CN101366728A - 用于预防或者治疗皮肤缺损的组合物及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本文描述的是治疗或者预防个体皮肤缺损的组合物和方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求享有2007年4月24日提交的美国临时申请序列号60/913,576的优先权。本申请因此完整引入其全部教导作为参考。
发明背景
皮肤创伤的最优愈合需要复杂生物学和分子事件的良好协调的整合，所述事件包括细胞迁移和增殖，和细胞外基质(ECM)沉积，血管发生和重塑。但是，在许多慢性疾病例如糖尿病中，愈合过程的这种有序进展被损伤。常见的慢性皮肤创伤包括糖尿病足溃疡，褥疮，和静脉淤血溃疡，而糖尿病溃疡是足部和腿截肢的最常见原因。在世界范围内1.5亿糖尿病个体当中，15％患有足溃疡，这经常变为无法愈合的慢性创伤。
过去数十年中在预防慢性创伤的发病和致残方面未显示任何进展。对这些慢性创伤的现有最佳治疗方式只获得50％的治愈率，这还经常是短暂的。在造成无法愈合创伤的许多因素中，来自炎性细胞和成纤维细胞的细胞因子释放的减少和降低的血管发生是非常重要的。最近，血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)已经被用于糖尿病溃疡的临床试验，具有与常规治疗相比在20周时创伤闭合的发生提高15％的最佳效果。显然，需要新的疗法来促进慢性创伤的愈合。
发明概述
此处描述的是治疗或者预防个体皮肤缺损的组合物和方法。本发明的优点部分在以下描述中阐明，部分是从描述中可以明显得出，或者可以通过实践下面描述的方面获得。通过所附权利要求特别指出的要素和组合实现和获得下面所述的优点。应该清楚上述一般描述和下列详细描述只是示范性和说明性的，不是限制性的。
附图简述
被引入并组成本说明书一部分的附图解释下述几个方面。
图1显示与对照培养基或者成纤维细胞相比，间充质干细胞(MSC)促进非糖尿病(A&B)或者糖尿病小鼠(C&D)中切割创伤的闭合，增加表皮再植，结构再生和细胞构成(E-G)。
图2显示移入创面的MSC分化为表达细胞角蛋白的角质形成细胞(A)，并形成汗/皮脂腺体样结构(B&C)。
图3显示与预处理培养基或者成纤维细胞培养基相比，MSC条件培养基促进皮肤角质形成细胞生长(A)、迁移(B)和附着(C&D)。
图4显示与载体培养基或者成纤维细胞治疗的创伤相比，MSC治疗的创伤显示增加的血管供应：(A)显示全皮肤固定后创面的血管系统；(B)显示内皮细胞的创伤切面的免疫染色；(C)毛细管密度创伤的定量。
图5显示与预处理培养基或者成纤维细胞条件培养基相比，MSC条件培养基促进HUVEC迁移、增殖(B)和血管形成。
图6显示创伤愈合中MSC的旁分泌效果。(A)实时PCR分析显示与成纤维细胞比较，细胞因子和ECM分子在MSC中的表达水平。(B)低氧治疗后在载体对照、成纤维细胞或者BM-MSC条件培养基中IGF-1的ELISA检测。(C)第7天创面IGF-1的RT-PCR分析。(D)MSC条件培养基的注射促进创伤闭合。
图7显示MSC或者成纤维细胞条件培养基的抗体阵列分析显示细胞因子明显不同的蛋白表达。
图8显示Western印迹分析，表明在成纤维细胞或者MSC条件培养基或者治疗的创伤中VEGF-α、血管生成素(angiopoietin)(Ang)1和2的水平。
图9是FACS分析，表明MSC治疗的创伤显示Flk-1+或者CD34+细胞分数的增加和CD3+细胞分数的减少。
图10显示创伤切面的免疫染色，表明与载体培养基或者成纤维细胞治疗的创伤相比，MSC治疗的创伤具有增加的CD68+巨噬细胞和减少的CD3+T细胞。
图11是(A)创伤消化的FACS分析，显示在第2周接受混合的DiI-角质形成细胞和皮肤成纤维细胞(粉红色峰)或者DiI-角质形成细胞和BM-MSC(红色峰)的创面的DiI-角质形成细胞分数，未接受细胞移植的创伤消化被用作阴性对照(灰色峰)；和(B)在第1和2周接受混合的DiI-角质形成细胞和皮肤成纤维细胞(粉红色峰)或者DiI-角质形成细胞和BM-MSC的创面的平均DiI-角质形成细胞分数(n＝4，P<0.01)。
发明详述
在本化合物、组合物和/或方法被公开和描述前，应当理解下面描述的方面不限于特定的化合物，合成方法，或者这样的用途当然可以改变。还应理解此处使用的术语只是为了描述特定方面而不是用于限制。
在下面的说明书和权利要求中，将对许多术语做出注释，这些术语被定义为具有以下的含义：
必需注意到，在说明书和所附权利要求中使用时，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指称，除非上下文另外明确指出。因此，例如，“一种药物载体”的含义包括两种或者多种载体的混合物，等等。
“个体”表示一个个体。个体可以是哺乳动物例如灵长类动物或者人类。术语“个体”可以包括家养动物，包括但不限于，猫、狗等等，家畜(例如，牛，马，猪，绵羊，山羊，等等)，和实验动物(例如，小鼠，兔，大鼠，豚鼠，等等)。
“接触”表示通过至少一种物质与另一种物质紧密物理接触的暴露的情况。例如，接触可以包括将一种物质例如药剂与细胞接触。
“治疗”表示给药患有不希望的病症(例如，皮肤缺损)的个体或者系统组合物以减轻不希望的病症的症状。“预防”表示消除感染不希望的病症(例如，皮肤缺损)的可能性。“预防”还包括降低感染不希望的病症的可能性。
“有效量”表示达到希望的效果所需的治疗量。
“诱导”被定义为希望的效果或者结果的起始。“增强”被定义为增加或者提高先前存在的情况。
I.间充质干细胞和条件培养基
此处描述的是预防或者治疗个体中存在的皮肤缺损的间充质干细胞，源自间充质干细胞的条件培养基或者其化合物的组合。间充质干细胞(MSC)还称为骨髓基质细胞或者间充质祖细胞。此处使用的MSC在标准培养条件下与塑料附着，表达CD105和CD90，缺乏CD45的表达，并且可以在体外分化为成骨细胞，脂肪细胞和软骨细胞。
MSC可以衍生自许多来源。例如，MSC可以源自非骨髓组织例如脂肪和其他组织。一方面，间充质干细胞源自骨髓。一方面，骨髓(BM)MSC是在添加来自动物或者人的血浆或者血清的培养基中培养一段时间(数小时，数天，数周)后，与无包被(或者包被细胞外基质分子)的聚苯乙烯或者玻璃组织培养皿附着的BM细胞，所述培养基添加或者不添加生长因子或者其他营养物。骨髓细胞包括所有源自骨髓的细胞，或者一部分细胞例如有核细胞。骨髓细胞的来源还可以根据个体改变。因此，骨髓细胞可以源自人，猪，狗，猫，小鼠，马，和其他哺乳动物。一方面，骨髓细胞来源的间充质干细胞可以包括内皮祖细胞。
间充质干细胞的分离和培养是本领域已知的(Mackay等人，Tissue Eng.4：415-428(1988))；William等人，Am Surg.65：22-26(1999)；Pittenger等人，Science 284，143-147(1999))。通过冲刷骨髓或者用缓冲液或者细胞培养基洗涤骨磨片可以获得骨髓细胞。利用免疫耗竭通过去除血系细胞可以从骨髓细胞的悬浮液中分离BM-MSC。然后通过将细胞置于新的培养皿板上培养可以扩增分离的MSC。
短语“源自间充质干细胞的条件培养基”此处被定义为包含一种或者多种成分的培养基，所述成分不存在于起始细胞培养基中，但由间充质干细胞的培养产生，其中新的成分进入培养基。产生条件培养基的技术是本领域已知的。通常，间充质干细胞被置于细胞能够与其附着的支持物例如培养皿上。细胞然后在供应细胞充足生长时间(例如，从数分钟直到数周)的培养基中孵育。培养基可以包括一种或者多种用于刺激细胞生长的成分例如添加的化学物，药物，细胞因子，等等。培养基包括氨基酸(D和/或L-氨基酸)，糖，脱氧核糖，核糖，核苷，水溶性维生素，核黄素，盐，微量金属，类脂，醋酸盐，磷酸盐，HEPES，酚红，丙酮酸盐，缓冲液，脂溶性维生素(包括A，D，E和K)，类固醇和它们的衍生物，胆固醇，脂肪酸和类脂Tween 80，2-巯基乙醇嘧啶以及各种添加物包括血清(胎，马，牛，等等)，蛋白(例如，胰岛素，转铁蛋白，生长因子，激素，等等)，抗生素，全卵超滤物，和附着因子。一方面，培养基是无血清的。另一方面，培养基是DMEM，IMEM或者MEM。
通过改变培养条件，有可能改变分泌到细胞培养基的胞外蛋白的类型(例如，生长因子，细胞因子和应激蛋白)以及各蛋白的相对量。一方面，孵育期间在含氧量正常条件下产生条件培养基。另一方面，孵育期间在低氧条件下产生条件培养基，其中培养期间最低到(小于1％)无氧。在这个方面，在缺氧条件下的小室中进行间充质干细胞的细胞培养。例如，可以使用惰性气体例如氮气。对于骨髓间充质干细胞来说，在低氧条件下间充质干细胞能够表达高水平的几种趋化因子例如SDF-1和干细胞因子(SCF)和细胞因子例如EGF、IGF、KGF和VEGF。已知这些因子对角质形成细胞和内皮细胞的迁移、附着和增殖非常重要。一方面，与成纤维细胞相比，骨髓间充质干细胞产生更高表达水平的IGF-1、EGF和KGF，以及更低表达的TGF-β1，已知这调节瘢痕修复。
一旦条件培养基被制备和分离后，预期其还可以被进一步处理。例如，通过水流过滤装置或者通过超滤可以浓缩条件培养基。在其他方面，可以进一步纯化条件培养基以除去不需要的杂质。纯化方法包括，但不限于，条件培养基的凝胶层析(利用基质例如葡聚糖凝胶)离子交换，利用不溶性基质例如交联琼脂糖的金属螯合亲和层析，HPLC纯化和疏水作用层析。
II.药物组合物
一方面，上述任意间充质干细胞和条件培养基可以制成药物组合物。可以利用本领域已知的技术制备药物组合物。一方面，通过将此处所述的细胞或者条件培养基与药学上可接受的载体混合制备组合物。
应了解特定情况下间充质干细胞和条件培养基的实际优选的量，给药方式和给药间隔将根据使用的特异组合物，制备的特定组合物，应用方式以及待治疗的特定位置和个体而改变。对于给定宿主的剂量可以利用常规因素确定，例如通过相关化合物和已知试剂不同活性的惯用比较，例如，通过合适的常规药学实验步骤。熟练确定药学化合物剂量的医师和药剂师可以根据标准推荐(Physicians Desk Reference，Barnhart Publishing(1999)毫无疑问的确定药学化合物的剂量。
此处描述的药物组合物可以在生物系统或者实体可以耐受的任意赋形剂中制备。这类赋形剂的实例包括但不限于，水，盐水，Ringer’s溶液，葡萄糖溶液，Hank’s溶液，和其他水性生理平衡的盐溶液。还可以使用非水性载体，例如不挥发性油，植物油例如橄榄油和芝麻油，甘油三酯，丙二醇，聚乙二醇，和可注射的有机酯例如油酸乙酯。其他有用的制剂包括悬浮剂，所述悬浮剂包含增粘剂例如羧甲基纤维素钠，山梨醇或者右旋糖酐。赋形剂还包括少量添加剂，例如增强等渗性和化学稳定性的物质。缓冲液的实例包括磷酸缓冲液，碳酸氢盐缓冲液和Tris缓冲液，而防腐剂的实例包括硫柳贡，甲酚，福尔马林和苯甲醇。
根据是需要局部或者全身给药，和待治疗的区域，可以采用多种方式给药药物组合物。给药可以是局部的(例如，皮肤的，眼的，阴道的，直肠的，鼻内的)。用于局部给药的制剂可以包括软膏剂，洗剂，乳剂，凝胶，滴剂，栓剂，喷雾剂，液体和粉末。常规药物载体，含水的，粉末或者油性基，稠化剂等等可能是必须或者需要的。用于局部给药的制剂还可以包括使用其他载体例如胶原(包括明胶)，弹性蛋白，层粘连蛋白，纤连蛋白，透明质酸，蛋白聚糖和糖胺聚糖。
用于胃肠外给药的制剂包括无菌的水性或者非水性溶液，悬浮液和乳液。非水性载体的实例包括水，醇/水性溶液，乳液或者悬浮液，包括盐和缓冲介质。如果需要用于所公开组合物和方法的间接使用，胃肠外载体包括氯化钠溶液，Ringer’s葡萄糖，葡萄糖和氯化钠，乳酸盐的Ringer’s，或者非挥发性油。如果需要用于所公开组合物和方法的间接使用，静脉载体包括流体和营养物补充剂，电介质补充剂(例如那些基于Ringer’s葡萄糖的)，等等。还可以存在防腐剂和其他添加剂，例如抗生素，抗氧化剂，螯合剂和惰性气体等等。
药物组合物还包括其他药物和生物活性药剂。生物活性药剂能够在生物系统中提供局部或者全身的生物学、生理学或者治疗的效果。例如，所述药剂能够用于控制感染或者炎症，增强细胞增殖和组织再生，控制肿瘤生长，用作止痛剂，促进抗细胞附着，和增强骨生长，及其他功能。
III.使用方法
此处描述的是利用间充质干细胞，源自间充质干细胞的条件培养基，或者其组合预防或者治疗个体皮肤缺损的方法。该方法包括给药皮肤缺损一种组合物，所述组合物包括间充质干细胞，源自间充质干细胞的条件培养基，或者其组合。
利用此处描述的技术可以治疗或者预防许多不同的皮肤缺损。“皮肤缺损”被定义为皮肤任意部分的任意不希望的病症，包括表皮，真皮，以及与表皮和真皮相关或者存在于表皮和真皮中的所有结构。一方面，此处描述的方面可用于美容应用。例如，该方法可以减少或者预防皱纹，瘢痕形成(例如，普通瘢痕和肥大瘢痕)，老年斑，或者蹙额纹。一方面，间充质干细胞，源自间充质干细胞的条件培养基，或者其组合可以是直接应用于皮肤的局部制剂。因此，此处描述的组合物和方法可用作抗衰老药剂。不希望被理论束缚，据信MSC通过分化和旁分泌机制促进皮肤再生。
另一方面，皮肤缺损可能是严重的皮肤缺损例如切口或者溃疡。糖尿病溃疡和其他慢性创伤是难以愈合的，过去数十年中在预防发病和致残方面几乎没有进展。慢性创伤的现有最佳治疗方式只获得50％的治愈率，这还经常是短暂的。此外，皮肤和其他组织的损伤愈合不是通过组织对已损伤形式的再生而是通过瘢痕组织的形成。
对于皮肤缺损是切口，溃疡或者严重破坏的皮组织的情况，给药间充质干细胞和/或条件培养基的方式可以改变。一方面，间充质干细胞和/或条件培养基可以通过注射或者局部施用直接给药创面。另一方面，间充质干细胞和/或条件培养基可以应用于接触创面的绷带。或者，间充质干细胞和/或条件培养基可以整合入水凝胶或者其他形式的基质材料，例如由胶原(包括明胶)、弹性蛋白，层粘连蛋白，纤连蛋白，透明质酸，蛋白聚糖，糖胺聚糖，或者其任意组合制成的片层，然后可以局部施用或者插入创面。预期其他细胞类型可以在给药个体前添加到间充质干细胞和/或条件培养基。一方面，角质形成细胞，成纤维细胞或者内皮细胞可以添加到间充质干细胞和/或条件培养基以促进和加快创伤愈合。上述方法涉及体内给药间充质干细胞和/或条件培养基来治疗或者预防皮肤缺损。利用此处描述的方法还可以预期体外(in vitro)和间接体内(ex vivo)应用，在实施例中得到证明。
此处描述的方法对于创伤愈合来说提供额外的优点。用骨髓间充质干细胞或者培养过的培养基治疗的创伤加速伤口闭合。例如，如在实施例中所示，骨髓间充质干细胞可以在创面分化为角质形成细胞。此外，骨髓间充质干细胞条件培养基能够促进角质形成细胞迁移，生长和附着以及内皮细胞血管形成。因此，此处描述的方法造成皮肤内皮细胞的形成并阻止瘢痕形成。骨髓间充质干细胞或者源自其培养过的培养基的使用还可以造成汗腺和皮脂腺体样结构以及毛囊的形成。
此外，此处描述的方法可以诱导或者增强创面的血管发生。新生血管形成是创伤愈合步骤中的一个重要步骤。新血管的形成是维持新形成的肉芽组织和角质形成细胞的存活必需的。血管发生是一个复杂过程，依赖创面的ECM以及内皮细胞的迁移和促有丝分裂刺激。一方面，骨髓间充质干细胞培养过的培养基包括高水平的几种已知促血管生成因子例如VEGF、bFGF和IGF和Ang1。此外，条件培养基包括更高量的趋化因子例如，MIP和MIG，用于吸引巨噬细胞到创面。在某些方面，用骨髓间充质干细胞或者源于其的培养基治疗的创伤具有更高量的内皮祖细胞，这是与血管发生有关的细胞。内皮祖细胞和巨噬细胞在创伤愈合中起着重要作用。内皮祖细胞的存在减少与受损的创伤愈合有关。在巨噬细胞缺失的情况下，创伤不愈合。
实施例
给出下列实施例以便为本领域普通技术人员提供此处描述和要求的化合物、组合物和方法如何制备和评价的完全公开和描述，只是用于示范而不是用于限制本发明人认定其发明的范围。已经尽力确保数字(例如，量，温度等等)的准确性，但需要明确一些误差和偏差。除非另外说明，份数是重量份数，温度是℃或者周围温度，压力是或者接近大气压。存在多种变化和反应条件的组合，例如，组成浓度，需要的溶剂，溶剂混合物，温度，压力和其他反应范围和条件，它们可用于优化产物纯度和从所述步骤获得的产量。只需要合理和常规的实验法来优化这种步骤条件。
方法
所有动物实验过程符合Health Sciences Animal Policy and Welfare Committeeof the University Alberta的指导。
MSC的分离和纯化
从5-7周龄雄性C57或者C57GFP转基因(C57BL/6 TgN[ACT6EGFP])小鼠(Jackson Laboratory)的股骨收集骨髓。利用Ficoll-paque密度梯度分离骨髓的单核部分。有核细胞置于塑料组织培养皿，在添加17％胎牛血清(FBS)的最低必需培养基(α-MEM；GIBCO)中孵育。首先通过它们优先与未包被的聚苯乙烯组织培养皿附着的性质筛选BM-MSC，然后利用磁性微珠(Miltenyi Biotec)和抗CD34、CD14、Gr1、CD3和CD19的单克隆抗体通过免疫耗竭进一步纯化。第3-5代细胞用于实验。
流式细胞术
用胰蛋白酶/EDTA分离第3代BM-MSC，用MSC生长培养基中和，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，在包含1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS中重悬为106/ml。100μl细胞部分与异硫氰酸荧光素(FITC)-或者藻红蛋白(PE)-偶联的单克隆抗体或者对照同种型IgG在冰上孵育30分钟，所述抗体特异于Sca-1、CD105(endoglin)、CD29、CD44、CD90、CD45、CD14、CD3、CD19和CD34。用PBS洗涤细胞。所有抗体购自BD Pharmingen。为检测皮肤中的GFP+细胞，切割的小鼠皮肤和创面被分散成单细胞悬液。简单来说，组织与1mg/ml的分散酶I(Sigma)在4℃孵育过夜，切碎，在包含1mg/ml透明质酸酶、1mg/ml胶原酶D和150单位/ml DNAase的消化缓冲液中在37℃振荡水浴孵育2小时。收集分散酶消化物和透明质酸酶消化物，通过70μm Nylon细胞滤网过滤。洗涤、沉淀细胞并在包含3％ FBS的PBS中重悬。利用Cell Quest软件通过流式细胞术(Becton Dickinson)分析10000个事件。
MSC分化分析
检测第4代BM-MSC分化成脂肪细胞，成骨细胞和软骨细胞的能力。对脂肪细胞分化来说，细胞在包含10-6M地塞米松、10μg/mL胰岛素和100μg/mL 3-异丁基-L-甲基黄嘌呤(Sigma)的生脂培养基中培养3周。对成骨细胞来说，细胞在包含10-7M地塞米松、50μg/mL抗坏血酸和10mM β-磷酸甘油(Sigma)的成骨培养基中培养3周。培养物对碱性磷酸酶(碱性磷酸酶检测试剂盒，Sigma)或者用Alizarin Red(Sigma)染色。对软骨细胞分化来说，使用pellet culture system。Pellet在包含10-7M地塞米松、50μg/mL抗坏血酸-2-磷酸盐、10μg/mL丙酮酸盐(Sigma)、10ng/mL TGF-β1(R&D Systems)和50mg/mL ITS+Premix(BDBiosciences，6.25μg/mL转铁蛋白，6.25ng/mL亚硒酸，1.25mg/mL牛血清蛋白和5.35ng/mL亚油酸)的DMEM(高糖)中培养3周。固定培养物，切片用于阿辛蓝(Sigma)染色或者用于RNA提取和RT-PCR分析。
从皮肤分离细胞
从新生Balb/C小鼠皮肤中分离皮肤角质形成细胞。简单来说，皮肤在角质形成细胞-SFM(Gibco)中用10mg/ml分散酶II(Sigma)4℃孵育13小时。从真皮分离后，表皮用胰蛋白酶消化(0.25％胰蛋白酶/0.1％EDTA)10分钟。细胞在添加10ng/ml EGF和10-10M霍乱毒素的角质形成细胞-SFM中种于塑料组织培养板。在用0.75％胶原酶消化后从新生Balb/C小鼠的真皮获得成纤维细胞，并在添加10％FBS的DMEM中培养。第3-5代细胞用于实验。
创伤愈合模型和BM-MSC移植
Balb/C小鼠(8周龄，雌性，体重20-23克)，db/db小鼠(BKS.Cg-m+/+Leprdb/J，db+/db+，13周龄，雌性)和它们的正常同胞仔(db+/m+，13周龄，雌性)获自JacksonLaboratory(表1)。在实验开始，与db+/m+小鼠相比，db/db小鼠显示显著增加的体重，血糖，甘油三酯和胆固醇。动物被随机分为三组，产生切割创伤-夹板模型。简单来说，在背部表面除毛和麻醉后，在中线两侧产生两条6-mm全层切割皮肤伤口。每个伤口移植100万个细胞(同种小鼠GFP+ BM-MSC或者同种新生皮肤成纤维细胞)：溶于60μl磷酸盐缓冲液(PBS)的0.7×106皮内注射到伤口周围的4处注射部位，溶于20μl由胶原、层粘连蛋白、弹性蛋白和蛋白聚糖组成的Growth Factor Reduced(GFR)Matrigel BD的0.3×106被施用在创面床。放置环形硅酮夹板以便伤口集中在夹板内。用速粘胶粘剂(Krazy 
)将夹板固定到皮肤，然后破坏缝合以稳定其位置(图1A)，将Tegaderm(3M)置于伤口上。动物分笼饲养。我们在本实验前检验了胶粘剂(Krazy 
)对小鼠皮肤的影响，未发现任何皮肤刺激或者过敏性反应。
创伤分析
在第0、3、7、10、14、21和28天对创伤进行数字成像。创伤闭合时间被定义为创面床完全再上皮形成和填充新组织的时间。创伤面积通过追踪创伤边缘测量并利用图象分析系统(NIH Image)计算。个体测量样品对组和治疗来说是盲的。创伤闭合的百分比计算为：(原始创伤面积-实际创伤面积)/原始创伤面积×100。夹板的内边缘与创伤边缘正好吻合，因此夹板固定的孔用于代表原始创伤大小。当利用10mm钻取活检收集包括创伤的皮肤样品和4mm周围皮肤时，在第7、14和28天处死小鼠。每个创伤被对分为两片，被用于组织学和RNA提取。对于整个皮肤固定，全部创伤和周围的皮肤置于塑料(组织培养皿)上，真皮面向下，立即拍照。
组织学检查
全部组织标本在3％新鲜制备的多聚甲醛(PFA)中固定24小时，包埋进OCT。6微米厚切片用苏木精伊红(H&E)染色进行光学显微镜观察。以盲模式进行组织学评分。根据先前报道修改的下列参数给予每个载玻片从1到10的组织学分数：再上皮形成，皮肤细胞构成和再生，肉芽组织形成和血管发生。在用抗CD31抗体对内皮细胞进行免疫荧光染色后，通过检测6个连续前面边缘之间的每个创伤切片(6μm厚)的3个区域，对毛细管密度进行形态测量分析。用于创伤愈合组织学评分的标准是再上皮形成，细胞构成，肉芽形成和血管发生(表2)。
对于免疫荧光来说，组织切片与硼氢化钠(1mg/ml溶于PBS)预孵育以降低自发荧光。利用链霉亲和素生物素封闭试剂盒(Vector)对内源生物素进行封闭。利用抗各种表皮角蛋白(角蛋白亚单位58，56，52，60，51和48kD，Dako，WideSpectrum Screening，WSS)的抗体对角质形成细胞染色。利用山羊抗GFP抗体(USbiological)检测GFP，利用FITC偶联的抗山羊的二抗显影。利用抗CD31或者Von Willebrand因子(vWF，BD Biosciences)的抗体然后与生物素化的二抗(Jackson Immunoresearch)孵育并利用Fluor 568-偶联链霉亲和素(Invitrogen)显影来鉴定内皮细胞。利用Hoeschst和Ki67或者同种型IgG(Dako)进行核染色。对于CD31和Ki67免疫染色中的阴性对照，利用针对每一种的同种型对照抗体。在针对GFP和细胞角蛋白免疫染色的阴性对照中，单独利用FITC-或者TRITC-偶联二抗处理切片。利用Zeiss LSM 510共焦显微镜检查切片。通过检查覆盖4个连续切片边缘之间每个创伤面的表皮和下部真皮的5个区域来确定Ki67阳性细胞的百分比，利用成像分析系统(NIH Image)计算每个区域核的总数。拍摄到创伤处的附件样结构，计算具有超过10％ Ki67阳性核的每个切面该结构的数目。
条件培养基
按如下方式产生条件培养基：10cm组织培养皿中80％汇合的第3代BM-MSC或者新生皮肤成纤维细胞用每皿5ml无血清α-MEM或者其他所示培养基饲养，在含氧量正常或者低氧条件下(5％ CO2，95％ N2，和0.5％ O2)在低氧小室中孵育13小时。对于体内实验，条件培养基利用Centrifugal Filter Units通过超滤进行进一步浓缩，按照制造商的说明书5kDa截留(Millipore)。
细胞生长和附着
相同数量的小鼠皮肤角质形成细胞或者人脐静脉内皮细胞(HUVEC，CAMBREX)在载体-、FB-或者MSC-条件培养基或者所示对照培养基中种于12孔组织培养板，孵育不同时间。在第4天更换一次培养基。解离并计数细胞。在附着分析中，12孔组织培养板用BSA、纤连蛋白(10ng/ml)、载体培养基或者FB-或者MSC-条件化无血清α-MEM包被。板用PBS洗涤，用5％ BSA封闭1小时。洗涤后，105细胞/孔种于角质形成细胞生长培养基，在37℃孵育1小时。去除未附着细胞后，利用胰蛋白酶消化解离附着细胞并计数。
细胞迁移
进行细胞transwell迁移分析，其中每孔100μl培养中的0.5×105角质形成细胞或者HUVEC被添加到24孔transwell板(8.0μm，孔径；Costar)的顶部小室。向更低的小室添加600μl MSC-或者成纤维细胞(FB)-条件培养基或者载体对照培养基。细胞在37℃维持8(HUVECs)或者15(角质形成细胞)小时。擦掉滤纸上部的细胞，滤纸底部(迁移的)的细胞用PFA固定，利用Hoechst染色来显影核并拍照。计数每孔6个区域的细胞数目。
内皮细胞网络形成分析
在添加0.75％ FBS的0.4ml EGM-2(基本加生长因子核FBS添加物，CAMBREX)、载体、成纤维细胞-或者BM-MSC-条件化EGM-2基本培养基中悬浮每孔2.5×104 HUVEC细胞，种于Matrigel(BD)-包被的24孔板，在37℃/5％CO2中孵育12小时。除去培养基后，固定细胞并进行拍照。利用NIH-Image软件确定管样结构的总长。每孔测量4个随机区域。
BM-MSC与角质形成细胞的共培养
在4孔小室载玻片上培养小鼠或者人角质形成细胞至80％汇合度，然后利用来自60Co源的10Gy进行辐射，剂量率为0.3Gy/分钟。或者，角质形成细胞单层用1％PFA固定0.5小时，然后用PBS剧烈洗涤。24小时后，104或者2×104GFP+ BM-MSC种于角质形成细胞单层，在添加0、1、2.5和5％FBS的K-SFM中维持1或者2周。每隔3天更换培养基。固定细胞，用与表皮角蛋白反应的抗体(Dako，WSS)染色。
实时PCR分析
从BM-MSC或者新生皮肤成纤维细胞提取总RNA(Rneasy Mini Kit，Qiagen)，所述细胞达到80％汇合度并在低氧条件下处理8小时。对于组织总RNA，新鲜皮肤组织立即保存在RNAlater(Qiagen)中，然后继之以组织匀浆和利用亲和树脂柱(Qiagen)的总RNA提取。利用SuperScript First-Strand Synthesis试剂盒(RT-PCR；Invitrogen)对总RNA进行逆转录。用于实时PCR的引物显示于表3。在BioRad iCycler iQ Detection System中利用SYBR-Green PCR master mix(Applied Biosystems)进行反应。作为内参，与靶基因平行定量β-肌动蛋白的水平。利用ΔΔCt方法计算归一化和倍数变化。
统计学分析
所有值表示为平均值±SD。进行Student’s配对t检验以比较配对样品的数据，对多组比较使用单向ANOVA检验。概率(P)值<0.05被认为是显著的。
结果
BM-MSC增强创伤愈合
BM-MSC的荧光激活细胞分类术(FACS)分析显示它们具有MSC的典型特征。它们对细胞系标记物例如CD34、CD45、CD14、CD3和CD19阴性，高表达MSC的典型表面抗原例如Sca-1、CD29、CD44、CD105和CD90(数据未显示)。当在生脂、成骨或者软骨形成培养基中培养时，它们分化为脂细胞、成骨细胞或者软骨细胞(数据未显示)。
在Balb/C小鼠(图1A&B)和遗传性糖尿病db/db小鼠(图1C&D)中，与成纤维细胞-或者载体培养基治疗的损伤相比，BM-MSC治疗的损伤显示加速的创伤闭合。在Balb/C小鼠中这种增强早在移植3天后已经出现，在Balb/C和db/db小鼠中这种增强在7天后变得更明显。在BM-MSC治疗的db/db小鼠中第7天创伤闭合甚至显示比在载体培养基治疗的无糖尿病db/m小鼠(图1D)中更快，尽管这种模式没有持续到第14天，当载体培养基治疗的db/m小鼠中创伤闭合超过BM-MSC治疗的db/db小鼠。因为一些db/m小鼠中的夹板没有与皮肤紧密结合，在14天后由于移动和毛发再生未能限制皮肤收缩，第14天后的创伤闭合数据被排除。相反，由于显著降低的物理移动和减少的毛发再生，在db/db小鼠中夹板仍然与皮肤牢固结合。与载体培养基治疗相比，在db/db小鼠中在第7、14和21天(P<0.01)而不是第28天和Balb/C小鼠中成纤维细胞治疗加速创伤闭合。
与成纤维细胞治疗的创伤(10个创伤中6个完全再上皮形成，n＝5)或者载体培养基治疗的创伤(10个创伤中4个完全再上皮形成，n＝5)相比，第7天Balb/C小鼠创伤的组织学评价显示BM-MSC治疗创伤中增强的再上皮形成(全部10个创伤完全再上皮形成，n＝5)。第7和14天创伤的分析显示BM-MSC治疗的创伤具有增强的细胞构成，更厚和更大的肉芽组织，增加的脉管系统(还可参见图4B&C)和更多数量发育中的毛发滤泡-或者腺体-样结构(图1E&F)。创伤真皮中的发育毛发滤泡-或者腺体-样结构显示增加比例的Ki67-阳性细胞(图1G)。
BM-MSC有助于皮肤角质形成细胞和附件
创伤切片的免疫染色显示手术后7天，在接受GFP+ BM-MSC的创伤中，存在大量GFP-阳性MSC，其中许多共表达的角质形成细胞特异的角蛋白(图2A)。大部分GFP和细胞角蛋白双阳性细胞发现于接近表皮的真皮中，但一些出现在表皮，尤其是基层中(图2A)。在载体培养基或者成纤维细胞治疗的创伤中未检测到GFP阳性细胞(图2A)，表明我们染色的特异性。受损皮肤真皮中的BM-MSC形成腺体-样结构，其对细胞角蛋白是阳性的(图2B)。在第14天该结构更像汗腺(图2C)。第14天创伤中GFP-阳性BM-MSC的整体丰度降低。
BM-MSC条件培养基促进角质形成细胞生长，迁移和附着
为了调查BM-MSC对皮肤其他细胞的直接影响，检验BM-MSC条件培养基对角质形成细胞行为的作用。发现与对照培养基或者成纤维细胞条件培养基相比，源自低氧处理的BM-MSC条件培养基显著促进皮肤角质形成细胞增殖(图3A)和迁移(图3B)。成纤维细胞条件培养基像BM-MSC条件培养基一样显著促进角质形成细胞附着(图3C&D)但是对角质形成细胞增殖只显示一般效果(图3A，与载体培养基相比，在第3天P<0.05，在第5和7天P>0.05)。BM-MSC增强血管发生
Balb/C小鼠皮肤是薄的和半透明的，皮肤的血管能够肉眼可见。在第7天Balb/C小鼠的假的(sham)和FB创伤中，血管在创伤周围是清晰可见的，但限于创伤中。相反，在MSC组的创伤中，血管和它们的细小分支延伸到创伤形成网络(图4A)。针对内皮蛋白CD31或者vWF的组织切片免疫组织学染色显示相对于载体培养基或者成纤维细胞治疗的创伤，第7和14天BM-MSC治疗创伤中增加的脉管系统(图4B)。在针对CD31的免疫组织学染色后，对第14天创伤的毛细管密度进行形态测量评价。如图4C所示，BM-MSC治疗创伤中毛细管密度(771±55/mm2)显著高于载体培养基(357±51/mm2)或者成纤维细胞(398±44/mm2)治疗的创伤(n＝5，P<0.001)。为了确定BM-MSC是否通过旁分泌作用增强血管发生，在BM-MSC条件培养基中培养HUVEC，发现与对照培养基或者成纤维细胞条件培养基相比，BM-MSC条件培养基显著增强HUVEC迁移(图5A)，生长(图5B)和基质胶上的血管形成(图5C)。
创伤愈合中BM-MSC的旁分泌作用
体外检验表明BM-MSC释放影响角质形成细胞和内皮细胞生长、附着、迁移和血管发生的因子。为了确定可能涉及的调节因子，通过实时PCR检测低氧处理后BM-MSC中生长因子、趋化因子和附着分子相对于新生表皮成纤维细胞的mRNA表达水平。分析显示BM-MSC差别表达更多量的生长因子例如表皮生长因子(EGF，15倍)，角质形成细胞生长因子(KGF，21倍)和胰岛素样生长因子-1(IGF-1，49倍)(图6A)，但更低量的转化生长因子(TGF)-β1(-2.5倍)。尽管BM-MSC和成纤维细胞均表达高水平的血管内皮生长因子(VEGF)-1，BM-MSC中血管生成素(Ang)1/Ang2的比例(5.7)大于成纤维细胞中(1.07)。在被检测的几种ECM分子中，BM-MSC中纤连蛋白的表达更高(2.4倍)。此外，BM-MSC显著表达比成纤维细胞更高量的趋化因子例如基质衍生因子(SDF)-1(2.7倍)，巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1b(7.3倍)和γ干扰素(MIG)诱导的单核因子(2.8倍)(图6A)。ELISA检测(IGF-1免疫分析试剂盒，Quantikine，R&D Systems)显示低氧处理后BM-MSC条件培养基中的大量的IGF-1，比新生皮肤成纤维细胞条件培养基中的高22倍(图6B，P<0.001)。针对IGF1的从第7天创伤提取的总RNA的RT-PCR分析表明BM-MSC治疗创伤中显著增加的表达，相对于成纤维细胞或者载体培养基治疗创伤(图6C)。
最后，为了检测BM-MSC释放的因子是否能够有助于增强的创伤愈合，围绕Balb/C小鼠切割创伤注射浓缩的BM-MSC条件培养基(从1百万个BM-MSC的5ml培养基浓缩到60μl/创伤)，发现与载体对照培养基的注射相比，该治疗造成显著加速的创伤闭合(图6D)。
与我们的RT-PCR数据一致，抗体阵列分析表明与成纤维细胞相比，BM-MSC表达不同量的几种趋化因子例如更大量的MIP2、IL12、MCP5和sTNFRI和更少量的IL6(图7)。IL6和肿瘤坏死因子(TNF)是有效的促炎症细胞因子。可溶性TNF受体型1(sTNF RI)负调节TNF的生物学作用。BM-MSC和成纤维细胞之间在趋化因子表达的差异可以部分解释BM-MSC治疗创伤和成纤维细胞治疗创伤之间细胞组成的差异。
为了检测血管生成因子的蛋白表达水平，进行低氧条件下浓缩BM-MSC-或者成纤维细胞-条件培养基和来自载体培养基(假的(sham))-、成纤维细胞-或者BM-MSC治疗创伤的裂解物的Western印记分析。该数据显示第7和14天，BM-MSC条件培养基中更大量的Ang-1蛋白和BM-MSC治疗创伤中更高水平的Ang-1，但未改变量的Ang-2(图8)。在还原条件下，抗VEGF-a抗体检测到大约22kDa的主带，其对应于VEGF164的分子大小。明显的，在第7和14天相对于载体培养基-或者成纤维细胞-治疗的创伤，BM-MSC治疗创伤中检测到更大量的VEGF(图8)。
利用BM-MSC治疗的创伤具有增加水平的内皮祖细胞和巨噬细胞
来自各创伤的总细胞的FACS分析表明与载体培养基(假的(sham))-或者成纤维细胞-治疗的创伤相比，BM-MSC治疗的创伤具有增加量的Flk-1阳性和CD34阳性细胞但减少的CD3阳性细胞(图9)。FLK1和CD34是内皮祖细胞的特征标记物。创伤切片的免疫荧光染色证明BM-MSC治疗的创伤具有增加的CD68阳性巨噬细胞但减少的(CD3)淋巴细胞(图10)。这些发现表明创伤中BM-MSC募集内皮祖细胞和巨噬细胞到创伤处，而成纤维细胞造成加重的炎症，这通常导致增加的瘢痕形成。
RT-PCR分析显示MSC培养基具有更高量的用于募集循环干细胞的因子，例如SDF-1、EPO、TPO和G-CSF。该数据显示MSC治疗的创伤具有更高量的内皮祖细胞，用于血管发生的细胞。此外，该数据还表明MSC条件培养基中针对巨噬细胞的更高量的趋化因子例如MIP和MIG。内皮祖细胞和巨噬细胞均在创伤愈合中起着重要作用。内皮祖细胞存在的减少伴随着受损的创伤愈合。在巨噬细胞缺失时，创伤不愈合。
MSC在角质形成细胞移植中的分析
在Balb/C小鼠背部利用钻取活检产生10mm全层皮肤创伤，插入硅移植穹顶(dome)的底部小室，缝合固定。1百万个同源BM-MSC或者皮肤成纤维细胞与皮肤角质形成细胞混合，其在200μl Growth Factor Reduced Matrigel(BD)中用荧光染料DiI(1:1)预标记，被小心施用在底部小室中的创面床。在底部小室上放置顶部小室，用绷带固定。一周后移去穹顶。在第1和2周处死动物，收集带有周围皮肤一小部分的创面，用分散酶和透明质酸酶消化获得单细胞悬液。通过FACS分析细胞来测定DiI-角质形成细胞的分数。相对于接受角质形成细胞和皮肤成纤维细胞联用混合物的创伤，FACS分析(图11)显示施用角质形成细胞和BM-MSC混合物的创伤中更大量的DiI-角质形成细胞(图1，n＝4，P<0.01)。该数据表明BM-MSC在调节角质形成细胞存活和移植中具有有益作用。
贯穿本申请引用了各种出版物。这些出版物的完整公开引入本申请为了更全面地描述此处描述的化合物、组合物和方法。
对此处描述的化合物、组合物和方法可以做出不同的改变和变化。考虑到此处描述的化合物、组合物和方法的说明和实践，此处描述的化合物、组合物和方法的其他方面是显而易见的。说明和实施例只是作为示例。
表1：实验开始时的小鼠
| 体重克 | 葡萄糖mmol/l | 甘油三酯mmol/l | 胆固醇mmol/l | |
| db+/m+ | 22.4±1.6 | 12.6±10.8 | 0.82±0.21 | 1.54±0.17 |
| db+/db+ | 46.3±3.3** | 44±7.7** | 143±0.6* | 2.4±0.59** |
*P<0.01，**P<0.0001
表2：组织学评分的标准
| 分数 | 表皮和真皮再生 | 细胞浸润 | 肉芽组织 | 血管发生(仅在第14天的创伤) |
| 1-3 | 最低到中等的再上皮形成，具有或者不具有创伤中最低的发育中腺体样结构形成 | 创伤覆盖有薄到中等的细胞层 | 仅在创伤边缘周围形成肉芽 | 毛细管密度<400/mm2 |
| 4-7 | 完全的再上皮形成，具有创伤中最低的发育中腺体样结构形成 | 创伤覆盖有厚的细胞层 | 在创伤边缘周围和30-50％的创面床形成肉芽 | 毛细管密度400-600/mm2 |
| 8-10 | 完全的再上皮形成，具有创伤中相当的发育中腺体样结构形成 | 创伤覆盖有非常厚和紧密聚集的细胞层 | 在创伤边缘周围和>50％的创面床形成厚的肉芽 | 毛细管密度>600/mm2 |
表3.用于实时PCR的鼠引物
| 正向 | 反向 | ||
| 血管内皮生长因子-a | VEGFa | AGAGCAACATCACCATGCAG | CAGTGAACGCTCCAGGATTT |
| 表皮生长因子 | EGF | AGCTGTGTCTTCTTCACT | TGgGGTCACCTGCTTTAAC |
| 角质形成细胞生长因子 | KGF | CTTCCAATGAGGTCAGCAA | CCAtaAAtCAACAGGCAAAA |
| 胰岛素样生长因子 | IGF | GGTGGtTTATGAATGGTT | AGGGtGTGtCTAATGGAG |
| 肝素结合EGF样生长因子 | HB-EGF | AAAAGAAGAAGAAAGGAAAGGG | TGCAAGAGGGAGTACGGAA |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | bFGF | ATGATGACGACGACGATGA | CTACGGTTTGGTTTGGTGTTG |
| 转化生长因子β1 | TGFβ1 | TGtTAAAACTGGCATCTGA | GTCtCttAGGAAGTAGGT |
| 基质衍生因子 | SDF-1 | GTCCTCTTGCTGTCCAGCTC | AGATGCTTGACGTTGGCTCT |
| 干细胞因子 | SCF | TAATGTTCCCCGCTCTCT | TTTTGCTGtTTTTCttTGCTTT |
| 红细胞生成素 | EPO | ACAGTCCCAGATACCAAA | GGCCTTGCCAAACTTCTATG |
| 粒细胞集落刺激因子 | G-CSF | ATCATTCTCTCCACTTCC | GTATTTACCCATCTCCTTCCCT |
| 血小板生成素-1 | TPO | ACCCCAGACTCCTAAATAAAC | CAGCAGAACAGGGATAGACAAA |
| 巨噬细胞炎性蛋白-1 | MCP-1 | CCCGTAAATCTGAAGCTAA | CACACTGGTCACTCCTACAGAA |
| 巨噬细胞炎性蛋白1a | MIP1a | CCAGTCCCTTTTCTGTTC | CtTGGTTGCAGAGTGTCAT |
| 巨噬细胞炎性蛋白1b | MIP1b | ACGGgGGTCAATTCTAAG | GCCATTCCTGACTCCACA |
| γ干扰素诱导的单核细胞 | MIG | ACCAAAAGAAAAAGCAAAAGAG | CCTTGAACGACGACGACT |
| 前胶原，I型，α1 | Col1???al | ATTCGGACTAGACATTGG | GGGTTGTTCGTCTGTTTC |
| 前胶原，III型，α1 | Col3al | TttAGACAtGAtGAGCTT | ATCTACGTTGGACTGCTGTG |
| 纤连蛋白-1 | Fn1 | AATCCAGTCCACAGCCATTC | TAGTGGCCACCATGAGTCCT |
| 层粘连蛋白1 | Lam1 | AGTGGAAGGAATGGTTCACG | TGCCAGTAGCCAGGAAGACT |
| 粘蛋白(tenascin)C | TnC | CAAGGGAGACAAGGAGAG | TCGTCCAGAAAAACGTCAGA |
| 血小板反应素 | Thbsl | ACAAGTCACCCAGTCCTA | GAGTTCACAACCttTACAGA |
| 多能聚糖 | PG-M | TGTGCTTCACTCATCATTTC | GCAGTCCCATAATCCAAACC |
| 聚集蛋白聚糖1 | Agcl | GAGTGAGAACCTACGGAA | CTGgGGATGTCGCATAAAAGA |
| 核心蛋白多糖 | PGII | CTGGCACAGCATAAGTATATC | AGCCGAGTAGGAAGCCTTT |
| 透明质烷(hyaluronan)合酶1 | Has1 | GGGAGgGGTAATTTATTGA | TAGCAACAGGGAGAAAATGGAG |
| 透明质烷合酶2 | Has2 | CAAAAAGAGCACCAAGGTT | GTGCAGCTTTCCCTTAGACA |
| 透明质烷合酶3 | Has3 | GTTTCTTCCCATTCTTCCTC | CCtTGATAATGCCCACCA |
| 血管生成素-2(Ang-2) | Ang2 | GACTTCCAGAGGACGTGGAAAG | CTCATTGCCCAGCCAGTACTC |
| 血管生成素1(Angpt1) | Ang-1 | TTGTGATTCTGGTGATTGTGG | CttGTTTCGCttTATTTTTGT |
| γ干扰素诱导蛋白-10 | CXCL10 | TGTCCTAGCTCTGTACTGT | AACTTAGAACTGACGAGCCT |
| β肌动蛋白 | ACGGCCAGGTCATCACTATTG | CAAGAAGGAAGGCTGGAAAAGA |
Claims (15)
1.一种预防或者治疗个体皮肤缺损的方法，所述方法包括给药皮肤缺损一种包括间充质干细胞、源自间充质干细胞的条件培养基或者其组合的组合物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于皮肤缺损包括皱纹、瘢痕、老年斑或者蹙额纹。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于皮肤缺损包括切口或者溃疡。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于组合物被局部施用于皮肤缺损。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于组合物被注射到皮肤缺损。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于间充质干细胞源自骨髓。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于相对于给药组合物前皮肤缺损中的量，给药皮肤缺损组合物后内皮祖细胞、巨噬细胞或者其组合的量增加。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于条件培养基来自低氧或者含氧量正常条件下的间充质干细胞。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于组合物的给药诱导或者增强皮肤缺损中的血管发生。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于组合物还包括角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞或者任意其组合。
11.一种诱导或者促进角质形成细胞生长的方法，所述方法包括将皮肤缺损中存在的受损角质形成细胞与包括间充质干细胞、源自间充质干细胞的条件培养基或者其组合的组合物接触。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于组合物还包括角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞或者任意其组合。
13.一种条件细胞培养基，其是通过包括在低氧或者含氧量正常条件下培养间充质干细胞的方法产生的。
14.一种药物组合物，所述组合物包括权利要求13所述的条件细胞培养基，间充质干细胞或者其组合，和药学上可接受的载体。
15.如权利要求14所述的药物组合物，其特征在于组合物还包括角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞或者其任意其组合。
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