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CN101415434A - 用于治疗b细胞淋巴瘤和其它癌症的方法和组合物 - Google Patents

用于治疗b细胞淋巴瘤和其它癌症的方法和组合物 Download PDF

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CN101415434A
CN101415434A CNA2004800384843A CN200480038484A CN101415434A CN 101415434 A CN101415434 A CN 101415434A CN A2004800384843 A CNA2004800384843 A CN A2004800384843A CN 200480038484 A CN200480038484 A CN 200480038484A CN 101415434 A CN101415434 A CN 101415434A
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cell
albumen
lymphoma
sensitivity
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CNA2004800384843A
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J·G·麦克阿瑟
L·良
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Morningside Venture Investments Ltd
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Morningside Venture Investments Ltd
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Abstract

本发明公开了FRIL蛋白家族的某些成员抑制FRIL－敏感的癌细胞的增殖和/或存活的能力。FRIL蛋白可以用于治疗这样的FRIL－敏感的癌症的方法，生产用于治疗这样的癌症的药物，和成像、检测或定位这样的癌症。FRIL－敏感的癌症包括但不限于，B细胞淋巴瘤和T细胞皮肤淋巴瘤。

Description

用于治疗B细胞淋巴瘤和其它癌症的方法和组合物
相关申请
本申请要求2003年11月12日提交的美国临时申请系列号60/519,182的优先权利益。
发明背景
发明领域
本发明涉及用于治疗B细胞淋巴瘤和其它FRIL-敏感的癌症的方法和组合物。更具体地，本发明涉及使用蛋白治疗这样的疾病的方法和产品，所述的蛋白是祖细胞保存因子和其变体的FRIL家族的成员。
背景
在美国，每年诊断出超过100万新的癌症病例，并且，尽管存在对癌症的许多疗法和治疗方案，美国每年有超过500,000人死于癌症。根据国家癌症研究所，淋巴瘤是在美国诊断出的第五种最常见的恶性肿瘤(每年有大约60,000新病例)，且是与癌症有关的死亡的第六大原因。
淋巴瘤的主要种类是B细胞淋巴瘤，包括非霍奇金氏淋巴瘤和B细胞白血病。B细胞非霍奇金氏淋巴瘤(B-NHL)代表着所有淋巴瘤病例的大部分，在美国每年有约50,000新病例。B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)主要影响15岁以下的儿童，在美国每年有约2,000新病例。
尽管B-NHL和B-ALL的5-年存活率是50％至65％，这些疾病难以彻底治愈。鉴于死于B细胞癌症的巨大数目，和用已知的方法治疗该疾病的困难，需要发现用于治疗B细胞癌症的新的方法和组合物。
以前鉴别出了FRIL家族的蛋白，并描述为能结合甘露糖的植物凝集素，其具有通过抑制增殖和/或分化来保存祖细胞的能力(见，例如，Moore等(1997)，Blood 90，Suppl.308(abstract)；Mo等1999)，Glycobiology 9：173-179；Colucci等(1999)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：646-650；Moore等(2000)，Biochim.Biophys Acta25027：1-9)。但是，在本发明之前，并不知道FRIL蛋白具有与癌细胞有关的任何活性或用途，包括B细胞淋巴瘤和T细胞皮肤淋巴瘤。
发明简述
本发明部分地依赖下述发现，即某些凝集素可以用于治疗B细胞淋巴瘤，T细胞皮肤淋巴瘤和其它的FRIL-敏感的癌症。更具体地，本发明依赖于FRIL家族的蛋白的鉴定和下述令人惊奇的发现，即这些蛋白(最初鉴别了它们对祖细胞的作用)可以用于抑制B细胞淋巴瘤、T细胞皮肤淋巴瘤和某些其它癌症的增殖和/或存活。本发明还依赖于有用的FRIL蛋白变体(包括突变蛋白、其嵌合体和融合体)的鉴别和开发。
因而，在一个方面，本发明提供了通过使癌细胞接触该癌细胞敏感的FRIL蛋白，抑制FRIL-敏感的癌细胞的增殖和/或存活的方法。在一些实施方案中，FRIL-敏感的癌细胞选自B细胞淋巴瘤和T细胞皮肤淋巴瘤。
在具体的实施方案中，B细胞淋巴瘤源自成熟的B细胞淋巴细胞，B细胞淋巴瘤是非霍奇金氏淋巴瘤，或非霍奇金氏淋巴瘤选自小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)，套细胞淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，伯基特-样淋巴瘤，滤泡中心细胞淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，边缘区B-细胞淋巴瘤，节边缘区B细胞淋巴瘤，节外边缘区B细胞淋巴瘤，脾边缘区B细胞淋巴瘤，淋巴浆细胞性淋巴瘤，成淋巴细胞B细胞淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤，纵隔大B细胞淋巴瘤和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。
在具体的实施方案中，B细胞淋巴瘤是B细胞白血病，或B细胞白血病选自B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)，前体B细胞急性淋巴细胞白血病，B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)，前体B-成淋巴细胞白血病，B细胞前淋巴细胞白血病，毛细胞白血病和伯基特细胞白血病。
在具体的实施方案中，B细胞淋巴瘤选自浆细胞骨髓瘤，浆细胞瘤，primary effusive淋巴瘤，弥漫性混合B细胞淋巴瘤和未分化的B细胞淋巴瘤。
在一些实施方案中，FRIL-敏感的癌细胞是在哺乳动物体内。在具体的实施方案中，哺乳动物是人患者。在其它的实施方案中，FRIL-敏感的癌细胞离体地在细胞培养物中。
在另一个方面，本发明提供了确定癌细胞是否对FRIL蛋白敏感的方法，通过使所述的细胞接触FRIL蛋白，并检测FRIL蛋白是否能抑制细胞的增殖和/或存活。
在另一个方面，本发明提供了确定患有癌症的哺乳动物对象是否能从FRIL蛋白治疗中获益的方法，通过使来自对象的癌细胞接触FRIL蛋白，和检测FRIL蛋白是否能抑制细胞的增殖和/或存活。
在另一个方面，本发明提供了通过给对象施用药物组合物来治疗患有FRIL-敏感的癌症的哺乳动物对象的方法，所述的药物组合物包含治疗有效量的能抑制癌细胞的增殖和/或存活的FRIL蛋白。
在另一个方面，本发明提供了通过给对象施用可检测地标记的FRIL蛋白和在对象中成像、检测或定位标记来在哺乳动物对象中成像、检测或定位FRIL-敏感的癌症的方法。
在任一个前述方面的一些实施方案中，FRIL蛋白可以选自天然的FRIL蛋白和重组的FRIL蛋白。在具体的实施方案中，天然的FRIL蛋白可以是天然的D1-FRIL蛋白，天然的Pv-FRIL蛋白或天然的Pa-FRIL蛋白。在一些具体的实施方案中，FRIL蛋白是成熟的缺乏N-末端先导序列的FRIL蛋白。在一些具体的实施方案中，FRIL蛋白对应着包含在SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4和SEQ NO.6中的氨基酸序列。在一些实施方案中，从包含SEQ NO：1或SEQ ID NO：5的核酸表达FRIL蛋白。
在另一个方面，本发明提供了FRIL蛋白在生产用于治疗FRIL-敏感的癌症的药物中的应用。在一些实施方案中，将FRIL蛋白与标准的化学治疗剂或用于选择性地杀死癌细胞的试剂相组合。在一些实施方案中，将FRIL蛋白与毒素或靶向分子缀合。
附图简述
下面的附图是本发明的实施方案的解释，且无意限制权利要求书包含的本发明的范围。
图1是显示正常的人B细胞(白色正方形)和2个B细胞肿瘤系CCRF-SB(黑色圆圈)和JM1(黑色三角形)的百分比的线图的示意图，它们被标示浓度的生物素化的D1-FRIL染色，然后用第二种链霉抗生物素-PE染色。
图2是显示在与D1-FRIL接触后活细胞的数目(使用XTT)的线图的示意图。测试的细胞系是：KG-1a(白色正方形)；JM1(白色圆圈)；SR(白色三角形)；RL(黑色矩形)；RAJI(黑色圆圈)；MC116(黑色正方形)；HT(黑色三角形)；和CCRF(黑色菱形)。
图3是对比用递增浓度的D1-FRIL孵育正常的T细胞(空心的正方形)，T细胞白血病CCRF-CEM(实心的菱形)，前-B白血病JM1(X′s)，皮肤T细胞淋巴瘤HuT78(实心的三角形)和B急性淋巴细胞白血病CCRF-SB(实心的正方形)后，对T细胞及B和T肿瘤细胞系的杀伤的线图的示意图。
图4是用于检测D1-FRIL是否能诱导细胞凋亡的对D1-FRIL处理的MC116(FRIL-敏感的)和JM1(FRIL-不敏感的)细胞的膜联蛋白-V和7-AAD染色的示意图。
图5是显示100mM甲基α-D-吡喃甘露糖苷对D1-FRIL-介导的对MC116淋巴瘤细胞和RAJI伯基特淋巴瘤细胞的杀伤的抑制的条线图的示意图。
图6是显示用0.2μg/ml(白色符号)或10μg/ml(黑色符号)的D1-FRIL孵育正常的B细胞(圆形)和MC116淋巴瘤细胞(正方形)后，对B细胞和淋巴瘤细胞的杀伤的线图的示意图。
图7是显示D1-FRIL(实心的三角形)和Pa-FRIL(实心的正方形)对B细胞肿瘤系(CCRF-SB)的杀伤水平的线图的示意图。
图8是显示在有FRIL-不敏感的T细胞白血病CCRF-CEM细胞存在下，对FRIL-敏感的MC116 B淋巴瘤细胞的杀伤的线图的示意图。
优选实施方案的详细描述
在本文中提及的专利、科学和医学出版物建立了在产生本发明时本领域的普通技术人员可以获得的知识。在本文中引用的授权的美国专利、出版的和未决的专利申请、和其它文献的完整内容，在这里引作参考。
定义
除了在下面另有定义外，在本文中使用的所有技术和科学术语都意在具有本领域的普通技术人员通常理解的含义。在本文中提及的采用的技术，意指本领域通常理解的技术，包括这些技术的变体或等同方案的替代或本领域的技术人员显而易见的以后开发的技术。另外，为了更清楚、准确地描述本发明的主题，为在说明书和所附权利要求书中使用的某些术语提供了下面的定义。
如本文所使用的，术语＂FRIL-敏感的癌症＂指任何形式的癌症，其中使癌细胞接触本发明的FRIL蛋白会抑制细胞的增殖和/或存活至统计上显著的程度。癌细胞可以是增生性的细胞，缺乏体外生长接触抑制的细胞，非转移性的肿瘤细胞，或转移性的细胞。
如本文所使用的，术语“天然的FRIL-蛋白”指从天然地表达蛋白的豆荚中分离的FRIL蛋白。
如本文所使用的，术语＂重组的FRIL-蛋白＂指从由重组基因表达蛋白的生物分离的FRIL蛋白，包括但不限于，已经用编码FRIL蛋白的重组构建体转染的细菌、酵母、植物或动物细胞。重组的FRIL蛋白可以具有与天然的FRIL蛋白相同的氨基酸序列，或可以具有包含一个或多个氨基酸插入、缺失和/或置换的氨基酸序列，包括但不限于N-末端添加或缺失，C-末端添加或缺失，和嵌合蛋白。
如本文所使用的，术语＂FRIL-蛋白＂，不经其它修饰，指任意的天然的FRIL蛋白或重组的FRIL蛋白。
如本文所使用的，关于氨基酸序列，术语＂百分比同一性＂和＂序列同一性＂指基于序列比对的2个序列的相似程度的度量，其能最大化同一性，且其随着相同的核苷酸或残基的数目、总核苷酸或残基的数目、和在序列比对中间隙的存在和长度而变化。使用标准的参数，许多算法和计算机程序可以用于检测序列同一性。例如，Gapped BLAST或PSI-BLAST(Altschul等(1997)，Nucleic Acids Res.25：3389-3402)，BLAST(Altschul等(1990)，J.Mol.Biol.215：403-410)，和Smith-Waterman(Smith等(1981)，J.Mol.Biol.147：195-197)。如本文所使用的，百分比同一性是基于BLAST算法的缺省值。
如本文所使用的，关于蛋白制品，术语＂基本上纯的＂指含有至少60％(按干重计)目标蛋白的制品，不包括其它有意包含的化合物的重量。在一些实施方案中，制品按干重计是至少75％、至少90％或至少99％目标蛋白，不包括其它有意包含的化合物的重量。可以通过任何合适的方法测量纯度，例如，柱色谱，凝胶电泳，或HPLC分析。如果制品有意地包含2种或多种不同的本发明的蛋白，＂基本上纯的＂制品指其中本发明的蛋白的总干重是总干重的至少60％的制品，不包括其它有意包含的化合物的重量。对于含有2种或多种本发明的蛋白的这样的制品，本发明的蛋白的总重量可以是制品的总干重的至少75％，至少90％，或至少99％，不包括其它有意包含的化合物的重量。因而，如果为了施用、稳定性、保藏等目的，将本发明的蛋白与一种或多种其它的蛋白(例如，血清白蛋白)或化合物(例如，稀释剂，去污剂，赋形剂，盐，多糖，糖，类脂)相混合，在计算制品的纯度时，忽略这样的其它的蛋白或化合物的重量。
如本文所使用的，如在短语“使A接触B”中的术语＂接触＂，指使A和B充分地物理临近，以在分子水平相互作用，如通过将A和B在溶液中混合到一起，或将A的溶液倒到在基质上的B上。如本文所使用的，短语“使A接触B”意在等同于“使B接触A”，且无意暗示任一种元素相对于另一种是固定的，或任一种元素相对于另一种是移动的。
如本文所使用的，术语“标记的”指化学地构成的或修饰的，以便于通过标准的化学的、生化的、生物的或成像的测定进行检测，包括但不限于放射测定(例如，放射性同位素测定)，光谱测定(例如，荧光，化学发光，生物发光测定)，免疫测定(例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)，夹心测定，免疫荧光测定，免疫放射测定)，CAT扫描或磁共振成像测定。
如本文所使用的，术语＂治疗有效量＂指药物组合物或方法的每种活性组分的总量，足以显示出有意义的患者益处(例如，癌细胞的增殖速度的统计上显著的降低，癌细胞的实际数目或滴度的增加速度的统计上显著的降低，癌细胞的实际数目或滴度的统计上显著的减小，实体瘤的大小的增加速度的统计上显著的降低，实体瘤的大小的统计上显著的减小)。当应用于单独施用的各活性成分时，该术语指单独的该成分。当应用于组合时，该术语指能产生治疗效果的活性成分的组合量，无论组合、连续或同时施用。
如本文所使用的，术语“增加”和“减少”分别指造成统计上显著的增加(即，p<0.1)和统计上显著的减少(即，p<0.1)。
如本文所使用的，术语“抑制”指相对于基线水平或在没有指定的处理的情况下将会预期的水平，造成指定特征的减少，例如增殖(即，细胞繁殖)或存活率。
如本文所使用的，术语＂统计上显著的＂指在相关的无效假设下具有低于10％的可能性(即，p<0.1)。
如本文所使用的，变量的数值范围的引用，意在表达用与该范围内的任意值相等的变量，可以实现本发明。因而，对于固有地离散的变量，该变量可以等于数值范围内的任意整数值，包括范围的端点。同样地，对于固有地连续的变量，该变量可以等于数值范围内的任意实值，包括范围的端点。作为一个实例，且无限制地，描述为具有0和2之间的值的变量，如果变量固有地是离散的，可以取值0，1或2；如果变量固有地是连续的，可以取值0.0，0.1，0.01，0.001，或≥0且≤2的任何其它实值。
如本文所使用的，除非另有具体的说明，词语“或”以＂和/或＂的包含含义使用，而非“任一种/或”的排除含义。
一般考虑
本发明部分地依赖下述发现，即某些凝集素可以用于治疗B细胞淋巴瘤，T细胞皮肤淋巴瘤和其它的FRIL-敏感的癌症。更具体地，本发明依赖于下述发现，即FRIL蛋白能结合某些癌性细胞，包括B细胞淋巴瘤和T细胞皮肤淋巴瘤，并抑制这些细胞的增殖和/或存活。FRIL蛋白也结合某些非癌性的细胞(例如，表达Flt3受体的祖细胞)，但是具有减少的抑制这些细胞的增殖和/或存活的能力，或没有该能力。因而，本发明的FRIL蛋白可以选择性地抑制某些癌症的增殖和/或存活，因此，它们可以用于治疗患有这样的癌症的患者。另外，因为它们的选择性地结合这样的癌细胞的能力，标记的FRIL蛋白可以用作成像、检测或定位这样的癌症的标记。
FRIL蛋白
FRIL蛋白是甘露糖/葡萄糖-特异性的豆类凝集素，其最初被鉴别为在抑制分化的意义上具有保存祖细胞的能力(有或无诱导增殖)，且称作＂pylartin＂(见，例如，美国专利号6,084,060)。在生物测定中还显示该蛋白能刺激用flk2/Flt3受体转染的NIH 3T3细胞的增殖，但不能刺激未转染的细胞，因此，称作Flt3受体相互作用凝集素(FRIL)(见，例如，Moore等(1997)，Blood 90，Suppl.1，308(abstract)；Mo等，1999)，Glycobiology 9：173-179；Colucci等(1999)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：646-650；Moore等(2000)，Biochim.Biophys Acta 25027：1-9)。但是，在本发明的上下文中，如在下面的实施例中所述，证实了FRIL蛋白能结合不表达Flt3受体的癌细胞。因此，结合Flt3受体的能力不是本发明中该蛋白的应用所必需的，且命名FRIL应当理解为该蛋白的历史名称，而不是功能上的要求。
在扁豆(Dolichos lab lab)中鉴定出了第一种FRIL蛋白，但是现在已经在其它的豆科植物(tribe Phaseoleae)中鉴别出了FRIL蛋白，包括但不限于菜豆(Phaseolus vulgaris)，Sphenostylisstenocarpa，鹰嘴豆(Cicer arietinum)，Sphenostylis stenocarpa，Phaseolus acutifolius，棉豆(Phaseolus lunatus)，Vignasinensis和Voandzeia subterranea。可以用于本发明的天然的FRIL蛋白包括但不限于扁豆(Dolichos lab lab)(″Dl-FRIL″)，菜豆(Phaseolus vulgaris)(″Pv-FRIL″)和Phaseolus acutifolius(″Pa-FRIL″)的FRIL蛋白。
天然的FRIL蛋白表达为α和β链的杂二聚体，且α链具有大约15-20kD的计算分子量，β链具有大约12-20kD的计算分子量。α和β链最初表达为单个的多肽，但是随后被剪切。该蛋白还似乎具有N-连接的糖基化位点。
在SEQ ID NO：2中提供了一种Dl-FRIL蛋白的氨基酸序列。该序列始于22个氨基酸的先导序列，该先导序列会从成熟的蛋白切除。残基23-145构成β链，残基146-286构成α链。在成熟的天然蛋白中，C-末端经常被截短至不同的程度，包括缺失最后14个残基。SEQ ID.NO：2的蛋白是基于Colucci等(1999)，Proc.Nati，Acad.Sci.USA 96：646-650的序列，但是存在基于后来的数据的若干变化。Kotlarczyk等(2002)，UBEP 2002 Ninth Annual Undergraduate ResearchSymposium，Arizona State University，Abstract #35描述了来自Dolichos lab lab的具有SEQ ID NO：3提供的氨基酸序列的另一FRIL蛋白。不清楚该蛋白与Colucci等(1999)的天然的D1-FRIL蛋白之间的关系。SEQ ID NO：3序列的蛋白以源自免疫球蛋白K链的8个氨基酸的先导序列开始，且不是天然蛋白的一部分。残基9至约129-135构成β链，从约130-136至276的残基构成α链。如前所述，C-末端可以被截短至不同的程度，包括缺失最后约14个残基。Gowda等(1994)J.Biol.Chem.269：18789-18793描述了来自Dolichos lablab的具有SEQ ID NO：4提供的氨基酸序列的FRIL-样蛋白。不清楚该蛋白与天然的Dl-FRIL蛋白之间的关系。
在SEQ ID NO：6中提供了一种Pv-FRIL蛋白的氨基酸序列。该序列以22个氨基酸的先导序列开始，该先导序列会从成熟的蛋白切除。残基23-145构成β链，残基146-301构成α链。在成熟的天然蛋白中，C-末端经常被截短至不同的程度。
在每种FRIL蛋白的情况下，可以产生N-末端或C-末端缺失或添加，以及内部插入、缺失和置换，而不影响生物活性。
除了天然的FRIL蛋白外，本发明可以利用重组的FRIL蛋白。重组的FRIL蛋白可以具有与天然的FRIL蛋白相同的氨基酸序列，或可以具有包含一个或多个氨基酸插入、缺失和/或置换的的氨基酸序列。例如，天然的FRIL蛋白的N-末端先导序列可以缺失，或可以用替代性的先导序列替代。也可以截短或替代C-末端序列。还可以生产融合蛋白，添加纯化标记或表位(例如，聚-His标记，c-myc表位)，或靶向序列(例如，细胞表面受体的配体或免疫球蛋白结构域)。内部的置换、缺失和插入也是可行的。在一些实施方案中，重组蛋白是通过混合2种或多种天然的FRIL蛋白的序列而生成的嵌合序列。根据表达这样的重组的FRIL蛋白的宿主，由于翻译后的加工的不同，例如α和β链的剪切，N-末端先导序列的去除，和/或C-末端截短或降解，重组蛋白也可以不同于天然的FRIL蛋白。
许多重组的FRIL变体的描述，可以参见例如美国专利号6,310,195；PCT国际公开号WO 98/59038，和PCT国际公开号WO01/49851，其完整内容在这里引作参考。一般而言，可以生产重组的FRIL蛋白，包括嵌合蛋白，其与天然的FRIL蛋白具有至少45％氨基酸序列同一性，至少55％氨基酸序列同一性，至少65％氨基酸序列同一性，至少75％氨基酸序列同一性，或至少85％氨基酸序列同一性。在某些实施方案中，重组的FRIL蛋白可以与天然的FRIL蛋白(例如，SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：6)具有至少90％或至少95％同一性。根据标准方法(见，例如，Pearson和Lipman(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444-2448；George等，in Macromolecular Sequencing and Synthesis，Selected Mehtods and Applications，pps.127-149，Alan R.Liss，Inc.1988；Feng和Doolittle(1987)，Journal of Molecular Evolution 25：351-360；和the BLAST programsof the National Center for Biotechnology，National Library ofMedicine，Bethesda，MD)，可以测量2种蛋白或2种核酸分子之间的氨基酸序列同一性和核酸序列同一性。
并非所有的FRIL蛋白(无论天然的或重组的)都可以用于本发明。更具体地，有用的FRIL蛋白必须能结合目标癌细胞，并抑制该细胞的增殖和/或存活。使用简单的体外测定，例如下面在实施例中描述的那些，可以测试FRIL蛋白的结合癌细胞的能力。使用简单的体外测定，例如下面在实施例中描述的那些，也可以测试FRIL蛋白的抑制不同癌细胞系的增殖和/或存活的能力。
并非所有天然的FRIL蛋白都可以用于本发明。例如，Sphenostylis stenocarpa的FRIL蛋白(＂Ss-FRIL＂)似乎不能结合迄今为止测试的任一种癌细胞、抑制其增殖和/或存活。但是，Ss-FRIL可能用于治疗尚未测试的癌症。同样地，并非所有重组的FRIL都可以用于本发明，如果它们不能结合任一种癌细胞或抑制其增殖和/或存活的话。
FRIL-敏感的癌症
本发明的FRIL蛋白可以用于治疗任一种FRIL-敏感的癌症。这样的癌症的定义是，FRIL蛋白会抑制其癌细胞的增殖和/或存活的那些癌症，且通过本文所述的测定，可以鉴别出这样的癌症。通过本领域众所周知的蛋白结合、细胞增殖和/或细胞毒性的标准测定，可以鉴别出FRIL-敏感的癌症。
例如，在标准测定中，使用标记的FRIL蛋白(见下文)，可以检测特定FRIL蛋白的结合亲合力。因而，例如，通过测量结合到培养的细胞上的可检测地标记的FRIL的量，可以检测FRIL结合的量。或者，竞争测定可以用于检测EC50，或者洗脱50％结合到细胞上的标记的FRIL蛋白所需的游离FRIL蛋白的浓度。在一个实验中，证实了D1-FRIL能以0.5至0.8μg/ml的EC50结合到FRIL-敏感的癌性B细胞上，且以2至4μg/ml的EC50结合到正常的人B细胞上。同样地，发现超过5倍浓度的FRIL蛋白是达到与FRIL敏感的B-淋巴瘤等同杀伤正常人B细胞所必需的。如在下面的实施例中所描述的，D1-FRIL蛋白以低亲合力结合正常的B细胞，且正常的B细胞不是D1-FRIL-敏感的。相反地，D1-FRIL能以高亲合力结合成熟的B细胞淋巴瘤细胞，且这些B细胞是FRIL-敏感的。另一方面，D1-FRIL能结合某些癌细胞(例如，例如在下面的实施例中描述的KG-1髓细胞癌细胞系)，而不显著抑制这些细胞的存活。因此，尽管推测FRIL蛋白的结合是FRIL-介导的对增殖和/或存活的抑制所必需的，其还不足够。
因而，除了证实FRIL蛋白能结合癌细胞外，还必需在得出癌细胞是FRIL-敏感的结论之前，证实FRIL蛋白可以抑制增殖和/或存活。检测细胞增殖和存活的方法是本领域已知的，包括但不限于，计数活细胞(例如，使用血球计数器，库特氏细胞计数器，或Guava PCA装置)和测量标记的营养物(例如，3H-胸苷，XTT)的掺入或代谢率的方法。用于检测细胞增殖的这些和其它方法，记载在例如，Ausubel等(1999)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，New York，NY。
基于现有的实验证据，FRIL-敏感的癌症包括但不限于，B细胞淋巴瘤，尤其是源自成熟的B淋巴细胞的B细胞淋巴瘤。B细胞淋巴瘤的实例包括B细胞非-霍奇金氏淋巴瘤(例如，小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)，套细胞淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，伯基特-样淋巴瘤，滤泡中心细胞淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，边缘区B-细胞淋巴瘤，节边缘区B细胞淋巴瘤，节外边缘区B细胞淋巴瘤，脾边缘区B细胞淋巴瘤，淋巴浆细胞性淋巴瘤，成淋巴细胞B细胞淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤，纵隔大B细胞淋巴瘤和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症。也见，Cuneo(2000)，Atlas Genet.Cytogenet.Oncol.Haematol.)。B细胞淋巴瘤的其它实例包括B细胞白血病(例如B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)，前体B细胞急性淋巴细胞白血病，B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)，前体B-成淋巴细胞白血病，B细胞前淋巴细胞白血病，毛细胞白血病，伯基特细胞白血病)，浆细胞骨髓瘤，浆细胞瘤，primary effusive淋巴瘤，弥漫性混合B细胞淋巴瘤和未分化的B细胞淋巴瘤。
FRIL-敏感的癌症也包括T细胞皮肤淋巴瘤，如下面的实施例所述。
治疗方法
在另一个方面，本发明提供通过给哺乳动物施用包含治疗有效量的癌症对其敏感的FRIL蛋白的药物组合物，治疗被诊断患有FRIL-敏感的癌症的哺乳动物的方法，例如B细胞淋巴瘤或T细胞皮肤淋巴瘤。哺乳动物可以是人患者，或者，在一些实施方案中，哺乳动物可以是非人的灵长动物，实验室动物(例如，小鼠，大鼠，兔子，仓鼠)，家畜或饲养动物(例如，马，绵羊，奶牛，猪，山羊)，或宠物(例如，猫和狗)。
在一个方面，本发明提供了确定对象(例如，人患者)是否患有FRIL-敏感的癌症的方法，其能从包含FRIL蛋白的药物组合物治疗中获益。该方法包括，使来自患者的癌细胞接触FRIL蛋白，并检测FRIL蛋白是否能抑制癌细胞的增殖和/或存活(例如，通过与外部标准对比，或与来自相同患者的癌细胞的未处理的对照样品对比)。典型地，选择已知能有效地对抗患者患有的癌症类型的FRIL蛋白。如果确定了该癌症是FRIL-敏感的，则患者可以接受FRIL蛋白治疗。
可以采用适用于为FRIL蛋白药物组合物选择的具体剂型的任何给药途径，包括但不限于，肠胃外途径，例如静脉内的，动脉内的，肌肉内的，皮下的，腹膜内的，鼻内的，肺内的，直肠内的和阴道内的。对于某些制剂，也可以采用经口给药。可以将药物制品局部地施用到患病区域(例如，直接进入肿瘤块)，或可以全身地施用。因为本发明的FRIL蛋白可以杀死某些癌性细胞，但是不会杀死正常的细胞，本发明的组合物也可以全身地施用于例如癌症已经在全身转移的情况。
构成治疗有效量的FRIL蛋白的准确量取决于选择的FRIL蛋白的活性，待治疗的癌症的性质，待治疗的癌症的范围，对象的年龄、体重和总体健康，以及任何联合疗法的应用。作为一般原则，当全身施用时，治疗有效量的范围可以是每天500ng/kg(即，500ng FRIL蛋白/kg对象总体重)至100mg/kg。在一些实施方案中，治疗有效量的范围是每天1μg/kg至50mg/kg，或每天5μg/kg至25mg/kg。
FRIL蛋白的施用可以在对象出现症状之前，诊断出疾病时，或疾病已经进展之后。例如，可以将FRIL蛋白预防性地施用给已经暴露于高剂量的辐射或致癌物的对象，或者，可以用FRIL蛋白作为一线疗法治疗新诊断出患有B细胞癌症(例如，依靠阳性活组织检查)的尚未表现出该癌症的特征性症状(例如，疲劳，快速生长的淋巴结，呼吸急促，疼痛)的人患者。或者，在一些实施方案中，可以将FRIL蛋白作为辅助疗法与相关癌症的其它标准治疗联合施用。
作为一般原则，可以将对象的FRIL蛋白治疗与传统的癌症治疗相结合，例如，手术，类固醇治疗，放射治疗，化疗，或一种或多种这些治疗的组合。
因而，在一些实施方案中，将包含FRIL蛋白和能选择性地杀死B细胞的试剂的药物组合物施用给被诊断患有B细胞癌症的患者，以杀死患者中的全部或几乎全部B细胞，包括正常的B细胞和癌性的B细胞。治疗后，患者将能从骨髓(或其它造血器官，例如囊或胎儿肝脏)中的祖细胞产生新的健康的B细胞。因此，使用能杀死全部B细胞的治疗，将确保杀死所有癌性的B细胞。在本上下文中，“能选择性地杀死B细胞的试剂”是相对于体内的其它细胞能优先杀死B细胞的试剂，以便可以耐受治疗有效量的治疗。例如，能选择性地杀死B细胞的试剂可以是抗体或抗体-毒素缀合物，其能结合仅仅在B细胞上表达的细胞表面标记(包括但不限于，CD19，CD20，CD22，CD72，CD79α，CD79β，CD121b和CD138细胞表面蛋白)。
在本发明的另一个方面，通过使细胞体外地接触FRIL蛋白或包含FRIL蛋白的药物组合物，减少癌细胞的增殖和/或存活。例如，可以为了研究目的体外地测试FRIL蛋白对癌细胞的作用，以鉴别FRIL-敏感的癌症，或评价不同的FRIL蛋白的相对功效。同样地，可以使用培养的癌细胞来预测或检测用于抑制细胞的增殖和/或存活的FRIL蛋白的剂量。因而，可以使不同的FRIL蛋白和不同剂量的各种FRIL蛋白接触培养的细胞，以鉴别用于治疗不同癌症的最有效的FRIL蛋白。
在另一个方面，可以从患者取出含有癌性的和非癌性的组织的混合物的组织，培养生长，并用FRIL蛋白处理，然后将组织返回患者。例如，可以从患有影响骨髓细胞亚群的癌症的患者取出骨髓，可以用FRIL蛋白体外地处理骨髓(有或没有联合疗法，例如放疗或标准的化疗)，且可以将FRIL-处理过的骨髓细胞重新导入患者。
药物制剂
在另一个方面，本发明提供了用于治疗FRIL-敏感的癌症的包含基本上纯的FRIL蛋白的药物制剂，或用于这样的治疗的药物的生产。
药物制剂可以包含干型的(例如，单独地或与稳定剂一起冻干)或在液体溶液或悬浮液(例如，在药学上可接受的载体或稀释剂中)中的FRIL蛋白。用于液体的肠胃外施用的药学上可接受的载体包括但不限于，水，缓冲盐水，多元醇(例如甘油)，聚亚烷基二醇(例如，丙二醇，液体聚乙二醇)，植物油，氢化萘，或其合适的混合物。也可以用缓冲剂或赋形剂配制FRIL蛋白。
在一些实施方案中，将FRIL蛋白配制在持续释放的颗粒或可植入的装置中。例如，这样的颗粒或装置可以用生物相容的可生物降解的交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物等制成，以控制FRIL蛋白的释放。其它潜在地有用的肠胃外的输送装置包括渗透泵，可植入的灌输系统和脂质体。
也可以将FRIL蛋白与在癌症的治疗中有用的其它药物或治疗剂组合配制。例如，可以将FRIL蛋白与化疗剂、放疗剂、类固醇或能选择性地杀死B细胞的试剂相组合。可以用于本发明的化疗剂包括但不限于，阿糖胞苷，环磷酰胺，胞嘧啶阿拉伯糖苷，阿霉素，柔红霉素，5-氟尿嘧啶(5-FU)，阿仑单抗，贝沙罗汀，地尼白介素-毒素连接物，苯丁酸氮芥，氟达拉滨，克拉屈滨，吉姆单抗-奥佐米星，替伊莫单抗，培门冬酶，美罗华，长春新碱，泼尼松龙，依托泊苷，米托蒽醌，和维A酸ATRA。
关于配制药物制剂的方法，参见例如Remington′sPharmaceutical Sciences(18th edition)，A.Gennaro编(1990)，Mack Publishing Company，Easton，PA.
使用标准技术，可以容易地纯化FRIL蛋白。用于纯化蛋白的方法是本领域已知的，包括但不限于，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，免疫沉淀，免疫吸附，高效液相色谱(HPLC)，大小排阻色谱(SEC)，免疫亲和色谱，离子交换色谱，疏水相互作用色谱，或任意这些方法的组合。这些和其它合适的方法记载在，例如，Marston(1987)，in DNA Cloning，Glover，ed.，Volume III，IRLPress Ltd.，Oxford；Marston和Hartley(1990).in Guide to Protein Purification.Deutscher.e.d..Academic Press，SanDiego；Laemmli(1970)，Nature 227：680-685；Ausubel等(1999)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NewYork，NY；和美国专利号6,084,060。通过结合甘露糖(其可以偶联到固相载体(例如，琼脂糖珠子)上)，也可以纯化FRIL家族成员分子。
也可以迅速且便宜地从豆科植物(例如，扁豆，莱豆)纯化FRIL蛋白。例如，通过甘露糖-亲和色谱或通过卵清蛋白亲和色谱，可以从粉碎的豆荚的提取物纯化FRIL蛋白。FRIL蛋白在豆科植物中相对丰富。例如，D1-FRIL占扁豆质量的大约0.02％。
通过重组方法，也可以制备纯化的FRIL蛋白。因而，通过本领域的技术人员众所周知的重组技术，将编码FRIL蛋白的核酸序列导入任何合适的宿主细胞类型，包括细菌(例如，大肠杆菌)，酵母(例如，酿酒酵母)，植物(例如，鼠耳芥属，浮萍属，烟草，或玉米)，昆虫(例如，果蝇)，或哺乳动物细胞(例如，CHO细胞)，可以生产FRIL蛋白。例如，可以将FRIL蛋白-编码核酸序列插入杆状病毒载体，其可以用于产生重组的杆状病毒颗粒。用重组的杆状病毒转导的昆虫细胞(例如，Sf9细胞)能表达FRIL蛋白。裂解后，可以纯化FRIL蛋白。
或者，可以在双子叶植物中生产重组的FRIL蛋白，例如烟草(Nicotiana tabacus)或鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)。例如，使用携带编码FRIL蛋白的核酸分子的根癌土壤杆菌菌株，可以转化鼠耳芥属植物。制备用于产生具有需要的核酸分子的土壤杆菌的载体的方法是本领域已知的(见，例如，McBride and Summerfelt(1990)，Plant Mol Biol.14(2)：269-276；美国专利号4,940,838和美国专利号5,464,763)。通过标准方法(见，例如，Ausubel等，同上)，可以从转化的植物纯化FRIL蛋白。
编码FRIL蛋白的核酸序列包括但不限于，编码SEQ ID NO：2，3或6的蛋白的任意序列，包括SEQ ID NO：1或5的核酸序列。另外，可以设计和生产编码本文所述的任意重组FRIL变体的核酸序列。
成像、检测和定位癌细胞的方法
在另一个方面，本发明提供了成像、检测或定位哺乳动物(例如，人患者)中的癌性细胞的方法，其包括给患者施用可检测地标记的FRIL蛋白，和成像、检测或定位对象中的标记。通过选择对癌症具有高结合亲合力的FRIL蛋白(如下面实施例所述)，标记将选择性地定位到体内存在癌性细胞的位置或区域。可以处理(例如，FRIL蛋白处理，放疗或化疗)或手术切除这些区域(例如，淋巴结)，以杀死或去除癌性的细胞。
可以通过标准技术标记FRIL蛋白，为了可以通过标准的化学的、生化的、生物的或成像的测定进行检测，包括但不限于，放射测定(例如，放射性同位素测定)，光谱测定(例如，荧光，化学发光，生物发光测定)，免疫测定(例如，ELISA，夹心测定，免疫荧光测定，免疫放射测定)，CAT扫描或MRI测定。例如，通过偶联剂，例如二醛，碳化二亚胺，和二马来酰亚胺，可以将发色的或发荧光的分子缀合到FRIL蛋白上。可检测的标记的实例包括但不限于，放射性的标记，例如3H，32P，或35S；荧光标记例如藻红蛋白和异硫氰酸荧光素(FITC)；和MRI成像剂例如含有钆的分子(例如，gadopentetate)。在替代性的实施方案中，可检测的标记是可间接检测的，例如表位或其自身能被直接检测到的另一种分子或化学部分的结合伴侣。
下面的实施例意在进一步解释本发明的某些优选的实施方案，在性质上不是限制性的。本领域的技术人员仅仅使用常规的实验，能认识到或能确定本文所述的具体物质和方法的许多等同方案。认为这样的等同方案在本发明和所附权利要求书的范围内。
实施例I
FRIL以高亲合力结合人B细胞恶性肿瘤
检测了非限制性的FRIL蛋白(即D1-FRIL)对不同的恶性B细胞系和正常的B细胞的亲合力。
为了这些研究，使用Rosette-Sep B-细胞分离抗体混合物(市场上购自StemCell Technologies，Vancouver，BC，Canada)以去除污染的非-B白细胞和红细胞，从健康的正常志愿者的外周血中分离了正常的人B细胞。使用缀合到藻红蛋白(BD Pharmingen，San Diego，CA)上的抗-CD19抗体，荧光地检测制品的纯度，然后使用Guava PCA(Guava Technologies，Inc.，Hayward，CA)分析细胞。B细胞制品>70％CD19-阳性的。
另外，从美国典型培养物中心(ATCC，Manassas，VA)得到了不同的癌性的B细胞系，即CCRF-SB(伯基特B-ALL细胞系)和JM1(非霍奇金氏淋巴瘤细胞系)，并在RPMI完全培养基(含有10％胎牛血清，50μM 2-巯基乙醇，和庆大霉素)中培养。
在这些研究中使用的Dl-FRIL分离自扁豆Dolichos lab labpurpureus，如前所述的(见，例如，Colucci等(1999)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：646-650)。简而言之，扁豆(Dolichos lab labpurpureus)的种子购自Stokes Seeds(Buffalo，NY)，并直接使用，或在温室中生长。将干种子在磨咖啡机或Retzel磨中研磨成细粉，并在4℃用5体积50mM Tris/HCl提取粉末4小时，该Tris/HCl含有MgCl2和CaCl2各1nM。通过在10,000xg离心20分钟，沉淀豆固体。用醋酸将上清液的pH酸化至pH4.0，然后进行第二次离心，以澄清上清液，最后用氢氧化钠将pH再调节至8.0。通过结合到甲基α-D-吡喃甘露糖苷琼脂糖基质(市场上购自Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)，实现FRIL蛋白的单步亲合力纯化。在22℃，将凝胶(即，基质)与豆粗提物翻滚10分钟，用含有MgCl2和CaCl2各1nM的50mMTris/HCl小心地洗涤4次，然后用100mM甲基α-D-吡喃甘露糖苷(市场上购自Sigma Chemical Co.，St.Louis MO)洗脱。纯化的Dl-FRIL制品超过96％ Dl-FRIL，如通过高效液相色谱/大小排阻色谱(HPLC-SEC)所确定的。
根据生产商的说明书所述，通过在室温用20-倍摩尔过量的硫代-NHS-生物素(市场上购自Sigma Chemical Co.，St Louis，MO)孵育2mg Dl-FRIL 30分钟，将Dl-FRIL生物素化，以生产生物素化的Dl-FRIL(Dl-FRIL-Bi)。
收获大约5 x 105癌性的或正常的B-细胞，在盐水溶液中洗涤，并用不同量的生物素化的D1-FRIL(即，0.1，0.5，1，2.5，10，和25μg/ml)在4℃孵育15分钟。然后洗涤细胞，并用0.1μg链霉抗生物素-PE(SA-PE；市场上购自Southern Biotech，Birmingham，AL)在4℃孵育10分钟。然后洗涤细胞，并使用Guava PCA(GuavaTechnologies，Inc.，Hayward，CA)，荧光分析FRIL结合。
如图1所示，生物素化的Dl-FRIL以比对正常的人B细胞更高的亲合力结合肿瘤细胞系之一，即CCRF-SB。令人感兴趣地，生物素化的Dl-FRIL也不结合JM1肿瘤细胞系。正常的人B细胞、CCRF-SB细胞和JM1细胞不表达FLT3受体，暗示着这些细胞的表面上存在Dl-FRIL的另外结合靶。
Dl-FRIL与正常的人B细胞的结合不影响活化或诱导增殖。Dl-FRIL的存在，不会影响抗-IgM和IL-4或LPS对活化标记B7.2(CD86)的诱导(未显示数据)。FRIL也不能诱导正常的人B细胞、JM1细胞或CCRF-SB细胞的增殖(未显示数据)。令人感兴趣地，CCRF-SB细胞(其以最高亲合力结合Dl-FRIL)似乎被Dl-FRIL结合杀死。
实施例II
FRIL杀死它以高亲合力结合的癌性的T和B细胞
基于实施例I中的观察，即FRIL以高亲合力结合并杀死CCRF-SB细胞，测试了Dl-FRIL与不同的人淋巴细胞和髓细胞细胞系的相互作用。为了这些研究，B细胞系包括伯基特淋巴瘤系，RAJI，Daudi，RJ2.2.5，RAMOS，Farage，和GA-10细胞；白血病细胞系，SR和EHEB细胞；弥漫性混合淋巴瘤细胞系，HT和DB；未分化的B淋巴瘤细胞系，MC116；滤泡性淋巴瘤细胞系，RL；和前-B白血病细胞系，JM1，NALM-6和SUP-B15。测试的非B细胞系包括嗜曙红肿瘤系，EOL-1；AML细胞系，KG-1和KG-1a；单核细胞肿瘤细胞系，THP-1；T白血病细胞系，CCRF-CEM和Jurkat；和皮肤T淋巴瘤细胞系，HuT78和Loucy。RJ2.2.5细胞系由Jerry Boss博士(Emory University，Atlanta，Georgia，经过Roberto Accola博士的许可，Universityof Insubria，Varese，Italy)提供，同时NALM-6，EHEB，和EOL-1细胞系从Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH(Braunschweig，Germany)得到。从美国典型培养物中心(ATCC，Manassas，VA)得到了其它的上述细胞系。在RPMI完全培养基(含有10％胎牛血清，50μM 2-巯基乙醇，和庆大霉素)中培养所有细胞系。
如实施例I所述，用生物素化的Dl-FRIL染色这些肿瘤系，以及CCRF-SB和JM1细胞(在实施例I中描述)。Dl-FRIL以高亲合力结合测试的所有成熟的B细胞肿瘤(Daudi，RAJI，RJ.2.2.5，RAMOS，Farage，GA10，EHEB，DB，HT，CCRF，和MC116)；皮肤T淋巴瘤，HuT78和Loucy；和髓细胞肿瘤系，KG-1。Dl-FRIL以中等亲合力结合正常的人B细胞和滤泡性淋巴瘤细胞系RL。Dl-FRIL不结合EOL-1，KG-1a，THP-1，CCRF-CEM，Jurkat，SR，JM1，NALM-6和SUP-B15细胞系(表I)。
接着，对所有肿瘤细胞系测试了Dl-FRIL-介导的杀伤。在37℃，在含有递增浓度(0.312，0.625，1.25，2.5，5，10，和20μg/ml)的纯化的Dl-FRIL(即，非生物素化的FRIL)的RPMI完全培养基中孵育肿瘤细胞48小时，并使用XTT(Sigma，St.Louis)，评价细胞存活力。
图2表明，FRIL结合的亲合力与杀伤水平相应。以高亲合力结合Dl-FRIL的细胞(RAJI，HT，CCRF，和MC116)被有效地杀死；Dl-FRIL较低效率地杀死了以中等亲合力结合Dl-FRIL的细胞(RL)。更低效率地杀死了预期以比RL细胞稍微更低的亲合力结合Dl-FRIL的正常的人B细胞。
纯化的Dl-FRIL没有杀死在该测定中测试的以非常低的亲合力结合Dl-FRIL或根本不结合的3种细胞系(KG-1，SR和JM1)。Dl-FRIL没有杀死JM1细胞(一种癌性的前-B细胞系)，这可能是因为，在该细胞系体外繁殖过程中，Dl-FRIL结合的细胞表面分子的表达丧失。另一种可能是，因为JM1细胞是前-B细胞，它们不表达象更成熟的癌性的B细胞那样高水平的FRIL配体。在总结于表I中的其它研究中，证实了测试的所有成熟的B细胞肿瘤-衍生的细胞系都结合FRIL，并被FRIL杀死。
Dl-FRIL也杀死了几种T皮肤淋巴瘤系(HuT78和Loucy；表I和图3)。但是，正常的人T细胞不结合且不被Dl-FRIL杀死(图3)。令人感兴趣地，Dl-FRIL没有杀死AML细胞系KG-1，其结合FRIL(图3)。
已经测试了几种其它的肿瘤类型，包括结肠癌肿瘤系MB-231，MDA-MB-435，MX-1，T-47D，ZR-75-1；肺癌NCI-H23，NCI-H522，NCI-H69，和神经肿瘤系SNB75和U251。这些细胞系以低亲合力结合Dl-FRIL蛋白，或根本不结合，且未被杀死。但是，这些细胞可能可以以高亲合力结合其它的FRIL蛋白，并且其它的FRIL蛋白可能可以抑制这些细胞的增殖和/或存活。另外，Dl-FRIL蛋白可能可以抑制其它结肠癌、肺癌和/或神经肿瘤细胞系的增殖和/或存活。
表I
 
细胞系 分类 细胞类型 结合FRIL 被FRIL杀死
EOL-1 骨髓瘤 嗜酸性粒细胞 否 否
KG-1 AML 髓细胞 是 否
KG-1a AML 髓细胞 否 否
THP-1 单核细胞 单核细胞 否 否
CCRF-CEM T-ALL T细胞 否 否
Jurkat T白血病 T细胞 否 否
HuT78 皮肤T淋巴瘤 T细胞 是 是
Loucy 皮肤T T细胞 是 是
SR 成淋巴细胞白血病 B-细胞前体 否 否
JM1 成淋巴细胞白血病 B-细胞前体 否 否
NALM-6 B-细胞前体 否 否
SUP-B15 前B-ALL B-细胞前体 ？？ 否
RL 滤泡性淋巴瘤 成熟的B细胞 是 是
Daudi 伯基特(EBV+) 成熟的B细胞 是 是
RAJI 伯基特(EBV+) 成熟的B细胞 是 是
RJ.2.2.5 伯基特(EBV+) 成熟的B细胞 是 是
RAMOS 伯基特(EBV+) 成熟的B细胞 是 是
Farage 伯基特(EBV+) 成熟的B细胞 是 是
GA-10 伯基特(EBV-) 成熟的B细胞 是 是
EHEB 慢性淋巴细胞白血病 成熟的B细胞 是 是
DB 弥漫性大细胞 成熟的B细胞 是 是
HT 弥漫性大细胞 成熟的B细胞 是 是
CCRF-SB B-ALL 成熟的B细胞 是 是
MC116 未分化的 成熟的B细胞 是 是
外周B细胞 正常细胞 成熟的B细胞 低 低
外周T细胞 正常细胞 成熟的T细胞 否 否
表I总结了Dl-FRIL与不同的人淋巴细胞和髓细胞肿瘤细胞系的相互作用。Dl-FRIL杀死了所有的B淋巴瘤细胞系，除了JM1，NALM-6和SUP-B15以外，它们都源自前-B细胞肿瘤。除髓细胞系KG-1a以外，结合导致了杀死。
Dl-FRIL迅速杀死淋巴瘤细胞。使用Guava PCA(GuavaTechnologies，Inc.)，使用基于摄入7-AAD(一种细胞不可渗透的染料)和膜联蛋白-V(其能结合凋亡的细胞上的反转的磷脂酰丝氨酸)的细胞百分比的测定，检测了该杀死模式。数据显示在图4中，表明5μg/ml Dl-FRIL在30分钟内杀死MC116细胞，最可能通过坏死-介导的途径。不结合FRIL的JM1细胞没有表现出坏死的或凋亡的群体的增加。
这些结果表明，各种癌性的B细胞与纯化的D1-FRIL的高亲合力结合，会导致对这些细胞的有效杀死(图2)。Dl-FRIL能在接触几小时内诱导B细胞淋巴瘤的坏死。该Dl-FRIL杀伤不是补体-介导的(未显示数据)。
实施例III
Dl-FRIL对淋巴瘤细胞的杀伤是凝集素-介导的
Dl-FRIL-介导的对B淋巴瘤细胞的杀死是通过凝集素的聚糖-结合性质介导的。图5表明，用100mM或250mM竞争糖α-D-吡喃甘露糖苷(Sigma Chemical，St.Louis，MQ)预孵育Dl-FRIL，可以阻止对B淋巴瘤细胞系的杀死。
实施例IV
Dl-FRIL高效率地杀死癌性的B细胞
接着，检测了Dl-FRIL的杀伤动力学。在有0.2μg/ml或1μg/ml纯化的Dl-FRIL存在下，培养了正常的外周B细胞和MC116细胞(FRIL-敏感的B细胞非霍奇金氏淋巴瘤细胞系)。在接触后不同的时间(即，接触后30分钟，60分钟，180分钟，和360分钟)，如实施例II所述评价了存活性。
如图6所示，在接触FRIL30分钟内，甚至在亚微克/ml浓度的FRIL，观察到了癌性B细胞死亡(见图6，白色正方形)。在6小时内，在含有1.0μg/ml纯化的Dl-FRIL的培养物中超过90％的淋巴瘤细胞被杀死(图6，黑色正方形)，更长期的培养没有证实从这些培养物长出活细胞(未显示数据)。该杀死是不依赖补体的，且不是通过抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)机制介导。同样地，该杀死不依赖于血清的存在，且在含有完全胎牛血清的培养基、已知成份培养基或缺乏血清的培养基中都观测到(未显示数据)。而且，该杀死不需要放射性同位素。在亚微克/ml浓度的FRIL，也观察到了低水平的正常人B细胞的杀死(图6，白色圆形)，在更高浓度的FRIL，随时间观察到了更高水平的正常B细胞的杀死(图6，黑色圆形)。因而，FRIL表现出显著的治疗比。
实施例V
不同的FRIL蛋白对癌性B细胞的杀死
Dl-FRIL和Pv-FRIL具有类似的结合特异性和靶亲和性。因此，预期它们二者都能结合并杀死相同的或类似的细胞群体。相反地，预期其它的凝集素，包括对靶细胞不具有相同的结合特异性或不具有类似的亲和性的FRIL蛋白，不能以相同的程度(如果有的话)抑制这些靶细胞的生长或杀死这些靶细胞。关于此的一个实施例显示在图7中，该图示意性地显示了Dl-FRIL(实心的三角形)和Pa-FRIL(实心的正方形)对B细胞肿瘤系(CCRF-SB)的杀死水平。Pa-FRIL较低效率地结合B细胞淋巴瘤，且不能同样效率地杀死B细胞肿瘤系。但是，Pa-FRIL蛋白确实具有显著的和有益的作用，因此，可以用于本发明的方法中。
实施例VI
FRIL特异性地杀死癌性的B细胞
为了确定FRIL蛋白的杀死活性是否是对癌性的B细胞特异性的，通过向培养基中添加纯化的FRIL蛋白，使FRIL-不敏感的T-ALL细胞CCRF-CEM和对FRIL敏感的癌性的B细胞系MC116的混合培养物接触FRIL蛋白。经过指定的培养时间后，分析剩余的细胞。
为了该研究，在RPMI完全培养基(含有10％胎牛血清，50μM 2-巯基乙醇，和庆大霉素)中培养来自ATCC的CCRF-CEM和MC116细胞。用不能从细胞浸出的膜相互螯合染料PKH-Red(Sigma，St.Louis，MO)，标记了MC116细胞。
接着，将大约相同数量的PKH-Red标记的MC116细胞与未标记的MC116细胞或未标记的CCRF-CEM细胞相混合。使用Guava PCA(GuavaTechnologies，Inc.，Hayward，CA)，测定了培养物中PKH-Red细胞的百分比。
当在有0.1，0.5或5.0μg/ml Dl-FRIL存在下，在37℃培养FRIL-敏感的MC116细胞时，标记的和未标记的MC116细胞都被杀死，因此培养物中PKH-Red阳性细胞的百分比保持相对恒定。相反地，当在有0.1，0.5或5.0μg/ml Dl-FRIL存在下，在37℃孵育FRIL不敏感的CCRF-CEM和标记的MC116细胞时，仅仅杀死了标记的MC116细胞，培养物中PKH-Red阳性细胞的百分比降低(图8)。该实验证实，使培养物接触FRIL，能有差别地杀死癌性的B细胞。
实施例VII
FRIL杀死癌性的B细胞而对祖细胞无害
在与实施例-VI所述类似的研究中，将HT细胞与来自人类女性的脐带血细胞一起培养。通过向培养基中添加FRIL蛋白，使培养的细胞接触FRIL蛋白。培养指定的时间(例如，一周)后，计数活细胞，分析它们的DNA，以确定它们是否含有Y染色体。
接触FRIL蛋白后，剩余在培养物中的唯一活细胞是女性细胞(即，缺少Y染色体)。这些细胞是源自女性脐带血的祖细胞和正常的B细胞。祖细胞尽管被FRIL蛋白诱导进了静止态，仍然是活的，且可以在从培养基中去除FRIL蛋白后，继续增殖和/或分化。或者，可以冲洗细胞，并重新接种到缺乏FRIL蛋白的培养基中。
实施例VIII
用FRIL治疗携带淋巴瘤的动物
通过每日注射FRIL，治疗了携带经证实在体外对FRIL蛋白杀伤敏感的B或T淋巴瘤的动物，包括但不限于小鼠、大鼠、狗、猫和猴子。FRIL的剂量可以是每天0.1mg/kg至50mg/kg总体重的FRIL蛋白，在生理盐水溶液中，静脉内地或腹膜内地施用。可以以每天一次或一系列注射输送FRIL治疗，连续进行一天或多天。可以重复该治疗几个周期。肿瘤大小的减小或肿瘤生长速度的减小，表明该淋巴瘤是FRIL-敏感的。
实施例IX
用FRIL治疗患有B细胞非霍奇金氏淋巴瘤的人
从怀疑患有B细胞非霍奇金氏淋巴瘤的人对象采取含有癌性B细胞的活组织样品。使活组织样品的细胞接触FRIL蛋白，以确定它们是否对FRIL蛋白敏感(即，当接触FRIL蛋白时，细胞是否被杀死，和/或它们的生长被抑制)。
如果患者的癌性的B细胞对FRIL蛋白敏感，通过施用治疗有效量的FRIL蛋白，使患者接着接受治疗。尽管给药可以采取任何途径，在该实施例中，患者每天静脉内地接受约5μg/kg至50mg/kg总体重的在生理盐水溶液中的FRIL蛋白。用FRIL-治疗的患者的状况的改善，表明该B细胞非霍奇金氏淋巴瘤是FRIL-敏感的。
实施例X
用FRIL治疗患有B细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)的人
最初，以在第1-3天45mg/m2的柔红霉素+在第1-7天100mg/m2的阿糖胞苷治疗患有ALL的2位患者前7天。
除了柔红霉素和阿糖胞苷化疗剂外，一位患者接受治疗有效量的FRIL蛋白(例如，每天静脉内地施用5μg/kg至50mg/kg总体重的在生理盐水溶液中的FRIL蛋白)。用FRIL-治疗的患者的状况的相对改善，表明该B细胞ALL是FRIL-敏感的。
实施例XI
用FRIL治疗患有T细胞皮肤淋巴瘤的人
从怀疑患有T细胞皮肤淋巴瘤的人对象采取含有癌性T细胞的活组织样品。使活组织样品的细胞接触FRIL蛋白，以确定它们是否对FRIL蛋白敏感(即，当接触FRIL蛋白时，细胞是否被杀死，和/或它们的生长被抑制)。
如果患者的癌性的T细胞对FRIL蛋白敏感，通过施用治疗有效量的FRIL蛋白，使患者接着接受治疗。尽管给药可以采取任何途径，在该实施例中，患者每天静脉内地接受约5μg/kg至50mg/kg总体重的在生理盐水溶液中的FRIL蛋白。用FRIL-治疗的患者的状况的改善，表明该T细胞皮肤淋巴瘤是FRIL-敏感的。
序列表
SEQ ID NO：1
扁豆(Dolichos lab lab)(D11)FRIL(Moore，D1-FRIL)的DNA序列
Figure A200480038484Q00311
SEQ ID NO：2
D11-FRIL(Moore，D1-FRIL)的氨基酸序列
Figure A200480038484Q00312
SEQ ID NO：3
第二D11-FRIL(Kotlarczyk等人)的氨基酸序列
Figure A200480038484Q00313
SEQ ID NO：4
Gowda’s甘露糖凝集素的氨基酸序列
SEQ ID NO：5
Pv-FRIL的DNA序列
Figure A200480038484Q00321
SEQ ID NO：6
Pv-FRIL的氨基酸序列
Figure A200480038484Q00322

Claims (20)

1.抑制FRIL-敏感的癌细胞的增殖和/或存活的方法，包括使所述的癌细胞接触所述癌细胞对其敏感的FRIL蛋白。
2.权利要求1的方法，其中所述的FRIL-敏感的癌细胞选自B细胞淋巴瘤和T细胞皮肤淋巴瘤。
3.权利要求2的方法，其中所述的B细胞淋巴瘤源自成熟的B细胞淋巴细胞。
4.权利要求2的方法，其中所述的B细胞淋巴瘤是非霍奇金氏淋巴瘤。
5.权利要求4的方法，其中所述的非霍奇金氏淋巴瘤选自小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)，套细胞淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，伯基特-样淋巴瘤，滤泡中心细胞淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，边缘区B-细胞淋巴瘤，节边缘区B细胞淋巴瘤，节外边缘区B细胞淋巴瘤，脾边缘区B细胞淋巴瘤，淋巴浆细胞性淋巴瘤，成淋巴细胞B细胞淋巴瘤，弥漫性大B细胞淋巴瘤，纵隔大B细胞淋巴瘤和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血球。
6.权利要求2的方法，其中所述的B细胞淋巴瘤是B细胞白血病。
7.权利要求6的方法，其中所述的B细胞白血病选自B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)，前体B细胞急性淋巴细胞白血病，B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)，前体B-成淋巴细胞白血病，B细胞前淋巴细胞白血病，毛细胞白血病和伯基特细胞白血病。
8.权利要求2的方法，其中所述的B细胞淋巴瘤选自浆细胞骨髓瘤，浆细胞瘤，primary effusive淋巴瘤，弥漫性混合B细胞淋巴瘤和未分化的B细胞淋巴瘤。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述的FRIL-敏感的癌细胞是在哺乳动物体内。
10.权利要求9的方法，其中哺乳动物是人患者。
11.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述的FRIL-敏感的癌细胞是在离体的细胞培养物中。
12.确定癌细胞是否对FRIL蛋白敏感的方法，包括使所述的细胞接触FRIL蛋白，并检测所述的FRIL蛋白是否抑制所述细胞的增殖和/或存活。
13.确定患有癌症的哺乳动物对象是否将从FRIL蛋白治疗中获益的方法，包括使来自所述对象的癌细胞接触FRIL蛋白，并检测所述的FRIL蛋白是否抑制所述细胞的增殖和/或存活。
14.治疗患有FRIL-敏感的癌症的哺乳动物对象的方法，包括给所述对象施用药物组合物，其包含治疗有效量的抑制所述癌症的增殖和/或生长的FRIL蛋白。
15.在哺乳动物对象中成像、检测或定位FRIL-敏感的癌症的方法，包括给所述对象施用可检测地标记的FRIL蛋白，并成像、检测或定位所述的标记。
16.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述的FRIL蛋白选自天然的FRIL蛋白和重组的FRIL蛋白。
17.权利要求16的方法，其中所述的天然的FRIL蛋白选自天然的Dl-FRIL蛋白，天然的Pv-FRIL蛋白和天然的Pa-FRIL蛋白。
18.权利要求16的方法，其中所述的FRIL蛋白是成熟的缺乏N-末端先导序列的FRIL蛋白。
19.权利要求1-18中任一项的方法，其中所述的FRIL蛋白对应于包含在SEQ ID NO.2，3或6中的氨基酸序列。
20.FRIL蛋白在生产用于治疗FRIL-敏感的癌症的药物中的应用。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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