CN101389761A - 使用bmi-1使星形胶质细胞去分化成为神经干细胞 - Google Patents

Abstract

本发明公开了使用Bmi－1诱导星形胶质细胞去分化成为神经干细胞的组合物和方法。去分化的神经干细胞具有分化为星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞的能力。

Description

使用BMI-1使星形胶质细胞去分化成为神经干细胞

技术领域

神经干细胞(NSCs)是神经系统的祖细胞的亚型，它具有分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元的能力。从中枢神经系统(CNS)和外周神经系统(PNS)开始，神经干细胞形成多细胞神经球，它们在各自的背景条件下分化为胶质系和神经系细胞(SallyTemple等人，2001)。这些神经干细胞用于治疗不治之症，并且研究其作为细胞治疗的潜在方法。由于神经干细胞是几乎不会产生伦理问题的成体干细胞，所以对其进行了广泛研究。近来进行的关于去分化的热点研究强化了成体干细胞的重要性。成体干细胞比胚胎干细胞更容易获得，但是在其实际应用上仍有许多困难。此外，使用他人的成体干细胞时，免疫排斥反应也是一个问题。因此，使用病人自身的细胞诱导去分化可以解决当前的问题。为了这个目的，必须诱导已经分化了的细胞去分化。现在，正在进行广泛研究以使用例如细胞融合和核移植的方法来诱导去分化。在使用不同方法的另一个研究组中，Alexis J.报道了从皮肤中分离的细胞在神经干细胞培养条件下培养时具有神经干细胞的特性(Lancet2004)。此外，Toru K.成功使少突胶质细胞前体去分化成为神经干细胞(Genes & Development2004)。这个研究组自2000年起已经发表了关于此问题的文章，并且在2004年的一篇文章中报道了各阶段的基因表达与染色质重塑和组蛋白修饰有关。

背景技术

在本发明中，提出了一种解决前述所介绍方法的问题的途径，并且建立了一种适合的新使用方法。在本发明中，选择和过表达了一种已知调节NSCs性能的转录因子来研究分化为神经干细胞。被选择的因子，鉴定为“Bmi-1”，是用于调节组蛋白修饰和细胞周期调节子的蛋白质之一(Jan W.等人，1999)。据报道Cdkn2a/INK4A基因座是Bmi-1的靶点。Bmi-1已知为该靶基因的转录抑制子。近来，Bmi-1基因已报道在神经干细胞中表达且在神经干细胞的自我更新中起重要作用(Anna V.M.等人，2003，2005，In-Kyoung Park等人，2004)。

本发明者在此背景下进行了深入和彻底的研究，从而发现了其中Bmi-1的过表达会诱导已分化的星形胶质细胞去分化成为能够自我更新和分化为星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞的神经干细胞样的细胞，从而导致本发明。

发明内容

本发明的目的是提供诱导星形胶质细胞去分化成为神经干细胞的组合物，包含Bmi-1蛋白质或含有编码Bmi-1蛋白质的核苷酸序列的核酸材料。

本发明的另一个目的是提供了一种诱导星形胶质细胞去分化成为神经干细胞的方法，包含用Bmi-1蛋白质或含有编码Bmi-1蛋白质的核苷酸序列的核酸材料处理星形胶质细胞。

本发明的另一个目的是提供使用此方法制备的神经干细胞。

本发明的另一个目的是提供一种将去分化的神经干细胞分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元的方法。

附图简述

本发明的上述和其它目的、特征和其它优点将从以下的详细描述并参考附图得到更清楚地理解，其中：

图1显示了用免疫细胞化学分析的Bmi-1靶p16^Ink4a和p19^Arf的过表达；

图2显示了诱导的去分化，其中显示了球形成(A)和直接球形成(B)(当在适合于神经干细胞的条件下培养单细胞时形成直接球而仅在适合于星形胶质细胞的培养条件下贴附后在适合于神经干细胞在的条件下培养单细胞时形成球，且稳定12小时)；

图3显示了(a)用免疫细胞化学分析的神经干细胞标记物的表达，其中分化为神经干细胞(A至C)和神经干细胞样的细胞(D至F)；

图4显示了用RT-PCR检测的神经干细胞特异性标记物的表达(Ast:星形胶质细胞、NSC：神经干细胞、Ast-Bmi-1：星形胶质细胞+Bmi-1NSCLC：神经干细胞样的细胞)；和

图5显示了神经干细胞(A-C)和神经干细胞样的细胞(D-G)体外分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元。

实现本发明的最佳形式

本发明的一个方面涉及能够诱导星形胶质细胞去分化成为神经干细胞的组合物，它包含Bmi-1蛋白质或含有编码Bmi-1蛋白质的核苷酸序列的核酸材料。

如本文所用的术语“神经干细胞样的细胞”表示多能干细胞，由能分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元的体细胞去分化而来。在本发明中，神经干细胞样的细胞还描述为神经干细胞。

在本发明中新近公开当Bmi-1过表达时，即使已经分化，星形胶质细胞也可以去分化成为多能神经干细胞样的细胞。

在本发明中，Bmi-1以蛋白质或编码Bmi-1蛋白质的核酸的形式提供。

只要是来源于哺乳动物例如人、马、绵羊、猪山羊、骆驼、羚羊和狗，任何Bmi-1可用于本发明的组合物中。此外，本发明的用来去分化成为神经细胞的Bmi-1蛋白质可以是它的野生型或变异体。

术语“Bmi-1蛋白质变异体”涉及自然或人工产生的Bmi-1蛋白质，其中Bmi-1蛋白质在氨基酸序列上由于氨基酸的缺失、插入、非保守置换或保守置换或其组合而与野生型不同。变异体是具有与天然蛋白质具有相同生物活性的功能同等物，尽管它们的物理和/或化学性质有变化。优选地，变异体增强了对物理和化学环境的结构稳定性或生理活性。

在本发明的一个优选实施方案中，Bmi-1是包含编码Bmi-1蛋白质的核苷酸序列的核酸材料的形式。

编码Bmi-1蛋白质的核苷酸序列是其野生型或变异体，其中天然产生或人工合成的变异体由于碱基的缺失、插入、非保守置换或保守置换或它们的组合在氨基酸序列上与野生型不同。

编码Bmi-1蛋白质的核苷酸序列可以是包括DNA分子(基因组，cDNA)或RNA分子的单链或双链。

本发明的一个优选实施方案中，含有编码Bmi-1蛋白质的核苷酸序列的核酸材料是允许Bmi-1蛋白质表达的载体。

如本文所用的术语“载体”涉及含有DNA序列的DNA构建体，所述DNA序列可操作性的连接于能够影响所述DNA在适合的宿主细胞中表达的调控序列上。

如本文所用的术语“可操作性的连接”涉及核酸表达调控序列和编码靶蛋白质的第二核酸序列间的功能性连接从而能完成一般的功能。与重组载体的可操作性的连接可使用本领域众所周知的基因重组技术制备，并且位点特异的DNA断裂和连接可使用本领域公知的酶进行。

适合于本发明使用的载体包括信号序列或用于膜定向或分泌的引导序列和表达调控元件，例如启动子、操纵子、起始密码子、终止密码子、多腺苷酸化信号和增强子，并且可根据它们的目的构建成多种形式。载体的启动子可以是组成型或是诱导型。此外，表达载体包括选择性的标记物，所述标记物允许选择含有载体的宿主细胞，并且可复制的表达载体包括复制起始点。此载体可以是自我复制的，或者可以是整合至宿主细胞的DNA上。

能在本发明中使用的载体可以是质粒载体、粘粒载体或病毒载体，优选病毒载体。病毒载体的实例包括但是不限制于来源于逆转录病毒例如HIV(人免疫缺陷病毒)、MLV(鼠白血病病毒)、ASLV(禽肉瘤病毒)、SNV(脾坏死病毒)、RSV(劳斯肉瘤病毒)、MMTV(小鼠乳腺瘤病毒)等等、腺病毒、腺伴随病毒和单纯疱疹病毒的载体。在本发明的一个实际实施例中，使用pBabe puro载体，它来源于基于莫洛尼氏白血病病毒的病毒载体，携带嘌呤霉素的选择性标记。

含有编码Bmi-1蛋白质的核苷酸序列的核酸材料可以以载体的形式作为裸露DNA(Wolff等人，Science，247：1465-8，1990；Wolff等人，J.Cell Sci.103：1249-59，1992)，或在脂质体或阳离子聚合物的帮助下引入细胞。为了在基因转染中使用，脂质体是阳离子磷脂例如DOTMA和DOTAP制成的磷脂膜。当与负电荷核苷酸以一定比例混合时，阳离子脂质体形成核酸-脂质体复合物。

在本发明的另一个优选实施方案中，含有编码Bmi-1蛋白质的核苷酸序列的核酸材料可以是其中表达Bmi-1蛋白质的病毒。

如本文所用的术语“病毒”涉及用携带编码Bmi-1蛋白质的核苷酸序列的病毒载体转化或转染包装细胞而制备的Bmi-1表达病毒。

根据本发明的Bmi-1表达病毒的制备中所使用的病毒实例包括但是不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒和单纯疱疹病毒。优选逆转录病毒。在以下实施例中，Bmi-1表达病毒通过将携带编码Bmi-1蛋白质(pBabe puro Bmi-1)的核苷酸序列的重组pBabepuro载体转化至PT67包装细胞中制备。

本发明的另一方面涉及星形胶质细胞去分化成为神经干细胞的方法，包含用Bmi-1蛋白质或含有编码Bmi-1蛋白质的核苷酸序列的核酸材料处理。

更详细地，此方法包含步骤(i)在培养基中培养星形胶质细胞；(ii)用Bmi-1蛋白质或含有编码Bmi-1蛋白质的核苷酸序列的核酸材料处理培养基；和(iii)诱导星形胶质细胞去分化成为神经干细胞。

任何用于培养神经干细胞的常规培养基可以用作在步骤(i)中星形胶质细胞的培养基。培养基通常含有碳源、氮源和微量元素组分。此外，培养基可包括抗生素，例如青霉素、链霉素和庆大霉素。培养基优选含有bFGF。

步骤(ii)中用于处理细胞的Bmi-1蛋白质或含有编码Bmi-1蛋白质的核苷酸序列的核酸材料如上所述。

本发明的另一方面涉及用前所述方法制备的神经干细胞。

已证实通过根据本发明的去分化制备的神经干细胞表达同样水平的神经干细胞特异性标记物巢蛋白、CD133和Sox2，并且具有与一般神经干细胞相同的分化能力。通过根据本发明的去分化制备的神经干细胞还显示了自我更新特征。

本发明的另一方面还涉及根据前述方法的去分化得到的神经干细胞分化成为星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元的方法。

当使用本发明的组合物和方法去分化的神经干细胞被置于各自分化的条件下时，分化为星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞可通过检测特异于各自细胞的标记物表达来监测。

本发明的更好理解可通过以下实施例获得，它们用于理解而不用于限制本发明。

实施例1：实验方法

1.鼠星形胶质细胞和鼠神经干细胞的培养

分离自E13.5CNS的鼠星形胶质细胞在适当的条件下培养。它们在补充10％FBS(HyClone)、1％青霉素/链霉素和1％L-谷氨酰胺(Cambrex)的改良的Eagle’s培养基(DMEM(高糖，HyClone))中培养前用胰岛素处理(Gibco0.05％)。从第二天起，每天用新鲜培养基更换一次培养基。使用一代和三代间的细胞。神经干细胞分离自鼠(E13.5)并且作为对照在补充B27血清取代(Gibco)、人重组碱性FGF和人重组EGF(R&D)、含有胰岛素(Sigma)、转铁蛋白(Sigma)、硒(Sigma)、孕酮(Sigma)和青霉素/链霉素(Cambrex)的Dulbecco’改良的Eagle’s培养基/F12(DMEM/F12，Gibco)中培养。

2.逆转录病毒介导的感染

pBabe puro Bmi-1(用插入人Bmi-1(NCBI登记号：L13689NM_024865)至pBabe puro载体中制备)和pBabe puro使用Lipofectamine(Invitrogen)转染至PT67包装细胞株(Clontech)中且在嘌呤霉素(3μg/ml)(BD science)存在下选择。转化细胞株生长至90％或更高覆盖度(confluency)后，上清液通过滤器(0.45μm)(Millipore)以除去细胞碎片，然后使上清液重复感染星形胶质细胞，使用凝聚胺(polybrene(Sigma)在间隔10小时时进行分离。随后在嘌呤霉素(0.5μg/ml)存在下进行选择。

3.蛋白质印迹分析和半定量PCR

使用RIPA缓冲液使全部的细胞提取物从细胞中分离出来，随后用Branford检测法(Bio-rad)确定其中的蛋白质浓度。每50μg的细胞提取物进行10％或4～12％预制SDS-PAGE(Invitrogen)。由此将被分离的蛋白质转移至PVDF膜(Millipore)上且用3～5％脱脂乳TBST封闭。用anti-Bmi-1(Upstate)、anti-p16^INK4A(Santacruz)、anti-p19^ARF(Novous)和α-微管蛋白(sigma)在4℃振动过夜培养，随后与HRP缀合的抗鼠IgG、抗兔IgG(Zymed)在室温反应。Supersignal West Pico试剂盒(Pierce)用于检测。

使用Trizol(Invitrogen)使全部RNA从每个细胞株中分离处来。在寡聚d(T)12-18-mer(Invitrogen)存在下使用Superscriptase II逆转录酶(Invitrogen)从500ng总RNA中合成cDNA。用1μl cDNA在10pmol每个适合的引物存在下用PCR预先混合液(1U Tag DNA聚合酶、250μM dNTPs、10mM Tris-HCl、40mM KCl和1.5mM MgCl₂Bioneer，Korea)进行RT-PCR。用于RT-PCR的引物适合于扩增鼠标记物GAPDH、巢蛋白和Sox2，它们的碱基序列如下显示。

用于鼠GAPDH的引物

正向：5’-GATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3’(SEQ ID NO.:1)

反向：5’-GTTGCTGTAGCCGTATTCATTGTC-3’(SEQ ID NO.:2)

用于鼠巢蛋白的引物

正向：5’-GGCATCCCTGAATTACCCAA-3’(SEQ ID NO.:3)

反向：5’-AGCTCATGGGCATCTGTCAA-3’(SEQ ID NO.:4)

用于鼠sox2的引物

正向：5’-AGTGGTACGTTAGGCGCTTC-3’(SEQ ID NO.:5)

反向：5’-TGCCTTAAACAAGACCACGA-3’(SEQ ID NO.6)

4.诱导去分化

在与用于神经干细胞的相同的培养条件下诱导去分化。细胞培养使用两种不同的方法来进行。细胞以1×10⁵个细胞/孔的密度接种于6孔板上并培养12小时，随后将培养基换为补充B27无血清(Gibco)、人重组碱性FGF和人重组EGF(R&D)、含有胰岛素(Sigma)、转铁蛋白(Sigma)、硒(Sigma)、孕酮(Sigma)和青霉素/链霉素(Cambrex)的新鲜Dulbecco’s modified Eagle’s培养基/F12(N2)(DMEM/F12，Gibco)。细胞每天用bFGF处理，且培养基每隔一天一次换为新鲜培养基。或者，已在适当条件下培养的细胞用胰蛋白酶作用且以3×10⁵个细胞的密度接种至60mm细菌培养平板上。补充B27无血清(Gibco)、人重组碱性FGF和人重组EGF(R&D)、含有胰岛素(Sigma)、转铁蛋白(Sigma)、硒(Sigma)、孕酮(Sigma)和青霉素/链霉素(Cambrex)的新鲜Dulbecco’s modified Eagle’s培养基/F12(N2)(DMEM/F12，Gibco)用作培养基。

5.通过免疫细胞化学测定过表达和各自的标记物

用4％多聚甲醛(EMS)在4℃固定1小时后，神经球在20％蔗糖中振动培养过夜。然后，神经球使用OCT化合物超低温冷藏于8孔小室载玻片(Nunc)中且在染色前切成8～10μm厚。用含有10％正常羊血清(Jackson ImmunoResearch)+0.1％BSA(Sigma)+0.3％Triton X-100(Sigma)的PBS封闭后，切片用抗-巢蛋白(Chemicon)、抗-CD133(MACS)和抗-Sox2(Sigma)在4℃培养过夜然后用抗-小鼠-cy3(Jackson ImmunoResearch)、抗-兔-FITC(分子探针Molecular probe)和抗-山羊-cy3(Zymed)室温培养，最后用DAPI(Sigma)核染色。蔡司共焦透镜(confocal lens)(卡尔蔡司Carl Zeiss)用于染色后的检查。分化的细胞以与上述相同的方式染色。在这方面，抗-GFAP(Dako)、抗-S100β(Zymed)、抗-β-微管蛋白III(Covance)、抗-Map2a(Sigma)、抗-TH(Sigma)、抗-O4(R&D)和抗-CNPase(Chemicon)用作抗体。

6.体外分化

用PLO(聚L-鸟氨酸)(Sigma)和层粘连蛋白或纤维结合素(Sigma)包被后，细胞在下面给出的分化条件下培养。

为了分化成为星形胶质细胞，细胞培养在补充10％FBS(HyClone)的DMEM(HyClone，高糖)中在人重组bFGF和EGF(R&D)或CNTF(重组大鼠睫状节神经细胞营养因子)(Upstate)存在下进行5～7天。

通过在含有N2和B27无血清、补充人重组FGF的培养基中培养细胞4天然后在无FGF培养基中培养8天诱导其分化为神经元。或者，细胞在1～10μm RA(维甲酸，Sigma)作为分化诱导剂存在下培养7～14天。作为其它选择，细胞在1～10mM VPA(丙戊酸，Sigma)和1～10μm RA(维甲酸，Sigma)的共存在下培养7～14天以诱导分化成为神经元。

通过在补充B27无血清的N2培养基中在PDGF-AA(血小板衍生生长因子-AA，R&D)、T3(3，3，5-三碘-L-甲腺原氨酸，Sigma)、人重组碱性FGF和EGF(R&D)的存在下培养诱导分化为少突胶质细胞。

当在前述分化条件下培养时，监测细胞的形态学和使用特异于各自分化标记物的抗体进行免疫细胞化学以检测分化是否正确进行。

实施例2：结果

Bmi-1基因使用逆转录病毒载体转导系统在已分化的小鼠星形胶质细胞中过表达。当Bmi-1靶基因p16^Ink4a和p19^Art不表达时Bmi-1基因的过表达通过蛋白质印迹分析证实(图1)。

然后，使用用于培养神经干细胞的条件诱导去分化。星形胶质细胞以1×10⁵个细胞/孔的密度接种于6孔板上，12小时后，细胞在适合于神经干细胞的条件下培养。培养3-4天内，观察到细胞具有神经干细胞样的形态。当细胞以3×10⁵个细胞/板的密度接种于60mm细菌平板上且在与神经干细胞相同的条件下培养时，还观察到它们具有神经干细胞的形态。相反，当培养用对照载体pBabe puro EGFP转染的细胞时，没有形成神经球(图2)。在第6天，观察到神经球具有与当神经干细胞转移至新平板和在其上培养时相同的形态。为了检测用Bmi-1基因去分化的细胞是否能够自我更新，进行亚球(subsphere)形成检测。结果是一周后在单细胞中形成了球(数据未列出)。

为了发现这些细胞是否具有与神经干细胞相同的特性，使用各自的标记物进行免疫细胞化学。在这方面，主要大量表达于神经干细胞的标记物巢蛋白、CD133和Sox2还在染色后在神经干细胞样的细胞中观察到。此外，因此形成的神经球的冷冻切片确证了巢蛋白、CD133和Sox2的表达(图3)。

此外，通过RT-PCR分析，均表达于神经干细胞的巢蛋白和Sox2发现表达于根据本发明的去分化的细胞中。因此，判断根据本发明去分化的细胞是神经干细胞样的细胞(图4)。

为了检测神经干细胞样的细胞是否能像神经干细胞一样进行分化，以与上述相同的方式诱导分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元。通过用针对各自标记物的特异性抗体的分析，发现神经干细胞样的细胞像神经干细胞一样分化为细胞的三种类型。用GFAP和S100的表达来鉴别分化为星形胶质细胞，用β-微管蛋白III(Tuj1)和Map2a的表达鉴别分化为神经元，和用O4和CNPOase的表达来鉴别分化为少突胶质细胞(图5)。

总之，通过此研究获得的数据说明Bmi-1基因在将星形胶质细胞去分化为神经干细胞样的细胞中起着重要作用，并且这些去分化的神经干细胞样的细胞可以分化回星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元。

工业应用

如前描述，Bmi-1在诱导星形胶质细胞去分化成为神经干细胞中是有用的，并且去分化的神经干细胞可用于多种疾病的治疗。

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<400>1

<210>2

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>特异于GAPDH的反向引物

<400>2

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>特异于巢蛋白的正向引物

<400>3

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>特异于巢蛋白的反向引物

<400>4

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>特异于SOX2的正向引物

<400>5

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>特异于SOX2的反向引物

<400>6

Claims (10)

1.诱导星形胶质细胞去分化成为神经干细胞的组合物，包含Bmi-1蛋白质或含有编码Bmi-1蛋白质的核苷酸序列的核酸材料。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述的含有编码Bmi-1蛋白质的核苷酸序列的核酸材料是允许Bmi-1蛋白质表达的载体。

3.如权利要求1所述的组合物，其中所述的含有编码Bmi-1蛋白质的核苷酸序列的核酸材料是表达Bmi-1蛋白质的病毒。

4.如权利要求1所述的组合物，其中所述的去分化的神经干细胞具有分化为星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞的能力。

5.通过用Bmi-1蛋白质或含有编码Bmi-1蛋白质的核苷酸序列的核酸材料处理星形胶质细胞诱导星形胶质细胞去分化成为神经干细胞的方法。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述的去分化的神经干细胞具有分化为星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞的能力。

7.如权利要求5所述的方法，包含步骤：

(i)在培养基中培养星形胶质细胞；

(ii)用所述的Bmi-1蛋白质或所述的核酸材料处理所述的星形胶质细胞；和

(iii)诱导所述星形胶质细胞分化为神经干细胞。

8.如权利要求7所述的培养基，其中所述步骤(i)中的培养基中含有bFGF。

9.神经干细胞，使用权利要求5所述的方法制备。

10.使用权利要求5所述的方法所制备的神经干细胞分化为星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞的方法。

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