CN101386836B - 动物细胞培养基干粉组合物、培养基组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种动物细胞培养基干粉组合物，与现有的通过引入重组蛋白或动物来源组分来降低动物血清用量的动物细胞培养基干粉组合物相比，由于本发明的动物细胞培养基干粉组合物，无需额外引入蛋白成分(例如重组蛋白、植物蛋白或动物来源组分如细胞因子等)，就能配合低含量动物血清使用达到与高含量动物血清持平甚至更好的促进动物细胞生长的作用，因此本发明的动物细胞培养基干粉组合物不产生伴随蛋白成分的副作用，安全性好且成本低。用本发明的动物细胞培养基干粉组合物培养的细胞，不同批次差异小，成本低，利于分离细胞下游产品、安全性好，适于用作生产疫苗等生物制品的病毒宿主、表达载体等。

Description

动物细胞培养基干粉组合物、培养基组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及细胞培养基干粉组合物、细胞培养基组合物以及它们的制备方法，尤其涉及动物细胞培养基干粉组合物、动物细胞培养基组合物以及它们的制备方法。

背景技术

现有的动物细胞培养中，一般将动物细胞培养基干粉组合物分散于载剂(如重蒸水)中形成液体培养基组合物，然后与终浓度至少10体积％的动物血清配合使用；或者将不含动物血清的动物细胞液体培养基组合物与终浓度至少10体积％的动物血清配合使用；或者直接使用包括终浓度至少10体积％的动物血清的液体培养基组合物，才能保证细胞的正常生长传代。

然而动物血清是成分不明确的复杂混合物。一方面动物血清含有例如，携带激素、矿物质、微量元素、脂类物质的转运蛋白；细胞贴壁因子和扩散因子等可以促进细胞生长、稳定解毒、维持培养基的pH值，并抑制蛋白酶直接或间接的酶解。但另一方面，动物血清存在很多问题例如，添加及补充过程中导致培养基pH值变化大，存储过程中易受其他微生物污染，低温贮存解冻后易产生沉淀，不同批次差异大，成本高，以及难以从细胞下游产品中去除、安全性差等。

因此存在动物细胞培养基中尽量不用或少用动物血清的趋势。现有技术一般通过额外添加胰岛素、重组胰岛素、人源转铁蛋白、牛血清白蛋白、细胞因子、生长因子等重组蛋白和动物来源成分，来降低使用动物血清的量，例如CN 1723277中公开了一种源自肌肉组织的祖细胞/干细胞的培养基组合物，该组合物中添加了胰岛素、FGF型生长因子，可以降低人血清的使用量。但是重组蛋白和动物来源成分对生物制品(比如疫苗)的安全性有很大影响，比如重组蛋白和动物来源成分引起过敏反应等。

综上，需要配合低含量动物血清(终浓度小于10体积％)使用的动物细胞培养基干粉组合物或不含动物血清的动物细胞液体培养基组合物，或者低含量动物血清(终浓度小于10体积％)的动物细胞液体培养基组合物。

发明内容

本发明的目的是克服现有动物细胞培养基干粉组合物必须与高含量动物血清配合使用才能促进动物细胞生长、安全性差的缺点，提供一种动物细胞培养基干粉组合物，该组合物配合低含量的动物血清浓度就能促进动物细胞生长、安全性好。

本发明的第二个目的是提供上述动物细胞培养基干粉组合物的制备方法。

本发明的第三个目的是提供包括上述动物细胞培养基干粉组合物的动物细胞培养基组合物。

本发明的第四个目的提供包括上述动物细胞培养基干粉组合物的动物细胞培养基组合物的制备方法。

本发明的发明人意外地发现，仅仅将动物细胞培养基干粉组合物按照表1的组分和含量范围进行调整，加入载剂并与低含量动物血清(终浓度1至小于10体积％)配合使用，就能达到含重组蛋白和动物来源成分的动物细胞培养基与低含量动物血清配合使用(终浓度1体积％至小于10体积％)、或者现有动物细胞培养基与高含量动物血清(终浓度至少10体积％)配合使用的同样的促进细胞生长作用。

本发明提供了一种动物细胞培养基干粉组合物，其中，该动物细胞培养基干粉组合物包括下表1所示的组分：

表1

组分	重量份	组分	重量份
				L-丙氨酸	80-120	四水合硝酸钙	30-80
L-精氨酸盐酸盐	180-210	氯化钾	320-500
				L-天门冬氨酸	5-30	无水硫酸镁	40-80
L-天门冬酰胺	30-60	氯化钠	6000-8000
				L-半胱氨酸盐酸盐	10-30	无水磷酸氢二钠	300-400
L-谷氨酸	100-150	七水硫酸亚铁	0.1-1
				L-谷氨酰胺	200-500	七水合硫酸锌	0.2-3
L-组氨酸盐酸盐	20-50	D-葡萄糖	1000-3000
				L-羟脯氨酸	2-15	谷胱甘肽	0.2-2
L-异亮氨酸	90-150	丙酮酸钠	20-120
				L-亮氨酸	10-70	抗坏血酸	1-10
L-赖氨酸盐酸盐	100-200	氯化胆碱	5-25
				L-蛋氨酸	10-50	D-泛酸钙	1-10
L-苯丙氨酸	10-50	叶酸	2-10
				L-脯氨酸	20-60	烟酰胺	1-5
L-丝氨酸	20-60	盐酸吡哆醇	1-10
				L-苏氨酸	60-100	核黄素	0.2-2

组分	重量份	组分	重量份
				L-色氨酸	10-50	盐酸硫胺	1-10
L-缬氨酸	30-70	维生素B12	1-10
				L-酪氨酸	30-80	六水合氯化镁	40-100
甘氨酸	30-80	次黄嘌呤	1-10
				L-胱氨酸盐酸盐	30-80	胸苷	0.1-2
无水氯化钙	30-80	无水磷酸二氢钾	20-100
				无水磷酸二氢钠	30-80

本发明还提供了上述动物细胞培养基干粉组合物的制备方法，该方法包括将本发明所述的动物细胞培养基干粉组合物的组分分散在分散剂中，移除所得混合物中的分散剂。

本发明还提供了一种动物细胞培养基组合物，该组合物包括动物细胞培养基干粉组合物及其载剂，其中，所述动物细胞培养基干粉组合物选自本发明所述的动物细胞培养基干粉组合物中的一种或几种。

本发明还提供了上述动物细胞培养基组合物的制备方法，该方法包括将动物细胞培养基干粉组合物分散在载剂中，过滤灭菌，其中，所述动物细胞培养基干粉组合物选自本发明所述的动物细胞培养基干粉组合物中的一种或几种。

与现有的通过引入重组蛋白或动物来源组分来降低动物血清用量的动物细胞培养基干粉组合物相比，由于本发明的动物细胞培养基干粉组合物，无需额外引入蛋白成分(例如重组蛋白、植物蛋白或动物来源组分如细胞因子等)，能配合低含量动物血清使用达到与高含量动物血清持平甚至更好的促进动物细胞生长的作用，因此本发明的动物细胞培养基干粉组合物不产生伴随蛋白成分的副作用，安全性好且成本低。用本发明的动物细胞培养基干粉组合物培养的细胞，不同批次差异小，成本低，利于分离细胞下游产品、安全性好，适于用作生产疫苗等生物制品的病毒宿主、表达载体等。

附图说明

图1为使用本发明实施例1的动物细胞培养基干粉组合物、并配合低动物血清浓度(3体积％小牛血清)培养72小时的Vero细胞的照片；

图2为使用对比例1的动物细胞培养基干粉组合物、并配合高动物血清浓度(10体积％小牛血清)培养72小时的Vero细胞的照片；

图3为使用CN 1723277培养基组合物(含有细胞因子+激素+低血清浓度3体积％小牛血清)培养72小时的Vero细胞的照片；

图4为使用对比例1的动物细胞培养基干粉组合物、并配合低动物血清浓度(3体积％小牛血清)培养72小时的Vero细胞的照片；

图5为使用实施例5的动物细胞培养基组合物(含2.9体积％小牛血清)培养72小时的CHO细胞的照片。

具体实施方式

本发明提供了一种动物细胞培养基干粉组合物，其中，该动物细胞培养基干粉组合物包括下表1所示的组分：

表1

组分	重量份	组分	重量份
				L-丙氨酸	80-120	四水合硝酸钙	30-80
L-精氨酸盐酸盐	180-210	氯化钾	320-500
				L-天门冬氨酸	5-30	无水硫酸镁	40-80
L-天门冬酰胺	30-60	氯化钠	6000-8000
				L-半胱氨酸盐酸盐	10-30	无水磷酸氢二钠	300-400
L-谷氨酸	100-150	七水硫酸亚铁	0.1-1
				L-谷氨酰胺	200-500	七水合硫酸锌	0.2-3
L-组氨酸盐酸盐	20-50	D-葡萄糖	1000-3000
				L-羟脯氨酸	2-15	谷胱甘肽	0.2-2
L-异亮氨酸	90-150	丙酮酸钠	20-120
				L-亮氨酸	10-70	抗坏血酸	1-10
L-赖氨酸盐酸盐	100-200	氯化胆碱	5-25
				L-蛋氨酸	10-50	D-泛酸钙	1-10
L-苯丙氨酸	10-50	叶酸	2-10
				L-脯氨酸	20-60	烟酰胺	1-5
L-丝氨酸	20-60	盐酸吡哆醇	1-10
				L-苏氨酸	60-100	核黄素	0.2-2

组分	重量份	组分	重量份
				L-色氨酸	10-50	盐酸硫胺	1-10
L-缬氨酸	30-70	维生素B12	1-10
				L-酪氨酸	30-80	六水合氯化镁	40-100
甘氨酸	30-80	次黄嘌呤	1-10
				L-胱氨酸盐酸盐	30-80	胸苷	0.1-2
无水氯化钙	30-80	无水磷酸二氢钾	20-100
				无水磷酸二氢钠	30-80

优选所述细胞培养基干粉组合物包括下表2所示的组分：

表2

组分	重量份	组分	重量份
				L-丙氨酸	90-110	四水合硝酸钙	30-60
L-精氨酸盐酸盐	190-210	氯化钾	320-400
				L-天门冬氨酸	5-20	无水硫酸镁	50-70
L-天门冬酰胺	30-50	氯化钠	6500-7500
				L-半胱氨酸盐酸盐	10-15	无水磷酸氢二钠	300-380
L-谷氨酸	100-120	七水硫酸亚铁	0.1-0.5
				L-谷氨酰胺	300-500	七水合硫酸锌	0.2-1.5
L-组氨酸盐酸盐	30-50	D-葡萄糖	2000-3000
				L-羟脯氨酸	2-10	谷胱甘肽	0.6-1.5
L-异亮氨酸	90-120	丙酮酸钠	50-100
				L-亮氨酸	30-70	抗坏血酸	2-7
L-赖氨酸盐酸盐	100-180	氯化胆碱	10-16

组分	重量份	组分	重量份
				L-蛋氨酸	20-50	D-泛酸钙	2-6
L-苯丙氨酸	30-50	叶酸	3-6
				L-脯氨酸	40-60	烟酰胺	2-4
L-丝氨酸	40-60	盐酸吡哆醇	2-6
				L-苏氨酸	60-80	核黄素	0.5-1
L-色氨酸	10-30	盐酸硫胺	2-5
				L-缬氨酸	40-70	维生素B12	3-7
L-酪氨酸	30-50	六水合氯化镁	50-80
				甘氨酸	30-60	次黄嘌呤	1-4
L-胱氨酸盐酸盐	40-60	胸苷	0.5-1
				无水氯化钙	60-80	无水磷酸二氢钾	50-90
无水磷酸二氢钠	40-70

优选所述细胞干粉组合物还可以包括1-3重量份的亚油酸、1-3重量份的维生素D2、1-3重量份的维生素K3和2-10重量份的酚红中的一种或几种。其中，亚油酸、维生素D2和维生素K3可以进一步促进细胞的生长；酚红作为pH值指示剂加入，可以通过目测随时掌握细胞的生长情况。更优选所述细胞干粉组合物还可以包括1.5-2重量份的亚油酸、1.5-2重量份的维生素D2、1.5-2重量份的维生素K3和3-5重量份的酚红中的一种或几种。

制备动物细胞培养基干粉组合物可以使用干法和湿法两类方法。所谓干法指在干燥的条件下混合固体组分的粉末(比如利用球磨机球磨混合)。使用干法时，优选首先按照构成培养基干粉组合物的各个组分的性质对它们分别干燥。比如将无水磷酸二氢钠、氯化钾、无水硫酸镁、氯化钠、无水磷酸氢二钠、无水磷酸二氢钾可以在100-120℃，优选100-105℃下干燥1-5小时；将L-丙氨酸、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-色氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-酪氨酸、甘氨酸、L-胱氨酸盐酸盐在30-80℃优选35-50℃下干燥1-3小时；无水磷酸二氢钾将四水合硝酸钙、谷胱甘肽、七水硫酸亚铁、七水合硫酸锌、丙酮酸钠放入真空干燥箱内抽真空干燥10小时以上。所谓湿法指将可以形成动物细胞培养基干粉组合物的固体组分与分散剂混合，然后移除所得混合物的分散剂。还可以将干法与湿法结合，即将一部分固体组分用湿法混合，移除分散剂后，用干法与其余部分的固体组分混合。

本发明还提供了一种动物细胞培养基干粉组合物的优选制备方法，该方法包括该方法包括将本发明所述的动物细胞培养基干粉组合物的组分分散在分散剂中，移除所得混合物中的分散剂。所述动物细胞培养基干粉组合物的组分在分散剂中的分散可以通过本领域常用的各种分散方法实现，比如搅拌、超声振荡等。

所述分散剂可以选自本领域用于制备动物细胞培养基干粉组合物的各种分散剂。所述分散剂的作用是使动物细胞培养基干粉组合物的各种组分均匀地混合，一般对分散剂没有特别的要求，只要不引入新的影响细胞生长的离子、污染杂质(如内毒素、微生物等)，不改变该动物细胞培养基干粉组合物溶于载剂后的适宜细胞生长的pH值范围、在不破坏培养基组分的前提下容易去除即可。因此所述分散剂优选选自蒸馏水、去离子水、注射用水、重蒸水、超纯水、能与水以任意比互溶的醇、碱性水溶液和酸性水溶液中的一种或几种，其中所述碱性水溶液为氨水或者本发明所述的动物细胞培养基干粉组合物中出现的阳离子的碱的水溶液，所述酸性水溶液为本发明中所述的动物细胞培养基干粉组合物出现的酸根离子的酸的水溶液。所述能与水以任意比互溶的醇可以为乙醇、甲醇、丙醇中的一种或几种。所述碱性水溶液优选氢氧化钠的水溶液、氢氧化钾的水溶液、氢氧化钙的水溶液、氨水、碱性氨基酸的水溶液中的一种或几种，最优选氢氧化钠的水溶液。所述酸性水溶液优选盐酸溶液、硫酸的水溶液、硝酸的水溶液、有机酸(碳酸、草酸、琥珀酸、苹果酸、丙酮酸、磷酸、酸性氨基酸)的水溶液中的一种或几种，最优选盐酸的水溶液。

本发明对构成动物细胞培养基干粉组合物的各个组分加入分散剂中的顺序没有特别的要求。此外，可以将构成动物细胞培养基干粉组合物的各种组分分散在同一种分散剂中，也可以将不同组分分散在不同的分散剂中，然后混合得到的分散体。优选后者，例如优选将胸苷、次黄嘌呤分散于1-10重量％的氢氧化钠的水溶液(氢氧化钠的水溶液优选用重蒸水配制)中，可以适当加热至60℃；将亲脂性物质(如维生素K3、维生素D2)先分散于低沸点亲水小分子有机溶剂(如乙醇)中。对于所述培养基组合物中含量很少的组分(比如含量不超过10重量份的组分)，在制备时，可以先用分散剂配制该组分的高浓度液体分散体，然后按照最终培养基干粉组合物中该组分所需的定量以该高浓度液体分散体的形式使该组分与其他组分混合。所用分散剂的温度不应高于被分散组分的最低分解温度。

所述分散剂的用量没有特别的限制，只要能使培养基干粉组合物的组分与分散剂形成均一稳定的分散体即可；另外，在满足前述条件的前提下，出于能耗的考虑，分散剂的用量越少越好。

可以采用本领域常用的方法除去分散剂，比如干燥。所述干燥可以为加热、真空干燥、真空冷冻干燥、干燥剂(如硅胶、氧化铝凝胶、分子筛、活性炭、骨炭、木炭、活性白土、五氧化磷、生石灰、氯化钙等)吸湿等。

本发明还提供了一种动物细胞培养基组合物，该组合物包括动物细胞培养基干粉组合物及其载剂，其中，所述动物细胞培养基干粉组合物本发明所述的动物细胞培养基干粉组合物中的一种或几种。

所述载剂可以选自本领域用作培养细胞的各种载剂，优选选自蒸馏水、去离子水、注射用水、重蒸水和超纯水中的一种或几种，更优选所述载剂为注射用水和/或超纯水。所述载剂的用量为600000-1500000重量份，优选为800000-1200000重量份，更优选为1000000重量份。所述载剂的单位重量份与表1和表2中各个组分所采用的单位重量份相同。

所述动物细胞培养基组合物还可以包括终浓度为1体积％至小于10体积％的动物血清，优选包括终浓度为3体积％至5体积％的动物血清。所述动物血清可以是牛血清(如胎牛血清)、马血清、兔血清、猴血清和人源血清中的一种或几种。

本发明的动物细胞培养基组合物可以将本发明动物细胞培养基干粉组合物的组分，一一称量，然后分散在相同的载剂中；或者使所述动物细胞培养基干粉组合物的组分分别分散在不同载剂中，然后混合不同的分散体。对于所述培养基组合物中含量很少的组分(比如含量不超过10重量份的组分)，在制备时，可以先用载剂配制该组分的高浓度液体分散体，然后按照最终液体培养基中组分所需的定量以该高浓度液体分散体的形式添加该组分。所用载剂的温度不应高于被分散组分的最低分解温度。更优选本发明提供的动物细胞培养基组合物的制备方法，该方法包括将动物细胞培养基干粉组合物分散在载剂中，过滤灭菌，其中，所述动物细胞培养基干粉组合物选自本发明所述的动物细胞培养基干粉组合物中的一种或几种。优选该方法还包括，在过滤灭菌前，向分散有所述培养基干粉组合物的载剂中加入终浓度为1体积％至小于10体积％的动物血清，更优选加入包括终浓度为3重量％至5重量％的动物血清。所述过滤灭菌的方法为本领域公知，可以采用孔径不大于0.22μm的滤菌膜，进行一次或几次过滤。所述动物细胞培养基干粉组合物在载剂中的分散可以通过本领域常用的各种分散方法实现，比如搅拌、超声振荡等。

本发明的动物细胞培养基干粉组合物、动物细胞培养基组合物(液体)对能够培养的细胞没有特别的限制，可以培养体细胞(如Vero细胞)或生殖细胞(CHO细胞)，原代细胞(如地鼠肾细胞)或传代细胞(恒河猴肾细胞MA-104)，癌细胞如hela细胞、正常细胞以及经过基因工程修饰的细胞(杂交瘤细胞)或经过人工选育的细胞(如BHK21细胞)。

除非特别说明，本发明使用的各种试剂均可以商购，也可以采用本领域常用的方法制备。用于细胞培养的试剂，不仅纯度要求高，优选分析纯，而且不能存在任何影响细胞正常生理活动的物质，因此还需要符合医药制品的要求，优选注射级原料药。

以下结合实施例，进一步说明本发明。

实施例1

本实施例用于说明本发明的动物细胞培养基干粉组合物及其制备方法。

表3

组分	mg/L	组分	mg/L
				L-丙氨酸	90	四水合硝酸钙	50
L-精氨酸盐酸盐	200	氯化钾	400
				L-天门冬氨酸	20	无水硫酸镁	43
L-天门冬酰胺	30	氯化钠	6400
				L-半胱氨酸盐酸盐	20	无水磷酸氢二钠	320

组分	mg/L	组分	mg/L
				L-谷氨酸	130	七水硫酸亚铁	0.2
L-谷氨酰胺	300	七水合硫酸锌	0.3
				L-组氨酸盐酸盐	30	D-葡萄糖	2000
L-羟脯氨酸	10	谷胱甘肽	0.3
				L-异亮氨酸	120	丙酮酸钠	50
L-亮氨酸	30	抗坏血酸	3
				L-赖氨酸盐酸盐	150	氯化胆碱	15
L-蛋氨酸	20	D-泛酸钙	3
				L-苯丙氨酸	30	叶酸	5
L-脯氨酸	40	烟酰胺	5
				L-丝氨酸	30	盐酸吡哆醇	3
L-苏氨酸	80	核黄素	0.6
				L-色氨酸	20	盐酸硫胺	2
L-缬氨酸	50	维生素B12	2
				L-酪氨酸	32	六水合氯化镁	60
甘氨酸	50	次黄嘌呤	2
				L-胱氨酸盐酸盐	50	胸苷	1
无水氯化钙	60	无水磷酸二氢钾	25
				无水磷酸二氢钠	40

表3及以下各表中固体组分的单位mg/L是指，以将该培养基干粉组合物与载剂混合所得最终液体培养基的体积为基准，相对于每升最终液体培养基，在制备培养基时需要加入的固体物质的毫克数。将表3所示的固体组分按照10升最终液体培养基的用量，用万分之一天平一一精确称量混合后，再加入10升蒸馏水，用上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司85-2型搅拌器搅拌2小时后，得到均匀分散体，使用FD-3A中型冷冻干燥机(西安德派生物仪器有限公司)，按照该仪器说明书，在预冷温度-45℃，缓慢升温保持仪器内真空度9Pa下冷冻干燥50小时，得到本发明的动物细胞培养基干粉组合物。

实施例2

本实施例用于说明本发明的动物细胞培养基干粉组合物及其制备方法。

表4

组分	mg/L	组分	mg/L
				L-丙氨酸	110	四水合硝酸钙	60
L-精氨酸盐酸盐	190	氯化钾	320
				L-天门冬氨酸	10	无水硫酸镁	60
L-天门冬酰胺	50	氯化钠	7300
				L-半胱氨酸盐酸盐	10	无水磷酸氢二钠	380
L-谷氨酸	100	七水硫酸亚铁	0.4
				L-谷氨酰胺	500	七水合硫酸锌	0.8
L-组氨酸盐酸盐	45	D-葡萄糖	3000
				L-羟脯氨酸	5	谷胱甘肽	0.9
L-异亮氨酸	90	丙酮酸钠	60
				L-亮氨酸	70	抗坏血酸	7
L-赖氨酸盐酸盐	100	氯化胆碱	10
				L-蛋氨酸	40	D-泛酸钙	4
L-苯丙氨酸	50	叶酸	3
				L-脯氨酸	60	烟酰胺	4
L-丝氨酸	60	盐酸吡哆醇	5
				L-苏氨酸	60	核黄素	1
L-色氨酸	15	盐酸硫胺	5
				L-缬氨酸	70	维生素B12	5

组分	mg/L	组分	mg/L
				L-酪氨酸	50	六水合氯化镁	80
甘氨酸	30	次黄嘌呤	4
				L-胱氨酸盐酸盐	60	胸苷	0.5
无水氯化钙	80	无水磷酸二氢钾	60
				无水磷酸二氢钠	60	酚红	5
亚油酸	3	维生素D2	1

表4所示的固体组分按照10升最终液体培养基的用量，用万分之一分析天平称取。其中，将次黄嘌呤、胸苷溶于1000ml的1mol/L NaOH蒸馏水溶液中，得到A溶液；将L-丙氨酸、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐、L-赖氨酸盐酸盐、L-精氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟脯氨酸、L-丝氨酸、L-色氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、抗坏血酸、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺、维生素B12溶于3000ml蒸馏水中得到B溶液；将维生素D2、亚油酸溶于10ml 99％的乙醇得到C溶液；合并A溶液、B溶液、C溶液，然后向所得混合溶液中加入葡萄糖、无水磷酸二氢钠、氯化钾、无水硫酸镁、无水氯化钙、氯化钠、无水磷酸氢二钠、无水磷酸二氢钾、甘氨酸、L-胱氨酸盐酸盐、L-半胱氨酸盐酸盐、L-酪氨酸、L-天门冬酰胺、四水合硝酸钙、谷胱甘肽、七水硫酸亚铁、七水合硫酸锌、丙酮酸钠、酚红，用蒸馏水定容至10000ml摇匀，收集所得混合液，使用FD-3A中型冷冻干燥机(西安德派生物仪器有限公司)，按照该仪器说明书，在预冷温度-50℃，缓慢升温保持真空度10Pa下冷冻干燥40小时，即得到本发明的动物细胞培养基干粉组合物。

实施例3

本实施例用于说明本发明的动物细胞培养基干粉组合物及其制备方法。

表5

组分	mg/L	组分	mg/L
				L-丙氨酸	100	四水合硝酸钙	40
L-精氨酸盐酸盐	205	氯化钾	350
				L-天门冬氨酸	15	无水硫酸镁	55
L-天门冬酰胺	40	氯化钠	7000
				L-半胱氨酸盐酸盐	15	无水磷酸氢二钠	350

组分	mg/L	组分	mg/L
				L-谷氨酸	120	七水硫酸亚铁	0.3
L-谷氨酰胺	400	七水合硫酸锌	0.5
				L-组氨酸盐酸盐	35	D-葡萄糖	2500
L-羟脯氨酸	8	谷胱甘肽	0.6
				L-异亮氨酸	100	丙酮酸钠	80
L-亮氨酸	50	抗坏血酸	5
				L-赖氨酸盐酸盐	130	氯化胆碱	13
L-蛋氨酸	30	D-泛酸钙	5
				L-苯丙氨酸	40	叶酸	4
L-脯氨酸	50	烟酰胺	3
				L-丝氨酸	50	盐酸吡哆醇	4
L-苏氨酸	70	核黄素	0.8
				L-色氨酸	28	盐酸硫胺	4
L-缬氨酸	60	维生素B12	6
				L-酪氨酸	40	六水合氯化镁	70
甘氨酸	40	次黄嘌呤	3
				L-胱氨酸盐酸盐	55	胸苷	0.8
无水氯化钙	70	无水磷酸二氢钾	50
				无水磷酸二氢钠	50	酚红	4
亚油酸	2	维生素D2	2
				维生素K3	2

表5所示的固体组分按照10升最终液体培养基的用量，用万分之一分析天平称取。其中，将次黄嘌呤、胸苷，溶于1000ml的1mol/L NaOH蒸馏水溶液中，得到A溶液；将维生素K3、维生素D2、亚油酸溶于10ml 99％乙醇溶液，得到B溶液；将抗坏血酸、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺、维生素B12溶于1000ml蒸馏水中得到C溶液，合并A溶液、B溶液和C溶液，然后向所得混合溶液中加入葡萄糖，用蒸馏水定容至10000ml摇匀，收集所得混合液，使用FD-3A中型冷冻干燥机(西安德派生物仪器有限公司)，按照该仪器说明书，在预冷温度-40℃，缓慢升温保持真空度10Pa下冷冻干燥30小时，得到冻干粉。将无水磷酸二氢钠、氯化钾、无水硫酸镁、氯化钠、无水磷酸氢二钠、无水磷酸二氢钾、无水氯化钙、于105℃干燥2小时，将L-丙氨酸、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐、L-精氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸盐酸盐、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-色氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、L-酪氨酸、甘氨酸、L-胱氨酸盐酸盐、酚红于40℃下干燥1小时。将四水合硝酸钙、六水合氯化镁、谷胱甘肽、七水硫酸亚铁、七水合硫酸锌、丙酮酸钠、L-半胱氨酸盐酸盐、L-天门冬酰胺、L-羟脯氨酸放入真空干燥箱内干燥20小时。将上述所有干燥后的组分以及冻干粉装入球磨罐内，球磨10小时，即得本发明动物细胞培养基干粉组合物。

对比例1

本对比例用于说明现有的动物细胞培养基干粉组合物(商品名为MD500型199培养基)及其制备方法。

表6

组分	(mg/L)	组分	(mg/L)
				氯化钙	200.00	D-葡萄糖	1000.00
九水合硝酸铁	0.70	谷胱甘肽(还原型)	0.05
				氯化钾	400.00	盐酸鸟嘌呤	0.30
无水硫酸镁	97.67	次黄嘌呤	0.30
				氯化钠	6800.00	酚红	20.00
无水磷酸二氢钠	121.74	D-核糖	0.50
				L-丙氨酸	25.00	乙酸钠	50.00
L-精氨酸盐酸盐	70.00	胸腺嘧啶	0.30
				L-天门冬氨酸	30.00	吐温80	20.00
L-半胱氨酸盐酸盐	0.11	尿嘧啶	0.30
				L-胱氨酸盐酸盐	26.00	黄嘌呤	0.30

组分	(mg/L)	组分	(mg/L)
				L-谷氨酸	75.00	维生素C	0.05
L-谷氨酰胺	100.00	维生素E	0.01
				甘氨酸	50.00	维生素H	0.01
L-组氨酸盐酸盐	21.88	维生素D2	0.10
				L-羟脯氨酸	10.00	D-泛酸钙	0.01
L-异亮氨酸	40.00	氯化胆碱	0.50
				L-亮氨酸	60.00	叶酸	0.01
L-赖氨酸盐酸盐	70.00	i-肌醇	0.05
				L-蛋氨酸	15.00	维生素K3	0.01
L-苯丙氨酸	25.00	烟酸	0.025
				L-脯氨酸	40.00	烟酰胺	0.025
L-丝氨酸	25.00	对氨基苯甲酸	0.05
				L-苏氨酸	30.00	盐酸吡哆醛	0.025
L-色氨酸	10.00	盐酸吡哆醇	0.025
				L-酪氨酸	40.00	核黄素	0.01
L-缬氨酸	25.00	盐酸硫胺	0.01
				硫酸腺嘌呤	10.00	维生素A醋酸酯	0.14
腺苷酸	0.20	胆固醇	0.20
				三磷酸腺苷二钠	1.00	脱氧核糖	0.50

表6为商品名199培养基的组分，按照10升最终液体培养基的用量，用万分之一分析天平称取。将胆固醇、维生素A醋酸酯、维生素E、维生素D2、维生素K3和吐温80溶于0.1升乙醇中；将胸腺嘧啶、尿嘧啶、黄嘌呤和次黄嘌呤加入含有0.5毫升氨水的1升重蒸水中，并60℃加热至溶解；使叶酸和核黄素振荡溶于2.5升重蒸水；将维生素H和盐酸鸟嘌呤加入到2升0.075N的盐酸溶液中，并50℃加热至溶解；将三磷酸腺苷二钠、腺苷酸、脱氧核糖、谷胱甘肽、D-核糖、D-泛酸钙、维生素C、叶酸、氯化胆碱、i-肌醇、烟酸、烟酰胺、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醛、盐酸吡哆醇和盐酸硫胺溶于200毫升重蒸水中；合并得到的五种溶液，然后加入D-葡萄糖，用双蒸水定容至10升摇匀。使用FD-3A中型冷冻干燥机(西安德派生物仪器有限公司)，按照该仪器说明书，在预冷温度-50℃，缓慢升温保持真空度8Pa下冷冻干燥24小时，得到冻干粉。

将氯化钠、氯化钾、无水硫酸镁、硫酸腺嘌呤、九水合硝酸铁、氯化钙、乙酸钠、无水磷酸二氢钠、在105℃烘箱中干燥2小时。将L-丙氨酸、L-谷氨酰胺、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-羟脯氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸、L-精氨酸盐酸盐、L-半胱氨酸盐酸盐、L-胱氨酸盐酸盐、L-谷氨酸、L-组氨酸盐酸盐、L-赖氨酸盐酸盐、L-天门冬氨酸、甘氨酸、L-亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-酪氨酸、酚红用真空干燥箱抽真空干燥15小时。

将上述所得冻干粉和干燥固体组分在球磨机中进行连续10小时混合，所得固体粉末即为现有的动物细胞培养基干粉组合物，商品名MD500型199培养基。

实施例4

本实施例用于说明本发明的动物细胞培养基组合物及其制备方法。

将实施例3制得的干粉组合物123.64克，溶于9升蒸馏水中，然后用蒸馏水定容至10升混匀，使用0.22μm的滤菌膜过滤灭菌，即得到本发明的动物细胞培养基组合物。

实施例5

本实施例用于说明本发明的动物细胞培养基组合物及其制备方法。

表7

组分	mg/L	组分	mg/L
				L-丙氨酸	80	四水合硝酸钙	30
L-精氨酸盐酸盐	210	氯化钾	380
				L-天门冬氨酸	7	无水硫酸镁	70
L-天门冬酰胺	45	氯化钠	6500
				L-半胱氨酸盐酸盐	13	无水磷酸氢二钠	330
L-谷氨酸	110	七水硫酸亚铁	0.5
				L-谷氨酰胺	450	七水合硫酸锌	1.2
L-组氨酸盐酸盐	50	D-葡萄糖	2700
				L-羟脯氨酸	3	谷胱甘肽	1.2
L-异亮氨酸	110	丙酮酸钠	100

组分	mg/L	组分	mg/L
				L-亮氨酸	60	抗坏血酸	6
L-赖氨酸盐酸盐	180	氯化胆碱	12
				L-蛋氨酸	50	D-泛酸钙	6
L-苯丙氨酸	45	叶酸	6
				L-脯氨酸	55	烟酰胺	2
L-丝氨酸	40	盐酸吡哆醇	6
				L-苏氨酸	75	核黄素	0.5
L-色氨酸	30	盐酸硫胺	3
				L-缬氨酸	40	维生素B12	4
L-酪氨酸	30	六水合氯化镁	50
				甘氨酸	60	次黄嘌呤	1
L-胱氨酸盐酸盐	40	胸苷	0.6
				无水氯化钙	75	无水磷酸二氢钾	70
无水磷酸二氢钠	70	酚红	6
				亚油酸	1.5	维生素D2	3
维生素K3	3

表7所示的固体组分按照10升最终液体培养基的用量，用万分之一分析天平称取。其中，将次黄嘌呤、胸苷溶于1000ml的1mol/L NaOH蒸馏水溶液中，得到A溶液；将L-丙氨酸、L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-组氨酸盐酸盐、L-赖氨酸盐酸盐、L-精氨酸盐酸盐、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-羟脯氨酸、L-丝氨酸、L-色氨酸、L-苏氨酸、L-缬氨酸、抗坏血酸、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺、维生素B12溶于3000ml蒸馏水中得到B溶液；将维生素D2、亚油酸、维生素K3溶于10ml 99％的乙醇得到C溶液；合并A溶液、B溶液、C溶液，然后向所得混合溶液中加入葡萄糖、无水磷酸二氢钠、氯化钾、无水硫酸镁、无水氯化钙、氯化钠、无水磷酸氢二钠、无水磷酸二氢钾、甘氨酸、L-胱氨酸盐酸盐、L-半胱氨酸盐酸盐、L-酪氨酸、L-天门冬酰胺、四水合硝酸钙、谷胱甘肽、七水硫酸亚铁、七水合硫酸锌、丙酮酸钠、酚红，用蒸馏水定容至10000ml摇匀。将300ml小牛血清加入所得培养基混匀，将所得混合物使用0.22μm的滤菌膜过滤灭菌，得到10300ml含2.9％牛血清的本发明培养基组合物。

性能测试：

(1)澄清度

按照中华人民共和国药典2005年版二部附录IX B澄清度检查法，分别检测新制的对比例1和实施例1-3的培养基干粉组合物和在室温、相对湿度50％的环境下储存30天后的对比例1和实施例1-3的培养基干粉组合物与蒸馏水混合后形成的培养基液体，以及新制实施例4-5的培养基组合物(液体)和过滤灭菌后在2℃下保存一周后的实施例4-5的培养基组合物(液体)。对于培养基干粉组合物，取配制1升的用量，置于1000ml烧杯中，加水1000ml，搅拌至溶解；对于培养基组合物(液体)直接进行测试。测试结果如下表所示：

表8

样品	实施例1	存储实施例1	实施例2	存储实施例2	实施例3	存储实施例3	对比例1	存储对比例1	实施例4	存储实施例4	实施例5	存储实施例5
													澄清度	澄清	澄清	澄清	澄清	澄清	澄清	澄清	澄清	澄清	澄清	澄清	澄清

从表8的结果可以看出，本发明的培养基干粉混合物和培养基组合物(液体)无论是新制还是存储一段时间后，都能达到与现有培养基组合物相同水平的澄清度。

(2)pH值

按照中华人民共和国药典2005年版二部附录VI H pH值测定法，用pH计分别检测新制的对比例1和实施例1-3的培养基干粉组合物和在室温、相对湿度50％的环境下储存30天后的对比例1和实施例1-3的培养基干粉组合物与蒸馏水混合后形成的培养基液体，以及新制实施例4-5的培养基组合物(液体)和过滤灭菌后在2℃下保存一周后的实施例4-5的培养基组合物(液体)。对于培养基干粉组合物，取配制1升的用量，置于1000ml烧杯中，加水1000ml，搅拌至溶解；对于培养基组合物(液体)直接进行测试。测试结果如下表所示：

表9

样品	实施例1	存储实施例1	实施例2	存储实施例2	实施例3	存储实施例3	对比例1	存储对比例1	实施例4	存储实施例4	实施例5	存储实施例5
													pH	4.8	4.9	5.0	5.1	5.3	5.3	4.3	4.4	5.3	5.3	5.5	5.5

从表9的结果可以看出，本发明的培养基干粉混合物和培养基组合物(液体)无论是新制还是存储一段时间后，都能达到与现有培养基组合物相同的pH水平，而且本发明的培养基干粉混合物和培养基组合物存储前后pH的变化不超过0.1。

(3)干燥减量

按照中华人民共和国药典2005年版二部附录VIII L干燥失重测定法，分别检测新制的对比例1和实施例1-3的培养基干粉组合物和在室温、相对湿度50％的环境下储存30天后的对比例1和实施例1-3的培养基干粉组合物。测试结果如下表所示：

表10

样品	实施例1	存储实施例1	实施例2	存储实施例2	实施例3	存储实施例3	对比例1	存储对比例1
									干燥减量(％)	3.0	3.1	2.5	2.4	3.2	3.2	3.4	3.5

从表10的结果可以看出，本发明的培养基干粉混合物和培养基组合物(液体)无论是新制还是存储一段时间后，都能达到与现有培养基组合物相当的干燥减量水平，而且本发明的培养基干粉混合物和培养基组合物存储前后的干燥减量变化不超过0.2％。

(4)渗透压

按照中华人民共和国药典2005年版二部附录IX G渗透压摩尔浓度测定法，分别检测新制的对比例1和实施例1-3的培养基干粉组合物和在室温、相对湿度50％的环境下储存30天后的对比例1和实施例1-3的培养基干粉组合物与蒸馏水混合后形成的培养基液体，以及新制实施例4-5的培养基组合物(液体)和过滤灭菌后在2℃下保存一周后的实施例4-5的培养基组合物(液体)。对于培养基干粉组合物，取配制1升的用量，置于1000ml烧杯中，加水1000ml，搅拌至溶解；对于培养基组合物(液体)直接进行测试。测试结果如下表所示：

表11

样品	实施例1	存储实施例1	实施例2	存储实施例2	实施例3	存储实施例3	对比例1	存储对比例1	实施例4	存储实施例4	实施例5	存储实施例5
													渗透压(mOsmol/KgH<sub>2</sub>O)	260	262	270	264	280	275	256	254	268	268	274	279

从表11的结果可以看出，本发明的培养基干粉混合物和培养基组合物(液体)无论是新制还是存储一段时间后，都能达到与现有培养基组合物相同的渗透压水平，而且本发明的培养基干粉混合物和培养基组合物存储前后渗透压的变化不超过10mOsmol/KgH₂O。

(5)细菌内毒素

按照中华人民共和国药典2005年版附录XI E细菌内毒素检查法中的凝胶法，分别检测新制的对比例1和实施例1-3的培养基干粉组合物和在室温、相对湿度50％的环境下储存30天后的对比例1和实施例1-3的培养基干粉组合物与蒸馏水混合后形成的培养基液体，以及新制实施例4-5的培养基组合物(液体)和过滤灭菌后在2℃下保存一周后的实施例4-5的培养基组合物(液体)。对于培养基干粉组合物，取配制1升的用量，置于1000ml烧杯中，加水1000ml，搅拌至溶解；对于培养基组合物(液体)直接进行测试。取0.1ml培养基(液体)加入细菌内毒素检查用水(美国ACC)3.9ml，混匀即得试验溶液。测试结果如下表所示：

表12

样品	实施例1	存储实施例1	实施例2	存储实施例2	实施例3	存储实施例3	对比例1	存储对比例1	实施例4	存储实施例4	实施例5	存储实施例5
													细菌内毒素(EU/ml)	＜10	＜10	＜10	＜10	＜10	＜10	＜10	＜10	＜10	＜10	＜10	＜10

从表12的结果可以看出，本发明的培养基干粉混合物和培养基组合物(液体)无论是新制还是存储一段时间后，都能与现有培养基组合物的细菌内毒素水平相当，符合本行业标准对内毒素水平的要求(＜10 EU/ml)，而且本发明的培养基干粉混合物和培养基组合物存储前后细菌内毒素水平变化不超过1EU/ml。

(6)微生物限度

按中华人民共和国药典2005年版附录XI J微生物限度检查法进行，检查项目为细菌数、霉菌数，检查法为平皿法。对于动物细胞培养基干粉组合物，称取1g，精确至0.01g，加入无菌纯化水10ml溶解，混匀可得试验溶液；对于动物细胞培养基(液体)组合物用灭菌移液器在无菌条件下转移10ml以直接作为试验溶液。测试结果如下表所示：

表13

样品		实施例1	存储实施例1	实施例2	存储实施例2	实施例3	存储实施例3	对比例1	存储对比例1	实施例4	存储实施例4	实施例5	存储实施例5
														微生物限度(CFU/g)	细菌	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50
霉菌	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0

从表13的结果可以看出，本发明的培养基干粉混合物和培养基组合物(液体)无论是新制还是存储一段时间后，都能与现有培养基组合物的微生物限度水平相当，符合本行业标准对内毒素水平的要求(＜200 CFU/g的细菌)，而且本发明的培养基干粉混合物和培养基组合物存储前后微生物限度水平并未发生变化。

(7)细胞生长试验

培养实施例1

将实施例1制得的动物细胞培养基干粉组合物11022.4毫克，溶于900ml超纯水中，向所得混合物中加入30ml小牛血清混合，然后用超纯水定容至1000ml。使用0.20μm的滤菌膜过滤灭菌，即得培养液。

在无菌条件下，用灭菌移液器将10ml上述培养液转移到25cm²细胞培养瓶中，接种Vero细胞悬液，接种密度为5×10⁴细胞/ml。然后在(37±1)℃温度条件及(5±0.1)％二氧化碳体积分数条件下进行培养，记录单位天数细胞覆盖瓶底的面积以及细胞长满培养瓶底的时间。培养结果见后文表14，细胞培养72小时的照片见图1。由图1可以看出，被培养的细胞密度大，细胞的边缘非常清晰，形态正常。

培养实施例2

将实施例2制得的动物细胞培养基干粉组合物13294.6毫克，溶于900ml超纯水中，向所得混合物中加入40ml小牛血清混合，然后用超纯水定容至1000ml。使用0.10μm的滤菌膜过滤灭菌，即得培养液。

在无菌条件下，用灭菌移液器将10ml上述培养液转移到25cm²细胞培养瓶中，接种Vero细胞悬液，接种密度为5×10⁴细胞/ml。然后在(37±1)℃温度条件及(5±0.1)％二氧化碳体积分数条件下进行培养，记录单位天数细胞覆盖瓶底的面积以及细胞长满培养瓶底的时间。培养结果见后文表14。

培养实施例3

将实施例3制得的动物细胞培养基干粉组合物12316毫克，溶于900ml超纯水中，向所得混合物中加入10ml小牛血清混合，然后用超纯水定容至1000ml。使用0.15μm的滤菌膜过滤灭菌，即得培养液。

在无菌条件下，用灭菌移液器将10ml上述培养液转移到25cm²细胞培养瓶中，接种Vero细胞悬液，接种密度为5×10⁴细胞/ml。然后在(37±1)℃温度条件及(5±0.1)％二氧化碳体积分数条件下进行培养，记录单位天数细胞覆盖瓶底的面积以及细胞长满培养瓶底的时间。培养结果见后文表14。

培养实施例4

向970ml实施例4制得的动物细胞培养基组合物中加入30ml马血清混合，使用0.15μm的滤菌膜过滤灭菌，即得培养液。

在无菌条件下，用灭菌移液器将10ml上述培养液转移到25cm²细胞培养瓶中，接种Vero细胞悬液，接种密度为5×10⁴细胞/ml。然后在(37±1)℃温度条件及(5±0.1)％二氧化碳体积分数条件下进行培养，记录单位天数细胞覆盖瓶底的面积以及细胞长满培养瓶底的时间。培养结果见后文表14。

培养实施例5

取实施例5制得的培养基组合物1000ml直接使用，其中含有2.9体积％的小牛血清。

在无菌条件下，用灭菌移液器将10ml上述培养液转移到25cm²细胞培养瓶中，接种CHO细胞悬液，接种密度为5×10⁴细胞/ml。然后在(37±1)℃温度条件及(5±0.1)％二氧化碳体积分数条件下进行培养，记录单位天数细胞覆盖瓶底的面积以及细胞长满培养瓶底的时间。培养结果见后文表14，细胞培养72小时的照片见图5。由图5可以看出，被培养的细胞密度大，细胞的边缘非常清晰，形态正常。

培养对比例1

将对比例1制得的动物细胞培养基干粉组合物9513.11毫克，溶于850ml超纯水中，向所得混合物中加入100ml小牛血清混合，然后用超纯水定容至1000ml。使用0.20μm的滤菌膜过滤灭菌，即得培养液。

在无菌条件下，用灭菌移液器将10ml上述培养液转移到25cm²细胞培养瓶中，接种Vero细胞悬液，接种密度为5×10⁴细胞/ml。然后在(37±1)℃温度条件及(5±0.1)％二氧化碳体积分数条件下进行培养，记录单位天数细胞覆盖瓶底的面积以及细胞长满培养瓶底的时间。培养结果见后文表14，细胞培养72小时的照片见图2。由图2可以看出，被培养的细胞密度大，细胞的边缘清晰，形态正常。

培养对比例2

采用CN 1723277的实施例2记载的培养基[5％牛血清+FGF-2(10ng/ml)+胰岛素(10μg/ml)+PDGF(1ng/ml)+EGF(10ng/ml)地塞米松(5×10^-9M)+凝血酶(1单位)]，按照培养对比例1相同的条件下培养细胞，记录单位天数细胞覆盖瓶底的面积以及细胞长满培养瓶底的时间。培养结果见后文表14，细胞培养72小时的照片见图3。由图3可以看出，被培养的细胞密度大，细胞的边缘清晰，形态正常。

培养对比例3

按照培养对比例1的方法制备培养液并培养细胞，不同的是，只加入30ml小牛血清。培养结果见后文表14，细胞培养72小时的照片见图4。从图4可以看出，由于培养过程中使用的血清少，导致Vero细胞生长速度慢、密度低，细胞的边缘不清晰，形态不正常。

表14

	动物血清添加量(体积％)	接种细胞密度(细胞/ml)	24小时平均细胞数量(覆盖瓶底面积％)	48小时平均细胞数量(覆盖瓶底面积％)	72小时平均细胞数量(覆盖瓶底面积％)	铺满瓶底时间(h)
							培养实施例1	3	5×10<sup>4</sup>	50	85	100	60
培养实施例2	4	5×10<sup>4</sup>	60	90	100	60
							培养实施例3	1	5×10<sup>4</sup>	40	70	90	75
培养实施例4	3	5×10<sup>4</sup>	50	83	100	72
							培养实施例5	2.9	5×10<sup>4</sup>	50	82	100	72
培养对比例1	10	5×10<sup>4</sup>	60	85	100	72

	动物血清添加量(体积％)	接种细胞密度(细胞/ml)	24小时平均细胞数量(覆盖瓶底面积％)	48小时平均细胞数量(覆盖瓶底面积％)	72小时平均细胞数量(覆盖瓶底面积％)	铺满瓶底时间(h)
							培养对比例2	3	5×10<sup>4</sup>	60	85	100	72
培养对比例3	3	5×10<sup>4</sup>	30	60	80	90

从表14的结果可以看出，本发明的动物细胞培养基干粉组合物和培养基组合物能配合低含量动物血清使用(或含有低含量的动物血清)，达到与使用高含量动物血清持平甚至更好的促进动物细胞生长的作用。由于采用本发明的动物细胞培养基干粉组合物和培养基组合物，在动物细胞培养的整个过程中，在不影响细胞生长的前提下，血清的使用量可以显著降低，从而使大规模生产的成本显著降低。由于本发明的动物细胞培养基干粉组合物，无需额外引入蛋白成分(例如重组蛋白、植物蛋白或动物来源组分如细胞因子等)，因此不产生伴随蛋白成分的副作用，安全性好。

Claims (15)

1.一种动物细胞培养基干粉组合物，其特征在于，该动物细胞培养基干粉组合物包括下表1所示的组分：

表1

  组分   重量份   组分   重量份   L-丙氨酸   80-120   四水合硝酸钙   30-80   L-精氨酸盐酸盐   180-210   氯化钾   320-500   L-天门冬氨酸   5-30   无水硫酸镁   40-80   L-天门冬酰胺   30-60   氯化钠   6000-8000   L-半胱氨酸盐酸盐   10-30   无水磷酸氢二钠   300-400   L-谷氨酸   100-150   七水硫酸亚铁   0.1-1   L-谷氨酰胺   200-500   七水合硫酸锌   0.2-3   L-组氨酸盐酸盐   20-50   D-葡萄糖   1000-3000   L-羟脯氨酸   2-15   谷胱甘肽   0.2-2   L-异亮氨酸   90-150   丙酮酸钠   20-120   L-亮氨酸   10-70   抗坏血酸   1-10   L-赖氨酸盐酸盐   100-200   氯化胆碱   5-25   L-蛋氨酸   10-50   D-泛酸钙   1-10   L-苯丙氨酸   10-50   叶酸   2-10   L-脯氨酸   20-60   烟酰胺   1-5   L-丝氨酸   20-60   盐酸吡哆醇   1-10   L-苏氨酸   60-100   核黄素   0.2-2   L-色氨酸   10-50   盐酸硫胺   1-10   L-缬氨酸   30-70   维生素B12   1-10   L-酪氨酸   30-80   六水合氯化镁   40-100

  组分   重量份   组分   重量份   甘氨酸   30-80   次黄嘌呤   1-10   L-胱氨酸盐酸盐   30-80   胸苷   0.1-2   无水氯化钙   30-80   无水磷酸二氢钾   20-100   无水磷酸二氢钠   30-80

2.根据权利要求1所述的动物细胞培养基干粉组合物，其中，所述动物细胞培养基干粉组合物包括下表2所示的组分：

表2

  组分   重量份   组分   重量份   L-丙氨酸   90-110   四水合硝酸钙   30-60   L-精氨酸盐酸盐   190-210   氯化钾   320-400   L-天门冬氨酸   5-20   无水硫酸镁   50-70   L-天门冬酰胺   30-50   氯化钠   6500-7500   L-半胱氨酸盐酸盐   10-15   无水磷酸氢二钠   300-380   L-谷氨酸   100-120   七水硫酸亚铁   0.1-0.5   L-谷氨酰胺   300-500   七水合硫酸锌   0.2-1.5   L-组氨酸盐酸盐   30-50   D-葡萄糖   2000-3000   L-羟脯氨酸   2-10   谷胱甘肽   0.6-1.5   L-异亮氨酸   90-120   丙酮酸钠   50-100   L-亮氨酸   30-70   抗坏血酸   2-7   L-赖氨酸盐酸盐   100-180   氯化胆碱   10-16   L-蛋氨酸   20-50   D-泛酸钙   2-6   L-苯丙氨酸   30-50   叶酸   3-6   L-脯氨酸   40-60   烟酰胺   2-4

  组分   重量份   组分   重量份   L-丝氨酸   40-60   盐酸吡哆醇   2-6   L-苏氨酸   60-80   核黄素   0.5-1   L-色氨酸   10-30   盐酸硫胺   2-5   L-缬氨酸   40-70   维生素B12   3-7   L-酪氨酸   30-50   六水合氯化镁   50-80   甘氨酸   30-60   次黄嘌呤   1-4   L-胱氨酸盐酸盐   40-60   胸苷   0.5-1   无水氯化钙   60-80   无水磷酸二氢钾   50-90   无水磷酸二氢钠   40-70

3.根据权利要求1或2所述的动物细胞培养基干粉组合物，其中，所述细胞干粉组合物还包括1-3重量份的亚油酸、1-3重量份的维生素D2、1-3重量份的维生素K3和2-10重量份的酚红中的一种或几种。

4.一种动物细胞培养基干粉组合物的制备方法，该方法包括将选自权利要求1-3中任意一项所述的动物细胞培养基干粉组合物的组分分散在分散剂中，移除所得混合物中的分散剂。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述分散剂选自蒸馏水、去离子水、注射用水、重蒸水、超纯水、能与水以任意比互溶的醇、碱性水溶液和酸性水溶液中的一种或几种。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述碱性水溶液为氢氧化钠溶液或者权利要求1-3中所述的动物细胞培养基干粉组合物中出现的阳离子的碱的水溶液，所述酸性水溶液为权利要求1-3中所述的动物细胞培养基干粉组合物出现的酸根离子的酸的水溶液。

7.一种动物细胞培养基组合物，该组合物包括动物细胞培养基干粉组合物及其载剂，其特征在于，所述动物细胞培养基干粉组合物选自权利要求1-3中任意一项所述的动物细胞培养基干粉组合物。

8.根据权利要求7所述的动物细胞培养基组合物，其中，所述载剂选自蒸馏水、去离子水、注射用水、重蒸水和超纯水中的一种或几种。

9.根据权利要求8所述的动物细胞培养基组合物，其中，所述载剂为注射用水和/或超纯水。

10.根据权利要求7所述的动物细胞培养基组合物，其中，所述载剂的用量为600000-1500000重量份。

11.根据权利要求10所述的动物细胞培养基组合物，其中，所述载剂的用量为800000-1200000重量份。

12.根据权利要求11所述的动物细胞培养基组合物，其中，所述载剂的用量为1000000重量份。

13.根据权利要求7所述的动物细胞培养基组合物，其中，所述动物细胞培养基组合物还包括终浓度为1体积％至小于10体积％的动物血清。

14.一种动物细胞培养基组合物的制备方法，该方法包括将动物细胞培养基干粉组合物分散在载剂中，过滤灭菌，其特征在于，所述动物细胞培养基干粉组合物选自权利要求1-3中所述的动物细胞培养基干粉组合物中的一种或几种。

15.根据权利要求14所述的动物细胞培养基组合物的制备方法，该方法还包括向分散有所述培养基干粉组合物的载剂中加入终浓度为1体积％至小于10体积％的动物血清。

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