CN101297031B

CN101297031B - 在脊椎动物中作为遗传操作和分析工具的piggyBac

Info

Publication number: CN101297031B
Application number: CN2005800510732A
Authority: CN
Inventors: T·徐; M·韩; Y·庄; X·吴; S·丁; G·李
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2005-05-14
Filing date: 2005-05-14
Publication date: 2013-06-05
Anticipated expiration: 2025-05-14
Also published as: NO20076465L; WO2006122442A1; EP1896578A1; EP1896578A4; MX2007014139A; CA2608481A1; AU2005331864A1; IL187348A0; CN101297031A; US20100154070A1; JP2008545375A; BRPI0520212A2

Abstract

本发明涉及其基因组包含piggyBac家族转座子系统的一种或多种因子的转基因脊椎动物(包括哺乳动物)细胞。还提供其基因组包含piggyBac家族转座子系统的一种或多种因子的转基因非人脊椎动物，包括转基因非人哺乳动物。另外提供制备和使用本发明的细胞和动物的方法，包括在医学、兽医学和农学领域中的应用。本发明还涉及可用于实施这些方法的试剂盒。

Description

在脊椎动物中作为遗传操作和分析工具的piggyBac

1.发明领域

本发明涉及其基因组包含piggyBac家族转座子系统的一种或多种因子的转基因脊椎动物(包括哺乳动物)细胞和转基因非人脊椎动物，包括非人哺乳动物，以及制备和使用所述细胞和动物的方法。本发明还涉及可用于实施这些方法的试剂盒。

2.发明背景

转座因子或转座子是在许多后生动物(包括蠕虫、昆虫和人)中鉴别出来的移动遗传单位。在人和小鼠中，转座子来源的序列占基因组的40％以上(Lander等，2001，Nature 409：860-921；Waterston等，2002，Nature 420：520-562)，表明了转座在进化中的重要性。自从McClintock(McClintock，1950，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 36：344-345)在玉米中发现了第一种转座子，转座因子已成为在许多生物中进行遗传分析的非常宝贵的工具。在原核生物中，基于转座子的诱变已导致发现了对微生物致病原因重要的基因(Hutchison等，1999，Science 286：2165-2169；Vilen等，2003，J.Virol.77：123-134)。在真核生物中，导入P-因子介导的转基因和插入诱变使果蝇遗传学取得了显著进步(Rubin和Spradling，1982，Science 218：348-353)。包括P-因子在内的许多转座子在其天然宿主以外都是无功能的，提示宿主因子参与转座(Handler等，1993，Archives of Insect Biochemistry & Physiology 22：373-384)。

包括Tc1/Mariner家族成员在内的几种转座子系统已应用于小鼠和斑马鱼(Danio rerio)。利用比较系统发育学方法已经证明合成的Tc1样转座子睡美人(Sleeping Beauty(SB))在小鼠和人的细胞中有活性(Ivics等，1997，Cell 91：501-510；Luo等，1998，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 95：10769-10773)。虽然已在小鼠中检验了诸如Sleeping Beauty和Minos的转座子的插入诱变(Dupuy等，2001，Genesis 30：82-88；Fischer等，2001，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 98：6759-6764；Horie等，2001，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 98：9191-9196；Zagoraiou等，2001，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 98：11474-11478)，但由于新转座子插入主要集中在原始位点周围以及以低效率发生的事实，这些转座子在小鼠遗传学中的普遍应用仍然有限(Drabek等，2003，Genomics 81：108-111；Dupuy等，2001，Genesis 30：82-88；Fischer等，2001，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA98：6759-6764；Horie等，2001，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA98：9191-9196；Horie等，2003，Mol.Cell Biol.23：9189-9207；Zagoraiou等，2001，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 98：11474-11478)。

piggyBac因子是2472bp的转座子，具有13bp的反向末端重复(“ITR”)和594个氨基酸的转座酶(Cary等，Virology，Volume 161，8-17，1989)。业已表明，粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的piggyBac转座因子(Cary等，Virology，161卷，8-17，1989)是地中海实蝇(Ceratitis capitata)中的有效基因转移载体(Handler等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95卷，7520-7525，1998)。处于piggyBac启动子调节下的未修饰转座酶辅助质粒(helper)的应用表明piggyBac保留了在地中海果蝇(medfly)中的自主功能，因为转录调节以及酶活性得以保留。此观察结果是绝无仅有的，因为所有其它成功的昆虫种系转化都被局限于使用分离自相同的或另一种双翅类昆虫的载体的双翅类昆虫物种。地中海果蝇的最初转化(Loukeris等，Science，270卷，2002-2005，1995)使用得自海德氏果蝇(Drosophila hydei)的Minos载体(Franz和Savakis，Nucl.Acids Res.，19卷，6646，1991)，而埃及斑蚊(Aedes aegypti)已由家蝇(Muscadomestica)(Warren等，Genet.Res.Camb.，Volume 64，87-97，1994)的Hermes(Jasinskiene等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95卷，3743-3747，1998)和毛里塔尼亚果蝇(Drosophila mauritiana)(Jacobson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83卷，8684-8688，1986)的mariner(Coates等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95卷，3748-3751，1998)转化。黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)也已用Hermes(O′Brochta等，Insect Biochem.Molec.Biol.，26卷，739-753，1996)、mariner(Lidholm等，Genetics，134卷，859-868，1993)、Minos(Franz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91卷，4746-4750，1994)以及最初在其自身基因组中发现的P和hobo转座子(Rubin和Spradling，1989；Blackman等，EMBO J.，8卷，211-217，1989)转化。黑果蝇(Drosophila virilis)也已用hobo(Lozovskaya等，Genetics，143卷，365-374，1995；Gomez & Handler，Insect Mol.Biol.，6卷，1-8，1997)和mariner(Lohe等，Genetics，143卷，365-374，1996)转化。尽管对双翅类昆虫载体的局限部分缘于由非双翅类昆虫物种获得的转座子系统数目有限，但鉴于功能性转座子可能对宿主基因组具有有害作用，对转座子功能的系统发生限制并不出乎意料。实际上，这可由作用于物种间、宿主物种的品系间乃至生物内的细胞类型间的转座子移动的高水平调节反映出来(Berg和Howe，Mobile DNA，AmericanSociety for Microbiology，Washington，D.C.1989)。

piggyBac(PB)属于DNA转座子，其因子一般通过切割和粘贴机制由由一个基因组位点切离，并整合入另一个基因组位点。其是一个2472-bp的转座子，具有13-bp的反向末端重复(ITR)和594个氨基酸的转座酶(Cary等，1989，Virology 172：156-169；Fraser等，1995，Virology 211：397-407；Fraser等，1996，Insect Molecular Biology5：141-151)。piggyBac因子已用于黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)和其它昆虫的遗传分析。已发现转座子插入到4核苷酸TTAA位点中，该TTAA位点在插入处重复(Fraser等，1995，Virology 211：397-407；Fraser等，1996，Insect Molecular Biology 5：141-151)。因为其特有的转座酶和TTAA靶位点序列，所以已表明该转座子为一个新DNA转座子家族-piggyBac家族的创始成员(Robertson，2002，载于MobileDNA II，Craig等编辑，(Washington，D.C.，ASM Press)，1093-1110页)。piggyBac已用于转化覆盖4个昆虫目的10多种物种的种系(Handler，2002，Insect Biochemistry & Molecular Biology 32：1211-1220；Sumitani等，2003，Insect Biochem.Mol.Biol.33：449-458)。作为诱变剂，piggyBac在果蝇属(Drosophila)中的转座效率至少和P因子等效(Thibault等，2004，Nat.Genet.36：283-287)。在红色面象虫(Tribolium castaneum)中，piggyBac转座也在非同源染色体间有效发生(Lorenzen等，2003，InsectMol.Biol.12：433-440)。在从真菌到哺乳动物的许多系统发育地位不同的物种基因组中都发现有很多piggyBac样序列，进一步表明了其活性可能并不仅局限在昆虫中(Sarkar等，2003，Mol.Genet.Genomics270：173-180)。事实上，最近已发现piggyBac能在涡虫(Girardia tigrina)中转座(Gonzalez-Estevez等，2003，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA100：14046-14051)。

本文的论述或提及的参考文献不应被解释为承认这些参考文献是本发明的先有技术。

3.发明概述

本发明基于出乎意料发现：piggyBac在脊椎动物(包括哺乳动物)细胞中于体内和离体均可有效移位。piggyBac转座几乎独有地依照精确的切割和粘贴方式发生在TTAA位点。当将piggyBac转座子导入到受精卵中时，其可整合入小鼠基因组中，而没有明显的染色体区域偏好，优选插入到转录单位中。另外，piggyBac因子可携带多个标记基因，并允许这些基因在不同的插入位点表达。因此，piggyBac转座子系统和“piggyBac样”转座子家族的其它成员是在小鼠和其它脊椎动物中进行有效遗传操作和分析的有价值的新工具。

本发明提供制备转基因非人脊椎动物的方法，所述脊椎动物在其一种或多种细胞的基因组中包含piggyBac样转座子和/或piggyBac样转座酶。因此，本文提供将piggyBac样转座子和转座酶导入动物中的方法，还提供移动或固定piggyBac样转座子的方法。

在某些实施方案中，本发明提供产生转基因非人脊椎动物的方法，所述转基因非人脊椎动物在其一种或多种细胞的基因组中包含携带至少1.5kb的插入片段的piggyBac样转座子，所述方法包括以下步骤：(a)将含携带至少1.5kb的插入片段的piggyBac样转座子的核酸和在同一核酸中或在独立核酸上的、编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列，离体(ex vivo)导入非人脊椎动物胚胎或受精卵中；(b)在有利于所述胚胎发育成转基因非人脊椎动物的条件下，将所得的非人脊椎动物胚胎或受精卵植入到相同物种的养母(foster mother)中；和(c)在足以允许所述胚胎发育成转基因非人脊椎动物的一段时间后，由该养母回收转基因非人脊椎动物；由此产生在其一种或多种细胞的基因组中包含携带至少1.5kb的插入片段的piggyBac样转座子的转基因非人脊椎动物。

作为将含携带至少1.5kb的插入片段的piggyBac样转座子的核酸离体导入非人脊椎动物胚胎或受精卵中的备选方案，可导入含piggyBac样转座子的重叠部分的多种核酸，只要该重叠足以在导入所述核酸的细胞内部发生同源重组。此备选方案尤其可用于将携带大插入片段的piggyBac样转座子导入细胞基因组中。因此，在这些实施方案中，第一个核酸应具有piggyBac样转座子的左末端和至少一部分插入片段，而第二种核酸应具有piggyBac样转座子的右末端和至少一部分插入片段。如果仅使用两种核酸，则第一种核酸具有的插入片段部分和第二种核酸具有的插入片段部分重叠。如果使用第三种核酸，则第三种核酸应在一个末端与第一种核酸具有重叠区，在另一个末端与第二种核酸具有重叠区。图14B图解了此实施方案。可应用此以多种重叠核酸(例如2、3、4、5、6种或更多种)进行同源重组的基本原理，将具有大插入片段的piggyBac样转座子导入到脊椎动物细胞和生物的基因组中。

本发明还提供一种产生转基因非人脊椎动物的方法，所述转基因非人脊椎动物在其一种或多种细胞的基因组中包含piggyBac样转座子，所述piggyBac样转座子包含编码蛋白的核苷酸序列，其中所述蛋白改变所述转基因非人脊椎动物中的性状，所述方法包括以下步骤：(a)将含piggyBac样转座子的核酸和在同一核酸中或在独立核酸上的、编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列，离体导入非人脊椎动物胚胎或受精卵中，所述piggyBac样转座子包含编码蛋白的核苷酸序列，其中所述蛋白改变所述转基因非人脊椎动物中的性状；(b)在有利于所述胚胎发育成转基因非人脊椎动物的条件下，将所得的非人脊椎动物胚胎或受精卵植入到相同物种的养母中；和(c)在足以允许所述胚胎发育成转基因非人脊椎动物的一段时间后，由该养母回收转基因非人脊椎动物；由此产生在其一种或多种细胞的基因组中包含piggyBac样转座子的转基因非人脊椎动物，所述piggyBac样转座子包含编码蛋白的核苷酸序列，其中所述蛋白改变所述转基因非人脊椎动物中的性状。

本发明还提供一种产生转基因非人脊椎动物的方法，所述转基因非人脊椎动物在其一种或多种细胞的基因组中包含piggyBac样转座子，其中所述piggyBac样转座子位于串联体(concatamer)中，所述串联体包含多个piggyBac样转座子，所述方法包括以下步骤：(a)将含piggyBac样转座子的线性化核酸和在同一核酸中或在独立核酸上的、编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列，离体导入非人脊椎动物胚胎或受精卵中；(b)在有利于所述胚胎发育成转基因非人脊椎动物的条件下，将所得的非人脊椎动物胚胎或受精卵植入到相同物种的养母中；和(c)在足以允许所述胚胎发育成转基因非人脊椎动物的一段时间后，由该养母回收转基因非人脊椎动物，由此产生在其一种或多种细胞的基因组中含位于串联体内的piggyBac样转座子的转基因非人脊椎动物，所述串联体含多个piggyBac样转座子。

本发明再提供一种产生转基因非人脊椎动物的方法，所述转基因非人脊椎动物在其一种或多种细胞的基因组中包含编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列，其中所述编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列位于串联体中，所述串联体包含多个核苷酸序列，其中每个核苷酸序列都编码piggyBac样转座酶，所述方法包括以下步骤：(a)将含编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列的线性化核酸离体导入非人脊椎动物胚胎或受精卵中；(b)在有利于所述胚胎发育成转基因非人脊椎动物的条件下，将所得的非人脊椎动物胚胎或受精卵植入到相同物种的养母中；和(c)在足以允许所述胚胎发育成转基因非人脊椎动物的一段时间后，由该养母回收转基因非人脊椎动物，由此产生在其一种或多种细胞的基因组中含编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列的转基因非人脊椎动物，其中所述编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列位于串联体中，所述串联体包含多个核苷酸序列，其中每个核苷酸序列都编码piggyBac样转座酶。

本发明还又提供一种产生转基因非人脊椎动物的方法，所述转基因非人脊椎动物在其一种或多种细胞的基因组中包含固定的piggyBac样转座子，所述方法包括以下步骤：(a)分别将(i)含piggyBac样转座子的核酸；和(ii)piggyBac样转座酶多肽离体导入非人脊椎动物胚胎或受精卵中，导入量有效诱导所述piggyBac样转座子整合入所述胚胎的一种或多种细胞的基因组中，或整合入所述卵母细胞或胚胎所来源的一种或多种细胞的基因组中；(b)在有利于所述胚胎发育成转基因非人脊椎动物的条件下，将所得的非人脊椎动物胚胎或受精卵植入到相同物种的养母中；和(c)在足以允许所述胚胎发育成转基因非人脊椎动物的一段时间后，由该养母回收转基因非人脊椎动物；由此产生在其一种或多种细胞的基因组中含固定的piggyBac样转座子的转基因非人脊椎动物。

本发明还又提供一种产生培养的重组脊椎动物细胞的方法，所述细胞的基因组包含携带至少1.5kb的插入片段的piggyBac样转座子，所述方法包括以下步骤：(a)将含携带至少1.5kb的插入片段的piggBac样转座子的核酸和在同一核酸中或在独立核酸上的、编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列导入到培养的脊椎动物细胞中；和(b)在其中表达piggyBac样转座酶的条件下培养所述细胞，这样piggyBac样转座子被整合入所述培养的脊椎动物细胞的基因组中，由此产生培养的重组脊椎动物细胞，其基因组包含携带至少1.5kb的插入片段的piggyBac样转座子。

作为将含携带至少1.5kb的插入片段的piggyBac样转座子的核酸导入培养的脊椎动物细胞中的备选方案，可导入含piggyBac样转座子的重叠部分的多种核酸，只要该重叠足以在导入所述核酸的细胞内部发生同源重组。如上所述，通过使用仅含部分piggyBac样转座子及其插入片段的多种核酸，该备选方案尤其可用于产生携带大插入片段的piggyBac样转座子并将其导入到细胞基因组中。

本发明还又提供产生培养的重组脊椎动物细胞的方法，所述细胞的基因组包含piggyBac样转座子，所述piggyBac样转座子包含编码在脊椎动物疾病或障碍的治疗或预防中有价值的蛋白的核苷酸序列，所述方法包括以下步骤：(a)将含piggyBac样转座子的核酸和在同一核酸中或在独立核酸上的、编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列导入到培养的脊椎动物细胞中，所述piggyBac样转座子包含编码在脊椎动物疾病或障碍的治疗或预防中有价值的蛋白的核苷酸序列；(b)在其中表达piggyBac样转座酶的条件下培养所述细胞，这样piggyBac样转座子被整合入所述培养的脊椎动物细胞的基因组中，由此产生培养的重组脊椎动物细胞，其基因组包含piggyBac样转座子，所述piggyBac样转座子包含编码在脊椎动物疾病或障碍的治疗或预防中有价值的蛋白的核苷酸序列。

本发明还又提供产生培养的重组脊椎动物细胞的方法，所述细胞的基因组包含piggyBac样转座子，其中所述piggyBac样转座子位于串联体中，所述串联体包含多个piggyBac样转座子，所述方法包括以下步骤：(a)将含piggyBac样转座子的线性化核酸和在同一核酸中或在独立核酸上的、编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列导入到培养的脊椎动物细胞中；(b)在其中表达piggyBac样转座酶的条件下培养所述细胞，这样piggyBac样转座子被整合入所述培养的脊椎动物细胞的基因组中，由此产生培养的重组脊椎动物细胞，其基因组含piggyBac样转座子，其中所述piggyBac样转座子位于串联体中，所述串联体包含多个piggyBac样转座子。

本发明还又提供产生培养的重组脊椎动物细胞的方法，所述细胞的基因组包含编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列，其中所述编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列位于串联体中，所述串联体包含多个核苷酸序列，其中每个核苷酸序列都编码piggyBac样转座酶，所述方法包括以下步骤：(a)将含编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列的线性化核酸导入到培养的脊椎动物细胞中；和(b)在其中编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列被整合入所述培养的脊椎动物的基因组中的条件下培养所述细胞，由此产生培养的重组脊椎动物细胞，其基因组含编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列，其中编码所述piggyBac样转座酶的所述核苷酸序列位于串联体中，所述串联体包含多个核苷酸序列，其中每个核苷酸序列都编码piggyBac样转座酶。

本发明还又提供在非人脊椎动物中移动piggyBac样转座子的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使第一种转基因非人脊椎动物与第二种转基因非人脊椎动物交配，以产生一个或多个子代，所述第一种转基因非人脊椎动物在其一种或多种生殖细胞的基因组中包含piggyBac样转座子，其中所述piggyBac样转座子携带至少1.5kb的插入片段，所述第二种转基因非人脊椎动物在其一种或多种生殖细胞的基因组中包含编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列；(b)鉴别步骤(a)的所述一个或多个子代中至少一个在其一种或多种细胞的基因组中既包含所述piggyBac样转座子又包含所述编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列的子代，使得piggyBac样转座酶被表达，piggyBac样转座子被移动；由此在非人脊椎动物中移动piggyBac样转座子。所述第一种和第二种转基因非人脊椎动物可按照本文描述的任一种方法产生。

本发明还又提供在非人脊椎动物中移动piggyBac样转座子的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使第一种转基因非人脊椎动物与第二种转基因非人脊椎动物交配，以产生一个或多个子代，所述第一种转基因非人脊椎动物在其一种或多种生殖细胞的基因组中包含piggyBac样转座子，其中所述piggyBac样转座子包含编码蛋白的核苷酸序列，其中所述蛋白改变所述转基因非人脊椎动物中的性状，所述第二种转基因非人脊椎动物在其一种或多种生殖细胞的基因组中包含编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列；(b)鉴别步骤(a)的所述一个或多个子代中至少一个在其一种或多种细胞的基因组中既包含所述piggyBac样转座子又包含所述编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列的子代，使得piggyBac样转座酶被表达，piggyBac样转座子被移动；由此在非人脊椎动物中移动piggyBac样转座子。所述第一种和第二种转基因非人脊椎动物可按照本文描述的任一种方法产生。

本发明还又提供在非人脊椎动物中移动piggyBac样转座子的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使第一种转基因非人脊椎动物与第二种转基因非人脊椎动物交配，以产生一个或多个子代，所述第一种转基因非人脊椎动物在其一种或多种生殖细胞的基因组中包含piggyBac样转座子，其中所述piggyBac样转座子位于串联体中，所述串联体包含多个piggyBac样转座子，所述第二种转基因非人脊椎动物在其一种或多种生殖细胞的基因组中包含编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列；(b)鉴别步骤(a)的所述一个或多个子代中至少一个在其一种或多种细胞的基因组中既包含所述piggyBac样转座子又包含所述编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列的子代，使得piggyBac样转座酶被表达，piggyBac样转座子被移动；由此在非人脊椎动物中移动piggyBac样转座子。所述第一种和第二种转基因非人脊椎动物可按照本文描述的任一种方法产生。

本发明还又提供在非人脊椎动物中固定piggyBac样转座子的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使第一种转基因非人脊椎动物与第二种成年脊椎动物交配，以产生一个或多个子代，所述第一种转基因非人脊椎动物在其一种或多种细胞的基因组中既包含(i)含至少2kb的插入片段的piggyBac样转座子，又包含(ii)编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列；(b)鉴别步骤(a)的所述一个或多个子代中至少一个在其基因组中不包含编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列、而在其一种或多种细胞的基因组中包含piggyBac样转座子的子代，使得piggyBac样转座子被固定在所述子代中，由此在非人脊椎动物中固定piggyBac样转座子。所述第一种转基因非人脊椎动物可按照本文描述的任一种方法产生。所述第二种转基因非人脊椎动物不一定是转基因动物；但是，如果是转基因的，则其可按照本文描述的任一种方法产生。

本发明还又提供在非人脊椎动物中固定piggyBac样转座子的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使第一种转基因非人脊椎动物与第二种成年脊椎动物交配，以产生一个或多个子代，所述第一种转基因非人脊椎动物在其一种或多种细胞的基因组中既包含(i)piggyBac样转座子，其包含编码蛋白的核苷酸序列，所述蛋白改变所述转基因非人脊椎动物中的性状，又包含(ii)编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列；(b)鉴别步骤(a)的所述一个或多个子代中至少一个在其基因组中不包含编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列、而在其一种或多种细胞的基因组中包含piggyBac样转座子的子代，使得piggyBac样转座子被固定在所述子代中，由此在非人脊椎动物中固定piggyBac样转座子。所述第一种转基因非人脊椎动物可按照本文描述的任一种方法产生。所述第二种转基因非人脊椎动物不一定是转基因动物；但是，如果是转基因的，则其可按照本文描述的任一种方法产生。

本发明还又提供在非人脊椎动物中固定piggyBac样转座子的方法，所述方法包括以下步骤：(a)使第一种转基因非人脊椎动物与第二种成年脊椎动物交配，以产生一个或多个子代，所述第一种转基因非人脊椎动物在其一种或多种细胞的基因组中既包含(i)piggyBac样转座子，其中所述piggyBac样转座子位于串联体中，所述串联体包含多个piggyBac样转座子，又包含(ii)编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列；(b)鉴别步骤(a)的所述一个或多个子代中至少一个在其基因组中不包含编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列、而在其一种或多种细胞的基因组中包含piggyBac样转座子的子代，使得piggyBac样转座子被固定在所述子代中，由此在非人脊椎动物中固定piggyBac样转座子。所述第一种转基因非人脊椎动物可按照本文描述的任一种方法产生。所述第二种转基因非人脊椎动物不一定是转基因动物；但是，如果是转基因的，则其可按照本文描述的任一种方法产生。

本发明还又提供产生转基因非人脊椎动物的方法，所述转基因非人脊椎动物在其一种或多种细胞的基因组中含固定的piggyBac样转座子，所述方法包括以下步骤：(a)产生一种转基因非人脊椎动物，所述转基因非人脊椎动物在其多种种系细胞的基因组中既包含(i)piggyBac样转座子，又包含(ii)编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列有效连接至在种系中表达的启动子，其中所述piggyBac样转座子和所述编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列中的至少一个在包含多个piggyBac样转座子的串联体中，或在包含多个核苷酸序列的串联体中，所述核苷酸序列每个都编码piggyBac样转座酶，所述产生一种转基因非人脊椎动物包括以下步骤：将一种或多种核酸离体导入非人脊椎动物胚胎或受精卵中，所述一种或多种核酸包含(i)piggyBac样转座子和(ii)编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列有效连接至在种系中表达的启动子，其中所述一种或多种核酸中的至少一种被线性化；在有利于所述胚胎发育成转基因非人脊椎动物的条件下，将所得的非人脊椎动物胚胎或受精卵植入到相同物种的养母中；和在足以允许所述胚胎发育成转基因非人脊椎动物的一段时间后，由该养母回收转基因非人脊椎动物，该动物在其多种种系细胞的基因组中既包含(i)piggyBac样转座子，又包含(ii)编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列有效连接至在种系中表达的启动子，其中所述piggyBac样转座子和所述编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列中的至少一个在包含多个piggyBac样转座子的串联体中，或在包含多个每个都编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列的串联体中；(b)让步骤(a)的回收的转基因非人脊椎动物生长至成年；(c)使步骤(b)的成年转基因非人脊椎动物与第二个成年脊椎动物交配，以产生一个或多个子代；(d)鉴别步骤(c)的所述一个或多个子代中至少一个在其基因组中不包含编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列但在其一种或多种细胞的基因组中包含piggyBac样转座子的子代，所述核苷酸序列有效连接至在种系中表达的启动子，其中所述一个或多个子代均为转基因非人脊椎动物，所述动物在其一种或多种细胞的基因组中包含固定的piggyBac样转座子；由此产生转基因非人脊椎动物，所述动物在其一种或多种细胞的基因组中包含固定的piggyBac样转座子。

本发明还又提供产生转基因非人脊椎动物文库的方法，所述文库的每个在其一种或多种细胞的基因组中均含固定的piggyBac样转座子，所述方法包括以下步骤：(a)产生一种转基因非人脊椎动物，所述转基因非人脊椎动物在其多种种系细胞的基因组中既包含(i)piggyBac样转座子，又包含(ii)编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列有效连接至在种系中表达的启动子，其中所述piggyBac样转座子和所述编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列中的至少一个在包含多个piggyBac样转座子的串联体中，或在包含多个每个都编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列的串联体中，所述产生一种转基因非人脊椎动物包括以下步骤：将一种或多种核酸离体导入非人脊椎动物胚胎或受精卵中，所述一种或多种核酸包含(i)piggyBac样转座子和(ii)编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列有效连接至在种系中表达的启动子，其中所述一种或多种核酸中的至少一种被线性化；在有利于所述胚胎发育成转基因非人脊椎动物的条件下，将所得的非人脊椎动物胚胎或受精卵植入到相同物种的养母中；和在足以允许所述胚胎发育成转基因非人脊椎动物的一段时间后，由该养母回收转基因非人脊椎动物，该动物在其多种种系细胞的基因组中既包含(i)piggyBac样转座子，又包含(ii)编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列有效连接至在种系中表达的启动子，其中所述piggyBac样转座子和所述编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列中的至少一个在包含多个piggyBac样转座子的串联体中，或在包含多个每个都编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列的串联体中；(b)使步骤(a)的回收的转基因非人脊椎动物生长至成年；(c)使步骤(b)的成年转基因非人脊椎动物与第二个成年脊椎动物交配，以产生一个或多个子代；(d)鉴别步骤(c)的两个或多个子代，其中每个均在其基因组中不包含编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列，但在其一种或多种细胞的基因组中包含piggyBac样转座子，所述核苷酸序列有效连接至在种系中表达的启动子，其中所述两个或多个子代均为转基因非人脊椎动物，所述转基因非人脊椎动物在其一种或多种细胞的基因组中包含固定的piggyBac样转座子，由此产生转基因非人脊椎动物的文库，其中每个均在其一种或多种细胞的基因组中包含固定的piggyBac样转座子。

在某些方面，本发明还提供一种转基因非人脊椎动物，所述动物在其一种或多种细胞的基因组中包含piggyBac样转座子和/或piggyBac样转座酶。在某些实施方案中，所述转座子：携带至少1.5kb的插入片段；包含编码蛋白的核苷酸序列，其中所述蛋白改变所述转基因非人脊椎动物中的性状；和/或在包含多个piggyBac样转座子的串联体中。

在某些方面，本发明还提供一种培养的脊椎动物细胞，所述细胞在其基因组中包含piggyBac样转座子和/或piggyBac样转座酶。在某些实施方案中，所述转座子：携带至少1.5kb的插入片段；包含编码蛋白的核苷酸序列，其中所述蛋白改变所述转基因非人脊椎动物中的性状；在包含多个piggyBac样转座子的串联体中；和/或包含编码在脊椎动物疾病或障碍的治疗或预防中有价值的蛋白的核苷酸序列。

本发明还提供本文描述的转基因非人脊椎动物或培养的脊椎动物细胞的文库。在某些实施方案中，所述文库通过本发明的方法生产。在某些实施方案中，转基因非人脊椎动物的文库包含至少6个、至少10个、至少20个、至少50个、至少100个或至少1000个成员，其中至少一些或优选全部在基因组中的不同位置具有piggyBac样转座子。在某些实施方案中，培养的脊椎动物细胞文库包含至少10个、至少20个、至少50个或至少100个成员，其中至少一些或优选全部在基因组中的不同位置具有piggyBac样转座子。因此，在某些实施方案中，本发明提供转基因非人脊椎动物或培养的脊椎动物细胞的文库，其基因组具有piggyBac样转座子，其中所述转座子：携带至少1.5kb的插入片段；所包含的核苷酸序列编码改变转基因非人脊椎动物中性状的蛋白；在包含多个piggyBac样转座子的串联体中；和/或包含编码在脊椎动物疾病或障碍的治疗或预防中有价值的蛋白的核苷酸序列。

本发明的方法和组合物可用于治疗或预防疾病或障碍。因此，在某些方面，本发明提供治疗或预防疾病或障碍的方法，所述方法包括将重组脊椎动物细胞施用给需要此治疗或预防的受治疗者的步骤，其中所述细胞的基因组包含piggyBac样转座子，所述piggyBac样转座子包含编码在脊椎动物疾病或障碍的治疗或预防中有价值的蛋白的核苷酸序列。

在其它方面，本发明提供将核酸传递给需要治疗或预防的受治疗者的一种或多种细胞的方法，所述核酸编码在脊椎动物疾病的治疗或预防中有价值的蛋白，所述方法包括施用重组病毒的步骤，所述病毒的基因组包含：(i)含编码所述蛋白的核苷酸序列的piggyBac样转座子；和(ii)编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列有效连接至引导piggyBac样转座酶在所述受治疗者的所述一种或多种细胞中表达的启动子；使得piggyBac样转座子在所述施用后被整合入所述受治疗者的所述一种或多种细胞的基因组中，由此将编码在脊椎动物疾病的治疗或预防中有价值的蛋白的核酸传递给需要此治疗或预防的受治疗者。在某些实施方案中，所述病毒可为逆转录病毒、腺病毒或腺相关病毒。

本发明还提供一种重组病毒，例如逆转录病毒、腺病毒或腺相关病毒，其基因组包含(i)含编码所述蛋白的核苷酸序列的piggyBac样转座子，和(ii)编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列有效连接至启动子。

由于piggyBac样转座子的精确切离，所以本发明方法可用于确定由在其一种或多种细胞的基因组中包含piggyBac样转座子的转基因非人脊椎动物所展示出的表型是否由所述piggyBac样转座子引起。在某些方面，所述方法包括以下步骤：(a)产生其中所述piggyBac样转座子被切离的所述转基因非人脊椎动物的一个或多个子代；(b)确定所述子代中的所述piggyBac样转座子的切离和表型逆转之间是否存在关联，其中关联表示所述表型由piggyBac样转座子引起，由此确定由在其一种或多种细胞的基因组中包含piggyBac样转座子的转基因非人脊椎动物展示出的表型是否由所述piggyBac样转座子引起。

本发明的piggyBac样转座子可用于增强子捕获。因此，本发明提供由非人脊椎动物或培养的脊椎动物细胞分离增强子的方法。在某些方面，所述方法包括以下步骤：(a)在其一种或多种细胞或组织的基因组中包含piggyBac样转座子的转基因非人脊椎动物中，评价在该转基因非人脊椎动物或由其获得的子代的所述一种或多种细胞或组织中的报告基因表达，其中所述转座子含处于最小启动子控制下的报告基因；和(b)分离所述piggyBac样转座子侧翼的核酸，所述核酸负责报告基因在所述一种或多种细胞或组织中的表达；由此由非人脊椎动物分离出增强子。在其它方面，所述方法可用于由培养的重组脊椎动物细胞分离增强子，其中所述重组细胞包含piggyBac样转座子，所述piggyBac样转座子含处于最小启动子控制下的报告基因，所述方法包括以下步骤：(a)在所述重组脊椎动物细胞或其子代中评价报告基因的表达；和(b)分离所述piggyBac样转座子侧翼的核酸，所述核酸负责报告基因在重组脊椎动物细胞中的表达；由此由培养的重组脊椎动物分离出增强子。

本发明方法是产生嵌合非人脊椎动物的有用方法。因此，在某些方面，本发明提供产生转基因非人脊椎动物的方法，所述动物的细胞是piggyBac样转座子镶嵌体，所述方法包括以下步骤：(a)产生一种转基因非人胚胎，所述胚胎在其基因组中包含(i)piggyBac样转座子纯合型的遗传基因座，其中所述piggyBac样转座子包含位点特异性重组酶识别序列，和(ii)编码所述位点特异性重组酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列有效连接至启动子；(b)在其中表达位点特异性重组酶和发生增殖的条件下培养转基因非人胚胎；由此产生其细胞为piggyBac样转座子镶嵌体的非人转基因脊椎动物。通过这些方法产生的嵌合动物也包括在本发明中。

本发明还提供含适于实施本发明的材料的试剂盒。因此，在某些方面，本发明提供的试剂盒包含：(a)在一个或多个容器中的一种或多种核酸，所述核酸包含(i)piggyBac样转座子和(ii)编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列；和(b)在第二个容器中的(i)培养的脊椎动物细胞或(ii)非人脊椎动物卵母细胞。在具体的实施方案中，piggyBac样转座子携带至少1.5kb的插入片段，和/或携带编码在脊椎动物疾病或障碍的治疗或预防中有价值的蛋白的插入片段。在某些方面，在本发明试剂盒中的至少一种核酸被线性化。

在本文要求保护的方法和组合物的某些实施方案中，piggyBac样转座子包含编码蛋白的核苷酸序列，其中所述蛋白改变所述转基因非人脊椎动物中的性状。

在本文要求保护的方法和组合物的某些方面，包含piggyBac样转座子的核酸被线性化，使得一种或多种所述细胞的基因组包含位于串联体中的所述piggyBac样转座子，所述串联体包含多个piggyBac样转座子。

在本文要求保护的方法和组合物的其它方面，包含编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列的核酸被线性化，使得一种或多种所述细胞的基因组包含位于串联体内的所述编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列，所述串联体包含多个核苷酸序列，其中每个核苷酸序列都编码piggyBac样转座酶。

在本文要求保护的方法和组合物的其它方面，piggyBac样转座子包含由结合和/或修饰核酸的蛋白所识别的序列。在某些实施方案中，所述修饰核酸的蛋白是DNA结合蛋白、DNA-修饰蛋白、RNA结合蛋白或RNA-修饰蛋白。所述修饰核酸的蛋白还可为位点特异性重组酶的靶位点，例如FRT或lox重组酶的靶位点。

在本发明的方法和组合物的其它方面，piggyBac样转座子包含选择标记。在其它方面，piggyBac样转座子包含报告基因。在一个具体实施方案中，piggyBac样转座子既包含选择标记，又包含报告基因。在另一个具体实施方案中，所述报告基因对导入转座子的物种是内源的。

在本发明的方法和组合物的其它方面，piggyBac样转座子包含至少0.5kb、至少1kb或至少1.5kb的插入片段。在其它实施方案中，piggyBac样转座子包含至少2kb、至少2.5kb、至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb、至少8kb、至少9kb、至少10kb、至少11kb、至少11.5kb、至少13kb、至少14kb或至少15kb的插入片段。在其它具体实施方案中，piggyBac样转座子包含不超过15kb、不超过20kb、不超过25kb、不超过30kb、不超过35kb、不超过40kb、不超过45kb、不超过50kb、不超过60kb、不超过75kb或不超过100kb的插入片段。在另外的具体实施方案中，piggyBac样转座子包含处于1.5-3kb、1.5-5kb、1.5-10kb、1.5-20kb、1.5-30kb、1.5-50kb、1.5-75kb、2-5kb、2-10kb、2-20kb、2-30kb、2-50kb、2-75kb、3-5kb、3-10kb、3-20kb、3-30kb、3-50kb、3-75kb、5-10kb、5-20kb、5-30kb、5-50kb、5-75kb、10-20kb、10-30kb、10-50kb或10-75kb之间的插入片段。

在本发明的方法或组合物使piggyBac样转座子和编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列这二者导入到细胞或生物中时，piggyBac样转座子和编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列可在同一核酸中，或在独立核酸上。在其中转座子和转座酶编码区在独立核酸上的实施方案中，含piggyBac样转座子的核酸是DNA，含piggyBac样转座酶的核酸是RNA，使得piggyBac样转座子被固定在所述细胞或生物的基因组中。

备选地，包含piggyBac样转座子和piggyBac样转座酶的核酸均可为DNA，使得可以产生其基因组包含编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列的细胞或生物。优选地，编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列有效连接至启动子。在一个实施方案中，所述启动子引导在种系中的转座酶表达，例如为遍在启动子，或更优选地为种系特异性启动子。在一个实施方案中，所述种系特异性启动子为雄性特异性启动子(例如本文所述的鱼精蛋白1(Prm)启动子)。在另一个实施方案中，所述种系特异性启动子为雌性特异性启动子(例如ZP3启动子)。

本发明的治疗或预防方法的受治疗者优选为非人脊椎动物。在优选实施方案中，所述受治疗者是人或非人动物。在具体实施方案中，所述动物是宠物(例如猫、狗)或家畜(牛、马)。

在某些实施方案中，本发明的转基因非人脊椎动物是鸟(例如鸡或其它禽类)或鱼(例如斑马鱼)。在其它实施方案中，所述脊椎动物是非人哺乳动物，包括但不限于非人灵长类动物、牛、猫、狗、马、绵羊、小鼠、大鼠、豚鼠、熊猫和猪。在具体实施方案中，所述转基因非人脊椎动物是家畜。

本发明的重组细胞可为任意脊椎动物细胞。在具体实施方案中，所述细胞是禽(例如鸡或其它禽类)或鱼(例如斑马鱼)源的细胞。在其它实施方案中，所述细胞是哺乳动物源的，包括但不限于灵长类动物(包括但不限于人细胞和黑猩猩细胞)、牛、猫、狗、马、绵羊、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、貂、熊猫和猪。在其它实施方案中，所述细胞是蛙类细胞，例如非洲爪蟾(Xenopus laevis)细胞。在一个具体实施方案中，细胞来源是家畜。所述细胞可为正常的或患病的，并可为任意不同的类型或状态。

在本发明的某些实施方案中，带有piggyBac样转座子和/或转座酶编码序列的核酸被线性化，然后将其导入到细胞或生物中，使得所述核酸作为串联体被插入到所述细胞或生物的基因组中。

优选地，在本发明的方法和组合物中所使用的piggyBac样转座子是piggyBac转座子，和/或piggyBac样转座酶是piggyBac转座酶。

本发明还提供涵盖本文所述特征的任意排列的实施方案。在本文列出的所有值之间的所有值和范围，例如就piggyBac样转座子插入片段大小或细胞/生物文库大小而言，也包括在本发明中。

4.附图简述

图1，用于哺乳动物细胞和小鼠的piggyBac二元转座子系统的转座子载体和转座酶构建物。(图1A)PB供体构建物。将由各种启动子驱动的标记或内源基因(阴影框，箭头表示转录方向)置于一对PB重复末端(PBL和PBR，黑色箭头)之间。末端之上的箭头显示了用于反向PCR的引物的相对位置。还指示了转座子的总长度。空心框代表质粒主链序列。M：MfeI；B：BamHI；S：SwaI；A：AscI；H：HindIII。(图1B)PB转座酶辅助质粒构建物。由巨细胞病毒(CMV)启动子、β-肌动蛋白(Act)启动子或鱼精蛋白1(Prm1)启动子驱动的piggyBac转座酶基因(PBase)后接牛生长激素polyA(BGH pA)或兔β-球蛋白polyA(rBG pA)。

图2，在哺乳动物培养细胞中的piggyBac整合。(图2A)在293细胞中增强的转基因整合的统计学结果。计数来自由有或没有辅助质粒的供体转座子构建物的转染的G418抗性克隆的数目。每个数目都是由3个转染实验获得的平均值。条棒显示标准偏差(P＜0.0001)。(图2B)在小鼠W4/129S6 ES细胞中增强的转基因整合的统计学结果。克隆如(A)中一样计数。(图2C)小鼠ES细胞转染实验的实例。在G418选择后用亚甲蓝染色存活克隆。

图3，在小鼠中的piggyBac因子转座。(图3A)在通过注射环形质粒所产生的所有幼崽中通过PCR基因分型测定的转座子阳性的创始鼠(founder)的比率。实心条棒和空心条棒分别代表共注射供体质粒和辅助质粒或注射单独的供体质粒获得的结果。PB转座酶的存在导致转基因效率提升。(图3B)PB[Act-RFP]阳性创始鼠的DNA印迹分析。在某些情况下，在一只创始鼠(AF0-41)中观察到超过10个整合，而在野生型对照中没有发现信号。(图3C)DNA印迹分析表明PB因子的种系传递。在与野生型动物交配后，分析创始鼠及其子代。雄性创始鼠(AF0-61)的多个PB[Act-RFP]整合在其子代中分离。携带单个PB[Act-RFP]转座整合(通过DNA印迹和反向PCR结果判断，表3中的A47T6)的雌性PB[Act-RFP]创始鼠(AF0-47)也将其转座子传递给其一个子代(47-336)。

图4，PiggyBac在小鼠种系中的精确切离和转座。共注射Prml-PBase和PB[Act-RFP]的雄性创始鼠用于分析种系转座。(图4A)PB[Act-RFP]转座子的放大结构。基因组DNA由曲线代表，而含PB转座子的质粒串联体显示在对准的框中。限制位点：M：MluI；E：EcoRV；B：BglII；A：Acc65I。用于DNA印迹分析的探针的位置以实线表示。用于检测切离事件的引物以箭头指示。(图4B)创始鼠(BF0-33)及其子代的DNA印迹分析揭示了1.3kb串联体信号之外的条带，因此暗示出现种系转座。(图4C)在用示于(图4A)的引物进行PCR扩增后，在几个子代中观察到具有预期的精确切离后长度的阳性条带。

图5，转基因在piggyBac载体中的表达。(图5A)在子代中的PB[Act-RFP]表达在手提式长波UV灯照射下产生红色荧光。显示了携带相同单拷贝转座子的2只阳性小鼠(箭头)和2只阴性同窝小鼠(星号)。(图5B)在创始鼠及其子代中的PB[Act-RFP]表达。红色荧光在创始鼠中是嵌合体。转座子在子代中分离产生不同的RFP信号强度。星号标记转基因阴性同窝小鼠。(图5C)和(图5D)2个转基因在同一piggyBac载体中的共表达。由于酪氨酸酶的表达，PB[K14-Tyr，Act-RFP]创始鼠在白光下显示出灰色毛色，而转基因阴性同窝小鼠保持白色(图5C，分别在右侧和左侧)。当通过UV照射时，由此创始鼠观察到红色荧光(图5D)。

图6，小鼠中的piggyBac整合位点。(图6A)来自100个PB整合位点的侧翼序列的核苷酸组成。除了TTAA靶点特异性以外，在侧翼序列中还观察到T和A的富集。星号表示在与随机采样的TTAA对照的侧翼序列相比时P＜0.05。(图6B)PB插入在基因中的分布。图解了位于外显子、内含子、5’调节序列(邻接转录起始位点的10kb)、3’调节序列(邻接聚腺苷酸化位点的10kb)和全部4个区域(总计)中的PB插入的百分率。实心条棒指示所有已知和预测的基因的数据，空心条棒指示已知基因或EST的数据。(图6C)PB插入在5’区中的分布。(图6D)PB插入在3’区中的分布。(图6E)在小鼠中93个整合位点的分析表明，PB整合看起来命中了除2个最小染色体(19和Y)之外的所有染色体。实心箭头表示命中外显子，黑色箭头指示命中内含子，空心箭头指示命中预测的基因间区域。

图7，在各种哺乳动物细胞系中增强的piggyBac整合。

图8，piggyBac可在不同物种中转座。

图9，piggyBac可在小鼠体细胞中切离和转座。通过杂交获得Act-PBase和PB串联体双阳性的小鼠。采用PB侧翼引物的PCR检测到转座子由其原始位点切离。通过相同个体的反向PCR进一步揭示了新的转座子插入。这些事件在其PB单阳性亲本中未检测到。因为DNA由尾部样品提取，所以预期所述切离和转座发生在体细胞中。

图10，通过共注射piggyBac转座子和Pmr-piggyBac转座酶构建物而转座。

图11A-C，通过杂交转座。图11A，用杂交策略进一步检验雄性种系特异性启动子(prm)。携带piggyBac转座子的小鼠与携带Pmr-PBase转基因的小鼠杂交，结果表明杂交策略可用于诱导新的转座。图11B，Act-PBase和PB串联体双阳性小鼠与野生型小鼠杂交。通过反向PCR和DNA印迹在该杂交的子代中检测到新转座事件。检验的全部3个新转座均能稳定传递至下一代。图11C，Pmr-PBase和PB串联体双阳性雄性小鼠(DF0-9)活跃地生产携带新转座子插入的子代(由左图的DNA印迹分析和反向PCR揭示)。约50％的新插入位于4号染色体上的推定原始位点附近，提示在PB跳跃时可能发生局部跳跃。携带非自主PB转座子(串联体或单拷贝)的小鼠与携带转座酶的小鼠(例如在小鼠种系中特异性表达转座酶的Pmr-PBase)杂交。转座子/转座酶双阳性F1小鼠(对Pmr-Pbase而言仅雄性小鼠)与野生型小鼠杂交。在下一代(F2)中，使用DNA印迹和反向PCR来克隆新转座位点。使用Pmr-Pbase和Act-Pbase这二者在尝试的每个重组中均获得新插入，即便在携带单拷贝转座子的小鼠用作初始系(starter line)时也是如此。所分析的其中一种转座源于5号染色体，而定位于1号染色体。

图12A-B，piggyBac插入可报告基因表达谱。含lacZ的piggyBac转座子可报告它们所插入基因的表达谱。2个实例：在F27iR43(图12A)中和Grb10(图12B)中插入。在图12B中，显示了携带lacZ报告基因的基于PB的外显子捕获载体的结果。当转座子被插入到Grb10的第一个内含子中时，小鼠胚胎的lacZ染色显示了与其他人报告的结果一致的Grb10表达谱。

图13A-B，piggyBac插入可在小鼠中产生表型。两个实例：在Pkd2基因中插入引起胚胎致死性(隐性的，在Pkd2纯合胚胎中引起灶性出血和全身水肿)(图13A-B)，而在Eya1基因中插入引起眼部缺陷(显性的)(图13B)，就象传统敲除法产生的突变小鼠一样。

图14A-B图解了应用piggyBac样转座子系统将大段DNA插入脊椎动物基因组中。图14A显示了携带一个或多个基因(由黑色箭头指示)并被克隆入piggyBac样转座子的反向末端重复(ITR)中的质粒、粘粒、P1片段或BAC片段。在存在piggyBac样转座酶(环形)时，整个表达盒都将通过转座被整合入基因组(实线)中。备选地，如图14B所示，将大染色体区切成几个部分重叠的片段，两个最外部的部分每个都携带piggyBac样ITR。在存在piggyBac样转座酶时，这些片段应通过转座和同源重组而整合入基因组(实线)中。

5.发明详述

本发明提供了piggyBac样转座子系统在脊椎动物细胞和非人脊椎动物生物体中的应用。本发明提供经工程化而表达piggyBac样转座子系统组分的脊椎动物细胞和非人生物、制备此细胞和生物的方法、这些工程化的细胞和生物的文库。

本发明涉及将本发明的piggyBac样转座子导入细胞基因组中。当细胞还包含piggyBac样转座酶时，发生转座子的有效掺入。如上所述，piggyBac样转座酶可作为piggyBac样转座酶蛋白或编码piggyBac样转座酶的核酸提供给细胞。编码piggyBac样转座酶的核酸可采用RNA或DNA的形式。此外，编码piggyBac样转座酶的核酸可稳定地或瞬时地掺入细胞中，以利于piggyBac样转座酶在细胞中短暂的或延长的表达。此外，启动子或其它表达控制区可与编码piggyBac样转座酶的核酸有效连接，以定量或组织特异性方式调节该蛋白的表达。

可使用本领域已知的各种技术中的任一种将本发明的piggyBac样转座子导入一种或多种细胞中，所述技术包括但不限于微注射、将含转座子的核酸与脂质囊泡如阳离子脂质囊泡组合、粒子轰击、电穿孔、DNA浓缩剂(例如磷酸钙、聚赖氨酸或聚乙烯亚胺)或将转座子掺入病毒载体中并使病毒载体与细胞接触。在使用病毒载体的情况下，病毒载体可包括本领域已知的各种病毒载体中的任一种，包括选自逆转录病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体的病毒载体。

本发明的piggyBac样转座子系统可容易地用于产生转基因动物，其中所述动物在其一种或多种细胞中携带特定标记或表达特定蛋白。产生转基因动物的方法是本领域已知的。

在本发明的另一种应用中，本发明提供一种在细胞中移动piggyBac样序列的方法。在该方法中，piggyBac样转座子被掺入到细胞的DNA中。另外的piggyBac样转座酶或编码piggyBac样转座酶的核酸被导入到细胞中，该蛋白能够将所述核酸片段由细胞DNA中的第一个位置移动(即转移)到该细胞DNA中的第二个位置。该方法允许核酸片段由基因组中的一个位置转移到基因组中的另一个位置，或者例如由细胞中的质粒转移到该细胞的基因组。在一个实施方案中，所述细胞是培养的。

piggyBac样转座子的移动还可以在动物中发生，例如通过使2个成年动物交配，其中1个在其至少一些生殖细胞中带有piggyBac样转座子，而另1个在其至少一些生殖细胞中带有piggyBac样转座酶编码序列，由此产生既具有转座子又具有转座酶的子代。备选地，如下产生转基因动物：将piggyBac样转座子和转座酶的核酸(在相同或独立的核酸上)共注射入卵子或受精卵中，由此产生包含piggyBac样转座子和转座酶编码序列这二者的转基因动物。转座酶编码序列可处于遍在启动子或组织特异性启动子控制之下，使得其在至少一些具有所述转座子的细胞中表达。这使得所述转座子可以移动。如果启动子在种系中有活性，则动物的子代可遗传移动的转座子。为确保移动的转座子的稳定性，选择不包含转座酶编码基因的子代。在这样的子代中，所述转座子被固定。

含与piggyBac样转座酶蛋白或编码piggyBac样转座酶的核酸组合的piggyBac样转座子的本发明的piggyBac样转座子系统是用于种系转化、产生转基因动物、导入核酸至细胞的DNA中、插入诱变以及在各种脊椎动物物种中的基因标记的强力工具。

本发明还提供该系统在脊椎动物中作为有效遗传操作和分析工具的应用，以及在医学、药学和畜牧业中的应用。

5.1.piggyBac样转座子系统

本发明涉及piggyBac样转座子系统在脊椎动物细胞中的应用。此系统用于将核酸序列导入到脊椎动物细胞的DNA中。piggyBac样转座酶结合至piggyBac样转座子的反向重复序列中的识别位点，并催化所述转座子掺入DNA如靶细胞的基因组DNA中。如在实施例中所述，piggyBac样转座子和piggyBac样转座酶编码核酸的这种组合导致转座子序列整合入细胞或生物中。

piggyBac样转座子是可移动的，因为它们可在piggyBac样转座酶存在的情况下由DNA上的一个位置转移到DNA上的第二个位置。piggyBac样转座子系统有两个基本组分：活性piggyBac样转座酶源和由所述转座酶识别并移动的piggyBac样ITR。ITR的移动使ITR之间的间插核酸也被移动。

因此，本发明的piggyBac样转座子系统包含两种组分：piggyBac样转座酶或编码piggyBac样转座酶的核酸，以及克隆的piggyBac样转座子，后者是含至少2个由piggyBac样转座酶识别的反向重复序列的核酸。当将这两种组分放置在一起时，提供了活跃的转座子活性。在使用时，转座酶结合至反向重复序列，促进间插核酸序列整合入细胞的DNA中。

因此，组合物方法的实施涉及一种二分piggyBac样转座子系统，其包含piggyBac样转座因子(transposon element)和piggyBac样转座酶或编码piggyBac样转座酶的核酸。piggyBac样组分可来源于piggyBac或任意相关的piggyBac样转座子系统。

在本发明的piggyBac样转座子中，左和右转座子末端(其含由piggyBac样转座酶识别的5’和3’末端重复序列)侧接插入片段，例如待插入到靶细胞基因组中的核酸或编码选择标记或表型标记的核酸，如下文更详细的描述。

位于或处于piggyBac样转座子的左末端和右末端之间的插入片段的大小可大幅变化。实际上，发明人已得到了出乎意料发现：piggyBac即便在携带14kb或以上的插入片段时仍可稳定转座。在具体的实施方案中，所述插入片段为至少0.5kb、至少1kb、至少1.5kb、至少2kb、至少2.5kb、至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb、至少8kb、至少9kb、至少10kb、至少11kb、至少11.5kb、至少13kb、至少14kb或至少15kb。在其它具体实施方案中，piggyBac样转座子包含不超过15kb、不超过20kb、不超过25kb、不超过30kb、不超过35kb、不超过40kb、不超过45kb、不超过50kb、不超过60kb、不超过75kb或不超过100kb的插入片段。在另外的具体实施方案中，piggyBac样转座子包含处于1.5-3kb、1.5-5kb、1.5-10kb、1.5-20kb、1.5-30kb、1.5-50kb、1.5-75kb、2-5kb、2-10kb、2-20kb、2-30kb、2-50kb、2-75kb、2.5-5kb、2.5-10kb、2.5-20kb、2.5-30kb、2.5-50kb、2.5-75kb、3-5kb、3-10kb、3-20kb、3-30kb、3-50kb、3-75kb、5-10kb、5-20kb、5-30kb、5-50kb、5-75kb、10-20kb、10-30kb、10-50kb或10-75kb之间的插入片段。

在插入片段的尺度大得足以使转座子系统将转座子整合入目标基因组中的能力失活的情况下，可在不同核酸上以重叠部分(例如两个或三个或四个部分)提供转座子，使得同源重组会使不同的核酸在细胞中重组，并在存在piggyBac样转座酶的情况下作为单个大转座子整合入基因组中。因此，在这样的实施方案中，第一种核酸会带有piggyBac样转座子的左末端和至少一部分插入片段，第二种核酸会带有piggyBac样转座子的右末端和至少一部分插入片段。如果仅使用两种核酸，则第一种核酸所带有的插入片段部分和第二种核酸所带有的插入片段部分重叠。如果使用第三种核酸，则第三种核酸应与第一种核酸在一个末端有重叠区，与第二种核酸在另一个末端有重叠区。图14B图解了此实施方案。采用多种(例如2、3、4、5、6个或更多种)重叠核酸进行同源重组的此基本原理可应用于将具有大插入片段的piggyBac样转座子导入脊椎动物细胞或生物的基因组中。以此方式可将具有达50kb、60kb、75kb、100kb、120kb、140kb、160kb乃至更大的插入片段的转座子导入到靶细胞的基因组中。

此同源重组系统有利地允许将大段DNA(例如含内含子、外显子或调节元件的完整基因)插入到靶细胞中。每对核酸之间的重叠程度将取决于靶细胞的重组要求，但可小至约20个核苷酸至几个kb。在具体的实施方案中，重叠的程度为至少50个核苷酸、至少100个核苷酸、至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少500个核苷酸、至少750个核苷酸或至少1kb。在其它实施方案中，重叠的程度不超过750个核苷酸、不超过1kb、不超过1.5kb或不超过1.5kb。

如上所述，本发明的piggyBac样转座子系统还包括piggyBac样转座酶活性源。piggyBac样转座酶活性是结合至piggyBac样转座子的末端重复序列并介导转座子整合入靶细胞基因组中的活性。任意合适的piggyBac样转座酶活性都可用于题述方法，只要其满足以上参数。piggyBac样转座酶活性可来自与piggyBac样转座子自身相同的来源或不同的来源。

piggyBac样转座酶活性的来源可变。在某些实施方案中，所述来源可为表现出piggyBac样转座酶活性的蛋白。但是，所述来源一般是编码具有piggyBac样转座酶活性的蛋白的核酸。当所述来源是编码具有piggyBac样转座酶活性的蛋白的核酸时，编码转座酶蛋白的核酸一般是如上所述的表达组件的一部分，其中额外的因子根据需要供转座酶表达用。因此，转座酶可整合入靶细胞的基因组中。但是，在某些实施方案中，转座酶作为蛋白或RNA提供给细胞。

一般来说，本发明的piggyBac样转座子在载体上被导入到靶细胞中，所述载体例如为质粒、病毒型载体、线性DNA分子等。优选地，piggyBac样转座子包含插入片段，该插入片段含至少一部分可读框。适宜的可读框在5.14节中提供。在一个实施方案中，piggyBac样转座子插入片段还包含调节区，例如转录调节区(例如启动子、增强子、沉默子、基因座控制区或边界元件)。适宜的调节区在5.11节中提供。优选地，所述调节区连接至可读框。

在其中转座酶活性源是编码piggyBac样转座酶的核酸的某些实施方案中，piggyBac样转座子和编码转座酶的核酸存在于独立的载体上，例如独立的质粒。在某些其它实施方案中，转座酶编码序列可与转座子存在于相同的载体上，例如在相同的质粒上。当存在于相同载体上时，piggyBac样转座酶编码区或结构域位于转座子ITR之外。

由其可获得本发明的转座因子和转座酶因子的示例性转座子系统列于以下的表1：

表1-适宜的转座子系统来源

除了在以上表1和以下章节6中提供的具体piggyBac样转座酶序列之外，piggyBac样转座酶可由在严格杂交条件下可与表1中提供的转座酶编码核酸杂交的DNA编码，只要所编码蛋白保留针对piggyBac样转座子的转座酶活性。在具体的实施方案中，转座酶由与表1中提供的piggyBac样转座酶编码序列具有至少60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的序列同一性的核苷酸序列编码。

在某些实施方案中，可对piggyBac样转座酶的氨基酸序列实施多种保守改变，而不改变piggyBac样活性。这些改变称为保守突变，即属于具有特定大小或特征的氨基酸类别的氨基酸可被另一种氨基酸置换，特别是例如在与催化活性或DNA结合活性不相关的蛋白区域中。piggyBac样转座酶的其它氨基酸序列包括具有含相对于本文所提供序列保守改变的氨基酸序列的转座子，所述保守改变不显著改变转座酶的功能。对氨基酸序列的置换可选自该氨基酸所属类别的其它成员。例如，非极性(疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。特别优选的保守置换包括但不限于：Lys置换Arg，反之亦然，以保持正电荷；Glu置换Asp，反之亦然，以保持负电荷；Ser置换Thr，使游离羟基得以保持；以及Gln置换Asn，以保持游离氨基。

此外，可修饰编码piggyBac样转座酶的特定DNA序列，以使用对特定细胞类型优选的密码子，例如对要导入转座酶编码序列的靶细胞优选的密码子。

除了在表1中和在以下章节6中具体列举的piggyBac样转座子序列以外，术语“piggyBac样转座子”包括可由天然或人工转座酶切离并再插入到基因组中的TTAA靶位点的任意DNA片段，以引起侧接所述因子的靶位点重复(TSD)。在具体的实施方案中，该序列来源于列于表1或描述于以下章节6的piggyBac或piggyBac样因子。

5.2.制备piggyBac样转座酶系统的方法

用于题述方法的piggyBac样转座子系统的各种因子，例如含piggyBac样转座子或转座酶因子的载体，可通过限制酶剪切、连接和分子克隆的标准方法产生。一种用于构建题述载体的方法包括以下步骤。首先，用限制性内切核酸酶由初始来源(例如含piggyBac样转座子的载体)切取含所需组成核苷酸序列以及附加序列的纯化的核酸片段。然后使用常规分离方法，例如通过琼脂糖凝胶电泳，将含所需核苷酸序列的片段与不同大小的不需要片段分离。由凝胶切取所需片段，以合适的配置连接在一起，以便产生含如本文所述的所需序列的环形核酸或质粒。在需要时，则在原核宿主如大肠杆菌中扩增如此构建的环形分子。涉及这些步骤的剪切、质粒构建、细胞转化和质粒产生的方法对本领域技术人员而言是众所周知的，限制和连接所需要的酶是商品化的(参见例如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.(1982)；Catalog 1982-83，New EnglandBiolabs，Inc.；Catalog 1982-83，Bethesda Research Laboratories，Inc.)。如何构建用于题述方法的载体的其它实例提供于下文的章节6。

5.3.使用piggyBac样转座子系统将核酸整合入靶细胞基因组中

本文描述的方法可用于其中期望将外源核酸导入并稳定整合入靶细胞或生物的基因组中的各种应用。

目标生物包括脊椎动物，其中所述脊椎动物在许多实施方案中是哺乳动物。在某些实施方案中，本发明的脊椎动物是鸟(例如鸡或其它禽类)或鱼(例如斑马鱼)。在其它实施方案中，所述脊椎动物是非人哺乳动物，包括但不限于非人灵长类动物、牛、猫、狗、马、绵羊、小鼠、大鼠、仓鼠、貂、豚鼠、熊猫和猪。在其它实施方案中，所述生物是蛙类，例如非洲爪蟾(Xenopus laevis)。在一个具体实施方案中，所述转基因非人脊椎动物是家畜。

在涉及将所述转座子系统直接施用给多细胞生物的实施方案中，例如用于基因治疗目的(在下文的5.4节中更详尽地描述)，所述哺乳动物还可以是人。

5.4.将piggyBac样转座系统导入多细胞生物中的方法

piggyBac样转座子系统导入多细胞生物中的途径取决于几个参数，包括：携带所述系统组分的载体的性质、传递载体的性质、生物性质，等等。

该施用模式的共同特征在于其供体内传递转座子系统组分至靶细胞用。在某些实施方案中，线性或环化DNA如质粒用作将转座子系统传递至靶细胞的载体。在这样的实施方案中，质粒可在水性传递溶媒如盐水溶液中给予。备选地，可使用调节载体在多细胞生物中分布的物质。例如，在含题述系统组分的载体为质粒载体的情况下，可使用基于脂质如脂质体的载体，在此情况下基于脂质的载体可靶向特定细胞类型，用于所述载体的细胞或组织特异性传递。公开了这些方法的专利包括：美国专利第5,877,302、5,840,710、5,830,430和5,827,703号，其公开内容在此引入作为参考。备选地，基于多聚赖氨酸的肽可用作载体，其可用或可不用靶向部分等修饰。(Brooks，A.I.等，1998，J.Neurosci.Methods 80卷：137-47页；Muramatsu，T.，Nakamura，A.和H.M.Park 1998，Int.J.Mol.Med.1卷：55-62页)。在其它实施方案中，所述系统组分可掺入到病毒载体上，例如腺病毒衍生载体、新培斯病毒衍生载体、逆转录病毒衍生载体等，杂种载体，诸如此类。以上载体和传递载体仅仅是示例。可使用任意载体/传递载体组合，只要其供体内施用转座子系统至多细胞生物和靶细胞用。在基因治疗背景下适宜的载体/传递载体提供于以下的5.13节。

因为可使用众多不同类型的载体和传递载体，施用可经由众多不同途径进行，其中代表性的施用途径包括：口服、局部、动脉内、静脉内、腹膜内、肌内等。施用的具体模式至少部分取决于用于具有piggyBac样转座子系统的载体的传递载体性质。在许多实施方案中，使用水基传递载体，例如盐水溶液，血管内(例如动脉内或静脉内)施用一种或多种具有piggyBac样转座子系统的载体。

将piggyBac样转座子系统的因子，例如piggyBac样转座子和piggyBac样转座酶源，以体内方式给予多细胞生物，使得它们在足以使反向重复序列侧翼核酸由携带所述转座子的载体切离并且随后切离的核酸被整合入靶细胞基因组中的条件下被导入到多细胞生物的靶细胞中。根据转座子载体自身的结构，即载体是否包含具有piggyBac样转座酶活性的产物的编码区，该方法还可包括将编码必需转座酶活性的第二种载体导入到靶细胞中。

导入到细胞中的含转座因子的载体核酸的量，以及在许多实施方案中导入到细胞中的编码转座酶的载体核酸的量，足以供预期的转座子核酸切离和插入到靶细胞基因组中使用。因此，导入的载体核酸的量应提供足量的转座酶活性和期望插入靶细胞中的足够的核酸拷贝数。导入到靶细胞中的载体核酸量随使用的具体导入方案(例如使用的具体体内施用方案)的效率而变。

施用给多细胞生物的所述系统的各个组分的具体剂量随转座子核酸的性质而变，所述性质例如为表达组件和基因的性质、组分因子存在于其上的载体的性质、传递载体的性质等。剂量可由本领域技术人员凭经验容易地确定。例如，在其中piggyBac样转座子系统组分存在于单独质粒(在盐水溶液载体中静脉内施用给哺乳动物)上的小鼠中，在许多实施方案中施用的转座子质粒的量通常在约0.5-40μg的范围内，通常为约25μg，而施用的piggyBac样转座酶编码质粒的量通常在约0.5-25μg的范围内，通常为约1μg。

一旦载体DNA连同需要的转座酶一起已进入到靶细胞中，反向重复序列侧翼的载体核酸区，即位于piggyBac样转座酶所识别的反向重复序列之间的载体核酸，就被所提供的转座酶由载体上切离，并插入到靶细胞的基因组中。因此，将载体DNA导入到靶细胞之后发生转座酶介导的切离，并将载体所携带的外源核酸插入到靶细胞基因组中。

题述方法可用于将各种大小的核酸整合入靶细胞基因组中，如在上文的5.1节中所述。

题述方法导致核酸稳定整合入靶细胞基因组中。所谓稳定整合指核酸保持存在于靶细胞基因组中不止短时间段，并于部分染色体遗传物质上传递给靶细胞的子代。

5.5.产生含piggyBac样转座子的重组细胞的方法

转化细胞的建立要求DNA首先在物理上处于宿主细胞中。当前的转化步骤使用各种技术将DNA导入细胞中。在一种形式的转化中，通过使用微量移液管将DNA直接微注射入细胞中。备选地，可使用高速粒子轰击将结合小DNA的粒子推进到细胞中。在另一种形式中，细胞因存在聚乙二醇而被透化，因此使DNA通过扩散进入到细胞中。还可以通过将原生质体与含DNA的其它实体融合而将DNA导入到细胞中。这些实体包括微细胞、细胞、溶酶体或其它可融的脂质-表面体。电穿孔也是一种将DNA导入细胞中的可接受方法。在该技术中，细胞经受高场强的电脉冲，高场强可逆地透化生物膜，允许外源DNA序列进入。一种按照本发明将转化构建物导入细胞中的优选方法是用构建物微注射受精卵。在生物发育过程中，侧接转座子反向重复序列的DNA序列被插入到受精卵基因组中，该DNA将被传递到所有的子代细胞，从而产生转基因生物。先前已描述了微注射卵以产生转基因动物，并用于产生转化的哺乳动物(Hogan等，Manipulating The MouseEmbryo：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，N.Y.，1986；Shirk等，载于Biotechnology For Crop Protection，Hedin等(编辑)，ACS Books，Washington D.C.，135-146，1988；Morgan等，Annu.Rev.，Biochem.，62卷，191-217，1993；所有参考文献都在此引入作为参考)。

备选地，可经由病毒将两部分piggyBac样转座子系统传递至细胞，所述病毒包括逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和其它病毒。对于含侧接反向末端重复序列(ITR)的目标转基因的转座子部分和转座酶编码基因，有几种潜在的传递机制组合。例如，转座子和转座酶基因可一起包含在相同的重组病毒基因组上；单次感染传递piggyBac样系统的两个部分，从而使转座酶的表达引导转座子由重组病毒基因组剪切下来，随后整合入细胞染色体中。在另一个实例中，转座酶和转座子可通过病毒和/或非病毒系统如含脂质试剂的组合分别传递。在这些情况下，转座子和/或转座酶基因中的任一种都可以通过重组病毒传递。在每种情况下，所表达的转座酶基因都指引转座子由其载体DNA(病毒基因组)释放出来，用于整合入染色体DNA中。

本发明的piggyBac样转座子系统可导入到脊椎动物源的任意细胞系或原代细胞系中。

在某些实施方案中，所述细胞是一种细胞系，例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、HeLa、VERO、BHK、Cos、MDCK、293、3T3、骨髓瘤(例如NSO、NSI)、HT-1080或W138细胞。脊椎动物细胞也可为细胞融合事件的产物，例如杂交瘤细胞。

在某些实施方案中，所述细胞可为多能细胞(即其后代可分化为几种有限细胞类型的细胞，例如造血干细胞或其它干细胞)或全能细胞(即其后代可变成生物中的任意细胞类型的细胞，例如胚胎干细胞)。本发明还考虑了诸如卵母细胞、卵细胞以及一种或多种胚胎细胞的细胞。

在其它实施方案中，所述细胞可为各种器官或组织来源的成熟细胞。这样的细胞包括但不限于淋巴细胞、肝细胞、神经细胞、肌细胞、各种血液细胞以及生物体的各种细胞。

5.6.产生含piggyBac样转座子的重组动物的方法

将上述piggyBac样转基因导入到非人哺乳动物中。大部分非人哺乳动物是适宜的，包括诸如小鼠和大鼠的啮齿动物、兔、羊科动物(例如绵羊和山羊)、猪科动物(例如猪)以及牛科动物(例如牛和水牛)。

在某些基因转移方法中，将转基因导入到受精卵的原核中。对于某些动物，例如小鼠，体内进行受精，并经手术取出受精卵。在其它动物中，尤其是牛中，优选由活体或屠宰动物取出卵子，并在体外使卵受精。参见DeBoer等，WO 91/08216。体外受精允许转基因被导入处于细胞周期的最佳整合期(不迟于S期)的基本同步细胞中。转基因通常通过微注射导入。参见美国专利第4,873,292号。然后在体外培养受精卵，直至获得含约16-150个细胞的植入前胚胎。胚胎的16-32细胞期被描述为桑椹胚。含超过32个细胞的植入前胚胎称为胚泡。这些胚胎通常在64细胞期显示出囊胚腔发育。培养受精卵至植入前期的方法描述于Gordon等(1984)Methods Enzymol.101，414；Hogan等，Manipulation of the Mouse Embryo：A Laboratory Manual，C.S.H.L.N.Y.(1986)(小鼠胚胎)；和Hammer等(1985)Nature 315，680(兔和猪胚胎)；Gandolfi等(1987)J.Reprod.Fert.81，23-28；Rexroad等(1988)J.Anim.Sci.66，947-953(羊胚胎)和Eyestone等(1989)J.Reprod.Fert.85，715-720；Camous等(1984)J.Reprod.Fert.72，779-785；和Heyman等(1987)Theriogenology 27，5968(牛胚胎)(这些参考文献就其所有用途整体引入作为参考)。有时植入前胚胎冷冻储存一段时间，等待植入。将植入前胚胎转移至适宜的雌性中，根据转基因整合时的发育阶段导致诞生转基因动物或嵌合动物。可繁育嵌合动物，以形成真正的种系转基因动物。

备选地，可将转基因导入到胚胎干细胞(ES)中。这些细胞得自体外培养的植入前胚胎。Bradley等(1984)，Nature 309，255-258(就其所有用途整体引入作为参考)。转基因可通过电穿孔或微注射导入到这些细胞中。使转化的ES细胞与来自非人动物的胚泡混合。ES细胞于胚胎中建群，在某些胚胎中形成所得嵌合动物的种系。参见Jaenisch，Science，240，1468-1474(1988)(就其所有用途整体引入作为参考)。备选地，ES细胞可用作供移植入去核受精卵中用的细胞核源，产生转基因哺乳动物。

对于含两种或多种转基因的转基因动物的生产，例如在其中本发明的piggyBac样转座子和piggyBac样转座酶组分经独立核酸导入到动物中的实施方案中，可使用与对单个基因相同的方法同时导入转基因。备选地，所述转基因起初可导入到单独的动物中，然后通过繁殖所述动物合并入相同基因组中。备选地，产生含其中一种转基因的第一种转基因动物。然后将第二种转基因导入到来自该动物的受精卵或胚胎干细胞中。

在某些实施方案中，将转基因构建为重叠片段，要不然其长度会超过约50kb。将这样的重叠片段同时导入到受精卵或胚胎干细胞中，并经历体内同源重组。参见Kay等，WO 92/03917(就其所有用途整体引入作为参考)。

可如下常规地产生转基因哺乳动物：将上述转基因微注射到哺乳动物受精卵(原核期的受精卵)中，在几次附加温育后将受精卵植入雌性哺乳动物(受体哺乳动物)的输卵管或直接植入其同步假孕子宫，并获得幼崽。

为查明产生的幼崽是否是转基因的，可使用下述斑点印迹分析、PCR、免疫组织学分析、补体抑制分析等。

由此产生的转基因哺乳动物可如下繁殖：常规交配并获得幼崽，或将已初始化或未初始化的转基因哺乳动物体细胞的核转移至其核预先已被去核的受精卵中(核转移)，将卵植入受体哺乳动物的输卵管或子宫中，并获得克隆幼崽。

如果纳入选择标记作为所导入DNA序列的一部分，则可由未转化细胞和/或转化生物中选择转化细胞和/或转基因生物(含插入到宿主细胞DNA中的DNA的细胞和/或生物)。选择标记包括例如提供抗生素抗性的基因；改变宿主生理的基因，例如绿色荧光蛋白，以产生改变的可见表型；等等。含这些基因的细胞和/或生物能够在杀死未转化细胞/生物的抗生素、杀虫剂或除草剂浓度存在下存活，或产生改变的可见表型。使用熟悉本领域的技术人员已知的标准技术，例如DNA印迹分析和聚合酶链反应，可由转基因细胞和/或生物中分离出DNA，以证实所导入的DNA已被插入。

5.7.携带位点特异性重组酶识别位点的piggyBac样转座子

本发明的piggyBac样转座子系统可用于在非人脊椎动物的染色体中随机插入位点特异性重组酶识别序列，以利于产生突变型和/或镶嵌型动物。在具体的实施方案中，位点特异性重组酶是Cre-loxP系统或FLP-FRT系统(参见Kilby，1993，Trends Genet 9(12)：413-421和其中引用的参考文献)。

两个整合在不同染色体上的位点特异性重组酶识别序列之间的重组产生在这些染色体之间转座。这样的转座是建立导致发育异常或肿瘤发生的突变的常见方法。

两个双位点特异性重组酶识别序列之间在直向重复方向的重组可引起间插DNA序列(例如基因)的切离。尽管这样的事件是潜在可逆的，但被切离DNA序列在细胞分裂过程中消失或因降解而消失使突变不可逆。在任意基因中的无效突变都可以此方式建立，可在特定细胞和/或特定发育阶段中研究基因功能。

两个双位点特异性重组酶识别序列之间在反向重复方向的重组可引起间插序列或基因的倒置。倒置可引起基因活化或失活。如果基因活性是可检测的(例如选择标记、组织化学标记、报告基因)，则可通过检测基因活化或失活鉴别标记细胞及其后代的重组事件来跟踪细胞谱系。可通过监测位点特异性重组酶识别序列的整合位点的差异跟踪细胞谱系，而与基因活性无关。

整合在染色体上的位点特异性重组酶识别序列和整合在染色体外遗传物质上的位点特异性酶识别序列之间的重组可使遗传物质插入到染色体中。以此方式建立的插入会提供建立转基因非人动物的方法，该转基因非人动物在其基因组中由染色体位点特异性重组酶识别序列确定的位点处具有位点特异性整合的单拷贝转基因。

优选地，间插序列或遗传物质含基因，例如发育基因、必需基因、细胞因子基因、神经递质基因、神经递质受体基因、癌基因、肿瘤抑制基因、选择标记或组织化学标记或其部分。重组可分别通过调节区与基因的邻接或调节区与基因的分离而引起基因活化或失活。

5.8.外显子捕获

本发明的piggyBac样转座子系统还可用于外显子捕获克隆或启动子捕获程序，以检测各种组织中的差别基因表达。参见例如D.Auch和Reth等，“Exon Trap Cloning：Using PCR to Rapidly Detect and CloneExons from Genomic DNA Fragments”，Nucleic Acids Research，18卷，第22期，6743页；Buckler等，1996，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA88：4005-4009(1991)；Henske等，Am.J.Hum.Genet.59：400-406。在这些实施方案中，piggyBac样转座子优选包含侧接外显子剪接供体和受体位点的检测标记基因，例如GFP或亲和标记。因此，由标记基因编码的蛋白在由其中插入了piggyBac样转座子的遗传基因座所编码的蛋白中被翻译，使得可检测由遗传基因座编码的蛋白。

5.9.多肽合成应用

本文公开的产生转基因动物和镶嵌动物以及重组细胞的方法可用于合成多肽，例如目标蛋白。

在这些应用中，产生其某些或全部细胞的基因组含piggyBac样转座子连同必需和/或期望的表达调节序列如启动子等(即表达组件)的转基因型或镶嵌型动物，以用作表达所述多肽的表达宿主，其中所述piggyBac样转座子含编码目标多肽的插入片段。同样，在这些方法中可使用含此piggyBac样转座子的培养的脊椎动物细胞。然后，让转基因型或镶嵌型动物或重组细胞经历足以表达piggyBac样转座子所带有的插入片段编码多肽的条件。然后使用任意常规方法收集表达的蛋白，并在必要时纯化。

在转基因型或镶嵌型动物背景下，本发明的方法提供了一种在动物中表达目标蛋白或产生能够高水平表达目标蛋白的细胞系的手段。因此，用本发明产生的动物和细胞可用作用于目标蛋白生产的“生物反应器”。目标蛋白对所述细胞或动物来说可为内源的或外源的。

另外，本文描述的方法可用于改良牲畜的性状。

5.10.治疗应用

本发明的方法可用于治疗应用，其中piggyBac样转座子用于将治疗性核酸如基因稳定整合入靶细胞基因组中，即基因治疗应用。piggyBac样转座子系统可用于将各种各样的治疗性核酸传递给受治疗者。治疗性目标核酸包含替代靶宿主细胞中的缺陷基因(例如引起遗传缺陷型病症的基因)的基因或可读框；在癌症治疗中有治疗用途的基因；等等。示例性的治疗有益编码序列公开于5.13节。

如上文所述的题述方法的重要特征在于题述方法可用于体内基因治疗应用。所谓体内基因治疗应用指其中期望治疗性基因表达的一种或多种靶细胞在与转座子系统接触前并未从宿主中取出。相反，包含转座子系统的载体直接施用给多细胞生物，并由靶细胞摄取，之后发生所述基因在靶细胞基因组中的整合。

5.11.启动子

在本发明的一个实施方案中，插入到piggyBac样转座子中的核酸编码有效连接至调节ORF表达的元件的可读框(“ORF”)。另外，调节元件对于调节piggyBac样转座酶的表达而言是理想的，特别是在其中编码转座酶的核酸被导入到动物基因组中的本发明实施方案中。

优选地，piggyBac样转座子中的表达组件包含转录调节元件，其供转座子带有的ORF表达用。具体转录调节元件的实例包括：如Dijkema等，EMBO J.(1985)4：761所述的SV40因子；如Gorman等，Proc.Nat′l Acad.Sci USA(1982)79：6777所述来源于劳斯肉瘤病毒的LTR的转录调节元件；如Boshart等，Cell(1985)41：521所述来源于人巨细胞病毒(CMV)的LTR的转录调节元件；hsp70启动子(Levy-Holtzman，R.和I.Schechter(Biochim.Biophys.Acta(1995)1263：96-98)Presnail，J.K.和M.A.Hoy，(Exp.Appl.Acarol.(1994)18：301-308))等。

在具体的实施方案中，调节元件是诱导型启动子。诱导型启动子对熟悉本领域的人员来说是已知的，存在多种可用于驱动转座酶基因表达的诱导型启动子。诱导型启动子包括例如热激启动子系统、金属硫蛋白系统、糖皮质激素系统、组织特异性启动子等。由热激调节的启动子，例如一般与70kDa热激蛋白编码基因相连的启动子，可在暴露于提升的温度后使表达增加几倍。糖皮质激素系统也可很好地起触发基因表达的作用。该系统由编码糖皮质激素受体蛋白(GR)的基因组成，GR在甾类激素(即糖皮质激素或其一种合成等价物，例如地塞米松)存在下与激素形成复合物。该复合物然后结合称为糖皮质激素效应元件(GRE)的短核苷酸序列(26bp)，此结合活化所连接基因的表达。因此，诱导型启动子可用作控制所导入基因表达的环境诱导型启动子。除了控制基因产物的功能活性的诱导型启动子之外的其它方法对熟悉本领域的人员来说是已知的。

在某些实施方案中，piggyBac样转座酶在种系特异性启动子控制下表达。在某些实施方案中，种系特异性启动子是雄性特异性启动子(例如本文所述的鱼精蛋白1(Prm)启动子)。在其它实施方案中，种系特异性启动子是雌性特异性启动子(例如ZP3启动子，例如鼠ZP3(mZP3)启动子(Lira等，1990，Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.87(18)：7215-9)。

为使用家畜作为生物反应器，蛋白可大量地在乳汁、尿、血液或蛋中生产。在乳汁、尿、血液或蛋中启动表达的启动子是已知的，这些启动子分别包括但不限于酪蛋白启动子、小鼠尿蛋白启动子、β-球蛋白启动子和卵清蛋白启动子。

5.12.piggyBac样转座子诱变和基因发现

转座子标记是一种藉此将转基因DNA传递至细胞，使得转基因DNA整合入基因中，由此通过插入诱变活化基因的技术。在该方法中，被失活基因由转座因子标记，然后可使用转座因子回收突变等位基因。转座因子的插入可破坏可产生特征表型的基因的功能。

由于转座因子在基因组内和基因组间由一个染色体位置向另一个染色体移动的固有能力，其具有某些生物的进化的遗传操作，所述生物包括细菌(Gonzales等，1996 Vet.Microbiol.48，283-291；Lee和Henk，1996.Vet.Microbiol.50，143-148)、果蝇(Drosophila)(Ballinger和Benzer，1989Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，9402-9406；Bellen等，1989 Genes Dev.3，1288-1300；Spradling等，1995 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，10824-10830)、秀丽隐杆线虫(C.elegans)(Plasterk，1995.Meth.Cell.Biol.，Academic Press，Inc.59-80页)和各种植物物种(OpiggyBac-likeorne and Baker，Curr.Opin.Cell Biol，7，406-413(1995))。已利用转座子作为有用的载体进行转座子-标记、增强子捕获和基因转移。但是，即便不是全部也是大部分脊椎动物没有此强力工具。由于本发明的piggyBac样转座子系统的简单性和在不同生物中起作用的能力，其可作为有效载体用于其中DNA转座子技术在当前不可用的物种。

转座子标记是一种其中转座子被移动，以“跳”进基因中，由此通过插入诱变失活所述基因的技术。这些方法论述于Evans等，TIG1997 13：370-374。在该方法中，被失活基因由转座因子“标记”，转座因子随后可用于回收突变的等位基因。因此，本发明提供一种将piggyBac样转座子标记导入细胞基因组中的有效方法。当所述标记被插入到细胞中破坏特定表型相关性蛋白之表达的位置时，在含piggyBac样转座子的细胞中的改变表型的表达则允许将特定表型与已被转座子破坏的特定基因相关联。piggyBac样转座子在此起标记的功能。设计用于反向PCR或对本发明核酸片段侧翼的基因组DNA测序的引物可用于获得有关被破坏基因的序列信息。

有几种分离被标记基因的方法。在所有情况下，通过常规技术(其随不同组织和动物而变)由突变动物的一种或多种组织的细胞中分离基因组DNA。所述DNA通过可在转座子标记中切割或可不切割(多半其的确在已知位点切割)的限制性内切核酸酶剪切。然后将获得的片段直接克隆入质粒或噬菌体载体中，使用针对转座子DNA的探针进行鉴别(参见Mobile Genetic Elements，IRL Press，D.L.Sheratt编辑中Kim等，1995的参考文献)。备选地，所述DNA可以众多方法中的任一种进行PCR扩增。可使用Izsvak和Ivics(1993，Biotechniques.15(5)：814-8)的LM-PCR法。LM-PCR法可按照Devon等(1995，Nucleic Acids Res.23(9)：1644-5)改进的方法实施，并通过其与转座子探针的杂交鉴别。一种备选方法是反向PCR(例如Allende等，1996，Genes Dev.，10：3141-3155)。不考虑克隆的方法，然后对所鉴别的克隆测序。侧接转座子(或其它插入DNA)的序列可通过其与插入因子的不一致性来鉴别。所述序列可组合，然后用于检索核酸数据库中与其它先前已表征基因的同源性，或与编码某种功能的基因或序列基序的部分同源性。在某些情况下，所述基因与任意已知蛋白都没有同源性。其成为其它序列将与其对比的新序列。所编码蛋白将成为进一步研究其在产生诱导其恢复的表型中作用的中心。

因此，piggyBac样转座子可用于使脊椎动物基因组诱变，使得可产生丧失功能的突变体，并筛选突变体的目标表型。通常，使用含一个或多个因子元件的piggyBac样转座子，所述元件允许检测含该转座子的动物。更经常地使用影响可见性状如毛皮或眼睛颜色的标记基因。但是，任意基因都可用作在转基因动物中产生可靠的和容易记录的表型改变的标记。

其中插入了piggyBac样转座子的基因可如下鉴别：用能够剪切piggyBac样转座子序列的限制性内切核酸酶消化转座子插入其中的细胞中的DNA；鉴别转座子的反向重复序列；对紧邻反向重复序列的核酸测序，以获得可读框的DNA序列；并比较该DNA序列与计算机数据库中的序列信息。在一个实施方案中，限制性内切核酸酶识别4碱基识别序列。在另一个实施方案中，消化步骤还包括克隆消化片段或PCR扩增消化片段。在一个实施方案中，所述基因通过反向PCR鉴别。

因此，本发明的piggyBac样转座子系统还可用于基因发现。在一个实施例中，将与piggyBac样转座酶蛋白或编码piggyBac样转座酶的核酸组合的piggyBac样转座子导入细胞中。piggyBac样转座子优选包含一种含标记蛋白(例如GFP)和限制性内切核酸酶识别位点(优选为6碱基识别序列)的插入片段。在整合后，分离细胞DNA，并用限制性内切核酸酶消化。在使用运用4碱基识别序列的限制性内切核酸酶的情况下，细胞DNA被切成平均约256-bp的片段。这些片段可被克隆，或者可将接头加至消化片段的末端，以提供PCR引物的互补序列。在加入接头的情况下，使用来自接头的引物和结合核酸片段中的反向重复序列的正向重复序列的引物，使用PCR反应扩增片段。然后对扩增片段测序，侧接正向重复序列的DNA用于检索计算机数据库，例如GenBank。

5.12.1.用于突变确认的表型逆转

用于本发明方法的piggyBac样转座子在体内转座时精确切离，在切离时没有留下任何转座子序列。可利用piggyBac样转座子系统的此特征，以证实在非人脊椎动物中观测到的表型由piggyBac样转座子在基因组中的插入直接引起。

5.13.基因治疗

用于基因治疗的基因转移载体可大致分类为病毒载体或非病毒载体。piggyBac样转座子系统的应用是对非病毒DNA介导的基因转移的精修。到目前为止，已发现病毒载体在细胞中导入和表达基因方面更有效。对于新基因疗法的开发而言，非病毒基因转移优于病毒介导的基因转移有几个原因。例如，采用病毒作为基因治疗剂使遗传设计限于该病毒基因组在大小、结构和表达调节方面的约束条件。非病毒载体主要由合成原料产生，因此比病毒载体更容易生产。非病毒因子不大可能比病毒因子更具免疫原性，使得可重复施用。非病毒载体比病毒载体更稳定，因此比病毒载体更适合于药用制剂和应用。

目前的非病毒基因转移系统未被配置而促使核酸整合入细胞的DNA(包括宿主染色体)中。因此，使用非病毒系统的稳定基因转移频率一直非常低；在组织培养细胞中最好时为0.1％，在原代细胞和组织中要低得多。本发明的系统是一种有利于整合并显著改善稳定基因转移之频率的非病毒基因转移系统。

在本发明的基因转移系统中，可将piggyBac样转座酶作为蛋白或作为编码蛋白的核酸导入到细胞中。在一个实施方案中，编码蛋白的核酸是RNA，在另一个实施方案中，所述核酸是DNA。此外，可通过病毒载体、阳离子脂质或其它标准转染机制，包括用于真核细胞的电穿孔或粒子轰击，将编码piggyBac样转座酶的核酸掺入到细胞中。在导入编码piggyBac样转座子的核酸后，可将piggyBac样转座酶导入到相同细胞中。

同样，可将piggyBac样转座酶作为线性片段或环化片段、优选作为质粒或重组病毒DNA，导入到细胞中。优选地，所述核酸序列包含至少一部分可读框，以产生含氨基酸的产物。在优选实施方案中，piggyBac样转座子包含编码至少一种蛋白的插入片段，例如选择标记、报告体、治疗性蛋白或在畜牧业有价值的蛋白，并包含至少一个选定用于控制插入到piggyBac样转座子中的可读框或编码区表达的启动子。包含在本发明的piggyBac样转座子中的适宜编码区的更详尽描述提供于下文的5.14节。

关于基因治疗方法的一般性综述，参见Goldspiel等，1993，ClinicalPharmacy 12：488-505；Wu和Wu，1991，Biotherapy 3：87-95；Tolstoshev，1993，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596；Mulligan，1993，Science 260：926-932；以及Morgan和Anderson，1993，Ann.Rev.Biochem.62：191-217；1993年5月，TIBTECH 11(5)：155-215)。重组DNA技术领域公知的可用方法描述于Ausubel等(编辑)，1993，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York；以及Kriegler，1990，Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，New York。任意这样的方法都可用于传递本发明的piggyBac样核酸。

piggyBac样核酸例如为包含piggyBac样转座子和/或编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列的核酸，可选地有效连接至启动子，它们可直接传递到患者中，在该情况下患者与所述核酸或携带核酸的载体直接接触，或者可间接传递到患者中，在该情况下细胞首先用piggyBac样核酸体外转化，然后植入患者中。这两种方法分别被称为体内基因治疗或离体基因治疗。

在具体实施方案中，所述核酸在体内直接施用，其在体内表达以产生所编码产物。这可通过本领域已知的众多方法中的任一种完成，例如通过将其作为适宜核酸表达载体的一部分构建并施用，使得其变成胞内的；例如通过使用缺陷型或减毒型逆转录病毒载体或其它病毒载体感染(参见美国专利第4,980,286号)；或通过直接注射裸DNA；或通过使用微粒轰击(例如基因枪；Biolistic，Dupont)；或用脂质或细胞表面受体或转染剂包被；在脂质体、微粒或微囊中包封；或通过将其连同已知进入细胞核的肽一起施用；通过将其连同经受受体介导的胞吞作用的配体一起施用(参见例如Wu和Wu，1987，J.Biol.Chem.262：4429-4432)(其可用于靶向特异性表达该受体的细胞类型)，等等。在另一个实施方案中，可形成核酸-配体复合物，其中所述配体包含融合病毒肽，以破坏核内体，使核酸得以避免溶酶体降解。在另一个实施方案中，所述核酸可为体内靶向的，以便通过靶向特定受体而被细胞特异性吸收和表达(参见例如1992年4月16日公开的PCT公开说明书WO 92/06180(Wu等)；1992年12月23日公开的WO 92/22635(Wilson等)；1992年11月26日公开的WO 92/20316(Findeis等)；1993年1月22日公开的WO 93/14188(Clarke等)；1993年10月14日公开的WO 93/20221(Young))。备选地，所述核酸可通过同源重组胞内导入，并掺入到宿主细胞DNA中用于表达(Koller和Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935；Zijlstra等，1989，Nature342：435-438)。

在一个具体实施方案中，使用含piggyBac样核酸的病毒载体。例如，可使用逆转录病毒载体(参见Miller等，1993，Meth.Enzymol.217：581-599)。这些逆转录病毒载体已被修饰，以缺失对包装病毒基因组和整合入宿主细胞DNA中非必要的逆转录病毒序列。待用于基因治疗的piggyBac样核酸克隆入有利于将基因传递入患者中的载体中。关于逆转录病毒的更多细节可见于Boesen等，1994，Biotherapy6：291-302。其它阐述逆转录载体在基因治疗中应用的参考文献是：Clowes等，1994，J.Clin.Invest.93：644-651；Kiem等，1994，Blood83：1467-1473；Salmons和Gunzberg，1993，Human Gene Therapy4：129-141；以及Grossman和Wilson，1993，Curr.Opin.载于Geneticsand Devel.3：110-114。

腺病毒是可用于基因治疗的其它病毒载体。腺病毒是用于将基因传递至呼吸道上皮的尤其有吸引力的载体。腺病毒天然感染呼吸道上皮，在该处它们引起轻微疾病。基于腺病毒的传递系统的其它标靶是肝脏、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感染非分裂细胞的优势。Kozarsky和Wilson，1993，Current Opinion in Genetics andDevelopment 3：499-503提出了基于腺病毒的基因治疗的综述。Bout等，1994，Human Gene Therapy 5：3-10证明了应用腺病毒载体将基因转移至猕猴的呼吸道上皮。腺病毒在基因治疗中的应用的其它实例可见于Rosenfeld等，1991，Science 252：431-434；Rosenfeld等，1992，Cell68：143-155；以及Mastrangeli等，1993，J.Clin.Invest.91：225-234。

还已提议腺相关病毒(AAV)用于基因治疗(Walsh等，1993，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204：289-300)。

另一种基因治疗方法包括通过诸如电穿孔、脂转染、磷酸钙介导的转染或病毒感染的方法将piggyBac样核酸转移至组织培养物中的细胞。通常，转移方法包括将选择标记转移给细胞。然后将细胞置于选择压力之下，以分离那些已摄取并表达转移基因的细胞。然后将这些细胞传递给患者。

在该实施方案中，将piggyBac样核酸导入细胞中，然后体内施用所获重组细胞。这样的导入可通过本领域已知的任意方法实施，包括但不限于转染、电穿孔、微注射、用含所述核酸序列的病毒或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微细胞介导的基因转移、原生质球融合等。将外源基因导入细胞中的众多技术是本领域已知的(参见例如Loeffler和Behr，1993，Meth.Enzymol.217：599-618；Cohen等，1993，Meth.Enzymol.217：618-644；Cline，1985，Pharmac.Ther.29：69-92)，可按照本发明使用，只要未破坏受体细胞的必需的发育和生理功能。该技术应使核酸稳定转移入细胞，使得所述核酸可由所述细胞表达，优选地可由其细胞子代遗传和表达。

获得的重组细胞可通过本领域已知的各种方法传递给患者。在一个优选实施方案中，例如皮下注射上皮细胞。在另一个实施方案中，重组皮肤细胞可作为皮肤移植物应用于患者。重组血液细胞(例如造血干细胞或祖细胞)优选静脉内施用。预期使用的细胞量取决于所需效果、患者状况等，可由本领域技术人员确定。

用于基因治疗的可导入piggyBac样核酸的细胞包括任意期望的、可获得的细胞类型，包括但不限于上皮细胞、内皮细胞、角化细胞、成纤维细胞、肌细胞、肝细胞；血细胞，如T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、巨核细胞、粒细胞；各种干细胞或祖细胞，尤其是造血干细胞或祖细胞，例如得自骨髓、脐带血、外周血、胎肝等的造血干细胞或祖细胞。

5.14.由piggyBac样转座子编码的蛋白

如本文所述，本发明的piggyBac样转座子可用于将所述核酸带有的各种核酸传递给受治疗者。另外，在诸如增强子捕获的某些应用中，转座子可有益地带有标记基因。在其它方面，piggyBac样转座子可带有改变靶细胞或生物的基因组中性状的核苷酸序列、选择标记等。以下提供了本发明的piggyBac样转座子带有的此类核酸的实例。

用于治疗或预防基于遗传缺陷的病症的具体治疗剂包括编码以下产物的基因：IX因子、β-球蛋白、低密度蛋白受体、腺苷脱氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶、鞘磷脂酶、葡糖脑苷脂酶、囊性纤维化跨膜调节剂、α-抗胰蛋白酶、CD18、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨琥珀酸合成酶、苯丙氨酸羟化酶、支链α-酮酸脱氢酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、葡糖6-磷酸酶、α-L-岩藻糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、半乳糖1-磷酸尿苷酰转移酶、胰岛素、人生长激素、促红细胞生成素、凝血因子VI、牛生长激素、血小板衍生生长因子、凝血因子VIII、血小板生成素、白介素-1、白介素-2、白介素-1RA、过氧化物歧化酶、过氧化氢酶、成纤维细胞生长因子、轴突生长因子、粒细胞集落刺激因子、L-天冬酰胺酶、尿酸氧化酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶、蔗糖酶、降钙素、Ob基因产物、胰高血糖素、干扰素、转化生长因子、睫状轴突转化因子、胰岛素样生长因子-1、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、脑衍生轴突因子、促胰岛素、组织纤溶酶原激活物、尿激酶、链激酶、腺苷脱酰胺酶、降钙素、精氨酸酶、苯丙氨酸氨裂解酶、γ-干扰素、胃蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶、乳糖酶、内因子、缩胆囊肽和促胰岛素激素(insulinotrophic hormone)等。

可经题述方法传递的癌症治疗基因包括：增强淋巴细胞的抗肿瘤活性的基因、其表达产物增强肿瘤细胞的免疫原性的基因、肿瘤抑制基因、毒素基因、自杀基因、多重抗药性基因、反义序列等。

由本发明的piggyBac样转座子带有的标记基因序列可为酶、含表位的蛋白或肽、受体、转运蛋白、tRNA、rRNA或生物发光剂、化学发光剂或荧光分子。在具体的实施方案中，所述标记是绿色荧光蛋白(GFP)或其突变体，例如具有改变的荧光波长、增加的荧光或这二者的突变GFP。在某些具体的实施方案中，突变GFP是蓝色GFP。在其它模式的实施方案中，所述荧光分子是红色荧光蛋白(参见章节6)或黄色荧光蛋白。在其它实施方案中，所述标记是氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(lacZ)和萤光素酶(LUC)。

在畜牧应用中，piggyBac样转座子可带有生长激素(例如胰岛素样生长因子(IGF))的序列，例如以在转基因动物中促进生长。在其它畜牧应用中，piggyBac样转座子带有的转基因可提供对疾病的更大抗性。

可将多种标记基因插入到本发明的piggyBac样转座子中，包括但不限于可分别在tk-、hgprt-或aprt-细胞中使用单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(Wigler等，1977，Cell 11：223)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(Szybalska和Szybalski，1962，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：2026)和腺苷酸磷酸核糖基转移酶(Lowy等，1980，Cell 22：817)基因。另外，抗代谢物抗性可用作赋予对氨甲蝶呤抗性的dhfr(Wigler等，1980，Natl.Acad.Sci.USA 77：3567；O′Hare等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527)；赋予对霉酚酸抗性的gpt(Mulligan和Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072)；赋予对氨基糖苷G-418抗性的neo(Colberre-Garapin等，1981，J.Mol.Biol.150∶1)；赋予对潮霉素抗性的hygro(Santerre等，1984，Gene 30：147)；允许细胞使用吲哚代替色氨酸的trpB；允许细胞使用组氨醇代替组氨酸的hisD(Hartman和Mulligan，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：8047)；以及赋予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸即DFMO抗性的ODC(鸟氨酸脱羧酶)(McConlogue，L.，1987，载于：Current Communications in MolecularBiology，Cold Spring Harbor Laboratory，Ed.)的选择基础。

5.15.由piggyBac样转座子带有的非编码序列

另外，或作为备选，ORF-本发明的piggyBac样转座子还可包含至少一个由结合和/或修饰核酸的蛋白所识别的序列。在具体的实施方案中，所述蛋白是DNA结合蛋白、DNA-修饰蛋白、RNA-结合蛋白或RNA-修饰蛋白。

在某些具体的实施方案中，所述序列是由限制性内切核酸酶识别的序列，即限制性位点。各种限制性位点是本领域已知的，可包括例如由以下限制酶识别的位点：HindIII、PstI、SalI、AccI、HincII、XbaI、BamHI、SmaI、XmaI、KpnI、SacI、EcoRI等。

在其它具体的实施方案中，所述序列是位点特异性重组酶的靶点，所述重组酶例如为FLP重组酶(即所述序列是FRT)或CRE重组酶(即所述序列是loxP)。这样的实施方案可用于产生如5.7节所述的镶嵌动物。

5.16.本发明的兽医和家畜应用

本发明方法和组合物可在非人动物中用于治疗或预防疾病或障碍或提升家畜品质的兽医应用。

在一个具体的实施方案中，所述非人动物是家庭宠物。在另一个具体实施方案中，所述非人动物是家畜。在一个优选实施方案中，所述非人动物是哺乳动物，最优选为牛、马、绵羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔、仓鼠、貂或豚鼠。在另一个优选实施方案中，所述非人动物是禽类物种，最优选为鸡、火鸡、鸭、鹅或鹌鹑。

6.实施例

6.1.导言

转座因子已常规地用作低等生物中的遗传操作工具，包括产生转基因动物和插入诱变。相比之下，转座子在小鼠和其它脊椎动物系统中的应用仍然有限，原因是没有有效的转座子系统。我们已检验了来自粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的一种DNA转座子piggyBac在哺乳动物系统中转座的能力，并已发现携带多个基因的piggyBac因子可在人和小鼠细胞系中以及在小鼠中有效转座。本文提供的数据表明，在种系转座过程中，piggyBac因子精确地由原始插入位点切离，并在不同位点转座入小鼠基因组中，优选转座入转录单位，并允许由所述转座子携带的标记基因表达。这些数据提供了一个对用于各种遗传操作(包括在小鼠和其它脊椎动物中的基因转移和插入诱变)的高效转座子系统关键的步骤。

6.2.材料和方法

6.2.1.质粒构建

PB[SV40-neo]：pSLfa1180fa的BamHI-KpnI片段(Horn和Wimmer，2000，Dev Genes Evol 210，630-637)由pCLXSN(IMGENEX)的BamHI-KpnI片段替代。然后，用AscI切出新霉素表达盒，并插入到pBac{3xP3-EGFPafm}的AscI位点中(Horn和Wimmer，2000，Dev.Genes Evol.210：630-637)。

CMV-PBase：piggyBac转座酶的编码序列用引物BacEN-F(5’-GCCACCATGGGATGTTCTTTAG-3’)(SEQ ID NO：1)和BacEN-B(5’-GTACTCAGAAACAACTTTGGC-3’)(SEQ ID NO：2)经PCR由phsp-Bac扩增(Handler和Harrell，2001，Insect Biochem Mol Biol31：199-205)，并克隆入pSLfal 180fa的SpeI和SphI位点中，产生pSL-BacEN。由pSL-BacEN分离含所述转座酶基因的HindIII-EcoRI片段，并插入到pcDNA4/HisA(Invitrogen)中，产生最终构建物。

PB[PGK-neo]：将得自pPNT的PGK-neo基因(Tybulewicz等，1991，Cell 65：1153-1163)克隆入一种改良的piggyBac构建物pBac-AB的BglII位点中，产生PB[PGK-neo]。

PB[Act-RFP]：pCX-EGFP的0.7kb EcoRI片段(Okabe等，1997，FEBS Lett 407：313-319)由mRFP的编码序列(Campbell等，2002，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 99：7877-7882)替代，制备pCX-RFP。将包含完整RFP表达盒的pCX-RFP的SalI-BamHI片段进一步克隆入pBac-AB的BglII位点，产生PB[Act-RFP]。加入多接头，产生具有多个独特克隆位点的通用PB载体PB[Act-RFP]DS。

Prm1-PBase：将pPrm1-SB10的Pmr-1启动子和BamHI-SalI片段(Fischer等，2001，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 98：6759-6764)分别克隆入pSL-BacEN的HindIII位点和BamHI-XhoI位点，产生此睾丸特异性转座酶辅助质粒。

Act-PBase：使用NheI-NotI接头，用pSL-BacEN的SpeI-EagI转座酶片段替换pCX-EGFP的EcoRI片段，产生此遍在表达的转座酶辅助质粒。

PB[K14-Tyr]：将plnK14-Albino中的K14启动子的SmaI片段(Saitou等，1995，Nature 374：159-162)、通过RT-PCR由129Sv小鼠的皮肤样品扩增的酪氨酸酶cDNA以及SV40polyA插入到pBac-AB的BglII位点中，产生PB[K14-Tyr]。

PB[K14-Tyr，Act-RFP]：将pCX-RFP的SalI-BamHI片段克隆入PB[K14-Tyr]的AscI位点中，产生该构建物。

PB[Act-RFP，MCK-TSC1]：PB[Act-RFP]的SmaI片段由RFP表达盒和左末端(piggyBacL)组成，用该片段替换pBluescript的SalI-EcoRV片段，产生pBS-BLRFP。然后将由右末端(PBR)组成的PB[Act-RFP]DS的SmaI-EcoRV片段克隆入pBS-BLRFP的PmeI位点中，产生PB[[Act-RFP]，其用作通用piggyBac-型(piggyBac-based)转基因载体。将MCK-TSC1构建物的BssHII片段(Inoki等，2002，Nat.CellBiol.4：648-657)和hGH polyA(Nguyen等，1998，Science 279：1725-1729)克隆入PB[Act-RFP]DS的SwaI位点中。

6.2.2.细胞转染

将293细胞在补加10％血清的DMEM(GIBCO/BRL)中于37℃和5％CO₂下培养。在转染前1天，将1.5×10⁵个细胞接种入24孔板的每个孔中。对于每个孔，按照标准方法(Invitrogen)通过LipofectAMINE2000用测试组中的0.5μg环状PB[SV40-neo]和0.5μg环状CMV-PBase或对照组中的0.5μg环状pcDNA4/HisA进行转染。转染后1天，用胰蛋白酶处理各孔中的细胞，并接种在1个10-cm平板上的含500mg/ml G-418(GIBCO/BRL)的培养基中。药物选择持续2周。

在生产商(Taconic)推荐的方法中描述了W4/129S6小鼠胚胎干(ES)细胞的培养和电穿孔条件。使用测试组中的24μg环形PB[PGK-neo]和6μg Act-PBase或对照组中的6μg鲱鱼精DNA(Promega)电穿孔1×10⁷个细胞。在电穿孔后立即将各组中的细胞接种在3块含丝裂霉素C处理的小鼠胚胎成纤维饲养细胞的10-cm平板上。在电穿孔后48小时用含200mg/ml G-418的培养基启动选择。药物选择持续2周。

在药物选择结束时，用含4％多聚甲醛的PBS固定细胞达10分钟，然后用0.2％亚甲基蓝染色1小时。在用去离子水充分洗涤后计数克隆。

6.2.3.PCR和序列分析

使基因组DNA的HaeIII或MspI消化物自连接，以用作反向PCR的模板。用于回收piggyBac转座子左侧侧翼序列的引物是LF1(5’-CTT GAC CTT GCC ACA GAG GAC TAT TAG AGG-3’)(SEQ IDNO：3)和LR1(5’-CAG TGA CAC TTA CCG CAT TGA CAA GCACGC-3’)(SEQ ID NO：4)。用于回收piggyBac转座子右侧侧翼序列的引物是RF1(5’-CCT CGA TAT ACA GAC CGA TAA AAC ACA TGC-3’)(SEQ ID NO：5)和RR1(5’-AGT CAG TCA GAA ACA ACT TTGGCA CAT ATC-3’)(SEQ ID NO：6)。

用引物EL1(5’-CCA TAT ACG CAT CGG GTT GA-3’)(SEQ IDNO：7)和引物ER1(5’-TTA AAG TTT AGG TCG AGT AAA GCG C-3’)(SEQ ID NO：8)进行切离位点的PCR检测。

将PCR产物克隆入pGEM-T载体(Promega)，用于随后的测序。用NCBI BLAST搜索(www.ncbi.nlm.nih.gov)和Ensembl人或小鼠基因组数据库(www.ensembl.org)分析测序结果。

为检测PB插入事件的附加序列偏好性，对小鼠中的100个piggyBac插入分析TTAA靶位点上游和下游的5个碱基对。同时，分析作为对照的100个随机选择的TTAA位点。用STATISTICA 6.0计算两部分(proportion)之间的单侧概率。

6.2.4.转基因小鼠的产生

将环形piggyBac供体构建物与辅助质粒以2∶1的比率混合。如所述将混合的DNA样品(2ng/μl)微注射入受精的FVB/Nj卵母细胞中(Nagy等，2003，Manipulating the mouse embryo：a laboratory manual，第3版(Cold Spring Harbor Laboratory Press))。

6.2.5.DNA印迹

由尾样品分离基因组DNA，用EcoRV和BglII消化，然后在0.7％琼脂糖凝胶中分离，之后进行DNA印迹分析。探针为PB[Act-RFP]的SacII消化物的499bp片段。

6.3.结果

6.3.1.piggyBac在培养的哺乳动物细胞中的转座活性

由供体和辅助质粒这二者组成的二元共转染测定系统，设计用于检测组织培养细胞中piggyBac介导的染色体整合事件。供体质粒包含其中piggyBac转座酶(PBase)被药物选择标记替换的piggyBac因子(图1A)。辅助质粒携带转座酶片段，但没有转座所需的末端序列(图1B)。在没有辅助质粒的情况下，供体质粒可随机整合入基因组中，但如果供体质粒保持环形形式，则这些随机整合事件可减到最少。因此，在辅助质粒存在下抗药性克隆的增加应指示转座事件。

我们首先检验了人293细胞中的piggyBac转座。携带SV40启动子的驱动新霉素抗性(neo)基因的供体PB[SV40-neo]因子和携带遍在表达的转座酶的辅助CMV-PBase的共转染(图1)产生的新霉素抗性克隆高达用单独的供体质粒转染的10倍咽2A)。为检验提升的供体整合是否归因于转座，进行反向PCR，以回收邻接整合的PB[SV40-neo]的piggyBac右侧反向末端重复(PBR)位点的序列(图1A)。真实转座事件的PCR产物应产生PBR之外的基因组序列，而不是质粒序列。由5个抗药性克隆回收了18个独立的基因组序列。所有这些序列都在整合位点处包含特征(signature)TTAA序列(表2)。

表2.在人293细胞中的PB转座

通过对在转座子另一末端的几个接合片段测序证实了TTAA复制(未出示数据)。相比之下，用单独的PB[SV40-neo]稳定转染的新霉素抗性克隆的反向PCR分析仅检测出接合质粒序列，这与随机插入事件一致(未出示数据)。该实验表明，在人细胞中发生的piggyBac转座与在昆虫细胞中具有相同的位点偏好性。在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和(貂源)MvlLu细胞中实施共转染步骤时获得了相似的结果(参见图7)。

我们接着检验了piggyBac在小鼠W4/129S6胚胎干(ES)细胞中转座的能力。在该检验中，供体质粒PB[PGK-neo]因子携带PGK启动子驱动的neo基因，辅助质粒Act-PBase提供处于杂种肌动蛋白启动子控制之下的piggyBac转座酶(图1B)。在3个重复的转染实验中，PB[PGK-neo]和Act-PBase共转染产生的抗药性克隆平均高达单独的PB[PGK-neo]转染的50倍(图2B和2C)。反向PCR分析证实，增强的克隆生产缘于转座(表3)。

表3.在小鼠W4/129S6胚胎干细胞中的PB转座

当在各种不同来源(包括貂、仓鼠、大鼠、猴、人和鸡)的细胞系中实施共转染步骤时，获得了相似的转座结果(参见图8)。

6.3.2.piggyBac在小鼠种系中有效转座

在小鼠ES细胞中的有效转座鼓励我们检验piggyBac转座在小鼠种系中的可行性。进行原核共注射转座子供体和转座酶辅助质粒，产生转基因小鼠。为有利于转基因小鼠中的转座分析，我们使用可见标记(红色荧光蛋白，RFP)代替供体质粒中的抗药性标记。将供体PB[Act-RFP]因子和辅助质粒Act-PBase以环形形式共注射入FVB/Nj小鼠胚胎的原核中。PCR分析表明，34.8％(62/184)的创始鼠是PB[Act-RFP]单阳性，0.5％(1/184)是Act-PBase单阳性，2.7％(5/184)是双阳性。相比之下，当用单独的PB[Act-RFP]进行注射时仅10.4％(10/96)的幼崽是阳性。当将具有不同的标记基因酪氨酸酶(其影响皮肤色素形成)的较长PB因子PB[K14-Tyr]与相同辅助构建物一起共注射时，获得相似的结果(图1和图3A)。

为分析RFP阳性创始鼠中整合的转基因的结构，与转座子特异性探针进行DNA杂交(图1A)。大部分创始鼠具有多个整合事件(图3B)。然后我们进行反向PCR，以回收转座子末端侧翼的基因组序列。由42个RFP阳性创始鼠回收了总共85个转座事件(表4)。

表4.小鼠中的PB转座。1.A，B：PB[Act-RFP]；C：PB[K14-Tyr，Act-RFP]；D：PB[Act-RFP，MCK-TSC1]；2.少于10kb的已知或预测基因的下游序列；3.少于10kb的已知或预测基因的上游序列；4.来自种系转座的插入。

依据侧接整合转座子的右末端重复序列的基因组序列将这些转座的大部分作图至小鼠基因组。我们随机选择了9个转座事件，扩增了转座子对侧上的基因组接合序列。在每种情况下均发现转座子插入产生精确的整合位点的TTAA复制(未出示数据)。这些结果表明，由共注射产生的大部分转基因整合归因于转座。

为检验整合的转座子通过种系传递的能力，使几只PB[Act-RFP]阳性但辅助质粒阴性的创始鼠与野生型FVB/Nj小鼠交配，以产生转基因系。详细分析了其中1只具有8个PB[Act-RFP]整合的创始鼠(AF0-61)。基于PCR的基因分型表明，该创始鼠的16只子代中有15只保有转座子DNA。PCR阳性个体的DNA印迹分析表明，全部这些个体遗传了至少1个拷贝的转座PB[Act-RFP](图3C和未出示的数据)。这些转基因的随机分离提示初始转座事件在创始鼠中的不同染色体分布。具有单个转座子的第二只创始鼠(AF0-47)的子代分析表明，在一群同窝幼崽的8个F1中有2个遗传了转座子(图3C和未出示的数据)。采用靶向几个个别转座子整合位点的引物进行的基于PCR的基因表型分析也证实整合的转座子由创始鼠稳定遗传给F1代(未出示数据)。总之，转座介导的基因整合的高频率和整合的转基因通过种系传递的能力表明了使用piggyBac因子作为小鼠中的基因转移工具的可行性。

6.3.3.在小鼠种系中piggyBac的精确切离和转座

我们采用“起跳株(jumpstarter)”和“增变株(mutator)”原种的经典育种策略(Cooley等，1988，Science 239：1121-1128；Horn等，2003，Genetics 163：647-661)进一步检验了piggyBac在小鼠种系中的转座行为。在该方法中，携带非自主转座子的增变系与在雄性种系中表达转座酶的起跳系杂交。预期仅在同时携带转座子与转座酶DNA的雄性的生殖细胞中才发生活性转座。这些雄性随后与野生型雌性交配，产出具有新转座子插入的品系。我们修正了该方法，用共注射法直接生产出非自主转座子和辅助转座酶基因双阳性的小鼠。转基因动物通过常规的线性质粒原核注射产生，这确保了供体与辅助质粒共整合在相同基因座中。产生若干同时携带PB[Act-RFP]和鱼精蛋白1(prm1)启动子驱动的piggyBac转座酶转基因(Prm1-PBase)的转基因小鼠品系。预期prm1启动子在精子形成过程中有活性(O′Gorman等，1997，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 94：14602-14607)。因此，在这样的双阳性转基因系中，预期雄性小鼠将产生新转座事件，而雌性小鼠可用作种畜(breeder)。

这些双转基因系的其中一个品系称为BF0-33，检验其子代中的转座。用转座子特异性引物进行的DNA印迹杂交(图1A)揭示，在67.8％(19/28)的转座子阳性子代中有新的转座子整合(图4A和未出示的数据)。平均每个配子产生了1.1个新插入。新插入似乎不是区域性的，因为对其中三个新插入测序，发现它们位于三个不同染色体(表4中的BF1-29T6、BF1-30T43和BF1-44T10)。

应用靶向转座子侧翼的PB[Act-RFP]质粒序列的引物来研究种系中piggyBac的转座行为(图4B)。如果piggyBac通过切割和粘贴方式进行，则应检测到一种273bp的PCR产物。实际上，该PCR产物在BF0-33系的17个后代中的10个中检出(图4C)。对这些样品中的七个进行测序，揭示存在单个TTAA靶点(未出示数据)，说明piggyBac在小鼠雄性种系中通过精确的切割和粘贴方式转座。因为该创始鼠携带转基因串联子(transgene array)，故预期某些转座事件(图4B-C中的子代BF1-30和BF1-32)没有与此273bp产物的检出联系在一起。

6.3.4.作为独特的转基因工具的piggyBac转座子系统

先前已表明，随着一些转座子长度的增加转座效率显著降低，这妨碍其作为遗传工具的效力。例如在HeLa细胞中，已表明SB转座子在其2.2kb原长度之外长度每增加1kb，转座效率降低约30％(Izsvak等，2000，J.Mol.Biol.302：93-102)。为测定小鼠中PB转座的尺度限制，使用4.8-14.3kb的几个PB因子制备转基因小鼠(图1A)。这些转座子携带RFP报告体表达盒和/或独立的转录单位。在没有或有Act-PBase辅助质粒的情况下检验环形质粒中这些PB元件的整合比率(图3A)。结果表明，PB因子可携带9.1kb的外源序列，而不显著降低整合效率。PCR分析证实，在具有携带两个标记基因的PB[K14-Tyr，Act-RFP]因子的创始鼠中有83.9％(26/31)存在转座事件。应用14.3kb的PB[Act-RFP，MCK-TSC1]因子时，辅助质粒辅助的整合降低。通过DNA印迹杂交和反向PCR分析11只PB[Act-RFP，MCK-TSC1]阳性创始鼠，发现四只具有转座整合(表4和未出示了数据)。因此，PB能使达14kb的序列转座。

接着，我们评价了整合PB因子的转基因表达行为。在携带PB[Act-RFP]的小鼠中，98％(39/40)表达RFP标记。在我们的实验中，甚至单拷贝的PB[Act-RFP]转座子在UV照射下也产生可见的红色信号(图5A)。这些创始鼠中有一些表现出镶嵌RFP信号，该信号是一种最有可能起因于单细胞期之后的胚胎发育中的转座的现象(图5B)。在29％(9/31)的携带PB[K14-Tyr，Act-RFP]的创始鼠中观察到RFP和酪氨酸酶标记这二者的共表达，所述PB[K14-Tyr，Act-RFP]是一种既含K14启动子驱动的酪氨酸酶基因、又含RFP表达盒的转座子(图1A、5C和5D)。因此，含独特的克隆位点和RFP标记的PB[Act-RFP]构建物用作通用转基因PB载体。两个独立转录单位能同时表达和高频率整合事件提示，PB转座可用作产生转基因小鼠的有效方法。

6.3.5.作为插入诱变工具的piggyBac转座子系统

为了测试PB在脊椎动物中作为插入诱变工具的可行性，我们评价了小鼠中产生的104例转座事件(表3)。首先，TTAA序列存在于除一个以外的所有PB整合位点处。其次，我们比较了整合的TTAA位点侧翼的基因组序列和在小鼠基因组中随机采样的TTAA位点，发现核心TTAA序列周围富含T和A(图6A)。这和昆虫中存在的整合位点相似(Li等，2005，Insect Mol Biol.14(1)：17-30)。最后，对Ensembl小鼠基因组数据库分析了这些转座位点的基因组定位。尽管由于数据库中存在重复序列与序列间隙而使一些位点不能被作图，但仍确定了93个转座子整合位点的精确位置(表4；图6E)。在这些转座位点中观察到广泛的染色体分布。除了两个染色体(19号染色体与Y染色体)以外的所有小鼠染色体均被PB转座命中(图6E)。

所有转座位点的67％(70/104)被作图到已知的或预测的转录单位。在这些整合中，约97％(68/70)命中内含子，而3％(2/70)命中外显子(图6B)。即使分析中排除了未经证实的(即预测的)基因和EST(48％(50/104))，转录单位内的整合优先性仍保持很高。而且，超过40％的“基因间的”转座被作图在50Kb的已知基因或EST内(图6C和6D)。在转录单位的5′和3′末端设置10Kb的间隔作为调节区的任意阈值时，对于已知或预测的转录单位而言，BP转座命中基因的频率为约80％(83/104)(图6B)。转座的广泛染色体分布和在转录单位中的偏好性表明，PB因子可用作全基因组遗传筛选的高效诱变剂。

针对多达共128个新插入的另外的研究表明，112个位于转录单位中，覆盖所有染色体。转座子中有5个作图至外显子，63个作图至内含子。

6.4.讨论

我们已表明，BP因子可在人和小鼠中活跃地转座。相比于其它转座子，PB转座被认为基本不依赖于宿主因子，因为它是已知能在超过12种不同昆虫物种中转座的唯一转座子(Handler，2002，InsectBiochemistry & Molecular Biology 32：1211-1220；Sumitani等，2003，Insect Biochem.Mol.Biol.33：449-458)。PB在昆虫与哺乳动物中均可有效转座的事实表明，该转座系统可广泛应用于无脊椎动物与脊椎动物中的遗传研究。进一步提示PB因子的转座机制可能与其它自然存在的、仅在高度有限的物种中起作用的转座子显著不同。

6.4.1.作为基因转移工具的piggyBac

我们的研究表明，PB是一种产生转基因小鼠的实用工具，并且可能是产生其它转基因脊椎动物的实用工具。首先，PB可被高效导入到小鼠种系中。辅助质粒和供体质粒的原核共注射导致在其种系中超过30％的供体携带整合的供体质粒(图3A)。其次，该方法产生了单拷贝的整合转基因。在大部分情况下，小鼠中线性DNA的经典原核注射导致形成转基因串联体(Nagy等，2003，Manipulating the mouseembryo：a laboratory manual，第3版(Cold Spring Harbor LaboratoryPress))。我们表明，各个转座整合位点可通过反向PCR快速确定。由此，可估计染色质环境对所整合转基因的影响。第三，PB因子允许其携带的转基因表达。显示预期的转基因表达谱的小鼠的总频率与传统转基因实验相当。最后，我们的结果表明，PB可携带多达9.1kb的转基因，而不显著降低转座频率。观察到大至14.3kb的转基因的转座，这比逆转录病毒可携带的插入片段要大得多。因此，单个PB因子可携带多个基因，使人们可进行复杂的转基因实验，例如在可见标记的帮助下鉴别阳性转基因动物。

6.4.2.作为破译基因功能的基因组工具的piggyBac

在后基因组时代，系统性基因失活是最强有力的基因组功能破译方法之一。该方法已被证实在细菌和酵母之类的单细胞生物以及诸如秀丽隐杆线虫(C.elegans)、果蝇(Drosophila)、斑马鱼和拟南芥(Arabidopsis)之类的多细胞生物的研究中得到成功应用。不幸的是，用于哺乳动物中基因组范围的基因失活的有效方法仍然有限。ENU诱变是少数可用于小鼠中的基因组范围基因失活的方法之一；然而，对ENU诱导的突变作图以及克隆由突变限定的基因通常耗力耗时(Herron等，2002，Nat.Genet.30：185-189)。反转录病毒介导的插入诱变也已广泛用于在整个小鼠基因组中产生诱变。虽然该方法确实产生了大量突变，但这些突变大部分产生于小鼠ES细胞，需要大量额外的工作将这些基因特异性突变传递到活体动物中。最近，已检验了SB在小鼠中的插入诱变。但是，局部跳跃和转座到转录单位内的效率相对低，使其不能被广泛应用。

相比之下，PB为筛选小鼠中的隐性突变提供了一个新的有吸引力的选择。小鼠种系中有效PB转座的成功提示该转座子对插入诱变的适用性。PB的若干独特特性可大大推动小鼠中的插入诱变研究。插入诱变实验的一个重要考虑因素是诱变剂是否能以无偏方式命中基因组中的每个基因。我们的实验已表明，PB整合在小鼠基因组中有多样分布，这与最近在果蝇中的一项研究相一致，该研究表明PB以比广泛应用的P因子低偏倚方式命中基因(Thibault等，2004，Nat.Genet.36：283-287)。

有趣的是，我们的研究揭示了PB转座对转录单位的高度偏好。67％的转座子整合存在于已知的或推测的转录单位中。若包括在与转录起始位点和终止位点邻接的调节区域中的插入，基因中的PB转座频率甚至更高。鉴于仅有约15％的小鼠常染色质序列编码基因，PB转座对编码序列是高度选择性的。还不清楚这种整合特性是否受到基因组或PB因子携带的外源序列的转录活性影响。不过，这种整合偏好性使PB成为基因组范围插入诱变的潜在理想工具。

由随机诱变获得的突变分析的一个重要方面是确认突变与其产生的表型之间的关联。这在新基因的分析中尤其重要。基因型/表型关联的确认通常通过将野生型基因导入突变背景中并寻找表型“拯救”(理想地，诱导的突变回复为野生型)来进行。确定基因型/表型关联的另一种方法是切离插入突变并寻找表型回复。因此，转座子切离的能力一直被认为是超越逆转录病毒载体的一个重要优势。但是，多数转座子从原始位点被切离后都留下小的缺失或插入。有趣的是，PB在切离后一般不留下痕迹，这使其对产生回复体很理想。该特征还使PB不太可能在其中于单个基因组中发生多个转座事件的诱变过程中引起基因组损伤。我们的研究表明，通过在种系表达转座酶，可轻易实现PB切离。在转座过程中PB可携带多个基因的事实使包括插入诱变和表型表征在内的众多遗传操作得到巨大优势。它使人们可借助于RFP和酪氨酸酶之类的可见标记跟踪插入/突变和突变状态，例如杂合子与纯合子以及单突变与双突变。鉴于与小鼠育种相关的长世代时间和高动物饲养费用，这将急剧削减很多类型实验的开支，并将使一些不切实际的实验变得可行。

而且，用于插入诱变的PB转座子还可携带用于增强子/启动子检测或“基因捕获”的报告基因，这可大大地推动小鼠基因组的功能注释工作，并为多种类型的生物分析提供试剂。例如，基因捕获技术可使用PB系统。微注射或杂交可用于诱导携带基因捕获载体的PB转座子转座入小鼠基因组中。当所述转座子以正确的方向插入到基因的内含子中时，其中的标记基因(例如LacZ)将被活化，内源基因将被破坏。这使得可以检测报告基因表达，以及在某些情况下可检测在某些捕获系中由基因破坏引起的可见表型。

总之，我们的实验为小鼠中的高效基因转移和插入诱变系统提供了基础，提示PB系统还可在其它脊椎动物生物体中用作遗传操作的强力工具(Thibault等，2004，Nat.Genet.36：283-287)。

7.引证的参考文献

本文引证的所有参考文献都就其所有目的整体在此引入作为参考，其程度如同每个单独的出版物或专利或专利申请被明确和单独地指出就其所有目的整体引入作为参考。

可对本发明实施众多修改和变更，而不偏离本发明的精神和范围，这些修改和变更对本领域技术人员是显而易见的。本文描述的具体实施方案仅作为实例提供，本发明仅由所附权利要求的术语连同这些权利要求授予的等同方案的完整范围限制。

Claims

1.一种产生培养的重组脊椎动物细胞的方法，所述细胞的基因组包含携带至少1.5kb的插入片段的piggyBac样转座子，所述方法包括以下步骤：

(a)将(i)含携带至少1.5kb的插入片段的piggyBac样转座子的核酸和(ii)在同一核酸中或在独立的核酸上的、与启动子有效连接的编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列导入到培养的脊椎动物细胞中；和

(b)在其中表达piggyBac样转座酶的条件下培养所述细胞，这样所述piggyBac样转座子被整合入所述培养的脊椎动物的基因组中，

由此产生培养的重组脊椎动物细胞，其基因组包含携带至少1.5kb的插入片段的piggyBac样转座子。

2.一种产生培养的重组脊椎动物细胞的方法，所述细胞的基因组包含携带至少1.5kb的插入片段的piggyBac样转座子，所述piggyBacc样转座子包含编码在脊椎动物疾病或障碍的治疗或预防中有价值的蛋白的核苷酸序列，所述方法包括以下步骤：

(a)将(i)含携带至少1.5kb的插入片段的piggyBac样转座子的核酸和(ii)在同一核酸中或在独立的核酸上的、与启动子有效连接的编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列导入到培养的脊椎动物细胞中，所述piggyBacc样转座子包含编码在脊椎动物疾病或障碍的治疗或预防中有价值的蛋白的核苷酸序列；

(b)在其中表达piggyBac样转座酶的条件下培养所述细胞，这样所述piggyBac样转座子被整合入所述培养的脊椎动物细胞基因组中，

由此产生培养的重组脊椎动物细胞，其基因组含携带至少1.5kb的插入片段的piggyBac样转座子，所述piggyBacc样转座子包含编码在脊椎动物疾病或障碍的治疗或预防中有价值的蛋白的核苷酸序列。

3.一种产生培养的重组脊椎动物细胞的方法，所述细胞的基因组包含携带至少1.5kb的插入片段的piggyBac样转座子，其中所述piggyBac样转座子位于串联体中，所述串联体包含多个piggyBac样转座子，所述方法包括以下步骤：

(a)将(i)含携带至少1.5kb的插入片段的piggyBac样转座子的线性化核酸和(ii)在同一核酸中或在独立的核酸上的、与启动子有效连接的编码piggyBac样转座酶的核苷酸序列导入到培养的脊椎动物细胞中；

由此产生培养的重组脊椎动物细胞，所述细胞的基因组含携带至少1.5kb的插入片段的piggyBac样转座子，其中所述piggyBac样转座子位于串联体中，所述串联体包含多个piggyBac样转座子。

4.权利要求1的方法，其中所述脊椎动物细胞为卵母细胞或胚胎细胞。

5.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述脊椎动物细胞是哺乳动物细胞。

6.权利要求5的方法，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。

7.权利要求1-3中的任一项的方法，其中所述piggyBac样转座子是piggyBac转座子，和/或piggyBac样转座酶是piggyBac转座酶。

8.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述piggBac样转座子携带至少4kb的插入片段。