CN101428154A - 一种植入式人工肝脏 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植入式人工肝脏，它包括聚乙醇酸或聚乳酸羟基乙酸封套，1片以上的三维多孔支架，聚乙醇酸或聚乳酸羟基乙酸管封口；三维多孔支架装在聚乙醇酸或聚乳酸羟基乙酸封套中，聚乙醇酸或聚乳酸羟基乙酸封套两端用聚乙醇酸或聚乳酸羟基乙酸管封口。本发明的有益之处在于：本发明最大限度模拟肝小叶结构，促进植入干细胞定向分化至成熟肝细胞，诱导组织工程肝的微血管再生；同时在三维生物支架外包被生物相容性极佳的生物材料封套，模拟肝包膜结构，该封套与支架之间形成小腔隙，以供血液循环通过组织工程支架，促进包膜内工程肝的血管再生并最终生成人工肝脏以替代宿主受损肝脏功能。
Description
技术领域
本发明属于临床医学、生物医学与再生医学领域，涉及组织工程与人工器官技术，具体涉及一种植入式人工肝脏。
背景技术
原位肝移植是迄今公认治疗各种原因所致的终未期肝功能衰竭唯一有效方法，但由于严重的供肝短缺，大量患者在等待肝移植的过程中死去。肝细胞移植因价廉、移植细胞易获取及冻存方便、操作简便等优点，正日益被人们所关注(1，2)。最近的研究表明，利用组织工程和干细胞技术，可极大的提高移植细胞的再生和功能发挥，拓展肝细胞治疗的再生医学空间(3)。目前国内外多采用高分子合成的三维多孔可降解生物支架结合不同来源的细胞(包括动物或人胚胎干细胞、骨髓或脐血等来源的成体干细胞、胎儿或成人原代肝细胞等)直接进行体内移植实验，以期重建人工肝脏(或肝组织)来替代受损的宿主肝脏功能。但目前常用的组织工程支架是各项功能基本同性的多孔材料，整个材料的化学性质和基本物理性能大致均一，没有特异的生物相应性，难以诱导微血管生成并支持移植细胞的长期存活与肝组织再生，致使植入细胞无法最终替代器官功能。如能找到一种既可促进移植细胞再生组织，又能迅速诱导再生组织内微血管生成并长期支持再生组织存活并发挥功能，各种原因所致的急慢性肝功能衰竭治疗具有极其重要的意义。
发明内容
为克服植入细胞生物支架复合体自身缺乏微血管，难以得到外周血液循环的支持，本发明设计了一个全新的模拟人体肝脏结构的植入式人工肝脏。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
本发明的一种植入式人工肝脏，它包括聚乙醇酸或聚乳酸羟基乙酸封套，1片以上的三维多孔支架，聚乙醇酸或聚乳酸羟基乙酸管封口；三维多孔支架装在聚乙醇酸或聚乳酸羟基乙酸封套中，聚乙醇酸或聚乳酸羟基乙酸封套两端用聚乙醇酸或聚乳酸羟基乙酸管封口。
所述的聚乙醇酸或聚乳酸羟基乙酸封套和聚乙醇酸或聚乳酸羟基乙酸管封口材料为经生物化和抗凝血处理的聚乙醇酸或聚乳酸羟基乙酸材料。
所述的植入式人工肝脏的直径为5-20mm，长度为10-50mm。
所述的聚乙醇酸或聚乳酸羟基乙酸管封口直径为1-4mm。
所述的三维多孔支架材料是分子量为5—10万单位的聚乳酸/乙醇酸共聚物(PLGA)、左旋聚乳酸(PLLA)或藻酸盐，多孔支架为2—10片。
所述的多孔支架直径为4—19mm。
所述的多孔支架厚度径为1—4mm。
所述的多孔支架的孔径为50—500nm。
所述的多孔支架设有特定管腔1-10个，管腔结构即为孔径200-500nm的圆形管腔，该管腔是在三维支架中直接激光打孔，无其它材料，主要用于提供内皮细胞生长和诱导微血管生成。
本发明的优点：本发明的模拟人体肝脏结构的植入式人工肝脏，可克服组织工程肝的长期血管化难题、促进移植组织工程肝的长期成活与功能发挥。植入式人工肝脏是将干细胞预种植至三维可降解生物支架(如PLLA、PLGA、藻酸盐等)，该支架预先经肝素与胶原生物修饰并包埋能促进微血管再生的细胞因子(如微血管生长因子、成纤维细胞生长因子和胰岛素样生长因子等)，并预种植内皮细胞于该支架特定管道(模拟肝组织中央静脉)内，最大限度模拟肝小叶结构，促进植入干细胞定向分化至成熟肝细胞，诱导组织工程肝的微血管再生。同时在三维生物支架外包被生物相容性极佳的生物材料封套，模拟肝包膜结构，该封套与支架之间形成小腔隙，以供血液循环通过组织工程支架，促进包膜内工程肝的血管再生并最终生成人工肝脏以替代宿主受损肝脏功能。利用该发明进行移植治疗急性肝功能衰竭(AHF)具有组织再生能力强，再生肝组织可长期成活并有效替代宿主受损肝脏功能，为组织工程干细胞移植治疗各种原因所致的急性肝功能衰竭提供新的途径。
附图说明
图1为本发明的实施例的结构示意图。
图2为本发明的实施例1的两组细胞的生长曲线图。
图3为本发明的实施例1的白蛋白(ALB)的酶联免疫吸附试验(ELISA)结果图。
图4为本发明的实施例1的尿素(Urea)的酶联免疫吸附试验(ELISA)结果图。
图5为本发明的实施例2的逆转录PCR的结果图。
图6为本发明的实施例2的免疫印迹的结果图。
图7为本发明的实施例2的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测白蛋白(ALB)的结果图。
图8为本发明的实施例2的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测尿素(Urea)的结果图。
具体实施方式
以下通过实施例进一步对本发明进行描述：
如附图1所示，本发明包括：包括聚乙醇酸或聚乳酸羟基乙酸封套1，1片以上的三维多孔支架2，聚乙醇酸或聚乳酸羟基乙酸管封口3；三维多孔支架2装在聚乙醇酸或聚乳酸羟基乙酸封套1中，聚乙醇酸或聚乳酸羟基乙酸封套1两端用聚乙醇酸或聚乳酸羟基乙酸管封口3。
具体实施例1(植入式人工肝脏和单层贴壁法培养大鼠肝细胞的比较)
聚乙醇酸或聚乳酸羟基乙酸封套1长15mm，三维多孔支架2材料为PLGA，PLGA分子量为7万单位。多孔支架2直径9mm，厚度为3mm，孔径为100—200nm，设有特定管腔(管腔结构即为孔径200-500nm的圆形管腔，该管腔是在三维支架中直接激光打孔，无其它材料，主要用于提供内皮细胞生长和诱导微血管生成。)6—8个，孔径为400nm，4片多孔支架2组叠而成。聚乙醇酸或聚乳酸羟基乙酸管封口3直径为2mm。
按常规分离得到的大鼠原代肝细胞，以107cells/ml密度接种至含15％FBS的DMEM的培养基中，用注射器将细胞注入PLGA三维多孔支架中，每片支架的细胞量为106cells，在常温下以1000g的离心力离心5分钟，使细胞均匀分散至支架。在37℃、5％ CO2条件下培养过夜使细胞粘附于多孔支架，然后在无菌条件下将含有细胞的4片多孔支架层层叠起，装入聚乙醇酸封套后，在37℃、5％ CO2条件下继续培养。每间隔2—3天置换新鲜培养基，共分化培养2周。
将同批分离的大鼠肝细胞以106cells/ml接种至培养瓶进行单层贴壁培养，每瓶细胞量为106cells，培养条件与上述相同。
各重复3组，每隔2天分别收集人工肝脏内和单层贴壁培养的细胞、细胞支架复合体及培养液上清，检测肝细胞代谢功能和分析生长曲线。
结果如图2、图3、图4：
图2表示了两组细胞的生长曲线结果：结果显示，人工肝脏组大鼠原代肝细胞成活时间达60天，而对照组仅存活28天。
图3表示白蛋白(ALB)的酶联免疫吸附试验(ELISA)结果：结果显示人工肝脏组分泌的白蛋白明显高于对照组。
图4表示尿素(Urea)的酶联免疫吸附试验(ELISA)结果：结果显示人工肝脏组合成的尿素明显高于对照组。
由图2—4表明，相比普通单层贴壁培养法，利用植入式人工肝脏进行肝细胞培养可明显延长原代肝细胞的体外培养时间，培养肝细胞的代谢功能也明显高于对照组。说明了本发明所具有的明显优势。
具体实施例2(植入式人工肝脏和单层贴壁法分化大鼠骨髓间质干细胞(BMSCs)至肝细胞的比较)
聚乙醇酸或聚乳酸羟基乙酸封套1长15mm，三维多孔支架2材料为PLGA，PLGA分子量为7万单位。多孔支架2直径9mm，厚度为3mm，孔径为100—200nm，设有特定管腔6—8个，孔径为400nm，4片多孔支架2组叠而成。聚乙醇酸或聚乳酸羟基乙酸管封口3直径为2mm。
按常规分离得到的大鼠BMSCs按107cells/ml密度接种至含肝细胞生长因子的IMDM(购自Invitrogen公司)培养基中，用注射器将细胞注入PLGA三维多孔支架中，每片支架的细胞量为106cells，在常温下以1000g的离心力离心5分钟，使细胞均匀分散至支架。在37℃、5％ CO2条件下培养过夜使细胞粘附于多孔支架，然后在无菌条件下将含有细胞的4片多孔支架层层叠起，装入聚乙醇酸封套后，在37℃、5％ CO2条件下继续培养。每间隔一天置换新鲜培养基，共分化培养3周。
将同批分离的BMSCs以106cells/ml接种至培养瓶进行单层贴壁培养，每瓶细胞量为106cells，培养条件与上述相同。
各重复3组，每隔一周分别收集人工肝脏内和单层贴壁培养的细胞、细胞支架复合体及培养液上清，检测肝细胞的特异性功能基因及表达产物，比较两组分化成肝细胞的时间与分化肝细胞的功能。
结果如下如图5、图6、图7、图8：：
图5表示了逆转录PCR的结果：第一道为空白对照，2—4道为植入式人工肝组分化1—3周，5—7道为单层贴壁组分化1—3周，8道阳性对照，9道为DNA标记。结果显示人工肝组在一周后即表达ALB(白蛋白)和AFP(甲胎蛋白)，而对照组在第二周才表达。
图6表示了免疫印迹的结果：第一道为空白对照，2—4道为植入式人工肝组分化1—3周，5—7道为单层贴壁组分化1—3周，8道阳性对照，9道为DNA标记。结果显示人工肝组在一周后即表达ALB和细胞色素P450，而对照组在第二周才表达。
图7表示了酶联免疫吸附试验(ELISA)检测白蛋白(ALB)的结果：结果显示人工肝组在一周后即检测到ALB，而对照组在第二周检测到，且人工肝脏组明显高于对照。
图8表示了酶联免疫吸附试验(ELISA)检测尿素(Urea)的结果：结果显示人工肝组在一周后即检测到尿素，而对照组在第二周检测到，且人工肝脏组明显高于对照。
由图5—8表明，相比普通单层贴壁分化培养法，利用植入式人工肝脏进行肝细胞分化可明显缩短分化时间，分化肝细胞的代谢功能明显比前者强。说明了本发明所具有的明显优势。
具体实施例3(植入式人工肝脏和直接注射法进行细胞移植治疗AHF大鼠的比较)
聚乙醇酸或聚乳酸羟基乙酸封套1长15mm，三维多孔支架2材料为PLGA，PLGA分子量为7万单位。多孔支架2直径9mm，厚度为3mm，孔径为100—200nm，设有特定管腔6—8个，孔径为400nm，4片多孔支架2组叠而成。聚乙醇酸或聚乳酸羟基乙酸管封口3直径为2mm。
按常规分离得到的大鼠BMSCs按107cells/ml密度接种至含肝细胞生长因子的IMDM(购自Invitrogen公司)培养基中，用注射器将细胞注入PLGA三维多孔支架中，每片支架的细胞量为106cells。在常温下以1000g的离心力离心5分钟，使细胞均匀分散至支架。在37℃、5％ CO2条件下培养过夜使细胞粘附于多孔支架，然后在无菌条件下将含有细胞的4片多孔支架层层叠起，装入聚乙醇酸封套后，在37℃、5％ CO2条件下继续培养。每间隔一天置换新鲜培养基，7天后将收集到的大鼠内皮细胞经聚乙醇酸封口管注入聚乙醇酸封套与多孔支架之间的腔隙，并将该人工肝脏植入至经肝大部切除所致的急性肝衰竭模型小鼠腹腔，同时将肠系膜动、静脉分支连接到人工肝脏的两端。
将同批收集到的等量(4×106cells)大鼠BMSCs，在相同的肝细胞分化培养条件下，在体外单层贴壁分化培养7天，然后收集分化细胞，采用目前常规的经脾注射移植法移植至AHF小鼠脾内作为对照组。
各重复3组，移植手术后每隔2天观察移植小鼠的生命体征和肝功能。比较两组对急性肝衰竭小鼠的治疗作用。
结果如下表1
| 植入式人工肝脏组 | 常规细胞移植组 | |
| 手术后存活时间 | 平均25天 | 平均7天 |
| 手术后ALT恢复正常 | 平均7天 | 平均12天 |
| 手术后AST恢复正常 | 平均8天 | 平均12天 |
由表1结果显示，相比普通细胞移植法，植入式人工肝脏组可明显延长AHF小鼠寿命，明显改善AHF小鼠的肝功能。说明本发明在治疗急性肝衰竭小鼠的实验研究中所具有的独特优势。
综上所述：本发明设计将干细胞预种植至经肝素与胶原生物修饰的三维可降解生物支架，并预种植内皮细胞于该支架特定管道(模拟肝组织中央静脉)内，最大限度模拟肝小叶结构，促进植入干细胞定向分化至成熟肝细胞，诱导组织工程肝的长期微血管化并最终生成人工肝脏以替代宿主受损肝脏功能。利用该发明进行移植治疗急性肝功能衰竭(AHF)具有组织再生能力强，再生肝组织可长期成活并有效替代宿主受损肝脏功能，为组织工程干细胞移植治疗各种原因所致的急性肝功能衰竭提供新的途径。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (9)
1、一种植入式人工肝脏，其特征在于：它包括聚乙醇酸或聚乳酸羟基乙酸封套，1片以上的三维多孔支架，聚乙醇酸或聚乳酸羟基乙酸管封口；三维多孔支架装在聚乙醇酸或聚乳酸羟基乙酸封套中，聚乙醇酸或聚乳酸羟基乙酸封套两端用聚乙醇酸或聚乳酸羟基乙酸管封口。
2、根据权利要求1所述的一种植入式人工肝脏，其特征在于：所述的聚乙醇酸或聚乳酸羟基乙酸封套和聚乙醇酸或聚乳酸羟基乙酸管封口材料为经生物化和抗凝血处理的聚乙醇酸或聚乳酸羟基乙酸材料。
3、根据权利要求1所述的一种植入式人工肝脏，其特征在于：所述的植入式人工肝脏的直径为5-20mm，长度为10-50mm。
4、根据权利要求1所述的一种植入式人工肝脏，其特征在于：所述的聚乙醇酸或聚乳酸羟基乙酸管封口直径为1-4mm。
5、根据权利要求1所述的一种植入式人工肝脏，其特征在于：所述的三维多孔支架材料是分子量为5—10万单位的聚乳酸/乙醇酸共聚物、左旋聚乳酸或藻酸盐，多孔支架为2—10片。
6、根据权利要求1所述的一种植入式人工肝脏，其特征在于：所述的多孔支架直径为4—19mm。
7、根据权利要求1所述的一种植入式人工肝脏，其特征在于：所述的多孔支架厚度径为1—4mm。
8、根据权利要求1所述的一种植入式人工肝脏，其特征在于：所述的多孔支架的孔径为50—500nm。
9、根据权利要求1所述的一种植入式人工肝脏，其特征在于：所述的多孔支架设有特定管腔1-10个，是孔径为200-500nm的圆形管腔，所述管腔是在三维支架中激光打孔得到。
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