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CN101292033B - 用于活性试剂向细胞的递送的多价rna纳粒 - Google Patents

用于活性试剂向细胞的递送的多价rna纳粒 Download PDF

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CN101292033B CN2006800365235A CN200680036523A CN101292033B CN 101292033 B CN101292033 B CN 101292033B CN 2006800365235 A CN2006800365235 A CN 2006800365235A CN 200680036523 A CN200680036523 A CN 200680036523A CN 101292033 B CN101292033 B CN 101292033B
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Abstract

由多个嵌合pRNA分子形成的多价多聚复合物，各携带至少一个生物学活性部分、可检测标记或其他异源组件。

Description

用于活性试剂向细胞的递送的多价RNA纳粒
本申请要求2005年8月1日提交的美国临时申请系列号NO.60/704,261的权益，并且是2005年6月16日提交的美国专利申请系列号NO.10/539,241的部分延续专利申请；美国专利申请系列号NO.10/539,241是2003年12月16日提交的国际专利申请No.PCT/US2003/039950(于2005年1月13日作为WO 2005/003293公开)的美国国家阶段专利申请；其要求了2002年12月16日提交的美国临时专利申请系列号No.60/433,697的权益，并且是2003年2月24日提交的美国专利申请系列号NO.10/373,612的部分延续专利申请，其是2001年8月23日提交的国际专利申请PCT/US01/26333的部分延续申请，其接着要求了2000年8月23日提交的美国临时专利申请系列号NO.60/227,393的权益，这些专利申请的每一个通过完全引用合并在此。
                    政府权益的声明
本发明在来自国家卫生研究所(拨款Nos.GM59944、.GM48159和R01-EB003730)、国防部(乳腺癌概念奖金BC024308和拨款Nos.W81XWH-05-0158和DAMD17-03-1-0589)；和国家科学基金会(拨款No.MCB-9723923)的拨款之下由政府的支持做出。在本发明中政府拥有某些权力。
                        背景
纳米技术已经带来了用于疾病的检测和治疗的多种前所未有的革命性方法。由于它们很小的尺寸，纳粒(nanoparticle)可以容易地与细胞表面或内部的生物分子相互作用。为了利用这种优点，期望的是开发多功能的工程化的、靶向的复合物，其能够绕过生物屏障来直接向特定细胞或组织递送多种治疗试剂。由于它们容易接近身体的许多区域，多价的纳粒提供了大量的创新工具的可能性，具有以早先不可思议的方式组合检测和治疗的潜力。
在癌症发展的不同阶段，异常的和功能紊乱的细胞表达多种细胞因子、信号分子、标记物、受体和其他特异性抗原。通过多价治疗试剂或检测传感器对具有独特标志的癌症的早期检测和治疗可以大大地有益于患者并且挽救生命。(Hood，et al.，Science 2002；296：2404-2407)。然而，检测癌细胞的阶段特异性特征、从而产生目标图象和多种药物递送系统的能力的开发仍然是种挑战。大于50nm的颗粒难以进入细胞；内吞作用的尺寸限制是约100nm。小于20nm的分子会在循环期间移出血管，具有较短的体内滞留时间。
小的干扰siRNA(Elbashir et al.(2001)，Nature，411，494-498；McCaffrey et al.(2002)，Nature，418，38-39；Li et al.，Science 2002；296：1319-1321；Ryther et al.，Gene Ther 2005；12：5-11；Brummelkamp etal.，Science 2002；296；550-553；Jacque et al.，Nature 2002；418：435-438；Carmichael，Nature 2002；418：379-380；Soutschek et al.，Nature 2004；432(7014)：173-178)、核酶(Hoeprich et al.，Gene Therapy 2003，10(15)，1258-1267；Rossi，Adv Drug Deliv Rev 2000；44：71-78)和反义RNA(Coleman et al.，Nature 1985；315：601-603；Knecht et al.，Science1987；236：1081-1086；Kumar et al.(1998)，Microbiol Mol Biol Rev，62，1415-1434)都在减量调节(down-regulate)癌细胞或病毒感染的细胞中特定基因表达的新的分子学方法方面显示了显著的潜力。
siRNA和核酶RNA已经被广泛地用于以序列特异性方式的转录后基因沉默。已经通过各种方法研究了siRNA的递送，包括病毒载体递送(Devroe et al.，Expert Opin Biol Ther 2004；4：319-327)和脂质密封的RNA注射(Morrissey et al.，Nat Biotechnol 2005；23：1002-1007)。近来，已经报道了连接到胆固醇基团的siRNA经由静脉内注射在小鼠中沉默目标基因表达。(Soutschek et al.，Nature 2004；432：173-178)。siRNA还被成功地用于敲除HIV相关的基因表达(Novina et al.(2002)，Nat Med，8，681-686；Akkina et al.(2003)，Anticancer Res，23，1997-2005；Mariadason et al.，Cancer Res 2003；63：8791-8812)。
核酶是能够裂解(cleaving)目标RNA分子、或进行其他催化功能和酶功能的RNA分子。在结构上，它是单链RNA，特征在于位于小的环体两侧的两个“臂”。核酶碱基与目标RNA上的区域配对，所述区域与核酶的两个臂的核苷酸序列互补。环体区域充当了活性催化中心，其对目标RNA进行裂解功能(附图1)。
核酶在植物、人类和动物中的疾病治疗和预防方面的用途具有变革生物技术的潜力。例如，锤头(Hammerhead)核酶已经用于在转基因植物和动物中裂解RNA。然而，尽管大量的公开物报道了试管中的研究的结果，关于在活有机体中成功使用锤头核酶的报道是较少的(Perrimanet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：6175-6179(1995))。虽然明显的是锤头核酶可以在试管中裂解特定的病毒RNA或mRNA，在细胞中的裂解效力由于核酶在细胞中的不稳定性和错误折叠而显著降低。
核酶在细胞内环境的不稳定性的主要原因是细胞中存在的核酸外切酶对核酶的降解(Cotton et al.，EMBO J.8：3861-3866(1989))。核酸外切酶是从两端非特异性修整RNA的酶。用于阻断核酶的细胞内降解的一种方法是通过将核酶在其一个末端连接到载体RNA，如tRNA来保护核酶(Vaish et al.，Nucl.Acids Res.26：5237-5242(1998))。然而，由于产生的嵌合RNA的再折叠，与未受保护的核酶相比，这种核酶在效力方面改变了(Bertrand et al.，RNA 3：75-88(1997))。还报道了核酶拴系到tRNA的两端，但损害了折叠和/或活性(Vaish et al.，Nucl.AciasRes.26：5237-5242(1998))。
通过使用核酶裂解癌症和病原体感染中涉及的RNA来治疗疾病的潜力是巨大的。对于降解有抗性并且正确折叠、从而在细胞内环境中保持活性的稳定的核酶的可用性将为许多重要的医学疗法的开发铺平道路。
siRNA和核酶对于治疗癌症和其他疾病和状况的成功的应用需要克服以下障碍：1)由于膜穿透性的尺寸限制进入细胞的难度；2)被细胞内的核酸外切酶降解；3)运输进入适合的细胞区室；4)如果融合到载体，核酶或siRNA在细胞中的正确折叠；以及5)靶细胞的识别。在此时，开发安全、有效、特异性以及非致病性的纳粒用于多种治疗性RNA的递送是高度期望的。
                        发明概述
本发明提供了嵌合pRNA，其包括配对的双链螺旋形结构域、分子间相互作用结构域以及异源组件。所述异源组件对所述嵌合pRNA赋予了期望的性质，并且可以采取生物学活性部分(例如，治疗试剂)、可检测标记、稳定试剂等等的形式。
在一个实施方式中，所述嵌合pRNA是环状排列的(permuted)嵌合pRNA分子。pRNA嵌合体由环状排列的(circularly permuted)pRNA区域、以及包括所述异源组件的间隔区形成。所述异源组件不限于任何化学结构，但优选的是生物学活性部分，更优选的是RNA，例如核酶、siRNA(小的干扰RNA)、RNA适体(aptamer)或反义RNA。所述间隔区在其5′和3′末端与所述pRNA区域共价连接。任选的，所述间隔区包括插入在所述生物学活性部分和所述pRNA区域之间的第一和第二核苷酸串列(nucleotide string)。
在另一个实施方式中，本发明的所述pRNA嵌合体包括siRNA作为它的异源组件，从而所述配对的双链螺旋形区域包括或由所述siRNA形成。所述siRNA对于沉默细胞中的基因表达是有效的，所述细胞例如癌细胞或被病毒感染的细胞。可以被沉默的基因的实例包括存活蛋白(survivin)和各种病毒基因。
在本发明的pRNA嵌合体的另一个实施方式中，所述异源组件在所述pRNA的5′或3′末端处或附近共价地或非共价地连接到所述pRNA。用于连接在所述pRNA的5′或3′末端处或附近的优选的异源组件包括靶向部分，例如叶酸，以及可检测标记，例如生物素、荧光标记和放射性标记。在特别优选的实施方式中，所述pRNA具有5′突出末端，所述异源组件与所述5′突出末端连接。
在本发明的pRNA嵌合体的又一个实施方式中，所述异源组件包括与所述pRNA的5′或3′末端退火(经由碱基配对/杂交)的寡核苷酸。优选的，所述寡核苷酸是DNA寡核苷酸，然而它可以是RNA寡核苷酸。在特别优选的实施方式中，所述pRNA具有5′或3′突出末端，所述寡核苷酸与所述突出末端，优选的所述3′突出末端退火。任选的，所述寡核苷酸包括可检测标记，例如生物素或放射性标记。
本发明的嵌合pRNA可以是单体的或多聚体的。当是多聚体时，所述pRNA优选的是二聚体、三聚体或六聚体，容许所述多聚复合物成为多价的。在多价多聚体复合物中，多个异源组件可以是相同的或不同的。所述多聚体复合物可以有益地含有一种或多种生物学活性部分，其促进特异性靶向以递送由其他组分嵌合pRNA携带的一种或多种治疗试剂，例如涉及细胞表面结合、膜扩散或内吞作用的生物学部分。例如，SELEX方法已经普遍地用于筛选结合细胞表面标记物的RNA适体(Ellington etal.，Nature 346，818-822(1990)；Tuerk et al.，Science 249，505-510(1990))。这种RNA适体可以附着于pRNA二聚体、三聚体或六聚体的多个亚单位之一，用于在治疗试剂的递送期间特异性细胞识别。可以包括入所述多聚体复合物的其他异源组件包括涉及治疗试剂、标记组件、稳定剂如互补寡核苷酸等等的细胞内靶向以及释放的那些。
pRNA区域具有噬菌体pRNA序列的紧密的稳定二级结构特征。因而，在pRNA嵌合体的一个实施方式中，所述pRNA区域包括选自由φ29、SF5′、B103、PZA、M2、NF和GA1构成的组的噬菌体的pRNA。所述pRNA可以是环状排列的或非环状排列的。在所述pRNA嵌合体的另一个实施方式中，所述pRNA区域包括：
(i)在5′到3′方向上从pRNA与间隔区的3′末端的共价键开始
第一环体；
第二环体；和
包含膨隆(bulge)、第一茎区段和第三环体的低位(lower)茎-环结构；
(ii)插入在所述间隔区和所述茎-环结构之间的第二茎区段；
(iii)插入在所述茎-环结构和所述第一环体之间的第三茎区段；
(iv)插入在所述第一环体和所述第二环体之间的第四茎区段；和
(v)划定所述pRNA嵌合体的5′和3′末端的开口，位于所述pRNA区域内的任何地方。
本发明还提供了产生本发明的pRNA嵌合体的方法。在一个实施方式中，编码pRNA嵌合体的DNA被体外转录来产生所述pRNA嵌合体，所述pRNA嵌合体含有pRNA区域以及包括生物学活性RNA的间隔区。任选的，使用聚合酶链式反应在DNA模板上产生编码所述pRNA嵌合体的DNA，或者，通过克隆所述DNA到质粒中并复制所述质粒来产生所述DNA。在另一个实施方式中，所述pRNA是使用较小的RNA片段(模块组件)化学地合成的。
本发明进一步提供了测定RNA分子是否与测试分子相互作用的方法。包括感兴趣的RNA分子的pRNA嵌合体被固定在基质上，然后与测试分子接触。然后检测所述测试分子是否与感兴趣的RNA相互作用，例如通过结合所述感兴趣的RNA。
本发明还提供了包括核苷酸序列的DNA分子，所述核苷酸序列编码pRNA嵌合体，所述pRNA嵌合体含有pRNA区域以及包括生物学活性RNA的间隔区。
本发明还提供的是将生物学活性RNA递送到细胞、优选植物细胞或动物细胞，例如人类细胞的方法。在一个实施方式中，具有核苷酸序列的DNA分子被导入细胞并被转录产生生物学活性RNA，所述核苷酸序列可操作地编码本发明的pRNA嵌合体。在另一个实施方式中，所述pRNA嵌合体被直接转染到细胞中。做为选择，通过掺入特异性结合细胞表面标记物的RNA适体，嵌合pRNA复合物可以经由内吞作用被递送给细胞(Ellington et al.，Nature 346，818-822(1990)；Tuerk et al.，Science 249，505-510(1990))。
                    附图的简要说明
附图1是代表性的核酶的目标RNA裂解的示意性描述。
附图2描绘了野生型φ29(phi29)pRNA(SEQ ID NO：27)的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)和二级结构，表明了(a)环体和膨隆的位置和名称(Zhang et al.，RNA 3：315-323(1997))；和(b)原衣壳(procapsid)结合结构域和DNA包装(packaging)结构域；右手和左手环体、头部环体、U72U73U74膨隆和C18C19A20膨隆在方框内；DNA包装结构域(5′/3′末端)和原衣壳结合结构域(更大的区域)是阴影的；曲线指出了两个相互作用的环体；注意到，(a)中显示的三碱基UAA 3′突出物在个图中不存在。
附图3描绘了环状排列之前的几种pRNA的核苷酸序列：(a)噬菌体SF5′(SEQ ID NO：11和28)，(b)噬菌体B103(SEQ ID NO：12和29)，(c)噬菌体φ29和PZA(SEQ ID NO：13和30)，(d)噬菌体M2和NF(SEQ ID NO：14和31)，和(e)噬菌体GA1(SEQID NO：15和32)(Chen et al.，RNA 5：805-818(1999))；以及(f)aptRNA(SEQ ID NO：16和33)。
附图4是本发明的pRNA嵌合体的各种结构特征的示意性描述：(a)完整的pRNA嵌合体；(b)间隔区组件；(c)pRNA区域组件。
附图5是(a)本发明的pRNA嵌合体的一个实施方式的设计；和(b)显示了各种圆环开口位置的示范性的环状排列的pRNA(cpRNA)分子的示意性描述。
附图6描绘了(a)pRNA核酶裂解活性的可能的机制；和(b)嵌合pRNA/核酶复合物的结构布置。
附图7描绘了(a)野生型pRNA(SEQ ID NO：1)的序列和预测的二级结构；(b)pRNA二聚体(SEQ ID NO：26)的二级结构(Trottieret al.，RNA 6：1257-66(2000))；(c)pRNA二聚体的三维计算机模型(Hoeprich and Guo，J Biol Chem 277：20794-803(2002))；其中(b)中的二聚体的单体亚单位的残基之间的线显示了经由手牵手(hand-in-hand)相互作用的左手和右手环体分子间相互作用的碱基(Guo et al.，Mol Cell 2：149-55(1998)；Zhang et al.，Mol Cell 2：141-47(1998))；(d)和(e)描绘了通过上和下环体序列相互作用的pRNA六聚环的形成的图。
附图8描绘了pRNA二聚体、三聚体和六聚体作为多价基因递送载体的各种实施方式。
附图9描绘了在SELEX方法中使用环状排列的pRNA来鉴定结合预先鉴定的底物的RNA适体。NNN...N(25-100)...NNN，模板的随机序列；模板(SEQ ID NO：36)，模板引物；引物1(SEQ ID NO：35)，3′末端引物；引物2(SEQ ID NO：34)，5′末端引物。
附图10表现了通过噬斑形成单位来测量的、pRNA的3′末端的各种延伸(SEQ ID NO：19-22)对病毒活性的影响。
附图11描绘了环状排列的pRNA的设计和产生。(a)中的模板DNA(SEQ ID NO：2)使用短的(AAA)序列来连接天然的5′/3′末端，而(b)中的模板(SEQ ID NO：38)使用较长的序列(SEQ ID NO：8)来连接天然的5′/3′末端。cpRNA的新的开口通过指向转录产物序列(SEQID NO：37和39)中的位置的楔形来表明(参见Zhang et al.，RNA3：315-323(1997))。
附图12描绘了结合到U7snRNA底物(SEQ ID NO：4)的部分的RNA嵌合体(SEQ ID NO：3的残基1-167)。
附图13描绘了pRNA携带的嵌合核酶对底物的体外裂解。(a)显示RzU7、U7snRNA靶向核酶(SEQ ID NO：10)、与其底物的碱基配对(SEQ ID NO：4)的二级结构的示意图。(b)变性尿素凝胶，显示了底物U7snRNA的裂解成为预期的69mer和25mer裂解产物，通过核酶RzU7和嵌合核酶PRNA-RzU7。
附图14显示了变性尿素凝胶，表明底物HBV-polyA成为它预期的70mer和67mer裂解产物的成功裂解。
附图15描绘了编码靶向HBV polyA信号的自我加工核酶的质粒的设计和构建。(a)显示了编码核酶pRNA-RzA的质粒的设计。(b)显示了在转录和顺式裂解之后加工的嵌合核酶。(c)显示了与HBV polyA目标序列(SEQ ID NO：24)碱基配对的锤头核酶(RzA)(SEQ ID NO：23)的二级结构。从“G”到“A”的标明的改变产生无效的酶作为阴性对照。(d)显示了与HBV polyA底物(SEQ ID NO：24)碱基配对的核酶pRNA-RzA(SEQ ID NO：25)的二级结构。
附图16描绘了核酶对HepG2细胞中HBV RNA水平的影响。
附图17描绘了与底物RNA(SEQ ID NO：6)结合的抗-12-LOX核酶(SEQ ID NO：5)。
附图18描绘了pRNA二聚体、三聚体和六聚体经由右手(大写字母)和左手(小写字母)环体的相互作用的形成。在大写字母和小写字母中相同的字母，例如A和a′，表示互补的序列，而不同的字母，例如A和b′，表示非互补环体。
附图19描绘了phi29病毒颗粒上pRNA的二级结构、结构域和位置：(a)pRNA A-b′(SEQ ID NO：40)的二级结构。分子间结合结构域(阴影区域)和反应性DNA易位结构域用粗线标出。在右手和左手环体中对内部RNA相互作用负责的四个碱基是有框的；(b)Power Rangers描绘了通过手牵手相互作用的pRNA六聚体；(c)具有通过pRNA A-b′和B-a′形成的pRNA六聚体的phi29 DNA包装引擎。环绕的五边形代表五辐对称的衣壳顶点，看成是端头向上的侧视的病毒粒子。pRNA的中心区域结合连接物，5′/3′配对的区域向外延伸(Chen et al.，RNA，5：805-818(1999)).
附图20描绘了(a)两个；(b)三个和(c)六个互锁的(interlocking)pRNA。
附图21描绘了代表性的嵌合pRNA设计。I.携带核酶的嵌合pRNA与目标杂交。II.pRNA单体的二级结构(SEQ ID NO：1)。III.靶向HIV tat/rev底物的携带核酶(SEQ ID NO：44)的嵌合pRNA(SEQ ID NO：41)的二级结构。IV.携带腺病毒knob结合适体(SEQ ID NO：43)的嵌合pRNA的二级结构。V.携带CD4结合RNA适体(SEQ ID NO：42)的嵌合pRNA的二级结构。三种pRNA组合形成三聚体。
附图22显示了RNA纳粒的工程化和建造的示意图。(I)phi29 pRNA载体的大小和三维计算机模型。(II)制造的三聚体。
附图23显示了含有适体、siRNA、配体和荧光物的三聚体设计的六种不同结构。
附图24显示了共焦显微镜检查，其显示了三种组件向CD4过量表达细胞的特异性和同时递送。I.含有pRNA(A-b’)/适体(CD4)、pRNA(B-e’)-FITC和pRNA(E-a’)-Rhodamine的pRNA三聚体对CD4hi T细胞(左列的A-D，右列的I-L)和CD4neg T细胞(中间列的E-H)的结合的分析。A、E和I用FITC滤镜成像；而B、F和J用Rhodamine滤镜检视；C、G和K是重叠的；D、H和L是DIC图像。右侧列代表CD4hi细胞的全貌图。箭头指向进入细胞的复合物。II.共焦显微镜检查图像的局部区分了结合(M)和细胞进入(N和O中的箭头)以及阴性对照(P)。含有CD4结合适体的FITC标记的pRNA三聚体对淋巴细胞的结合显示为圆圈，进入显示为细胞内部的绿斑(O中的箭头)。N中的红颜色是用Texas红标记的转铁蛋白阳性进入对照。
附图25显示了天然聚丙烯酰胺凝胶(A)、AFM成像(B)和蔗糖浓度梯度沉降法(C)来检测制造的pRNA三聚体的形成。(A)天然PAGE凝胶，显示展现不同的迁移速度的pRNA单体和pRNA嵌合体的三聚体。(B).低和高放大率的pRNA单体和三聚体的AFM图像。pRNA单体折叠成对勾(checkmark)形状，三聚体展现了三角形状。每个图像内的颜色反映分子的厚度和高度。更亮的(或更白的)颜色表明更厚的或更高的分子；更暗的颜色表明更薄的分子。(C.)通过5-20％蔗糖浓度梯度沉降法的pRNA单体和三聚体的分离。所有颗粒加载到梯度的顶部，通过超速离心分离。沉降是从右到左。
附图26显示了不同的嵌合siRNA构建体的GFP敲除分析。在用各种嵌合pRNA/siRNA构建体转染细胞后两天，通过荧光显微镜观察GFP表达。
附图27显示了经由携带适体(CD4)、siRNA(CD4)和pRNA/FITC的制造的pRNA三聚体共同递送的siRNA(CD4)的功能分析。(I)显示了在三聚体中pRNA(A-b′)/适体(CD4)、pRNA(B-e′)-FITC和pRNA(E-a′)-Rhodamine的共同递送的阳性对照(附图23A)。如通过流式细胞计评定的，CD4hi T细胞与三聚体的孵育、无转染产生了95％的细胞，其通过适体(CD4)介导接受FITC和Rhodamine荧光RNA。(II)CD4hi T细胞与含有pRNA(A-b′)/适体(CD4)、pRNA(B-e′)-FITC和pRNA(E-a′)-siRNA(CD4)(附图1-III-C)的pRNA三聚体的孵育、无转染产生了85％的细胞接受FITC。接受pRNA三聚体的CD4hiT细胞被分为FITC阳性和FITC阴性细胞，通过用PE标记的抗体的表面染色来测定CD4水平。与FITC-阴性细胞的42.56％相比，在FITC阳性细胞中CD4水平被降低到17.8％，表明了三聚体中siRNA(CD4)的递送和功能。(III)显示了CD4hi T细胞与携带适体(CD4)而不是siRNA(CD4)的pRNA二聚体或三聚体的孵育的阴性对照在CD4水平(都是约90％)和细胞生存力(都是约70％)方面没有产生差异。对照二聚体或三聚体含有pRNA/siRNA(BIM)代替pRNA/siRNA(CD4)。
附图28显示了通过细胞溶胞产物(C)或纯化的Dicer(D)的嵌合pRNA/siRNA复合物成为siRNA的加工。pRNA/siRNA单体(泳道b-e)、phi29 pRNA载体(泳道f-I，&m-o)或三聚嵌合体(j-l)在5′末端用32P标记，与细胞溶胞产物(C)或Dicer(D)孵育，通过变性凝结分析。(E)和(F)显示了特异性pRNA/siRNA保护的淋巴细胞的前细胞凋亡因子BIM的抑制作用，免于细胞因子退出和诱导的细胞凋亡。D1(T细胞)是细胞因子依赖性淋巴细胞系，其表达BIM，并展现不存在细胞因子的情况下的细胞凋亡。pRNA/siRNA(BIM)引入D1细胞(E)产生了免于IL-3退出诱导的细胞死亡的保护。通过Western印迹分析BIM的蛋白水平(F)。
附图29显示了使用制造的RNA纳粒的癌症治疗的动物试验。(A)没有pRNA/siRNA嵌合体的注射(No RNA)；(B)用含有叶酸-pRNA和siRNA的RNA嵌合体治疗(存活蛋白)；(C)用含有叶酸-pRNA和siRNA(存活蛋白)、在siRNA序列中具有突变的RNA嵌合体治疗；(D)用在其5′末端不含有叶酸的pRNA-siRNA嵌合体治疗。
附图30显示了pRNA嵌合体的序列和结构的草图。(A)phi29 pRNA序列和二级结构。5′/3′末端的双链螺旋形结构域是有边框的，二聚体形成的结构域是阴影的。曲线指向两个相互作用环体。(B)pRNA二聚体的三维结构。(C)天然聚丙烯酰胺凝胶，显示展现不同迁移速度的单体和pRNA嵌合体的二聚体。在凝胶下方是phi29 pRNA单体和二聚体的低温AFM图像。颜色反映了分子的厚度和高度；颜色更亮，分子就更厚或更高。(D)携带外源部分的嵌合pRNA二聚体的设计(参见“结果”之后的“RNA亚单位的命名”)。
附图31显示了通过Dicer对嵌合pRNA/siRNA复合物的加工。pRNA/siRNA载体的结构在(A)和(B)中示出。通过重组Dicer将pRNA/siRNA加工成为22-bp siRNA。具有5′-末端32P标记的嵌合pRNA/siRNA与纯化的重组Dicer分别孵育30分钟和2小时，然后在变性PAGE/尿素凝胶上分离。放射性标记的22-核苷酸RNA用作分子量标记。
附图32显示了通过转染的嵌合pRNA/siRNA(GFP)的功能分析。(A-C)显示了通过转染的GFP基因的沉默的荧光显微图像。(A)通过嵌合pRNA/siRNA(GFP)的剂量依赖性沉默(左列)。突变从pRNA/siRNA(右列)充当阴性对照。(B)用各种RNA转染的细胞的GFP表达：(a)无RNA；(b)合成的双链siRNA(GFP)；(c)双链siRNA(LacZ)对照；(d)pRNA/siRNA(GFP)；(e)pRNA/siRNA(突变的)；(f)单独的pRNA载体。(C)(a)嵌合pRNA/siRNA(GFP)和(b)相同浓度的常规的双链siRNA(GFP)；(c)没有siRNA处理的对照物的性能的比较。(D)检查转染后嵌合pRNA/siRNA(GFP)对GFM mRNA水平的影响的Northern印迹。泳道1和2显示了两种不同的pRNA/siRNA(GFP)构建体的影响；泳道3，双链siRNA；泳道4，没有RNA处理的细胞。rRNA被用作加载对照。
附图33显示了通过转染的嵌合pRNA/siRNA靶向荧光素酶的功能分析。(A)双报告物荧光素酶分析，显示了分别通过pRNA/siRNA(萤火虫)或pRNA/siRNA(Renilla)以剂量依赖性方式的荧光虫荧光素酶或Renilla荧光素酶表达的特异性敲除。(B)常规的发夹siRNA(荧光素酶)和pRNA/siRNA(荧光素酶)的活性的比较。在siRNA序列中具有突变的pRNA/siRNA(突变)被包括作为非特异性对照。
附图34显示了由携带靶向存活蛋白的siRNA的嵌合pRNA的转染诱导的细胞凋亡和细胞死亡。(I)用pRNA/siRNA(存活蛋白)转染乳腺癌MCF-7细胞，通过PI-annexin V双标记和随后的流式细胞计来监视细胞凋亡。底部右侧象限内的细胞代表细胞凋亡的细胞。(II)乳腺癌细胞(MDA-231)和前列腺癌细胞(PC-3)在24孔平板中用20pmol的pRNA/siRNA(存活蛋白)转染，在转染后24小时采集图像。突变的pRNA/siRNA并行转染作为阴性对照。
附图35显示了靶向促细胞凋亡因子BAD的pRNA/siRNA嵌合体的功能分析。(A)pRNA/siRNA(BAD)和对照siRNA(10nM)在第1天通过电穿孔导入原B细胞，与转染试剂组合。在第2天洗涤细胞以除去IL-3，在第3天分析生存力。(B)比较用嵌合siRNA(BAD)或用两个在siRNA序列内含有不同突变的突变对照物转染的细胞中的BAD蛋白水平。对照细胞用单独的pRNA处理。在第3天制备细胞溶胞产物(Khaled et al.，2001)，通过12％SDS-PAGE分离蛋白，随后使用BAD抗体(Cell SignalingTechnology，Beverly，MA)Western印迹。画面下的编号表明剩余的BAD水平，表示为与对照细胞相比的百分比。(C)用pRNA/siRNA(survivin)或突变体转染的原B细胞在含有IL-3或没有IL-3的完全培养基中生长。通过显微镜检查观察RNA对细胞形态的影响。
附图36显示了通过CD4受体的嵌合pRNA/siRNA的特异性递送。(I)相应于含有CD4结合适体的FITC标记的pRNA二聚体与淋巴细胞的结合的绿色圆圈是通过共焦显微镜检查(a)显示的，RNA的进入显示为细胞内部的绿色斑点(d)。Texas红标记的转铁蛋白用作内在化的阳性对照(b)。在没有CD4表达的对照细胞系中没有观察到结合(c)。插图：用于染色的细胞的微分干涉相衬(DIC)图片。(II)如通过台盼蓝排阻分析所测定的，RNA二聚体的孵育引起细胞生存力的特异性抑制。在存在或缺乏IL-7的情况下，没有CD4表达、低CD4表达水平或高CD4表达水平的三种不同的细胞系与pRNA/siRNA(存活蛋白)-pRNA/适体(CD4)复合物孵育。
附图37显示了靶向存活蛋白的嵌合pRNA的毒性分析。将HeLaT4细胞接种到24孔平板中，使得它们在孵育之时是30-50％汇合的。接种后24小时，向每个孔添加标明数量的RNA。在培养箱中进一步孵育细胞24、48和72小时，通过血球计数器来计算活细胞的数目。显示的相对存活率通过每种处理中存活细胞的数量除以没有用RNA处理的存活细胞的数量来获得。
附图38显示了通过叶酸-pRNA的嵌合pRNA/siRNA的特异性递送。(A)FITC标记的叶酸-pRNA与KB细胞的结合的流式细胞计分析。左图：细胞与用FITC标记的叶酸-pRNA孵育。中图：细胞与游离叶酸预孵育，其充当阻断试剂来与叶酸-pRNA竞争结合受体。右图：还使用FITC标记的无叶酸pRNA作为阴性对照测试结合。FITC阳性细胞的百分比在右上部分象限中显示。(B)叶酸-pRNA二聚体与KB细胞的特异性结合。在细胞与[3H]叶酸-pRNA二聚体在存在(中间列)或缺乏(左列)游离叶酸的情况下孵育之后，分离细胞并进行闪烁计数。右边列代表没有叶酸标记的3H标记的二聚体作为阴性对照。(C)在通过孵育的敲除分析中，含有pRNA(B-a′)/叶酸和pRNA(A-b′)/siRNA(萤火虫)的叶酸嵌合二聚体与KB细胞孵育3小时以容许RNA的结合和进入。第二天在双报告物系统中测量荧光素酶水平。除了缺少叶酸标记之外，对照二聚体与叶酸二聚体是相同的。
附图39显示了pRNA六聚体作为多价基因递送载体的潜在用途。已经发现pRNA的六个拷贝形成六聚环来驱动细菌病毒phi29的DNA包装引擎。因而存在六个可用的位置来携带外源部分用于靶向、治疗和检测。
附图40显示了叶酸-AMP的结构、纯化和特征。(A).通过竞争分析显示的叶酸-AMP与叶酸受体的结合。KB细胞没有处理(a)或与叶酸-FITC孵育(c)还显示的是没有叶酸标记的FITC的结合(b)。右上象限显示的数字代表荧光阳性细胞的百分比。用游离叶酸(d)或叶酸-AMP(e)阻断叶酸-FITC与KB细胞的结合。(B).叶酸-AMP的结构。(C).通过反相HPLC在以下条件下叶酸-AMP的纯化：柱：DeltaPak C18 7.8×300mm，用20mM磷酸盐，pH 7.0预平衡；流速6mL/分钟。在样品加载之后，根据以下顺序人工地改变洗脱溶液：在8分钟内从100％20mM磷酸盐到100％水，到19分钟时10％MeOH/90％水，最后在20分钟时到15％MeOH/90％水。收集22-31分钟叶酸-AMP级分并冻干。
附图41显示了通过叶酸的pRNA的5′标记和叶酸-pRNA对KB细胞的结合。(A)叶酸-AMP被包括在体外转录中与未修饰的NTP一起。包括痕量的[α32P]ATP来表明RNA的位置。当省略叶酸-AMP时在PAGE/尿素凝胶上仅检测对到一个主要条带。当分别利用2mM和4mM叶酸-AMP时，约50％-60％的RNA转入上部位置。(B)[3H]标记的叶酸-RNA与KB细胞的结合。
附图42显示了pRNA嵌合体的序列和结构的草图。(A)Phi29 pRNA序列和二级结构。右手和左手环体是圆圈的，双螺旋结构域是方框的，分子间相互作用结构域是阴影的。曲线指向两个相互作用环体。(B)pRNA单体的3D结构。(C)具有截短的序列的叶酸标记的pRNA(7-106)的构建的示例。(D)携带针对存活蛋白的siRNA的叶酸标记的嵌合pRNA二聚体。(E)通过天然PAGE证明了pRNA二聚体的高效形成。(F)叶酸-pRNA二聚体与KB细胞的特异性结合。在存在(中间列)或缺乏(左侧列)游离叶酸的情况下，细胞与RNA二聚体孵育，所述RNA二聚体由叶酸-pRNA(A-b′)和[3H]-pRNA(B-a′)组成。右侧列是没有叶酸标记的[3H]-二聚体作为阴性对照。
附图43显示了通过转染pRNA/siRNA的基因表达的特异性敲除。双荧光素酶分析，显示了通过短暂转染，分别通过pRNA/siRNA(萤火虫)和pRNA/siRNA(Renilla)的荧光虫荧光素酶(左侧)和renilla荧光素酶(右侧)基因的特异性沉默。
附图44显示了通过重组Dicer，嵌合pRNA/siRNA复合物加工成为22-bp siRNA。具有5′-末端[γ32P]标记的嵌合pRNA/siRNA(泳道a-c)或pRNA载体(泳道e-f)与纯化的重组Dicer分别孵育30分钟和2小时，然后在变性PAGE/尿素凝胶上分离。22nt RNA用作标记物。还检查了二聚RNA(泳道a&d)的加工。
附图45显示了pRNA嵌合体的序列和结构的草图。(A)pRNA载体中携带的嵌合核酶的草图。(B)pRNA/RZ(Sur)序列和二级结构。突出显示的G75是pRNA/RZ(mut1)中的删除。在pRNA/RZ(mut2)中，G75被删除，G58用“A”替换。(C)pRNA/RZ(mut3)的序列。
附图46显示了(A)在pRNA/RZ(Sur)嵌合体的处理之后MCF-7的细胞形态。MCF-7用pRNA/RZ(Sur)、pRNA/RZ(mut3)以高剂量和地剂量转染。转染后一天，使用反向显微镜采集图像。(B).PI/annexinV双染色来从坏死中区分细胞凋亡。用pRNA/RZ(sur)转染乳腺癌MCF-7细胞，使用PI/annexin V双标记和随后的流式细胞计来监视细胞凋亡。进行三个平行试验，显示带有标准误差的细胞凋亡细胞百分比。
附图47显示了嵌合的存活蛋白核酶对乳腺癌细胞的影响。(A).MDA-MB-231和(B).MDA-MB-453细胞用标明数量的RNA转染，在第二天测量细胞生存力。
附图48显示了嵌合的存活蛋白核酶对宫颈癌细胞的影响。人类宫颈癌Hela T4细胞用标明数量的pRNA/RZ(Sur)转染，在第二天通过48分析来测量细胞生存力。
附图49显示了嵌合的存活蛋白核酶对鼻咽癌细胞的影响。人类鼻咽癌KB细胞用标明数量的pRNA/RZ(Sur)转染，在第二天通过MTT分析来测量细胞生存力。
附图50显示了嵌合的存活蛋白核酶对前列腺癌细胞的影响。人类前列腺癌LNCaP细胞用标明数量的pRNA/RZ(Sur)转染，在第二天通过MTT分析来测量细胞生存力。
附图51显示了通过实时PCR揭示的不同pRNA嵌合体处理的样品的mRNA水平的比较。基因表达水平与任意地分配了数值1的未转染样品中发现的基因表达水平比较。柱形代表基因表达相对未转染样品中表达水平的倍数。对于用pRNA/RZ(sur)转染的样品，mRNA水平降低到未转染细胞的水平的16％，pRNA/RRZ(mut3)处理的细胞的24％。
附图52显示了在用嵌合pRNA/RZ(sur)或突变的嵌合核酶转染T47D细胞之后通过Western印迹的存活蛋白蛋白水平的比较。
附图53显示了(A).如在8％天然PAGE中显示的pRNA/RZ(Sur)的二聚体和三聚体形成。(B).通过pRNA/RZ(Sur)的存活蛋白mRNA的部分序列的裂解。底物RNA是用[32P]标记的人类存活蛋白的mRNA的部分序列。(C).可递送的二聚体和三聚复合物。
附图54显示了(A)表4.用于pRNA嵌合体的生产的DNA寡核苷酸；和(b)表5.靶向存活蛋白的嵌合pRNA/核酶的功能分析。
附图55显示了sph1-pRNA嵌合体，其具有3′RNA延伸(即，突出的、未配对的3′末端)和与之退火的互补DNA寡核苷酸tag。
附图56显示了各种sph-1pRNA构建体的pRNA毒性研究的结果的凝胶电泳。
附图57显示了(A)具有与3′末端退火的不同DNA尾部的sph1-pRNA；(B)sph1-pRNA/siRNA(荧光素酶)；(C)sph1-pRNA/siRNA(存活蛋白)；和(D)具有与3′末端退火的不同DNA尾部的sph1-pRNA/siRNA(GFP)的pRNA毒性研究的结果。
附图58显示了通过各种嵌合pRNA/siRNA在果蝇S2细胞中GFP表达的抑制作用。sph1pRNA包括与3′末端的奇序列退火的互补寡核苷酸(DNA tag)。
附图59显示了使用双荧光素酶分析通过各种嵌合pRNA/siRNA的荧光素酶表达的抑制作用。
                        详细说明
噬菌体φ29(phi29)是双链DNA病毒。1987年，发明人之一Dr.Peixuan Guo发现病毒编码的120碱基RNA在噬菌体φ29DNA包装(packaging)中起到关键作用(Guo et al.Science 236：690-694(1987))。这种RNA被称为包装RNA或“pRNA”。它在入口顶点(portal vertex)(DNA进入原衣壳的位置)处与病毒原衣壳结合(Guo et al.，Nucl.AcidsRes.15：7081-7090(1987))，并且在成熟φ29病毒颗粒中不存在。
包装一个基因组DNA需要六个拷贝的pRNA(Trottier et al.，J.Virol.70：55-61(1996)；Trottier et al.，J.Virol.71，487-494(1997)；Guo et al.，Mol.Cell.2，149-155(1998))。当六个裂隙(slot)之一被在5′或3′末端具有突变的一个无活性pRNA占据时，DNA包装被完全阻断(Trottieret al.，J.Virol.70：55-61(1996)；Trottier et al.，J.Virol.71：487-494(1997))。噬菌体φ29 pRNA在DNA易位加工期间与原衣壳相连(Chenet al.，J.Virol.71：3864-3871(1997))。抑制作用数据还表明pRNA在DNA易位中起到重要作用(Trottier et al.，J.Virol.71：487-494(1997))；Trottier et al.J.Virol.70：55-6(1996))。pRNA的Mg2+诱导的构象变化导致它与入口顶点结合(Chen et al.J.Virol.71，495-500(1997))。还报道了pRNA单体和二聚体的三级结构(Zhang et al.，Virology 81：281-93(2001)；Trottier et al.，RNA 6(9)：1257-1266(2000)；Chen et al.J.Biol.Chem.275(23)：17510-17516(2000)；Garver et al.，J.Biol.Chem.275(4)：2817-2824(2000))。
近来，根据来自光亲和性交联(Garver and Guo，RNA 3：1068-79(1997)；Chen and Guo，J Virol 71：495-500(1997))；化学修饰和化学修饰干扰(Mat-Arip et al.，J.Biol Chem 276：32575-84(2001)；Zhang etal.，Virology 281：281-93(2001)；Trottier et al.，RNA 6：1257-66(2000))；互补修饰(Zhang et al.，RNA 1：1041-50(1995)；Zhang et al.，Virology201：77-85(1994)；Zhang et al.，RNA 3：315-22(1997)；Reid et al.，J BiolChem 269：18656-61(1994)；Wichitwechkarn et al.，Mol Biol 223：991-98(1992))；核酸酶探测(Chen and Guo，J Virol 71：495-500(1997)；Reid et al.，J Biol Chem 269：5157-62(1994)；Zhang et al.，Virology211：568-76(1995))；寡聚靶向竞争分析(Trottier and Guo，J Virol71：487-94(1997)；Trottier et al.，J Virol 70：55-61(1996))和低温(cryo)原子力显微镜检查(Mat-Arip et al.，J Biol Chem 276：32575-84(2001)；Trottier et al.，RNA 6：1257-66(2000)；Chen et al.，J Biol Chem275：17510-16(2000))的实验数据，已经构建了pRNA单体的三维结构的计算机模型(Hoeprich and Guo，J.Biol.Chem.277：20794-803(2002))。与连接物晶体结构对接(docking)的pRNA六聚体显示了与涉及pRNA的3D结构的可用的生物化学、遗传学和物理数据的非常令人印象深刻的匹配(Hoeprich and Guo，J Biol Chem 277：20794-803(2002))。
天然全长φ29 pRNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)(Guo et al.，Nucl.Acids Res.15：7081-7090(1987))，以及它的预测的碱基配对的二级结构在附图2(a)中示出(Zhang et al.，RNA 3：315-323(1997)；Zhang et al.，Virology 207：442-451(1995))。以及部分地确认了预测的二级结构(Zhang et al.，RNA 1：1041-1050(1995)；Reid et al.，J.Biol.Chem.269：18656-18661(1994)；Zhang et al.，Virology 201：77-85(1994)；Chen et al.，J.Virol.71：495-500(1997))。
如附图2(b)所示，pRNA单体含有两个功能结构域。一个结构域是原衣壳结合结构域。这个结构域包括“分子间相互作用结构域”(参见，例如，附图45)，其促进pRNA分子的相互作用(例如，二聚化、三聚化)。这个结构域包括右手环体和左手环体，其在pRNA之间的相互作用方面是重要的，如以下更详细描述的。另一个结构域是DNA易位结构域，在此也称为5′/3′双链的(配对的)螺旋结构域。原衣壳结合结构域位于碱基23-97处pRNA分子的中心部分(Garver et al.，RNA3：1068-79(1997)；Chen et al.，J Biol Chem 275：17510-16(2000))，而DNA易位结构域位于5′/3′配对的末端。5′和3′末端已经发现是靠近的，已经构建了几种环状排列的pRNA(Zhang et al.，RNA 3：315-22(1997)；Zhang et al.，Virology 207：442-51(1995)；Guo，Prog in Nucl Acid Res &Mole Biol 72：415-72(2002))。这两个结构域是紧密的和独立折叠的，暗示外源RNA可以连接到pRNA的末端而不影响pRNA折叠，以及phi29pRNA可以用作载体来护送(escort)和伴护(chaperone)小的治疗性RNA分子。实际上，DNA易位结构域的除去不会改变pRNA的分子间相互作用的性质，即，在残基#23之前或残基#97之后的核苷酸的替换或插入不影响二聚体、三聚体和六聚体的形成(Hoeprich et al.，Gene Therapy，10(15)：1258-1267(2003)；Chen et al.，RNA，5：805-818(1999)；以及Shu et al.，J Nanosci and Nanotech(JNN)，4：295-302(2003))。我们确认了，外源RNA可以连接到pRNA的3′或5′末端而不影响pRNA折叠；这种外源RNA分子也独立地折叠(Hoeprich etal.，Gene Therapy，10(15)：1258-1267(2003)；Shu et al.，J Nanosci andNanotech(JNN)，4：295-302(2003)；Guo，J.Nanosci Nanothechnol，2005，5(12)：1964-1982)。
来自噬菌体SF5′、B103、φ29、PZA、M2、NF和GA1的pRNA的系统发生分析(Chen et al.，RNA 5：805-818(1999))显示了非常低的序列同一性和少数的保守碱基，然而pRNA的家族看来具有显著的相似性和稳定的预测的二级结构(附图3)。来自枯草杆菌(Bacillus subtilis)的噬菌体SF5′(SEQ ID NO：11和28)、B103(SEQ ID NO：12和29)、φ29/PZA(SEQ ID NO：13和30)、M2/NF(SEQ ID NO：14和31)、GA1(SEQ ID NO：15和32)的pRNA(Chen et al.，RNA 5：805-818(1999)；以及aptRNA(SEQ ID NO：16和33)都被预测具有二级结构，其展现了如附图2所示与φ29 pRNA基本上相同的结构特征(Chen et al.，RNA5：805-818(1999))。所有的在茎结构的左边末端具有天然的5′和3′末端(如附图3所示)，并含有位于相同的相对位置处的相同的结构特征。
这些噬菌体的pRNA，它们享有单一的稳定二级结构，提供了本发明的pRNA嵌合体的框架。
RNA分子中的二级结构由核糖核苷酸之间的碱基配对形成。RNA碱基对通常包括G-C、A-T和U-G。二级结构的预测优选地根据Zuker和Jaeger的方法进行，例如通过使用已知的由David H.Mathews编写的商品名称为RNASTRUCTURE 3.6的程序(Mathews et al.，J.Mol.Biol.288：911-940(1999)；还参见Zuker，Science 244：48-52(1989)；Jaegeret al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：7706-7710(1989)；Jaeger et al.，Meth.Enzymol.183：281-306(1990))。这个程序可在互联网上在Rochester大学的Douglas Turner实验室的主页rna.chem.rochester.edu/RNAstructure.html公众地获得，在MS Windows 95、98、ME、2000和NT4上运行。该程序也可以在互联网上Michael Zuker在RensselaerPolytechnic Institute的主页(bioinfo.math.rpi.edu/～zukerm/home.html)公众地获得；他的主页提供了在线折叠和在Silicon Graphics、Sun或DECAlpha工作站上编译的算法的版本。选择具有最低能量的结构(即，最佳结构)。
RNA的二级结构的特征在于茎、环体和膨隆。“茎”是两个长度的碱基配对的核糖核苷酸的双链区段。茎区段含有至少2个碱基配对，大小上仅由RNA分子的长度限制。“环体”是单链的区段，其一般包括至少3个核糖核苷酸，并且在大小上也仅由RNA分子的长度限制。在“茎环”中，环体的5′和3′末端与碱基配对的茎区段的末端重合。在“膨隆环”中，环体沿着茎区段的长度伸出。膨隆环体的5′和3′末端一般不是碱基配对的，虽然它们可能潜在地是配对的(参见，例如，φ29 pRNA结构中膨隆环体的G40和C48；附图2)。“膨隆”是沿着茎区段的长度(或在茎区段之间)存在的约1到约6个核糖核苷酸的未配对的单链区段。注意到，在大的“膨隆”和小的“膨隆环体”之间没有明显的界限。在此，当使用术语“膨隆”时，它还包括小的“膨隆环体”(即，低于约7个核糖核苷酸的膨隆环体)。
RNA分子的二级结构由沿着它的长度上碱基配对选择的性质和位置决定。RNA二级结构是简并的；也就是说，不同的初级核糖核苷酸序列可以产生相同的碱基配对结构和因而相同的二级结构。在某种程度上，它类似于多种氨基酸序列可以产生相同的二级结构如α-螺旋的方式。
单个二级结构以可预测的和充分了解的方式由许多不同的初级序列指定。例如，一般可以添加、除去或取代单个或成对核苷酸而不改变RNA分子内的总体碱基配对相互作用并且不影响它的生物学功能。如果沿着分子的双链杂交长度(length)上除去、添加或取代一个或几个碱基对，或如果在单链环体区域中除去、添加或取代一个或多个核苷酸，这是特别真实的。例如，虽然GC碱基对和AT碱基对在它们的热力学稳定性方面稍微不同，一般可以在双链长度内的位点用一个取代另一个，而不改变RNA分子的二级结构。由于它们的增加的稳定性，在茎区域中GC碱基对是优选的。作为核苷酸的添加、删除或修饰的结果的二级结构的改变可以通过应用如上所述Zuker和Jaeger的二级结构预测算法来容易地评定。pRNA的5′/3′双链螺旋区域可以容纳初级序列中的相当的变异而没有二级结构中的明显改变。
本发明的pRNA嵌合体作为携带和递送一种或多种生物学活性部分、可检测标记等等到目标分子、细胞或位置的媒介物(vehicle)是有用的。生物学活性部分、可检测标记等等在此被认为是pRNA嵌合体的“异源”组件(也就是说，它们不存在于天然存在的pRNA中)，在此有时称为由所述pRNA嵌合体携带的“货物(cargo)”。如pRNA本身一样，是RNA的本发明的pRNA嵌合体的异源组件在此有时被称为“女儿(daughter)”RNA。所述货物组件可以是寡核苷酸、多核苷酸、肽、多肽、碳水化合物、脂质、激素、标记试剂、小的有机分子等等，没有限制，用货物组件衍化的(derivatized)、结合到货物组件的、或含有货物组件或与货物组件相连的任何pRNA被认为是本发明的“pRNA嵌合体”或“嵌合pRNA”。如以下更详细地描述的，嵌合pRNA可以有益地被看作“建筑块”，其被定制、选择、混合和匹配以产生多聚的、多价pRNA复合物，为了期望的应用或目的特制的。
本发明的pRNA嵌合体可以采用两种一般形式的任一种。在一个实施方式中，所述pRNA嵌合体基本上由具有附图3例示(以及在附图4中示意地描绘，如以下详述的)的二级结构的pRNA区域组成，被异源间隔区中断(即，侧翼)，所述异源间隔区含有生物学活性部分，优选的RNA，如用于靶向细胞表面受体的RNA适体或核酶。含有附着于天然存在的5′和3′末端的异源间隔区的pRNA嵌合体的这个实施方式，它的5′和3′末端位于非天然位置，当与天然存在的pRNA相比时，表现RNA序列的“环状排列”，如以下更详细描述的。
pRNA嵌合体的pRNA区域的二级结构是常见的二级结构，其有来自噬菌体φ29、SF5′、B103、PZA、M2、NF和GA1的pRNA的特征。间隔区被称为“异源的”，因为它的核苷酸序列的所有或一部分被工程化，或它获自噬菌体以外的有机体。对于本发明来说，异源间隔区的存在使得所述构建体是“嵌合的”。由于货物RNA的两个末端都与pRNA连接，预计该连接保护了敏感的货物，例如核酶，免于降解，并且帮助生物学活性部分适当地折叠。
值得注意地，pRNA嵌合体进行它保护和携带生物学活性部分的预定功能的能力不取决于pRNA区域的初级核苷酸序列(一级结构)，而取决于二级结构(碱基配对相互作用)，所述二级结构是pRNA区域作为其初级核糖核苷酸序列的结果呈现的。pRNA嵌合体的“pRNA区域”被这样称呼，是因为它具有二级结构，虽然不一定是RNA序列、但是是天然噬菌体pRNA分子的特征。因而，除非另作说明，在此使用的术语“pRNA区域”包括天然存在的(天然的)pRNA序列、非天然存在的(非天然的)序列和其组合，只要它们产生具有在此描述的天然存在的(天然的)噬菌体pRNA的二级结构特征。换言之，术语“pRNA区域”不意图仅限于那些对于pRNA是天然的特定核苷酸序列。因而pRNA区域可以含有任何核苷酸序列，其产生附图4所示的二级结构。折叠成上述二级结构的核苷酸序列包括天然存在的序列、通过修饰天然存在的pRNA序列衍生的那些序列、和从头设计的那些，以及它们的组合。通过对核苷酸序列应用应用二级结构算法，例如如上所述的RNASTRUCTURE，本领域的技术人员可以容易地确定核苷酸序列是否将折叠成附图4所示的和在此描述的二级结构。
当折叠时产生本发明的pRNA嵌合体的pRNA区域的二级结构的核苷酸序列的实例在附图3中示出。它们包括来自噬菌体SF5′(SEQ IDNO：11和28)、B103(SEQ ID NO：12和29)、φ29/PZA(SEQ ID NO：13和30)、M2/NF(SEQ ID NO：14和31)、GA1(SEQ ID NO：15和32)以及aptRNA(SEQ ID NO：16和33)的pRNA序列。
在环状排列的(permitted)pRNA嵌合体的实施例中，其中pRNA区域包括或来自天然存在的pRNA，在被认为是pRNA序列的“天然”5′和3′末端的地方，pRNA嵌合体的间隔区共价连接到pRNA区域，从而连接pRNA区域的天然末端。当与天然噬菌体pRNA相比较时，pRNA嵌合体的pRNA区域任选地是截短的；在这些实施方式中，以及作为结果，pRNA区域的“天然”5′和3′末端仅仅是指终端的或包含截短的天然pRNA的实际末端的核苷酸。在pRNA区域中形成开口来线性化产生的pRNA嵌合体，产生以下详述的pRNA的“环状排列”。尽管如此要理解的是，术语“环状排列的pRNA区域”不限于已经环状排列的天然存在的pRNA，而意图是具有RNA的更广泛含义，所述RNA具有如附图4(c)所示的pRNA样二级结构，包括形成pRNA嵌合体的5′和3′末端的pRNA区域中的开口。
本发明的pRNA嵌合体的实例是从噬菌体SF5′(SEQ ID NO：11和28)、B103(SEQ ID NO：12和29)、φ29/PZA(SEQ ID NO：13和30)、M2/NF(SEQ ID NO：14和31)、GA1(SEQ ID NO：15和32)以及aptRNA(SEQ ID NO：16和33)通过将天然5′和3′末端连接到间隔区并在pRNA区域中的其他地方引入开口来形成的那些，如在此所描述的。本发明的pRNA嵌合体的另一个实例是：
5′-GUUGAUNjGUCAAUCAUGGCAA-间隔区-UUGUCAUGUGUAUGUUGGGGAUUANjCUGAUUGAGUUCAGCCCACAUAC-3′(分别为SEQ IDNOS：45和7)
其中N代表任何核苷酸，没有限制，j是约4到约8之间的整数。优选的，j是4或5。间隔区由Nm-B-Nn表示，其中Nn和Nm是核苷酸串列，其任选地被包括在所述间隔区内，B包括生物学活性部分。优选的，B是包括生物学活性RNA的核糖核苷酸序列。m和n都可以独立地是零或任何整数。优选的，m和n独立地是至少约3，更优选的至少约5，以及最优选的至少约10。进一步的，n和m独立地是优选的最多约300，更优选的最多约50，以及最优选的最多约30。
进一步的，由于pRNA嵌合体的pRNA区域由它的二级结构确定，pRNA嵌合体的再其他的实例可以通过“混合和匹配”折叠成特定二级结构特征(膨隆、环体、茎-环，等等)的、来自例如SEQ ID NO：1、2、7、11、12、14、15和16的核苷酸片段来容易地产生，只要产生的核苷酸序列折叠成如附图4所示的总体二级结构。例如，来自噬菌体SF5′pRNA(SEQ ID NO：11)的编码膨隆环体22的核苷酸可以被φ29 pRNA(SEQ ID NO：1)中编码膨隆环体22的核苷酸代替，来产生在此描述的pRNA区域。同样地，许多人工序列可以代入SEQ ID NO：1、2、7、11、12、14、15和16来替换折叠成一种或多种结构特征(或其部分)的核苷酸序列，以形成在此描述的pRNA区域。参见，例如，aptRNA(附图3(f))其按照这样的方式衍生自φ29 pRNA。决定性原则是，pRNA区域的总体二级结构是噬菌体pRNA共有的二级结构，如附图4中所示意性描绘的。
重要地，环状排列的pRNA嵌合体实施方式不是环状分子；更确切地，由于pRNA区域的环状排列它被线性化(Zhang et al.，RNA 3：315-323(1997)；Zhang et al.，Virology 207：442-451(1995))。简要地，在pRNA区域中在任何指定的位点提供了开口(即，裂解点或中断点)来形成RNA嵌合体的实际的5′和3′末端。相对于天然存在的线性pRNA，这些5′和3′末端处于“非天然”位置。
附图5(a)显示了如何从核酶和pRNA区域形成本发明的pRNA嵌合体。pRNA的5′和3′末端可以被工程化到环状排列的pRNA嵌合体上任何期望的位点中。附图5(b)显示了示范性的环状排列的RNA分子，显示了环状开口的各种位置。
附图4描绘了各种结构特征，其表征了本发明的环状排列的pRNA嵌合体。如附图4(a)中所示，线性分子包括pRNA区域1，以及对于环状排列的pRNA嵌合体来说，间隔区2。间隔区2含有生物学活性部分3，在核酶的情况下，侧翼是核糖核苷酸串列4。pRNA区域1是分支的；它包括第一pRNA段5，具有3′末端6和“天然的”5′末端7，第二pRNA片段8具有“天然的”3′末端9和5′末端10。末端6和10是pRNA嵌合体的实际终末端。开口11使得分子是线性的，通过末端6和10的重新定位可以位于pRNA区域1中的任何地方。
在附图4(b)中详细显示了间隔区2。核酶3由侧翼是目标结合序列16的催化结构域15组成。
在附图4(c)中详细显示了pRNA区域1。总体上，pRNA区域1特征在于茎-环二级结构，其中头部环体、环体24是相对小的，茎中的碱基配对(基本上茎区段20、21和23)被环体24的两侧的结构中断。膨隆环体22，“右手环体”位于环体24的5′。位于环体24的3′的是茎-环结构，其含有膨隆25、茎26和环体27，“左手环体”。
茎区段20长度可以是任何数量的核糖核苷酸，可以含有没有限制的数量的膨隆，只要它仍然能够碱基配对。优选的，茎区段20含有至少约4个、更优选的至少约10个碱基对；进一步的，优选的，它含有最多约50个、更优选的最多约40个碱基对。优选的，茎区段20含有约0到约8个膨隆；更优选的，它含有约0到约4个膨隆。
注意到，在本发明的pRNA嵌合体的非环状排列的实施方式中，以下更详细地描述的，茎区段20可以被双链siRNA替换。在嵌合pRNA的这个实施方式中，嵌合pRNA携带的“货物”采取茎区段20本身的形式，其构成生物学活性siRNA。如实施例11和12中所示，有证据表明当递送至细胞后，siRNA从pRNA分子上裂解，对于沉默目标基因是有效的。
在非环状排列的嵌合pRNA的其他实施方式中，这些实施方式由于不是环状排列的而展现了在它们“天然”位置处或附近的5′和3′末端，茎区段20可以是在所述5′或3′末端之一或两处用生物学活性部分、可检测标记、等等，作为它的异源组件“货物”衍生的。例如，茎区段20中存在的pRNA的5′末端可以用叶酸(来便于靶向)或用荧光标记(来便于检测)衍生的。对于可以在形成本发明的pRNA嵌合体中采用的各种茎区段20的实例参见实施例11和附图23。
茎区段21优选的含有5-13个碱基对和0-2个膨隆。
膨隆环体22优选的含有5-12个碱基。
茎区段23优选的含有3-12个碱基对和0-2个膨隆。
环体24优选的含有3-8个碱基。
膨隆25优选的含有0-5个碱基。
茎26优选的含有4-8个碱基对和0-2个膨隆。
环体27优选的含有3-10个碱基。
RNA分子内的三级相互作用可以来自RNA分子的区域的非局部相互作用，所述区域在初级序列中相互不靠近。虽然天然的噬菌体pRNA看起来展现了膨隆环体22(“右手”环体)和环体27(“左手”环体)之间的三级相互作用(Chen et al.，RNA 5：805-818(1999)；Guo et al，Mol.Cell.2：149-155(1998))，要理解的是，本发明的pRNA嵌合体不局限于展现任何特别的三级相互作用的RNA分子。另一方面，要理解的是这些分子内的三级相互作用可能是有用的。例如，在本发明提供的多聚pRNA复合物中，各种单体的右手和左手环体之间的相互作用可能通过在期望的互补性中工程化来控制，有益地产生专门的二聚体、三聚体和六聚体，用于治疗应用；如参见实施例7。
在一个实施方式中，本发明的pRNA嵌合体含有天然的SF5′pRNA(附图3(a))、B103 pRNA(附图3(b))、φ29/PZA pRNA(附图3(c))、M2/NF pRNA(附图3(d))、GA1 pRNA(附图3(e))、或aptRNA(附图3(f))，优选的天然的φ29 pRNA中存在的至少8个、更优选的至少15个、最优选的至少30个连续核糖核苷酸。最优选的，pRNA嵌合体的pRNA区域含有至少φ29 pRNA序列，其在φ29pRNA序列中的核糖核苷酸23、优选的在核糖核苷酸20处开始，在核糖核苷酸95、优选的核糖核苷酸97处结束(附图2)。此外或作为选择，pRNA嵌合体的pRNA区域的核苷酸序列优选的至少60％相同于、更优选的80％相同于、在更优选的90％相同于、最优选的95％相同于相应的天然SF5′pRNA(附图3(a))、B103 pRNA(附图3(b))、φ29/PZA pRNA(附图3(c))、M2/NF pRNA(附图3(d))、GA1 pRNA(附图3(e))或aptRNA嵌合体(附图3(f))、最优选的φ29 pRNA(特别是碱基20-97)的核苷酸序列。
同一性百分比通过对准(aligning)两个多核苷酸来优化沿它们序列长度上相同的核苷酸的数目；在进行比对(alignment)时在序列之一或两个中的缺口是允许的，以优化共有的核苷酸的数目，尽管如此每个序列中的核苷酸必需保持它们正确的顺序。例如，使用如Tatusova等描述的BLAST 2检索算法的Blastn程序容易地比较两个核苷酸序列(FEMSMicrobiol Lett 1999，174：247-250)。优选的，对所有BLAST 2检索参数使用默认值，包括匹配的奖赏＝1，错配的罚分＝-2，开放缺口罚分＝5，延伸缺口罚分＝2，缺口x_dropoff＝50、预期＝10，字大小＝11，过滤器开(filter on)。
在pRNA嵌合体的环状排列的实施方式中，生物学活性部分和pRNA区域之间的共价键可以是直接的或间接的，但优选的是间接的。在间接的连接中，间隔区在生物学活性部分的一端或两端包括其他核糖核苷酸串列。这些核糖核苷酸串列，如果存在，优选地含有至少约3个核糖核苷酸；优选地含有最多约300、更优选的最多约30个核糖核苷酸。组合地，所述串列可以含有任何期望的核糖核苷酸，然而优选的是选择核糖核苷酸组成以防止在所述生物学部分两侧的核糖核苷酸串列互相之间或与pRNA嵌合体的其他部分碱基配对。
示范性的生物学活性部分包括，无限制地，DNA、RNA、DNA或RNA类似物，包括核酶、siRNA、RNA适体或反义RNA、肽核酸(PNA)、肽、蛋白例如抗体、多糖、脂质、病毒、质粒、辅助因子、或它们的组合。生物学活性部分可以无限制地选择，包括具有期望的活性或特征，如结合活性、酶活性等等的那些。优选地，生物学活性部分的生物学活性是酶活性或结合活性或两者，例如，生物学活性部分可以起到核酶或其他催化部分的作用，或编码它们。由于siRNA是双链RNA，有效的siRNA部分可以包括任何序列来替换5′/3′配对的螺旋区域，而不是位于环状排列的pRNA嵌合体的间隔区中，如以下更详细描述的。
生物学活性部分优选的是多核苷酸。优选的生物学活性多核苷酸是多核糖核苷酸，更优选的，所述生物学活性多核苷酸是核酶，例如锤头核酶或发夹核酶。反义RNA和其他生物学活性RNA也是优选的。
要理解的是，在此使用的术语“核苷酸”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”包括DNA、RNA或其组合，除非另有陈述。进一步的，术语DNA和RNA应当理解为不仅包括天然存在的核酸，还包括含有核苷酸类似物或修饰的核苷酸的序列，例如被化学地或酶学地修饰的那些，例如DNA硫代磷酯(phosphorothioate)、RNA硫代磷酯和2′-O-甲基-核糖核苷酸。
在本发明的pRNA嵌合体的优选的实施方式中，一种或多种核苷酸衍生物，例如2′-NH2-2′-脱氧CTP、2′-CH3-2′-脱氧CTP、2′-F-2′脱氧CTP、2′-F-2′脱氧UTP和spiegelmers(L-核苷酸适体)在合成期间被掺入pRNA中，来产生对RNase消化有抗性的稳定的RNA转录产物。稳定化修饰优选的在核糖核苷酸的2′位置或在其他位置进行。在大多数情况下，稳定核苷酸衍生物的掺入预计不会显著地影响pRNA的二聚化或三聚化以形成多聚的复合物，还预计的是不会不利地影响“货物”部分的活性或功能。由于不涉及pRNA本身的生物学功能(除了它形成多聚体复合物的能力之外)，包括非天然的核苷酸衍生物是适合的，特别是对于选自随机库(例如，使用SELEX)的受体结合适体。如果RNase抗性核苷酸衍生物掺入到拴系到pRNA上的治疗性RNA中碰巧影响了货物RNA的生物学活性，例如催化功能，例如，货物RNA可以用常规核苷酸合成并连接到pRNA分子。
核酶一般地特征在于：
                    臂1-活性酶中心-臂2
其中臂1和臂2是与要由该核酶裂解的目标底物互补的序列，活性酶中心是裂解目标RNA的催化中心。核酶的“臂”一般含有至少约7个核苷酸，优选的至少约12个核苷酸；一般含有最多约100个核苷酸，优选的最多约30个核苷酸。臂的核苷酸序列可以被工程化以同任何期望的目标核酸的核苷酸序列杂交。
有益地，在本发明的环状排列的pRNA嵌合体中包括生物学活性多核苷酸，例如核酶，保护了所述核酶的末端，从而使它对核酸外切酶降解有抗性。此外，pRNA的二级结构是紧密的和非常稳定的。由φ29pRNA的核苷酸30-91划定的pRNA结构域是特别稳定的。
pRNA的紧密性和稳定性容许pRNA区域和核酶独立地折叠。方便了插入的RNA的适当折叠，从而保持它的生物学活性。也保持了载体pRNA区域的稳定结构。在设计递送核酶的分子中的主要障碍，即，核酶和载体区域作为它们之间的相互作用的结果的错误折叠，因而通过利用非常稳定的pRNA分子作为载体被克服了。在环状排列的pRNA嵌合体中核酶活性的保持是特别有意义的，因为这意味着pRNA嵌合体的新的5′和3′末端可以被安置，从而将它们“埋”在折叠的pRNA结构中，从而进一步包括pRNA嵌合体免于降解。这些特征暗示了本发明的pRNA嵌合体作为核酶递送工具在医学和兽医学应用中的用途的巨大前景。
如以下的实施例所示，构建环状排列的pRNA而不影响pRNA折叠。此外，pRNA 5′/3′末端与可变序列的连接不影响它的折叠和功能。这些独特的特征使得pRNA成为携带治疗RNA的理想载体，它帮助防止两个常见的难题——细胞中的核酸外切酶降解和错误折叠。
如上所述，在一个实施方式中，本发明的pRNA嵌合体采用噬菌体pRNA的“环状排列”。“环状排列的”RNA分子(cpRNA)是线性RNA分子，其中天然的5′和3′末端是共价连接的。连接可以是直接的，或可以是通过使用间隔区间接的。由于cpRNA分子是线性的，新的非天然5′和3′末端通过在分子中在不同的位置形成开口(即，pRNA序列中的不连续性)来创建。作为在噬菌体pRNA框架中在指定的位点处非天然开口的结果，本发明的pRNA嵌合体是线性的，所述开口环状排列了噬菌体框架，并形成pRNA嵌合体的实际的5′和3′末端。如已经指出的，非天然开口可以处在pRNA区域中的任何期望的位置。在例如φ29pRNA中选择的位置的实例可以在Zhang et al.，RNA 3：315-323(1997)和Zhang et al.，Virology 207：442-451(1995)中找到。还参见Garver et al.，J.Biol.Chem.275：2817-2824(2000)；Chen et al.，J.Virology 71：495-500(1997)；Trottier et al.，RNA 6：1257-1266(2000)；和Zhang et al.，Virology281：281-293(2001)。
本发明的pRNA嵌合体可以使用标准的实验室方案化学地或酶学地合成。pRNA区域优选的从编码它的DNA模板转录，然而如果希望，它可以化学地合成。做为选择，嵌合pRNA可以从化学合成的RNA片段(模块组件)组装(参见，例如Fang et al.，Biochemistry，2005，44(26)：9348-9358)。如果化学地合成，pRNA区域任选地含有非天然核苷酸(例如，衍生的或取代的核苷酸)和/或非天然键，其类似于表征天然存在的核酸的磷酸二酯键。包括非天然核苷酸或非天然键可以提高pRNA嵌合体的稳定性并使它对酶降解更有抗性。
优选的，pRNA区域作为单个RNA分子被转录或合成。在用于环状排列的pRNA的创建的方法的一个实施方式中，间隔区被化学地或酶学地连接到pRNA区域的“天然”末端来形成环状嵌合分子。然后在预定的位点裂解pRNA来形成线性的、环状排列的pRNA嵌合体。
当所述间隔区是RNA时，用于环状排列的pRNA的创建的方法另一个实施方式包括从编码完整嵌合分子的单个DNA模板转录整个pRNA嵌合体。在所述方法的另一个实施方式中，通过从它自己的模板转录或通过化学合成单独地产生RNA间隔区，之后将其连接到pRNA区域。
除了具有位于间隔区中的″货物″部分(例如，RNA适体或核酶)的、环状排列的pRNA嵌合体之外，本发明还提供了pRNA嵌合体的另一种实施方式，其中“货物”部分被掺入或连接到pRNA结构中的其他地方。本发明的这个实施方式，当构成像环状排列的实施方式一样的线性pRNA时，相对于天然的phi29 pRNA不是环状排列的。两种实施方式(即，环状排列的和非环状排列的pRNA)被称为“嵌合pRNA”或“pRNA嵌合体”，只要它们含有异源“货物”，如上文更详细地描述的。
非环状排列的pRNA嵌合体的一个实例是一种pRNA，其包括siRNA代替pRNA的5′/3′双链配对的螺旋区域(几种实例参见附图23和实施例11中伴随的文字)在残基#23之前或残基#97之后的核苷酸的替换或插入已经显示了不影响二聚体的形成，只要链是配对的(Chen etal.，RNA 1999；5：805-818)。siRNA是短的(一般19-25个核苷酸，但可以更短或更长)，因而理想地适合掺入pRNA来形成5′/3′配对的螺旋区域。要注意的是，含有siRNA作为它的5′/3′配对的螺旋区域的pRNA嵌合体优选的不是环状排列的，但它可以是；产生的pRNA的环状排列不消除siRNA的活性(参见实施例11)并因而是可选的。含有siRNA作为它的5′/3′配对的螺旋区域的pRNA适当地折叠，并可以用于与在此描述的其他pRNA嵌合体组合来形成多价二聚体、三聚体或六聚体。
当用siRNA替换pRNA的5′/3′配对的螺旋形区域时，对于siRNA链(strand)可以附着的pRNA序列中的位置已经观察到相当的耐受性。已经显示的是，例如，在核苷酸23之前的5′末端、以及在核苷酸97之后的3′末端的核苷酸的添加或删除不影响分子间相互作用(原衣壳结合)结构域的正确折叠(Zhang et al.，RNA 1995；1：1041-1050)。例如，使用附着在位置29和91的互补siRNA来形成配对的螺旋区域，用附着在位置21和99的siRNA来形成配对的螺旋区域，实现了基因沉默(参见实施例11)。在掺入siRNA作为“茎”(例如，附图4c中的茎20)来形成pRNA嵌合体中重要的是，所述siRNA不侵入分子间相互作用区域(含有右手和左手环体)使得它干扰右手和左手环体在二聚体、三聚体和六聚体的形成中的相互作用。
非环状排列的pRNA的另一个实例是在它的“天然的”5′和/或3′末端之处或附近用生物学活性部分、可检测标记或其他感兴趣的部分衍生的(derivatized)pRNA。附着在pRNA的5′或3′末端之处或附近的优选的部分是靶向部分，例如抗体或受体配体。例如，叶酸分子的共价键(参见实施例13)将修饰的pRNA靶向在它们的表面具有叶酸受体的细胞。要注意的是在另一个方面，本发明包括将叶酸结合到RNA、优选的pRNA的方法，如在实施例13中说明的。
可以附着到pRNA的5′和/或3′末端之处或附近的另一种部分是可检测标记。pRNA或pRNA嵌合体(例如，包括siRNA作为配对的螺旋区域的pRNA)的一个或多个5′或3′末端也可以被衍生来包括可检测标记，例如荧光标记、放射性标记或顺磁性标记。标记多聚体的pRNA复合物的至少一个组件容许该复合物被检测。同样地，治疗试剂，例如放射性核素，可以连接在pRNA、pRNA嵌合体或修饰的pRNA的5′或3′末端之处或附近，一旦多聚的复合物结合到靶细胞和/或被靶细胞内在化，来实现受试者的治疗。
要理解的是，pRNA在它的5′或3′末端的衍生包括将货物部分连接到当前构成pRNA的5′或3′末端的无论哪个核苷酸。换句话说，对于天然存在的pRNA，pRNA可以是截短的(在5′或3′末端)，或者与天然存在的pRNA相比较时它可以具有添加到它的5′和/或3′末端的一个或多个额外的核苷酸。无论如何，本发明预期的是线性pRNA的第一个和最后一个核苷酸的衍生化；即，特定pRNA分子的5′和/或3′核苷酸。此外，要理解的是，异源组件可以在pRNA的5′或3′末端处或附近共价地或非共价地连接到所述pRNA。优选的，所述连接是共价的，除了互补寡核苷酸构成异源组件的情况，这在这里的其他地方论述了。
在特别优选的实施方式中，pRNA的5′或3′末端是突出的末端；也就是说，它是未配对的并且延伸出配对的螺旋区域达一个或多个碱基，所述异源组件与所述突出的末端连接。优选的，所述异源组件与5′突出末端连接。
在另一个实施方式中，当pRNA被工程化以包括反义RNA作为5′或3′延伸、优选的作为3′延伸时，所述突出末端本身构成异源组件。
进一步的，如果希望，预期的是5′/3′配对的螺旋区域上的其他核苷酸位置可以用货物部分衍生，而不会不利地影响二聚化、三聚化或货物部分的活性。
在本发明的pRNA嵌合体的又一个实施方式中，所述异源组件包括与所述pRNA的5′或3′末端退火的寡核苷酸。所述寡核苷酸和所述pRNA嵌合体之间的相互作用优选的是非共价的；也就是说，两个分子经由碱基配对相互作用(例如，杂交)缔合。优选的，所述寡核苷酸是DNA寡核苷酸，然而它可以是RNA寡核苷酸。在特别优选的实施方式中，所述pRNA具有5′或3′突出末端，所述寡核苷酸与所述突出末端，优选的所述3′突出末端退火。任选的，所述退火的寡核苷酸包括可检测标记，例如生物素或放射性标记。所述寡核苷酸长度优选的是至少5个核苷酸，更优选的长度至少10个核苷酸，最优选的长度至少15个核苷酸。所述寡核苷酸长度优选的是最多70个核苷酸，更优选的长度最多50个核苷酸，更优选的长度最多40个核苷酸。
最后，要注意的是，单个pRNA嵌合体可以包括超过一种异源组件。例如，pRNA嵌合体可以包括结合到它的5′末端的叶酸和结合到它的3′末端的可检测标记。或者，例如，环状排列的pRNA嵌合体可以包括间隔区中的RNA适体，以及治疗性siRNA作为它的配对的螺旋区域。
还包括在本发明中的是DNA分子，其包括编码本发明的pRNA嵌合体的核苷酸序列。在本发明的这个方面，编码的嵌合体的间隔区必需是RNA。所述DNA分子可以是线性或环形的。它可以是双链的或单链的；如果是单链的，它的互补物也被包括在术语“DNA分子”之内。
本发明的pRNA嵌合体可以以许多不同的方式导入宿主细胞。例如，pRNA嵌合体可以在细胞外合成、与细胞表面接触，从而组分RNA适体或其他靶向试剂与细胞表面的成分结合，并经由受体介导的内吞作用、膜扩散、通过孔洞转运等等被细胞接受。做为选择，它可以作为病毒递送试剂(RNA病毒或DNA病毒)携带的遗传货物的部分被递送。它还可以作为质粒，即，作为编码期望的pRNA嵌合体的DNA分子来递送。还可能的是直接将所述pRNA嵌合体转染入宿主细胞。例如，以商品名称TRANSMESSENGER TRANSFECTION REAGENT(可从Qiagen获得)可获得的产品，一种与特定的RNA浓缩增强物和优化的缓冲液一同使用的基于脂质的制剂，可以用于将所述pRNA嵌合体转染入真核细胞。
用于将pRNA导入细胞的DNA分子优选地含有调节元件，从而所述pRNA嵌合体被可操作地编码。当DNA分子含有调节元件时，所述调节元件容许pRNA嵌合体通过细胞内所述DNA分子的转录来产生，pRNA嵌合体是由DNA分子“可操作地编码”的。这种调节元件至少包括启动子。任选的，DNA分子包括促进RNA嵌合体转录的其他调节基序，例如，但不限于增强子。DNA分子可以使用阴离子或阳离子脂质介导的递送或其他标准的转染机制，包括电穿孔、吸附、粒子轰击或显微注射、或通过使用病毒或逆转录病毒载体来导入宿主细胞。
任选的，DNA分子可以含有容许它整合入细胞的基因组的一种或多种特征。例如，它可以以转座子、反转座子、或整合载体的形式递送；做为选择，它可以含有同源于基因组序列、容许它经由同源重组整合的序列。另一方面，DNA分子可以被设计以在细胞内作为非基因组DNA，例如，作为质粒、粘粒、游离体等等存在。
编码完整嵌合RNA分子的DNA模板的转录可以在体外或在细胞内发生。细胞可以在细胞培养物中，或在有机体(体内)如植物或动物中，特别是人类中，或在从有机体外植的细胞中(体外)。
有益地，本发明的pRNA嵌合体可以用于递送生物学活性RNA分子到细胞内的目标。具有可操作地编码环状排列的pRNA区域和间隔区的核苷酸序列的DNA分子被导入细胞。间隔区包括生物学活性RNA，DNA的转录产生所述生物学活性RNA。由此递送的生物学活性分子优选的是核酶，目标优选的是与基因相关的病毒或mRNA，所述基因的表达希望降低。附图6(a)显示了目标RNA被pRNA核酶嵌合体裂解的提议的机制。靶向HBV polyA信号的核酶与phi29 pRNA的天然5′/3′末端连接(附图6(b))。可以靶向细胞内DNA或RNA的反义RNA作为生物学活性分子也是优选的。
φ29 pRNA具有很强的动力来形成二聚体(附图7)，二聚体是六聚体的建筑块(Hoeprich and Guo，J Biol Chem 277：20794-20803(2001)；Mat-Arip et al.，J Biol Chem 276：32575-32584(2001)；Trottier et al.，RNA6：1257-1266(2000)；Chen et al.，RNA 5：805-818(1999)；Guo et al.，MolCell 2：149-155(1998)；Zhang et al.，Mol Cell 2：141-147(1998)；Hendrix，Cell 94：147-150(1998))。单体或二聚体的形成可以通过操作和控制两个相互作用环体的序列来控制(Hoeprich and Guo.，J Biol Chem277：20794-20803(2001)；Mat-Arip et al.，J Biol Chem 276：32575-32584(2001)；Trottier et al.，RNA 6：1257-1266(2000))；Chen et al.，RNA5：805-818(1999)；和Zhang et al.，Mol Cell 2：141-147(1998))。
我们早先显示了，pRNA的六个拷贝形成六聚环(Guo et al.，Mol.Cell.，2：149-155(1998)；Hendrix et al.，Cell，94：147-150(1998)；和Zhang et al.，Mol.Cell.，2：141-147(1998))来驱动DNA包装引擎(motor)(综述参见Grimes et al.，Adv.Virus Res.，58：255-294(2002)和Guo，Prog in Nucl Acid Res & Mole Biol.，72：415-472(2002))。pRNA二聚体是六聚体的构建块(Chen et al.，J Biol Chem，275(23)：17510-17516(2000))。右和左互锁环体的手牵手相互作用可以被操作来产生期望的稳定的二聚体和三聚体(Chen et al.，RNA，5：805-818(1999)；Guo et al.，Mol.Cell.，2：149-155(1998)；Shu et al.，J Nanosci and Nanotech(JNN)，4：295-302(2003)；和Zhang et al.，Mol.Cell.，2：141-147(1998))；通过两个互锁左手和右手环体的碱基配对经由手牵手相互作用形成六聚体(Chen et al.，RNA，5：805-818(1999)；Guo et al.，Mol.Cell.，2：149-155(1998)；和Zhang et al.，Mol.Cell.，2：141-147(1998))。因而，pRNA具有强烈的倾向通过手牵手相互作用形成圆环，无论它是处于二聚体、三聚体还是六聚体形式(Chen etal.，RNA，5：805-818(1999)和Shu et al.，J Nanosci and Nanotech(JNN)，4：295-302(2003))。
已经通过凝胶、沉降(Shu et al.，J Nanosci and Nanotech(JNN)，4：295-302(2003))、二项式分布(Trottier et al.，J.Virol.，71：487-494(1997))、低温AFM(原子力显微镜检查(atomic force microscopy))，以及通过混合具有分子间互补环体的两个无效突变pRNA，然后分析该混合物在DNA包装分析中的活性(Guo et al.，Mol.Cell.，2：149-155(1998)和Zhang et al.，Mol.Cell.，2：141-147(1998))研究了pRNA的化学计量。pRNA的预测的二级结构(附图19)揭示了两个环体，称为左手和右手环体(12)。两个天然存在的环体的序列(右手环体的碱基45-48，和左手环体的碱基85-82)是互补的。化学修饰干扰被用于从不涉及分子间缔合的那些碱基中辨别出涉及分子间缔合(即，二聚体形成)的那些。碱基45-49、52、54-55、59-62、65-66、68-71、82-85和88-90显示了二聚体形成中非常强的关联。化学修饰干扰、化学探测和低温-AFM揭示了，二聚体经由手牵手和头接头(head-to-head)接触来形成，一种不典型的和新的RNA二聚作用，其与其他报道的相互作用例如HIV的伪结(pseudoknots)或接吻环体(kissing loops)不同(Chang et al.，J MolBiol，269(1)：52-66(1997)；Laughrea et al.，Biochemistry，35(5)：1589-1598(1996)；Muriaux et al.，J Biol Chem，271(52)：33686-33692(1996)；Paillart et al.，Proc Natl Acad Sci U.S.A，93：5572-5577(1996)；和Puglisiet al.，Nature，331：283(1988))。
化学修饰实验表明，C18C19A20作为膨隆存在于pRNA的表面上，用于与其他DNA包装组件相互作用(Trottier et al.，RNA，6：1257-1266(2000))。化学修饰还揭示了环体和膨隆中不配对的碱基，例如碱基18-20、42-48、55-57、82-86以及单碱基膨隆A9、C10、U36、A93和A100。U72U73U74碱基作为存在于三通(three-way)接点处的膨隆存在，以提供折叠中的柔性并充当左手茎-环的扭转(twisting)的铰链(Trottier et al.，RNA，6：1257-1266(2000))。化学修饰揭示了，主要环体中的三个在单体中被强烈修饰了，但在二聚体中被保护免于修饰。
为了简化可递送复合物中亚单位的描述，我们使用大写字母来代表pRNA的右手环体，小写字母来代表左手环体(附图7，18)。在大写和小写的情况中，相同的字母代表互补的序列，而不同的字母代表非互补环体。例如，pRNA A-a′代表具有互补的右手环体A(5’G45G46A47C48)和左手环体′a′(3’C85C84U83G82)的pRNA，而pRNA A-b′代表具有不配对的右手环体A和不配对的左手环体b′(3’U85G84C83G82))的pRNA。参见附图18。
pRNA二聚体的形成(附图7)也可能帮助稳定pRNA/核酶嵌合体分子。只要环状排列的pRNA的开口接近二聚体形成的区域，三级结构可以帮助防止核酸外切酶接近RNA分子的末端。
当使用先有技术方法全身地递送时，生物学活性RNA例如siRNA和核酶进入细胞的效力由于RNA的大的尺寸是非常低的。当前，大多数递送方依靠转染和病毒载体。化学介导的转染过程可以用于细胞培养物，但明显地不适合向患者递送。病毒载体是有效的，但是靶向特定细胞方面的难题仍需要解决。
细胞外大分子和颗粒通过受体介导的内吞作用(RME)的摄取是对几乎所有真核细胞共同的过程。受体介导的内吞作用的机制已经受到密集的研究，已经报道了它用于递送治疗分子，例如抗体(Becerril et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，255：386-393(1999)和Poul et al.，JMol.Biol.，301：1149-1161(2000))、药物或RNA适体(Homann et al.，Bioorg.Med Chem，9：2571-2580(2001))的总体可能性。然而，在采用受体介导的内吞作用(RME)用于治疗试剂的靶向和递送已经遭遇到困难，包括1)相对于健康细胞，缺乏对靶细胞的特异性；2)治疗分子在内吞途径中的溶酶体降解；3)靶向和递送系统在体内的不稳定性；和4)与重复给药相关的有害免疫学反应。
本发明的pRNA嵌合体形成二聚体、三聚体、四聚体和六聚体的能力开辟了疾病的诊断和治疗的激动人心的新机会。每种单独的pRNA嵌合体可以被看作嵌合pRNA“构建块(building block)”。这些构建块可以被设计和选择来充当专用的或“设计的”多聚pRNA复合物的组件。单体的构建块被工程化以在分子间相互作用结构域中包括右手和左手环体，其促进期望的相互作用(例如，A-b′、B-e′、E-a′来形成三聚体)。参见Shu et al.，Nano Letters 2004；4：1717-1724；2005年4月21日公开的WO2005/035760。右手环体至少包括核苷酸45-48，左手环体至少包括核苷酸82-85(参见实施例11)。
这些多聚体复合物的多价性质使得治疗和/或诊断的整合的多方面方法成为可能。如在实施例11和12和附图23中说明的，存在多聚pRNA复合物的多种排列，其可以使用在此描述的衍生化和修饰来设想和创建。可以设计pRNA单体的库，为特定应用而专用化的多聚复合物可以通过从库中选择期望的嵌合pRNA构建块来容易地构建。例如，从在螺旋区域中包括治疗siRNA的pRNA嵌合体、包括用于指引和靶向的RNA适体的pRNA嵌合体、和/或已经在一端或两端用可检测标记衍生的pRNA嵌合体，可以产生多聚复合物。
因而本发明提供了解决在使用受体介导的内吞作用用于治疗试剂递送中早先遭遇的难题的机制。pRNA的多聚性质便于根据本发明的稳定的、多价的pRNA嵌合体(即，多聚pRNA复合物)的构建，其携带用于特异性细胞识别、内涵体逃避和/或一种或多种治疗分子的递送的多个组件。
例如，二聚复合物可以含有两个间隔区，因而含有两个生物学活性部分。优选的二聚的复合物是包括第一嵌合pRNA和第二嵌合pRNA的复合物，所述第一嵌合pRNA包括靶向部分(例如，RNA适体、和抗体，或受体配体，如叶酸)，所述第二嵌合pRNA包括生物学活性RNA，例如siRNA、核酶或反义RNA。
pRNA二聚体介导的递送的策略是，受体结合部分介导细胞识别和随后的内在化，治疗RNA，例如siRNA，然后被释放以减量调节特定基因。所述靶向部分将所述pRNA二聚体靶向预定的细胞，并结合到细胞表面受体。这样做时，它优选地刺激受体介导的内吞作用，从而引起pRNA二聚体的内在化。当要治疗的疾病是病毒病，例如HIV或肝炎病毒感染时，靶向部分可以靶向被包括在受感染细胞表面的特异性病毒糖蛋白。所述生物学活性RNA是调节细胞功能、从而影响细胞生长、死亡、生理机能等等的RNA。优选的，所述生物学活性RNA是治疗性siRNA或核酶。
在附图8中说明了更复杂的六聚复合物。除了携带靶向部分的pRNA之外，六聚复合物可以包括携带不同治疗试剂的多个pRNA(例如，一个含有siRNA，另一个含有核酶)。另外，六聚体可以包括pRNA嵌合体，其携带标记试剂，例如重金属、量子点、荧光染料或珠子、或放射性同位素。同样地，六聚体可以包括携带组件的一个或多个pRNA嵌合体，所述组件例如能够提高内涵体破坏从而释放治疗性分子的融合肽。六聚体也可以包括被设计以容许细胞凋亡的检测的pRNA嵌合体。
在优选的实施方式中，多价pRNA复合物的一个亚单位携带靶向试剂，优选的RNA适体，例如CD4适体(以下更详细地描述)、抗体、或结合细胞表面受体的配体，从而诱导受体介导的内吞作用。靶向部分也可以与细胞膜或细胞壁的某些成分相互作用，并通过受体介导的内吞作用以外的机制获得对细胞的进入。如早先提到的，靶向部分，如可以被pRNA嵌合体携带的其他“货物”(异源组件)，可以被包括在环状排列的pRNA嵌合体的间隔区中(特别是如果它们从RNA形成，象RNA适体一样)，或它们可以共价连接到非环状排列pRNA的5′或3′末端。作为靶向部分有用的优选的受体配体是叶酸(folic acid，folate)。叶酸结合叶酸受体，其通常在癌细胞上过量表达(参见实施例13)。在优选的实施方式中，设计以提高叶酸对细胞表面的叶酸受体的可接近性，嵌合pRNA被设计具有5′突出，叶酸结合到所述pRNA的5′末端上。这可以伴随着添加核苷酸到5′末端，或从pRNA的3′末端删除核苷酸而实现。因而，结合到叶酸的pRNA嵌合体是设计以治疗或检测癌症的多聚pRNA复合物的优选的组件。
pRNA复合物的另一个或两个亚单位任选地携带提高内涵体破坏的组件，用于从内涵体释放递送的治疗分子。在文献中描述了破坏内涵体并介导治疗分子的内涵体逃避的许多物质。缺陷的或补骨脂素(psoralen)钝化的腺病毒颗粒由于它们具有相当大的内涵体裂解活性而显示了前景(Cotton et al.，Proc Natl Acad Sci USA，89：6094-6098(1992))。模拟流感病毒的血球凝集素的膜融合区域的合成肽也已经成功地用于基因递送系统来帮助内涵体逃避(Mastrobattista et al.，J BiolChem，277：27135-27143(2002)；Plank et al.，J Biol Chem，269：12918-12924(1994)；和Van Rossenberg et al.，J Biol Chem，277：45803-45810(2002))。多聚的内涵体破坏基因递送载体，例如聚(氨基酯)(n-PAE)(Lim et al.，Bioconjug.Chem，13：952-957(2002))或聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)(Panyam et al.，FASEB J，16：1217-1226(2002))也将被测试。通过包括一个含有RNA适体(以下更详细地描述)的pRNA嵌合亚单位，所述RNA适体被设计以特异性结合内涵体破坏试剂，内涵体破坏试剂可以方便地连接到多价pRNA复合物。因而pRNA嵌合体优选地包括内涵体破坏试剂，或与内涵体破坏试剂共同递送。
另一种pRNA嵌合体可以含有标记试剂，例如，重金属、量子点、光学活性部分(例如荧光标记)、生物素或放射性同位素。含有这种pRNA嵌合体的多聚pRNA复合物对于受影响的细胞，例如癌细胞的检测是有用的。
另一种pRNA嵌合体可以包括与pRNA的5′或3′末端退火的独立的DNA或RNA寡核苷酸作为异源组件。优选的，在这个实施方式中，pRNA嵌合体包括与pRNA的3′退火的DNA寡核苷酸。任选的，DNA寡核苷酸是衍生的；例如，它可以含有可检测标记，例如放射性标记、或生物素部分，等等。
治疗试剂(例如，生物学活性RNA，如核酶或siRNA，或其他药物)可以由组成二聚、三聚或六聚多价pRNA嵌合体的另外的pRNA单体携带。治疗试剂可以包括生物学活性RNA、酶、化学治疗药物，等等。它们可以被选择以有效对抗癌症或传染性疾病，包括由人类免疫缺陷病毒(HIV)和肝炎病毒、特别是乙型肝炎病毒(HBV)引起的那些。可以被掺入pRNA嵌合体用作抗癌多聚复合物组件的治疗试剂的实例是针对编码存活蛋白的基因的siRNA。存活蛋白抑制某些癌细胞中的细胞凋亡，因而沉默存活蛋白的存活蛋白siRNA诱导癌细胞的细胞凋亡，如在实施例11和14中说明的。
本发明的二聚、三聚和六聚多价pRNA复合物因而理想地适合于用于癌症、病毒感染和遗传疾病的治疗的治疗性siRNA或其他化学药物。多治疗试剂的应用预计将提高体内治疗的效力。
例如，结合其他分子的RNA分子(例如，细胞表面受体结合RNA分子或结合内涵体破坏试剂的RNA分子)可以通过SELEX(通过指数性富集的配体的系统性进化)被鉴定和分离(Tuerk et al.，Science249：505-510(1990)；和Ellington et al.，Nature 346：818-822(1990))。这些RNA分子被称为“RNA适体”。从含有随机RNA序列的库开始，体外进化技术容许选择能够结合特定的预先鉴定的底物，如配体或受体的RNA分子(Ciesiolka et al.，RNA 1：538-550(1995)；Klug and Famulok，Molecular Biology Reports 20：97-107(1994)。受体结合(“抗受体”)RNA可以被插入pRNA载体来形成在此描述的环状排列的pRNA。携带锤头核酶的嵌合RNA和携带抗受体的嵌合RNA可以被混合来经由早先报道的内RNA环体/环体相互作用来形成二聚体或更高级的结构(Chenet al.，J Biol Chem 275：17510-17516(2000)；Guo et al，.Mol Cell 2：149-155(1998)；Zhang et al.，Mol Cell 2：141-147(1998)；和Hendrix，Cell94：147-150(1998))。含有RNA适体作为抗受体的多价RNA的使用预计产生了比蛋白抗受体优越的特异性。
此外，可以采用SELEX方法的基本原理来使用本发明的基础pRNA嵌合体设计以创建RNA适体。对于鉴定结合预定底物的RNA适体有用的RNA分子含有随机序列，优选的25-100个碱基，存在于本发明的pRNA的一个末端，优选的连接到天然5′/3′末端处于的位置。任选的，可以包括将连接到5′/3′末端的两端的随机序列连接的接头序列。这种RNA分子可以通过化学或酶学合成来制成。例如，对于鉴定RNA适体有用的RNA分子可以使用三种引物来产生：模板引物、3′末端引物和5′末端引物(参见，附图17)。根据pRNA序列或它的衍生物和对应物设计和确定DNA引物。模板引物包括随机序列，其侧翼是结合3′和5′末端引物的两个核苷酸序列。优选的，DNA模板的每个侧翼序列含有具有至少14个碱基的核苷酸序列，其互补于与pRNA的5′和3′末端相应的3′末端引物和5′末端引物的序列。
3′和5′末端引物可以用于通过PCR产生对RNA适体的鉴定有用的RNA分子，以及用于在SELEX方法期间的扩增。3′末端引物含有与RNA序列互补的核苷酸来产生pRNA序列的5′末端，在或接近5′末端开始，在任何初生的3′末端，例如碱基71结束。同样地，5′末端引物含有与pRNA序列3′末端处的RNA序列互补的核苷酸，在或接近3′末端(例如，约碱基117)开始，在任何初生的5′末端，例如碱基75结束(附图17)。合起来，5′和3′末端引物含有与所有或大部分pRNA序列、优选的野生型pRNA序列互补的的核苷酸序列，从而在转录后，产生的RNA适体结构是本发明的pRNA嵌合体的结构。例如，如果3′末端引物在野生型pRNA的碱基71处终止，5′末端引物在野生型pRNA的碱基75处终止，仅pRNA碱基72-74从SELEX过程中产生的pRNA嵌合体中缺少，这不会影响pRNA的独立折叠。产生的pRNA嵌合体的二级结构等价于phi29pRNA结构(对于等效结构的实例参见附图3)。例如，pRNA的5′/3′螺旋区域的序列可以改变，只要它形成配对的双链区域。
从这个系统产生的、结合预先鉴定的底物的RNA适体分子将含有新选择的RNA序列，其连接到cp-pRNA的原始5′和3′末端，并将准备好用于没有进一步修饰的各种应用。这种含有pRNA部分的RNA适体将能够在各种应用中结合预先鉴定的底物，包括而不限于，药物或基因递送、以及纳米设备的构建。
SELEX系统被用于鉴定特异性结合蛋白、多糖、脂质、ATP、化学物质和具有明确定义的分子结构的理论上任何物质的RNA适体(Bouvet，Methods Mol.Biol，148：603-610(2001)；Ciesiolka et al.，RNA，1：538-550(1995)；Davis et al.，Methods Enzymol.，267：302-314(1996)；Gold，Harvey Lect.，91：47-57(1995)；Kraus et al.，J Immunol.，160：5209-5212(1998)；Shu et al.，J.Biol.Chem.，278(9)：7119-7125(2003)；Shultzabergeret al.，Nucleic Acids Res.，27：882-887(1999)；Wang et al.，Sheng Wu HuaXue.Yu Sheng Wu Wu Li Xue.Bao.(Shanghai)，30：402-404(1998)；和Zhenet al.，Sheng Wu Hua Xue.Yu Sheng Wu Wu Li Xue.Bao.(Shanghai)，34：635-642(2002))。实际上，这种方法可以被一般化，远远超过作为递送内涵体破坏试剂或结合靶细胞表面受体的方式，因为，它提供了连接基本上任何期望的分子(一般地，非核酸)到pRNA递送媒介物的途径，只要鉴定了结合所述分子的RNA适体。RNA适体和它的目标分子之间的连接是非共价的，但如果希望，在某些情况下交联可以在发生初始的结合步骤之后实现。
做为选择，代替(或除了)使用SELEX来鉴定特异性结合的RNA适体，功能基团例如生物素、-SH、或-NH2可以连接到pRNA的末端。一旦已经衍生了pRNA，内涵体破坏试剂(或其他期望的分子，特别是非核酸分子)可以通过链霉抗生物素蛋白-生物素相互作用或通过化学交联(-SH/马来酰亚胺或-NH2/NHS酯)来连接到pRNA的末端。
在此公开的设计pRNA分子的能力为加工提供了无比的多功能性，所述pRNA分子以预编程的、希望的方式组装成六聚体。除了抗受体适体之外，例如，六聚体可以携带多达五个其他组件。这可以包括聚(氨基酯)(n-PAE)(Lim et al.，Bioconjug.Chem，13：952-957(2002))、合成的肽(Mastrobattista et al.，J Biol Chem，277：27135-27143(2002)；Plank et al.，J Biol Chem，269：12918-12924(1994)；和Van Rossenberg etal.，J Biol Chem，277：45803-45810(2002))、病毒衍生的颗粒(Nicklinet al.，Circulation，102：231-237(2000))用于溶酶体逃避、佐剂、药物或毒素。使用相同的原理，可以利用二聚体或三聚体。甚至六聚体结合的空的原衣壳可能被证明是有用的，充当纳囊(nanocapsule)来携带编码特定基因的DNA用于递送。
重要地，RNA是唯一适用于治疗慢性疾病的，因为除了与蛋白复合时，它具有低的和不可检测的水平的免疫原性。(Goldsby et al.InImmunology，5th ed.；W.H.Freeman and Company：New York，2002；pp57-61；Madaio et al.，J.Immunol.1984；132：872-876).本发明的单体或多聚pRNA嵌合体不含有蛋白或肽，因而使用这种无蛋白的纳粒来避免免疫反应容许在慢性疾病的治疗中长期施用。
在附图3中显示的来自枯草杆菌(Bacillus subtilis)噬菌体SF5、B103、phi29、PZA、M2、NF和GA1的pRNA的系统发生分析显示了非常低的序列同一性和很少的保守碱基，而pRNA的家族看起来具有相似的预测二级结构(Pecenkova et al.，Gene 199：157-163(1997)；Chen etal.，RNA 5：805-818(1999)；Bailey et al.，J Biol Chem 265：22365-22370(1990))。这些噬菌体的所有七种pRNA含有右手和左手环体，其形成经由Watson-Crick碱基配对的环体/环体相互作用。两个环体内的互补序列在这些pRNA的每一个中发现。因此，这些pRNA也可以作为载体来携带小的治疗RNA分子(附图3)。
这些核酶介导的抑制实验的结果可以用于其他细胞类型，包括许多植物和动物物种的那些。因而如果嵌合的核酶-pRNA被掺入细胞、动物或植物的基因组，能够为了各种目的开发转基因植物和动物。
令人惊讶地，核酶与分支pRNA区域的结合从而核酶的两端都共价连接到pRNA区域，没有使得该核酶失效，看起来也不影响pRNA区域或核酶区域的独立折叠。由于核酶RNA的两端的拴系预计也阻止通过核酸外切酶的降解，产生的pRNA-核酶嵌合体预计对于裂解植物和动物、包括人类中的非期望RNA是有用的。另外，通过向细胞的基因组DNA导入编码pRNA-核酶嵌合体的DNA，可以开发对疾病有抗性的转基因植物和动物。
本发明的pRNA嵌合体在体外也是有用的，例如，用于RNA分子的表征。RNA分子，特别是小的RNA分子，可以通过包含在本发明的pRNA嵌合体的间隔区中被稳定或“伴护”，这确保了它们保持适当地折叠、活性和暴露。例如，含有感兴趣的RNA的pRNA嵌合体可以共价或非共价地固定在基质上，从而呈现感兴趣的RNA。然后固定的pRNA嵌合体可以接触测试分子，例如细胞提取物或成分，来鉴定所述感兴趣的RNA结合或相互作用的成分。这优于将感兴趣的RNA直接固定在基质上，因为直接固定可能干扰感兴趣的RNA的折叠，并且也阻断结构的部分与测试分子接触。pRNA嵌合体也可以用于稳定溶液中的RNA，用于结合分析、裂解分析、诊断等等。
                        实施例
通过以下实施例说明本发明。要理解的是，特定的实例、材料、数量和操作将根据在此阐述的本发明的范围和精神广义地解释。
实施例1.phi29 pRNA在3′末端的延伸以及对活性的影响
为了研究其他负荷是否可以施加到pRNA上，pRNA的3′末端被延伸变动的长度。
使用来自分别用EcoRI或XbaI/HindIII预先裂解的质粒pCRTMII的DNA模板，通过体外T7RNA聚合酶转录，产生了RNA产物Eco-pRNA和XbHi-pRNA。为了产生质粒pCRTM2，使用引物对P7/P11产生PCR DNA片段来侧翼于pRNA编码序列(Zhang et al.，Virology207：442-51(1995))。PCR片段然后克隆到PCR克隆载体pCRTMII(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。菌落分离之后的DNA测序确认了质粒中PCR片段的存在。如Guo等(Science 236：690-94(1987))和Wichitwechkarn等(Nucl.Acids Res.17：3459-68(1989))所描述的从原衣壳提取RNA产物174-pRNA，或根据Wichitwechkarn等(Mol Biol223：991-98(1992))中描述的方法使用质粒pCl3-12A(RNA)作为模板用产生的PCR DNA片段体外转录RNA产物174-pRNA。如Zhang等(Virology 207：442-51(1995))所描述的，使用cpDNAT7作为PCR反应的模板用PCR DNA片段体外转录具有pRNA的3′末端的120个碱基延伸的RNA产品Di-RNA。
发现的是，至少120个碱基可以被添加到pRNA的3′末端而不显著影响pRNA功能(附图9)。这种添加包括生物素、pCp、DIG和磷酸盐的pRNA的末端标记。添加到pRNA的3′末端的变动长度的序列对病毒活性具有不可检测的或最小的影响。这些结果表明，117碱基的pRNA独立于它的3′末端延伸出的碱基而折叠。
实施例2.环状排列的φ29 pRNA
来自噬菌体φ29的环状排列的pRNA(cpRNA)通过从DNA模板转录的方式来合成。构建环状排列的pRNA的可能性在于天然φ29 RNA 5′和3′末端的紧密接近(Zhang et al.，Virology 201：77-85(1994))。φ29pRNA 5′和3′末端是紧密接近的。生物学活性环状排列的pRNA的构建揭示了，pRNA内部碱基的中断不影响pRNA的全局折叠。
为了构建环状排列的pRNA，将由3-碱基或17-碱基环序列分隔的两个串联的pRNA编码序列克隆到质粒中(附图10)(参见Zhang et al.，Virology 207：442-451(1995)。含有串联的pRNA编码序列的质粒cpDNA3A(I)和cpDNAT7(II)分别通过3-核苷酸或17-核苷酸合成环体连接。使用PCR来创建具有非天然5′/3′末端的dsDNA片段。然后进行体外转录来产生具有新的5′/3′末端的pRNA。与pRNA编码序列内的各个位置互补的PCR引物对，例如P6/P5，被设计以合成用于cp-pRNA的转录的PCR片段。PCR DNA片段被直接用作模板用于使用SP6RNA聚合酶的体外转录。产生的线性cpRNA转录产物通过小的环体的方式连接pRNA的天然5′末端和它的3′末端：对于DNA模板cpDNA3A来说小环体为AAA，对于DNA模板cpDNAT7来说为TAATACGACTCACTATA(SEQ ID NO：8)。
附图11显示了一般的环状排列的pRNA结构(SEQ ID NO：2)，箭头表明各种新的开口(Zhang et al.，RNA 3：315-323(1997))。5′U1C2和3′A117G116的野生型序列可以被分别改变成G1G2和C116C117，相对于野生型pRNA，以促进和提高T7RNA聚合酶的转录。
出乎我们意料之外，我们发现，插入序列来连接pRNA分子的天然5′和3′末端以及5′和3′在分子上其他地方的重新定位没有影响pRNA活性，因为cpRNA仍然能够催化φ29组装。因而，大多数内部碱基可以用作新的末端用于构建活性cp-pRNA(Zhang et al.，Virology 207：442-451(1995)；Zhang et al.，RNA 3：315-322(1997))。
由于用可变长度的核苷酸序列连接pRNA的3′和5′末端不影响pRNA活性，这是pRNA和连接的序列独立地折叠的指示。这些发现意味着，核酶可以被置于pRNA的3′和5′末端之间，能够折叠而不受到pRNA的序列和折叠的影响。
实施例3.pRNA核酶嵌合体的体外活性
实施例2中用于连接pRNA的天然末端的环体本身不具有任何生物学活性。然而，我们想知道，如果被拴系在pRNA的两个末端，具有生物学活性的RNA序列是否将保持它的活性。决定测试作为环体序列的锤头核酶。
如早先Cotton等(EMBO J.8：3861-3866(1989))描述的体外模型系统(附图12)被修改并用作对照来测定pRNA-核酶嵌合体的功能。选择U7snRNA(SEQ ID NO：4)作为目标RNA。合成嵌合RNA分子pRNA-RzU7(SEQ ID NO：3)。这个系统被用于确定pRNA是否可以携带其他锤头核酶来在底物裂解中起作用(Cotten and Birnstiel，EMBO J8：3861-3866(1989))。
如早先Zhang等(Virology 201：77-85(1994))描述的制备RNA。简要地，使用期望的序列合成DNA寡核苷酸，用于通过PCR产生双链DNA。含有T7启动子的DNA产物被克隆到质粒中，或作为底物用于指导体外转录。编码U7底物的反义DNA和编码核酶RzU7的DNA在转录之前与T7正义(sense)启动子混合。通过PCR制备编码核酶RzU7-pRNA和T7启动子的dsDNA。通过run-off转录用T7RNA聚合酶合成RNA，从聚丙烯酰胺凝胶上纯化。质粒和PCR产物的序列通过DNA测序来确认。
比较了U7靶向核酶(47个碱基)、RzU7和U7靶向pRNA-核酶(168个碱基)、RzU7-pRNA裂解U7snRNA片段的相对能力。进行核酶裂解反应来作为对照实验以证明核酶反应没有任何修饰地正确工作。结果揭示了，RzU7-pRNA核酶能够裂解底物，结果与对照RzU7核酶是可比较的(附图12)。扩展的研究揭示了pRNA携带的特异性锤头核酶能够裂解其他相应的底物。
这些实验中使用的RNA通过使用PCR或克隆到质粒中体外T7聚合酶转录产生。转录产物如下：
pRNA-RzU7的T7转录产生168mer：
5′GUUGAUUGGUUGUCAAUCAUGGCAAAAGUGCACGCUACUUUGAAAAACAAAUUCUAAAACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAAGCUGUAACACAAAAUCAAUGGUACGGUACUUCCAUUGUCAUGUGUAUGUUGGGGAUUAAACCCUGAUUGAGUUCAGCCCACAUACA3′(SEQ IDNO：3)
U7模板的T7转录产生94mer：
5′GGGAAAGCUUAUAGUGUUACAGCUCUUUUAGAAUUUGUCUAGCAGGUUUUCUGACUUCGGUCGGAAAACGCCUAACGUUGCAUGCCUGCAGGUC3′(SEQ ID NO：9)
RzU7模板的T7转录产生47mer：
5′GGCAAAUUCUAAAACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAAGCUGUAACAC3′(SEQ ID NO：10)。
比较了RzU7(47个碱基)(SEQ ID NO：10)和pRNA-RzU7(168个碱基)(SEQ ID NO：3)裂解U7snRNA(SEQ ID NO：9)的能力。进行RzU7裂解反应来作为对照实验以证明核酶反应没有任何修饰地正确工作。进行使用pRNA-RzU7的分裂反应来确认pRNA可以成功地用作核酶的载体分子。
在存在20mM Tris pH 7.5、20mM MgCl2和150mM NaCl的情况下在37℃进行90分钟U7靶向核酶RzU7和核酶RzU7-pRNA裂解反应。通过用水代替RNA进行对照反应。样品在Millipore 0.025μm VS型膜上相对TE(10mM Tris，1mM EDTA，pH 8.0)进行透析30分钟。2×加载缓冲液(8M尿素、TBE、0.08％溴酚蓝、0.08％二甲苯蓝)添加到样品，之后将它们加载到TBE(0.09M Tris-硼酸，0.002M EDTA)中的15％PAGE/8M尿素变性凝胶上。凝胶用溴化乙锭染色，使用EAGLEEYE II(Stratagene)显现。
附图12(b)显示了裂解反应的成功结果。可以看到预测的69mer和25mer裂解产物。
这个实验确认了成功地使用pRNA作为核酶的载体分子。锤头核酶在pRNA-RzU7构建体中保持活性的发现具有重要意义。pRNA的独立折叠显然地并且有益地容许核酶折叠成正确结构和进行它裂解目标RNA的功能。此外，由于核酶的两个末端都连接到pRNA，该连接预计保护了核酶免于细胞中核酸外切酶消化。因此，在转基因植物或动物中表达后所述核酶将是稳定的，解决了妨碍核酶的治疗用途的持久性难题。
实施例4.pRNA核酶嵌合体针对乙型肝炎病毒的体外活性
肝炎是在世界范围内许多国家中普遍的严重疾病。乙型肝炎病毒(HBV)是这种疾病的一个致病因素。HBV是RNA病毒。HBV的RNA基因组被用作目标来测试嵌合pRNA-核酶的功能。这种工作是重要的，因为它提供了治疗这种严重传染性疾病的可能性。
基于噬菌体φ29的基于pRNA的载体被设计以携带裂解乙型肝炎病毒(HBV)polyA信号的锤头核酶。由Feng等(Biol.Chem.382：655-660(2001))设计的这种锤头核酶将137-核苷酸HBV-polyA底物裂解为70和67个核苷酸的两个片段。
我们测试了这种核酶的两个版本：pRNA-RzA，其含有pRNA部分，以及RzA，其不含有。编码嵌合核酶的体外质粒pRNA-RzA通过使用限制性内切酶XbaI和KpnI来从质粒pRzA除去编码未修饰的核酶的序列来构建，所述质粒pRzA编码靶向HBV polyA信号的核酶(Feng et al.，Biol Chem 382：655-60(2001))。然后，通过PCR制成的、编码188个核苷酸的嵌合核酶的dsDNA片段连接到用Xba I和Kpn I双消化的质粒pRzA中(附图14)。将HBV靶向核酶连接到pRNA的5′和3′末端，将pRNA重新组织成环状排列的形式。将两个顺式裂解核酶添加到pRNA和HBV靶向核酶的侧翼。
如早先Zhang等(Virology 201：77-85(1994))描述的制备RNA。简要地，使用期望的序列合成DNA寡核苷酸，用于通过PCR产生双链DNA。含有T7启动子的DNA产物被克隆到质粒中，或作为底物用于指导体外转录。编码HBV polyA(Feng et al.，Biol Chem 382：655-660(2001))底物的体外质粒pTZS用BglII线性化。编码HBV polyA底物靶向核酶RzA和pRNA嵌合体核酶pRNA-RzA的体外质粒用EcoRI线性化。通过使用线性DNA作为run-off转录的模板用T7聚合酶体外转录来产生RNA。质粒和PCR产物的序列通过DNA测序来确认。
顺式裂解的转录的产物核酶pRNA-RzA是188mer：
5′GCUAGUUCUAGAGUUGAUUGGUUGUCAAUCAUGGCAAAAGUGCACGCUACUUUGCAAAACAAAUUCUUUACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACGGGUCAAAAGCAAUGGUACGGUACUUCCAUUGUCAUGUGUAUGUUGGGGAUUAAACCCUGAUUGAGUUCAGCCCACAUACGGUACCUCGACGUC3′(SEQ ID NO：17)
转录的核酶RzA是66mer：
5′GCUAGUUCUAGACAAAUUCUUUACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACGGGUCGGUACCUCGACGUC3′(SEQ ID NO：18)
体外质粒的整个盒处在T7启动子的控制下。在盒的转录期间，转录产物自身裂解产生嵌合核酶(pRNA-RzA)，其含有连接到pRNA的HBV靶向核酶(附图14)。
在存在20mM Tris pH 7.5和20mM MgCl2的情况下在37℃进行裂解反应60分钟。pRNA-RzA(0.539nmol)被用于裂解HBV-polyA(0.117nmol)。通过用水代替某些RNA进行对照反应。被水代替的RNA从对照物的名称中省略。例如，pRNA-RzA对照物没有HBV-polyA。样品在Millipore 0.025μm VS型膜上相对TE(10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0)进行透析30分钟。2×加载缓冲液(8M尿素、TBE、0.08％溴酚蓝、0.08％二甲苯蓝)添加到样品，之后将它们加载到TBE(0.09M Tris-硼酸，0.002M EDTA)中的15％PAGE/8M尿素变性凝胶上。凝胶在100伏特跑动指导二甲苯蓝(xylene cyanol)离开凝胶的底部1.5cm。凝胶用溴化乙锭染色，使用Stratagene的EAGLE EYE II显现。
编码pRNA嵌合体pRNA-RzA(表1)的dsDNA片段通过PCR制成。pRNA-RzA核酶和HBV-polyA底物RNA通过使用线性DNA作为模板用于run-off转录、通过使用T7聚合酶的体外转录来产生。这种pRNA-RzA核酶转录产物然后经历两个顺式裂解反应来将它自己从外来的RNA侧翼序列中释放。“顺式裂解”是指裂解反应，其中核酶和底物是同一分子的部分。这两种顺式裂解通过侧翼于嵌合序列的两个核酶实现。一个顺式核酶(63nt)是嵌合体的5′，另一个顺式核酶(46nt)是嵌合体的3′(附图14)。顺式裂解反应主要在pRNA-RzA核酶被转录期间发生(附图14)。
表1.用于核酶活性分析的质粒、寡聚物和PCR产物
  名称   功能   启动子   目标或目的   含有pRNA
  cpDNA3A(质粒)   环状排列的pRNA，体外   SP6   cpRNA的产生   是
  cpDNAT7(质粒)   环状排列的pRNA，体外   SP6   嵌合核酶的构建   是
  pRNA-RzA(质粒)   核酶，体外   T7   HBV polyA   是
  pRzA(质粒)   核酶，体外   T7   HBV polyA   否
  pTZS(质粒)   底物，体外   T7   HBV polyA   否
  pRNA-CRzA(质粒)   核酶，组织培养   CMV   HBV polyA   是
  pCRzA(质粒)   核酶，组织培养   CMV   HBV polyA   否
  pCdRzA(质粒)   失效的核酶，组织培养   CMV   HBV polyA   否
  p3.6II(质粒)   HBV基因组RNA，组织培养   HBV polyA   否
  U7(寡聚物)   底物，体外   T7   U7   否
  RzU7(寡聚物)   核酶，体外   T7   U7   否
PRNA-RzU7(PCR) 核酶，体外 T7 U7 是
  12-LOX(寡聚物)   底物，体外   T7   12-LOX   否
  Rz12lox(寡聚物)   核酶，体外   T7   12-LOX   否
  PRNA-Rz12lox(PCR)   核酶，体外   T7   12-LOX   是
顺式裂解转录的产生的产物188mer是凝胶中的主要条带，并被纯化。在UV灯下用于纯化pRNA-RzA核酶的凝胶的检查产生了三个不同的阴影。缓慢迁移的条带是pRNA-RzA核酶。迁移快得多的另外两个条带是5′和3′顺式裂解核酶。这表明顺式裂解完成了。
HBV-polyA底物被功能性嵌合体pRNA-RzA核酶裂解在附图13中示出。含有pRNA部分的核酶pRNA-RzA能够以几乎100％的效力裂解底物HBV-polyA。预测的67碱基和70碱基裂解产物作为裂解反应的一个条带被看见，其包括HBV-polyA和pRNA-RzA核酶。标记pRNA-RzA的泳道显示了不含有HBV-polyA的对照反应，标记HBV-polyA的泳道显示了不含有pRNA-RzA核酶的对照反应。
附图13中标记RzA的泳道显示了两个条带。上部条带(66nt)是裂解HBV-polyA底物的核酶。下部条带(63nt)是在RzA核酶转录反应中产生的顺式裂解核酶。两个核酶在凝胶上紧密地迁移。标记RzA-pRNA的泳道显示了超过一个条带。顶部条带是嵌合核酶pRNA-RzA。下部条带是如上所述的裂解的产物。没有看到未裂解的底物。
为了在裂解反应中使用等摩尔浓度的RzA和pRNA-RzA，使用了大量的pRNA-RzA。由于这种凝胶中的高RNA浓度和嵌合核酶的大的尺寸，在嵌合核酶和裂解产物之间显示的其它材料是降解的嵌合核酶。甚至小百分比的降解导致可见的降解产物。由于二级结构和通过尿素的不完全变性，RNA的迁移速度与尺寸不完全匹配。
发现的是，包括用于HBV靶向的两个臂的锤头核酶能够正确地折叠而被pRNA护送。有和没有pRNA载体的核酶的裂解效力的比较揭示了显著差异。含有pRNA部分的核酶pRNA-RzA能够以接近100％的效力裂解底物HBV-polyA。嵌合核酶在体外几乎完全地裂解HBV mRNA的polyA信号。然而，没有pRNA部分的核酶RzA以比70％低得多的效力裂解底物(未显示)。
实施例5.pRNA核酶嵌合体在细胞培养中针对乙型肝炎病毒的活性
质粒pCRzA从上海的Guorong Qi教授处获得。这个质粒含有编码顺式作用锤头核酶、侧翼是靶向乙型肝炎病毒polyA信号的两个序列的序列。当这个质粒与HBV基因组共转染到HepG2细胞中时，HBV RNA水平被降低，乙型肝炎病毒复制以剂量依赖性的方式被抑制。
我们基本上根据实施例3构建了质粒pRNA-CRzA。在pRNA-CRzA中，锤头核酶和它的侧翼序列被phi29 pRNA携带，产生pRNA嵌合体。
用于细胞培养研究的pRNA-CRzA质粒的设计基本上与用于体外研究的相同，只是使用CMV启动子代替用于体外研究的T7启动子(表1)。测试了这种核酶的两个版本：pRNA-RzA核酶，其含有pRNA部分，以及RzA核酶，其不含有。两个质粒都含有编码锤头核酶的序列，所述锤头核酶靶向HBV-polyA信号、包括两个顺式裂解锤头核酶。
编码嵌合核酶的组织培养质粒pRNA-CRzA通过使用XbaI和KpnI来从质粒pCRzA除去编码未修饰的核酶的序列来构建，所述质粒pCRzA编码靶向HBV polyA信号的核酶(Feng et al.，Biol Chem 382：655-60(2001))。然后，通过PCR制成的、编码188nt嵌合核酶的dsDNA片段连接到用Xba I和Kpn I双消化的质粒pCRzA的位置中(附图14)。
HepG2细胞在37℃和10％CO2维持在补充有10％胎牛血清和抗生素的Dulbecco′s修改的Eagle′s培养基(DMEM)中。使用磷酸钙沉淀的方法进行短暂的转染。一般地，在60mm平皿中的细胞用1μg HBV表达质粒p3.6II(Feng et al.，Biol Chem 382：655-660(2001))和5μg表达构建体(CMV载体，pCRzA质粒(Feng et al.，Biol Chem 382：655-660(2001))或pRNA-RzA质粒)短暂转染。携带lacZ基因(Invitrogen)的1μg pcDNA4LacZ也被包括在每个转染中作为内部对照。检测β-半乳糖苷酶活性来标准化不同的平皿之中的转染效力。
为了分析HBV病毒RNA转录，转染后72小时，收获细胞并在TRIZOL试剂(Gibcol-BRL)中裂解用于总RNA提取。对于Northern印迹，20μg变性的RNA在0.6M甲醛-1％琼脂糖凝胶上分辨(resolve)，转移到HYBOND N+尼龙膜(Amersham)上。根据供应商(Promega，Madison，WI)用来自质粒p3.6 II的HBV(adr)的1.8kb XbaI片段和[α-32P]dATP随机引物化(priming)来制备探针。在与HBV探针杂交之后，剥离印迹，与GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)的探针重新杂交，GAPDH的探针充当内部对照用于标准化总细胞RNA的水平。
为了分析e抗原，转染后72小时，收获细胞，在37℃在缓冲液(1％NP-40、50mM Tris-HCl和1mM EDTA)中裂解10分钟。测定细胞溶胞产物中的β-半乳糖苷酶活性来标准化不同的样品之间的转染效力的变异。使用商业的ELISA试剂盒(Sino-American Co.)分析细胞溶胞产物和培养基中的e-Ag，并针对β-半乳糖苷酶活性标准化。CMV载体、pCRzA、pRNA-RzA和失效的核酶质粒pCdRzA与HBV表达质粒p3.6II和充当内部对照的β-半乳糖苷酶表达质粒pcDNA4LacZ一同转化到HepG2细胞中。参见表2。CMV载体的数量被任意地视为1。
表2.在用不同质粒转染的HepG2细胞的培养基和细胞质中HBV的e抗原(e-Ag)水平的比较。
Figure S2006800365235D00501
进行e抗原分析来调查pRNA是否可以通过锤头核酶提高HBV复制的抑制作用。e-Ag通过从前核心(pre-core，pre-c)编码区上游的起始位点的翻译而表达，具有与核心抗原几乎相同的氨基酸序列，然而由于蛋白表达位置的差异具有不同的抗原性。e-Ag在急性HBV感染早期出现，适合于细胞培养物中的抗原分析。
通过比较用质粒pcRzA(仅表达锤头核酶)、pRNA-RzA(表达具有pRNA载体的嵌合核酶)、pCdRzA(表达失效的核酶)和仅载体(表2)转染的细胞的e-Ag水平，e-Ag的分析揭示了pRNA提高了核酶的抑制效果。催化上失效的核酶的抑制作用可能是由于涉及臂I和臂II与互补HBV序列杂交的反义机制。
为了评估在细胞培养物中pRNA-RzA核酶的效果，核酶表达质粒pCRzA、pRNA-RzA、pCdRzA或空载体与HBV基因组表达质粒p3.6 II共转染到肝细胞瘤HepG2细胞中。p3.6II含有HBV(adr)基因组的1.2个拷贝，在没有任何其他因子的HepG2细胞中产生全部病毒RNA转录产物(3.5Kb前核心和前基因组RNA；2.4Kb前-S RNA，2.1kb S RNA和0.8Kb X RNA)。转染后72小时提取全部细胞RNA。在针对作为内部对照的β-半乳糖苷酶活性标准化之后，可比较数量的RNA(加载到每个泳道中的RNA样品的数量可以通过GAPDH水平来评估)施加到凝胶，通过使用HBV特异性DNA探针的Northern印迹来检测。使用探针来检测所标明的3.5Kb和2.1/2.4Kb病毒RNA。pRNA-RzA核酶的存在引起3.5和2.1/2.4Kb HBV RNA水平的明显降低。
与CRzA核酶相比，特别是在影响2.1/2.4Kb病毒RNA水平方面，这种修饰的核酶的抑制作用更加显著。在Helix II中带有一个碱基突变的失效的核酶CdRzA(由质粒pCdRzA编码)也与CRzA核酶和pRNA-RzA核酶并行地使用(附图15)。
抗原分析和Northern印迹表明，phi29 pRNA可以伴护和护送锤头核酶来在细胞中起作用，提高裂解效力和核酶对HBV的抑制效果。核酶活性的这种提高的机制可能是由于pRNA可以防止核酶错误折叠并保护核酶免于细胞中存在的核酸外切酶的降解这个事实。pRNA分子含有两个独立的功能结构域：原衣壳结合结构域和DNA易位结构域(附图2(a))。展现的是，外源RNA可以连接到pRNA的末端而不影响pRNA折叠。至少120个非特异性的碱基从aptRNA的3′末端伸出而不阻碍pRNA的折叠或功能，表明117-碱基pRNA独立于它3′末端延伸的碱基而折叠。此外，生物学活性环状排列的pRNA的构建揭示了，pRNA内部碱基的中断不影响pRNA的全局折叠。可变长度的核苷酸序列与pRNA的3′和5′末端连接不影响pRNA活性的展示，是pRNA和连接的序列独立地折叠的指示。
这些细胞培养研究显示了，当与不由pRNA护送的核酶相比时，如通过Northern印迹和e抗原分析所展示的，嵌合核酶能够提高HBV复制的抑制作用。pRNA也可以携带另一个锤头核酶来裂解其他RNA底物。这些研究显示，核酶可以被置于pRNA的3′和5′末端之间，并且将能够折叠而不受到原始pRNA序列的影响。这些发现表明，pRNA可以用作载体用于为细胞内环境中的核酶、反义物、和其他治疗RNA分子赋予稳定性。
实施例6.pRNA-核酶嵌合体在细胞培养物中对抗癌症的活性
实体肿瘤的生长和转移需要持久的血管生成。血管生成是新血管形成的重要过程。血小板中的蛋白12型脂肪氧合酶(12-LOX)通过将O2添加到C-12花生四烯酸来产生12-HETE(12-羟基-5，8，10，14-二十碳四烯酸)。12-LOX和它的代谢物可能是肿瘤血管生成中的重要因子。这项研究的应用可以通过防止癌细胞促进血管在周围组织中生长来限制肿瘤生长。
Liu等的体外研究显示了这种核酶12loxRz有效地裂解底物(CancerGene Ther.7：671-675(2000))。当反应温度从37℃改变到50℃时，效力提高。细胞培养物中的研究显示了从质粒表达核酶的细胞具有这样的12-LOX mRNA的降低水平，其是通过Northern印迹不可检测的。仅具有非功能性突变的核酶的细胞的对照组在12-LOX mRNA水平方面仅具有轻微的降低。这种12-LOX mRNA表达的轻微降低可能是突变的核酶仅通过与12-LOX mRNA结合而不是裂解它的反义效果的结果。分析了细胞提取物的12-LOX酶活性。在6个月后，与亲本细胞相比，表达核酶的细胞具有13％的12-LOX酶活性。与亲本细胞相比，表达突变的非功能核酶的细胞具有80％的12-LOX酶活性(Liu et al.，Cancer Gene Ther.，7：671-675，2000)。这展现了核酶的活性。
血小板12型-脂肪氧合酶(12-lox mRNA)mRNA(附图16)被选择作为目标来测试嵌合体锤头核酶是否可以起作用来抑制人类红白血病(HEL)细胞中的mRNA水平。我们从National Key Lab of VirusResearch的主管Tien教授处获得编码核酶的体外和组织培养质粒，在National Key Lab of Virus Research中发明人Peixuan Guo是顾问和访问教授。基本上使用实施例3中描述的方法将锤头核酶插入我们的pRNA中。我们创建了嵌合核酶12loxRzpRNA，首先在两步PCR反应中从编码T7启动子的寡核苷酸和插入pRNA序列中的12loxRz构建dsDNA模板。这个模板随后被转录来得到12loxRzpRNA。
进行实验来测试12loxRzpRNA的活性。对于体外实验，基本上使用实施例2中描述的方法从寡核苷酸产生12loxRz和12-lox mRNA(mRNA底物)的目标RNA片段。12loxRz和底物RNA各自从它们自己的两个杂交的DNA寡核苷酸的组转录。一个编码负义(negative sense)T7聚合酶启动子和底物序列或12loxRz序列。另一个寡核苷酸编码正义(positive sense)T7启动子序列。使用小牛肠磷酸酶(CIP)和然后具有[γ32P]-ATP的多核苷酸激酶(PNK)放射性标记RNA底物。
在体外和细胞内(细胞培养物)评估有和没有pRNA部分的两种核酶的裂解效力。对于体外研究，我们将比较核酶对pH值、离子浓度、RNase和细胞溶胞产物的抗性的稳定性。这些是影响核酶稳定性和细胞中的功能的因素。
表达12-lox的HEL细胞将用于细胞培养物实验。空的表达盒或处在编码tRNAval启动子的表达盒中的12loxRzpRNA、12loxRzpRNA嵌合体和真核生物聚合酶III终止子序列(5个T残基)将通过使用电穿孔的转染来递送。12loxRzpRNA嵌合体和12-lox mRNA在细胞中的表达通过Northern印迹来检测。未转染的HEL细胞将用作对照。通过测定HEL细胞中是否存在12-HETE产生的降低来评估12-LOX酶活性。
对于体外和细胞培养实验，突变体12loxRz和突变体12loxRzpRNA嵌合体对照物将用作第二对照。突变体12loxRz在它的保守催化核心结构域中一个核苷酸被另一个碱基替代，使得核酶不能裂解底物RNA。设计使用非催化性突变核酶作为第二对照目的是揭示天然的核酶是否能够通过结合RNA底物(即，反义效果)而不是裂解它来抑制翻译。
实施例7.活性二聚体、三聚体和六聚体的构建
右和左互锁环体之间的手牵手相互作用引起稳定的二聚体、三聚体或六聚体的形成。pRNA具有强烈的倾向通过手牵手相互作用形成圆环，无论所述pRNA是处于它的二聚体、三聚体还是六聚体形式。对分子间pRNA/pRNA相互作用负责的序列位于残基23-97之间(Chen et al.，RNA，5：805-818(1999))。在残基#23之前或残基#97之后的核苷酸改变或插入不影响二聚体、三聚体和六聚体的形成。形成二聚体或三聚体的能力也不受残基#23之前和残基#97之后的5′或3′末端截断的影响。
我们的方法是构建单独的嵌合pRNA单体，其可以被“混合并匹配”来携带治疗试剂，例如“女儿”RNA分子，如siRNA或核酶，到特定的靶细胞。每个单体亚单位是在此描述的环状排列的pRNA，并且被设计以具有特定的右或左环体，例如A(右)-b′(左)，被设计以促进分子间相互作用来形成多聚体。每种pRNA携带特定的“有效负载(payload)”(例如，受体靶向适体，内涵体裂解试剂，或治疗性RNA)。单独的环状排列的嵌合pRNA与合适的互锁环体的混合引起二聚体、三聚体或六聚体可递送复合物的有效形成。
pRNA二聚体的构建
pRNA二聚体通过互锁右和左环体的分子间相互作用形成。为了简化在此描述的突变体的描述，大写字母和小写字母被分别用于指代pRNA的右手和左手环体的序列。在大写字母和小写字母中相同的字母表示一对互补的序列。例如，在pRNA A-a′中，右手环体A(5’GGAC48)和左手环体a′(3’CCUG82)是互补的，而在pRNA A-b′中，右手环体A的四个碱基与左手环体b′的序列(3’UGCG82)不是互补的。具有互补的环体序列(例如pRNA A/a′)的突变体pRNA在phi29 DNA包装中是有活性的，而具有非互补环体的突变体(例如，pRNA A/b′)是无效的(附图20)。
我们发现，pRNA A-i′和I-a′单独在DNA包装中是无效的，但是当A-i′和I-a′混合在一起时，DNA包装活性被恢复(附图20a；Hoeprich et al.，J Biol.Chem.，277(23)：20794-20803(2002))。这种结果可以通过pRNA环体的反互补性(trans-complementarity)，即，pRNA A-i′的右手环体A可以与pRNA I-a′的左手环体a′配对来解释。混合具有互锁环体的两种无效pRNA，例如当pRNA A-b′和B-a′以1∶1摩尔比混合时，导致pRNA二聚体的产生，具有高达100％的效力。因而，pRNA的化学计量被预测为是二的倍数(六或十二)。
我们构建了几个共价连接的二聚pRNA，发现其在DNA体外包装中是活性的(Shu et al.，J Nanosci and Nanotech(JNN)，4：295-302(2003))。这进一步证实了二聚体是六聚体的构建块。这三种完全活性的RNA的每一种的Hill系数的确定意味着对于每种原衣壳，存在着二聚体的三个结合位点并且结合是协同的。
pRNA三聚体的构建
另一组突变体由三种pRNA构成：A-b′、B-c′和C-a′(附图20b)。这个组几何上预计能够形成携带三种突变体的每一种的3-、6-、9-、或12-mer环体。我们构建了几种三聚体的组，例如A-b′、B-c′和C-a′。当单独测试时，每种单独的pRNA展现很少的或没有活性。当混合三种突变体的任何两种时，再一次检测到很少的活性或没有活性。然而，当所有三种pRNA以1∶1∶1比例混合时，DNA包装活性被恢复。实际上，使用三种互锁pRNA的这样的组，稳定的pRNA三聚体以非常高的效力形成，直至100％(附图8和22)。在仅两种突变pRNA的混合物中活性的缺乏以及在三种突变pRNA的混合物中恢复的活性是预期的，因为每种RNA中的突变被这样工程化，使得仅在所有三种RNA存在时产生封闭的环。当混合在一起时三种无效的pRNA完全活性的事实表明，在DNA包装复合物中pRNA的数量是3的倍数，除了是2的倍数之外(附图20b)。因而DNA包装所需的pRNA的数量是2和3的公倍数，其是6(或12，但这个数目通过二项式分布和连续稀释分析的方法被排除了，它们揭露了pRNA在5-6之间的化学计量)(Trottier et al.，J.Virol.，71：487-494(1997))。
六聚体的构建
通过混合六种不同的突变pRNA也实现了DNA包装活性，每一种在单独使用时是无活性的(附图20c)。因而，互锁六聚环可以被预测以通过互锁环体的碱基配对形成。在无蛋白溶液中从二聚体形成pRNA六聚体的效力是低的(Guo et al.，Mol.Cell.，2：149-155(1998)和Zhanget al.，Mol.Cell.，2：141-147(1998)。然而，具有合适的互锁环体的超过一半的二聚体pRNA在存在合适的蛋白模板-连接物或原衣壳的情况下可以形成六聚体(Chen et al.，J Biol Chem，275(23)：17510-17516(2000)和Hoeprich et al.，J Biol.Chem.，277(23)：20794-20803(2002))。具有这种蛋白模板的六聚体作为递送颗粒将是有用的，因为原衣壳颗粒的尺寸仅是30nm×40nm。可选择的方法是通过使用掺入到pRNA的右或左互锁环体中的交联试剂产生高产量的无蛋白六聚体，如我们早先的公开出版物所报道的(Garver et al.，J Biol Chem，275(4)：2817-2824(2000)和Mat-Arip et al.，J Biol Chem，276：32575-32584(2001))。这些六聚体在存在蛋白的情况下产生，在交联之后除去蛋白以分离所述六聚体。
实施例8.携带生物学活性RNA的pRNA分子
嵌合pRNA单体可以被构建携带期望的“女儿”RNA分子。
锤头核酶
锤头核酶(Forster et al.，Cell，50：9-16(1987)和Sarver et al.，Science，247：1222-1225(1990))通过使用互补核苷酸靶向RNA底物序列，两个臂与目标RNA碱基配对。在核酶的互补核苷酸的两个臂之间是催化RNA的短序列，其针对目标RNA进行裂解功能。特异性裂解的目标位点是三碱基序列NUH(N＝A、C、G、U，H＝A、C、U但不是鸟嘌呤核苷)。在目标序列任一侧的核苷酸不应具有强的二级或三级结构，从而核酶可以容易地与目标碱基配对。选择锤头核酶作用的目标的方法早先已经公开了(Mercatanti et al.，J Comput.Biol，9：641-653(2002))。
在实施例5中描述了成功地靶向乙型肝炎病毒RNA的携带锤头核酶的嵌合pRNA。表达盒的转录引起转录产物的自我裂解，产生嵌合核酶(实施例5)。为了构建携带锤头核酶的其他嵌合pRNA，核酶的RNA序列类似地连接到pRNA的5′和3′末端，pRNA是环状排列的，具有优选地重新放置在原始pRNA序列的残基71/75处的新生的5′/3′末端。71/75处的末端已经显示了位于紧密折叠的区域中(Hoeprich et al.，JBiol.Chem.，277(23)：20794-20803(2002))。携带核酶的嵌合pRNA含有合适的右手和左手环体，用于二聚体、三聚体或六聚体复合物的构建，如所期望的。如(Hoeprich et al.，Gene Therapy，10(15)：1258-1267(2003))中报道的，两个顺式作用核酶添加到pRNA和核酶的侧翼。
整个盒优选地，对于体外转录处在T7启动子的控制下，或当盒在体内表达时，处于CMV启动子的控制下。
发夹核酶
发夹核酶(Chowrira et al.，Nature，354：320-322(1991)和Ojwang etal.，Proc Natl Acad Sci USA，89：10802-10806(1992))也通过与目标碱基配对的两个互补臂靶向RNA，但是它的结构和目标序列要求是更为限制性的。发夹核酶的序列要求是BN*GUC，其中B是除了腺嘌呤外的任何核苷酸。因为核酶的需要的发夹通过目标结合臂之一从核酶的其余部分分离，该臂通常被制成仅四个核苷酸以保持核酶活性合理。但一般地，携带特异性发夹核酶的嵌合pRNA单体的构建方法和途径与用于锤头核酶的那些类似。
反义RNA
反义RNA是与mRNA互补的单链RNA分子。已经显示了反义RNA可以在细胞中抑制基因表达(Coleman et al.，Nature，315：601-603(1985)和Knecht et al.，Science，236：1081-1086(1987))。我们早先证明了，至少120个非特异性碱基可以从pRNA的3′末端伸出而不妨碍它的折叠和功能(Hoeprich et al.，Gene Therapy，10(15)：1258-1267(2003)和Shu et al.，J Nanosci and Nanotech(JNN)，4：295-302(2003))。这种添加包括用生物素、pCp、DIG、SH基团和磷酸盐的pRNA的末端标记。我们的结果表明，117碱基的pRNA独立于从它的3’末端延伸出的碱基而折叠。这种发现适用于携带单链的反义RNA的嵌合pRNA单体的构建。用于阻断基因功能的所有反义RNA被置于pRNA的3′末端。
siRNA
近来，转录后基因沉默和RNA干扰已经使用双链RNA在各种各样的有机体中广泛地研究(McCaffrey et al.，Nature，418：38-39(2002)和Zilberman et al.，Science，299：716-719(2003))。这种RNA被加工成19-25个核苷酸的小的干扰双链RNA(siRNA)(Coburn et al.，J.Virol.，76：9225-9231(2003)和Elbashir et al.，Nature，411：494-498(2001))，其作为指导用于目标mRNA裂解所需的沉默酶复合物的形成(Hutvagner et al.，Science，297：2056-2060(2002)和Volpe et al.，Science，297：1833-1837(2002))。这些siRNA特异性地抑制具有与siRNA相同的序列的目标mRNA的表达。虽然转录后基因沉默和RNA干扰的详细机制仍然需要阐明，这种采用siRNA的用于选择性抑制特定基因表达的强大的新技术在癌症和病毒感染的治疗中显示了巨大前景(Carmichael，Nature，418：379-380(2002)；Li et al.，Science，296：1319-1321(2002)；和Varambally et al.，Nature，419：624-629(2002))。
我们确认了pRNA的5′和3′末端配对形成双链螺旋(Hoeprich etal.，J Biol.Chem.，277(23)：20794-20803(2002)和Zhang et al.，Virology，201：77-85(1994))。这种具有超过30个碱基的双链区域是独立的结构域。互补修饰研究揭示了，改变初级序列不影响pRNA结构和折叠，只要两条链是配对的。我们确认了，用其他双链RNA替换这个双链区域不妨碍pRNA二聚体、三聚体和六聚体的形成。因而这个区域可以被任何双链的、19-25个碱基的siRNA替代。近来报道的是，具有环体来连接siRNA的两条链的两个末端的发夹siRNA仍然可以在基因沉默中起作用(Brummelkamp et al.，Science，296：550-553(2002)；McManus etal.，RNA.，8：842-850(2002)；Murchie et al.，Mol.Cell，1：873-881(1998)；Paddison et al.，Genes Dev.，16：948-958(2002)；Paul et al.，Nat Biotechnol.，20：505-508(2002)；Sui et al.，Proc Natl Acad Sci USA，99：5515-5520(2002)；和Yu et al.，Proc Natl Acad Sci USA，99：6047-6052(2002))，表明有可能在末端将siRNA连接到互锁环体的区域。
受体结合适体或分子结合适体
结合特定目标的RNA分子的体外选择已经成为筛选随机RNA库来获得称为“适体”的、与目标分子特异性结合的RNA分子的强有力的工具。从含有随机RNA序列的库开始，体外进化技术(例如，通过指数性富集的配体的系统性进化，SELEX)容许选择以高亲和性有效地结合特定受体或配体的RNA分子(Ciesiolka et al.，RNA，1：538-550(1995)和Klug et al.，Molecular Biology Reports，20：97-107(1994))。使用这种技术，已经获得了特异性识别多种目标，例如有机化合物、核苷酸、肽、蛋白和受体的许多适体。
虽然SELEX系统是强大的，它的缺点之一是产生的RNA适体中的某些以很低的效率结合底物。这种不良结果部分地由于使用具有预设的值而不是随机的序列的两个引物。我们开发了独特系统，在此描述的，用于使用SELEX来筛选具有稳定的结构和对它们的目标更高的亲和性的RNA适体。这个系统可以用于分离以高度特异性和效力结合到细胞表面受体的RNA适体。经由与pRNA的原始5′/3′末端连接，并通过使用类似于用来构建pRNA护送的锤头核酶的方法，这种RNA适体然后被掺入pRNA中(Hoeprich et al.，Gene Therapy，10(15)：1258-1267(2003))。我们成功地构建了含有结合CD4和HVI的gp120的适体的嵌合pRNA。将选择这些适体的每一种用于分别地掺入环状排列的pRNA单体。
实施例9.生物素/链霉抗生物素蛋白相互作用来形成嵌合pRNA
我们开发了操作来添加生物素到RNA的5′或3′末端。对于5′末端RNA标记，我们使用T7RNA聚合酶的特殊启动子，其利用生物素-单磷酸腺苷作为底物用于RNA转录的起始(Huang，Nucleic Acias Res，31：e8(2003))。对于3′末端标记，pRNA复合物与合成的生物素化的DNA寡聚物退火，所述DNA寡聚物与所述pRNA的3′末端互补。照这样，以下示范性的颗粒可以被掺入到可递送的复合物中：1)具有50-200nm大小的荧光链霉抗生物素蛋白珠子，通过生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用掺入到RNA复合物中；2)用荧光和生物素标记的、然后通过链霉抗生物素蛋白分子连接到RNA复合物并被纯化的phi29原衣壳(40nm)；3)生物素化的GFP(绿色荧光蛋白)，通过链霉抗生物素蛋白分子与RNA复合物连接然后纯化；以及4)具有5-10nm大小的链霉抗生物素蛋白纳米金颗粒，通过生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用掺入到RNA复合物中。此外，RNA可以直接用荧光标记，例如，使用Bodipy TMR-C5(Molecular Probe)的5′标记(Homann et al.，Bioorg.Med Chem，9：2571-2580(2001))。嵌合pRNA的内在化可以通过荧光显微镜或共焦显微镜来检查。做为选择，细胞可以通过流式细胞计检查。对于金颗粒，通过电子显微镜分析结果。
实施例10.靶向HIV感染的细胞
CD4是展示在某些T辅助淋巴细胞的表面的受体，并因而是独特的目标，用于可递送RNA复合物向细胞的特异性递送。我们构建了携带结合CD4(以及也结合gp120)的RNA适体的嵌合pRNA A-b′和B-a′单体。这些具有A-b′环体的嵌合pRNA与pRNA B-a′有效地形成二聚体。
这种嵌合pRNA可以被掺入pRNA二聚体、三聚体或六聚体的亚单位之一。携带CD4结合RNA适体的pRNA多聚体将经由与CD4的相互作用和内吞作用优先地进入CD4+细胞。特异性裂解细胞的CCR5的mRNA(Feng et al.，Virology，276：271-278(2003)和Goila et al.，FEBS，436：233-238(2003))，或gag、tat的HIV mRNA(Jackson et al.，BiochemBiophys Res Commun，245：81-84(2003)和Wyszko et al.，IntermationalJournal of Biological Macromolecules，28：373-380(2003))、rev，env，LTR(Bramlage et al.，Nucleic Acids Res.，28：4059-4067(2003))或HIV基因组RNA的其他位置的核酶或siRNA被融合到pRNA多价复合物的其他亚单位上。核苷酸衍生物可以被掺入到pRNA中来通过赋予对RNase消化的抗性来提高RNA的稳定性。这些嵌合pRNA可以评估它们在多种CD4阳性细胞系中抑制HIV复制方面的效力(附图22)。使用携带CD4结合适体的荧光标记的pRNA，我们发现这种RNA复合物结合到T淋巴细胞的CD4。
实施例11.使用RNA纳米技术、用于多种治疗分子向癌细胞的特异性递送的纳粒的可控制自组装：pRNA/siRNA嵌合体的用途
利用RNA纳米技术，治疗性siRNA和受体结合RNA适体被工程化到phi29的引擎(motor)的单独的pRNA中。携带治疗分子的RNA构建块随后通过工程化的右手和左手互锁RNA环体的相互作用制成三聚体。含有受体结合适体或其他配体的游离纳米尺度颗粒的孵育引起三价治疗颗粒对细胞的结合和共同进入，随后调节癌细胞和白血病模型淋巴细胞的细胞凋亡。这种无抗原性的20nm颗粒的使用具有用于慢性疾病的重复长期治疗的前景。
引言
噬菌体phi29编码的小RNA已经显示了在将DNA包装到原衣壳中起到原始的和必需的作用(Guo et al.，Science 1987；236：690-694)。这种RNA被称为包装RNA或“pRNA”。pRNA通过两个互锁的左手和右手环体的碱基配对经由手牵手相互作用形成二聚体、三聚体和六聚体，具有20nm的大小(附图23)(Chen et al.，RNA 1999；5：805-818；Shu et al.，J Nanosci and Nanotech(JNN)2003；3：295-302；Guo et al.，Mol.Cell.1998；2：149-155；Zhang et al.，Mol.Cell.1998；2：141-147)。
根据来自光亲和性交联(Garver et al.，RNA.1997；3：1068-1079)和化学修饰干扰(Trottier et al.，RNA 2000；6：1257-1266；Mat-Arip et al.，J BiolChem 2001；276：32575-32584)、互补修饰(Zhang et al.，RNA1995；1：1041-1050；Zhang et al.，RNA 1997；3：315-322)核酸酶探测(Reidet al.，J Biol Chem 1994，269，5157-5162)、寡聚物靶向(Zhang et al.，Virology 1995；211：568-576)、竞争分析(Trottier et al.J.Virol.1997；71：487-494；Trottier et al.，J.Virol.1996；70：55-61)和低温原子力显微镜检查(Trottier et al.，RNA 2000，6，1257-1266；Mat-Arip et al.，JBiol Chem 2001，276，32575-32584；Chen et al.，J Biol Chem 2000；275(23)：17510-17516)的实验数据，构建了pRNA构建块的三维结构的计算机模型(Hoeprich et al.，J Biol Chem.2002；277(23)：20794-20803)。与连接物晶体结构的pRNA六聚体对接(docking)揭示了与涉及pRNA的3D结构的可用的生物化学、遗传学和物理数据的令人印象深刻的匹配(Hoeprich et al.，J Biol.Chem.2002；277(23)；20794-20803)。
近来，我们使用pRNA构建块的底部朝上(bottom-up)组装特征来产生各种结构和形状，包括棒状、三角形、双体、四聚体和三维阵列直至大小几微米。(Shu et al.，J Nanosci and Nanotech(JNN)2003；3：295-302；Shu et al.，Nano Letters 2004；4：1717-1724)。这样的过程作为编程的螺旋区域和环体的相互作用的结果发生。通过这种方法产生的阵列已经显示了对各种环境压力，包括大范围的盐浓度、温度和pH水平有抗性。(Shuet al.，J Nanosci and Nanotech(JNN)2003；3：295-302；Shu et al.，NanoLetters 2004；4：1717-1724)。
117个核苷酸的pRNA单体含有两个功能结构域：分子间相互作用结构域和双链螺旋DNA包装结构域(附图23)。分子间相互作用结构域位于pRNA分子的中心段，含有两个互锁的左手和右手环体，其可以被工程化用于底部朝上组装，而双链螺旋DNA包装结构域位于5′/3′配对的末端。可用的数据表明，这两个结构域相互独立地折叠。结构的研究确认了pRNA的5′和3′末端是接近的，并配对形成双链螺旋。(Hoeprichet al.，J Biol.Chem.2002；277(23)：20794-20803；Shu et al.，Nano Letters2004；4：1717-1724).这个双链区域(具有超过30个核苷酸)是独立的结构域，在核苷酸#23之前的5′末端和在核苷酸#97之后的3′末端的核苷酸添加或删除不影响原衣壳结合结构域的正确折叠。互补修饰研究揭示了，改变螺旋的任何核苷酸的初级序列不影响pRNA结构和折叠，只要两条链是配对的。
大量的研究表明siRNA是双链(ds)RNA螺旋(Li，et al.，Science2002；296：1319-1321；Brummelkamp et al.，Science 2002；296：550-553；Jacque et al.，Nature 2002；418：435-438；Carmichael，Nature 2002，418，379-380；Elbashir et al.，Nature 2001；411：494-498)。为了测试是否有可能用双链siRNA替换pRNA螺旋区域，工程化了各种嵌合pRNA。对于该报告，我们发现用siRNA替换pRNA的5′/3′螺线区域或CD4结合RNA适体、叶酸或其他化学成分在这个区域中的连接不影响pRNA和siRNA的折叠或插入的部分的功能，也不影响三聚体的形成。发现的是，工程化到三聚体中的三种试剂被同时地共同递送到特定癌细胞，由嵌合pRNA构建块之一导引，其携带CD4结合RNA适体或结合细胞表面受体的叶酸。
能够使用30-40nm大小的纳粒避免了由于短滞留时间的体内小分子的短半衰期的难题。此外，大于100nm、很少地递送到细胞的分子的难题被解决了。在科学界公认的是，除了与蛋白质复合时，RNA具有非常低的或不可检测水平的免疫原性。(Goldsby et al.In Immunology，5thed.；W.H.Freeman and Company：New York，2002；pp 57-61；Madaio etal.，J.Immunol.1984；132：872-876).我们的系统不含有蛋白或肽，因而使用这种无蛋白的纳粒来避免免疫反应将容许在慢性疾病的治疗中长期施用。
材料和方法
RNA构建块的工程化和pRNA三聚体的底部朝上组装。如早先描述的制备RNA(Shu et al.，J Nanosci and Nanotech(JNN)2003；3：295-302)。使用期望的序列合成DNA寡聚物，用于通过PCR产生双链DNA。含有T7启动子的DNA产物被克隆到质粒中，或作为底物用于指导体外转录。通过T7RNA聚合酶产生的所有pRNA嵌合体通过小牛肠碱性磷酸酶处理来除去5′磷酸。(Kim et al.，Nat.Biotechnol.2004；22：321-325)。
为了工程化pRNA/siRNA(GFP)、pRNA/siRNA(荧光素酶)和pRNA/siRNA(存活蛋白)，pRNA的5′/3′配对末端的螺旋区域被连接到核苷酸#29和91的双链siRNA替换。
为了工程化携带CD4结合适体的嵌合pRNA，CD4结合的RNA适体的序列(Kraus et al.，J Immunol.1998；160(11)：5209-5212)被连接到pRNA的5′和3′末端。pRNA被重新组织成环状排列的形式，新生的5′/3′末端重新定位在位于紧密折叠的区域中的pRNA核苷酸71/75。(Hoeprich et al.，J Biol.Chem.2002，277(23)；20794-20803)。具有这种CD4结合适体的嵌合pRNA保持了合适的右手和左手环体，例如，对于pRNA A-b′是环体A和b′，用于三聚体的建造。
制造的RNA纳粒的物理特征。通过：1)具有10mM镁但没有尿素的8％天然聚丙烯酰胺凝胶；2)通过具有10mM镁的5-20％蔗糖梯度沉降；和3)AFM成像来验证了制造的RNA纳粒的结构和纯度。(Trottieret al.，RNA 2000；6：1257-1266；Mat-Arip et al.，J Biol Chem2001；276：32575-32584；Chen et al.，J Biol Chem 2000；275(23)：17510-17516).
工程化的嵌合pRNA构建块对细胞的功能分析。对于proB FL5.12A细胞，将107个细胞重悬浮于具有10％FBS的500μl RPMI中。对于D1细胞，细胞重悬浮在低渗透缓冲液中。使用Electro Square PoratorECM 830用4mm比色杯进行电穿孔。在200V、3次脉冲对FL5.12A细胞进行电穿孔，D1细胞在180V、1次脉冲。在冰上短期孵育之后，细胞重悬浮在具有细胞因子的10ml完全培养基中，在37℃和5％CO2孵育2小时。在用Mirus试剂转染之前通过台盼蓝排阻分析显微地测量细胞生存力。106个细胞与RNA构建体(100nM)孵育过夜，用Hanks’平衡盐溶液洗涤两次，重悬浮在有或者没有细胞因子的培养基中，在37℃+5％CO2孵育另外24到48小时。
对于果蝇S2细胞，GFP表达质粒pMT-GFP和各种siRNA使用Cellfectin(Invitrogen)在接种(seeding)后24小时在24孔平板中共转染到细胞中。GFP的表达通过转染后与0.5mM的CuSO4过夜孵育24小时来诱导。GFP表达抑制通过荧光显微镜来观察。
制造的RNA纳粒对细胞的递送的功能分析。对于IL-7依赖性D1细胞系，其从分离自p53-/-小鼠的CD4-CD8-小鼠胸腺细胞建立(Kim etal.，J Immunol Methods 2003；274：177-184)，细胞在含有RPMI1640具有10％FBS(胎牛血清)并具有50U.I每ml的青霉素和链霉素、0.1％β-巯基乙醇和50ng/ml IL-7的的完全培养基中生长。FL5.12A细胞在补充有2ng/ml IL-3的完全培养基中生长。对于CD4在D1细胞中的过量表达，L3T4(小鼠CD4)插入物被亚克隆到pcDNA 6/V5-HisB(Invitrogen)中。通过电穿孔用DNA转染D1细胞。通过抗生素抗性选择稳定的细胞系。表达高水平CD4的D1-CD4hi细胞进一步通过荧光活化的细胞分选来分离。D1-CD4hi细胞系维持在补充有50ng/ml IL-7和杀稻瘟菌素(Blasticidin)HCl(2.5mg/ml)的完全培养基中。
对于分析含叶酸三聚体的递送，人类鼻咽表皮癌KB细胞系在补充有10％FBS(胎牛血清)和青霉素和链霉素的无叶酸RPMI1640培养基(Gibco BRL)中在5％CO2培养箱中维持。细胞生长到单层，血清提供了内源叶酸的正常补充用于细胞生长。在台盼蓝染色之后通过血球计测定细胞滴度。
通过以相同摩尔浓度混合pRNA(A-b′)/叶酸、pRNA(B-e′)/siRNA(GFP)和pRNA(E-a′)/siRNA(萤火虫)来制备三聚的RNA复合物。然后从凝胶纯化三聚复合物，并添加到KB细胞中以容许RNA的结合和进入。在用RPMI培养基洗涤之后，收集细胞并进行双报告物分析(Promega)。
为了分析嵌合pRNA复合物到D1细胞的递送，CD4hi、CD4lo和CD4neg细胞接种到96孔平底平板中。每份样品5×104个细胞在具有10mM Mg2+的PBS中洗涤一次。细胞在37℃在20μl具有10mM Mg2+和400ng(100nM)RNA复合物的PBS中孵育30分钟。在孵育之后，有或者没有细胞因子的完全培养基添加到100μl的最终容积，细胞在37℃+5％CO2孵育24或48小时。通过台盼蓝排阻分析显微地测量细胞生存力。
嵌合pRNA/siRNA加工。RNA通过细胞溶胞产物的加工根据Bernstein等(Bernstein et al.，Nature 2001；409(6818)：363-366)使用的步骤进行。
对于RNA通过Dicer的加工，纯化的重组酶购自Gene TherapySystems。
共焦显微镜检查。包被有聚-L-赖氨酸(200μg/ml)的盖玻片与在补充有细胞因子的完全培养基中生长的细胞孵育过夜。CD4-阴性原B细胞系F15.12A(CD4neg)、原T细胞系D1(CD4neg)和D1-CD4过量表达细胞系(CD4hi)与嵌合pRNA三聚体孵育。使用含有相同摩尔量RNA的pRNA(A-b′)/适体(CD4)、pRNA(B-e′)/FITC和pRNA(E-a′)/罗丹明的混合物在存在10mM Mg2+的情况下从凝胶纯化三聚体复合物。具有细胞的盖玻片用4％多聚甲醛固定，在具有10mM Mg2+的PBS中洗涤，装在Gel/MountT(Biomeda，CA)中。通过Zeiss共焦显微镜LSM 510 NLO捕获图像。
体内动物试验。五周龄雄性无胸腺裸鼠(Harlan Sprague Dawley)居住在无病原体环境中。将动物随机分配到实验组(n＝8)。在注射之前，细胞维持在无抗生素培养基中一周。在注射当天，细胞用PBS漂洗两次，在37℃与二聚的pRNA复合物孵育3h，之后通过胰蛋白酶消化来收集。0.1ml培养基中2.5×105个细胞用于每只小鼠的注射。在前肢的右侧腋窝皮下地接种细胞。一旦异种移植物可见，通过在两个维度上外部测量肿瘤每周两次地测定它们的大小。通过以下公式计算体积：V＝(L×W2)×0.5，其中L是长度，W是异种移植物的宽度。
结果
RNA构建块的命名：为了简化使用工程化的RNA构建块的底部朝上组装的描述，大写字母用于代表pRNA的右手环体，小写字母代表左手环体(附图23)。在大写字母和小写字母的情况中，相同的字母代表互补的序列，用于环体/环体相互作用，而不同的字母代表非互补环体。例如，pRNA A-b′代表其中右手环体A(5’G45G46A47C48)与pRNA E-a′的左手环体a′(3’C85C84U83G82)互补的pRNA(参见Chen et al.，RNA1999；5：805-818)。名称“pRNA/适体(CD4)”代表携带结合CD4的适体的pRNA嵌合体，而“pRNA/siRNA(存活蛋白)”代表携带靶向抗细胞凋亡因子存活蛋白的siRNA的pRNA嵌合体。
1.嵌合RNA作为构建块的工程化，用于建造三聚体作为治疗分子递送的媒介物。
首先，测试了工程化携带受体结合适体的嵌合pRNA构建块的可能性。对于治疗媒介物向细胞的特异性递送，必需的是包括可以识别细胞表面标记的化学部分。与抗体和噬菌体展示肽相比，RNA适体是吸引人的选择，因为它提供了避免诱导免疫反应的益处。(Goldsby et al.Antigens.In Immunology，5th ed.；W.H.Freeman and Company：New York，2002；pp 57-61；Madaio et al.，J.Immunol.1984；132：872-876)。获得以高亲和性选择性结合特定受体的RNA适体的强有力的技术是基于RNA分子的体外筛选，所述RNA分子来自含有随机RNA序列的库(Ellington et al.，Nature 1990；346：818-822；Tuerk et al.，Science1990；249：505-510)。使用这种SELEX方法，已经获得了许多特异性识别特定细胞表面受体例如CD4的适体(Kraus et al.，J Immunol.1998；160(11)：5209-5212)。通过连接到pRNA的原始5′/3′末端将一个CD4结合RNA适体掺入pRNA(附图23)。pRNA载体被工程化和重新组织成环状排列的形式，具有分别重新定位到原始pRNA序列的残基71和75的新生5′和3′末端。71/75末端已经显示位于紧密折叠的区域(Hoeprichet al.，J Biol.Chem.2002；277(23)：20794-20803)，其包埋了末端并保护末端免于核酸外切酶降解(Hoeprich et al.，Gene Therapy 2003；10(15)：1258-1267)。具有这种适体的嵌合pRNA构建块还含有三聚复合物的工程化和建造所需的合适的右手和左手环体。
为了测试pRNA/适体嵌合体是否能够结合特定细胞，pRNA/适体(CD4)用FITC标记，通过荧光显微镜检查分析它结合CD4受体的能力。使用CD4过表达的工程化的胸腺T细胞系D1(CD4hi)(见下文)和衍生出前者的CD4阴性亲本系D1(CD4neg)(Kim et al.，J ImmunolMethods 2003；274：177-184)的结合分析揭示了嵌合pRNA-FITC/适体(CD4)能够有效地结合CD4hi T细胞。使用“切片(Section)”技术通过共焦显微镜检查观察结合和内在化。在共焦显微镜图像中的T细胞的层显示为绿色圆圈，确认了FITC标记的嵌合pRNA/适体(CD4)与球形T细胞的结合(附图2-II)。使用各种对照物，包括CD4受体阴性D1细胞(附图24E、F、G、H、P)、没有CD4适体的荧光pRNA二聚体或pRNA三聚体(未显示)、和没有RNA的单独荧光染料(未显示)研究了适体的结合特异性，所有这些都产生了最小的荧光检测。CD4hi和CD4neg都内在化转铁蛋白-Texas红阳性对照，表明细胞胜任膜结合分子的内吞作用(附图24N)。
然后，还测试了携带受体结合叶酸的嵌合pRNA构建块的工程化。叶酸受体在各种类型的肿瘤中过量表达，已经用于特异性地递送治疗试剂到癌细胞(Zhao et al.，Adv.Drug Deliv.Rev.2004；56：1193-1204；Lu etal.，Adv.Drug Deliv.Rev.2002；54：675-693)。因而，结合叶酸的pRNA纳粒向叶酸受体的选择性靶向是靶向癌细胞的有用方法。携带pRNA和叶酸的嵌合RNA(叶酸-pRNA)通过将叶酸共价连接到pRNA的5′末端来工程化。叶酸-pRNA的特异性细胞结合通过使用FITC标记的叶酸-pRNA的流式细胞计来展现。当叶酸受体阳性人类鼻咽表皮癌细胞与这种双标记的pRNA孵育时，几乎所有的细胞是FITC阳性的。向孵育缓冲液添加游离叶酸降低了FITC阳性细胞到低于1％，表明pRNA与细胞的结合是特异性的和叶酸依赖性的。作为对照，没有叶酸结合的FITC标记的pRNA不展现结合。
2.嵌合三聚体形成中手牵手环体的序列要求的确定。
在左手和右手环体中野生型pRNA的碱基45-48和82-85分别被发现参与pRNA/pRNA相互作用(Guo et al.，Mol.Cell.1998；2：149-155；Trottier et al.，RNA 2000；6：1257-1266)。不考虑三级相互作用，在某些情况下在相互作用环体之间的仅两个G/C配对就可以容许pRNA多聚体的形成。当所有四个核苷酸配对时，至少一个G/C配对是所需的。容许最佳多聚体形成的两个环体之间的碱基配对的最大数目是五。在右手和左手环体中pRNA/pRNA相互作用所需的最小数量的核苷酸分别是五个和三个。我们的结果表明，75-核苷酸RNA片段，核苷酸23-97是pRNA三聚体形成中RNA/RNA相互作用中涉及的自身折叠的独立结构域，而核苷酸1-22和98-120对于RNA/RNA相互作用是可有可无的。
通过互锁的环体/环体相互作用的pRNA三聚体形成的基质被利用，用于建造携带受体结合RNA适体和/或治疗性siRNA的嵌合pRNA的三聚体(附图23)。单独的嵌合pRNA构建块被工程化来携带一个女儿RNA分子，例如siRNA或受体结合适体。每种构建块被有意地设计来具有特定的右手或左手环体，例如A-b′(右-左)来与其他构建块相互作用。测试了在形成三聚体中RNA的适当折叠的可能性和它们的能力。混合单独的嵌合pRNA与具有合适的互锁环体的对应配偶体引起了期望三聚体的有效形成，如通过凝胶电泳、AFM成像和蔗糖浓度梯度沉降法所证明的(附图25)。单体构建块在天然凝胶中更快地迁移，而由三种嵌合pRNA(A-b′)、(B-e′)和(E-a′)构成的三聚体复合物(附图23-III)在天然凝胶中更缓慢地迁移(附图25A)。这表明，尽管用ds-siRNA替换5′/3′螺旋或连接5′/3′末端到CD4结合适体，从单体构建块生成了RNA三聚体。根据pRNA嵌合体的正确折叠将确保同phi29原衣壳对pRNA结合位点的竞争性结合，并将阻断phi29复制期间的phi29DNA包装的发现，通过phi29体外组装抑制分析(Guo et al.，Science1987；236：690-694；Guo et al.，Mol.Cell.1998；2：149-155)，也确认了pRNA嵌合体的正确折叠。
3.用于构建携带siRNA的pRNA嵌合体的pRNA载体的长度要求的确定
如前所述，pRNA的分子间相互作用结构域和双链螺旋结构域独立地折叠(附图23)。只要保持了互补性，改变螺旋结构域的任何核苷酸的初级序列不影响pRNA结构和折叠。其他功能性RNA，例如锤头核酶，已经结合到双链结构域，产生了提高的核酶裂解效力。(Hoeprich et al.，Gene Therapy 2003；10(15)：1258-1267)
扩展的研究揭示，siRNA是双链的RNA螺旋(Li et al.，Science2002；296：1319-1321；Brummelkamp et al.，Science 2002；296：550-553；Jacque et al.，Nature 2002；418：435-438；Carmichael et al.，Nature2002；418：379-380；Elbashir et al.，Nature 2001；411L494-498)。为了测试是否可能用双链的siRNA替换pRNA螺旋区域、以及确定在基因沉默和三聚体形成中哪种构建体具有最佳的功能，构建了几种嵌合pRNA/siRNA，测试了它们在基因沉默方面的有效性。29-bp siRNA被连接到pRNA的核苷酸29/91或21/99，分别产生pRNA/siRNA(GFP)29/91和pRNA/siRNA(GFP)21/99。两个额外的尿嘧啶核苷插入到三向接点来增加这个区域对于RNase加工的柔性。如荧光显微镜检查揭示的，在通过短暂转染导入细胞之后，两种嵌合siRNA都显示了对GFP表达的显著抑制(附图26)。抑制作用是高度特异性的，因为在siRNA序列中具有突变的突变体嵌合pRNA/siRNA不展现任何抑制效果。
还构建了环状排列的pRNA嵌合体来携带siRNA。对于这些构建体，它们的5′/3′末端被重新定位在紧密折叠的区域内，因而不容易被核酸外切酶接近，从而提高了整个RNA的稳定性(Zhang et al.，Virology1995；207：442-451)。构建了两个环状排列的pRNA/siRNA嵌合体，具有位于原始pRNA的71/75或29/30位置处的新的5′/3′末端，称为pRNA/siRNA(GFP)71/75和pRNA/siRNA(GFP)29/30。pRNA/siRNA(GFP)29/30以比pRNA/siRNA(GFP)21/99低的效力沉默GFP表达，而pRNA/siRNA(GFP)71/75实际上对于沉默GFP表达没有作用(附图26)。
此外，还构建了携带荧光素酶的siRNA的嵌合pRNA(附图23)。双报告物分析表明，pRNA/siRNA(萤火虫)强烈地并特异性地抑制荧光虫荧光素酶蛋白的表达而不影响renilla荧光素酶表达。对于pRNA/siRNA(Renilla)还观察到特异性敲除。
4.展现三种pRNA嵌合构建块向一个细胞中的共同递送
a.通过共焦显微镜检查和流式细胞计展现共同递送。CD4是在T淋巴细胞的某些子集的表面展示的受体。在T辅助细胞中，除了当过量表达时，CD4通常不涉及内吞作用。(Pelchen-Matthews et al.，J.Exp.Med.1991；173：575-587)。生长取决于IL-7的鼠胸腺T淋巴细胞系D1(Kimet al.，J Immunol Methods 2003；274：177-184)被用作模型系统，用于测试经由CD4的特异性基因递送的效果。由于D1细胞是最小地表达CD4的不成熟的胸腺细胞，我们通过在含有L3T4(小鼠CD4)的哺乳动物表达载体存在的情况下在低渗缓冲液中电穿孔细胞来在D1细胞中过量表达鼠CD4。抗生素选择被用于筛选出整合，表达高水平的CD4的细胞(CD4hi)通过荧光活化的细胞分选(FACS)进一步选择。结果，超过99％的CD4hi细胞表达CD4受体。
为了测试这种RNA纳粒是否可以充当媒介物来同时地和特异性地递送多种治疗分子，由pRNA(A-b′)/适体(CD4)、pRNA(B-e′)/FITC和pRNA(E-a′)/罗丹明组成的三聚复合物(附图23，III-C)被制造，通过使用共焦显微镜检查的片段技术分析(附图24)。通过CD4hi细胞内荧光的检测展现了三聚体的结合以及三种嵌合构建块经由CD4结合向细胞中的共同进入(附图24，A-D&I-L)。这种结合和进入是特异性的，因为在CD4neg细胞上没有观察到荧光(附图24，E-H)。当使用FITC过滤器时，在CD4hi T淋巴细胞中绿色荧光标记是可见的(附图24，A&I)。当使用罗丹明过滤器时，在图像上可见红色标记，所述图像与CD4hi T淋巴细胞中的FITC标记重叠(附图24，B&J)。FITC图像与罗丹明图像的相似和叠盖(附图24，C&K)以及分别代表FITC和罗丹明的绿色和红色在细胞的相同位置上的共同显现，证实了三种嵌合pRNA构建块借助CD4结合RNA适体向特定细胞中的共同递送。这些结果表明，所有的pRNA构建块作为三聚体共同递送，phi29 pRNA三聚体可以充当有效的媒介物用于多种治疗成分的递送。
在制造的三聚体中三种组件的共同递送通过使用流式细胞计分析大量的细胞(30,000个细胞)来进一步确认(附图27-I)。在90-95％的CD4hi T细胞中FITC和罗丹明的双掺入表明了pRNA三聚体被群体中几乎所有的CD4表达细胞的成功摄取。
b.携带pRNA/siRNA(CD4)、pRNA/适体(CD4)和pRNA/FITC的共同递送的三聚体的功能分析。已经证明了pRNA三聚体的三种组件的共同递送(附图24)，必须的是测试pRNA三聚体的摄取是否引起由递送的组件介导的生物学效应。
孵育CD4hi和CD4neg D1 T细胞，而不用含有pRNA/siRNA(CD4)、pRNA/适体(CD4)和pRNA/FITC的构建块的pRNA三聚体转染(附图23)。掺入三聚体中的siRNA(CD4)的CD4表达抑制作用通过用PE标记的CD4抗体测量CD4的表面表达来展现。当评定FITC摄取时，CD4neg D1细胞没有摄取可检测数量的pRNA三聚体。这通过流式细胞计确认了(数据未显示)。相比之下，用pRNA三聚体处理的85％的CD4hi D1细胞是FITC阳性的(附图27-II)，表明CD4适体选择性地靶向CD4过量表达细胞并递送pRNA三聚体复合物。
然后，为了确定pRNA三聚体复合物递送的siRNA(CD4)是否产生CD4表面表达的减量调节，CD4hi D1细胞与三聚体孵育24小时，然后用与PE结合的抗CD4抗体染色并进行流式细胞计分析。从总细胞群体中门选(gate)FITC阳性和FITC阴性细胞(附图27-II)。FITC阴性细胞中的CD4水平被确定为42.56％，但是在FITC阳性CD4hi D1细胞中该水平降低到17.8％。因此，仅在FITC阳性细胞(85％的CD4hi D1细胞)而不是FITC阴性细胞(15％的CD4hi D1细胞)中CD4表达的水平被降低到这样的程度。这些发现表明，在CD4表达细胞中，pRNA三聚体被内在化，如pRNA/FITC的摄取所表明的，并且在沉默CD4基因方面是有功能的，如引起FITC阳性细胞中CD4蛋白表达降低的pRNA/siRNA(CD4)复合物的共同递送所表明的。
使用对照物的扩展的研究(附图27-III)表明，在附图27-II中所见的PE染色中CD4水平的降低特别地是由于pRNA三聚体中pRNA/siRNA(CD4)的基因沉默，而不是由于CD4结合触发的内在化，因为含有CD4适体的pRNA复合物不引起CD4降低，除非包括了CD4siRNA。
c.由CD4结合RNA适体指导的靶向抗细胞凋亡或前细胞凋亡因子的siRNA的共同递送的功能分析。为了评估优先的递送系统的有效性，携带靶向前细胞凋亡或抗细胞凋亡因子的siRNA的RNA纳粒被工程化。存活蛋白是在大多数正常的成年人类组织中不表达但在大多数人类癌症中表达的抗细胞凋亡因子(Grossman，Proc Natl Acad Sci2001；98：635-640；Ambrosini et al.，J Biol Chem 1998；273(18)：11177-11182；Choi et al.，Cancer Gene Ther.2003；10(2)：87-95)。测试pRNA/siRNA(存活蛋白)来评估诱导细胞凋亡作为杀死癌细胞的治疗手段的有用性。为了比较，设计和测试了靶向前细胞凋亡因子的嵌合pRNA/siRNA，所述前细胞凋亡因子例如BAD和BIM。通过防止细胞凋亡而不是诱导它，前细胞凋亡分析可以更清楚地确定嵌合pRNA复合物的递送是否产生非特异性毒性反应。为此，采用了两种细胞因子依赖性细胞系，IL-3依赖性前B细胞系(FL5.12A)，和CD4hi或CD4neg IL-7依赖性D1细胞系。IL-3或IL-7的退出可以分别促进D1或FL5.12A细胞系的细胞凋亡，并诱导FL5.12A细胞中BAD和BIM的表达。(Letaiet al.，Cancer Cell 2002；2：183-192；Zong et al.，Genes Dev.2001；15：1481-1486；Liu et al.，Cancer Res.2002；62：2976-2981；Simoes-Wust et al.，Breast Cancer Res Treat.2002；76(2)：157-166；Luzi etal.，Cancer Gene Ther.2003；10(3)：201-208；Kumar et al.，Science2002；297(5585)：1290-1291；Gibson et al.，Clin.Cancer Res20006：213-222；Khaled et al.，Nat.Rev.Immunol.2002；2：817-830)
RNA纳粒的扩展测试，包括单体(通过转染)、二聚体(通过转染或孵育)和三聚体(通过孵育)确认了由CD4结合RNA适体指导的pRNA复合物的特异性结合和进入。在转染后12、24、48和120小时进行annexinV-碘化丙锭(PI)双染色方法和随后的流式细胞计，确认了在MCF-7细胞中pRNA/siRNA(存活蛋白)的细胞凋亡诱导(数据未示出)。发现的是pRNA/siRNA(存活蛋白)和pRNA/siRNA(BIM)特异性和有效地沉默了它们的目标基因。此外，pRNA/siRNA(存活蛋白)的导入使得癌细胞和细胞因子依赖性细胞死亡，而pRNA/siRNA(BIM)的导入在不存在IL-3的情况下保护了IL-3依赖性细胞免于死亡(附图28)。
d.叶酸-pRNA指导的三聚体中的pRNA/siRNA(Renilla)或pRNA/siRNA(萤火虫)的共同递送。使用携带pRNA/siRNA(萤火虫或Renilla)的三聚体进一步展现了通过RNA纳粒转运的三种成分向特定细胞的共同递送。使用双报告分析，荧光素酶之一，例如renilla荧光素酶，将主动地充当另一种荧光素酶，例如荧光虫荧光素酶的内部对照。相互的内部对照可以通过消除可能的非特异性效果证明siRNA的特定活性。通过孵育在表面上表达叶酸受体的人类鼻咽癌细胞和三聚体，通过双分析系统展现了特定荧光素酶活性的降低，确认了叶酸-pRNA指导的三聚体进入细胞的特异性递送。
5.通过细胞成分或Dicer，嵌合pRNA/siRNA复合物成为单独的双链siRNA的作用机制、加工。
嵌合pRNA/siRNA复合物在细胞中起到类似于基因沉默中特异性siRNA的作用。这提出了重要的问题，嵌合的复合物被加工成单独的siRNA了么？为了解决这个问题，嵌合pRNA/siRNA单体或三聚嵌合体与细胞溶胞产物孵育(附图28A-D)，通过变性的凝胶来分析。这项研究中的单体携带29个核苷酸的双链siRNA，连接到从核苷酸29到91的三向接点(图28A)。两个额外的尿嘧啶核苷被添加到UUU分叉膨隆来通过提高用于环体折叠的ΔG帮助提高加工效率。与细胞溶胞产物孵育产生了大小等于29-核苷酸双链RNA的条带(附图28A、C泳道c-e)，表明如所预料的在细胞溶胞产物中被RNase裂解后siRNA被释放，因为单链的分叉膨隆比双链RNA对RNase消化更加敏感得多。
纯化的三聚嵌合体与对siRNA的加工负责的细胞成分纯化的Dicer的孵育，产生大小等于21核苷酸双链siRNA的条带，表明所述三聚体诱导的基因沉默效果实际上是由于细胞中Dicer的三聚体加工之后的siRNA。
6.动物试验表明RNA纳粒护送的治疗性pRNA/siRNA复合物向癌细胞的特异性递送。
进行动物实验来测试含有用叶酸标记的pRNA构建块和携带存活蛋白siRNA的pRNA构建块的pRNA复合物的递送方面的特异性。在无胸腺裸鼠中测试了这种RNA复合物抑制肿瘤形成的潜力。在通过腋窝注射导入裸鼠中之前，人类鼻咽表皮癌细胞与有或没有叶酸的嵌合RNA复合物孵育。仅接受癌细胞的小鼠在3周内发展出癌细胞，而接受用含有叶酸-pRNA和pRNA/siRNA(存活蛋白)的pRNA复合物预先处理的癌细胞的小鼠的组没有发展癌细胞(附图29)。肿瘤形成的抑制作用是特异性的，因为没有叶酸的对照RNA复合物或含有存活蛋白siRNA中的突变的RNA复合物在其他小鼠组中不影响肿瘤发展。
讨论
我们报道了，经由编程的螺旋区域和环体的相互作用，phi29 pRNA可以被随意地工程化和制造以形成各种结构和形状，包括双体(twins)、四聚体、棒、三角形和阵列大小从nm到微米的阵列(Shu et al.，J Nanosciand Nanotech(JNN)2003；3：295-302；Shu et al.，Nano Letters2004；4：1717-1724)。这样制造的RNA纳粒可以容纳具有可控制的化学计量的各种RNA构建块，从一个、两个、三个或六个拷贝直到数千个拷贝。这种系统的优点在于构建块的大小、形状和化学计量以及最终产物能够被操作和控制。多样性和种类的特征使得这种RNA纳粒能够携带多价治疗分子来提高治疗效力。使用一种复合物来进行几个分子的作用将解决对特定的治疗策略开发多种因子的难题。我们在此报道了使用pRNA三聚体形式的机制的三种组件的共同递送。在六聚复合物中六种组件的共同递送也是可能的，因为pRNA也形成六聚体(Guo et al.，Mol.Cell.1998；2：149-155；Zhang et al.，Mol.Cell.1998；2：141-147；Hoeprich etal.，J Biol.Chem.2002；277(23)：20794-20803)。可递送RNA复合物的一个构建块可以被修饰以携带结合特定细胞表面受体的RNA适体，从而诱导受体介导的内吞作用。六聚体的第二构建块将携带重金属、量子点、荧光珠子、或放射性同位素用于癌症检测。六聚体的第三个构建块将被改变以携带组件，所述组件将用于提高内涵体破坏从而释放治疗分子。RNA复合物的第四和第五个构建块将携带要递送的治疗性siRNA、核酶RNA、反义RNA或其他药物。六聚体的第六个构建块将被设计以容许细胞凋亡的检测。核苷酸衍生物例如2′-F-2′脱氧CTP、2′-F-2′脱氧UTP或spiegelmer将被掺入RNA来产生对RNase消化有抗性的稳定的体外RNA转录产物。
除了癌症治疗之外，这种多价RNA复合物也可以用于治疗慢性病毒感染，例如由HIV和HBV(乙型肝炎病毒)引起的那些，通过靶向被包括在受感染细胞的细胞表面的特异性病毒糖蛋白。不产生损坏健康细胞的严重副作用的特异性识别方法的开发将显著地改善HIV、HBV和其他相关的慢性和潜伏性疾病的治疗。RNA是唯一适合于慢性疾病的，因为它具有低的或不可检测的抗原性(Goldsby et al.Antigens.InImmunology，5th ed.；W.H.Freeman and Company：New York，2002；57-61；Madaio et al.，J.Immunol.1984；132：872-876)。这种30-或40-nm RNA复合物的使用将提供比其他小分子所提供的更长的体内周转时间。
实施例12.经由Phi29引擎pRNA的二聚作用机制、治疗剂向细胞的特异性递送
小RNA在治疗中的应用已经被缺乏有效和安全的递送系统以靶向特定细胞阻碍。使用RNA纳米技术来操作噬菌体phi29的引擎pRNA以产生经由互锁右手和左手环体形成二聚体的嵌合RNA。融合pRNA与受体结合RNA适体、叶酸、siRNA、核酶或其他化学基团不干扰二聚体形成或不干扰插入的部门的功能。pRNA二聚体的一个亚单位携带受体结合部分、另一个携带基因沉默分子，细胞与所述pRNA二聚体的孵育引起它们的结合并进入癌细胞，并随后沉默抗前细胞凋亡基因。发现嵌合pRNA复合物被Dicer加工成功能性的双链siRNA。动物试验确认了通过体外递送的癌细胞肿瘤发生抑制。这种无蛋白的30nm纳粒将容许重复的长期施用和避免低于30nm的小分子的短滞留时间、以及大于100nm的颗粒的不可递送性的难题。
我们发现，编码117-nt噬菌体phi29的RNA(pRNA)在将DNA包装到原衣壳中起到新的和重要的作用(附图30)(Guo et al.(1987)，Science，236，690-694)。pRNA的六个拷贝形成六聚环来驱动DNA包装引擎(Trottier & Guo(1997)，J Virol，71，487-494；Guo et al.(1998)，Mol Cell，2，149-155；Zhang et al.(1998)，Mol Cell，2，141-147)。pRNA二聚体是六聚体的构建块(Chen et al.(2000)，J Biol Chem，275(23)，17510-17516)。右和左互锁环体的手牵手相互作用可以被操作来产生期望的稳定的二聚体、三聚体或六聚体(Guo et al.(1998)，Mol Cell，2，149-155；Zhang et al.(1998)，Mol Cell，2，141-147；Chen et al.(1999)，RNA，5，805-818；Shu et al.(2003)，J Nanosci and Nanotech(JNN)，3，295-302)。pRNA二聚体的大小是约30nm(Hoeprich&Guo(2002)，JBiol Chem，277(23)，20794-20803；Shu et al.(2004)，Nano Letters，4，1717-1724)。我们近期的工作表明，RNA、特别是pRNA可以充当构建块来经由底部朝上组装构建纳米材料(Shu et al.(2004)，Nano Letters，4，1717-1724)。phi29 pRNA的结构和分子特征容许它容易操作，使得可能重新设计它的部分作为基因靶向和递送工具。pRNA分子含有分子间相互作用结构域和5′/3′螺旋结构域(附图30)(Zhang et al.(1995)，RNA，1，1041-1050；Garver et al.(1997)，RNA，3，1068-1079；Chen et al.(1999)，RNA，5，805-818；Chen et al.(2000)，J Biol Chem，275(23)，17510-17516)。5′/3′螺旋结构域的替换或插入不干扰二聚体形成(Chenet al.(1999)，RNA，5，805-818)。
通过构建嵌合pRNA二聚体测试了这些思想的可能性。二聚体的一个亚单位含有受体结合RNA适体或叶酸用于细胞识别，另一个携带siRNA、核酶或化学基团的部分。所述二聚体被递送给特定细胞来沉默GFP、荧光素酶和各种癌细胞中BCL-2家族的前/抗细胞凋亡成员的基因。
材料和方法
RNA的体外合成和物理表征
如所描述的(Zhang et al.(1995)，RNA，1，1041-1050)制备RNA，使用期望的序列合成DNA寡聚物，并用于通过PCR产生双链DNA。含有T7启动子的DNA产物被克隆到质粒中，或作为底物用于指导体外转录。通过小牛肠碱性磷酸酶(CIP)处理所有pRNA嵌合体来除去5′磷酸并消除PKR和干扰素影响(Kim et al.(2004)，Nat Biotechnol，22，321-325)，或在存在SH-AMP、Biotin AMP或CoA的情况下合成。已经描述了电泳和低温-AFM的方法(Chen et al.(2000)，J Biol Chem，275(23)，17510-17516；Shu et al.(2003)，J Nanosci and Nanotech(JNN)，3，295-302)。10mM的镁被包括在所有缓冲液中来维持pRNA的折叠和二聚体的形成(Chen et al.(2000)，J Biol Chem，275(23)，17510-17516；Mat-Arip et al.(2001)，J Biol Chem，276，32575-32584)。
单体的嵌合pRNA亚单位的转染分析
对于果蝇S2细胞，各种siRNA和GFP编码质粒pMT-GFP使用Cellfectin(Invitrogen)在24孔平板中共转染。GFP的表达通过与0.5mM的CuSO4过夜孵育来诱导。(Li et al.(2002)，Science，296，1319-1321)。
对于单体pRNA/siRNA的荧光素酶分析，各种嵌合siRNA与编码荧光虫荧光素酶的质粒DNA pGL3和编码Renilla荧光素酶的pRL-TK(Promega)共转染到小鼠成纤维细胞PA317-PAR细胞中。在转染后一天在双报告物分析系统(Promega)中测量荧光素酶活性。
对于存活蛋白敲除分析，使用Lipofectamine2000(Invitrogen)在24孔平板中以20pmol每孔用各种RNA转染MDA-231、PC-3、A-549、T47D和MCF-7细胞。第二天，在相差显微镜下观察细胞并根据生存力计分。
对于proB FL5.12A细胞，将107个细胞重悬浮在具有10％FBS的500μl RPMI1640中。对于D1细胞，细胞重悬浮在低渗透缓冲液中。使用Electro Square Porator ECM 830进行电穿孔。在200V、3次脉冲对FL5.12A细胞进行电穿孔，D1细胞在180V、1次脉冲。在冰水短期孵育之后，细胞重悬浮在具有细胞因子的10ml完全培养基中并孵育2小时。在用Mirus试剂转染之前通过台盼蓝分析测量细胞生存力。106个细胞与RNA构建体(100nM)孵育过夜，用Hanks’平衡盐溶液洗涤两次，在有或者没有细胞因子的培养基中孵育另外24到48小时。
通过Dicer的嵌合pRNA/siRNA加工
嵌合siRNA在37℃与纯化的重组Dicer(Gene Therapy Systems，Inc.)孵育2小时。使用T4多核苷酸激酶(NEB)在5′末端用[32P]标记RNA。携带CD4适体和存活蛋白siRNA的嵌合pRNA二聚体的功能分析
CD4hi、CD4lo和CD4neg细胞接种到96孔平板中。每份样品5×104个细胞洗涤一次。细胞与100nM RNA二聚体孵育30分钟。在清洗之后，细胞进一步孵育24或48小时，有或者没有细胞因子。通过台盼蓝分析测量细胞生存力。
通过共焦显微镜检查的CD4受体结合分析
D1细胞在具有10％FBS、具有青霉素/链霉素50U.I每ml、0.1％β-巯基乙醇和50ng/ml IL-7的RPMI1640中生长。FL5.12A细胞在补充有2ng/ml IL-3的完全培养基中生长。对于CD4在D1中的表达，L3T4(小鼠CD4)插入物被亚克隆到pcDNA 6/V5-HisB(Invitrogen)中。通过抗生素抗性选择稳定的系。表达高水平CD4的D1-CD4细胞进一步通过FACS来分离。D1-CD4细胞系维持在补充有50ng/mlIL-7和杀稻瘟菌素(Blasticidin)HCl(2.5mg/ml)的完全培养基中。包被有聚-L-赖氨酸(200μg/ml)的盖玻片与细胞孵育过夜。在固定之前，清洗具有细胞的盖玻片，在二聚RNA复合物的65nM溶液中处理30分钟。具有细胞的盖玻片用4％多聚甲醛固定，装在Gel/MountT(Biomeda，CA)上。通过Zeiss共焦显微镜LSM 510 NLO捕获图像。
叶酸受体介导的特异性基因敲除
通过混合叶酸-pRNA(7-106)B-a′和pRNA/siRNA(荧光虫荧光素酶)A-b′与10mM Mg2+来制备叶酸二聚体。KB细胞在无叶酸培养基中接种到6孔平板中。在补充有MgCl2的PBS洗涤之后，然后将预混合的二聚体RNA(1.75uM)添加到细胞并在37℃孵育3h。RNase抑制物SUPERRNaseIN(1单位/μl)(Ambion)添加到结合缓冲液中。在孵育之后，洗去游离RNA，使用Lipofectamine 2000(Promega)将pGL3和pRL-TK质粒导入细胞。第二天测量荧光素酶活性。
双标记和流式细胞计
用100nM浓度的RNA样品转染MCF-7细胞。通过annexin V和PI染色细胞，随后是流式细胞计分析。左上、右上、左下和右下区域分别代表破坏的细胞、坏死的细胞、活细胞和细胞凋亡的细胞。
动物研究
无病原体雄性5周龄无胸腺裸鼠(Harlan Sprague Dawley，Indianapolis)安置在无特定病原体的环境中。食物供给和仪器高压灭菌，所有操作在层流通风橱中进行。动物随机分配到实验组(n＝8)。在前肢的右侧腋窝皮下地接种细胞。通过在两维上外部测量肿瘤尺寸每周两次测定异种移植物大小。通过以下公式计算体积：V＝(L×W2)×0.5，其中L是长度，W是异种移植物的宽度。
RNA亚单位的命名：
为了简化RNA复合物的构建中的描述，分别使用大写字母和小写字母来代表pRNA的右手和左手环体(附图30A)。匹配的字母代表互补环体，而不同的字母代表非互补环体。例如，pRNA(A-b′)含有右手环体A(5’G45G46A47C48)和左手环体b′(3’U85G84C83G82)，其分别与pRNA(B-a′)的左手环体a′(3’C85C84U83G82)和右手环体B(5’A45C46G47C48)配对(附图30)。pRNA/适体(CD4)代表携带结合CD4的适体的pRNA嵌合体，和pRNA/siRNA(GFP)代表携带靶向绿色荧光蛋白(GFP)的siRNA的pRNA嵌合体。pRNA/核酶(存活蛋白)代表携带针对存活蛋白的锤头核酶的嵌合pRNA。
1.携带外源部分的嵌合pRNA亚单位的构建
a.携带siRNA的嵌合pRNA的构建
pRNA含有5′/3′末端的双链螺旋结构域和分子间结合结构域，其相互独立地结合。互补修饰研究揭示了改变螺旋区域的任何核苷酸的初级序列不影响pRNA结构和折叠，只要两条链是配对的(附图30)(Zhanget al.(1994)，Virology，201，77-85)。扩展的研究揭示，siRNA是双链的RNA螺旋(Elbashir et al.(2001)，Nature，411，494-498；Li et al.(2002)，Science，296，1319-1321；Brummelkamp et al.(2002)，296，550-553；Carmichael(2002)，Nature，418，379-380)。为了测试是否可能用双链siRNA替换pRNA中的螺旋区域，构建了具有不同目标的各种嵌合pRNA来携带连接到pRNA的核苷酸#29和91的siRNA(附图30)，产生pRNA/siRNA(GFP)、pRNA/siRNA(荧光素酶)、pRNA/siRNA(BAD)和pRNA/siRNA(存活蛋白)。
b.携带受体结合适体或核酶的嵌合pRNA的构建
为了实现治疗复合物的特异性递送，常常需要包括识别细胞表面的标志分子的部分。与抗体和噬菌体展示肽相比，RNA适体是吸引人的选择，因为它避免了诱导免疫反应(Goldsby et al.(2002)，Antigens.Immunology，W.H.Freeman and Company，New York，pp.57-61)。使用SELEX方法，已经获得了许多特异性识别特定细胞表面受体例如CD4的适体RNA适体(Kraus et al.(1998)，J Immunol，160，5209-5212)。选择一种CD4结合RNA适体来经由相互的5′/3′末端连接来构建嵌合pRNA/适体(CD4)(附图30D)。pRNA载体被工程化和重新组织成环状排列的形式，具有分别重新定位到原始pRNA序列的残基#71和75的新生5′和3′末端。71/75末端位于紧密折叠的区域(Hoeprich&Guo(2002)，J Biol Chem，277(23)，20794-20803)，包埋了末端并保护末端免于体内核酸外切酶降解(Hoeprich et al.(2003)，Gene Therapy，10(15)，1258-1267)。根据相似的规则来构建嵌合pRNA/核酶(存活蛋白)。
c.携带叶酸的嵌合pRNA的构建
叶酸受体在各种类型的肿瘤例如人类鼻咽表皮癌中过量表达，但在正常的成年人组织中一般是缺乏的。许多治疗试剂例如低分子量药物、反义寡核苷酸和蛋白毒素已经结合到叶酸然后被递送给肿瘤细胞(Sudimack et al.(2000)，Adv Drug Deliv Rev，41，147-162；Lu et al.(2003)，J Control Release，91，17-29)。在这项研究中采用相同的策略来递送siRNA到叶酸受体过量表达肿瘤细胞。将叶酸分子掺入RNA的5′末端，并与pRNA/siRNA嵌合体形成二聚体来实现特异性递送(附图30D)。为了提高叶酸分子对细胞表面的叶酸受体的可接近性，设计叶酸标记的RNA是5′突出的，其中pRNA的核苷酸#107到117是截短的。
2.通过Dicer的嵌合pRNA/siRNA复合物变成双链siRNA的加工
为了回答嵌合复合物是否可以被加工成功能siRNA的问题，嵌合pRNA/siRNA经历纯化重组Dicer的处理，纯化的重组Dicer在体外和体内加工长的双链RNA成22bp siRNA的功能是公知的。在这项研究中用作底物的嵌合pRNA/siRNA复合物研究29-bp双链siRNA，连接到pRNA内分子间相互作用结构域的核苷酸29到91。使用两个额外的尿嘧啶核苷来连接siRNA到pRNA结构域以通过提高用于环体折叠的ΔG帮助提高加工效率。纯化的嵌合pRNA/siRNA复合物在5′末端用[32P]标记，并与Dicer孵育，然后通过变性的PAGE/Urea分析消化产物。如附图31所示，pRNA/siRNA被Dicer消化30分钟到2小时引起高效率的22碱基siRNA的产生。这个结果确认了，嵌合pRNA/siRNA被裂解并释放位于5′/3′末端的功能性双链siRNA。
3.通过转染的嵌合pRNA亚单位功能分析
a.pRNA/siRNA(GFP)
为了测试pRNA/siRNA(GFP)的功能，GFP表达质粒与各种RNA嵌合体共转染到细胞中。荧光显微镜检查揭示了pRNA/siRNA(GFP)以剂量依赖性方式有效地抑制GFP基因表达(附图32A)。相比之下，使用含有siRNA序列内的定点突变的对照构建体没有观察到这种抑制效果。pRNA载体的非特异性抑制通过使用单独载体(核苷酸#18-99)的对照(附图32B)排除了。基因沉默在mRNA水平上的效果通过Northern印迹进一步证明(附图32D)。在两种分析中，嵌合pRNA/siRNA(GFP)展现了与化学合成的双链siRNA(GFP)相比相等的或优越的对GFP基因表达的抑制效果(附图32C和D)。
b.pRNA/siRNA(荧光素酶)
除了GFP特异性嵌合siRNA之外，还构建和测试了针对荧光素酶的pRNA/siRNA构建体。靶向荧光虫荧光素酶或renilla荧光素酶的两种嵌合pRNA/siRNA构建体在独立的实验中通过短暂转染导入细胞中，然后同时地通过双报告物分析来测量两种荧光素酶的表达水平。当检查目标荧光素酶时，非目标荧光素酶充当内部对照。如附图33A中所示，发现每种构建体有效地和特异性地抑制它的目标基因。当将突变导入pRNA复合物的siRNA中时，没有发生荧光素酶基因的沉默。此外，发现pRNA/siRNA(萤火虫)的沉默效果比单独的发夹siRNA(萤火虫)更有效(附图33B)。
c.pRNA/siRNA(存活蛋白)和pRNA/核酶(存活蛋白)敲除抗细胞凋亡因子存活蛋白并启动细胞死亡
为了评估治疗性RNA分子在治疗癌症中的有效性，必需抑制涉及肿瘤发育和发展的基因。选择存活蛋白作为目标，因为它抑制细胞凋亡，并仅在癌细胞中而不在正常的成年人细胞中检测到。已经显示了，存活蛋白的抑制诱导癌细胞的细胞凋亡(Grossman et al.(2001)，Proc NatlAcad Sci，98，635-640)。
首先在乳腺和前列腺癌细胞中检查pRNA/siRNA(存活蛋白)的功能和特异性。使用annexin V-碘化丙锭(PI)双染色和随后的流式细胞计分析来评定用pRNA/siRNA(存活蛋白)转染的乳腺癌细胞的细胞凋亡。如附图34-I-B所示，与作为阴性对照用突变的嵌合siRNA或5S RNA处理的细胞(附图34-I-A、C和D)相比，用pRNA/siRNA(存活蛋白)转染的细胞在代表细胞凋亡细胞的右下区域以更高得多的百分比显示。还在乳腺癌细胞系MDA-231和前列腺癌细胞系PC-3中通过细胞形态学研究评估了嵌合siRNA对细胞存活率的影响。在转染之后，大部分细胞缩小，并从细胞培养平板分离，而对照pRNA/siRNA(突变)不诱导细胞死亡(附图34-II)。
还测试了pRNA/核酶(存活蛋白)的敲除效果。当用pRNA/核酶(存活蛋白)转染数种人类癌细胞系时，超过80％的细胞在转染后24小时死亡(附图35A)。Western印迹分析揭示了在转染之后存活蛋白蛋白表达被嵌合RNA有效地敲除(附图35B)。相比之下，当仅与癌细胞孵育时，在缺乏转染试剂的情况下pRNA/siRNA(存活蛋白)或pRNA/核酶(存活蛋白)不引起细胞死亡达到72小时(附图35C)。这表明，嵌合pRNA在孵育时不显示非特异性细胞毒性。然而，当通过转染导入细胞时，针对存活蛋白的嵌合siRNA或核酶可以特异性地沉默存活蛋白基因并引起细胞死亡。
d.pRNA/siRNA(BAD)沉默前细胞凋亡因子并防止细胞死亡
通过敲除抗细胞凋亡因子诱导细胞死亡将是癌症治疗中理想的，但是它可能不足以表现RNA递送策略的特异性，因为细胞死亡可能潜在地起因于非特异性效果，如果有发生的话。为了排除非特异性细胞毒性的可能性，选择Bcl-2家族中的前细胞凋亡因子BAD(Khaled et al.，(2001)，J Biol Chem，276，6453-6462)作为目标，因为沉默前细胞凋亡因子将防止细胞凋亡而不是引起细胞死亡(Kumar et al.(2002)，Science，297，1290-1291)。因此，来自siRNA的敲除效果可以从RNA组件的非特异性毒性区分开来。为此，采用IL-3依赖性前B细胞系FL5.12A。IL-3的退出可以诱导BAD的表达，导致FL5.12A细胞的细胞凋亡(Khaled et al.(2002)，Nat Rev Immunol，2，817-830)。构建pRNA/siRNA(BAD)并导入前B细胞系中，Western印迹表明，与未处理的细胞相比，存在着BAD蛋白的显著降低(附图36B)，而突变的对照物和pRNA载体单独地仅引起BAD蛋白的微小降低。生存力分析揭示了pRNA/siRNA(BAD)的转染在IL-3消除时保护了FL5.12A细胞免于死亡，并且在存在IL-3的情况下不引起细胞死亡(附图36A)。这些结果表明，嵌合pRNA/siRNA可以特异性地沉默目标的前细胞凋亡基因的表达并防止生长因子退出诱导的细胞死亡。相比之下，与突变的嵌合siRNA对照物相比，在存在IL-3的情况下细胞死亡被pRNA/siRNA(存活蛋白)诱导，在IL-3退出时加剧(附图36C)。
4.由携带单独的功能亚单位的嵌合亚单位组成的pRNA二聚体的组装
有效的基因治疗需要至少两个特征：特异性细胞识别和细胞中特定基因的沉默。具有两种功能的RNA分子的构建将满足这些要求，但是一种RNA与两种或多种部分的直接融合或结合可能引起错误折叠和功能的丧失。RNA二聚体的构建是实现这两个目标的可选择的方法。
phi29 pRNA的广泛研究揭示了，两个pRNA亚单位通过pRNA单体的互补的左手和右手环体的相互作用形成二聚体。二聚体的可延伸的5′/3′末端提高了两个独立的位点来携带额外的序列而不改变pRNA载体或插入的序列的二级结构(Shu et al.(2004)，Nano Letters，4，1717-1724)。因而利用二聚体形成机制来构建RNA复合物以递送功能部分，用于1)受体结合RNA适体或叶酸介导的特异性识别；和2)siRNA或核酶介导的细胞功能(生长、死亡、生理机能，等等)的调节。
对分子间pRNA/pRNA相互作用负责的序列位于残基23-97之间(Chen et al.(1999)，RNA，5，805-818)。有意地设计嵌合的单体亚单位来具有A-b′或B-a′以相互匹配。当在存在10mM Mg2+的情况下pRNAA-b′和B-a′以1∶1摩尔比混合时，以高效率产生siRNA二聚体，如通过凝胶电泳和低温AFM成像所确认的(附图30C)。在AFM图像中，单体展现了对勾形状，二聚体是单体的两倍大。数据表明，尽管用双链siRNA替换5′/3′螺旋或连接5′/3′末端到适体或核酶，从单体亚单位生成了二聚体。如早先报道的，通过phi29体外组装抑制分析也确认了pRNA嵌合体的正确折叠(Guo et al.(1987)，Science，236，690-694；Guo et al.(1998)，Mol Cell，2，149-155)。
5.通过孵育的嵌合pRNA二聚体的功能分析
a.含有CD4适体的嵌合pRNA的结合分析
CD4是在某些T淋巴细胞的表面展示的受体。从通常表达不可检测的水平的内源CD4的鼠IL-7依赖性proT细胞系D1(称为CD4low)(Kimet al.(2003)，J Immunol Methods，274，177-184)开发CD4过量表达T细胞系(称为CD4hi)。CD4hi细胞与由pRNA(A-b′)/适体(CD4)和pRNA(B-a′)/FITC组成的RNA二聚体的孵育揭示了强的和特异性的结合(附图37I)，因为在没有CD4表达的FL5.12A细胞中(附图37-I-c)，或用没有适体(CD4)的FITC-二聚体(数据未显示)没有检测到结合。
b.与携带适体(CD4)和siRNA(存活蛋白)的二聚体孵育
RNA二聚体介导的基因递送的策略是，受体结合部分介导细胞识别和随后的内在化，然后siRNA被释放以减量调节特定基因。含有pRNA/siRNA(存活蛋白)和pRNA/适体(CD4)的二聚体与具有不同水平的CD4表达的细胞孵育。CD4hi细胞最强烈地响应pRNA二聚复合物，其显示了在存在IL-7的情况下细胞生存力方面超过30％的降低。在IL-7消除后，与CD4阴性FL5.12A细胞相比，D1 CD4low和CDHi都展现了严重的细胞死亡。细胞死亡的水平与CD4的表达水平相关。这些结果表明，存活蛋白siRNA的CD4介导的进入引起了细胞生存力的抑制，并且，这种效果取决于细胞表面上CD4分子的水平。
c.与叶酸结合的嵌合pRNA的结合分析
pRNA/叶酸单体的特异性细胞结合通过流式细胞计表现(附图38A)。当具有内源过量表达的叶酸受体的人类鼻咽表皮癌细胞与FITC-pRNA/叶酸孵育时，97.3％细胞是FITC阳性的。作为阻断试剂添加游离叶酸到孵育缓冲液中降低了FITC阳性细胞到仅仅0.7％(附图38A)，表明pRNA与细胞的结合是特异性的并取决于叶酸受体。没有叶酸结合的FITC标记的pRNA不展现结合。
还通过使用放射性标记的RNA展现了使用叶酸来携带二聚siRNA嵌合体的可能性。首先，通过在存在Mg2+的情况下混合等量的pRNA(A-b′)和[H3]-pRNA(B-a′)来产生RNA二聚体。与没有叶酸标记的对照二聚体相比，叶酸二聚体显示了更强得多的结合(附图38B)。当游离叶酸作为阻断试剂被包括时，叶酸标记的异二聚体RNA与细胞的结合减少。
d.在通过孵育向细胞递送之后pRNA/siRNA(萤火虫或renilla)的功能分析
在展现了针对荧光素酶的嵌合siRNA的特异性敲除(结果3-b)和叶酸标记的二聚体的特异性结合(结果5-c)之后，进一步研究了通过孵育的基因沉默效果。为了确定嵌合siRNA向叶酸受体过量表达细胞的叶酸介导的靶向是否可以引起RNA复合物的进入和特定基因的敲除，由pRNA/siRNA(萤火虫)和pRNA/叶酸组成的二聚体与叶酸受体阳性KB细胞孵育，以容许叶酸介导的RNA的结合和进入。双分析揭示了在孵育之后荧光虫荧光素酶方面的显著降低(附图38C)。相反地，没有叶酸标记的对照RNA不显著地影响目标蛋白表达。当renilla荧光素酶用作内部对照时，这些了二聚体中pRNA/siRNA(萤火虫)的特异性。
6.通过针对存活蛋白的嵌合siRNA的体外递送展现癌细胞的肿瘤发生学的特异性抑制的动物试验
通过使用含有pRNA(A-b′)/叶酸和pRNA(B-a′)/siRNA(存活蛋白)的二聚体的体外递送，进行动物试验来测试特异性。在无胸腺裸鼠中测试了这种RNA二聚体抑制肿瘤形成的潜力。在通过腋窝注射导入裸鼠中之前，人类鼻咽表皮癌(KB)细胞与有或没有阻断试剂游离叶酸的二聚RNA孵育。接受单独的细胞的小鼠在3周内发展出肿瘤，而接受用具有pRNA(A-b′)/叶酸和pRNA(B-a′)/siRNA(存活蛋白)的二聚体预先处理的细胞的小鼠都没有发展肿瘤(表3)。肿瘤形成的抑制作用是特异性的，因为在对照小鼠组中使用的没有叶酸结合的对照二聚体RNA不影响肿瘤发展。
表3.在表皮癌症治疗方面的动物试验a
处理组                            癌症动物的数量/
                                  测试的动物的数量
1.无pRNA                          4/8
2.二聚体[叶酸-pRNA(B-a′)+        0/7
pRNA/siRNA(存活蛋白)(A-b′)]
3.二聚体[pRNA(B-a′)+             7/8
pRNA/突变-siRNA(A-b′]
4.二聚体[pRNA(B-a′)+             6/8
pRNA/siRNA(存活蛋白)(A-b′)]
aKB细胞维持在无叶酸培养基RPMI 1640中。在用于动物注射之前，细胞与pRNA复合物预孵育3小时。在用含有10mM MgCl2的PBS洗涤两次之后，细胞收集到离心管中。用0.1mL培养基中的2.5×103个细胞接种每只小时。显示的是接受肿瘤异种移植以及嵌合pRNA复合物的小鼠的体内测试的结果。组2中的一只小鼠在1周内产生斑块，大大早于任何组中的任何其他小鼠，因而得到这种特殊情况，它被认为是非正常的，对于组2记录了七只小鼠而不是八只。
讨论
作为每个pRNA的互锁环体的相互作用的结果，Phi29 pRNA具有形成二聚体的倾向，所述二聚体是六聚体的构建块(附图39)。这个底稿展现了二聚体的产生，以递送治疗性RNA到特定细胞。将来，嵌合的六聚体也可以经由手牵手相互作用来组装。因而，由于在六聚体中存在六个嵌合pRNA，将有六个位置可用于携带用于细胞识别、治疗和检测的分子。除了受体结合适体之外，在此报道的siRNA、核酶和叶酸，其他材料例如荧光染料、重金属、量子点、荧光珠子或放射性同位素也可以结合用于在不同的发展阶段癌症标志的检测。结合叶酸和FITC的报道的方法可以用于化学药物的结合，可以添加内涵体破坏性化学物质以促进递送之后siRNA从内涵体释放来改善治疗效力(附图39)。核苷酸衍生物例如2′-F-2′脱氧CTP、2′-F-2′脱氧UTP或Spiegelmer将被掺入RNA来产生对RNase消化有抗性的稳定的体外RNA转录产物(Soutschek et al.(2004)，Nature，432，173-178)。
这种多价RNA复合物也可以潜在地用于治疗慢性病毒感染，例如由HIV和乙型肝炎病毒引起的那些，通过靶向被包括在受感染细胞表面的特异性病毒糖蛋白。在科学界很好地确立了的是，除了与蛋白复合时，RNA不诱导可检测的免疫反应(Madaio et al.(1984)，J Immunol，132，872-876；Goldsby et al.(2002)，Antigens.Immunology，W.H.Freeman andCompany，New York，pp.57-61)。RNA作为递送工具的使用可以避免在重复长期药物施用之后免疫反应和蛋白载体的排斥的难题。这种30-40纳米RNA复合物的使用将提供比其他小分子所提供的更长的体内周转时间。
实施例13.用于嵌合siRNA向鼻咽癌细胞的递送的、叶酸结合的噬菌体Phi29引擎pRNA的构建
鼻咽癌是高度表达hFR(人类叶酸受体)的分化不良的上呼吸道癌症。叶酸与hFR的结合触发内吞作用。叶酸通过1，6-己二胺键结合到AMP。在反相HPLC达到93％纯度之后，仅可以用于转录起始而不能用于链延伸的叶酸-AMP被掺入到phi29引擎pRNA的5′末端。在转录中16∶1比例的叶酸-AMP比ATP产生超过60％的含叶酸pRNA。需要具有5′突出的pRNA来提高5′叶酸对特异性受体结合的可接近性。利用工程化的左/右互锁环体，使用RNA纳米技术构建多价二聚pRNA纳粒来携带叶酸、检测标记物和靶向抗细胞凋亡因子的siRNA。嵌合pRNA复合物被Dicer加工成ds-siRNA。鼻咽表皮癌(KB)细胞与二聚体的孵育引起它对癌细胞的进入和随后目标基因的沉默。这种具有低抗原性的无蛋白质的RNA纳粒具有对于鼻咽癌重复长期施用的潜力，因为通过动物实验中的体外递送确认了有效性和特异性。
引言
发现了编码117-nt噬菌体phi29的RNA(pRNA)在DNA包装中起到新的和重要的作用(Guo et al.，Science 1987；236：690-694)。通过右和左互锁环体的手牵手相互作用，pRNA形成二聚体、三聚体，最终形成六聚体(Guo，Prog Nucl Acid Res Moe Biol 2002；72：415-472；Shu et al.，Nano Letters 2004；4：1717-1724)。已经广泛地研究的pRNA的结构特征容许容易的操作，并允许pRNA转变成基因靶向和递送工具。pRNA分子含有具有不同功能的两个独立折叠的结构域(Guo，Prog Nucl AcidRes Mol Biol 2002；72：415-472；Zhang et al.，Virology 1994；201：77-85)。在残基#23之前或残基#97之后核苷酸的替换或插入不影响二聚体的形成，只要链是配对的(Chen et al.，RNA 1999；5：805-818)。因此pRNA的5′/3′近双链螺旋区域(Zhang et al.m RNA 1995；1：1041-1050)可以被重新设计来携带其他的序列而不改变它的二级结构或分子内相互作用(Hoeprich et al.，Gene Therapy 2003；10(15)：1258-1267；Shu et al.，JNanosci and Nanotech(JNN)2003；3：295-302)。
作为人类上呼吸道的分化不良的癌，鼻咽癌具有在KB细胞中高度表达的人类叶酸受体(hFR)。通过叶酸与hFR结合介导的配体/受体复合物内吞作用已经被很好地研究，结合到叶酸的大分子已经成功地被叶酸受体结合并内在化到细胞中(Lee et al.，J Biol Chem1994；269：3198-3204；Mathias et al.，J Nucl Med 1996；37：1003-1008；Benns et al.，J Drug Target 2001；9：123-139)。近来，我们发现phi29 pRNA可以用作载体用于RNA纳粒的构建，以递送治疗RNA，例如siRNA和/或核酶到特异癌细胞。(Shu et al.，Nano Letters 2004；4：1717-1724；Guo et al.，Human Gene Therapy 2005；16：1097-1109[实施例12]；Khaledet al.，Nano Letters 2005；5：1797-1808[实施例11])在这个报告中，我们描述了叶酸-AMP的合成和纯化的方法、构建叶酸-pRNA的过程，以及含叶酸产物的纯度和功能的测试。还在动物试验中研究了由叶酸介导基因治疗中siRNA的潜力。
材料和方法
RNA的制备。RNA制备和二聚体的表征在我们的早先公开物中描述了(Zhang et al.，Virology 1994；201：77-85；Guo et al.，Mol Cell1998；2：149-155)。简要地，通过使用购自Ambion的T7-MegaShortscript试剂盒的体外转录来制备RNA。在存在7.5mM ATP、7.5mM GTP、7.5mM UTP和7.5mM CTP的情况下使用DNA模板和T7聚合酶。1μl[α-32P]ATP或[3H]UTP被包括用于RNA的放射性标记。通过8％PAGE/尿素纯化转录产物，用0.5M醋酸钠、0.1mM EDTA和0.1％SDS洗脱。RNA进行乙醇沉淀，并重悬浮在depc处理的水中。为了用叶酸标记RNA的5′末端，4mM叶酸-AMP和0.25mM ATP都被包括在转录反应中，与1mM UTP、CTP和GTP一起。
叶酸-AMP的合成和纯化。叶酸与腺苷5′-单磷酸(AMP)的结合根据所公开的相似的结合化学作用(Huang et al.，RNA2003；9：1562-1570)通过经由接头分子1，6-己二胺(HDA)将叶酸部分引入AMP来实现。然后通过半预备反相HPLC将5′叶酸-AMP纯化到93％纯度。在冻干之后，化合物溶于水中。通过在350nm的吸光度测定它的浓度，摩尔消光系数ε350＝8,000M-1.cm-1。然后直接使用叶酸-AMP用于叶酸结合的RNA的制备，在所公开的条件下在T7φ2.5启动子下。
细胞培养。KB细胞维持在5％CO2培养箱中的补充有10％FBS和青霉素/链霉素的无叶酸RPMI1640培养基(Gibco)中。血清提供了内源叶酸的正常补充用于细胞生长。
流式细胞计分析。4×105个KB细胞接种到6孔平板中并生长24h。在用PBS清洗两次之后，细胞与100nM叶酸-FITC在室温下孵育20分钟，有或者没有阻断试剂的存在。添加166μM游离叶酸或叶酸-AMP作为阻断试剂。然后在PBS中洗涤和收获细胞，通过流式细胞计分析。
叶酸RNA对KB细胞的结合。在存在10mM Mg2+的情况下将1微摩尔RNA添加到0.5mL培养基中107个细胞的悬浮液中，在37℃孵育30分钟。然后用RPMI1640培养基洗涤细胞两次，通过液体闪烁计数器来测量细胞的放射性。
双荧光素酶分析。通过将各种嵌合siRNA与编码荧光虫荧光素酶的pGL3质粒和编码Renilla荧光素酶的pRL-TK共转染到小鼠成纤维细胞PA317-PAR细胞中，来进行通过转染的基因沉默分析。通过双荧光素酶报告物分析系统(Promega)来测量两种荧光素酶的活性。
对于孵育分析，通过混合叶酸-pRNA(7-106)B-a′和pRNA/siRNA(荧光虫荧光素酶)A-b′与10mM Mg2+来制备叶酸二聚体。KB细胞在无叶酸培养基中接种到6孔平板中。在补充有MgCl2的PBS洗涤之后，然后将预混合的二聚体RNA(1.75μM)添加到细胞并在37℃孵育3h。将RNase抑制物SUPERRNaseIN(1单位/μl)(Ambion)添加到结合缓冲液中。在孵育之后，洗去游离RNA，使用Lipofectamine 2000(Promega)将pGL3和pRL-TK质粒导入细胞。第二天测量荧光素酶活性。
嵌合pRNA/siRNA加工。在该项研究中完全遵循了Nature中公开的展现双链RNA成为siRNA的加工的方法(Bernstein et al.，Nature2001；409：363-366)。纯化的重组Dicer购自Gene Therapy Systems。
体内动物研究。5周龄雄性无胸腺裸鼠(Harlan Sprague Dawley，Indianapolis)安置在无病原体自由环境中。动物随机分配到实验组(n＝8)。在注射之前，细胞维持在无抗生素培养基中一周。在注射当天，细胞用PBS漂洗两次，在37℃与二聚的pRNA复合物孵育3小时，之后通过胰蛋白酶消化来收集。0.1ml培养基中2.5×105个细胞用于每只小鼠的注射。在前肢的右侧腋窝皮下地接种细胞。一旦异种移植物可见，通过在两个维度上外部测量肿瘤每周两次地测定它们的大小。通过以下公式计算体积：V＝(L×W2)×0.5，其中L是长度，W是异种移植物的宽度。
结果
1.叶酸-AMP的特征
叶酸-AMP复合物(附图40)通过确立的化学作用(Huang et al.，Biochemistry 2000；39：15548-15555)通过接头分子1，6-己二胺(HDA)结合叶酸与腺苷5′-单磷酸(AMP)来合成。复合物通过半预备反相HPLC纯化(附图40C)。叶酸-AMP复合物的纯度通过反相HPLC和薄层层析来测定。展现了93％纯度(附图40C)的化合物用于以下讨论的叶酸-pRNA的合成。
为了测定叶酸-AMP是否能够结合细胞表面的叶酸受体，通过流式细胞计评定了叶酸-AMP与叶酸-FITC竞争结合人类鼻咽癌KB细胞的能力。叶酸受体阳性的97％的KB细胞展现了叶酸-FITC的强结合(附图40A)。然而，当KB细胞与叶酸-AMP预孵育时，仅仅0.1％的细胞被检测含有叶酸-FITC，叶酸-AMP充当了叶酸-FITC(100nM)的叶酸受体结合的竞争剂(附图40A)。当使用游离叶酸时观察到类似的阻断。这些结果表明，掺入AMP的叶酸部分保持了对叶酸受体的高结合能力。还包括了100nM FITC作为阴性对照来排除FITC和KB细胞之间的非特异性结合。
2.叶酸pRNA的合成
早先，通过使用T7RNA聚合酶和用于转录起始的GMPS实现了pRNA的特异性5′末端修饰(Garver et al.，RNA 1997；3：1068-1079)。在这种应用中的主要局限性是仅可以应用以“G”开始的RNA(Seelig et al.，Bioconjug Chem 1999；10：371-378)。当前，通过使用T7 II类启动子(Huang，Nucleic Acids Res 2003；31：e8；Pan et al.，Science 1991；254：1361-1364)，腺苷也可以作为转录的起点，因此我们能在单步骤的标记中将AMP衍生物掺入pRNA或环状排列的pRNA(cpRNA)的5′末端。AMP衍生物例如叶酸-AMP仅可以用于起始而不能用于链延伸，因而确保了标记仅在5′末端发生。
pRNA的体外转录在存在叶酸-AMP和ATP以及CTP、UTP和GTP的情况下进行。在转录反应中检查了不同摩尔比的AMP∶ATP。我们的结果显示，考虑到RNA产生的总产量和携带叶酸标记的pRNA的百分比，16∶1是最好的叶酸-AMP比ATP比例。与未标记的RNA相比，叶酸标记的RNA在变性尿素/PAGE上具有更慢的迁移速度(附图41A)。结果表明，在最佳的转录条件下，超过60％的pRNA含有叶酸部分，如根据凝胶所估计的(附图41A)。
3.叶酸-pRNA与鼻咽癌细胞的结合。
引擎pRNA单体单体的大小被测定为11nm(Hoeprich et al.，J BiolChem 2002；277(23)：20794-20803)。检查了这种具有叶酸标记的纳米尺度的颗粒的结合。构建了具有5′突出的pRNA(7-106)来提高5′叶酸对受体结合的可接近性(附图41B)。[3H]UTP被包括在转录反应中来均一地标记RNA。[与没有叶酸的RNA相比，[3H]-叶酸-RNA展现了对KB细胞的强结合(附图41B)。由于结合被游离叶酸阻断，展现了叶酸受体介导的结合中的特异性。3′末端的后退的钝端或突出显著地降低了叶酸-pRNA与受体的结合效力。
4.含有叶酸-pRNA和siRNA嵌合体的纳粒与鼻咽癌细胞的结合
Phi29 pRNA含有两个互锁环体，其可以被操作来产生大小约20nm的期望的稳定二聚体(Hoeprich et al.，J Biol Chem 2002；277(23)：20794-20803；Chen et al.，J Biol Chem 2000；275(23)：17510-17516)。例如，pRNA(A-b′)含有右手环体A(5′G45G46A47C48)和左手环体b′(3′U85G84C83G82)，它们一同可以分别与pRNA(B-a′)的左手环体a′(3′C85C84U83G82)和右手环体B(5′A45C46G47C48)配对(附图42)。通过用siRNA序列替换pRNA的双链螺旋区域构建了嵌合pRNA/siRNA单体，而不影响基因沉默功能和pRNA二级结构。(Guo etal.，Human Gene Therapy 2005；16：1097-1109[实施例12]；Khaled et al.，Nano Letters 2005；5：1797-1808[实施例11])。含有纳粒的可递送叶酸通过混合等摩尔数量的叶酸-pRNA(B-a′)和嵌合pRNA/siRNA(A-b′)、经由互锁环体的相互作用来结合(附图42)。通过天然-PAGE、低温AFM(附图42)和超速离心展现了二聚体的形成。为了评定这种pRNA二聚体对叶酸受体的结合能力，由[3H]-(A-b′)pRNA和未标记的叶酸-(B-a′)pRNA组成的RNA复合物与KB细胞孵育。与没有叶酸标记的对照RNA二聚体相比，叶酸标记的RNA二聚体显示了更强得多的结合(附图42)。通过使用游离叶酸的阻断展现了结合特异性。
5.含有folic-pRNA和siRNA嵌合体的纳粒向鼻咽癌细胞的进入
为了确定嵌合pRNA二聚体上的叶酸部分可以介导复合物向KB细胞的进入，siRNA被结合到复合物用于特异性基因沉默。含有叶酸和针对荧光虫荧光素酶的siRNA的1.75μM RNA二聚体与KB细胞孵育，而不是转染入KB细胞。用叶酸-RNA二聚体处理的细胞中荧光虫荧光素酶的表达水平降低到没有RNA处理的细胞的30％。相比之下，用对照的无叶酸RNA二聚体处理的细胞保持了85％的荧光素酶基因表达。这些结果表明，通过在缺少转染试剂的情况下嵌合pRNA二聚体的叶酸受体介导的内在化实现了荧光虫荧光素酶基因的特异性敲除。
6.通过Dicer的pRNA嵌合体和二聚pRNA嵌合体的复合物变为siRNA的加工
我们早先的工作显示了添加到pRNA的5′/3′末端的外源序列，例如siRNA或锤头核酶保持了细胞中的生物学功能。(Hoeprich et al.，GeneTherapy 2003；10(15)：1258-1267；Guo et al.，Human Gene Therapy2005；16：1097-1109[实施例12]；Khaled et al.，Nano Letters2005；5：1797-1808[实施例11])。在这项研究中，构建了靶向萤火虫或renilla荧光素酶的嵌合pRNA/siRNA，通过短暂转染测试了沉默效力。如通过双报告物分析所展现的，嵌合的siRNA构建体特异性和有效地抑制它的目标基因，在所述分析中在存在携带靶向荧光素酶之一的siRNA的嵌合pRNA的情况下测量两种不同荧光素酶的表达水平。未靶向的荧光素酶充当内部对照。当将突变导入pRNA复合物的siRNA中时，没有发生荧光素酶基因的沉默(附图43)。
为了确定以上显示的敲除效果是否是siRNA特异性的，用细胞溶胞产物或重组纯化的Dicer处理嵌合pRNA/siRNA单体或二聚体(附图44)，Dicer在加工长双链RNA成22-bp siRNA方面的独特功能是已知的(Carmell et al.，Nat Struct Mol Biol 2004；11：214-218)。
5′-[γ32P]-pRNA/siRNA复合物与细胞溶胞产物的孵育引起了嵌合RNA复合物变成29碱基双链siRNA的加工(未显示)。这种加工是预期的，因为我们有意地在三通接点引入了两个尿嘧啶核苷以提高接合区域折叠成单链环的自由能。携带29碱基双链siRNA的pRNA/siRNA复合物与纯化的Dicer的孵育引起嵌合的RNA复合物变成22-碱基双链siRNA的加工(附图44)，如变性尿素PAGE所揭示的。这些结果表明，嵌合pRNA/siRNA复合物特异性地裂解以释放5′/3′末端的功能性双链siRNA，并且在RNA复合物被递送到细胞内之后由siRNA引起基因沉默的功能。嵌合pRNA/siRNA的二聚体形式不影响功能性siRNA的加工和释放。
7.通过针对存活蛋白的嵌合siRNA的体外递送展现癌细胞的肿瘤发生学的特异性抑制的动物试验
通过使用含有pRNA(A-b′)/叶酸和pRNA(B-a′)/siRNA(存活蛋白)的二聚体的体外递送，进行动物试验来测试特异性。在无胸腺裸鼠中测试了这种RNA二聚体抑制肿瘤形成的潜力。在通过腋窝注射导入裸鼠中之前KB细胞与各种二聚的RNA样品孵育。接受单独的细胞的八只小鼠中的四只在3周内发展出肿瘤；接受没有叶酸标记的二聚体[pRNA(B-a′)+pRNA/siRNA(存活蛋白)(A-b′)]的八只小鼠中的六只发展出肿瘤，接受二聚体[pRNA(B-a′)+pRNA/突变siRNA(A-b′)]的八只小鼠中的七只发展出肿瘤。这些小鼠的每个组在注射的四十一天内展现了超过100mm3的平均肿瘤大小。相比之下，接受用pRNA(A-b′)/叶酸和pRNA(B-a′)/siRNA(存活蛋白)的二聚体预处理的细胞的八只小鼠的仅一只发展出肿瘤。这个单独的小鼠在一周之内产生斑块，大大早于任何其他组中的小鼠，因而，考虑到这些特殊情况，它被认为是非正常的。肿瘤形成的抑制作用是特异性的，因为在对照小鼠组中使用的没有叶酸结合的对照二聚体RNA不影响肿瘤发展。
讨论
这个工作的目标是构建结合叶酸的phi29 pRNA用于经由叶酸受体递送嵌合的siRNA到鼻咽癌细胞。通过利用叶酸-AMP作为使用T7 II启动子的RNA转录的起始物实现叶酸标记；然而当在高浓度使用时，叶酸-AMP也可能对转录产量具有某些抑制效果。噬菌体phi29 pRNA用作载体来携带siRNA序列。此外，乳腺癌细胞和卵巢癌细胞被叶酸-FITC特异性地染色，表明这种递送方法也可以用于至少两种其他类型的癌细胞。
pRNA/siRNA被Dicer加工并释放双链siRNA双链体，其导致基因表达的特异性抑制。通过混合两种pRNA来产生稳定的pRNA二聚体，其中之一携带叶酸标记，而另一个携带siRNA序列。当在缺乏转染反应的情况下这种RNA复合物与KB细胞混合时，叶酸部分显示了(1)介导二聚复合物的结合和(2)介导靶向的荧光素酶基因表达的敲除。此外，通过孵育针对存活蛋白基因的叶酸-siRNA复合物在小鼠试验中实现了肿瘤生长的抑制，存活蛋白在肿瘤发展中起到重要作用。
作为每个pRNA的互锁环体的相互作用的结果，Phi29 pRNA形成二聚体。将来，通过操作互锁环体的序列，将组装嵌合的三聚体甚至六聚体。pRNA的多价性质将便于携带具有各种功能的多个组件，包括细胞识别、检测、内涵体逃避和基因抑制。将利用核苷酸衍生物来产生稳定的RNase抗性RNA来改善沉默效果(Soutschek et al.Therapeuticsilencing of an endogenous gene by systemic administration of modifiedsiRNAs.Nature 2004；432：173-178)。这种多价RNA复合物也可以潜在地用于治疗由HIV和乙型肝炎病毒引起慢性病毒传染性疾病，通过靶向被呈现在受感染细胞表面的特异性病毒糖蛋白。
这种策略的一个益处是基因沉默可以仅通过混合RNA复合物和癌细胞而不用来源于阳离子脂质或CaCl2的转染试剂的帮助来实现。更重要地，由于癌细胞在不同的发展阶段表达多种标志受体，某些可内吞的受体可以用作载体来介导用受体配体标记的治疗试剂的进入。使用RNA作为递送工具的另一个优点是能够避免在重复长期药物施用之后免疫反应和蛋白载体的排斥的难题。
实施例14.靶向存活蛋白用于在各种癌细胞中诱导细胞凋亡的噬菌体Phi29 pRNA/核酶嵌合体
如在此报道的，噬菌体phi29引擎pRNA被工程化来经由携带配体、适体或siRNA的嵌合pRNA的互锁环体构建多价的RNA纳粒用于治疗性RNA的特异性细胞递送。在这个实施例中，我们报道了嵌合核酶作为可递送RNA纳粒的组装的其他亚单位的构建。在mRNA和蛋白水平展现了这种嵌合体的基因沉默效果。嵌合体引起各种的人类癌细胞系的细胞死亡，包括乳腺癌、前列腺癌、子宫颈癌、鼻咽癌和肺癌，而不引起显著性水平的非特异性细胞毒性。嵌合体保持了它形成可递送多亚单位复合物的能力。
为了克服治疗性核酶应用中的障碍，其涉及由降解、融合到载体后的错误折叠和异常的细胞输送引起的低体内效力，将核酶连接到环状排列的pRNA的紧密折叠的5′/3′新生末端以确保合适的折叠和提高稳定性。
引言
pRNA或包装RNA是由噬菌体phi29编码的117nt的小RNA。我们发现这种小的RNA在病毒基因组DNA包装中起到新的和重要的作用(Guo et al.，Science 1987；236：690-694)。野生型pRNA的六个拷贝形成六聚环(Guo et al.，Mol.Cell.1998；2：149-155；Trottier et al.，J.Virol.1997；71：487-494)，其一起以ATP依赖性方式驱动DNA包装引擎(综述参见Guo，Prog in Nucl Acid Res & Mole Biol.2002；72：415-472和Grimes et al.，Adv.Virus Res.2002；58：255-294)。每种pRNA分子含有两个功能结构域。分子间相互作用结构域(中央区域的碱基#23-97)含有右手环体和左手环体(Reid et al.，J Biol Chem 1994；269：5157-5162；Chen et al.，J Biol Chem 2000；275(23)：17510-17516；Garver et al.，RNA.1997；3：1068-1079；Chen et al.，RNA 1999；5：805-818)。在这两种环体之间的序列特异性相互作用是pRNA多聚体形成必需的。此外，这两种环体的序列可以被随意地操作以在存在Mg2+的情况下形成稳定的二聚体、三聚体或六聚体。第二种结构域是位于5′/3′配对的末端的双链螺旋结构，其是phi29引擎的DNA包装中pRNA的功能必需的(Zhang et al.，Virology 1994；201：77-85)。这两种结构域相互独立地折叠。我们发现，消除DNA包装结构域不会改变pRNA的分子间相互作用的性质。例如，在核苷酸#23之前或核苷酸#97之后的核苷酸替换或插入不会干扰二聚体、三聚体和六聚体形成(Hoeprich et al.，Gene Therapy 2003；10(15)：1258-1267；Chen et al.，RNA 1999；5：805-818；Shu et al.，J Nanosciand Nanotech(JNN)2003；3：295-302)。因此，pRNA的5′/3′双链螺旋结构域可以被利用来携带外源序列(Zhang et al.，RNA1995；1：1041-1050)。
pRNA单体、二聚体、三聚体和六聚体的三维计算机模型已经在我们的实验室中构建(Hoeprich et al.，J Biol.Chem.2002；277(23)：20794-20803)。这些3D模型的构建基于各种实验数据，包括化学修饰(Zhang et al.，Virology 2001；281：281-293；Trottier et al.，RNA2000；6：1257-1266)、光亲和性交联(Garver et al.，RNA1997；3：1068-1079)、互补修饰(Zhang et al.，Virology 1994；201：77-85；Zhang et al.，RNA 1995；1：1041-1050；Zhang et al.，RNA 1997；3：315-322；Wichitwechkarn et al.，J Mol.Biol 1992；223：991-998；Reid et al.J BiolChem 1994；269：18656-18661)化学修饰干扰(Mat-Arip et al.，J Biol Chem2001；276：32575-32584)、核酸酶探查(Reid et al.，J Biol Chem1994；269：5157-5162；Chen et al.，J.Virol.1997；71：495-500)、竞争分析(Trottier et al.，J.Virol.1997；71：487-494)、寡聚物靶向(Zhang et al.，Virology 1995；211：568-576)和低温原子力显微镜检查(Chen et al.，J BiolChem 2000；275(23)：17510-17516；Trottier et al.，RNA 2000；6：1257-1266)(Mat-Arip et al.，J Biol Chem 2001；276：32575-32584)。我们对phi29 pRNA的独特结构特征的了解容许进一步操作pRNA分子，将它转化成媒介物来携带其他RNA序列，所述序列也可以充当基因靶向RNA复合物的支架。
我们近来发现，pRNA与受体结合RNA适体、叶酸(Guo et al.GeneTher.2006.May；13(10)：814-20)[实施例13])、小干扰RNA(siRNA)(Guo et al.，Human Gene Therapy 2005；16：1097-1109[实施例12])(Khaled et al.，Nano Letters 2005；5：1797-1808[实施例11])和核酶(Hoeprich et al.，Gene Therapy 2003；10(15)：1258-1267)融合不会干扰二聚体形成或干扰插入的部分的功能。与常规的核酶相比，靶向HBVpolyA信号的pRNA核酶嵌合体展现了提高的HBV复制抑制效果(Hoeprich et al.，Gene Therapy 2003；10(15)：1258-1267)。处理嵌合pRNA亚单位的优点之外，我们还报道了pRNA可以用作构建块用于纳米技术中的底部向上组装(Shu et al.，Nano Letters 2004；4：1717-1724)。含有受体结合基序的三价纳米尺度颗粒的孵育引起治疗颗粒对细胞的结合和共同进入，随后调节靶细胞的细胞凋亡。这种从pRNA组装的无蛋白质纳粒的使用将大大地降低抗原性，容许重复的长期施用。基于纳米结构的pRNA的尺寸将避免小分子的短滞留时间的难题和递送大于100nm的颗粒方面的困难。在这个报告中，我们将治疗RNA的选择从siRNA扩展到靶向存活蛋白的锤头核酶，其显示了目标基因的特异性减量调节并诱导了程序化细胞死亡而不引起非特异性毒性。
材料和方法
RNA的体外合成。早先描述了RNA的合成(Zhang et al.，Virology1994；201：77-85)。简言之，购自IDT的DNA寡聚物(表4；附图54A)用于通过PCR产生dsDNA模板。含有T7启动子的DNA产物用作模板用于直接体外RNA转录。所有RNA进行凝胶纯化并重悬浮在DEPC治疗的H2O中。10mM的镁被包括在所有缓冲液中来维持pRNA的分子间相互作用和折叠(Chen et al.，J Biol Chem 2000；275(23)：17510-17516；Mat-Aripet al.，J Biol Chem 2001；276：32575-32584)。已经报导了pRNA的命名和产生的嵌合pRNA亚单位用于构建可递送的RNA纳粒(Chen et al.，RNA1999；5：805-818；Khaled et al.，Nano Letters 2005；5：1797-1808[实施例11])。pRNA/RZ(Sur)代表携带靶向存活蛋白的锤头核酶的pRNA嵌合体，对于pRNA/核酶(HBV)的构建根据相同的策略，其是具有基于pRNA的载体的嵌合RNA，来携带锤头核酶用于乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒(HBV)polyA信号的成功裂解(Hoeprich et al.Gene Therapy 2003；10(15)：1258-1267)。还在这项研究中使用了pRNA/核酶(HBV)(Hoeprichet al.，Gene Therapy 2003；10(15)：1258-1267)，称为pRNA/RZ(mut3)。
通过转染的pRNA/RZ(Sur)的基因沉默效力的分析。
已经报道了用pRNA嵌合体转染细胞的方法(Khaled et al.，NanoLetters 2005；5：1797-1808[实施例11])。人类子宫颈癌细胞Hela T4打板到24孔培养皿中，在37℃/5％CO2下孵育过夜。第二天早晨，培养基被替换为无抗生素培养基，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)以0.5μg、0.1μg或0.02μg的pRNA构建体单独地转染细胞，每个处理三个副本。在六小时之后，转染溶液替换为补充有10％FBS和抗生素的标准培养基。进行基于四唑的MTT分析来测定细胞生存力。对KB、LNCaP和MDA-MB-231细胞进行类似的分析。
Western印迹分析。T47D人类乳腺癌细胞接种到60mm平皿中，在补充有10％FBS和青霉素/链霉素的DMEM中生长到70％汇合。在转染之前，细胞转移到无抗生素培养基，然后用靶向存活蛋白的pRNA嵌合体转染，或用突变嵌合核酶转染作为阴性对照。根据厂家的说明书使用Lipofectamine 2000。在转染后12、16、20和24小时在裂解缓冲液中清洗并收获细胞。测定蛋白质浓度，等量的蛋白质加载到12％聚丙烯酰胺凝胶上。分辨蛋白质，使用半干的转移(BioRad)转移到硝化纤维膜上。根据厂家的说明书(Amersham ECL试剂盒)，封闭膜，与初级抗体过氧物酶孵育，并结合到二级抗体。在化学发光探针的活化之后，使膜暴露于底片。
使用PI/annexin V双重染色在流式细胞计中通过pRNA/RZ(Sur)诱导的MCF-7细胞凋亡的分析。已经报道了细胞凋亡分析的方法(Guo etal.，Human Gene Therapy 2005；16：097-1109[实施例12])。简要地，人类乳腺癌细胞MCF-7在补充有10％FBS和青霉素/链霉素的DMEM培养基中生长，并以每孔0.5×105个细胞的密度打板到24孔平板中。使用0.5μg核酶每孔进行转染，每个处理三个副本。转染后48小时，使用annexin V-碘化丙锭(PI)双重染色方法评定乳腺癌细胞MCF-7中的细胞凋亡。
实时PCR分析。MCF-7细胞以每孔0.5×105个细胞的密度接种到24孔平板中。使用0.5μg核酶每孔进行转染，每个处理三个副本。转染后48小时收获细胞，用QIAamp RNA试剂盒(Qiagen)提取总RNA。使用RevertAidTM First Strand Synthesis试剂盒(Fermentas)对1μgRNA进行逆转录。
在存在SYBR绿染料的情况下使用Quanti Tect SYBR Green RT-PCR试剂盒(Qiagen)和ABI PRISM 6700实时PCR检测机器(FenglingBiotechnology Inc.)对等量的cDNA进行PCR。存活蛋白的引物是，其是早先公开的5′-AAA GAG CCA AGA ACA AAA TTG C-3′和5′-GAGAGAGAA GCA GCC ACT GTT AC-3′(Weikert et al.，Fertil.Steril.2005Apr 1983；1100-1105)。通过95℃0.5秒、60℃10秒和72℃10秒的40个环状进行PCR。没有模板的PCR用作阴性对照。β-肌动蛋白内源持家基因作为内部对照。β-肌动蛋白和阴性对照都在与目标实验基因相同的平板上扩增。通过使用存活蛋白和β-肌动蛋白之间的临界阈值(CT)的差异来标准化每个样品。以下公式用于描述结果：ΔΔCT存活蛋白＝ΔCT存活蛋白-ΔCTβ-肌动蛋白，其中ΔCT存活蛋白是存活蛋白和阴性对照之间CT中的差异，以及ΔCTβ-肌动蛋白是β-肌动蛋白和阴性对照之间的差异。然后使用表达式2ΔΔCT存活蛋白比较每个样品的mRNA水平。平均每个组的结果。未转染的样品的表达水平任意地指定为值1，最终结果表示为与未转染的样品相比的倍数。
通过锤头核酶的体外裂解。在存在20mM Tris pH 7.5、20mM MgCl2和150mM NaCl的情况下在37℃进行存活蛋白mRNA靶向核酶pRNA/RZ(Sur)和对照核酶pRNA/RZ(Mut2)裂解反应60分钟。核酶RNA(5μg)用于裂解存活蛋白mRNA(200ng)的部分序列。127nt[32P]标记RNA底物预计被裂解成77nt和50nt片段。通过8％PAGE/8M尿素变性凝胶分离裂解产物。
结果
1.携带核酶的pRNA嵌合体的构建
为了评估治疗性RNA分子在治疗癌症中的有效性，必需抑制涉及肿瘤发育和发展的基因。选择存活蛋白作为目标，因为它抑制细胞凋亡，并仅在癌细胞中而不在正常的成年人细胞中检测到。早先已经报道了，存活蛋白的抑制诱导癌细胞的细胞凋亡(Grossman et al.，Proc Natl AcadSci 2001；98：635-640；Frey et al.，J Struct Biol 1999；127：94-100)。
构建根据pRNA载体序列的pRNA/RZ(Sur)RNA嵌合体来靶向存活蛋白mRNA(附图45)。存活蛋白靶向核酶连接到pRNA的5′/3′末端，pRNA被重排为环状排列的形式(Pennati et al.，J Clin.Invest2002；109：285-286)。如早先提及的，phi29 pRNA含有分子间相互作用结构域和双链螺旋结构域。这两个结构域相互独立地折叠，在碱基#23之前的5′末端和在碱基#97之后的3′末端的核苷酸的添加或删除不影响pRNA的正确折叠和总体结构(Zhang et al.，RNA 1995；1：1041-1050)。构建环状排列的pRNA而不影响它的折叠(Zhang et al.，Virology1995；207：442-451)。使用两个接头序列来连接核酶和pRNA载体。环状排列的方法是为了确保核酶和pRNA载体的独立性和正确折叠，以及重定位RNA嵌合体的新生5′/3′末端到紧密折叠的区域，并保护pRNA免于核酸外切酶消化。三种突变的嵌合核酶用于这项研究中(附图45)。
2.pRNA/RZ(Sur)嵌合体在所有测试的癌细胞中特异性地诱导细胞凋亡和细胞死亡
a.嵌合pRNA/RZ(Sur)在人类乳腺癌细胞中的效果
在四种乳腺癌细胞系MCF-7、T47D、MDA-MD-231和MDA-MB-453上测试了pRNA/RZ(Sur)。在转染之后，大部分细胞缩小并从细胞培养平板上脱离，而对照pRNA/RZ(mut3)不引起细胞的这种变化(附图46和表5，附图54B)。当在MDA-MD-231和MDA-MB-453细胞中通过MTT分析测量各种嵌合核酶的效果时，pRNA/RZ(Sur)显示了强的、剂量依赖性的细胞生存力抑制作用，而pRNA/RZ(mut3)没有显示效果(附图47)。
结果表明，嵌合pRNA不展现非特异性细胞毒性。然而，当通过短暂转染导入乳腺癌细胞时，pRNA/RZ(Sur)可以以剂量依赖性方式特异性地诱导细胞死亡。
b.嵌合pRNA/RZ(Sur)在人类宫颈癌细胞中的效果
pRNA/RZ(Sur)通过转染导入人类子宫颈癌Hela T4细胞，以评估它在诱导人类宫颈癌细胞的细胞凋亡方面的功能。在转染后各个时点测量细胞生存力。如附图48所示，与无RNA对照物相比，用pRNA/RZ(Sur)处理产生细胞生存力的剂量依赖性降低。对于pRNA/RZ(mut3)处理的细胞，当使用不同的RNA剂量时没有观察到存活率方面的显著差异，表明pRNA/RZ(Sur)作用于Hela T4细胞而不引起非特异性毒性。
c.嵌合pRNA/RZ(Sur)在鼻咽癌细胞中的效果
人类鼻咽癌KB细胞暴露于pRNA/RZ(Sur)，以及pRNA/RZ(mut3)作为阴性对照。如附图49所示，在转染之后KB细胞显著地相应pRNA/RZ(Sur)。突变的核酶诱导的非特异性毒性不是显著的，甚至在剂量提高时。这表明，嵌合的存活蛋白核酶引起的其是特异性的，如在其他癌细胞中发现的一样。
d.嵌合pRNA/RZ(Sur)在前列腺癌细胞中的效果
人类前列腺癌细胞系LNCaP用不同剂量的pRNA/RZ(Sur)或pRNA/RZ(mut3)转染，后者充当阴性对照。转染后12小时或24小时，前列腺癌细胞仅对pRNA/RZ(Sur)的处理强烈地反应，而对照RNA没有显著地影响细胞存活率(附图50)。这表明，细胞生存力的降低取决于与存活蛋白核酶相应的序列，而不是由非特异性RNA毒性引起。
e.嵌合pRNA/RZ(Sur)对人类肺癌细胞的影响
人类肺癌系A-549用不同的剂量的pRNA/RZ(Sur)或pRNA/RZ(mut3)转染。在转染之后，A-549对pRNA/RZ(Sur)的处理强烈地反应，并且接着从培养平板的孔上脱离，而对照pRNA/RZ(mut3)没有显著地影响细胞存活率(表2)。这表明，细胞生存力的降低取决于与存活蛋白核酶相应的序列，而不是由非特异性RNA毒性引起。
3.在mRNA和蛋白水平通过pRNA/RZ(Sur)的存活蛋白表达的特异性抑制
为了测试它在抑制存活蛋白表达方面的预计功能，pRNA/RZ(Sur)被导入丰富地表达存活蛋白的MCF-7和T47D人类乳腺癌细胞。实时PCR和免疫印迹分析都揭示了，存活蛋白的mRNA和蛋白表达被显著地降低，在短暂转染后16小时几乎完全消除(附图51和52)。相比之下，非特异性突变对照物处理的细胞或未处理的细胞都没有显示显著降低存活蛋白表达，进一步表明pRNA/RZ(Sur)作用的特异性。如附图52所示，与对照组相比，用pRNA/RZ(Sur)处理引起存活蛋白蛋白的时间依赖性降低。在附图53B中显示了pRNA/RZ(Sur)对存活蛋白mRNA的特异性裂解。由于在催化核心含有两个碱基突变的突变pRNA/RZ(mut2)没有产生RNA裂解产物，展现了特异性。
4.嵌合体引起细胞凋亡而不是坏死
为了确定pRNA/RZ(Sur)由于抗细胞凋亡因子存活蛋白的沉默诱导细胞凋亡还是非特异性地促进坏死，对pRNA/RZ(Sur)转染的乳腺癌细胞进行annexin V-碘化丙锭(PI)双染色，随后流式细胞计分析。如附图46B所示，25％±8.6的MCF-7细胞在RNA处理之后经历细胞凋亡，如在代表细胞凋亡细胞的右下象限中的细胞群体所显示的。相反地，与用单独的pRNA载体处理的细胞(2.1％±0.3)相比，用突变3处理的细胞仅显示了细胞凋亡细胞的轻微的提高(3.6％±0.2)。如在右上象限表明的，在RNA处理后坏死的细胞不显示显著提高，这表明在RNA处理的早期阶段RNA/核酶在癌细胞中引起细胞凋亡而不是坏死。
5.pRNA嵌合体的安全性的测试
通过在孵育和转染实验中使用大剂量的pRNA嵌合体测试pRNA嵌合体的安全性。细胞与变化浓度的pRNA嵌合体孵育不产生对细胞的值得注意的毒性(参见附图37；实施例12)。在没有转染试剂的情况下癌细胞与pRNA/siRNA(存活蛋白)或pRNA/RZ(Sur)的孵育不引起细胞死亡持续直到72小时(Guo et al.Human Gene Therapy2005；16：097-1109[实施例12])。这表明，嵌合pRNA在孵育时不显示非特异性细胞毒性。然而，当通过转染导入细胞时，pRNA嵌合体在来自乳腺癌、前列腺癌和肺癌的细胞中引起死亡。但仅有含存活蛋白核酶序列的嵌合pRNA引起细胞生存力的显著抑制。如附图48、49、50和51所示，抑制乙型肝炎病毒的复制、含有除核酶序列之外与pRNA/RZ(Sur)相同的载体序列的对照pRNA/RZ(mut3)，甚至在高RNA浓度不显示对细胞生长的显著抑制效果。
6.pRNA/RZ(Sur)在二聚体和三聚体纳粒的组装中的能力
特异性细胞识别和特异性基因沉默是有效的基于RNA的靶向治疗所需的。然而，功能性RNA分子的融合或结合可能引起错误折叠和功能损失。pRNA二聚体结构是实现这两个方面的可选择的方法。理想地，其他RNA基序或化学物质可以掺入到递送复合物中来进行其他任务，例如内涵体破坏、治疗之后细胞结局的检测、以及通过多靶向的治疗效果增强。近来，已经使用phi29 pRNA嵌合体构建了多价的RNA复合物。通过携带受体结合RNA适体或siRNA的工程化的嵌合pRNA的互锁环体/环体相互作用组装了二聚体或三聚体(Guo et al.Human Gene Therapy2005；16：097-1109[实施例12]；Khaled et al.，Nano Letters2005；5：1797-1808实施例11])。构建pRNA/RZ(Sur)的主要目标是设计一种亚单位构建块，用于作为递送纳粒的pRNA嵌合体的二聚体或三聚体。发现pRNA/RZ(Sur)能够胜任二聚体和三聚体形成，如通过天然凝胶电泳(附图53)和其他物理方法(数据未显示)例如超速离心和单分子计数所证明的。通过混合pRNA/RZ(Sur)(A-b′)与pRNA(B-a′)实现了二聚体的形成。通过混合pRNA/RZ(Sur)(A-b′)与pRNA(B-e′)和(E-a′)实现了三聚体的形成(Guo et al.，Mol.Cell.1998；2：149-155；Chen et al.，RNA 1999；5：805-818；Zhang et al.，Mol.Cell 1998；2：141-147)。显示了尽管添加存活蛋白核酶到pRNA载体序列，从嵌合RNA单体的构建块产生了稳定的RNA二聚体或三聚体。因此，pRNA/RZ(Sur)可用于二聚/三聚的RNA纳粒的组装，并将是多价RNA递送系统的其他的成员。
讨论
RNA治疗剂已经被认为是近代医学中最有前景的方法之一。在其他治疗剂中，毒性和特异性是开发中的两个主要问题。我们将我们的努力放在探索低毒性治疗RNA复合物上。早先，我们发现phi29 pRNA可以作为载体来护送核酶用于乙型肝炎病毒复制的抑制(Hoeprich et al.，Gene Therapy 2003；10(15)：1258-1267)。发现pRNA/RZ(Sur)在诱导特异性细胞死亡中是有效的。由于每种治疗性RNA含有独特的序列，安全性问题取决于细胞的类型，并且是各种情况下不同的问题。例如，与其他乳腺癌细胞系相比，乳腺癌细胞系MCF-7是脆弱得多的并且更易感于RNA转染。因此，我们测试了多种癌细胞系，包括乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、鼻咽癌和肺癌。发现pRNA/RZ(Sur)在诱导癌细胞细胞凋亡方面非常有效。然而，我们不能说这种RNA嵌合体对所有细胞类型是安全的。我们还通过实时PCR在最脆弱和敏感的MCF7细胞是测试了这种RNA嵌合体，来评估对存活蛋白基因的转录产物的沉默效力。我们发现，即使该分子可以特异性地沉默存活蛋白的表达，存活蛋白mRNA的表达也被突变体轻微地降低(附图51)。显然，这种降低是由于非特异性RNA影响。因而，安全问题必需再次提出。由于分子治疗涉及治疗试剂向细胞内的递送，特异性是比毒性更关键的，因为癌症治疗的目标是消灭癌细胞。在某些情况下，癌细胞的非特异性抑制可能是期望的，只要pRNA可以特异性地进入癌细胞以及只要未进入的pRNA对细胞不是有毒的。根据我们早先的报道，我们发现孵育细胞和高浓度的pRNA嵌合体不引起值得注意的细胞死亡。因而，pRNA嵌合体是有前景的，因为它可以通过工程化为多聚体来特异性地进入细胞。我们的努力将集中于细胞进入的特异性。使用phi29 pRNA嵌合体的益处是开发RNA嵌合体向靶细胞的特异性递送的强大方法；因而将评定在细胞杀伤和细胞进入的效力之间的平衡。
就我们所知，作为互锁环体的相互作用的结果，phi29 pRNA具有形式二聚体(2个pRNA的连接)、三聚体(3个pRNA)和六聚体(6个pRNA)的倾向。因而，两个到六个pRNA嵌合体可以掺入到RNA纳米复合物中，具有多个位置可用于携带RNA分子用于靶向、治疗或检测。例如，复合物的一个亚单位可以被改变来携带结合细胞表面受体的RNA适体或配体如叶酸(Guo et al.Gene Ther.2006.May；13(10)：814-20)实施例13)，从而帮助携带RNA复合物用于细胞进入。其余的亚单位可以被修改以携带特异性治疗性siRNA、核酶、反义RNA、化疗药物、荧光染料、重金属、量子点或放射性同位素用于癌细胞消灭或检测。内涵体破坏化学物质也可以掺入RNA复合物来促进RNA从内涵体的释放。此外，使用这些RNA纳粒(30-40纳米大小)避免了较小的分子由于短滞留时间在体内遭遇的短半衰期的难题，以及避免较大分子(大于100纳米)遭遇的不良递送效率的难题。公认的是，除了与蛋白质复合时，RNA的免疫原性处在非常低的水平(Goldsby et al.Immunology，pp.57-61(W.H.Freeman and Company，New York，2002)。无蛋白/肽纳粒的构建可以避免免疫反应，这可以容许长期的施用。
实施例15.核苷酸衍生物掺入嵌合pRNA以提高稳定性
核苷酸衍生物例如2′-NH2-、2′-CH3-、或2′-F-2′脱氧CTP；2′-F-2′脱氧UTP或spiegelmer(L-核苷酸适体)可以被掺入嵌合pRNA来产生在血清中对RNase消化有抗性的稳定转录产物。稳定化修饰可以在2′位置或在其他位置进行。pRNA的稳定有益于体内治疗应用，其中重要的是，pRNA纳粒在各种生物学条件下是稳定的并对血清中RNases的消化有抗性。天然噬菌体phi29 pRNA在与生物样品接触时易感于各种核酸酶的降解。可以构建具有修饰的核苷酸的pRNA类似物，其预计产生提高的生物稳定性。更一般地，具有2′-F-NTP、2′-NH2-NTP或2′-CH3-NTP的功能性pRNA代表了可以被构建的修饰的pRNA的实例。
从含有T7启动子和117-nt最小的野生型pRNA序列的dsDNA模板，可以使用例如2′-F-NTP或2′-NH2-NTP(Trilink Biotechnologies)来制备pRNA类似物。特别是，核苷酸衍生物例如2′-NH2-2′-CH3-或2′-F-2′脱氧CTP、2′-F-2′脱氧UTP、或spiegelmer可以被掺入RNA来产生对RNase消化有抗性的稳定的体外RNA转录产物。这种稳定的pRNA的实例是含有一种或两种未修饰的(天然发生的)核苷酸以及2′-F-、2′-NH2-或2′-CH3-spiegelmer核苷酸之一的pRNA。当作为携带细胞受体结合配体的pRNA二聚体、三聚体或六聚体的组件存在时，稳定的嵌合pRNA预计进入癌细胞.
展现有利的受体结合亲和性的稳定的pRNA嵌合体可以通过体外功能测试来进一步分析，例如二聚体、三聚体或六聚体形成的能力，进入细胞的特异性，以及特异性基因沉默的活性。可以测试嵌合pRNA在许多乳腺癌细胞系中抑制存活蛋白或Bcl-2表达式方面的有效性。
合成2′-NH2、2′-CH3、或2′-F-2′-脱氧CTP、2′-F-2′-脱氧UTP的或spiegelmer修饰的RNA片段也可以用于重构功能性pRNA。2′-F-2′-脱氧核苷酸可以从Epicentre获得。
实施例16.具有降低的毒性的pRNA嵌合体
毒性和特异性是所有治疗技术要解决的两种主要的关切，包括基于RNA的使用的技术。
1.环状排列
我们建议，通过鉴定环状排列的pRNA嵌合体的最佳环状排列，可以提高特异性和/或降低毒性。
pRNA的毒性可能受到它的一级序列、二级结构和三维结构、以及5′和3′末端的位置的开口的位置的影响。利用环状排列，可以产各种具有不同5′和3′末端但具有相同的序列和三维结构的pRNA。因而，在间隔区携带生物学活性部分(例如，核酶、反义、或适体)的嵌合pRNA可以被制成各种环状排列的RNA。对于在pRNA区域具有120个核苷酸的嵌合pRNA，可以产生具有相同的序列、功能和三维结构的120中环状排列的RNA。可以筛选这些种类来鉴定更低毒性的种类，其展现了完全的基因沉默功能和在纳粒构建中形成二聚体或三聚体的能力。
2.具有与3′末端退火的DNA的pRNA
降低毒性的另一种方法包括鉴定比它们的对应物毒性更低的嵌合pRNA。通过将26核苷酸单链RNA片段(5′AAUCCCGCGGCCAUGGCGGCCGGGAG 3′)连接到pRNA的3′末端来形成pRNA嵌合体sph1-pRNA。pRNA嵌合体然后与DNA寡核苷酸接触，所述DNA寡核苷酸与所述RNA片段互补，在容许所述DNA寡核苷酸与RNA片段退火的条件下。产生的pRNA构建体(附图55)，其包括退火的寡核苷酸，被发现具有降低的毒性。
类似地，sph1-pRNA/siRNA是在它的3′末端具有额外的26核苷酸RNA单链片段的嵌合pRNA/siRNA。额外的RNA片段与26核苷酸互补的DNA寡核苷酸退火。产生的sph1-pRNA/siRNA(包括26核苷酸互补的DNA寡核苷酸)发现具有(1)降低的毒性和(2)保持了基因沉默功能。通过MTT分析展现了降低的毒性，使用GFP和双荧光素酶分析展现了基因沉默功能。
稳定性研究
用于毒性研究的pRNA含有3′RNA片段延伸和退火的互补DNA寡核苷酸(附图55)。首先分析了这些pRNA的稳定性和退火效力，使用凝胶电泳(8％PAGE/尿素)。
附图56A中显示的凝胶的图例
1.Sph1-pRNA
2.与117-143寡核苷酸退火的sph1-pRNA
3.Sph1-pRNA/siRNA(荧光素酶)
4.与117-143寡核苷酸退火的sph1-pRNA/siRNA(荧光素酶)
5.Sph1-pRNA/siRNA(GFP)
6.与117-143寡核苷酸退火的sph1-pRNA/siRNA(GFP)
7.Sph1-pRNA/siRNA(存活蛋白)
8.与117-143寡核苷酸退火的sph1-pRNA/siRNA(存活蛋白)
9.阶梯
10.与117-143生物素化的寡核苷酸退火的sph1-pRNA
如附图56A所揭示的，没有发现显著的RNA降解。它也可以充当RNA毒性分析的加载对照。
附图56B中显示的凝胶的图例
1.与117-143生物素化的寡核苷酸退火的sph1-pRNA
2.与117-143生物素化的寡核苷酸退火的sph1-pRNA/siRNA(荧光素酶)
3.与117-143生物素化的寡核苷酸退火的sph1-pRNA/siRNA(GFP)
4.与117-143生物素化的寡核苷酸退火的sph1-pRNA/siRNA(存活蛋白)
5.阶梯
6.(空)
7.#1+链霉抗生物素蛋白
8.#2+链霉抗生物素蛋白
9.#3+链霉抗生物素蛋白
10.10.#4+链霉抗生物素蛋白
通过孵育四种生物素RNA与链霉抗生物素蛋白并查看迁移速度变化来测定退火效力。附图56B显示了大部分PAGE纯化的RNA携带3′末端DNA寡核苷酸。
毒性研究
为了确定pRNA的3′末端处DNA寡核苷酸的退火是否可以降低RNA毒性，使用40nM、13.3nM、4.44nM和1.48nM的RNA浓度在细胞系PC3中进行了毒性研究。使用MTT分析(可从Promega获得)来确定各种的构建体的细胞毒性。简要地，将各种的pRNA构建体转染入细胞。使用不同浓度的pRNA构建体测量细胞的生存力。在给定的浓度，具有最高毒性的RNA将杀死大多数细胞。没有细胞毒性或低细胞毒性的RNA构建体将对细胞生存力没有影响或有很低的影响，细胞生存力读取类似于未处理的对照组。
结果
附图57A显示了sph1-pRNA(三角形)；PAGE纯化的、与117-143DNA寡核苷酸退火的sph1-pRNA(菱形)；PAGE纯化的、与117-143生物素化的DNA寡核苷酸退火的sph1-pRNA(正方形)；单独的117-143DNA寡核苷酸(X)；和未纯化的、与117-143 DNA寡核苷酸混合的sph1-pRNA(/短划线)的毒性分析结果。
发现117-143DNA或117-143生物素化的DNA寡核苷酸的退火降低sph1-pRNA的细胞毒性。通过使DNA寡核苷酸与sph1-RNA退火，而不是使用DNA寡核苷酸和sph1-pRNA的混合物(未PAGE纯化的)，实现了降低的毒性。单独的DNA寡核苷酸对细胞生存力具有很小的影响。如以上表明的，通过PAGE凝胶确认了RNA的完整性。结果在附图57A中示出。
另外三组RNA毒性实验(附图57B、C和D)也表明Sph-pRNA/siRNA的毒性可以通过与DNA寡核苷酸退火来降低。
基因沉默
评估了sph1-pRNA/siRNA嵌合体沉默基因表达的能力。sph1-pRNA/siRNA(GFP)和sph1-pRNA/siRNA(荧光素酶)被分别用于测试二聚的pRNA沉默绿色荧光蛋白(GFP)和荧光素酶(Luci)的能力。pRNA/siRNA(GFP)和pRNA/siRNA(荧光素酶)用作对照。据发现，sph1-pRNA/siRNA(GFP)和sph1-pRNA/siRNA(Luci)pRNA嵌合体都以剂量依赖性方式沉默它们相应的目标基因，无论pRNA嵌合体是否在3′末端含有异源寡核苷酸。
材料和方法
果蝇S2细胞以0.6×106个每孔接种到24孔平板中。第二天，质粒pMT-GFP与附图58中标明的浓度的各种嵌合pRNA复合物共转染。GFP表达由CuSO4诱导。使用荧光显微镜采集图像。
结果
与DNA寡聚物退火的sph1-pRNA/siRNA和sph1-pRNA/siRNA对于剂量信赖性方式沉默GFP基因表达都是有效的(附图58，分别为组2和3的左侧画面；附图59)。敲除效果是序列特异性的，因为所有三种含有荧光素酶siRNA序列的RNA没有对GFP表达显示任何抑制效果(附图58；右侧画面)。
序列表自由文本
1     有机体名称：噬菌体phi29/PZA
2     来自噬菌体phi29的环状排列的pRNA(短环体)
3     含有phi29 pRNA和锤头核酶的RNA嵌合体
4     U7snRNA底物
5     抗-12-Lox核酶
6     Lox底物RNA
7     pRNA嵌合体
8     连接环体
9     U7底物
10    RzU7锤头核酶
11    有机体名称：噬菌体SF5′
12    有机体名称：噬菌体B103
13    来自噬菌体phi29的环状排列的pRNA(长环体)
14    有机体名称：噬菌体M2/NF
15    有机体名称：噬菌体GA1
16    aptRNA
17    含有phi29 pRNA和锤头核酶的RNA嵌合体
18    RzA锤头核酶
19-22 3′pRNA延伸
23    锤头核酶
24    乙型肝炎病毒polyA底物
25    含有phi29 pRNA和锤头核酶的RNA嵌合体
26    在茎结构的碱基具有碱基对改变的野生型pRNA。
27    野生型pRNA
28    合成的排列的SF5 pRNA嵌合体
29     合成的排列的B103pRNA嵌合体
30     合成的排列的SF5 pRNA嵌合体
31     合成的排列的M2/NF pRNA嵌合体
32     合成的排列的GA1 pRNA嵌合体
33     合成的排列的适体pRNA嵌合体
34     合成的环状排列的pRNA
35     合成的环状排列的pRNA
36     合成的环状排列的pRNA
37     合成的cpRNA转录产物
38     合成的DNA模板
39     合成的cpRNA转录产物
40     合成的phi29病毒颗粒
41     合成的嵌合pRNA
42     合成的嵌合pRNA
43     合成的嵌合pRNA
44     合成的嵌合pRNA
45     合成的pRNA嵌合体
在此引用的所有专利、包括临时专利申请的专利申请、以及公开物、电子可获得的材料(例如，GenBank氨基酸和核苷酸序列提交)的完整内容通过引用来合并。仅为了理解的清楚性提供了上述详细说明和实施例。由此要理解的是没有不必要的局限。本发明不局限于所显示和描述的确切细节；许多变化将对本领域技术人员是显而易见的，并被视为包括在权利要求定义的本发明内。
序列表
 
<110>PURDUE RESEARCH FOUNDATION
 
<120>用于活性试剂向细胞的递送的多价RNA纳粒
 
<130>290.00760201
 
<140>PCT/US06/029787
<141>2006-08-01
 
<150>60/704,261
<151>2005-08-01
 
<150>10/539,241
<151>2005-06-16
 
<150>PCT/US03/039950
<151>2003-12-16
 
<150>10/373,612
<151>2003-02-24
 
<150>60/433,697
<151>2002-12-16
 
<150>PCT/US01/26333
<151>2001-08-23
 
<150>60/227,393
<151>2000-08-23
 
<160>78
 
<170>PatentIn Ver.3.3
 
<210>1
<211>120
<212>RNA
<213>噬菌体phi-29
 
<400>1
ucaaugguac gguacuucca uugucaugug uauguugggg auuaaacccu gauugaguuc   60
agcccacaua cuuuguugau ugguugucaa ucauggcaaa agugcacgcu acuuugauaa   120
 
<210>2
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的DNA模板
 
<400>2
ttcctaaagg aatgg                                                    15
 
<210>3
<211>168
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的pRNA嵌合体
 
<400>3
guugauuggu ugucaaucau ggcaaaagug cacgcuacuu ugaaaaacaa auucuaaaac   60
ugaugagucc gugaggacga aagcuguaac acaaaaucaa ugguacggua cuuccauugu   120
cauguguaug uuggggauua aacccugauu gaguucagcc cacauaca                168
 
<210>4
<211>24
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：U7 snRNA底物的合成的部分
 
<400>4
guguuacagc ucuuuuagaa uuug                                           24
 
<210>5
<211>46
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的抗-12-LOX核酶
 
<400>5
acgcgguugu accugaugag uccgugagga cgaaacccgg agaaga                   46
 
<210>6
<211>25
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的RNA底物
 
<400>6
ucuucuccgg gucguacaac cgcgu                                          25
 
<210>7
<211>55
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<221>modified_base
<222>(25)..(32)
<223>任何核苷酸且这个区域可以为4-8个核苷酸，优选4或5个核苷酸
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的pRNA嵌合体
 
<400>7
uugucaugug uauguugggg auuannnnnn nncugauuga guucagccca cauac         55
 
<210>8
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的DNA环
 
<400>8
taatacgact cactata                                                   17
 
<210>9
<211>94
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的U7模板
 
<400>9
gggaaagcuu auaguguuac agcucuuuua gaauuugucu agcagguuuu cugacuucgg    60
ucggaaaacg ccuaacguug caugccugca gguc                                94
 
<210>10
<211>47
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的RzU7模板
 
<400>10
ggcaaauucu aaaacugaug aguccgugag gacgaaagcu guaacac                  47
 
<210>11
<211>68
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的排列的SF5 pRNA嵌合体
 
<400>11
gugagacauc guauuuacua uaauguaugu gugucggguu guuuucggau ugaguuccgc    60
cgacagca                                                             68
 
<210>12
<211>72
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的排列的B103 pRNA嵌合体
 
<400>12
gacaaggugc aacacuuccu auaguauggu gcgugauugg gguauauccu gauugaguuc    60
agcccacacg cc                                                        72
 
<210>13
<211>71
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的排列的phi29/PZA pRNA嵌合体
 
<400>13
ucaaugguac gguacuucca uugucaugug uauguugggg auuaaacccu gauugaguuc    60
agcccacaua c                                                         71
 
<210>14
<211>72
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的排列的M2/NF pRNA嵌合体
 
<400>14
gacaaggugc aacacuuccu auaguauggc acaugauugg gguauauccu gauugaguuc    60
agcccacaug uc                                                        72
 
<210>15
<211>68
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的排列的GA1 pRNA嵌合体
 
<400>15
uaaggcauug agguuaaaau auauaggcug ugcaacgggc auccuacugu aaaaaguacc    60
guugacag                                                             68
 
<210>16
<211>75
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的排列的适体pRNA
 
<400>16
ggaaugguac gguacuucca uugucaugug uaggguuggg aagaaacugu ggcacuucgg    60
ugccagcaac ccuac                                                     75
 
<210>17
<211>188
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的核酶pRNA-RzA转录产物
 
<400>17
gcuaguucua gaguugauug guugucaauc auggcaaaag ugcacgcuac uuugcaaaac    60
aaauucuuua cugaugaguc cgugaggacg aaacggguca aaagcaaugg uacgguacuu    120
ccauugucau guguauguug gggauuaaac ccugauugag uucagcccac auacgguacc    180
ucgacguc                                                             188
 
<210>18
<211>66
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的核酶RzA转录产物
 
<400>18
gcuaguucua gacaaauucu uuacugauga guccgugagg acgaaacggg ucgguaccuc    60
gacguc                                                               66
 
<210>19
<211>10
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的3’突出寡核苷酸
 
<400>19
aagccgaauu                                                           10
 
<210>20
<211>59
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的3’突出寡核苷酸
 
<400>20
aagccgaauu ccagcacacu ggcggccguu acuaguggau ccgagcucgg uaccaagcu     59
 
<210>21
<211>54
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的3’突出寡核苷酸
 
<400>21
ccuuuuacau gcgacacaga cgaagcgcua aaacguggga uucugugucg uuuu         54
 
<210>22
<211>120
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的3’突出寡核苷酸
 
<400>22
ucaaugguac gguacuucca uugucaugug uauguugggg auuaaacccu gauugaguuc    60
agcccacaua cuuuguugau ugguugucaa ucauggcaaa agugcacgcu acuuugauaa    120
 
<210>23
<211>40
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的锤头核酶
 
<400>23
caaauucuuu acugaugagu ccgugaggac gaaacggguc                          40
 
<210>24
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的HBV polyA靶
 
<400>24
gacccguaua aagaauuug                                                 19
 
<210>25
<211>162
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的核酶pRNA-RZA
 
<400>25
guugauuggu ugucaaucau ggcaaaagug cacgcuacuu ugaaaaacaa auucuuuacu    60
gaugaguccg ugaggacgaa acgggucaaa aucaauggua cgguacuucc auugucaugu    120
guauguuggg gauuaaaccc ugauugaguu cagcccacau ac                      162
 
<210>26
<211>119
<212>RNA
<213>噬菌体phi-29
 
<400>26
gcaaugguac gguacuucca uugucaugug uauguugggg auuaacgccu gauugaguuc    60
agcccacaua cuuuguugau uguccgucaa ucauggcaaa agugccgcua cuuugcuaa     119
 
<210>27
<211>117
<212>RNA
<213>噬菌体phi-29
 
<400>27
ucaaugguac gguacuucca uugucaugug uauguugggg auuaaacccu gauugaguuc    60
agcccacaua cuuuguugau ugguugucaa ucauggcaaa agugcacgcu acuuuga       117
 
<210>28
<211>44
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的排列的SF5 pRNA嵌合体
 
<400>28
gggagcguaa aacacucuug cauuaaaaau augacugauu ucgc                     44
 
<210>29
<211>43
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的排列的B103 pRNA嵌合体
 
<400>29
ggggauugau agcccucuua cuaaaaguga uuguuucuuu guc    43
 
<210>30
<211>43
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的排列的phi29/PZA pRNA嵌合体
 
<400>30
guugauuggu ugucaaucau ggcaaaagug cacgcuacuu uga    43
 
<210>31
<211>43
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的排列的M2/NF pRNA嵌合体
 
<400>31
ggggauugau aacccucuua cuaaaaguga uuguuucuuu guc    43
 
<210>32
<211>42
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的排列的GA1 pRNA嵌合体
 
<400>32
uguugcgugg uagcaauacu auauauacuc ucucucguuu ua    42
 
<210>33
<211>43
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的排列的适体pRNA
 
<400>33
guugauuggu ugucaaucau ggcaaaagug cacgcuacuu ucc                      43
 
<210>34
<211>71
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的环状排列的pRNA
 
<400>34
gcaaugguac gguacuucca uugucaugug uauguugggg auuaaacccu gauugaguuc    60
agcccacaua c                                                         71
 
<210>35
<211>43
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的环状排列的pRNA
 
<400>35
guugauuggu ugucaaucau ggcaaaagug cacgcuacuu ugc                      43
 
<210>36
<211>157
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<221>modified_base
<222>(29)..(31)
<223>a、c、t、g、未知或其他
 
<220>
<221>modified base
<222>(32)..(131)
<223>任何核苷酸且这个区域可以为25-100个核苷酸
 
<220>
<221>modified_base
<222>(132)..(134)
<223>a、c、t、g、未知或其他
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的环状排列的pRNA
 
<400>36
guacuguuac cuucauggca ugguaacgnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn    60
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn    120
nnnnnnnnnn nnnncguuuc aucgcacgug aaaacgg                            1 57
 
<210>37
<211>119
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的cpRNA转录产物
 
<400>37
ggaaugguac gguacuccau ugucaugugu auguugggga uuaaacccug auugaguuca    60
gcccacauac uuuguugauu gguugucaau cauggcaaag ugcacgcuac uuuccuaaa     119
 
<210>38
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的DNA模板
 
<400>38
ttccttaata cgactcacta taggaatgg                                      29
 
<210>39
<211>133
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的cpRNA转录产物
 
<400>39
ggaaugguac gguacuccau ugucaugugu auguugggga uuaaacccug auugaguuca    60
gcccacauac uuuguugauu gguugucaau cauggcaaag ugcacgcuac uuuccuuaau    120
acgacucacu aua                                                       133
 
<210>40
<211>120
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的phi29病毒颗粒
 
<400>40
ucaaugguac gguacuucca uugucaugug uauguugggg auuaggaccu gauugaguuc    60
agcccacaua cuuuguugau ugcgugucaa ucauggcaaa agugcacgcu acuuugauaa    120
 
<210>41
<211>120
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的嵌合pRNA
 
<400>41
guugauugcg ugucaaucau ggcuuuugag aagcuucuga ugaguccgug aggacgaaau    60
gagucuguuu ugucaugugu auguugggga uuaggaccug auugaguuca gcccacauac    120
 
<210>42
<211>108
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的嵌合pRNA
 
<400>42
guugauuugu cgucaaucau ggccucagag acagagcaga aacgacaguu caagccgaag    60
ucauguguau guuggggauu aacgccugau ugaguucagc ccacauac                108
 
<210>43
<211>72
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的嵌合pRNA
 
<400>43
gucaugugua uguuggggau uagacacuga uugaguucag cccacauacg uugauugucc    60
gucaaucaug gc                                                        72
 
<210>44
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的嵌合pRNA
 
<400>44
cagacucauc aagcuucuc                                                 19
 
<210>45
<211>28
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<221>modified_base
<222>(7)..(14)
<223>任何核苷酸且这个区域可以为4-8个核苷酸，优选4或5个核苷酸
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的pRNA嵌合体
 
<400>45
guugaunnnn nnnngucaau cauggcaa                                        28
 
<210>46
<211>126
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的寡核苷酸
 
<400>46
aggagggugu uugcaaauga uuuuugucau guguauguug gggauuagcc acugauugag     60
uucagcccac auacuuuguu gauuguccgu caaucauggc aauuuucauu ugcuuucacc     120
cuccuu                                                                126
 
<210>47
<211>108
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的寡核苷酸
 
<400>47
guugauugcg ugucaaucau ggccucagag acagagcaga aacgacaguu caagccgaag    60
ucauguguau guuggggauu aggaccugau ugaguucagc ccacauac                 108
 
<210>48
<211>117
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的寡核苷酸
 
<400>48
ucaaugguac gguacuucca uugucaugug uauguugggg auuaacgccu gauugaguuc    60
agcccacaua cuuuguugau uuggcgucaa ucauggcaaa agugcacgcu acuuuga       117
 
<210>49
<211>123
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的寡核苷酸
 
<400>49
agaacggcau caaggugaac uucaagauuu uguauguugg ggauuaggac cugauugagu    60
ucagcccaca uacuuuguug auugcguguc aauuuaucuu gaaguucacc uugaugccgu    120
ucu                                                                  123
 
<210>50
<211>117
<212>RNA
<213>噬菌体phi-29
 
<400>50
agaaugguac gguacuucca uugucaugug uauguugggg auuaggaccu gauugaguuc    60
agcccacaua cuuuguugau ugcgugucaa ucauggcaaa agugcacgcu acuuucu       117
 
<210>51
<211>117
<212>RNA
<213>噬菌体phi-29
 
<400>51
ucaaugguac gguacuucca uugucaugug uauguugggg auuaggaccu gauugaguuc    60
agcccacaua cuuuguugau ugcgugucaa ucauggcaaa agugcacgcu acuuuga       117
 
<210>52
<211>111
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的寡核苷酸
 
<400>52
guugauuguc cgucaaucua ggccucagag acagagcaga aacgacaguu caagccgaag    60
ucauguguau guuggggauu aacgccugau ugaguucagc ccacauacuu u             111
 
<210>53
<211>108
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的寡核苷酸
 
<400>53
ggaccaccgc aucucuacau uuuguauguu ggggauugga ccugauugag uucagcccac    60
auacuuuguu gauugcgugu caauuuaugu agacaugcgg ugguccuu                 108
 
<210>54
<211>82
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的寡核苷酸
 
<400>54
agguacgcgg uacuaacugc cuguuaguug uuucauacac ccgacuugag uuaguccgca    60
auuagggguu guauguguac ug                                             82
 
<210>55
<211>121
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的寡核苷酸
 
<400>55
ccuaagguug agucgcucuc ggugggcuau uuaacugugc guuaguuguu ucauacaccc    60
gacuugaguu aguccagggg gguuguaugu uuuaguccac cgagggcgac uuaaccuuag    120
g                                                                    121
 
<210>56
<211>117
<212>RNA
<213>噬菌体phi-29
 
<400>56
ucaaugguac gguacuucca uugucaugug uauguugggg auuaggaccu gauugaguuc    60
agcccacaua cuuuguugau uguccgucaa ucauggcaaa agugcacgcu acuuuga       117
 
<210>57
<211>100
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的寡核苷酸
 
<400>57
guacgguacu uccauuguca uguguauguu ggggauuagg accugauuga guucagccca    60
cauacuuugu ugauugcgug ucaaucaugg caaaagugca                          100
 
<210>58
<211>100
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的寡核苷酸
 
<400>58
guacgguacu uccauuguca uguguauguu ggggauuaac gccugauuga guucagccca    60
cauacuuugu ugauuguccg ucaaucaugg caaaagugca                          100
 
<210>59
<211>108
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的寡核苷酸
 
<400>59
ggaccaccgc aucucuacau uuuguauguu ggggauugga gcugauugag uucagcccac   60
auacuuuguu gauugcgugu caauuuaugu agagaugcgg ugguccuu                108
 
<210>60
<211>22
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的寡核苷酸
 
<400>60
ccgcaucucu acauucaaga ac                                             22
 
<210>61
<211>159
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的寡核苷酸
 
<400>61
guugauugcg ugucaaucau ggcaaaagug cacgcuacuu uccaaaacuu gaaugcugau   60
gaggccgaaa ggccgaaaga gaugaaaagg aaugguacgg uacuuccauu gucaugugua   120
uguuggggau uaggaccuga uugaguucag cccacauac                          159
 
<210>62
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的寡核苷酸
 
<400>62
gacccguaua aagaauuug                                                 19
 
<210>63
<211>163
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的寡核苷酸
 
<400>63
guuugauugc gugucaauca uggcaaaagu gcacgcuacu uugaaaaaca aauucuuuac   60
ugaugagucc gugaggacga aacgggucaa aaucaauggu acgguacuuc cauugucaug   120
uguauguugg ggauuaggac cugauugagu ucagcccaca uac                     163
 
<210>64
<211>159
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的寡核苷酸
 
<400>64
guugauuguc cgucaaucau ggcaaaagug cacgcuacuu ugaaaaacuu gaaugcugau   60
gaggccgaaa ggccgaaaga gaugaaaauc aaugguacgg uacuuccauu gucaugugua   120
uguuggggau uaacgccuga uugaguucag cccacauac                          159
 
<210>65
<211>100
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的寡核苷酸
 
<400>65
guacgguacu uccauuguca uguguauguu ggggauuaac gccugauuga guucagccca   60
cauacuuugu ugauuuggcg ucaaucaugg caaaagugca                         100
 
<210>66
<211>117
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的寡核苷酸
 
<400>66
ucaaugguac gguacuucca uugucaugug uauguugggg auuagccacu gauugaguuc   60
agcccacaua cuuuguugau uguccgucaa ucauggcaaa agugcacgcu acuuuga      117
 
<210>67
<211>159
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的寡核苷酸
 
<400>67
guugauugcg ugucaaucau ggcaaaagug cacgcuacuu ugaaaaacuu gaaugcugau   60
gaggccgaaa ggccgaaaga gaugaaaauc aaugguacgg uacuuccauu gucaugugua   120
uguuggggau uaggaccuga uugaguucag cccacauac                          159
 
<210>68
<211>101
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的寡核苷酸
 
<400>68
aguacgguac uuccauuguc auguguaugu uggggauuaa cgccugauug aguucagccc   60
acauacuuug uugauuuggc gucaaucaug gcaaaagugc a                       101
 
<210>69
<211>73
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的寡核苷酸
 
<400>69
gcacgctact ttccaaaact tgaatgctga tgaggccgaa aggccgaaag agatgaaaag   60
gaatggtacg gta                                                      73
 
<210>70
<211>72
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的寡核苷酸
 
<400>70
gcacgctact ttccaaaact tgaatgctga tgaggccgaa aggccaaaga gatgaaaagg   60
aatggtacgg ta                                                       72
 
<210>71
<211>72
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的寡核苷酸
 
<400>71
gcacgctact ttccaaaact tgaatgctaa tgaggccgaa aggccaaaga gatgaaaagg   60
aat ggtacgg ta                                                      72
 
<210>72
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的寡核苷酸
 
<400>72
taatacgact cactatagtt gattgcgtgt caatcatggc aaaagtgcac gctactttcc   60
 
<210>73
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的寡核苷酸
 
<400>73
gtatgtgggc tgaactcaat caggtcctaa tccccaacat acacatgaca atggaagtac     60
cgtaccattc c                                                          71
 
<210>74
<211>143
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的寡核苷酸
 
<400>74
agaaugguac gguacuucca uugucaugug uauguugggg auuaaacccu gauugaguuc    60
agcccacaua cuuuguugau ugguugucaa ucauggcaaa agugcacgcu acuuucuaau    120
cccgcggcca uggcggccgg gag                                            143
 
<210>75
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的寡核苷酸
 
<400>75
ctcccggccg ccatggccgc gggatt                                          26
 
<210>76
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的引物
 
<400>76
aaagagccaa gaacaaaatt gc                      22
 
<210>77
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的引物
 
<400>77
gagagagaag cagccactgt tac                     23
 
<210>78
<211>26
<212>RNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>人工序列描述：合成的寡核苷酸
 
<400>78
aaucccgcgg ccauggcggc cgggag                  26

Claims (67)

1.非环状排列的嵌合pRNA单体，其由下述组成：
非环状排列的噬菌体φ29编码的pRNA区域；和
代替pRNA的茎区段5′/3′双链配对的螺旋区域的siRNA。
2.非环状排列的嵌合pRNA单体，其由下述组成：
非环状排列的噬菌体φ29编码的pRNA区域；代替pRNA的茎区段5′/3′双链配对的螺旋区域的siRNA；和在其5′末端和/或3′末端处或附近连接的生物学活性部分或可检测标记或治疗试剂。
3.权利要求1或权利要求2的非环状排列的嵌合pRNA单体，其中所述siRNA对于沉默癌细胞中表达的基因或病毒基因是有效的。
4.权利要求3的非环状排列的嵌合pRNA单体，其中所述基因编码存活蛋白、CD4、BIM或BAD。
5.权利要求2的非环状排列的嵌合pRNA单体，其中所述生物学活性部分是选自抗体和受体配体的靶向部分；其中所述可检测标记选自荧光标记、放射性标记和顺磁性标记；且其中所述治疗试剂是放射性核素。
6.非环状排列的嵌合pRNA单体，其由下述组成：
非环状排列的噬菌体φ29编码的pRNA区域；代替pRNA的茎区段5′/3′双链配对的螺旋区域的siRNA；和在pRNA的5′或3′末端处的异源组件。
7.权利要求6的非环状排列的嵌合pRNA单体，其中所述异源组件包含pRNA突出末端、或与所述pRNA的5′或3′末端退火的寡核苷酸、或选自抗体和受体配体的靶向部分。
8.权利要求5或权利要求7的非环状排列的嵌合pRNA单体，其中所述受体配体选自叶酸和CD4适体。
9.权利要求6的非环状排列的嵌合pRNA单体，其中所述异源组件包含生物学活性部分。
10.权利要求9的非环状排列的嵌合pRNA单体，其中所述生物学活性部分选自由外源RNA、核酶、RNA适体、siRNA、抗受体RNA、反义RNA和肽核酸(PNA)构成的组。
11.权利要求1-7任一项的非环状排列的嵌合pRNA单体，其包含至少一个核苷酸类似物、核苷酸衍生物或修饰的核苷酸。
12.权利要求11的非环状排列的嵌合pRNA单体，其中所述至少一个核苷酸类似物、核苷酸衍生物或修饰的核苷酸选自RNA硫代磷酯、DNA硫代磷酯、2′-F-2′脱氧CTP、2′-F-2′脱氧UTP、2′-O-甲基-核糖核苷酸、2′-NH2-2′-脱氧CTP和2′-CH3-2′-脱氧CTP。
13.权利要求8的非环状排列的嵌合pRNA单体，其中所述叶酸被连接到所述pRNA的5′突出末端。
14.权利要求6的非环状排列的嵌合pRNA单体，其中所述异源组件包含标记试剂。
15.权利要求14的非环状排列的嵌合pRNA单体，其中所述标记试剂选自由生物素、荧光标记、pCp、DIG、-SH、-NH2和磷酸盐构成的组。
16.非环状排列的嵌合pRNA单体，其由配对的双链螺旋结构域、分子间相互作用结构域，和与噬菌体φ29编码的pRNA的5′或3′末端退火的寡核苷酸组成。
17.权利要求16的非环状排列的嵌合pRNA单体，其中所述寡核苷酸包含DNA寡核苷酸。
18.权利要求16或17的非环状排列的嵌合pRNA单体，其中所述寡核苷酸包含可检测标记。
19.权利要求18的非环状排列的嵌合pRNA单体，其中所述可检测标记包含生物素或放射性标记。
20.权利要求16或权利要求17的非环状排列的嵌合pRNA单体，其中所述pRNA包含3′突出末端，并且其中所述寡核苷酸与所述3′突出末端退火。
21.权利要求1-7任一项的非环状排列的嵌合pRNA单体，其从化学合成的RNA片段组装。
22.权利要求21的非环状排列的嵌合pRNA单体，其包含经由碱基配对相互作用缔合的两个分子。
23.多价多聚pRNA复合物，其包含多个嵌合pRNA单体，其中至少一个嵌合pRNA单体包含根据权利要求1-7、9、10和14-17的任一项的非环状排列的嵌合pRNA单体。
24.权利要求23的多价多聚pRNA复合物，其中至少一个非环状排列的嵌合pRNA单体包含靶向部分。
25.权利要求24的多价多聚pRNA复合物，其中所述靶向部分包括RNA适体。
26.权利要求25的多价多聚pRNA复合物，其中RNA适体与生物学活性部分结合。
27.权利要求25的多价多聚pRNA复合物，其中RNA适体与包含肽、蛋白、核酸或病毒的生物学活性分子结合。
28.权利要求24的多价多聚pRNA复合物，其中所述靶向部分包含抗体。
29.权利要求24的多价多聚pRNA复合物，其中所述靶向部分包含受体配体。
30.权利要求29的多价多聚pRNA复合物，其中所述受体配体包含叶酸。
31.权利要求24的多价多聚pRNA复合物，其中所述靶向部分与非环状排列的嵌合pRNA单体的5′或3′末端结合。
32.权利要求23的多价多聚pRNA复合物，所述复合物包含非环状排列的嵌合pRNA单体，所述非环状排列的嵌合pRNA单体包含至少一个包含治疗试剂的异源组件。
33.权利要求23的多价多聚pRNA复合物，所述复合物包含非环状排列的嵌合pRNA单体，所述非环状排列的嵌合pRNA单体包含至少一个包含内涵体破坏试剂的异源组件。
34.权利要求23的多价多聚pRNA复合物，包含至少一个环状排列的嵌合pRNA单体和至少一个非环状排列的嵌合pRNA单体。
35.权利要求23的多价多聚pRNA复合物，其是嵌合pRNA单体的二聚体、三聚体或六聚体。
36.权利要求23的多价多聚pRNA复合物，其中至少一个嵌合pRNA单体包含选自由核酶、siRNA、RNA适体、反义RNA和肽核酸(PNA)构成的组的生物学活性部分。
37.权利要求1-7、9、10和14-17的任一项的非环状排列的嵌合pRNA单体或多价多聚pRNA复合物，包含至少一个非天然的多核苷酸或多核苷酸键。
38.权利要求37的非环状排列的嵌合pRNA单体或多价pRNA复合物，其中所述非天然多核苷酸包含选自由DNA硫代磷酯、RNA硫代磷酯、2′-O-甲基-核糖核苷酸、2′-NH2-2′-脱氧CTP、2′-CH3-2′-脱氧CTP、2′-F-2′脱氧CTP、2′-F-2′脱氧UTP和spiegelmer构成的组的核苷酸。
39.DNA分子，其包括编码权利要求1-7、9、10和14-17任一项的非环状排列的嵌合pRNA单体的核苷酸序列，其中生物学活性部分包含核酸。
40.一种产生非环状排列的嵌合pRNA单体的方法，其包含：
提供DNA分子，其包括编码权利要求1-7、9、10和14-17任一项的非环状排列的嵌合pRNA单体的核苷酸序列，其中生物学活性部分包含核酸；和
体外转录所述DNA来产生所述非环状排列的嵌合pRNA单体。
41.权利要求40的方法，进一步包含使用聚合酶链式反应在DNA模板上产生编码所述非环状排列的嵌合pRNA单体的DNA。
42.权利要求41的方法，进一步包含通过克隆所述DNA到质粒中并复制所述质粒来产生编码所述非环状排列的嵌合pRNA单体的DNA。
43.一种向细胞递送非环状排列的嵌合pRNA单体的体外方法，所述方法不用于疾病的治疗或诊断，包括：
向所述细胞中导入DNA分子，其包括可操作地编码权利要求1-7、9、10和14-17任一项的非环状排列的嵌合pRNA单体的核苷酸序列，其中生物学活性部分包含核酸；和
使所述DNA转录来产生所述非环状排列的嵌合pRNA单体。
44.权利要求43的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
45.权利要求43的方法，其中所述细胞是人细胞。
46.一种向癌细胞递送非环状排列的嵌合pRNA单体的体外方法，所述方法不用于疾病的治疗或诊断，包括：
向所述细胞中导入DNA分子，其包括可操作地编码权利要求1-7、9、10和14-17任一项的非环状排列的嵌合pRNA单体的核苷酸序列，其中生物学活性部分包含核酸；和
使所述DNA转录来产生所述非环状排列的嵌合pRNA单体。
47.权利要求43的方法，其中所述转录在存在于细胞培养物中的细胞内或在从有机体外植的细胞中发生。
48.一种向细胞递送治疗试剂的体外方法，所述方法不用于疾病的治疗或诊断，包括：
使所述细胞与权利要求23的多价多聚pRNA复合物接触，其中所述多价多聚pRNA复合物包含第一嵌合pRNA单体和第二嵌合pRNA单体，所述第一嵌合pRNA单体包含治疗试剂，所述第二嵌合pRNA单体包含靶向部分，从而所述多价多聚复合物被所述宿主细胞摄取。
49.权利要求48的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
50.权利要求48的方法，其中所述细胞是人细胞。
51.一种向癌细胞递送治疗试剂的体外方法，所述方法不用于疾病的治疗或诊断，包括：
使所述细胞与权利要求23的多价多聚pRNA复合物接触，其中所述多价多聚pRNA复合物包含第一嵌合pRNA单体和第二嵌合pRNA单体，所述第一嵌合pRNA单体包含治疗试剂，所述第二嵌合pRNA单体包含靶向部分，从而所述多价多聚复合物被所述宿主细胞摄取。
52.权利要求48的方法，其中所述细胞存在于细胞培养物中或在从有机体外植的细胞中。
53.权利要求51的方法，其中所述细胞存在于细胞培养物中或在从有机体外植的细胞中。
54.权利要求48的方法，其中所述靶向部分结合到受体，并且其中所述多价多聚复合物经由受体介导的内吞作用被所述细胞摄取。
55.权利要求51的方法，其中所述靶向部分结合到受体，并且其中所述多价多聚复合物经由受体介导的内吞作用被所述细胞摄取。
56.一种向病毒感染的细胞递送非环状排列的嵌合pRNA单体的体外方法，所述方法不用于疾病的治疗或诊断，包括：
向所述细胞中导入DNA分子，其包括可操作地编码权利要求1-7、9、10和14-17任一项的非环状排列的嵌合pRNA单体的核苷酸序列，其中生物学活性部分包含核酸；和
使所述DNA转录来产生所述非环状排列的嵌合pRNA单体。
57.一种向病毒感染的细胞递送治疗试剂的体外方法，所述方法不用于疾病的治疗或诊断，包括：
使所述细胞与权利要求23的多价多聚pRNA复合物接触，其中所述多价多聚pRNA复合物包含第一嵌合pRNA单体和第二嵌合pRNA单体，所述第一嵌合pRNA单体包含治疗试剂，所述第二嵌合pRNA单体包含靶向部分，从而所述多价多聚复合物被所述宿主细胞摄取。
58.权利要求56的方法，其中所述细胞存在于细胞培养物中或在从有机体外植的细胞中。
59.权利要求57的方法，其中所述靶向部分结合到受体，并且其中所述多价多聚复合物经由受体介导的内吞作用被所述细胞摄取。
60.一种向植物细胞递送非环状排列的嵌合pRNA单体的方法，包括：
向所述细胞中导入DNA分子，其包括可操作地编码权利要求1-7、9、10和14-17任一项的非环状排列的嵌合pRNA单体的核苷酸序列，其中生物学活性部分包含核酸；和
使所述DNA转录来产生所述非环状排列的嵌合pRNA单体。
61.权利要求60的方法，其中所述方法在存在于植物的细胞中发生。
62.一种向植物细胞递送治疗试剂的方法，包括：
使所述细胞与权利要求23的多价多聚pRNA复合物接触，其中所述多价多聚pRNA复合物包含第一嵌合pRNA单体和第二嵌合pRNA单体，所述第一嵌合pRNA单体包含治疗试剂，所述第二嵌合pRNA单体包含靶向部分，从而所述多价多聚复合物被所述宿主细胞摄取。
63.权利要求62的方法，其中所述细胞存在于细胞培养物中或在从有机体外植的细胞中。
64.权利要求62的方法，其中所述方法在存在于植物的细胞中发生。
65.权利要求62的方法，其中所述靶向部分结合到受体，并且其中所述多价多聚复合物经由受体介导的内吞作用被所述细胞摄取。
66.下述中的至少一种在制备用于治疗癌症或病原体感染的药物中的用途：
(i)根据权利要求1-7、9、10和14-17任一项的嵌合pRNA单体，
(ii)多价多聚复合物，其包含多个嵌合pRNA单体，其中至少一个嵌合pRNA单体包含根据权利要求1-7、9、10和14-17的任一项的非环状排列的嵌合pRNA单体，和
(iii)DNA分子，其包括编码权利要求1-7、9、10和14-17任一项的非环状排列的嵌合pRNA单体的核苷酸序列。
67.药物组合物，其包含下述中的至少一种：
(i)根据权利要求1-7、9、10和14-17任一项的嵌合pRNA单体，
(ii)多价多聚复合物，其包含多个嵌合pRNA单体，其中至少一个嵌合pRNA单体包含根据权利要求1-7、9、10和14-17的任一项的非环状排列的嵌合pRNA单体，和
(iii)DNA分子，其包括编码权利要求1-7、9、10和14-17任一项的非环状排列的嵌合pRNA单体的核苷酸序列。
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