CN101374828B - 作为组蛋白脱乙酰酶抑制剂的杂环烷基衍生物 - Google Patents
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Abstract
本发明包括具有组蛋白脱乙酰酶抑制酶活性的新的式(I)化合物，其中R1、T、X、Y、A、n、m和p具有定义的含义；它们的制备方法；含它们的组合物和它们作为药物的用途。
Description
本发明涉及具有组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制酶活性的化合物。还涉及它们的制备方法；包含它们的组合物和它们在体外、体内抑制HDAC的用途；和它们作为药物例如作为抑制增殖性病症例如癌症和银屑病的药物的用途。
据认为核组蛋白是负责调节基因转录和其它DNA模版化(templated)过程例如复制、修复、重组和染色体分离的机制的整合和动态元件。它们是翻译后修饰的对象，翻译后修饰包括乙酰化、磷酸化、甲基化、遍在蛋白化和ADP-核糖基化。
本文中称为″HDACs″的组蛋白脱乙酰酶是催化除去蛋白的赖氨酸残基上乙酰基修饰的酶，这些蛋白包括核心核小体组蛋白H2A、H2B、H3和H4。HDACs与本文中称为″HATs″的组蛋白乙酰基转移酶一起调节组蛋白乙酰化的水平。核小体组蛋白的乙酰化平衡在多种基因转录中起重要作用。组蛋白的次乙酰化与导致基因转录阻抑的凝聚染色质结构有关，而乙酰化组蛋白与更开放的染色质结构和转录激活有关。
已阐明了11种结构相关的HDACs，它们分为两类。I类HDACs由HDAC 1、2、3、8和11组成，而II类HDACs由HDAC 4、5、6、7、9和10组成。第3类HDACs的成员的结构与I类和II类HDACs不相关。I/II类HDACs通过依赖锌的机制起作用，而III类HDACs依赖NAD。
除组蛋白外，其它蛋白也是乙酰化的底物，尤其转录因子例如p53、GATA-1和E2F；核受体例如糖皮质激素受体、甲状腺受体、雌激素受体和细胞周期调节蛋白例如pRb。蛋白的乙酰化与蛋白稳定如p53稳定、辅因子募集和DNA结合增加有关。p53是肿瘤抑制剂，该抑制剂可诱导响应多种应激信号例如DNA损伤的细胞周期停滞或凋亡。p53诱导的细胞周期停滞的主要目标似乎是p21基因。除其通过p53激活外，由于其与导致细胞周期G1和G2期停滞的细胞周期蛋白/依赖细胞周期蛋白的激酶复合体有关、其在衰老期间上调及其与增殖的细胞核抗原相互作用而鉴别p21。
HDACs抑制剂研究表明它们在细胞周期停滞、细胞分化、凋亡和转化表型回复中起重要作用。
例如，抑制剂制滴菌素A(TSA)造成细胞周期G1和G2期停滞，使不同细胞系转化的表型回复和诱导弗罗德白血病细胞和其它细胞分化。据报道，TSA(和辛二酰苯胺异羟肟酸SAHA)抑制小鼠细胞生长、诱导终末分化和阻止肿瘤形成(Finnin et al.，Nature，401：188-193，1999)。
据报道，制滴菌素A可用于治疗纤维变性例如肝纤维化和肝硬化(1998年3月11日公布的Geerts等的欧洲专利申请EP 0 827 742)。
HDAC抑制剂的药效基团由金属结合域、连接体域和表面识别域或帽化域组成，金属结合域与HDAC的含锌活性部位相互作用，帽化域与活性部位缘上的残基相互作用。
还据报道，HDAC抑制剂诱导p21基因表达。p21启动子域中的组蛋白H3和H4乙酰化后，染色质重塑促使由这些抑制剂诱导p21基因转录激活。该p21激活按独立于p53的方式发生，因此HDAC抑制剂在含突变的p53基因的细胞中起作用，突变的p53基因是无数肿瘤的标志。
另外，HDAC抑制剂还可能具有间接活性例如放大宿主免疫反应和抑制肿瘤血管发生，因此，可抑制原发性肿瘤生长并阻止转移(Mai etal.，Medicinal Research Reviews，25：261-309，2005)。
鉴于以上，HDAC抑制剂可能具有治疗细胞增殖性疾病或病症，包括含突变的p53基因的肿瘤的重大潜力。
2003年8月14日公布的专利申请EP1472216公开了作为组蛋白脱乙酰酶抑制剂的双环异羟肟酸酯。
其中2003年9月18日公布的专利申请EP1485099、EP1485348、EP1485353、EP1485354、EP1485364、EP1485365、EP1485370、EP1485378公开了作为组蛋白脱乙酰酶抑制剂的取代的哌嗪基嘧啶异羟肟酸，另外EP1485365公开了R306465。
2003年10月9日公布的专利申请EP1492534公开了作为HDAC抑制剂的含哌嗪连接体的氨基甲酸化合物。
2003年10月23日公布的专利申请EP1495002公开了作为组蛋白脱乙酰酶抑制剂的取代的哌嗪基苯基苯甲酰胺化合物。
2003年11月13日公布的专利申请EP1501508公开了作为组蛋白脱乙酰酶抑制剂的苯甲酰胺。
2004年1月29日公布的专利申请WO04/009536公开了作为组蛋白脱乙酰酶抑制剂的衍生物，该衍生物在芳基和异羟肟酸酯之间含烷基连接体。
2004年2月12日公布的专利申请EP1525199公开了作为组蛋白脱乙酰酶抑制剂的(杂)芳基烯基取代的双环异羟肟酸酯。
2004年6月24日公布的专利申请EP1572626公开了作为药理试剂的N-(2-氨基-苯基)-亚芳基-甲酰胺衍生物。
2004年7月29日公布的专利申请EP1581484公开了具有抗炎和抗肿瘤活性的N-羟基-苯甲酰胺衍生物的衍生物。
2004年7月29日公布的专利申请EP1585735公开了作为组蛋白脱乙酰酶抑制剂的取代的芳基异羟肟酸酯衍生物。
2004年8月19日公布的专利申请EP1592667公开了作为药理试剂的单酰化O-苯二胺衍生物。
2004年8月19日公布的专利申请EP1590340公开了作为组蛋白脱乙酰酶抑制剂的二氨基亚苯基衍生物。
2004年8月26日公布的专利申请EP1592665公开了作为组蛋白脱乙酰酶抑制剂的苯甲酰胺衍生物。
2004年8月26日公布的专利申请WO04/072047公开了作为组蛋白脱乙酰酶抑制剂的吲哚、苯并咪唑和萘咪唑(naphhimidazoles)。
2004年9月30日公布的专利申请EP1608628公开了作为组蛋白脱乙酰酶抑制剂的与非芳族杂环环系统连接的异羟肟酸酯。
2004年10月14日公布的专利申请EP1613622公开了作为组蛋白脱乙酰酶抑制剂的肟衍生物。
2004年10月28日公布的专利申请EP1611088公开了作为组蛋白脱乙酰酶抑制剂的异羟肟酸酯衍生物。
2005年3月31日公布的专利申请WO05/028447公开了作为组蛋白脱乙酰酶抑制剂的苯并咪唑。
2005年4月7日公布的专利申请WO05/030704和WO05/030705公开了作为组蛋白脱乙酰酶抑制剂的苯甲酰胺。
2005年5月6日公布的专利申请WO05/040101公开了作为组蛋白脱乙酰酶抑制剂的酰基脲连接的和磺酰脲连接的异羟肟酸酯。
也于2005年5月6日公布的专利申请WO05/040161公开了作为组蛋白脱乙酰酶抑制剂的联芳连接的异羟肟酸酯。
2005年8月18日公布的专利申请WO05/075469公开了作为组蛋白脱乙酰酶抑制剂的噻唑基异羟肟酸和噻二唑基异羟肟酸。
2005年9月22日公布的专利申请WO05/086898公开了作为组蛋白脱乙酰酶抑制剂的杂戊环异羟肟酸。
2005年10月6日公布的专利申请WO05/092899公开了作为组蛋白脱乙酰酶的烯基苯甲酰胺。本发明化合物与现有技术在结构、它们的药理活性和/或药理效力上不同。
尚待解决的问题是提供具有高酶活性和细胞活性的组蛋白脱乙酰酶抑制剂，这些抑制剂具有增加的生物利用度和/或体内效力。
本发明的新化合物解决了上述问题。本发明化合物可显示优良的组蛋白脱乙酰酶抑制酶和细胞活性。在细胞和体内水平上，本发明化合物还可具有高的激活p21基因的能力。本发明化合物的有利特征是代谢稳定性、溶解性和/或p21诱导能力。更尤其是，本发明化合物在大鼠肝细胞中可具有增加的半衰期；在水溶液中具有增加的溶解度和/或具有增强的体内p21启动子诱导能力。
本发明涉及式(I)化合物、其N-氧化物形式、药学上可接受的加成盐和立体化学异构形式
其中
R1为羟基或式(a-1)基团
其中
R2为羟基或氨基；
R3为氢、噻吩基、呋喃基或苯基，且噻吩基、呋喃基或苯基各自可任选被1或2个以下基团取代：卤素、氨基、硝基、氰基、羟基、苯基、C1-6烷基、(二C1-6烷基)氨基、C1-6烷氧基、苯基C1-6烷氧基、羟基C1-6烷基、C1-6烷氧基羰基、羟基羰基、C1-6烷基羰基、多卤代C1-6烷氧基、多卤代C1-6烷基、C1-6烷基磺酰基、羟基羰基C1-6烷基、 C1-6烷基羰基氨基、氨基磺酰基、氨基磺酰基C1-6烷基、异噁唑基、氨基羰基、苯基C2-6烯基、苯基C3-6炔基或吡啶基C3-6炔基；
R4、R5和R6各自独立为氢、氨基、硝基、呋喃基、卤素、C1-6 烷基、C1-6烷氧基、三氟甲基、噻吩基、苯基、C1-6烷基羰基氨基、氨基羰基C1-6烷基或-C≡C-CH2-R7；
其中R7为氢、C1-6烷基、羟基、氨基或C1-6烷氧基；
X为N或CH；
Y为O、N、NH、CH或CH2，且当Y为N或CH时，则取代基与环结构的Y原子连接；
T为O或NR8，其中R8为氢、C1-6烷基、C3-7环烷基、羟基C1-6 烷基、氰基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、羟基氨基羰基C1-6烷基、C1-6烷基磺酰基、C1-6烷基羰基、C1-6烷基氨基羰基或一-或二(C1-6烷基)氨基磺酰基；
n为0或1，且当n为0时，则为直键；
m为1或2；
p为0或1，条件是当p为0时，则n为0，-(CH2)n-(T)p-为直键，且Y为N；
A为选自以下的基团：
其中R9为氢、C1-6烷基、C3-7环烷基或C3-7环烷基C1-6烷基；
且R10为氢、羟基、氨基、卤素、氰基、C1-6烷基、多卤代C1-6 烷基、C1-6烷氧基羰基、羟基羰基、C1-6烷基羰基氨基、C1-6烷氧基或一-或二(C1-6烷基)氨基。
从取代基引入双环环系统中的线表示该键可与双环环系统的任何合适的环原子连接。
术语“组蛋白脱乙酰酶抑制剂”或“组蛋白脱乙酰酶的抑制剂”用于代表能够与组蛋白脱乙酰酶相互作用并抑制其活性，更尤其其酶活性的化合物。抑制组蛋白脱乙酰酶酶活性表示减少组蛋白脱乙酰酶除去组蛋白的乙酰基的能力。优选，这种抑制为特异性抑制，即组蛋白脱乙酰酶抑制剂在低于产生某些其它无关生物作用所需抑制剂浓度的浓度下，减少组蛋白脱乙酰酶除去组蛋白的乙酰基的能力。
当在前述定义和下文中使用时，卤素为氟、氯、溴和碘的通称；C1-2烷基定义为具有1或2个碳原子的直链饱和烃基，例如甲基或乙基；C1-6烷基定义为C1-2烷基和具有3-6个碳原子的直链和支链饱和烃基，例如丙基、丁基、1-甲基乙基、2-甲基丙基、戊基、2-甲基-丁基、 己基、2-甲基戊基等；多卤代C1-6烷基定义为含3个相同或不同卤素取代基的C1-6烷基，例如三氟甲基；C2-6烯基定义为含一个双键并具有2-6个碳原子的直链和支链烃基，例如乙烯基、2-丙烯基、3-丁烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、3-甲基-2-丁烯基等；C3-6炔基定义为含一个三键和具有3-6个碳原子的直链和支链烃基，例如2-丙炔基、3-丁炔基、2-丁炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、3-己炔基等；C3-7环烷基包括具有3-7个碳的环烃基，例如环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环庚基等。
药学上可接受的加成盐包括药学上可接受的酸加成盐和药学上可接受的碱加成盐。上文中所述药学上可接受的酸加成盐将包括式(I)化合物能够形成的治疗活性的无毒酸加成盐形式。可通过用适当的酸处理所述碱形式，将具有碱性的式(I)化合物转化为它们的药学上可接受的酸加成盐。适当的酸包括例如无机酸例如氢卤酸，例如盐酸或氢溴酸；硫酸；硝酸；磷酸和类似的酸；或有机酸例如乙酸、三氟乙酸、丙酸、羟基乙酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸(即丁二酸)、马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、环己烷氨基磺酸、水杨酸、对氨基-水杨酸、扑姆酸和类似的酸。
可通过用合适的有机碱或无机碱处理所述酸形式，将具有酸性的式(I)化合物转化为它们的药学上可接受的碱加成盐。适当的碱式盐形式包括例如铵盐；碱金属和碱土金属盐例如锂、钠、钾、镁、钙盐等；有机碱的盐例如苄星青霉素、N-甲基-D-葡糖胺、哈胺青霉素(hydrabamine)盐；和氨基酸的盐例如精氨酸、赖氨酸盐等。
术语“酸或碱加成盐”还包括式(I)化合物可形成的水合物和溶剂加合物形式。此类形式的实例是例如水合物、醇化物等。
本文中使用的术语“式(I)化合物的立体化学异构形式”定义为式(I)化合物可具有的由相同原子通过相同连接顺序连接但具有不可互变的不同三维结构组成的所有可能的化合物。除另外提及或说明外，化 合物的化学名包括所述化合物可具有的所有可能的立体化学异构体的混合物。所述混合物可含所述化合物的基本分子结构的所有非对映体和/或对映体。式(I)化合物的所有纯形式的立体化学异构体或其彼此的混合物将包括在本发明的范围内。
式(I)化合物的N-氧化物形式包括其中一个或几个氮原子氧化为所谓的N-氧化物的那些式(I)化合物，尤其其中哌啶-、哌嗪或哒嗪基-氮中一个或多个是N-氧化的那些N-氧化物。
某些式(I)化合物还可存在互变异构形式。尽管未明确在上式中表明，但此类形式包括在本发明范围内。
当在下文中使用时，术语“式(I)化合物”还包括药学上可接受的加成盐和所有立体异构形式。
本文中使用的术语“组蛋白脱乙酰酶”和″HDAC″是指从组蛋白的N末端上赖氨酸残基的ε-氨基上除去乙酰基的酶家族中任一种酶。除上下文中另有说明外，术语“组蛋白”是指包括任何种属的H1、H2A、H2B、H3、H4和H5的任何组蛋白。人HDAC蛋白或基因产物包括但不限于HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC-4、HDAC-5、HDAC-6、HDAC-7、HDAC-8、HDAC-9、HDAC-10和HDAC-11。组蛋白脱乙酰酶也可源自原虫或真菌源。
第1组目的化合物由那些式(I)化合物组成，其中R1为羟基。
第2组目的化合物由那些式(I)化合物组成，其中R3不为氢。
第3组目的化合物由那些式(I)化合物组成，其中适用一个或多个以下限定条件：
a)R1为羟基或式(a-1)基团，其中R2为氨基，R3为氢或噻吩基，R4、R5和R6各自为氢；
b)X为N或CH；
c)Y为O、N或CH；
d)T为O或NR8，其中R8为氢、C1-6烷基、氰基C1-6烷基、羟基氨基羰基C1-6烷基、C1-6烷基羰基或C1-6烷基磺酰基；
e)n为0或1；
f)m为1；
g)p为0或1；和
h)A为选自以下的基团：(b-1)、(b-2)、b-3)、(b-4)、(b-5)、(b-6)、(b-7)和(b-8)，其中R9为C1-6烷基，R10为氢。
第4组目的化合物由那些式(I)化合物组成，其中适用一个或多个以下限定条件：
a)R1为羟基或式(a-1)基团，其中R2为氨基，R3为氢，R4、R5和R6各自为氢；
b)X为N或CH；
c)Y为O、N或CH；
d)T为NR8，其中R8为氢、C1-6烷基、氰基C1-6烷基、羟基氨基羰基C1-6烷基、C1-6烷基羰基或C1-6烷基磺酰基；
e)n为1；
f)m为1；
g)p为1；和
h)A为选自以下的基团：(b-1)、(b-2)、(b-3)、(b-4)、(b-5)、(b-6)、(b-7)和(b-8)，其中R9为C1-6烷基，R10为氢。
第5组目的化合物由那些式(I)化合物组成，其中适用一个或多个以下限定条件：
a)R1为羟基或式(a-1)基团，其中R2为氨基，R3为氢或噻吩基，R4、R5和R6各自为氢；
b)X为N或CH；
c)Y为O、N或CH；
d)T为NR8，其中R8为氢、C1-6烷基、氰基C1-6烷基、羟基氨基羰基C1-6烷基、C1-6烷基羰基或C1-6烷基磺酰基；
e)n为1；
f)m为1；
g)p为1；和
h)A为选自以下的基团：(b-1)、(b-2)、(b-3)、(b-4)、(b-5)、(b-6)、(b-7)和(b-8)，其中R9为C1-6烷基，R10为氢。
第6组目的化合物由那些式(I)化合物组成，其中适用一个或多个以下限定条件：
a)R1为羟基；
b)X为N；
c)Y为O、N或CH；
d)T为O；
e)n为1；
f)m为1；
g)p为1；和
h)A为选自以下的基团：(b-1)、(b-2)、(b-3)、(b-4)、(b-5)、(b-6)、(b-7)和(b-8)，其中R9为C1-6烷基，R10为氢。
第7组目的化合物由那些式(I)化合物组成，其中适用一个或多个以下限定条件：
a)R1为羟基或式(a-1)基团，其中R2为氨基，R3为氢或噻吩基，R4、R5和R6各自为氢；
b)X为CH；
c)Y为N；
d)n为0；
e)m为1；
g)p为0；和
h)A为选自以下的基团：(b-1)、(b-2)、(b-3)、(b-4)、(b-5)、(b-6)、(b-7)和(b-8)，其中R9为C1-6烷基，R10为氢。
一组优选的化合物由那些式(I)化合物组成，其中适用一个或多个以下限定条件：
a)R1为羟基；
b)X为N；
c)Y为CH；
d)T为NR8，其中R8为氢；
e)n为1；
f)m为1；
g)p为1；且
h)A为选自以下的基团：(b-1)、(b-2)、(b-3)、(b-4)、(b-5)、(b-6)、(b-7)和(b-8)，其中R9为C1-6烷基，R10为氢。
一组更优选的化合物由那些式(I)化合物组成，其中适用一个或多个以下限定条件：
a)R1为羟基；
b)X为N；
c)Y为CH；
d)T为NR8，其中R8为氢；
e)n为1；
f)m为1；
g)p为1；且
h)A为选自以下的基团：(b-1)、(b-3)和(b-4)，其中R9为C1-6烷基，R10为氢。
尤其优选的式(I)化合物是以下所示1号化合物、2号化合物和3号化合物：
可按常规方法制备式(I)化合物及其药学上可接受的盐和N-氧化物和立体化学异构形式。原料和某些中间体是已知化合物，它们是市售化合物或可按照本领域中通常已知的常规反应方法或专利申请EP1485099、EP1485348、EP1485353、EP1485354、EP1485364、EP1485365、EP1485370和EP1485378中所述方法制备。
在下文中将更详细地阐述某些制备方法。在实施例中阐述得到最终式(I)化合物的其它方法。制备式(I)化合物的具体方法阐述如下：
a)可通过使式(II-a)中间体与适当的酸例如三氟乙酸反应，制备本文中称为式(I-a)化合物的式(I)异羟肟酸，其中R1为羟基。在适当的溶剂例如甲醇或二氯甲烷中，进行所述反应。
b)可在碱例如三乙胺和苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷-1-基-磷鎓六氟磷酸盐(PyBOP)的存在下，通过使其中M代表氢或碱金属例如钠或锂的式(IV)中间体与式(III)化合物反应，制备本文中称为式(I-b)化合物的式(I)化合物，其中R1为式(a-1)基团。在适当溶剂例如四氢呋喃或二氯甲烷或其混合物中，进行所述反应。
或者，可通过在合适的溶剂例如二氯甲烷中例如用磺酰氯(SOCl2)处理，将式(IV)化合物转化为酰氯，然后在碱例如吡啶的存在下，在合适的溶剂例如二氯甲烷或THF中，使得到的酰氯化合物与式(III)化合物反应，制备式(I-b)化合物。
也可通过使式(II-b)中间体与适当的酸例如三氟乙酸反应，制备本文中称为式(I-b1)化合物的式(I-b)化合物，其中R2为氨基。在适当的溶剂例如甲醇或二氯甲烷中，进行所述反应。
可通过使式(II-c)中间体在适当的溶剂例如四氢呋喃中与氟化四丁铵反应，制备本文中称为式(I-b2)化合物的式(I-b)化合物，其中R2 为羟基。在式(II-c)中间体中，TBDMS表示叔丁基(二甲基)硅烷基。
也可通过已知技术反应，或根据分子中其它基团敏感性进行官能团转化，使式(I)化合物相互转化，例如将羧酸酯水解为相应的羧酸或醇；可将醇转化为酯和醚；可将伯胺转化为仲胺或叔胺；可将伯胺或仲胺转化为酰胺或磺酰胺；可通过在合适的钯催化剂的存在下插入一氧化碳，将苯基上的碘基转化为酯基。
可在适当的试剂例如N’-(乙基羰基咪唑基(carbonimidoyl))-N，N-二甲基-1，3-丙二胺一盐酸盐(EDC)和1-羟基-1H-苯并三唑(HOBT)的存在下，通过使其中M代表氢或碱金属阳离子例如钠的式(IV)中间体与式(V)中间体反应，制备式(II-a)中间体。可在碱例如三乙胺的存在下，在合适的溶剂例如二氯甲烷和四氢呋喃的混合物中，进行该反应。
可在苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP)和氢化钠的存在下，通过使其中M为氢的本文中称为式(IV-b)中间体的式(IV)中间体与适当的叔丁氧基羰基(Boc)保护的式(III-b)苯胺反应，制备式(II-b)中间体。可在合适的溶剂例如吡啶中，进行所述反应。
可在苯并三唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐(BOP)和三乙胺的存在下，通过使式(IV-b)中间体与适当叔丁基(二甲基)硅烷基(TBDMS)保护的式(III-c)苯胺反应，制备式(II-c)中间体。在合适的溶剂例如N，N-二甲基甲酰胺中，进行所述反应。
也可在适当的试剂例如硼氢化钠的存在下，在合适的溶剂例如二氯乙烷或甲醇中，通过使式(VI)中间体与适当的其中m为0或1的式(VII)醛反应，制备本文中称为式(II-a1)中间体的式(II-a)中间体，其中p为1，T为NR8。或者，可在酸性条件下例如用乙酸，在合适的溶剂例如甲醇中用NaBH3CN；或在氢化条件下，在合适的溶剂例如甲醇中用钯-碳催化剂，完成该反应。
可在合适的溶剂例如乙醇或四氢呋喃和水的混合物中，通常在回流下，通过使式(VIII)中间体与适当的酸性溶液例如盐酸或适当的碱金属碱例如氢氧化钠或氢氧化锂反应，制备式(IV)中间体。
可通过使相应的其中R8为氢的式(II-a)或(VIII)化合物与适当的用于引入适当的R8基团的官能化试剂反应，制备式(II-a)和(VIII)中间体，其中p为1，T为NR8，其中R8同以上定义不为氢。例如，当R8为C1-6烷基、C3-7环烷基、羟基C1-6烷基、氰基C1-6烷基C1-6烷氧基C1-6 烷基或羟基氨基羰基C1-6烷基时，则试剂是适当的烷化剂例如适当的烷基卤例如烷基氯，在合适的溶剂例如二甲基甲酰胺中，在碱性条件下例如用三乙胺完成反应。当R8为C1-6烷基羰基或C1-6烷基氨基羰基时，则试剂是适当的酰化剂例如适当的酰卤例如酰氯，在合适的溶剂例如二氯甲烷中，在碱性条件下例如用三乙胺完成反应。当R8为C1-6 烷基磺酰基或一-或二(C1-6烷基)氨基磺酰基时，则试剂是适当的磺酰化试剂例如适当的磺酰卤例如磺酰氯，在常规条件下完成反应。
可通过在适当的试剂例如硼氢化钠的存在下，在合适的溶剂例如二氯乙烷或甲醇中，使式(IX)中间体与以上式(VII)中间体反应，制备本文中称为式(VIII-a)中间体的式(VIII)中间体，其中p为1，T为NR8。或者，可在酸性条件下例如用乙酸，在合适的溶剂例如甲醇中用NaBH3CN，或在氢化条件下在合适的溶剂例如甲醇中用钯-碳催化剂，完成该反应。
或者，可通过在碱例如K2CO3的存在下，在合适的溶剂例如乙腈中，使式(IX)中间体与其中L代表离去基团例如甲磺酰基的式(X)中间体反应，制备式(VIII-a)中间体。
可在N，N′-二异丙基乙胺(DIPEA)和二甲基乙酰胺或在K2CO3和乙腈中，通过使其中L1为离去基团例如卤素例如氯的式(XI)中间体与式(XII)中间体反应，制备式(IX)中间体。
可按照以下流程制备本文中称为式(X-a)中间体的式(X)中间体，其中L为有机磺酰氧基RSO2O，m为1：
阶段(a)：在合适的溶剂例如乙醇中，使式(XIII)中间体与氯化剂例如磺酰氯反应，形成式(XIV)中间体；
阶段(b)：在合适的溶剂例如四氢呋喃中，将式(XIV)中间体例如用氢化锂铝还原，形成式(XV)中间体；
阶段(c)：在碱性条件下例如用三乙胺，在合适的溶剂例如二氯甲烷中，使式(XV)中间体与适当的磺酰化试剂例如氯化物例如甲磺酰氯反应。
可通过在合适的溶剂例如二甲基甲酰胺中，使式(XVI)中间体与其中L2为离去基团例如卤素例如溴的式(XVII)中间体反应，制备本文中称为式(VIII-b)中间体的式(VIII)中间体，其中p为1，T为O。
可在N，N′-二异丙基乙胺(DIPEA)和二氯甲烷中，通过使其中L3 为离去基团例如卤素例如氯的式(XVIII)中间体与式(XIX)化合物反应，制备式(XVI)中间体。
可通过在NaBH(OAc)3的存在下，在合适的溶剂例如二氯乙烷中，使式(XX)中间体与其中m1为0或1的式(XXI)中间体反应，制备本文中称为式(VIII-c)中间体的式(VIII)中间体，其中Y为N，p为0。
本发明还涉及统称为式(B)化合物的式(IIa)、(IV)和(VIII)中间体及其N-氧化物形式、药学上可接受的加成盐和立体化学异构形式，其中 Q为C1-2烷氧基羰基、MO2C(其中M为氢或碱金属)或四氢吡喃氧基氨基羰基，n、m、p、X、Y、T和A同式(I)中定义。
可按照式(I)化合物定义的基团，定义以上中间体的目的化合物、优选的化合物、更优选的和最优选的化合物的基团。
式(I)化合物和某些中间体可在其结构中具有至少一个手性(stereogenic)中心。该手性中心可存在于R或S构型。
按上文所述方法制备的式(I)化合物通常为对映体的外消旋混合物，可按照已知技术拆分方法，将它们彼此分离。可通过与合适的手性酸反应，将外消旋式(I)化合物转化为相应的非对映体盐形式。然后例如通过选择性或分级结晶，将所述非对映体盐形式分离，对映体通过碱从中释放。分离式(I)化合物的对映体形式的备选方法涉及使用手性固定相的液相色谱。如果反应是立体有择的发生，则所述纯立体化学异构形式也可由适当原料的相应纯立体化学异构形式衍生。优选，如果需要特定立体异构体，应通过立体有择制备方法合成所述化合物。这些方法最好使用对映体纯原料。
式(I)化合物、其药学上可接受的酸加成盐和立体异构形式的有价值的药理性质在于它们具有组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制作用。
本发明提供通过给予有效量的本发明化合物抑制包括转化细胞的细胞异常生长的方法。细胞异常生长是指独立于正常调节机制的细胞生长(例如丧失接触抑制)。这包括通过引起癌细胞生长停滞、终末分化和/或凋亡直接抑制肿瘤生长，和通过抑制肿瘤新血管形成而间接抑制肿瘤生长。
本发明还提供通过给予需要这种治疗的患者例如哺乳动物(更尤其是人)有效量的本发明化合物，抑制肿瘤生长的方法。尤其是，本发 明提供通过给予有效量的本发明化合物抑制肿瘤生长的方法。可抑制的肿瘤的实例是但不限于肺癌(例如腺癌和包括非小细胞肺癌)、胰腺癌(例如胰腺癌例如外分泌胰腺癌)、结肠癌(例如结肠直肠癌例如结肠腺癌和结肠腺瘤)、包括晚期疾病的前列腺癌、淋巴系统的造血器官瘤(例如急性淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤)、骨髓性白血病(例如急性髓细胞性白血病(AML))、甲状腺滤泡癌、骨髓增生异常综合征(MDS)、间充质源的肿瘤(例如纤维肉瘤和横纹肌肉瘤)、黑素瘤、畸胎瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、皮肤良性瘤(例如角化棘皮瘤)、乳腺癌(例如晚期乳腺癌)、肾癌、卵巢癌、膀胱癌和表皮癌。
本发明化合物可用于其它治疗目的，例如：
a)在为治疗癌症给予肿瘤放射前、期间或之后，通过给予本发明化合物使肿瘤对放疗敏化；
b)治疗关节病和骨病例如类风湿性关节炎、骨关节炎、青少年关节炎、痛风、多关节炎、银屑病性关节炎、关节强硬性脊椎炎和系统性红斑狼疮；
c)抑制平滑肌细胞增殖，包括血管增殖性疾病、动脉粥样硬化和再狭窄；
d)治疗炎性病症和皮肤病，例如溃疡性结肠炎、局限性回肠炎、过敏性鼻炎、移植物抗宿主疾病、结膜炎、哮喘、ARDS、贝赫切特症、移植排斥、荨麻疹(uticaria)、过敏性皮炎、脱发(alopecia areata)、硬皮病、疹病、湿疹、皮肌炎、痤疮、糖尿病、系统性红斑狼疮、川崎病、多发性硬化、肺气肿、囊性纤维化和慢性支气管炎；
e)治疗子宫内膜异位、子宫纤维瘤、功能不良性子宫出血和子宫内膜增生；
f)治疗包括影响视网膜和脉络膜血管的血管病变的眼血管化；
g)治疗心功能障碍；
h)抑制免疫抑制性疾病，例如治疗HIV感染；
i)治疗肾功能障碍；
j)抑制内分泌障碍；
k)抑制糖原异生功能障碍；
l)治疗神经病例如帕金森病或导致认知障碍的神经病，例如早老性痴呆或聚谷氨酰胺有关的神经元疾病；
m)治疗精神病例如精神分裂症、双相性精神障碍、抑郁症、焦虑症和精神病；
n)抑制神经肌肉病例如肌萎缩性侧索硬化；
o)治疗脊髓性肌萎缩；
p)治疗对通过增强基因表达的治疗响应的其它病症；
q)强化基因疗法；
r)抑制脂肪形成；
s)治疗寄生虫病例如疟疾。
因此，本发明公开了用作药物的式(I)化合物和这些式(I)化合物在制备治疗一种或多种前述病症的药物中的用途。
式(I)化合物及其药学上可接受的酸加成盐和立体异构形式的有价值的诊断性质在于可用它们检测或鉴别生物样品中的HDAC，包括检测或测量由标记化合物和HDAC之间的复合物形成。
检测或鉴别方法可使用用标记剂标记的化合物，这些标记剂是例如放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质等。放射性同位素的实例包括125I、131I、3H和14C。通常通过与适当的底物缀合，将酶制成可测酶，而该缀合物又催化可测反应。其实例包括例如β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、碱性磷酸酯酶、过氧化物酶和苹果酸脱氢酶，优选辣根过氧化物酶。发光物质包括例如鲁米诺、鲁米诺衍生物、荧光素、水母发光蛋白和荧光素酶。
生物样品可定义为体组织或体液。体液的实例是脑脊液、血液、血浆、血清、尿、痰、唾液等。
鉴于它们的有用的药理性质，可将主题化合物配制成用于给药目的的各种药物形式。
为制备本发明药用组合物，使有效量的作为活性成分的碱或酸加成盐形式的特定化合物与药学上可接受的载体充分混合来组合，该载体可采取各种形式，取决于给药所需制剂形式。需要这些药用组合物为单位剂量形式，优选该形式适合口服、直肠、经皮或肠胃外注射给药。例如在制备口服剂型组合物时，在口服液体制剂例如混悬剂、糖浆、酏剂和溶液剂的情况中，可使用任何常用药物介质例如水、二醇、油、醇等；或在散剂、丸剂、胶囊剂和片剂的情况中，可使用固体载体例如淀粉、糖、高岭土、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。
因为它们便于给药，所以片剂和胶囊剂代表最佳口服剂量单位形式，在该情况中，显然使用固体药物载体。对于肠胃外组合物，载体通含包括无菌水，尽管例如可包括助溶的其它成分，但至少大部分为无菌水。例如可制备注射液，其中载体包含盐水溶液、葡萄糖溶液或盐水和葡萄糖溶液的混合物。也可制备注射混悬液，在该情况中可使用适当的液体载体、悬浮剂等。在适合经皮给药的组合物中，载体任选包括促渗剂和/或合适的湿润剂，任选以较小比例与合适的任何性质的添加剂组合，这些添加剂对皮肤不产生明显损害作用。所述添加剂可促进给予皮肤和/或可帮助制备需要的组合物。可按各种方式例如透皮贴剂、喷滴剂(spot-on)或乳膏给予这些组合物。
按便于给药和剂量均匀的剂量单位形式配制前述药用组合物尤其最好。用于本说明书和权利要求的剂量单位形式是指适合作为单位剂量的物理上离散的单位，每单位含经计算可产生需要的疗效的预定量的活性成分和组合应用的需要的药物载体。此类剂量单位形式的实例是片剂(包括刻痕片或包衣片)、胶囊剂、丸剂、袋装散剂、糯米纸囊剂、注射溶液或混悬液、茶匙剂、汤匙剂等及其分离的倍数。
本领域技术人员可容易地由下文中提供的试验结果确定有效量。一般而言，预计治疗有效量将为0.005mg/kg-100mg/kg体重，尤其是0.005mg/kg-10mg/kg体重。可以认识到，在一天中适当时间间隔内，按2、3、4或更多个分剂量给予需要的剂量。可将所述分剂量配制为 单位剂量形式，例如每单位剂量形式含0.5-500mg，尤其10mg-500mg活性成分。
作为本发明的另一方面，预计HDAC抑制剂与另一种抗癌药物的组合尤其可用作药物，更尤其用于治疗癌症或相关疾病。
为治疗以上病症，本发明化合物最好可与一种或多种其他药物联合使用，更尤其与其它抗癌药物联合使用。抗癌药物的实例是：
-铂配位化合物例如顺铂、卡铂或奥沙利铂(oxalyplatin)；
-紫杉烷化合物例如紫杉醇或多西他赛；
-拓扑异构酶I抑制剂例如喜树碱化合物，例如伊立替康或托泊替康；
-拓扑异构酶II抑制剂例如抗肿瘤鬼臼毒素衍生物，例如依托泊苷或替尼泊苷；
-抗肿瘤长春花生物碱例如长春碱、长春新碱或长春瑞滨；
-抗肿瘤核苷衍生物例如5-氟尿嘧啶、吉西他滨或卡培他滨；
-烷化剂例如氮芥或亚硝基脲，例如环磷酰胺、苯丁酸氮芥、卡莫司汀或洛莫司汀；
-抗肿瘤蒽环衍生物例如柔红霉素、多柔比星、伊达比星或米托蒽醌；
-HER2抗体例如曲妥单抗；
-雌激素受体拮抗剂或选择性雌激素受体调节剂，例如他莫昔芬、托瑞米芬、屈洛昔芬、氟维司群(faslodex)或雷洛昔芬；
-芳香酶抑制剂例如依西美坦、阿那曲唑、来曲唑和伏氯唑；
-分化剂例如类维生素A、维生素D和视黄酸代谢阻断剂(RAMBA)，例如异维A酸(accutane)；
-DNA甲基转移酶抑制剂，例如5-氮杂胞苷；
-激酶抑制剂，例如flavoperidol、甲磺酸伊马替尼或吉非替尼(gefitinib)；
-法尼基转移酶抑制剂；
-其它HDAC抑制剂；
-遍在蛋白-蛋白酶体途径抑制剂例如万珂(Velcade)；或
-Yondelis。
本文中使用的术语“铂配位化合物”表示抑制任何肿瘤细胞生长的铂配位化合物，该化合物提供离子形式的铂。
术语“紫杉烷化合物”代表具有紫杉烷环系统并与某些种红豆杉(红豆杉属)树的提取物有关或源自该提取物的一类化合物。
术语“拓扑异构酶抑制剂”用于表示在真核细胞中可改变DNA拓扑结构的酶。它们对重要的细胞功能和细胞增殖至关重要。在真核细胞中有两类拓扑异构酶，即I型和II型。拓扑异构酶I是约100,000分子量的单体酶。该酶与DNA结合，引起瞬时单链断裂，使双螺旋解旋(或让其解旋)，然后在DNA链解离前，将断裂重封。拓扑异构酶II具有相似的作用机制，该机制涉及诱导DNA链断裂或形成自由基。
术语“喜树碱化合物”用于表示与母体喜树碱化合物有关或从母体喜树碱化合物衍生的化合物，母体喜树碱是源自中国喜树(Camptothecin acuminata)和印度臭味假柴龙树(Nothapodytes foetida)的水不溶性生物碱。
术语“鬼臼毒素化合物”用于表示与母体鬼臼毒素有关或从它衍生的化合物，鬼臼毒素是从曼德拉草植物中提取的化合物。
术语“抗肿瘤长春花生物碱”用于表示与长春花属植物(Vincarosea)的提取物有关或从它衍生的化合物。
术语“烷化剂”包括具有共同特征的多组化合物，该特征在于在生理条件下它们具有向生物上必需的大分子例如DNA提供烷基的能力。在多数更重要的药物例如氮芥和亚硝基脲中，经过复杂的降解反应后，在体内产生活性烷基化部分，其中某些反应是酶促反应。烷化剂的最重要的药理作用是干扰涉及细胞增殖尤其DNA合成和细胞分裂的基本机制。烷化剂在快速增殖的组织中干扰DNA功能和完整性的能力为其治疗应用及其多种毒性性质提供基础。
术语“抗肿瘤蒽环衍生物”包括从真菌(Strep.peuticus var.caesius)得到的抗生素及其衍生物，其特征在于具有通过糖苷键与非普通糖氨基糖柔胺(daunosamine)连接的四环素环结构。
己证实人表皮生长因子受体2蛋白(HER 2)在原发性乳腺癌中扩增与某些患者临床预后差有关。曲妥单抗是高度纯化的重组DNA衍生的人源化单克隆IgG1κ抗体，该抗体与HER2受体的细胞外域以高亲和力和特异性结合。
许多乳腺癌具有雌激素受体，这些肿瘤的生长可通过雌激素刺激。术语“雌激素受体拮抗剂”和“选择性雌激素受体调节剂”用于表示雌二醇与雌激素受体(ER)结合的竞争性抑制剂。当与ER结合时，选择性雌激素受体调节剂引起受体的三维形状的改变，调节其与DNA上的雌激素效应元件(ERE)结合。
在绝经后妇女中，循环雌激素的主要来源是通过周围组织中芳香酶将肾上腺和卵巢雄激素(雌烯二酮和睾酮)转化为雌激素(雌酮和雌二醇)。通过芳香酶抑制或失活的雌激素剥夺可有效和选择性治疗某些患依赖激素的乳腺癌的绝经后患者。
本文中使用的术语“抗雌激素药物”不仅包括雌激素受体拮抗剂和选择性雌激素受体调节剂，而且包括上述芳香酶抑制剂。
术语“分化剂”包括可以各种方式抑制细胞增殖和诱导分化的化合物。已知维生物D和类维生素A在调节多种正常和恶性细胞类型的生长和分化中起主要作用。视黄酸代谢阻断剂(RAMBA)通过抑制细胞色素P450-介导的视黄酸分解代谢，增加内源性视黄酸水平。
DNA甲基化改变在人瘤形成中是最常见的异常。选择的基因的启动子中高甲基化通常与涉及的基因失活有关。术语“DNA甲基转移酶抑制剂”用于表示通过药理抑制DNA甲基转移酶和再激活肿瘤抑制基因表达起作用的化合物。
术语“激酶抑制剂”包括涉及细胞周期进展和程序性细胞死亡(凋亡)的激酶活性抑制剂。
术语“法尼基转移酶抑制剂”用于表示设计成阻止Ras和其它细胞内蛋白的法尼基化的化合物。已证实它们对恶性细胞增殖和存活有作用。
术语“其它HDAC抑制剂”包括但不限于：
-羧酸酯(盐)例如丁酸酯(盐)、肉桂酸、4-苯基丁酸酯(盐)或丙戊酸；
-异羟肟酸例如辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、含哌嗪的SAHA类似物、联芳异羟肟酸酯A-161906及其咔唑基(carbozolyl)醚-、四氢吡啶-和四氢萘酮-类似物、双环芳基-N-羟基甲酰胺、pyroxamide、CG-1521、PXD-101、磺酰胺异羟肟酸、LAQ-824、LBH-589、曲古抑菌素A(TSA)、oxamflatin、scriptaid、与scriptaid有关的三环分子、间羧基肉桂酸双异羟肟酸(CBHA)、CBHA样异羟肟酸、trapoxin-异羟肟酸类似物、CRA-024781、R306465和有关的苯甲酰基-和杂芳基-异羟肟酸、氨基辛二酸酯(盐)和丙二酰胺(malonyldiamide)；
-环四肽例如trapoxin、apidicin、缩肽、与spiruchostatin有关的化合物、RedFK-228、含巯基的环四肽(SCOPs)、含异羟肟酸的环四肽(CHAPs)、TAN-174s和azumamides；
-苯甲酰胺类例如MS-275或CI-994，或
-depudecin。
术语“遍在蛋白-蛋白酶体途径抑制剂”用于鉴定在包括细胞周期调节蛋白的蛋白酶体中抑制细胞蛋白靶向破坏的化合物。
对于癌症治疗，本发明化合物可和辐射联合给予上述患者。辐射表示电离辐射且尤其γ辐射，尤其通过直线加速器或目前常用的放射性核素发射的辐射。通过放射性核素辐射肿瘤可以是外部或内部。
本发明还涉及抗癌药和本发明HDAC抑制剂的本发明联合药物。
本发明还涉及用于医疗例如用于抑制肿瘤细胞生长的本发明联合药物。
本发明还涉及抑制肿瘤细胞生长的本发明联合药物。
本发明还涉及抑制人患者中肿瘤细胞生长的方法，该方法包括给予患者有效量的本发明联合药物。
本发明还提供通过给予有效量的本发明联合药物，抑制包括转化细胞的细胞异常生长的方法。
可同时(例如用分开的或单一组合物)，或按任何顺序序贯给予其它药物和HDAC抑制剂。在后一情况中，按足以确保达到有利或协同作用的量和方式，在一定时间内给予两种化合物。可以认识到，对于联合药物中各成分来讲，优选的给药方法和顺序以及各自的剂量和方案应取决于给予的具体其它药物和HDAC抑制剂、它们的给药途径、所治疗的具体肿瘤和所治疗的具体宿主。本领域技术人员可用常规方法和参考本文中所述信息，容易地确定最佳给药方法和顺序以及剂量和方案。
最好按1-500mg/米2(mg/m2)体表面积例如50-400mg/m2剂量给予铂配位化合物，尤其是每疗程按约75mg/m2剂量给予顺铂，按约300mg/m2给予卡铂。
最好按50-400mg/米2(mg/m2)体表面积例如75-250mg/m2剂量给予紫杉烷化合物，尤其是每疗程按约175-250mg/m2剂量给予紫杉醇，按约75-150mg/m2给予多西他赛。
最好按0.1-400mg/米2(mg/m2)体表面积例如1-300mg/m2剂量给予喜树碱化合物，尤其是每疗程按约100-350mg/m2剂量给予伊立替康，按约1-2mg/m2给予托泊替康。
最好按30-300mg/米2(mg/m2)体表面积例如50-250mg/m2剂量给予抗肿瘤鬼臼毒素衍生物，尤其是每疗程按约35-100mg/m2剂量给予依托泊苷，按约50-250mg/m2给予替尼泊苷。
最好按2-30mg/米2(mg/m2)体表面积剂量给予抗肿瘤长春花生物碱，尤其是每疗程按约3-12mg/m2剂量给予长春碱，按约1-2mg/m2剂量给予长春新碱，按约10-30mg/m2剂量给予长春瑞滨。
最好按200-2500mg/米2(mg/m2)体表面积例如700-1500mg/m2 剂量给予抗肿瘤核苷衍生物，尤其是每疗程按200-500mg/m2剂量给予5-FU，按约800-1200mg/m2剂量给予吉西他滨，按约1000-2500mg/m2给予卡培他滨。
最好按100-500mg/米2(mg/m2)体表面积例如120-200mg/m2剂量给予烷化剂例如氮芥或亚硝基脲，尤其是每疗程按约100-500mg/m2剂量给予环磷酰胺，按约0.1-0.2mg/kg剂量给予苯丁酸氮芥，按约150-200mg/m2剂量给予卡莫司汀，按约100-150mg/m2剂量给予洛莫司汀。
最好按10-75mg/米2(mg/m2)体表面积例如15-60mg/m2剂量给予抗肿瘤蒽环衍生物，尤其是每疗程按约40-75mg/m2剂量给予多柔比星，按约25-45mg/m2剂量给予柔红霉素，按约10-15mg/m2剂量给予伊达比星。
最好每疗程按1-5mg/米2(mg/m2)体表面积剂量，尤其是按2-4mg/m2给予曲妥单抗。
最好根据具体药物和所治疗的疾病，按约1-100mg/日剂量给予抗雌激素药。最好按5-50mg，优选10-20mg剂量，每日两次通过口服给予他莫昔芬，该疗法持续足以达到和维持疗效的时间。最好按约60mg剂量，每日一次通过口服给予托瑞米芬，该疗法持续足以达到和维持疗效的时间。最好按约1mg剂量，每日一次通过口服给予阿那曲唑。最好按约20-100mg剂量，每日一次通过口服给予屈洛昔芬。最好按约60mg剂量，每日一次通过口服给予雷洛昔芬。最好按约25mg剂量，每日一次通过口服给予依西美坦。
可按例如每疗程一次、两次或多次给予这些剂量，该疗程可以例如每隔7、14、21或28天重复进行。
鉴于它们的有用的药理性质，可将本发明联合药物中的成分即其它药物和HDAC抑制剂配制成用于给药目的的各种药物形式。可将这 些成分分别配制成单独的药用组合物，或配制成含两种成分的单一药用组合物。
因此，本发明还涉及药用组合物，该组合物含有其它药物和HDAC抑制剂以及一种或多种药物载体。
本发明还涉及药用组合物形式的本发明联合药物，该组合物含有抗癌药和本发明HDAC抑制剂以及一种或多种药物载体。
本发明还涉及本发明联合药物在制备抑制肿瘤细胞生长的药用组合物中的用途。
本发明还涉及含作为第一种活性成分的本发明HDAC抑制剂和作为第二种活性成分的抗癌药的产品，在治疗癌症患者中该产品作为联合制剂同时、分别或序贯使用。
实验部分
在下文中，″DCM″定义为二氯甲烷，″DIPE″定义为二异丙醚，″DMA″定义为N，N-二甲基乙酰胺，″DMF″定义为N，N-二甲基甲酰胺，″EDC″定义为N’-(乙基羰基咪唑基(carbonimidoyl))-N，N-二甲基-1，3-丙二胺一盐酸盐，″EtOAc″定义为乙酸乙酯，″EtOH″定义为乙醇，″HOBT″定义为1-羟基-1H-苯并三唑，″MeOH″定义为甲醇，″TFA″定义为三氟乙酸，″THF″定义为四氢呋喃，″PyBOP″定义为苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷-1-基-磷鎓六氟磷酸盐。
A.中间体化合物的制备
实施例A1
a)中间体1的制备
将2-[4-(氨基甲基)-1-哌啶基]-5-嘧啶甲酸乙酯(0.0045mol)、1-甲基-1H-吲唑-3-甲醛(0.0048mol)和硫酸镁(适量)在MeOH(80ml)中的混合物在室温下搅拌过夜。分批加入四氢硼酸钠(Sodiumtetrahydroborate)(0.0073mol)。将混合物搅拌5小时，倾入水中，用EtOAc萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(2g)经硅胶(15-40μm)柱层析(洗脱液：DCM/MeOH/NH4OH95/5/0.1)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到1.3g(70％)中间体1。
b)中间体2的制备
在75℃下，将中间体1(0.0032mol)和氢氧化钠(0.0064mol)在EtOH(100ml)中的混合物搅拌12小时，然后冷却至室温，蒸发至干，得到1.28g(100％)中间体2。
c)中间体3的制备
在室温下，在N2气流下，将EDC(0.0048mol)和HOBT(0.0048mol)分批加入中间体2(0.0032mol)的DCM(60ml)和THF(60ml)溶液。将混合物在室温下搅拌15分钟。加入O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.0064mol)。将混合物在室温下搅拌48小时，倾入水中，用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(2g)经硅胶(15-40μm)柱层析(洗脱液：DCM/MeOH/NH4OH 93/7/0.5)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发。使残留物(0.6g，39％)在CH3CN/乙醚中结晶。将沉淀滤出，干燥，得到0.45g中间体3，熔点153℃。
实施例A2
a)中间体4的制备
在室温下，将2-[4-(氨基甲基)-1-哌啶基]-5-嘧啶甲酸乙酯(0.0072mol)在THF(40ml)和1N氢氧化钠(40ml)中的混合物搅拌过夜。加入1N盐酸(40ml)。将混合物搅拌10分钟。加入碳酸钠(0.0216mol)。将混合物搅拌10分钟。分批加入1-[[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氧基]-2，5-吡咯烷二酮(0.0072mol)。将混合物在室温下搅拌6小时，然后冷却至0℃，用盐酸酸化。将沉淀过滤，用乙醚洗涤，干燥，得到4.1g(100％)中间体4。
b)中间体5的制备
在10℃下，在N2气流下，将EDC(0.0455mol)和HOBT(0.0455mol)的混合物加入中间体4(0.0379mol)和三乙胺(0.114mol)在DCM/HOBT(800ml)中的混合物。将混合物在室温下搅拌15分钟。加入O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.0455mol)。将混合物在室温下搅拌72小时，倾入水中，用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(23g)经硅胶(20-45μm)柱层析(洗脱液：DCM/MeOH/NH4OH 97/3/0.1)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到9.3g(100％)中间体5。
c)中间体6的制备
在35℃下，将中间体5(0.0355mol)和哌啶(0.089mol)在DCM(400ml)中的混合物搅拌72小时，然后冷却至室温，蒸发。残留物(25g)经硅胶(15-40μm)柱层析(洗脱液：DCM/MeOH/NH4OH 80/20/2)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到6.7g(56％)中间体6，熔点129℃。
d)中间体7的制备
将中间体6(0.0009mol)和1-甲基-1H-苯并三唑-6-甲醛(0.001mol)在MeOH(40ml)中的混合物在室温下搅拌过夜，然后在50℃下搅拌12小时，冷却至室温。加入四氢硼酸钠(0.0013mol)。将混合物在室温下搅拌48小时。加入少量水。将混合物用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(0.5g)经硅胶(5μm)柱层析(洗脱液：DCM/MeOH/NH4OH 90/10/1)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发。使残留物(0.28g，65％)在DIPE中结晶。将沉淀滤出，干燥，得到0.15g中间体7，熔点140℃。
实施例A3
a)中间体8的制备
将2-[4-(氨基甲基)-1-哌啶基]-5-嘧啶甲酸乙酯(0.0038mol)、1-甲基-1H-苯并咪唑-2-甲醛(0.0045mol)和硫酸镁(适量)在MeOH(80ml)中的混合物在60℃下搅拌过夜，然后冷却回室温。分批加入四氢硼酸钠(0.0064mol)。将混合物在室温下搅拌过夜，然后冷却回室温，倾入水中，用EtOAc萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸 发。残留物(1g)经硅胶(20-45μm)柱层析(洗脱液：DCM/MeOH/NH4OH97/3/0.3)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到0.32g中间体8。
b)中间体9的制备
在80℃下，将中间体8(0.0024mol)和氢氧化钠(0.0049mol)在EtOH(80ml)中的混合物搅拌6小时，然后冷却至室温。将沉淀过滤，依次用EtOH、乙醚洗涤，干燥，得到0.8g(82％)中间体9。
c)中间体10的制备
在室温下，在N2气流下，将EDC(0.003mol)和HOBT(0.41g)加入中间体9(0.002mol)在DCM(80ml)和THF(80ml)中的混合物中。将混合物在室温下搅拌15分钟。加入O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.004mol)。将混合物在室温下搅拌72小时，倾入水中，用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(1.8g)经硅胶(15-40μm)柱层析(洗脱液：DCM/MeOH/NH4OH 95/5/0.5)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发。使残留物(0.63g，66％)在乙醚中结晶。将沉淀滤出，干燥，得到0.5g中间体10，熔点196℃。
实施例A4
a)中间体11的制备
在N2气流下，将2-(甲磺酰基)-5-嘧啶甲酸乙酯(0.0118mol)的乙腈(30ml)溶液滴加到(2-吗啉基甲基)-氨基甲酸1，1-二甲基乙酯(0.0098mol)和碳酸钾(0.0196mol)的乙腈(80ml)溶液中。将混合物在室温下搅拌12小时，倾入水中，用EtOAc萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发至干。残留物(5.6g)经硅胶(15-35μm)柱层析(洗脱液：DCM/MeOH 99/1)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发。使残留物(0.75g，75％)在乙醚中结晶。将沉淀滤出，干燥，得到0.3g中间体11，熔点100℃
b)中间体12的制备
在0℃下，将TFA(7.5ml)加入中间体11(0.037mol)在DCM(150ml)中的混合物中。将混合物在室温下搅拌48小时。将溶剂蒸发。加入乙醚。将沉淀滤出，干燥，得到13.5g(96％)中间体12，熔点180℃。
c)中间体13的制备
将中间体12(0.0087mol)和1-甲基-1H-吲唑-3-甲醛(0.013mol)在MeOH(100ml)中的混合物在60℃下搅拌过夜，然后冷却至10℃。加入四氢硼酸钠(0.015mol)。将混合物在室温下搅拌48小时，倾入水中，用EtOAc萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(4.6g)经硅胶(15-40μm)柱层析(洗脱液：DCM/MeOH/NH4OH97/3//0.1)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到1.9g(62％)中间体13。
d)中间体14的制备
将中间体13(0.0054mol)和氢氧化钠(0.0108mol)在EtOH(80ml)中的混合物在80℃下搅拌过夜，然后冷却至室温，蒸发，得到2.1g(100％)中间体14。
e)中间体15的制备
在室温下，在N2气流下，将三乙胺(0.0075mol)加入中间体14(0.0025mol)的THF/DCM(20ml)溶液中。将混合物搅拌15分钟。加入O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.005mol)。将混合物在室温下搅拌72小时，倾入水中，用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(1.7g)经硅胶(15-40μm)柱层析(洗脱液：DCM/MeOH/H2O 95/5//0.9)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到0.34g(29％)中间体15。
实施例A5
a)中间体16的制备
在60℃下，将6-(1-哌嗪基)-3-吡啶甲酸乙酯(0.0094mol)和1-甲基-1H-吲唑-3-甲醛(0.0131mol)在1，2-二氯乙烷(60ml)中的混合物搅拌24小时，然后冷却至10℃。加入三(乙酸根合-α-O)硼氢化(1-)钠(0.016mol)。将混合物在室温下搅拌48小时，倾入水中，用EtOAc萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发，残留物(5.5g)经硅 胶(15-40μm)柱层析(洗脱液：DCM/MeOH/NH4OH 98/2/0.1)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发。使残留物(0.725g)在乙醚中结晶。将沉淀滤出，干燥，得到0.43g中间体16，熔点237℃。
b)中间体17的制备
在80℃下，将中间体16(0.0008mol)和氢氧化钠(0.0017mol)在EtOH(100ml)中的混合物搅拌过夜，然后冷却至室温。将沉淀过滤，依次用EtOH、乙醚洗涤，干燥，得到3g(94％)中间体17。
实施例A6
a)中间体18的制备
在室温下，在N2气流下，将2-氯-5-嘧啶甲酸甲酯(0.033mol)的DCM(80ml)溶液加入4-哌啶甲醇(0.066mol)和N-乙基-N-(1-甲基乙基)-2-丙胺(0.083mol)的DCM(100ml)溶液中。将混合物在室温下搅拌3小时又30分钟，倾入冰水中，用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。将残留物溶于戊烷。将沉淀滤出，干燥，得到7.88g(95％)中间体18。
b)中间体19的制备
在140℃下，将中间体18(0.01mol)和5-(溴甲基)-1-甲基-1H-苯并三唑(0.0035mol)在DMF(30ml)中的混合物搅拌6小时。将溶剂蒸发。 将残留物溶于EtOAc。将有机层依次用水、饱和氯化钠洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。将残留物与用类似方法制备的另一份流分合并，得到4g，然后经硅胶(15-40μm)柱层析(洗脱液：DCM/MeOH99/1)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发。残留物(0.9g)经硅胶(15-40μm)柱层析(洗脱液：DCM/MeOH 99/1)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到0.22g中间体19。
c)中间体20的制备
在室温下，将中间体19(0.0011mol)和氢氧化锂(0.0021mol)在THF(10ml)和水(10ml)中的混合物搅拌24小时。将溶剂蒸发。加入水(10ml)。将混合物用乙醚洗涤两次。将水层用3N盐酸酸化至pH4。将沉淀过滤，用水洗涤，干燥，得到0.29g(71％)中间体20。
d)中间体21的制备
在室温下，将EDC(0.001mol)和HOBT(0.001mol)加入到中间体20(0.0007mol)、O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.001mol)和三乙胺(0.003mol)在DCM/THF(50/50)(40ml)中的混合物中。将混合物在室温下搅拌48小时，倾入水中，用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(0.28g)经硅胶(15-40μm)柱层析(洗脱液：DCM/MeOH 98/2)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到：0.28g(80％)。使得到的部分残留物(0.04g)在乙醚中结晶。将沉淀滤出，干燥，得到0.032g中间体21，熔点159℃。
实施例A7
a)中间体22的制备
在室温下，在N2气流下，将硫酸镁(适量)加入2-[4-(氨基甲基)-1-哌啶基]-5-嘧啶甲酸乙酯(0.0013mol)和2-苯并噻唑甲醛(0.0015mol)的MeOH(15ml)溶液中。将混合物搅拌回流48小时，然后冷却至10℃。加入四氢硼酸钠(0.0026mol)。将混合物在室温下搅拌4小时。加入DCM(15ml)。将混合物搅拌过夜，倾入冰水中，用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发，得到0.5g中间体22。该产物直接用于下步反应。
b)中间体23的制备
在室温下，在3巴压力下，将中间体22(0.0012mol)和Pd/C(0.5g)在MeOH(40ml)中的混合物氢化48小时，然后通过硅藻土过滤。将滤液蒸发至干。残留物(0.46g)经硅胶(5μm)柱层析(洗脱液：DCM/MeOH 100/0-95/5)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到0.143g(30％)中间体23。
c)中间体24的制备
将中间体23(0.0003mol)和氢氧化钠(0.0014mol)在EtOH(15ml)中的混合物搅拌回流4小时，然后冷却至室温，将溶剂蒸发至干。将残留物溶于乙醚。将沉淀滤出，干燥，得到0.14g(100％)中间体24，熔点＞260℃。
d)中间体25的制备
在室温下，在N2气流下，将EDC(0.0007mol)和HOBT(0.0007mol)加入中间体24(0.0003mol)的THF(15ml)和DCM(15ml)溶液中。将混合物搅拌15分钟。加入O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.0007mol)。将混合物在室温下搅拌3天，倾入冰水中，用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(0.24g)经硅胶(10μm)柱层析(洗脱液：DCM/MeOH 98/2)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到0.075g(17％)中间体25。
实施例A8
中间体26的制备
在5℃下，在N2气流下，将甲磺酰氯(0.0046mol)加入1-甲基-1H-苯并三唑-5-甲醇(0.0031mol)和三乙胺(0.0092mol)在DCM(50ml)中的混合物。将混合物在10℃下搅拌2小时又30分钟，然后蒸发至干，得到中间体26。该产物直接用于下步反应。
实施例A9
a)中间体27的制备
在室温下，将2-[4-(氨基甲基)-1-哌啶基]-5-嘧啶甲酸乙酯(0.0038mol)、乙醛(0.0076mol)和Pd/C(0.2g)在MeOH(100ml)中的混合物氢化24小时，然后通过硅藻土过滤。将滤液蒸发至干，残留物(2.35g)经硅胶(15-40μm)柱层析(洗脱液：DCM/MeOH/NH4OH 90/10/0.5)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到0.66g(30％)中间体27。
b)中间体28的制备
将中间体27(0.002mol)、中间体26(0.0031mol)和碳酸钾(0.0061mol)在乙腈(60ml)中的混合物搅拌回流过夜，然后冷却至室温，倾入冰水中，用EtOAc萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(0.76g)经硅胶(5μm)柱层析(洗脱液：DCM/MeOH 100/0-98/2)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到0.42g(47％)中间体28。
c)中间体29的制备
将中间体28(0.0009mol)和氢氧化钠(0.0038mol)在EtOH(50ml)中的混合物搅拌回流4小时，然后冷却至室温，溶于乙醚。将沉淀滤出，干燥，得到0.35g(85％)中间体29，熔点＞260℃。
d)中间体30的制备
在室温下，在N2气流下，将EDC(0.0016mol)和HOBT(0.0016mol)加入中间体29(0.0008mol)的THF(40ml)和DCM(40ml)溶液中。 将混合物搅拌30分钟。加入O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.0016mol)。将混合物在室温下搅拌5天，倾入冰水中，用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(0.6g)经硅胶(5μm)柱层析(洗脱液：DCM/MeOH/NH4OH 99/1/0.05-93/7/0.35)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到0.285g(70％)中间体30。
实施例A10
a)中间体31的制备
在N2气流下，将2-氯-5-嘧啶甲酸甲酯(0.058mol)的DMA(80ml)溶液滴加到4-哌啶甲胺(0.116mol)和N-乙基-N-(1-甲基乙基)-2-丙胺(0.145mol)的DMA(150ml)溶液中。将混合物在室温下搅拌1小时又30分钟，倾入冰水中，依次用EtOAc、DCM萃取。将有机层用水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。使残留物在DIPE中结晶。将沉淀滤出，干燥，得到10g(65％)中间体31。
b)中间体32的制备
将中间体31(0.008mol)和1-甲基-1H苯并三唑-6-甲醛(0.0087mol)在MeOH(250ml)中的混合物搅拌回流15小时，然后冷却至5℃。分批加入四氢硼酸钠(0.0112mol)。将混合物在5℃下搅拌1小时，然后在室温下搅拌1小时，倾在冰上。将沉淀过滤，用水洗涤，干燥。残留物(3.1g)经硅胶(15-40μm)柱层析(洗脱液：DCM/MeOH/NH4OH95/5/0.2)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到2g(63％)中间体32。
c)中间体33的制备
将中间体32(0.0018mol)、碘乙烷(0.0037mol)和三乙胺(0.0056mol)在DMF(3.5ml)中的混合物在70℃下搅拌24小时。将溶剂蒸发。将残留物溶于水。将混合物用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(0.9g)(经硅胶(15-40μm)柱层析(洗脱液：DCM/MeOH 98/2纯化)。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到0.41g(51％)中间体33。
d)中间体34的制备
在室温下，将中间体33(0.0009mol)和氢氧化锂(0.0018mol)在THF(25ml)和水(12.5ml)中的混合物搅拌15小时。加入3N盐酸至pH4。将混合物用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发，得到0.35g(83％)中间体34。
e)中间体35的制备
在室温下，将EDC(0.0012mol)和HOBT(0.0012mol)加入中间体34(0.0007mol)、O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.0012mol)和三乙胺(0.0025mol)的DCM/THF(60ml)溶液中。将混合物在室温下搅拌48小时，倾入水中，用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(0.55g)经硅胶(5μm)柱层析(洗脱液： DCM/MeOH/NH4OH 99/1/0.1-93/7/0.7)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到0.31g(72％)中间体35。
实施例A11
a)中间体36的制备
在室温下，在3巴压力下，将2-[4-(氨基甲基)-1-哌啶基]-5-嘧啶甲酸乙酯(0.0013mol)、1-甲基-1H-苯并三唑-5-甲醛(0.0015mol)和Pd/C(0.1g)在MeOH(40ml)中的混合物氢化4天，然后通过硅藻土过滤。将滤液蒸发至干。残留物(0.6g)经硅胶(5μm)柱层析(洗脱液：DCM/MeOH100/0-95/5)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到0.23g(43％)中间体36。
b)中间体37的制备
将中间体36(0.0012mol)、氯代乙酸乙酯(0.0018mol)和三乙胺(0.0036mol)在DMF(10ml)中的混合物在50℃下搅拌24小时，然后在80℃下搅拌24小时，冷却至室温，倾入冰水中，用EtOAc萃取。将有机层用水洗涤，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(0.56g)经硅胶(10μm)柱层析(洗脱液：DCM/MeOH 99.5/0.5)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到0.21g(35％)中间体37。
c)中间体38的制备
将中间体37(0.0004mol)和氢氧化钠(0.0017mol)在EtOH(20ml)中的混合物搅拌回流6小时，然后在室温下搅拌过夜，蒸发至干。将残留物溶于乙醚。将沉淀滤出，干燥，得到0.2g(100％)中间体38，熔点＞260℃。
d)中间体39的制备
在室温下，在N2气流下，将EDC(0.0016mol)和HOBT(0.0016mol)加入中间体38(0.0004mol)的THF(25ml)和DCM(25ml)溶液中。将混合物搅拌15分钟。加入O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.0016mol)。将混合物在室温下搅拌4天，倾入水中，用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(0.5g)经硅胶(5μm)柱层析(洗脱液：DCM/MeOH/NH4OH 99/1/0.05-92/8/0.4)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到0.18g(71％)中间体39。
实施例A12
a)中间体40的制备
在5℃下，将甲磺酰氯(0.0018mol)滴加到中间体32(0.0012mol)和三乙胺(0.0037mol)的DCM(20ml)溶液中。将混合物在室温下搅拌15小时，倾入冰水中，用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。使残留物在DIPE中结晶。将沉淀滤出，干燥，得到0.53g(88％)中间体40，熔点190℃。
b)中间体41的制备
将中间体40(0.001mol)和氢氧化锂(0.002mol)在THF(30ml)和水(10ml)中的混合物在室温下搅拌15小时，然后加入3N盐酸中和。将溶剂蒸发。将沉淀过滤，依次用水、乙醚洗涤，干燥，得到0.3g(64％)中间体41。
c)中间体42的制备
在室温下，将EDC(0.0009mol)和HOBT(0.0009mol)加入中间体41(0.0006mol)、O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.0009mol)和三乙胺(0.0019mol)的DCM/THF(50/50)(30ml)溶液。将混合物在室温下搅拌48小时，倾入水中，用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(0.5g)经硅胶(15-40μm)柱层析(洗脱液：DCM/MeOH/NH4OH 97/3/0.1)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到0.33g(92％)中间体42。
实施例A13
a)中间体43的制备
在室温下，依次将三乙胺(0.011mol)、丙酰氯(0.0049 mol)滴加到中间体1(0.0038mol)的DCM(80ml)溶液中。将混合物在室温搅拌过夜，倾入冰水中，用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(2g)经硅胶(15-40μm)柱层析(洗脱液：DCM/MeOH 99/1)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发。使该流分(1.4g，80％)在乙醚/DIPE中结晶。将沉淀滤出，干燥，得到1.05g中间体43，熔点116℃。
b)中间体44的制备
在60℃下，将中间体43(0.0021mol)和氢氧化钠(0.17g)在EtOH(80ml)中的混合物搅拌15小时，冷却至室温，蒸发。将残留物溶于乙醚。将沉淀滤出，干燥，得到1.1g(100％)中间体44。
c)中间体45的制备
在室温下，在N2气流下，将EDC(0.0032mol)和HOBT(0.0032mol)加入中间体44(0.0021mol)和三乙胺(0.0065mol)的DCM/THF(120ml)溶液。将混合物在室温下搅拌15分钟。加入O-(四氢-2H-吡喃-2-基)-羟胺(0.0043mol)。将混合物在室温下搅拌72小时，倾入水中，用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(1.8g)经硅胶(15-40μm)柱层析(洗脱液：DCM/MeOH/NH4OH95/5/0.3)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发。使残留物(0.87g，75％)在乙醚/DIPE中结晶。将沉淀滤出，干燥，得到0.565g中间体45。
实施例A14
a)中间体46的制备
在-70℃下，在N2气流下，将氢化二(2-甲基丙基)铝(0.0344mol)加入1-丙基-1H-吲唑-3-甲酸甲酯(0.0138mol)的THF(140ml)溶液中。将混合物在-70℃下搅拌，然后升温至室温，保持1小时，倾入1N HCl和冰中，用EtOAc萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发，得到2.8g(100％)中间体46。
b)中间体47的制备
将中间体46(0.0138mol)和氧化镁(0.097mol)在DCM(150ml)中的混合物在室温下搅拌过夜，然后通过硅藻土过滤。将硅藻土用MeOH洗涤。将滤液蒸发，得到2.2g(85％)中间体47。
c)中间体48的制备
在60℃下，将6-(1-哌嗪基)-3-吡啶甲酸乙酯(0.0057mol)和中间体47(0.008mol)在1，2-二氯乙烷(30ml)中的混合物搅拌24小时，然后冷却至室温。分批加入NaBH(OAc)3(0.0096mol)。将混合物在室温下搅拌5小时，倾入水中，用EtOAc萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(3g)经硅胶(15-40μm)柱层析(洗脱液：DCM/MeOH/NH4OH 97/3/0.1)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到1.4g(61％)中间体48。
d)中间体49的制备
在80℃下，将中间体48(0.0025mol)和氢氧化钠(0.0049mol)在EtOH(60ml)中的混合物搅拌4小时，然后冷却至室温。将沉淀过滤，用EtOH洗涤。将滤液(0.25g)蒸发至干，得到0.7g中间体49。
e)中间体50的制备
在室温下，将三乙胺(0.002mol)加入中间体49(0.0005mol)、[2-氨基-4-(2-噻吩基)苯基]-氨基甲酸1，1-二甲基乙酯(0.001mol)和PyBOP(0.0011mol)的THF(3ml)和DCM(3ml)溶液中。将混合物在室温下搅拌48小时，倾入水中，用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(1g)经硅胶(15-40μm)柱层析(洗脱液：DCM/MeOH/NH4OH 93/7/0.5)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发，得到0.14g(43％)中间体50。
B.终化合物的制备
实施例B1
化合物1的制备
在室温下，将TFA(2ml)滴加到中间体3(0.001mol)在MeOH(40ml)中的混合物。将混合物在室温下搅拌24小时，然后蒸发至干，使残留物在CH3CN/乙醚中结晶。将沉淀滤出，干燥，得到0.336g(65％)化合物1，熔点197℃。
实施例B2
化合物2的制备
在5℃下，将TFA(1.7ml)加入中间体7(0.0007mol)的MeOH(34ml)溶液。将混合物在室温下搅拌48小时，然后蒸发至干。使残留物在乙醚/CH3CN中结晶。将沉淀过滤，用乙醚洗涤，干燥，得到0.32g(90％)化合物2，熔点206℃。
实施例B3
化合物3的制备
在室温下，将中间体10(0.001mol)在TFA(2.5ml)和MeOH(50ml)中的混合物搅拌72小时，然后蒸发。使残留物在CH3CN/乙醚中结晶。将沉淀滤出，干燥，得到0.5g(96％)化合物3，熔点209℃。
实施例B4
化合物4的制备
在室温下，将中间体15(0.0007mol)在TFA(2ml)和MeOH(40ml)中的混合物搅拌24小时，然后蒸发。使残留物在CH3CN/乙醚中结晶。将沉淀过滤，干燥，得到0.241g(65％)化合物4，熔点193℃。
实施例B5
化合物5的制备
在室温下，将三乙胺(0.01mol)加入到中间体14(0.0025mol)、1，2-苯二胺(0.0058mol)和PyBOP(0.005mol)的THF(30ml)和DCM(30ml)溶液。将混合物在室温下搅拌48小时，倾入水中，用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(4.3g)经硅胶(15-40μm)柱层析(洗脱液：DCM/MeOH/NH4OH 95/5/0.5-93/7/0.5)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发。使残留物(0.4g，34％)在乙醚中结晶。将沉淀滤出，干燥，得到0.288g化合物5，熔点152℃。
实施例B6
化合物6的制备
在室温下，将三乙胺(0.022mol)加入中间体17(0.0054mol)、1，2-苯二胺(0.0124mol)和PyBOP(0.0108mol)的THF(50ml)和DCM(50ml)溶液中。将混合物在室温下搅拌48小时，倾入水中，用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发。残留物(8.3g)经硅胶(15-40μm)柱层析(洗脱液：DCM/MeOH/NH4OH 96/4/0.4)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发。使残留物(0.48g，21％)在乙醚中结晶。将沉淀滤出，干燥，得到0.314g化合物6，熔点219℃。
实施例B7
化合物7的制备
在5℃下，将TFA(0.9ml)滴加到中间体21(0.0003mol)的MeOH(18ml)和DCM(6ml)溶液。将混合物在室温下搅拌48小时。将溶剂蒸发一半。将沉淀滤出，用乙醚洗涤，干燥，得到0.135g(71％)化合物7，熔点197℃。
实施例B8
化合物8的制备
将中间体25(0.0001mol)在TFA(0.3ml)和MeOH(8ml)中的混合物在室温下搅拌3天，然后蒸发至干。使残留物在MeOH/CH3CN/乙醚中结晶。将沉淀滤出，干燥，得到0.049g(64％)化合物8，熔点208℃。
实施例B9
化合物9的制备
将中间体30(0.0005mol)在TFA(1.5ml)和MeOH(30ml)中的混合物在室温下搅拌24小时，然后蒸发至干。残留物(0.38g)经氨基涂布的硅胶(amino coated silica gel)(25-40μ)柱层析(洗脱液：DCM/MeOH/水80/20/2)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发。使残留物(0.185g，78％)在CH3CN/乙醚中结晶。将沉淀滤出，干燥，得到0.15g(63％)化合物9，熔点168℃。
实施例B10
化合物10的制备
在5℃下，将TFA(1.5ml)加入中间体35(0.0005mol)的MeOH(30ml)溶液中。将混合物在室温下搅拌48小时，然后蒸发至干。使残留物在乙醚中结晶。将沉淀滤出，干燥，得到0.295g(93％)化合物10，熔点110℃。
实施例B11
化合物11的制备
在室温下，将中间体39(0.0002mol)在TFA(1ml)和MeOH(20ml)中的混合物搅拌7天，然后蒸发至干。残留物(0.2g)经氨基涂布的硅胶(25-40μm)柱层析(洗脱液：DCM/MeOH/NH4OH 80/20/2)纯化。将纯流分收集，将溶剂蒸发。使残留物(0.073g)在乙醚中结晶。将沉淀滤出，干燥，得到0.061g(46％)化合物11，熔点130℃。
实施例B12
化合物12的制备
在5℃下，将TFA(1.6ml)滴加到中间体42(0.0005mol)的MeOH(32ml)溶液中。将混合物在室温下搅拌15小时。加入DCM(20ml)。将混合物在室温下搅拌3天。将DCM蒸发。将沉淀滤出，依次用MeOH、乙醚洗涤，干燥，得到0.24g(88％)化合物12，熔点260℃。
实施例B13
化合物13的制备
在室温下，将中间体45(0.0014mol)在TFA(4ml)和MeOH(80ml)中的混合物搅拌24小时，然后蒸发。使残留物在CH3CN/乙醚中结晶。将沉淀滤出，干燥，得到0.449g(71％)化合物13，熔点199℃。
实施例B14
化合物31的制备
将中间体50(0.0002mol)在TFA(0.5ml)和DCM(5ml)中的混合物在室温下搅拌4小时，倾入冰水中，用10％碳酸钾碱化，用DCM萃取。将有机层分离，干燥(MgSO4)，过滤，将溶剂蒸发，得到0.073g(63％)化合物31，熔点138℃。
表F-1列出按以上实施例之一制备的化合物。在该表中使用以下缩写：C2HF3O2代表三氟乙酸盐。
表F-1
C.药理实施例：
由抑制组蛋白脱乙酰酶的体外测定方法(参见实施例C.1)测量由式(I)化合物得到的HDAC酶活性抑制。
用测定细胞毒性或存活的比色法，测定式(I)化合物对A2780肿瘤细胞的细胞活性(Mosmann Tim，Journal of Immunological Methods 65：55-63，1983)(参见实施例C.2)。
化合物的溶解度测量化合物停留在溶液中的能力。按照第一种方法，测量稀释后的化合物停留在水溶液中的能力(参见实施例C.3.a)。按连续3步，用单一水性缓冲溶剂稀释DMSO贮备液。对于每次稀释，用浊度计测量浊度。
按照第二种方法(C.3.b)，然后用BD Gentest溶解度扫描仪(Solubility Scanner)扫描混合物中出现的沉淀。
按照第三种方法，可用化学发光氮检测仪(ChemiluminescentNitrogen Detector)测量不同pH化合物的溶解度(参见实施例C.3.c)。
药物渗透率表示其从一种介质迁移到或通过另一种介质的能力。尤其是，其通过肠粘膜进入血液和/或从血液进入靶的能力。可通过形成过滤固相人造磷脂双层膜，测量渗透率(参见实施例C.4)。在过滤固相人造膜测定中，在当系统与缓冲水溶液接触时，在滤器通道内形成多个层状双层的条件下，用96孔微量滴定板和96孔滤板形成“夹层”，以使各复合孔分成两室，下部为供体溶液，上部为受体溶液，两室由涂布2％(w/v)二油酰基磷脂酰胆碱的十二烷溶液的125μm微量滤盘(0.45μm孔)分隔。以cm/s为单位，测量通过该人造膜的化合物的渗透率。目的是检测通过2种不同pH：4.0和7.4的平行人造膜的药物的渗透。在250-500nm最佳波长处，用UV光谱法检测化合物。
药物代谢表示脂溶性异生或体内生化合物通过酶转化为(a)极性、水溶性和可排泄的代谢物。药物代谢的主要器官是肝脏。代谢产物通常比母体药物的活性小或失活。但是，某些代谢物可具有增强的活性或毒性作用。因此，药物代谢可包括“解毒”和“中毒”过程。决定生物体处理药物和化学物质能力的主要酶系统之一由细胞色素P450单加氧酶代表，该酶是依赖NADPH的酶。可用亚细胞人组织测定化合物的体外代谢稳定性(参见实施例C.5.a.)。在本文中，以这些化合物与微粒体温育15分钟后代谢的药物百分比表示化合物的代谢稳定性。通过LC-MS分析定量化合物。也可通过计算化合物在大鼠肝细胞中的半衰期，测定化合物的代谢稳定性(参见实施例C.5.b.)。
已证实多种抗肿瘤药物激活p21蛋白，这些药物包括DNA损伤剂和组蛋白脱乙酰酶抑制剂。DNA损伤剂通过肿瘤抑制剂p53激活p21基因，而组蛋白脱乙酰酶抑制剂通过转录因子Sp1转录激活p21基因。因此，DNA损伤剂通过p53效应元件激活p21启动子，而组蛋 白脱乙酰酶抑制剂通过sp1位点(相对于TATA箱位于-60bp至+40bp区域)激活p21启动子，两者均导致p21蛋白表达增加。当细胞中的p21启动子由p21 1300bp启动子片段(该片段不含p53效应元件)组成时，则它不对DNA损伤剂产生应答。可按几种方法评价化合物诱导p21的能力。第一种方法是用目的化合物处理肿瘤细胞，将细胞裂解后，用p21酶连接的免疫吸附剂测定(Oncogene的WAF1 ELISA)检测p21诱导。p21测定是使用小鼠单克隆和兔多克隆抗体的“夹心式”酶免疫测定。对人p21蛋白有特异性的兔多克隆抗体已固定化在由试剂盒提供的塑料孔表面上。待测定的存在于样品中的任何p21将与捕获抗体结合。生物素化探测器单克隆抗体还识别人p21蛋白，且与由捕获抗体截留的任何p21结合。探测器抗体又与辣根过氧化物酶-缀合的链霉抗生素结合。在辣根过氧化物酶催化下，显色底物四甲基联苯胺由无色溶液转化为蓝色溶液(或加入终止试剂后变黄色)，其强度与和板结合的p21蛋白的量成比例。用分光光度计定量有色反应产物。通过用已知p21浓度(提供的冻干的)建立标准曲线，完成定量。该测定法可测量因DNA损伤或组蛋白脱乙酰酶抑制产生的p21诱导(参见实施例C.6.a.)。
另一种方法测试化合物在细胞水平上抑制HDAC从而诱导p21的能力。可用含p21 1300bp启动子片段的表达载体稳定转染细胞，该片段不含p53效应元件，其中相对于对照水平报道基因表达增加，因为具有p21的诱导能力而鉴定化合物。该报道基因是荧光蛋白，按发射的荧光量测量报道基因的表达(参见实施例C.6.b.)。最后一种方法是体内方法，其中用小鼠筛选化合物的药物活性。可以足够实现肿瘤产生的量，将上述稳定转染的肿瘤细胞给予小鼠。当肿瘤细胞具有形成肿瘤的足够时间后，可将潜在活性化合物给予动物，可通过测量报道基因的表达，评价所述化合物对肿瘤细胞的作用。与对照水平相比，与药物活性化合物一起温育导致报道基因表达增加(参见实施例C.6.c.)。
特异性HDAC抑制剂应不抑制其它酶例如高丰度CYP P450蛋白。CYP P450(大肠杆菌(E.coli)表达的)蛋白3A4、2D6和(en)2C9将它们的特异性底物转化为荧光分子。CYP3A4蛋白将7-苄氧基-三氟甲基香豆素(BFC)转化为7-羟基-三氟甲基香豆素。CYP2D6蛋白将3-[2-(N，N-二乙基-N-甲基氨基)乙基]-7-甲氧基-4-甲基香豆素(AMMC)转化为3-[2-(N，N-二乙基氨基)乙基]-7-羟基-4-甲基香豆素盐酸盐，CYP2C9蛋白将7-甲氧基-4-三氟甲基香豆素(MFC)转化为7-羟基-三氟甲基香豆素。抑制酶反应的化合物会导致荧光信号减少(参见实施例C.7)。
实施例C.1.：用荧光标记的底物体外测定组蛋白脱乙酰酶的抑制：
使用Biomol的HDAC荧光活性测定/药物发现(Drug Discovery)试剂盒(目录编号：AK-500-0001)。HDAC荧光活性测定以Fluor de Lys(荧光组蛋白脱乙酰酶赖氨酰)底物和显影剂组合为基础。Fluor de Lys底物含乙酰化赖氨酸侧链。底物脱乙酰化使底物增敏，以便在第二步用Fluor de Lys显影剂处理，产生荧光团。
在60μg/ml下，使HeLa核提取物(供应商：Biomol)与75μM底物一起温育。将Fluor de Lys底物加入到含25mM Tris，137mM NaCl，2.7mM KCl和1mM MgCl2.6H2O，pH7.4的缓冲液中。30min后，加入1体积显影剂。用355nm光激发荧光团，在荧光板读出器上检测发射光(450nm)。对于各实验，用对照(含HeLa核提取物和缓冲液)、空白温育物(含缓冲液但不含HeLa核提取物)和样品(含进一步用缓冲液稀释的化合物的DMSO溶液和HeLa核提取物)进行平行试验。在第一种情况中，在10-5M浓度下测试化合物。当在10-5M下化合物出现活性时，制备浓度-反应曲线，其中在10-5M-10-9M浓度中测试化合物。对所有样品均进行4次试验。在每次试验中，从对照和样品值中扣除空白值。对照样品代表100％的底物脱乙酰化。对于各样品，以对照平均值的百分比表示荧光值。适当时，用用于分级数据的概率分 析计算IC50值(将代谢物的量减少至对照的50％所需的药物浓度)。在本文中，试验化合物的作用以pIC50(IC50值的负log值)表示(参见表F-2)。
实施例C.2：在A2780细胞上测定抗增殖活性
将所有供试化合物溶于DMSO，再用培养基制备稀释液。在细胞增殖测定中，终DMSO浓度从不超过0.1％(v/v)。对照含A2780细胞和不含化合物的DMSO，空白含DMSO但不含细胞。按5mg/ml，将MTT溶于PBS。制备用NaOH(1N)缓冲至pH 10.5的由0.1M甘氨酸和0.1M NaCl组成的甘氨酸缓冲液(所有试剂均得自Merck)。
将人A2780卵巢癌细胞(Dr.T.C.Hamilton[Fox Chase CancerCentre，Pennsylvania，USA]赠送)在补充2mM L-谷氨酰胺，50μg/ml庆大霉素和10％肽牛血清的RPMI 1640培养基中培养。按惯例，在37℃下，在潮湿的5％CO2气氛下，将细胞按单层保持培养。按1∶40分裂比，用胰蛋白酶/EDTA溶液使细胞传代，每周一次。所有培养基和补充物均得自Life Technologies。用Gen-探针支原体组织培养(Gen-ProbeMycoplasma Tissue Culture)试剂盒(供应商：BioMérieux)测定，细胞未受菌质污染。
将细胞接种在NUNCTM 96孔培养板(供应商：Life Technologies)中，让其贴附在塑料上过夜。接种密度为1500细胞/孔，总体积为200μl培养基。细胞贴板后，改换培养基，加入药物和/或溶剂至终体积200μl。温育4天后，用200μl新制培养基替换培养基，用基于MTT的测定方法评价细胞密度和生存力。向各孔中加入25μl MTT溶液，在37℃下，将细胞再温育2小时。然后小心吸出培养基，通过依次加入25μl甘氨酸缓冲液、100μl DMSO，将蓝色MTT-甲 
产物溶解。在微量板摇床上，振摇微量试验板10min，在540nm处，用Emax 96孔分光光度计(供应商：Sopachem)测量吸光率。在实验中，各实验条件下的结果为3个重复孔的平均值。对于初步筛选目的，按10-6M单一 固定浓度，测试化合物。对于活性化合物，重复进行实验，建立完全浓度-反应曲线。对于各实验，用对照(不含药物)和空白温育物(不含细胞或药物)进行平行试验。从所有对照和样品值中扣除空白值。对于各样品，按对照细胞生长平均值的百分率表示细胞生长的平均值(以吸光率单位计)。适当时，用用于分级数据的概率分析计算IC50值(将细胞生长减少至对照的50％所需要的药物浓度)(Finney，D.J.，ProbitAnalyses，第2版，第10章，分级响应(Graded Responses)，CambridgeUniversity Press，Cambridge 1962)。在本文中，以pIC50(IC50值的负log值)表示试验化合物的作用(参见表F-2)。
实施例C.3：溶解度/稳定性
C.3.a.在水性介质中的动态溶解度
在第一步稀释中，将活性化合物溶于DMSO(5mM)的10μl浓贮备液加入100μl pH 7.4磷酸盐柠檬酸盐缓冲液，混合。在第二步稀释中，将第一步稀释的等分试样(20μl)进一步分散在100μl pH7.4磷酸盐柠檬酸盐缓冲液中，混合。最后，在第三步稀释中，将第二步稀释样品(20μl)用100μl pH 7.4磷酸盐柠檬酸盐缓冲液进一步稀释，混合。所有稀释均在96孔板中进行。最后一步稀释结束后，立即用浊度计测量3个连续稀释步骤的浊度。按一式三份，制备各化合物稀释液，以排除偶然误差。按照浊度测量值，将秩评定分为3级。具有高溶解度的化合物得3分，对于该化合物，第一步稀释液澄清。具有中等溶解度的化合物得2分。对于这些化合物，第一步稀释液不澄清，但第二步稀释液澄清。具有低溶解度的化合物得1分，对于这些化合物，第一和第二步稀释液都不澄清。2号和3号化合物均得3分。
C.3.b.在水性介质中的动态溶解度
在96孔贮备液板(200μl/孔)中，用DMSO制备5000-9.8μM(1/2稀释系列)DMSO贮备液。每次稀释后，将样品混合。然后将这些 DMSO溶液的等份试样(2μl)转移到2个其它96孔缓冲液板中，每孔含200μl缓冲水溶液。各缓冲液板含pH7.4的缓冲水溶液或pH4.0的缓冲水溶液。最后稀释结束后，将缓冲液板混合，使样品在室温下稳定1/2小时。按一式两份，制备各化合物的稀释液，以排除偶然误差。用BD Gentest溶解度扫描仪扫描混合物中出现的沉淀。根据混合物中不存在/存在沉淀，通过内插法计算动态溶解度。将秩评定分为3级。具有高溶解度的化合物得3分，其溶解度大于或等于50μM。具有中等溶解度的化合物得2分，其溶解度大于10μM且小于50μM。具有低溶解度的化合物得1分，这些化合物的溶解度小于或等于10μM。在pH＝7.4下，测试了4种化合物，它们的分数为2分。
C.3.c.在pH2，3下的溶解度
在pH2.3下，也可用化学发光氮气检测器测量化合物的溶解度(参见表F-2)。
实施例C.4：平行人造膜渗透率分析
在含2ml缓冲水溶液系统pH4或pH7.4(PSR4系统溶液浓缩液(System Solution Concentrate)(pION))的深孔或预混合板中稀释样品贮备液(用100％DMSO制备的5mM贮备液的10μl等份试样)。
在样品加入参照板前，将150μl缓冲液加入孔中，进行空白UV测量。然后弃去缓冲液，将该板作为参照板使用。所有测量均在防UV板(供应商：Costar或Greiner)中进行。
对参照板进行空白测量后，将150μl稀释样品加入参照板中，将200μl稀释样品加入供体板1。用4μl人造膜形成溶液(含0.1％2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚的1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱的十二烷溶液)涂布受体滤板1(供应商：Millipore，型号：MAIP N45)，置于供体板1的上部，形成“夹层”。使缓冲液(200μl)分布在上部的受体孔中。用盖覆盖夹层，在暗处，在室温下贮存18h。
将150μl缓冲液加入孔中，然后进行UV测量，对受体板2进行空白测量。对受体板2进行空白测量后，弃去缓冲液，将受体滤板1中的150μl受体液转移到受体板2中。然后移去受体滤板1，形成夹层。对供体板2进行空白测量(参见以上)后，将供体板1中的150μl供体液转移到供体板2中。扫描供体板2、受体板2和参照板孔的UV光谱(用SpectraMAX 190)。用PSR4p命令(Command)软件处理所有光谱，计算渗透率。所有化合物均按一式三份测量。在各实验中，用卡马西平、灰黄霉素、环鸟苷、阿替洛尔、呋塞米和氯噻嗪作标准。将化合物分为3类，低渗透率化合物(平均作用＜0.5×10-6cm/s；1分)，中等渗透率化合物(1×10-6cm/s＞平均作用≥0.5×10-6cm/s；2分)或高渗透率化合物(≥1×10-6cm/s；3分)。
实施例C.5：代谢稳定性
实施例C.5.a.
按照Gorrod等(Xenobiotica 5：453-462，1975)，通过机械将组织匀浆，离心分离，制备亚细胞组织制剂。将肝组织在冰冷0.1M Tris-HCl(pH7.4)缓冲液中漂洗，洗去过量血液。然后将组织印迹干燥，称重，用手术剪粗略剪碎。在3体积冰冷0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)中，将组织碎片用配备聚四氟乙烯槌的Potter-S(Braun，Italy)或SorvallOmni-Mix匀浆器匀浆7×10秒。在两种情况中，在匀浆期间，将容器保持在冰中/冰上。
在4℃下，按9000×g，用Sorvall离心机或Beckman超高速离心机将组织匀浆物离心20分钟。将得到的上清液保存在-80℃下，标记为′S9′。
可按100.000×g，用Beckman超高速离心机将S9组分进一步离心60分钟(4℃)。将得到的上清液小心吸出，分成等份试样，标记为“细胞溶胶”。按1ml终体积/0.5g原始组织重量，将沉淀再悬浮于0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)，标记为“微粒体”。
将所有亚细胞组分均分成等份试样，立即在液氮中冷冻，在-80℃下贮存，备用。
对于试验样品，温育混合物含PBS(0.1M)、化合物(5μM)、微粒体(1mg/ml)和NADPH-发生系统(0.8mM葡萄糖-6-磷酸、0.8mM氯化镁和0.8单位葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)。用加热失活的(95℃下加热10min)微粒体代替含相同物质但不同微粒体的对照样品。对照样品中的化合物回收率始终为100％。
将混合物在37℃下预温育5min。在0时间点(t＝0)加入0.8mMNADP，起动反应，将样品温育15min(t＝15)。通过加入2体积DMSO终止反应。然后按900×g，将样品离心10min，将上清液在室温下保存不超过24h，然后分析。所有温育均按一式两份进行。用LC-MS分析上清液。在Xterra MS C18(50×4.6mm，5μm，Waters，US)上洗脱样品。使用Alliance 2790(供应商：Waters，US)HPLC系统。用缓冲液A(25mM乙酸铵(pH5.2)/H2O/乙腈(95/5))、溶剂B为乙腈、溶剂C甲醇洗脱，流速2.4ml/min。所用梯度是有机相浓度按线性方式在5min内由0％增至50％B和50％C，在1min内高达100％B，将有机相浓度再保持固定1.5min。样品总进样体积为25μl。
用配有ESI源的Quattro(供应商：Micromass，Manchester，UK)三节四极质谱仪作检测器。将离子源和去溶剂化温度分别设定为120和350℃，用氮气作雾化器和干燥气。按正离子扫描模式(单离子反应)采集数据。锥电压设定为10V，采样时间为1秒。
按在活性微粒体的存在下温育15min后化合物的代谢百分率表示代谢稳定性(E(活性))(代谢％＝100％-((在t＝15时E(活性)的总离子流(TIC)/在t＝0时E(活性)的TIC)×100)。将代谢百分率小于20％的化合物定义为高度代谢稳定，给予3分。代谢百分率在20-70％之间的化合物定义为中等稳定，给予2分。代谢百分率大于70％的化合物定义为低代谢稳定，给予1分。每当进行代谢稳定筛选时，始终包括3种参照化合物。作为低代谢稳定性化合物包括维拉帕米(代谢％＝ 73％)。作为中等代谢稳定性化合物包括西沙必利(代谢％＝45％)和作为中等至高代谢稳定性化合物包括丙醇(25％代谢)。用这些参照化合物验证代谢稳定性测定。测试了15种化合物，9种得3分，6种得2分。
C.5.b.大鼠肝细胞培养物的代谢稳定性
在雄性Sprague Dowley大鼠中分离大鼠肝细胞。将化合物溶于100％DMSO制成5mM贮备液，用24孔板，在终浓度5μM下，与大鼠肝细胞培养物(0.5百万活细胞/0.5ml)一起温育0、15、30、60和120min。
通过加入2体积DMSO，制备用于LC-MS分析的样品。将样品充分振摇，然后按900g，离心10min(室温)。所有实验均按一式三份进行。在得到的上清液中取50μl，通过LC-MS分析。
对于LC-MS，在Hypersil BDS C18柱(50×4.6mm，5μm，Thermohypersil，UK)上洗脱样品。HPLC系统包含配备Surveyor自动进样器的Surveyor输送系统(Surveyor Inc.，San Jose，US)。用缓冲液A(10mM乙酸铵(pH6.9)/H2O/乙腈(95∶5))和溶剂B(乙腈)洗脱，流速1.2ml/min。所用梯度是初始条件为0.5min溶剂A，然后有机相浓度按线性方式在2min内由0％B增至95％B。将该有机相浓度再保持固定2min，在0.5min内，再减至0％B。
样品总进样体积为50μL。将柱温箱温度保持在40℃。将LC液流分流用于MS检测，让0.1ml进入离子源。用配备ESI源的三节四极质谱仪TSQ Quantum(Thermofinnigan，LaJolla，USA)进行检测。将离子源电压设定为3800伏，毛细管温度300℃。按正离子模式，按使质量调至M+H的SIM模式，定量扫描宽度1Da，运行质谱仪。用Xcalibur软件(ThermoFinnigan，San Jose，CA，U.S.A)进行仪器控制、数据采集和处理。以体外半衰期表示大鼠肝细胞中化合物的代谢稳定性。
使用化合物R306465(WO03/76422)作为参照(体外半衰期：8min)。对22号化合物和3号化合物进行测试，它们的体外半衰期为30-55min。
实施例C.6：p21诱导能力
实施例C.6.a：p21酶连接的免疫吸附测定
以下方案用于测定p21蛋白在人A2780卵巢癌细胞中表达水平。将A2780细胞(20000细胞/180μl)接种在含补充2mM L-谷氨酰胺、50μg/ml庆大霉素和10％胎牛血清的RPMI 1640培养基的96微孔板中。在将细胞裂解前24小时，加入终浓度10-5、10-6、10-7和10-8M的化合物。将所有试验化合物溶于DMSO，用培养基进一步稀释。加入化合物24小时后，从细胞取出上清液。将细胞用200μl冰冷PBS洗涤。将各孔中的溶液吸出，加入30μl裂解缓冲液(50mM Tris.HCl(pH7.6)、150mM NaCl、1％乙基苯基聚异二醇(Nonidet p40)和10％甘油)。将板在-70℃下温育过夜。
将适当数目的微量滴定孔的箔袋除去，放入空孔支架中。制备洗涤缓冲液工作液(1×)(20×板洗涤浓缩液：100ml 20倍浓缩的PBS溶液和表面活性剂。含2％氯代乙酰胺)。将冻干的p21WAF标准品溶于蒸馏H2O，用样品稀释液(由试剂盒提供)进一步稀释。
按1∶4将它们溶于样品稀释液，制备样品。将样品(100μl)和p21WAF1标准品(100μl)用移液管加入适当的孔中，在室温下温育2小时。将这些孔用1×洗涤缓冲液洗涤3次，然后用移液管将100μl探测抗体试剂(生物素化单克隆p21 WAF1抗体溶液)加入各孔。将这些孔在室温下温育1小时，然后用1×洗涤缓冲液洗涤3次。将400×缀合物(过氧化物酶链霉抗生物素缀合物：400倍浓缩的溶液)稀释，将100μl 1×溶液加入这些孔中。将这些孔在室温下温育30min，然后用1×洗涤缓冲液洗涤3次，用蒸馏H2O洗涤1次。将底物溶液(显色底物)(100μl)加入这些孔中，在室温下，将这些孔在暗处温育30分钟。按与先前 加入底物溶液相同的顺序，将终止液加入各孔中。在450/595nm双波长处，用分光光度板读出器测量各孔的吸光率。对于各实验，进行对照(不含药物)和空白温育物(不含细胞或药物)平行试验。从所有对照和样品值中均扣除空白值。对于各样品，按存在于对照中p21 WAF1值的百分率表示p21 WAF1诱导值(按吸光率单位计)。将大于130％的诱导百分率定义为显著诱导。测试一种化合物，显示在10-6M下出现显著诱导。
实施例C.6.b.：细胞方法
在37℃下，在潮湿的5％CO2培养箱中，在补充10％FCS，2mML-谷氨酰胺和庆大霉素的RPMI 1640培养基中培养A2780细胞(ATCC)。所有细胞培养液均由Gibco-BRL(Gaithersburg，MD)提供。其它物质由Nunc提供。
从增殖的A2780细胞中提取基因组DNA，将其用作嵌套式PCR分离p21启动子的模版。在55℃退火温度下，以基因组DNA为模版，用寡核苷酸对GAGGGCGCGGTGCTTGG和TGCCGCCGCTCTCTCACC，进行首次扩增20个周期。在88℃退火温度下，用寡核苷酸TCGGGTACCGAGGGCGCGGTGCTTGG和ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC，将得到的含相对于TATA箱的-4551至+88片段的4.5kb片段再扩增20个周期，得到4.5kb片段，然后在88℃退火温度下，用寡核苷酸对TCGGGTACCGGTAGATGGGAGCGGATAGACACATC和ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC，扩增20个周期，得到含相对于TATA箱的-1300至+88片段的1.3kb片段。用存在于寡核苷酸的限制位点XhoI和KpnI(下划线序列)亚克隆。
在KpnI和XbaI限制位点，将pGL3-basic中的荧光素酶报道基因除去，用ZsGreen报道基因(源自pZsGreenl-N1质粒)替换。通过将上述人p21启动子区域的1.3kb片段插入pGL3-basic-ZsGreen的XhoI 和KpnI位点，构建pGL3-basic-ZsGreen-1300。所有限制酶均由Boehringer Manheim(Germany)提供。按2×105细胞密度，将A2780细胞接种在6孔板，温育24小时，按制造商说明，用Lipofectamine 2000(Invitrogen，Brussels，Belgium)，用2μg pGL3-basic-ZsGreen-1300和0.2μg pSV2neo载体转染。用G418(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)选择转染的细胞10天，使单细胞悬浮液生长。三周后，得到单克隆。
使A2780选择的克隆扩展，按10000细胞/孔接种到96孔板。接种24小时后，将细胞用化合物再处理24小时(影响近端p21启动子区域中sp1位点)。然后，将细胞用4％PFA固定30′，用Hoechst染料复染色。通过Ascent Fluoroskan(Thermo Labsystems，Brussels，Belgium)监测导致ZsGreen产生和因此的荧光的p21启动子激活。
对于各实验，进行对照(不含药物)和空白温育物(不含细胞或药物)平行试验。从所有对照和样品值中扣除空白值。对于各样品，以存在于对照中的p21值的百分率表示p21诱导值。将大于130％的诱导百分率定义为显著诱导。
在10-6M下，25种化合物显示显著诱导。
实施例C.6.c.：体内方法
将选择的克隆(107细胞/200μl)皮下注射到裸小鼠胁腹内，12天后，得到卡尺可测的肿瘤。从第12天起，在6天内，每日通过口服或静脉内给予动物溶剂和20-40mpk化合物(4-10只动物/组)。通过内部开发的自动化整体成像系统(Automated Whole Body Imaging System)(基于National 
的IMAQ可视软件(Vision Software)的软件包控制的与 CV-M90型CCD照相机连接的配备GFP过滤器的 
SZX 12型荧光立体显微镜)，评价肿瘤荧光。用化合物R306465(WO03/76422)作参照化合物。将化合物分为无活性(无可测的荧光)、比R306465弱、相同或好。测试1号化合物，表明比R306465好。
实施例C.7：P450的抑制能力
将所有试验化合物溶于DMSO(5mM)，并用乙腈进一步稀释至5×10-4M。用测定缓冲液(0.1M磷酸NaK缓冲液pH7.4)制备进一步的稀释液，终溶剂浓度从不大于2％。
CYP3A4蛋白的测定方法包括每孔含15pmol P450/mg蛋白(溶于0.01M磷酸NaK缓冲液+1.15％KCl)、NADPH发生系统(溶于测定缓冲液的3.3mM葡萄糖-6-磷酸、0.4U/ml葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、1.3mMNADP和3.3mM MgCl2.6H2O)和化合物，总测定体积100μl。在37℃下预温育5min后，加入由测定缓冲液制备的150μM荧光探针底物BFC溶液，起动酶促反应。在室温下温育30分钟后，加入2体积乙腈后，反应终止。在激发波长405nm和发射波长535nm处，进行荧光测定。在该实验中，酮康唑作为参照化合物包括在内(IC50值＝3×10-8 M)。
CYP2D6蛋白的测定方法包括每孔含6pmol P450/mg蛋白(溶于0.01M磷酸NaK缓冲液+1.15％KCl)、NADPH发生系统(溶于测定缓冲液的0.41mM葡萄糖-6-磷酸、0.4U/ml葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、0.0082mM NADP和0.41mM MgCl2.6H2O)和化合物，总测定体积100μl。在37℃下预温育5min后，加入由测定缓冲液制备的3μM荧光探针底物AMMC溶液，起动酶促反应。在室温下温育45分钟后，加入2体积乙腈后，反应终止。在激发波长405nm和发射波长460nm处，进行荧光测定。在该实验中，奎尼丁作为参照化合物包括在内(IC50值＜5×10-8M)。
CYP2C9蛋白的测定方法包括每孔含15pmol P450/mg蛋白(0.01M磷酸NaK缓冲液+1.15％KCl)、NADPH发生系统(溶于测定缓冲液的3.3mM葡萄糖-6-磷酸、0.4U/ml葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、1.3mMNADP和3.3mM MgCl2.6H2O)和化合物，总测定体积100μl。在37℃下预温育5min后，加入由测定缓冲液制备的200μM荧光探针底物 MFC溶液，起动酶促反应。在室温下温育30分钟后，加入2体积乙腈后，反应终止。在激发波长405nm和发射波长535nm处，进行荧光测定。在该实验中，磺胺苯吡唑作为参照化合物包括在内(IC50值＝6.8×10-7M)。
为达到初步筛选目的，在单一固定浓度1×10-5M下测试化合物。对于活性化合物，重复进行实验，以建立完全浓度-反应曲线。对于各反应，进行对照(不含药物)和空白温育物(不含酶或药物)平行实验。所有化合物均按一式四份分析。从所有对照和样品值中均扣除空白值。对于各样品，以对照的P450活性平均值的百分率表示样品的P450活性平均值(按相对荧光单位计)。以100％-样品的P450活性平均值表示抑制百分率。适当时，计算IC50值(将P450活性减少至对照的50％所需的药物浓度)。
表F-2：列出按实施例C.1、C.2和C.3.c测试的化合物结果(空白表示相关化合物未得到数值)
| 化合物 编号 | 酶活性 pIC50 C.1 | 细胞活性 pIC50 C.2 | 溶解度 C.3.c. pH＝2.3 (mg/ml) |
| 1 2 3 4 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 | 8.4 8.1 8.1 7.8 7.8 8.2 8.3 8.7 8.5 7.8 7.6 7.5 8.2 7.5 9.0 7.6 8.1 7.8 7.5 9.4 8.0 8.4 7.7 7.4 6.9 7.4 7.2 | 7.7 6.6 7.0 6.7 6.7 7.0 6.7 7.3 6.1 5.9 6.6 6.8 7.4 7.0 7.5 6.8 5.8 6.8 6.1 7.1 6.0 7.3 6.9 5.8 5.7 6.6 6.1 | 2.5 2.1 2.5 2.4 2.7 ＜0.01 ＜0.01 3.8 2.5 2.5 1.9 2.2 4.6 ＜0.01 0.01 0.4 |
D.组合物实施例：薄膜衣片
制备片芯
将100g式(I)化合物、570g乳糖和200g淀粉的混合物充分混合，然后用5g十二烷基硫酸钠和10g聚乙烯吡咯烷酮的约200ml水溶液润湿。将湿粉末混合物过筛，干燥，再过筛。然后加入100g微晶纤 维素和15g氢化植物油。将所有组分充分混合，压制成片剂，得到10.000粒片剂，每片含10mg式(I)化合物。
包衣
向10g甲基纤维素的75ml变性乙醇溶液中加入5g乙基纤维素的150ml二氯甲烷溶液。然后加入75ml二氯甲烷和2.5ml 1，2，3-丙三醇，将10g聚乙二醇熔化，溶于75ml二氯甲烷，将后一溶液加入前者中，然后加入2.5g硬脂酸镁、5g聚乙烯吡咯烷酮和30ml浓色素悬浮液，将所有组分混匀。在包衣设备中，将片芯用由此得到的混合物包衣。
Claims (8)
1.一种式(I)化合物或其药学上可接受的加成盐
其中
R1为羟基或式(a-1)基团
其中
R2为氨基；
R3为氢或噻吩基；
R4、R5和R6各自为氢；
X为N或CH；
Y为O、N或CH，且当Y为N或CH时，则取代基与环结构的Y原子连接；
T为O或NR8，其中R8为氢、C1-6烷基、氰基C1-6烷基、羟基氨基羰基C1-6烷基、C1-6烷基磺酰基或C1-6烷基羰基；
n为0或1，且当n为0时，则为直键；
m为1；
p为0或1，条件是当p为0时，则n为0，-(CH2)n-(T)p-为直键，且Y为N；
A为选自以下的基团：
其中R9为氢、C1-6烷基、C3-7环烷基或C3-7环烷基C1-6烷基；
且R10为氢、羟基、氨基、卤素、氰基、C1-6烷基、多卤代C1-6烷基、C1-6烷氧基羰基、羟基羰基、C1-6烷基羰基氨基、C1-6烷氧基，或一-或二(C1-6烷基)氨基，
其中所述多卤代C1-6烷基为含3个相同或不同卤素取代基的C1-6烷基。
2.权利要求1的化合物，其中：
a)R1为羟基；
b)X为N；
c)Y为CH；
d)T为NR8，其中R8为氢；
e)n为1；
f)m为1；
g)p为1；和
h)A为选自以下的基团：(b-1)、(b-3)和(b-4)，其中R9为C 1-6烷基，且R10为氢。
3.权利要求1的化合物，所述化合物选自以下所示的1号化合物、2号化合物和3号化合物：
4.一种药用组合物，所述组合物包含药学上可接受的载体和作为活性成分的治疗有效量的权利要求1-3中任一项的化合物。
5.一种制备权利要求4的药用组合物的方法，其中将所述药学上可接受的载体与权利要求1-3中任一项的化合物充分混合。
6.权利要求1-3中任一项的化合物在制备治疗增殖性疾病的药物中的用途。
7.抗癌药和权利要求1-3中任一项的化合物的联合药物。
8.一种制备权利要求1的化合物的方法，其特征在于：
a)使式(II-a)化合物与适当的酸反应，形成式(I-a)化合物，
b)在碱的存在下，使其中M代表碱金属阳离子的式(IV)化合物与式(III)化合物反应，形成式(I-b)化合物
c)在溶剂中，使式(II-b)中间体与酸反应，形成式(I-b1)化合物
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