织工程支架材料及其制备方法。

背景技术

因工伤事故、交通事故、骨科炎症、骨肿瘤及与老龄相关的骨科疾病等所造成的骨缺损病例众多，严重影响了人们的健康水平和生活质量。当前采用的骨缺损临床治疗方法主要有：自体骨移植，异体骨移植和人造材料修复。虽然自体骨是理想的骨移植材料，但供骨来源有限，二次手术会给患者带来痛苦，并对供体产生新的损伤，供骨区还可能出现形态和功能障碍；异体骨虽然来源较丰富，可预先贮存，使用方便，但其存在免疫排异反应，而且因异体骨处理方面的疏漏还可能导致受体感染，并有导致传染疾病和肿瘤生成的可能，也限制了异体骨的广泛应用；而采用人造材料进行骨缺损的直接替代修复，由于难以实现缺损部位的骨组织再生，修复效果不理想。因此，人们一直寻求更理想的骨缺损生物性重建修复方法。

组织工程学(Tissue Engineering)的发展，为骨缺损的治疗和修复提供了一条较理想的、可行的途径。组织工程的核心为：建立细胞与生物材料的三维空间复合体，即具有生命力的活体组织，用来对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代。组织工程包括三个关键因素：信号分子(生长因子、诱导因子)、支架材料和靶细胞。支架材料在构建组织工程化组织或器官中占有举足轻重的地位，不仅为特定的细胞提供结构支撑，有利于细胞的黏附、营养物质的交换、细胞增殖和分化并向支架内部迁移，为细胞生长提供合适的外部环境，而且还能起到模板的作用，引导组织再生和控制组织结构。理想的组织工程支架材料应具有三维连通的多孔结构，良好的生物相容性，与组织再生相匹配的降解速度，能促进组织再生的化学表面和一定的力学强度。

目前常用的组织工程支架材料包括可降解的生物活性无机材料、天然生物高分子和可降解合成高分子材料以及它们的复合材料。天然生物高分子材料以胶原、明胶、壳聚糖为代表，这类材料具有良好的生物相容性和细胞亲和性，来源广泛，但这类材料产品性质不稳定，大多数力学性能差，成型加工受限制，分子结构复杂，此外，降解吸收过快，可控降解性不好；可降解合成高分子材料以聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)及它们的共聚物(PLGA)为代表，这类材料大多具有良好的力学性能，可使用多种加工方法制备成三维多孔材料，可通过分子设计对其降解速率、活性基团种类等进行一定的设计及调控，但这类材料的疏水性较强，细胞亲和性不理想，且降解产物一般呈酸性，易引起无菌性炎症，对组织造成不良的影响；无机材料以磷酸钙类陶瓷和生物活性玻璃为代表，这类材料成分接近硬组织，生物相容性和生物活性好，致密体的力学性能良好，在作为硬组织替代的骨植入材料方面有更好的应用前景，但这类材料呈脆性，在制备高孔隙率的三维连通支架上有一定难度，且其高孔隙率支架的强度通常很低，此外，由于缺乏类似高分子材料的可供反应的活性基团，在结合生物活性分子上受到一定的限制，其可控降解性也不太理想。虽然近几年有关组织工程支架材料的研究很多，但至今尚未研制出一种理想的骨组织工程支架材料。如何制备出生物相容性、细胞亲和性、力学性能良好以及材料降解与细胞生长或成骨速度基本匹配的高孔隙率支架是目前组织工程研究急需解决的问题。解决问题的可行途径之一是通过两种或以上具有互补特性的生物可降解材料复合，并进行仿生设计、模拟和实验，制备性能优异的复合组织工程支架材料。

磷酸钙骨水泥(CPC)是一种新型的自固型生物活性材料，具有良好的生物相容性、骨传导性、可降解性、可塑性，而且反应产生的热量少，是较理想的骨替代及修复材料。由于自固化磷酸钙能在常温下水化成为弱结晶羟基磷灰石，具有良好的可降解吸收性，且易于成型和成孔，因此是制备磷酸钙类多孔组织工程支架的理想材料。Xu等人对磷酸四钙-无水磷酸氢钙体系骨水泥组织工程支架进行了系统的研究，对支架的体外细胞培养表明磷酸钙骨水泥材料具有良好的生物相容性[H.H.K.Xu，et al.Biomaterials 2005，26：1337-1348.]。然而，在多年的研究与应用过程中，磷酸钙类材料呈脆性、强度偏低的问题一直未能得到很好的解决，限制了它的广泛应用。这直接造成了高孔隙率的多孔磷酸钙组织工程支架强度很低。为了解决这一难题，人们从不同的角度入手进行了研究，其中包括：采用不同的磷酸钙配方体系，加入能起增强作用的添加剂等；选用柠檬酸(钠)、苹果酸、磷酸钠盐等有机及无机溶液作为调和液；另外，借鉴传统的增强方法，与晶须、有机高分子材料、短纤维等复合。通过这些方法使磷酸钙骨水泥的力学性能得到了不同程度的提高，但是效果仍不理想，尤其是对于具有高孔隙率的磷酸钙组织工程支架材料，力学性能差仍然是阻碍其实际应用的关键。目前研究较多、效果较好的是采用复合高分子材料的方法，Xu等分别研究了直接向骨水泥基体中加入可吸收缝合线纤维[H.H.K.Xu et al.J.Biomed.Mater.Res.Part A.2005，75：966-975.]、加入PLGA网状增强物[H.H.K.Xu et al.J.Biomed.Mater.Res.Part A.2004，69：267-278.]、加入壳聚糖[H.H.K Xu et al.Biomaterials 2005，6：1337-1348.]，来改善骨水泥的力学性能，使多孔骨水泥支架的力学性能得到了比较明显的提高。然而由于加入的高分子材料的降解明显较磷酸钙骨水泥快，一旦与骨水泥随机混合的增强体降解后，支架的强度会显著下降，可能使材料无法承受原来所承受的载荷而塌陷。另一方面，这些增强剂对支架的生物相容性和细胞亲和性没有改善作用，甚至有的(如PLGA)还会使支架的生物相容性和细胞亲和性下降。

有关自固化磷酸钙组织工程支架材料的研究普遍没有考虑支架材料降解速率的调控问题。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种多重复合可梯度降解骨组织工程支架材料及其制备方法，该复合支架材料由磷酸钙骨水泥、生物相容可降解合成高分子及生物相容可降解天然高分子组成，在植入体内后，降解很快的天然高分子首先降解并在复合支架中原位形成连通大孔隙，供新骨组织长入，起到支架的作用；降解相对较慢的合成高分子附着在多孔支架的孔壁加强磷酸钙多孔支架基体，使支架能够在一段时间内保持良好的强度。随着合成高分子和磷酸钙骨水泥多孔基体的逐渐降解，细胞和组织不断长入，最终整个复合支架完全降解，植入部位被新生骨组织替代。多重复合支架材料具有较好的力学性能和梯度降解性能，同时还可以通过载入骨生长因子诱导体内干细胞分化为成骨细胞，达到骨组织缺损再生修复的目的，能适应临床使用的要求。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种多重复合可梯度降解骨组织工程支架材料的制备方法，包括如下步骤：

(1)将生物相容可降解合成高分子材料溶解在溶剂中，配制成质量百分比浓度为1～20％的溶液，然后搅拌或静置1～48小时，过滤，得到合成高分子溶液A；在溶解过程中，根据需要可采用加热(40～80℃)的方法促进合成高分子材料溶解；

将生物相容可降解天然高分子材料溶解在溶剂中，配制成质量百分比浓度为5～25％的溶液，然后搅拌或静置1～48小时，过滤，得到天然高分子溶液B；在溶解过程中，根据需要可采用加热(30～100℃)的方法促进天然高分子材料溶解；

(2)将总孔隙率为70～95％的磷酸钙骨水泥多孔支架在30～100℃下干燥1～48小时；将磷酸钙骨水泥多孔支架浸泡到步骤(1)所配制的合成高分子溶液A中，真空干燥0.5～5小时，合成高分子溶液在压力和毛细管力作用下灌注到磷酸钙骨水泥多孔支架的孔隙中，得到灌注了合成高分子材料的磷酸钙骨水泥多孔支架；

所述磷酸钙骨水泥多孔支架可以参照如下方法制备：方法1(H.H.K.Xu，S.Takagi，J.B.Quinn，et al.J.Biomed.Mater.Res.，2004，68A：725-734.)；方法2(A.Almirall，G.Larrecq，J.A.Delgado，et al.Biomaterials，2004，25：3671-3680)；方法3(X.Miao，Y.Hu，J.Liu，et al.Materials Letters，2004，58：397-402)；方法4(X.P.Qi，J.D.Ye，Y.J.Wang.J Biomed Mater Res Part A，DOI：10.1002/jbm.a.32054，in press)。

(3)将灌注了合成高分子材料的磷酸钙骨水泥多孔支架拭干表面，在-60～-4℃下预冻1～48小时；将获得的冻结复合材料冷冻干燥2～48小时，干燥后高分子在多孔磷酸钙孔壁上形成膜层，即得合成高分子与磷酸钙复合的多孔组织工程支架材料。可根据需要通过改变高分子溶液的浓度来改变成膜的厚度。

(5)将由步骤(3)所得到合成高分子与磷酸钙复合的多孔组织工程支架材料浸泡到步骤(1)的天然高分子溶液B中，真空干燥0.5～5小时，天然高分子溶液在压力和毛细管力作用下灌注到磷酸钙骨水泥多孔支架的孔隙中，得到灌注了天然高分子溶液的磷酸钙骨水泥多孔支架；

(6)将灌注了天然高分子溶液的磷酸钙骨水泥多孔支架拭干表面，在-60～-4℃下预冻1～48小时；然后将获得的冻结材料冷冻干燥2～48小时，干燥后天然高分子以多孔或网状结构填充于由步骤(3)所得到合成高分子与磷酸钙复合的多孔组织工程支架材料孔隙中，即得多重复合可梯度降解骨组织工程支架材料。

为了更好地实现本发明，所述的生物相容可降解合成高分子材料包括聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乳酸/淀粉共混物、聚己内酯(PCL)或聚己内酯(PCL)/淀粉共混物等中任意一种或两种或两种以上。

所述的生物相容可降解天然高分子材料包括胶原、明胶、壳聚糖、丝素蛋白、海藻酸钠或纤维素衍生物等中任意一种或两种或两种以上材料。

所述生物相容可降解合成高分子材料溶解在溶剂中的溶剂包括1，4-二氧六环、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜或三氯乙酸等。

所述生物相容可降解天然高分子材料溶解在溶剂中的溶剂为去离子水、蒸馏水、醋酸水溶液、磷酸水溶液、无水乙醇及其水溶液、氯化钙溶液或丙酮等。

所述的磷酸钙骨水泥包括无定型磷酸钙(ACP)+二水磷酸氢钙(DCPD)体系骨水泥、磷酸三钙(TCP)+二水磷酸氢钙(DCPD)体系骨水泥、α-磷酸三钙(α-TCP)+二水磷酸氢钙(DCPD)+碳酸钙(CaCO₃)+羟基磷灰石(HA)体系骨水泥、α-磷酸三钙(α-TCP)+二水磷酸氢钙(DCPD)+碳酸钙(CaCO₃)+羟基磷灰石(HA)+磷酸镁(Mg₃(PO₄)₂)+亚磷酸氢钠(NaHSO₃)体系骨水泥、磷酸四钙(TTCP)+无水磷酸氢钙(DCPA)+碳酸钙(CaCO₃)体系骨水泥、β-磷酸三钙(β-TCP)+焦磷酸钠(Na₄P₂O₇)体系骨水泥或者部分结晶磷酸钙(PCCP)+无水磷酸氢钙(DCPA)体系骨水泥。

一种多重复合可梯度降解磷酸钙骨组织工程支架，就是通过上述制备方法制备而成的。

与现有技术相比，本发明用于骨组织缺损再生修复的组织工程支架材料具有以下特点和优点：

1、本发明所制备的多重复合可梯度降解骨组织工程支架材料由磷酸钙骨水泥、合成高分子、天然高分子三重复合构成，可显著提高支架材料的初期强度和韧性，保障在操作和植入过程中支架材料有足够的强度和韧性；而且，由于复合高分子材料后支架具有的良好的柔韧性，可进行一定的切割等机械加工。

2、本发明所制备的多重复合可梯度降解骨组织工程支架材料在植入体内后，由于填充于磷酸钙骨水泥多孔支架孔隙内的可降解天然高分子材料降解速度最快，多孔磷酸钙孔壁上的合成高分子膜的降解速度相对较慢，而骨水泥的降解最慢，因此多重复合支架材料的降解是其中三种组成材料逐渐降解的梯度过程。由于天然高分子和合成高分子材料的梯度降解，支架材料的强度虽然会下降但不会突然显著下降和塌陷，而且随着新骨的逐步长入可保持植入部位整体保持良好的强度，复合支架材料的降解和新骨的长入具有较好的匹配性。

3、本发明所制备的多重复合可梯度降解骨组织工程支架材料在植入体内后，天然高分子材料降解后在支架材料中形成连通的多孔结构，为细胞和组织的生长提供空间。而且，由于其中的天然高分子是多孔或网状结构，降解快，可直接在支架上培养细胞。

4、本发明所制备的多重复合可梯度降解骨组织工程支架材料在植入体内后，其中的天然高分子在完全降解前，可起到显著改善支架的细胞亲和性的作用。而且，根据需要可在天然高分子中引入生长因子，诱导体外培养的或体内的干细胞分化，赋予支架骨诱导功能，促进新骨的生长。

5、本发明用于骨缺损再生修复的多重复合可梯度降解骨组织工程支架材料的制备方法适用范围广泛，工艺简单。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例一

1、将聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物(PLGA)溶解于二氯甲烷中，配成10％质量百分比浓度的溶液，用磁力搅拌器搅拌6小时，得到聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物溶液，放入容器中待用。

2、选用总孔隙率约为80％，气孔尺寸200～400μm的磷酸四钙(TTCP)+无水磷酸氢钙(DCPA)体系磷酸钙骨水泥多孔支架，将上述磷酸钙骨水泥多孔支架放入真空干燥箱中，50℃下真空干燥6个小时，取出，浸泡入步骤1制备的聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物(PLGA)溶液中，放入真空干燥器，抽真空2小时，聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物(PLGA)溶液在压力和毛细管力作用下灌注到磷酸钙骨水泥多孔支架的孔隙中。

3、将孔隙内灌注了PLGA的磷酸钙骨水泥多孔支架取出，用滤纸拭干表面，放入-18℃冰箱预冷冻24小时，之后在-40℃条件下冷冻干燥24小时，得一次复合磷酸钙多孔支架即合成高分子与磷酸钙复合的多孔组织工程支架材料。

4、将壳聚糖溶解在体积百分比为2％的稀醋酸水溶液中，配制成质量百分比浓度为15％的壳聚糖溶液，用磁力搅拌器搅拌2小时，过滤，得到壳聚糖溶液，待用。

5、将步骤3制备的一次复合磷酸钙基多孔支架浸泡到步骤4所配制的壳聚糖溶液中，放入真空干燥器中，抽真空0.5小时，壳聚糖溶液在压力和毛细管力作用下灌注到一次复合磷酸钙多孔支架的孔隙中，得到灌注了壳聚糖溶液的磷酸钙骨水泥多孔支架。

6、将经过PLGA和壳聚糖多重复合的磷酸钙骨水泥多孔支架即步骤5制得的多孔支架取出，用滤纸拭干表面，放入-18℃预冻12小时；将获得的材料冷冻干燥48小时，即得多重复合可梯度降解骨组织工程支架材料。所制备的多重复合可梯度降解骨组织工程支架材料的最终孔隙率为63％，抗压强度为4.7MPa，PLGA成膜状附着在磷酸钙骨水泥多孔支架的孔壁上，填充在支架内部的壳聚糖为多孔状，孔径在20～80μm之间。虽然壳聚糖填充体的孔径偏小，但随着壳聚糖较快降解，支架即可形成100μm以上的大孔，孔隙率随之增大。壳聚糖完全降解后，孔径可达200μm以上。材料的组成、结构与性能适合作为骨组织工程支架使用。而且，可根据需要在天然高分子中引入生长因子，赋予支架骨诱导功能，促进新骨的生长。

实施例二

1、将聚乳酸(PLA)溶解于1，4-二氧六环中，配制成5％质量百分比浓度的聚乳酸溶液，加热至40℃，搅拌12小时，待聚乳酸充分溶解，得到聚乳酸溶液，待用。

2、选用总孔隙率约为95％，气孔尺寸100～300μm的β-磷酸三钙(β-TCP)+二水磷酸氢钙(DCPD)体系磷酸钙骨水泥多孔支架，将上述多孔支架放入普通电热干燥箱中，100℃下干燥1个小时，取出，浸泡入步骤1制备的聚乳酸溶液中，放入真空干燥器，抽真空4小时，聚乳酸溶液在压力和毛细管力作用下灌注到磷酸钙骨水泥多孔支架的孔隙中。

3、将上述孔隙内灌注了PLA的支架材料取出，用滤纸拭干表面，放入-40℃冰箱预冷冻6小时，之后在-40℃条件下冷冻干燥36小时，即得一次复合磷酸钙基组织工程支架材料即合成高分子与磷酸钙复合的多孔组织工程支架材料。

4、将胶原溶解在体积百分比为1％的醋酸溶液中，配制成质量百分比浓度为10％的胶原溶液，用磁力搅拌器搅拌2小时，得到胶原溶液，待用。

5、将步骤3制备的一次复合磷酸钙基多孔支架浸泡到步骤4所配制的胶原溶液中，放入真空干燥器中，抽真空2小时，胶原溶液在压力和毛细管力作用下灌注到磷酸钙骨水泥多孔支架的孔隙中，得到灌注了胶原溶液的磷酸钙骨水泥多孔支架。

6、将经过PLA和胶原多重复合的磷酸钙骨水泥多孔支架即步骤5制备的多孔支架取出，用滤纸拭干表面，放入-60℃预冻1小时；将获得的材料冷冻干燥24小时，即得多重复合可梯度降解骨组织工程支架材料。所制备的多重复合可梯度降解骨组织工程支架材料的最终孔隙率为75％，抗压强度为2.5MPa，PLA成膜状附着在磷酸钙骨水泥多孔支架的孔壁上，填充在支架内部的胶原为网状多孔结构，孔径在50～120μm之间。虽然胶原填充体的孔径偏小，但随着胶原快速降解，支架即可形成100μm以上的大孔，孔隙率随之增大。胶原完全降解后，孔径可达100～300μm。材料的组成、结构与性能适合作为骨组织工程支架使用。而且，可根据需要在天然高分子中引入生长因子，赋予支架骨诱导功能，促进新骨的生长。

实施例三

1、将聚己内脂(PCL)/淀粉共混物溶解于二甲基亚砜中，配制成20％质量百分比浓度的溶液，加热至80℃，静置48小时，待聚己内脂(PCL)/淀粉共混物充分溶解，得到聚己内脂(PCL)/淀粉共混物溶液，待用。

2、选用总孔隙率约为80％，气孔尺寸200～400μm的β-磷酸三钙(β-TCP)+焦磷酸钠(Na₄P₂O₇)体系磷酸钙骨水泥多孔支架，将上述多孔支架放入真空干燥箱中，60℃下真空干燥4个小时，取出，浸泡入步骤1制备的聚己内脂(PCL)/淀粉共混物溶液中，放入真空干燥器，抽真空3小时，聚己内脂(PCL)/淀粉溶液在压力和毛细管力作用下灌注到磷酸钙骨水泥多孔支架的孔隙中。

3、将步骤2制得的孔隙内灌注了聚己内脂(PCL)/淀粉共混物的支架材料取出，用滤纸拭干表面，放入-40℃冰箱预冷冻2小时，之后在-50℃条件下冷冻干燥30小时，即得一次复合磷酸钙基组织工程支架材料。

4、将蚕丝置于质量百分比为0.05％的Na₂CO₃溶液中，于100℃处理30min，重复3次，脱去蚕丝中的丝胶，烘干后得到精炼蚕丝。精炼丝用CaCl₂-CH₃CH₂OH-H₂O三元溶剂(摩尔比1∶2∶8)于70℃搅拌溶解，经透析、过滤后得到丝素蛋白水溶液，用去离子水配制质量百分比浓度为5％的丝素溶液；用去离子水配制质量百分比浓度为8％的海藻酸钠溶液。静置24小时，分别过滤，然后按照1:1的体积比例将两种溶液混合，获得丝素蛋白、海藻酸钠质量含量分别为2.5％和4％的丝素蛋白/海藻酸钠混合溶液，待用。

5、将步骤3制备的一次复合磷酸钙基多孔支架浸泡到步骤4所配制的丝素蛋白/海藻酸钠混合溶液中，放入真空干燥器中，抽真空5小时，丝素蛋白/海藻酸钠混合溶液在压力和毛细管力作用下灌注到磷酸钙骨水泥多孔支架的孔隙中，得到灌注了丝素蛋白/海藻酸钠混合溶液的磷酸钙骨水泥多孔支架。

6、将经过聚己内脂(PCL)/淀粉和丝素蛋白/海藻酸钠多重复合的磷酸钙骨水泥多孔支架取出，用滤纸拭干表面，放入-40℃预冻24小时；将获得的材料冷冻干燥48小时，即得多重复合可梯度降解骨组织工程支架材料。所制备的多重复合可梯度降解骨组织工程支架材料的最终孔隙率为60％，抗压强度为3.7MPa，PCL/淀粉成膜状附着在磷酸钙骨水泥多孔支架的孔壁上，填充在支架内部的胶丝素蛋白/海藻酸钠为多孔结构，孔径在30～70μm之间。虽然胶丝素蛋白/海藻酸钠填充体的孔径偏小，但随着胶丝素蛋白/海藻酸钠的快速降解，支架即可形成100μm以上的大孔，孔隙率随之增大。胶丝素蛋白/海藻酸钠完全降解后，孔径可达200μm以上。材料的组成、结构与性能适合作为骨组织工程支架使用。而且，可根据需要在天然高分子中引入生长因子，赋予支架骨诱导功能，促进新骨的生长。

实施例四

1、将聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物(PLGA)溶解于丙酮中，配制成1％质量百分比浓度的PLGA溶液，加热至60℃，静置36小时，待PLGA充分溶解，待用。

2、选用总孔隙率约为85％，气孔尺寸300～400μm的无定型磷酸钙(ACP)+无水磷酸氢钙(DCPA)体系磷酸钙骨水泥多孔支架，将上述多孔支架放入真空干燥箱中，50℃下真空干燥12个小时，取出，浸泡入步骤1制备的PLGA溶液中，放入真空瓶，抽真空0.5小时，PLGA溶液在压力和毛细管力作用下灌注到磷酸钙骨水泥多孔支架的孔隙中。

3、将孔隙内灌注了PLGA的支架材料取出，用滤纸拭干表面，放入-4℃冰箱预冷冻48小时，之后在-60℃条件下冷冻干燥36小时，即得一次复合磷酸钙基组织工程支架材料。

4、用蒸馏水配制质量百分比浓度为25％的海藻酸钠溶液，静置24小时，过滤，得到海藻酸钠溶液，待用。

5、将步骤3制备的一次复合磷酸钙基多孔支架浸泡到步骤4所配制的海藻酸钠溶液中，放入真空干燥器中，抽真空5小时，海藻酸钠混合溶液在压力和毛细管力作用下灌注到磷酸钙骨水泥多孔支架的孔隙中，得到灌注了海藻酸钠溶液的磷酸钙骨水泥多孔支架。

6、将经过PLGA和海藻酸钠多重复合的磷酸钙骨水泥多孔支架取出，用滤纸拭干表面，放入-60℃预冻1小时；将获得的材料在-40℃条件下冷冻干燥12小时，即得多重复合可梯度降解骨组织工程支架材料。所制备的多重复合可梯度降解骨组织工程支架材料的最终孔隙率为65％，抗压强度为4.0MPa，PLGA成膜状附着在磷酸钙骨水泥多孔支架的孔壁上，填充在支架内部的海藻酸钠为多孔结构，孔径在30～60μm之间。虽然海藻酸钠填充体的孔径偏小，但随着海藻酸钠的快速降解，支架即可形成100μm以上的大孔，孔隙率随之增大。海藻酸钠完全降解后，孔径可达300μm以上。材料的组成、结构与性能适合作为骨组织工程支架使用。而且，可根据需要在天然高分子中引入生长因子，赋予支架骨诱导功能，促进新骨的生长。

实施例五

1、将聚羟基乙酸(PGA)溶解于三氯乙酸中，配制成20％质量百分比浓度的聚羟基乙酸溶液，搅拌1小时待聚羟基乙酸充分溶解，待用。

2、选用总孔隙率约为80％，气孔尺寸100～500μm的α-磷酸三钙(α-TCP)+二水磷酸氢钙(DCPD)+碳酸钙(CaCO₃)+羟基磷灰石(HA)+磷酸镁(Mg₃(PO₄)₂)+亚磷酸氢钠(NaHSO₃)体系骨水泥多孔支架，将上述多孔支架放入真空干燥箱中，80℃下真空干燥3个小时，取出，浸泡入步骤1制备的聚羟基乙酸溶液中，放入真空干燥器，抽真空5小时，聚羟基乙酸溶液在压力和毛细管力作用下灌注到多孔支架的孔隙中。

3、将孔隙内灌注了PGA的支架材料取出，用滤纸拭干表面，放入-60℃冰箱预冷冻1小时，之后在-30℃条件下冷冻干燥2小时，即得一次复合磷酸钙基组织工程支架材料。

4、用蒸馏水配制质量百分比浓度为10％的明胶溶液，用恒温磁力搅拌器在60℃下搅拌2小时，过滤，得到明胶溶液，待用。

5、将一次复合磷酸钙基多孔支架浸泡到步骤(4)所配制的明胶溶液中，放入真空干燥器中，抽真空4小时，明胶溶液在压力和毛细管力作用下灌注到磷酸钙骨水泥多孔支架的孔隙中，得到灌注了明胶溶液的磷酸钙骨水泥多孔支架。

6、将经过PGA和明胶多重复合的磷酸钙骨水泥多孔支架取出，用滤纸拭干表面，放入-30℃预冻20小时；之后在-50℃条件下冷冻干燥30小时，即得多重复合可梯度降解骨组织工程支架材料。所制备的多重复合可梯度降解骨组织工程支架材料的最终孔隙率为55％，抗压强度为3.3MPa，PGA成膜状附着在磷酸钙骨水泥多孔支架的孔壁上，填充在支架内部的明胶为多孔结构，孔径在50～80μm之间。虽然明胶填充体的孔径偏小，但随着明胶的较快降解，支架可逐步形成100μm以上的大孔，孔隙率随之增大。明胶完全降解后，孔径可达100～500μm。材料的组成、结构与性能适合作为骨组织工程支架使用。而且，可根据需要在天然高分子中引入生长因子，赋予支架骨诱导功能，促进新骨的生长。

实施例六

1、将聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物(PLGA)溶解于三氯甲烷中，配成15％质量百分比浓度的溶液，用磁力搅拌器搅拌6小时，得到聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物溶液，放入容器中待用。

2、选用总孔隙率约为75％，气孔尺寸200～500μm的部分结晶磷酸钙(PCCP)+无水磷酸氢钙(DCPA)体系骨水泥多孔支架，将多孔支架放入真空干燥箱中，37℃下真空干燥36个小时，取出，浸泡入步骤1制备的PLGA溶液中，放入真空干燥器，抽真空4小时，PLGA溶液在压力和毛细管力作用下灌注到多孔支架的孔隙中。

3、将孔隙内灌注了PLGA的支架材料取出，用滤纸拭干表面，放入-20℃冰箱预冷冻12小时，之后在-40℃条件下冷冻干燥12小时，即得一次复合磷酸钙基组织工程支架材料。

4、用蒸馏水配制质量百分比浓度为6％、9％的羧甲基纤维素溶液和海藻酸钠溶液；用体积百分比为2％的稀醋酸溶液配制质量百分比浓度为6％的壳聚糖溶液。静置12小时，分别过滤，然后按照1:1:1的体积比例将三种溶液混合，获得羧甲基纤维素、海藻酸钠和壳聚糖质量含量分别为2％、3％和2％的羧甲基纤维素/海藻酸钠/壳聚糖混合溶液，待用。

5、将步骤3制备的一次复合磷酸钙基多孔支架浸泡到步骤4所配制的羧甲基纤维素/海藻酸钠/壳聚糖混合溶液中，放入真空干燥器中，抽真空2小时，羧甲基纤维素/海藻酸钠/壳聚糖混合溶液在压力和毛细管力作用下灌注到磷酸钙骨水泥多孔支架的孔隙中，得到灌注了羧甲基纤维素/海藻酸钠/壳聚糖混合溶液的磷酸钙骨水泥多孔支架。

6、将经过PLGA和羧甲基纤维素/海藻酸钠/壳聚糖多重复合的磷酸钙骨水泥多孔支架取出，用滤纸拭干表面，放入-30℃预冻20小时；之后在-40℃条件下冷冻干燥48小时，即得多重复合可梯度降解骨组织工程支架材料。所制备的多重复合可梯度降解骨组织工程支架材料的最终孔隙率为52％，抗压强度为4.2MPa，PLGA成膜状附着在磷酸钙骨水泥多孔支架的孔壁上，填充在支架内部的羧甲基纤维素/海藻酸钠/壳聚糖为多孔结构，孔径在30～70μm之间。虽然羧甲基纤维素/海藻酸钠/壳聚糖填充体的孔径偏小，但随着羧甲基纤维素/海藻酸钠/壳聚糖的较快降解，支架可逐步形成100μm以上的大孔，孔隙率随之增大。羧甲基纤维素/海藻酸钠/壳聚糖完全降解后，孔径可达200μm以上。材料的组成、结构与性能适合作为骨组织工程支架使用。而且，可根据需要在天然高分子中引入生长因子，赋予支架骨诱导功能，促进新骨的生长。

实施例七

1、将聚乳酸(PLA)/淀粉共混物溶解于三氯甲烷中，配制成15％质量百分比浓度的溶液，搅拌使其充分溶解，待用。

2、选用总孔隙率约为70％，气孔尺寸200～400μm的β-磷酸三钙(β-TCP)+焦磷酸钠(Na₄P₂O₇)体系骨水泥多孔支架，将上述多孔支架放入真空干燥箱中，30℃下真空干燥48个小时，取出，浸泡入步骤1制备的PLA/淀粉溶液中，放入真空干燥器，抽真空4小时，PLA/淀粉溶液在压力和毛细管力作用下灌注到多孔支架的孔隙中。

3、将孔隙内灌注了PLA/淀粉溶液的支架材料取出，用滤纸拭干表面，放入-30℃冰箱预冷冻6小时，之后在-40℃条件下冷冻干燥16小时，即得一次复合磷酸钙基组织工程支架材料。

4、用体积百分比为1％的稀醋酸溶液配制质量百分比浓度为5％的胶原溶液，用磁力搅拌器搅拌混合12小时，得到胶原溶液，待用。

5、将步骤3制备的一次复合磷酸钙基多孔支架浸泡到步骤4所配制的溶液中，放入真空干燥器中，抽真空2小时，胶原溶液在压力和毛细管力作用下灌注到磷酸钙骨水泥多孔支架的孔隙中；得到灌注了胶原溶液的磷酸钙骨水泥多孔支架。

6、将经过PLA/淀粉和胶原多重复合的磷酸钙骨水泥多孔支架取出，用滤纸拭干表面，放入-30℃预冻20小时；之后在-40℃条件下冷冻干燥48小时，即得多重复合可梯度降解骨组织工程支架材料。所制备的多重复合可梯度降解骨组织工程支架材料的最终孔隙率为47％，抗压强度为5.5MPa，PLA/淀粉成膜状附着在磷酸钙骨水泥多孔支架的孔壁上，填充在支架内部的胶原为网状多孔结构，孔径在50～120μm之间。虽然胶原填充体的孔径偏小，但随着胶原的快速降解，支架可逐步形成100μm以上的大孔，孔隙率随之增大。胶原完全降解后，孔径可达200μm以上。材料的组成、结构与性能适合作为骨组织工程支架使用。而且，可根据需要在天然高分子中引入生长因子，赋予支架骨诱导功能，促进新骨的生长。

上述具体实施方式为本发明的优选实施例，并不能对本发明的权利要求进行限定，其他的任何未背离本发明的技术方案而所做的改变或其它等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1、一种多重复合可梯度降解骨组织工程支架材料的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将生物相容可降解合成高分子材料溶解在溶剂中，配制成质量百分比浓度为1～20％的溶液，然后搅拌或静置1～48小时，过滤，得到合成高分子溶液；

将生物相容可降解天然高分子材料溶解在溶剂中，配制成质量百分比浓度为5～25％的溶液，然后搅拌或静置1～48小时，过滤，得到天然高分子溶液；

(2)将总孔隙率为70～95％的磷酸钙骨水泥多孔支架在30～100℃下干燥1～48小时；将磷酸钙骨水泥多孔支架浸泡到步骤(1)所配制的合成高分子溶液中，真空干燥0.5～5小时，得到灌注了合成高分子材料的磷酸钙骨水泥多孔支架；

(3)将灌注了合成高分子材料的磷酸钙骨水泥多孔支架拭干表面，在-60～-4℃下预冻1～48小时；将获得的冻结复合材料冷冻干燥2～48小时，即得合成高分子与磷酸钙复合的多孔组织工程支架材料；

(5)将由步骤(3)所得到合成高分子与磷酸钙复合的多孔组织工程支架材料浸泡到步骤(1)的天然高分子溶液中，真空干燥0.5～5小时，得到灌注了天然高分子溶液的磷酸钙骨水泥多孔支架；

(6)将灌注了天然高分子溶液的磷酸钙骨水泥多孔支架拭干表面，在-60～-4℃下预冻1～48小时；然后将获得的冻结材料冷冻干燥2～48小时，即得多重复合可梯度降解骨组织工程支架材料。

2、根据权利要求1所述的一种多重复合可梯度降解骨组织工程支架材料的制备方法，其特征在于：所述的生物相容可降解合成高分子材料包括聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物、聚乳酸与淀粉共混物、聚己内酯或聚己内酯/淀粉共混物中任意一种或两种或两种以上材料。

3、根据权利要求1所述的一种多重复合可梯度降解骨组织工程支架材料的制备方法，其特征在于：所述的生物相容可降解天然高分子材料包括胶原、明胶、壳聚糖、丝素蛋白、海藻酸钠或纤维素衍生物中任意一种或两种或两种以上材料。

4、根据权利要求1所述的一种多重复合可梯度降解骨组织工程支架材料的制备方法，其特征在于：所述生物相容可降解合成高分子材料溶解在溶剂中的溶剂为1，4-二氧六环、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜或三氯乙酸。

5、根据权利要求1所述的一种多重复合可梯度降解骨组织工程支架材料的制备方法，其特征在于：所述生物相容可降解天然高分子材料溶解在溶剂中的溶剂为去离子水、蒸馏水、醋酸水溶液、磷酸水溶液、无水乙醇及其水溶液、氯化钙溶液或丙酮。

6、根据权利要求1所述的一种多重复合可梯度降解骨组织工程支架材料的制备方法，其特征在于：所述的磷酸钙骨水泥包括无定型磷酸钙+二水磷酸氢钙体系骨水泥、磷酸三钙+二水磷酸氢钙体系骨水泥、α-磷酸三钙+二水磷酸氢钙+碳酸钙+羟基磷灰石体系骨水泥、α-磷酸三钙+二水磷酸氢钙+碳酸钙+羟基磷灰石+磷酸镁+亚磷酸氢钠体系骨水泥、磷酸四钙+无水磷酸氢钙+碳酸钙体系骨水泥、β-磷酸三钙+焦磷酸钠体系骨水泥或者部分结晶磷酸钙+无水磷酸氢钙体系骨水泥。

7、一种多重复合可梯度降解磷酸钙骨组织工程支架，就是通过权利要求1～6任一项所述制备方法制备而成的。