CN101283805B - 一种锌-多肽配合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种锌-多肽配合物，该配合物由重量比为1∶1～1∶5的锌的无机物与动物原料按以下方法制成：动物原料被蛋白酶水解得到多肽，再与锌的无机物进行配合反应制得。本发明所述的配合物不仅含有可被人体和动物体吸收的锌元素，还含有的多肽成分，具有补锌和增强机体免疫能力的作用，可作为补锌以及提高机体免疫力的食品、营养品、保健品或动物饲料添加剂；所用原料为天然动物原料，且为低值农渔产品或农渔产品加工后的废料或下脚料，价格低廉。

Description

一种锌-多肽配合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及化学领域，具体涉及金属多肽配合物。

背景技术

锌(Zn)是人和动物必须的微量元素，被称为生命元素。目前，有机锌主要是氨基酸鳌合物，如锌、硒或钙等微量元素的氨基酸鳌合物。食用微量元素的氨基酸螯合物不仅可以补充人体或动物所需的微量元素，还可以同时补充人体或动物所需的氨基酸。国知局于1997年4月2日公开了一项发明专利申请“氨基酸锌的制备方法及其应用”(申请号94114854.8)，该申请公开了一种三甘氨酸锌鳌合物的制备方法，即将氨基酸和氧化锌按2∶1的摩尔比混合，在水溶液中反应一段时间后浓缩，最后用酒精析出反应产物。国知局于2006年2月11日公开了一项发明专利申请“氨基酸鳌合物的制备方法”(申请号200380105098.7)，该申请公开了一种制备金属氨基酸鳌合物的方法，即将摩尔比为1∶1～1∶4的金属碳酸盐和酸性氨基酸(如谷氨酸、天冬氨酸等)在0～100℃的水溶液中反应，最后取反应物上清经冷冻干燥即可。国知局于2006年2月22日授权公告了一项发明专利“一种有机硒的制备工艺”(申请号200410016499.1)，该专利公开了一种蛋氨酸硒的制备方法：将蛋氨酸盐和四氯化硒在水溶液或有机溶液中反应0.5～10小时，控制反应时pH2～9、温度-10～100℃，最后经过滤、浓缩和干燥，即可。上述方法所用的螯合剂都是非天然的单一成分的氨基酸，使所得鳌合物营养成分单一，在实际使用中，往往需要几种氨基酸微量元素螯合物的配合使用才能体现出较好的效果，应用成本相对较高。而且，由于氨基酸的制备是常采用化学酸水解法，难免会引入化学污染物或者化学残留物，需要加以严密的监控与检测。随着小分子多肽可以被机体整体吸收理论的证实，有关多肽的开发就成为营养学或食品科学领域新的关注焦点。由于纯品肽的化学合成难度大、成本高，而且化学合成肽往往比从动植物中制备肽的生物活性要低，所以，通过化学合成肽与微量元素反应制备金属配合物的应用也会受到一定限制。

发明内容

本发明的目的是提供一种锌-多肽配合物。

本发明的另一目的是提供该配合物的制备方法和应用。

本发明实现上述目的的技术方案是：

一种锌-多肽配合物，该配合物由重量比为1∶1～1∶5的动物原料与无机锌按以下方法制成：在动物原料中加入碱性蛋白酶或枯草杆菌中性蛋白酶水解得到的多肽，再与无机锌进行配合反应制得；其中，所述无机锌是氧化锌、氯化锌或碳酸锌，优选氧化锌或碳酸锌；所述动物原料是低值鱼贝类水产品、鱼贝类加工后的下脚料或废弃物。

本发明所述的锌-多肽配合物由以下方法制备得到：

(1)原料的预处理：将动物原料切碎或磨碎；

(2)蛋白酶水解：取步骤(1)处理后的原料，加入3～5倍的水，搅拌均匀，用PH调节剂调pH至6.5～9.5，然后按每克原料700～1000U的量加入碱性蛋白酶或枯草杆菌中性蛋白酶，最后在45～60℃下，搅拌或摇荡，水浴2～3小时，得水解液；所述的pH调节剂是碳酸氢钠、氢氧化钠或盐酸；

(3)酶灭活处理：将水解液加热到95～100℃，维持10分钟，冷却至室温，离心，过滤，取清液；

(4)配合反应：

①用醋酸或NaHCO₃调节步骤(3)所得清液的pH至4.0～7.0：当所述清液pH小于4.0时，用NaHCO₃或NaOH调节，当所述清液pH大于7.0时，用醋酸调节；

②加入无机锌溶液，然后加入清液4～5倍的纯水于反应体系中，在25℃至100℃的条件下反应0.5～10h，反应过程中间歇搅拌；其中，加入0.1g/ml无机锌溶液的体积与清液的体积比为1∶10；

③反应结束后将其浓缩，冷却后倒入95％～98％乙醇中进行沉降，过滤分离，最后将分离得到的沉淀物用少量蒸馏水或乙醇洗涤，抽干后80～100℃下干燥即可；或者浓缩以后直接进行热风干燥或喷雾干燥；其中浓缩的方法可以是真空浓缩，也可以是常压下加热浓缩；加热浓缩的温度一般在25～100℃之间，温度越低，所得配合物的活性保留越好，但是所需时间越长。

本发明方法中，

在磨碎或切碎的原料溶于水后，即步骤(2)中，在用PH调节剂调pH至6.5～9.5前，还可以于55℃水浴30分钟，然后于100℃下热处理20分钟，使原料中的蛋白质变性，有利于加入蛋白酶后充分水解为多肽；

当步骤(2)所用的蛋白酶为碱性蛋白酶时，最好将原料和水的混合物的pH值调至9.0～9.5，加酶后的水浴温度为50～60℃；；

当步骤(2)所用的蛋白酶为枯草杆菌中性蛋白酶时，最好将原料和水的混合物的pH值调至6.5～7.5，加酶后的水浴温度为45～55℃；

步骤(4)中所述清液的pH值优选调节至4.5～5.5；加入无机锌的量优选：与步骤(1)原料重量比为1∶2～1∶3；反应时间优选1～5小时，反应温度优选25℃～70℃。

本发明所述的锌-多肽配合物不仅含有可被人体和动物体吸收的锌元素，还含有丰富的多肽成分，具有增强机体免疫能力的作用，可作为补锌以及提高机体免疫力的营养品、保健品或动物饲料添加剂；所用原料为天然动物原料，且为低值农渔产品或农渔产品加工后的废料或下脚料，价格低廉。

本发明所述配合物用于制备含有水、果汁、牛奶、蔗糖、维生素、矿物质等基础配料的饮品的方法是：在所述基础配料中添加0.1～0.3％本发明所述的配合物。

本发明所述配合物用于制备豆(奶)粉食品的方法是：在豆奶或豆粉中添加0.3-0.5％的本发明所述配合物。

本发明所述配合物用于制备主要以淀粉为原料的固体食品的方法是：在原料中添加0.1～0.5％的本发明所述配合物。

本发明所述配合物用于制备主要以豆粕粉为原料的水产饲料的添加剂的使用方法是：在原料中添加3～5％的本发明所述配合物。

本发明所述配合物用于制备主要以玉米粉、豆粕粉、面粉、麸皮、糠饼等为原料的猪饲料的添加剂的使用方法是：在原料中添加1～3％的本发明所述配合物。

本发明所述配合物作为主要以玉米粉、豆粕粉、鱼粉、菜粕、次面粉、米糠等为原料的禽类饲料的添加剂的使用方法是：在原料中添加2～4％的本发明所述配合物。

下面将通过动物实验来证明本发明的技术效果。

一、实验材料：锌-多肽配合物，制备方法见实施例1。

二、实验动物及分组

选用体重19.85±0.91g、鼠龄9周的健康雄性昆明种小鼠(由广州中医药大学动物中心提供)，在安静、室温22±2℃条件下喂养，自然光照，每天定时通风。采用国家标准啮齿类动物饲料按自由饮食、灌胃生理盐水或锌-多肽配合物分组饲养：第1组(标准饲料对照组)，喂食标准饲料，灌胃生理盐水；第2组(低剂量组，锌-多肽配合物浓度为0.25mg/ml)，喂食标准饲料，灌胃锌-多肽配合物；第3组(中剂量组，锌-多肽配合物浓度为0.5mg/ml)，喂食标准饲料，灌胃锌-多肽配合物；第4组(高剂量组，锌-多肽配合物浓度为1.0mg/ml)，喂食标准饲料，灌胃锌-多肽配合物。连续喂养30d，然后测定小鼠巨噬细胞的吞噬功能和肝脏GSH-PX活力、SOD活力等相关指标。

三、实验方法及结果

1、本发明锌-多肽配合物对小鼠巨噬细胞活力的影响

通过小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(半体内法)，测定巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数，从而反映巨噬细胞的吞噬功能，体现机体的抗病能力。由于巨噬细胞能吞噬鸡红细胞，将巨噬细胞和吞噬鸡红细胞温育后染色，在油镜下计算吞噬鸡红细胞的巨噬细胞的百分比，并观察细胞内鸡红细胞的形态，据此判断巨噬细胞的吞噬功能和消化功能。

鸡红细胞悬液制备：

鸡断头取血，与生理盐水按1∶9的比例混合，置于有玻璃珠的锥形瓶中，朝一个方向充分摇动，以脱纤维。用生理盐水洗涤2～3次，离心(2000r/min，10min)，去上清，用生理盐水配成1％(v/v)的鸡红细胞悬液。

吞噬功能测定：

(1)每只小鼠腹腔内注射灭菌肉汤培养基1ml巨噬细胞诱导剂；

(2)24h后每鼠腹腔注射1％鸡红细胞悬液1mL。间隔30min，颈椎脱臼处死小鼠；

(3)将其仰位固定于鼠板上，正中剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2mL，轻揉腹部1min；

(4)然后吸出腹腔洗液1mL，平均分滴于2片载玻片上涂片，移置37℃孵箱温育30min；

(5)孵毕，于生理盐水中漂洗，以除去未贴片细胞；

(6)晾干，以1∶1丙酮甲醇溶液固定5min；

(7)1∶10(v/v)Giemsa-磷酸缓冲液染色30min，再用蒸馏水漂洗，晾干；

(8)显微镜下观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞的情况。

油镜下计数巨噬细胞，每张片计数100个，按下式计算吞噬百分率和吞噬指数。

表2不同剂量配合物的吞噬百分率和吞噬指数(

n＝7)

组别	吞噬百分率(％)	吞噬指数
			对照组	35.71±2.31	1.19±0.14
低剂量组	38.86±1.96	1.26±0.08
			中剂量组	42.71±3.65	1.50±0.08
高剂量组	42.57±3.33	1.40±0.09

如表2所示，吞噬百分率来讲，本发明配合物的中剂量组和高剂量组处理后的巨噬细胞的吞噬百分率与第1组(对照组)之间有明显差异(P＜0.05)，吞噬指数与第1组(对照组)之间有极显著差异(P＜0.01)。可见，锌-多肽配合物具有刺激巨噬细胞的吞噬能力，具有抗病毒、抑制肿瘤细胞的生长、增强动物对病原体的抗感染能力，明显降低感染性疾病发病率等作用。

2、本发明锌-多肽配合物对小鼠GSH-PX活力和SOD活力的影响

GSH-PX活力的测定，按照试剂盒(南京建成生物工程研究所提供)说明书进行测定。SOD活力的测定，按照试剂盒(南京建成生物工程研究所提供)说明书进行测定。

表3配合物对小鼠肾肝GSH-Px和SOD活力的影响(

n＝7)

组别	GSH-Px活力	SOD活力(U/mg prot)
			第1组(对照组)	55.63±752	105.43±5.63
第2组(低剂量组)	99.15±7.13	139.59±8.03
			第3组(中剂量组)	117.39±10.00	190.16±23.48
第4组(高剂量组)	110.95±14.65	218.46±25.66

如表3所示，本发明配合物各剂量组对GSH-Px和SOD活力的影响与第1组(对照组)之间都有极显著差异(P＜0.01)，可见，本发明锌-多肽配合物具有提高机体肝肾GSH-PX活力和SOD活力、增强机体免疫力、促进动物健康生长等作用。

3、本发明锌-多肽配合物对超氧自由基清除效果的测定

根据邻苯三酚在碱性条件下会发生自氧化，生成有色中间产物和超氧阴离子自由基(O^2-)，超氧阴离子自由基(O^2-)对自氧化有催化作用的原理，采用分光光度法进行测定锌-多肽配合物对超氧自由基清除率，见下表所示。

表4配合物对超氧自由基清除效果

锌-水解蛋白配合物用量(mg)	0.6	1.2	1.8	2.4	3.0
						清除率(％)	55.51	69.78	78.78	80.69	80.82

从表4可以看出，锌-多肽配合物对超氧自由基具有较好的清除效果，并且随着锌-多肽配合物用量的增加，对超氧自由基的清除效果会更好。

从上述实验结果可以看出，本发明配合物具有刺激巨噬细胞的吞噬能力，具有提高机体肝肾GSH-PX活力和SOD活力的作用，对超氧自由基具有较好的清除效果，能增强动物对病原体的抗感染能力，增强机体免疫力、促进动物健康生长。

附图说明

图1是对照水解蛋白多肽紫外吸收光谱的扫描图。

图2是本发明配合物紫外吸收光谱的扫描图。

图3是水解蛋白多肽和本发明配合物的红外光谱对比图，其中S1是水解蛋白多肽的红外光谱，S2是Zn-多肽配合物的红外光谱。

具体实施方式

制备例

例1

动物原料的预处理：称取罗非鱼加工下脚料，用组织捣碎机或斩拌机快速切细，避免原料形成凝胶状。

蛋白质水解：取一定量原料，按料∶水＝1∶3溶于水中，搅拌，调节pH至9.0，加入碱性蛋白酶700U/g原料，在50℃恒温水浴摇荡摇床中进行酶解反应2h，每隔10min摇荡一次。然后将水解液加热到100℃、保持10min，冷却至室温，过滤得清液备用。水解时所用的碱性蛋白酶为Alcalase 2.4L FG，由诺维信生物技术有限公司提供。

配合物制备：取清液100ml，调节pH至4.0，加入浓度为0.1g/ml的氯化锌溶液10ml，电炉预热10min，过滤除去不溶物，再加入400ml水，然后在70℃进行配合反应4小时，然后真空浓缩至10ml左右，冷却以后倒入95％乙醇中进行沉降，过滤分离，沉淀用少量蒸馏水及乙醇洗涤，抽干后置于80℃烘箱中干燥，即得固态的Zn-多肽配合物。

所得配合物的鉴定：

1、本发明配合物的红外光谱检测：

水解蛋白多肽(PEP)和锌-多肽配合物(Zn-PEP)分别通过红外光谱仪测定，对照水解蛋白多肽及其配合物在4000～500cm^-1区域的红外光谱(FTIR)吸收带及其归属统计如表1所示，图3是红外光谱(FTIR)图。

表1锌-多肽配合物的红外光谱频率与归属

1046.05	1045.61	C-N-C或CO伸缩振动(酰胺带V)
			929.70	929.05
	878.56
			591.09(很弱)	602.26
531.80

从表1可以看出，对照水解蛋白多肽(PEP)与本发明锌-多肽配合物(Zn-PEP)的IR光谱在强度和吸收频率方面均存在较大差异。PEP在3392.96cm^-1处的吸收峰在Zn-PEP中移至3325.67cm^-1，红移了71.92cm^-1；PEP合成Zn-PEP后，在3080.61cm^-1处的吸收峰消失；这些谱带分别对应着PEP的NH对称伸缩振动和反对称伸缩振动。说明多肽分子的氨基和羧基都参与了Zn²⁺的配位，而且PEP中与锌结合的氧同NH之间还可能存在着氢键。PEP在2970.89cm^-1处的吸收峰在Zn-PEP中移至2968.85cm^-1，红移了2.04cm^-1，这是PEP中CH₂，CH基团的伸缩振动，这说明Zn²⁺与PEP的作用而导致PEP结构构型的部分改变。PEP合成Zn-PEP后，在2084.13cm^-1处的吸收峰消失；PEP在1662.11cm^-1处的吸收峰在Zn-PE中移至1654.34cm^-1，红移了7.71cm^-1，这是COO^-或CO伸缩振动，说明PEP中羧基的氧参与了Zn²⁺的配位作用。PEP在1583.22cm^-1处的吸收峰消失，进一步说明羧基上的氧直接与Zn²⁺有直接的配位作用。PEP在1452.59cm^-1、1398.70cm^-1、1319.41cm^-1、1161.86cm^-1、1115.31cm^-1、1079.64cm^-1、1049.05cm^-1等处的吸收峰发生的红移，都表明PEP与Zn²⁺有配位作用，并生成了新的配合物。PEP在1262.64cm^-1处的吸收峰消失，表明残基上的氨基和羧基氧均可能与Zn²⁺⁺直接成键，并由氢键缔合作用。Zn-PEP在878.56cm^-1处附近的吸收峰加强和在602.26cm^-1处吸收峰的红移，有可能是Zn²⁺与N、O所形成的配合键的伸缩振动引起。

通过谱图解析结果可知，PEP与Zn²⁺确实发生了配位反应，并形成Zn²⁺和N、O之间的配合键，引起了PEP分子骨架的部分变化，配合作用发生在氨基残基和肽键的N、O原子上。

2、水解蛋白多肽和锌-多肽配合物的紫外吸收光谱

对照水解蛋白多肽的紫外吸收光谱见图1，本发明锌-多肽配合物的紫外吸收光谱见图2所示。从图1可以看出，水解蛋白的最大吸收峰在210nm处，这是由肽键上羰基(C＝O)n→π^*电子跃迁引起的。图2可以看出：配合物的最大紫外吸收峰在216nm处，与水解蛋白多肽的最大吸收峰210nm处相比，位移了6nm。这是由于锌离子与水解蛋白多肽中的N、O形成配合键后，影响了肽键上羰基(C＝O)n→π^*的电子跃迁；从锌-配合物紫外吸收光谱扫描图还可看出，在272nm处有一个较弱的新吸收峰出现，这是配体(N-C-O)中π→π^*电子跃迁所致；另外，锌-配合物在小于200nm和大于300nm的区域没有任何吸收峰。

通过锌-多肽配合物和水解蛋白多肽的红外光谱及紫外吸收光谱图分析表明，锌离子与水解蛋白多肽中的N、O发生了键合作用，形成了锌-水解蛋白多肽配合物。

例2

动物原料的预处理：称取罗非鱼加工下脚料，用组织捣碎机或斩拌机快速切细，避免原料形成凝胶状。

蛋白质水解：取一定量原料，按料∶水＝1∶5溶于水中，搅拌，调节pH至7.5，加入枯草杆菌中性蛋白酶1000U/g原料，在55℃恒温水浴摇荡摇床中进行酶解反应3h，每隔10min摇荡一次。然后将水解液加热到100℃、保持10min，冷却至室温，离心得清液备用。水解时所用的枯草杆菌中性蛋白酶由广西南宁庞博生物工程有限公司提供。

配合物制备：取清液100ml，调节pH至4.0，加入浓度为0.1g/ml的氯化锌溶液10ml，电炉预热3min，过滤除去不溶物，再加入500ml水，然后在100℃下进行配合反应5小时，然后真空浓缩至10ml左右，冷却以后倒入95％乙醇中进行沉降，过滤分离，沉淀用少量蒸馏水及乙醇洗涤，抽干后置于100℃烘箱中干燥，即得固体Zn-多肽配合物。

例3

动物原料的预处理：称取罗非鱼加工下脚料，用组织捣碎机或斩拌机快速切细，避免原料形成凝胶状。

蛋白质水解：取一定量原料，按料∶水＝1∶4溶于水中，搅拌，调节pH至9.0，加入碱性蛋白酶8000U/g原料，在55℃恒温水浴摇荡摇床中进行酶解反应2.5h，每隔10min摇荡一次。然后将水解液加热到100℃、保持10min，冷却至室温，过滤得清液备用。水解时所用的碱性蛋白酶为Alcalase 2.4L FG，由诺维信生物技术有限公司提供。

配合物制备：取清液100ml，调节pH至5.0，加入浓度为0.1g/ml的氧化锌溶液10ml，电炉预热7min，过滤除去不溶物，再加入400ml水，然后在70℃进行配合反应3小时，然后真空浓缩至10ml左右，冷却以后倒入95％乙醇中进行沉降，过滤分离，沉淀用少量蒸馏水及乙醇洗涤，抽干后置于90℃烘箱中干燥，即得固体Zn-多肽配合物。

例4

动物原料的预处理：称取罗非鱼加工下脚料，用组织捣碎机或斩拌机快速切细，避免原料形成凝胶状。

蛋白质水解：取一定量原料，按料∶水＝1∶3溶于水中，搅拌，调节pH至7.0，加入枯草杆菌中性蛋白酶1000U，在50℃恒温水浴摇荡摇床中进行酶解反应3.0h，每隔10min摇荡一次。然后将水解液加热到100℃、保持10min，冷却至室温，离心得清液备用。水解时所用的枯草杆菌中性蛋白酶由广西南宁庞博生物工程有限公司提供。

配合物制备：取清液100ml，调节pH至5.0，加入浓度为0.1g/ml的氯化锌溶液10ml，电炉预热3-10min，过滤除去不溶物，再加入400ml水，然后在70℃进行配合反应4小时，然后真空浓缩至10ml左右，冷却以后倒入95％乙醇中进行沉降，过滤分离，沉淀用少量蒸馏水及乙醇洗涤，抽干后置于80℃烘箱中干燥，即得固体Zn-多肽配合物。

例5

动物原料的预处理：称取罗非鱼加工下脚料，用组织捣碎机或斩拌机快速切细，避免原料形成凝胶状。

蛋白质水解：取一定量原料，按料∶水＝1∶3溶于水中，搅拌，调节pH至9.0，加入碱性蛋白酶1000U/g原料，在55℃恒温水浴摇荡摇床中进行酶解反应3.0h，每隔10min摇荡一次。然后将水解液加热到100℃、保持10min，冷却至室温，过滤得清液备用。水解时所用的碱性蛋白酶为Alcalase 2.4L FG，由诺维信生物技术有限公司提供。

配合物制备：取清液100ml，调节pH至5.0，加入浓度为0.1g/ml的碳酸锌溶液10ml，电炉预热10min，过滤除去不溶物，再加入400ml水，然后在25℃进行配合反应1h，反应完成后经于45℃、常压下浓缩，最后喷雾干燥，即得到固态锌-多肽配合物。

例6

动物原料的预处理：称取罗非鱼加工下脚料，用组织捣碎机或斩拌机快速切细，避免原料形成凝胶状。

蛋白质水解：取一定量原料，按料∶水＝1∶5溶于水中，搅拌，调节pH至7.5，加入枯草杆菌中性蛋白酶1000U/g原料，在45℃恒温水浴摇荡摇床中进行酶解反应2h，每隔10min摇荡一次。然后将水解液加热到95℃、保持10min，冷却至室温，过滤得清液备用。水解时所用的枯草杆菌中性蛋白酶由广西南宁庞博生物工程有限公司提供。

配合物制备：取清液100ml，调节pH至5.0，加入浓度为0.1g/ml的氯化锌溶液10ml，电炉预热10min，过滤除去不溶物，再加入400ml水，然后在50℃下进行配合反应0.5h，反应完成后于60℃、常压下浓缩，喷雾干燥或热风干燥，即得到可溶性固态锌-多肽配合物。

例7

动物原料的预处理：称取罗非鱼加工下脚料，用组织捣碎机或斩拌机快速切细，避免原料形成凝胶状。

蛋白质水解：取一定量原料，按料∶水＝1∶3溶于水中，搅拌，调节pH至9.0，加入碱性蛋白酶1000U/g原料，在60℃恒温水浴摇荡摇床中进行酶解反应3.0h，每隔10min摇荡一次。然后将水解液加热到100℃、保持10min，冷却至室温，过滤得清液备用。水解时所用的碱性蛋白酶为Alcalase 2.4L FG，由诺维信生物技术有限公司提供。

配合物制备：取清液100ml，调节pH至7.0，加入浓度为0.1g/ml的氯化锌溶液10ml，电炉预热10min，过滤除去不溶物，再加入400ml水，然后在70℃进行配合反应10h，反应完成后经真空浓缩，喷雾干燥，即得到可溶性固态锌-多肽配合物。

例8

动物原料的预处理：称取罗非鱼加工下脚料，用组织捣碎机或斩拌机快速切细，避免原料形成凝胶状。

蛋白质水解：取一定量原料，按料∶水＝1∶3溶于水中，搅拌，55℃水浴30分钟，然后于100℃下热处理20分钟，冷却后调节pH至7.0，加入枯草杆菌中性蛋白酶1000U/g原料，在50℃恒温水浴摇荡摇床中进行酶解反应3.0h，每隔10min摇荡一次。然后将水解液加热到100℃、保持10min，冷却至室温，过滤得清液备用。水解时所用的枯草杆菌中性蛋白酶由广西南宁庞博生物工程有限公司提供。

配合物制备：取清液100ml，调节pH至5.0，加入浓度为0.1g/ml的氯化锌溶液10ml，电炉预热10min，过滤除去不溶物，再加入400ml水，然后在70℃进行配合反应4h，反应完成后于100℃、常压下浓缩，热风干燥，即得锌-多肽配合物。

应用例

例1

锌-多肽配合物在饮品中的应用

一种饮品，主要由水、果汁、牛奶、蔗糖、维生素、矿物质等基础配料和相当基础配料重量0.2％的本发明所述锌-多肽配合物组成，其制备方法是：将本发明锌-多肽配合物分散加入到基础配料中，充分混匀，然后按照饮品加工工艺操作，即可。

例2

锌-多肽配合物在粉末或颗粒食品中的应用

一种豆粉食品，主要由全脂大豆粉、大米粉、糖浆、植物油、白沙糖、卵磷脂、矿物质、维生素等基础配料和相当基础配料重量0.4％的本发明所述锌-多肽配合物组成，其制备方法是：将本发明锌-多肽配合物分散加入到基础配料中，充分混匀，然后按照豆粉加工工艺操作，即可。

例3

锌-多肽配合物在固体食品中的应用

一种糕点食品，主要由精粉、白砂糖、食油、鸡蛋、奶粉、淀粉、香精、乳酸钙、碳酸氢铵、小苏打、亚硫酸氢钠等基础配料和相当基础配料重量0.3％的本发明锌-多肽配合物组成，其制备方法是：将本发明锌-多肽配合物分散加入到基础配料中，充分混匀，然后按照糕点加工工艺操作，即可。

例4

锌-多肽配合物作为水产饲料添加剂的应用

一种水产养殖饲料，主要由豆粕粉、鱼粉、维生素、矿物质、黏合剂等原来组成和相当原料重量3％的本发明锌-多肽配合物组成，其制备方法是：将本发明锌-多肽配合物分散加入到所述原料干粉中，充分混匀，然后按照饲料生产加工工艺制备，即可。

例5

锌-多肽配合物作为猪饲料添加剂的应用

一种猪饲料，主要由玉米粉、豆粕粉、面粉、麸皮、糠饼、维生素、矿物质、氨基酸等原料和相当原料重量1-3％的本发明锌-多肽配合物组成，其制备方法是：将本发明锌-多肽配合物分散加入到原料干粉中，充分混匀，然后按照饲料生产加工工艺制备，即可。

例6

锌-多肽配合物作为禽类饲料添加剂的应用

一种禽类饲料，主要由玉米粉、豆粕粉、鱼粉、菜粕、次面粉、米糠、维生素、磷酸氢钙、氨基酸等原料和相当原料重量3％的本发明锌-多肽配合物组成，其制备方法是：将本发明锌-多肽配合物分散加入到原来干粉中，充分混匀，然后按照饲料生产加工工艺制备，即可。

Claims (6)

1.一种锌-多肽配合物的制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)原料的预处理：将动物原料切碎或磨碎；

(2)蛋白酶水解：取步骤(1)处理后的原料，加入3～5倍的水，搅拌均匀，用PH调节剂调pH至6.5～9.5，然后按每克原料700～1000U的量加入碱性蛋白酶或枯草杆菌中性蛋白酶，最后在45～60℃下，搅拌或摇荡，水浴2～3小时，得水解液；所述的pH调节剂是碳酸氢钠、氢氧化钠或盐酸；

(3)酶灭活处理：将水解液加热到95～100℃，维持10分钟，冷却至室温，离心，过滤，取清液；

(4)配合反应：

①用醋酸或NaHCO₃调节步骤(3)所得清液的pH至4.0～7.0：当所述清液pH小于4.0时，用NaHCO₃或NaOH调节，当所述清液pH大于7.0时，用醋酸调节；

②加入无机锌溶液，然后加入清液4～5倍的纯水于反应体系中，在25℃～100℃的条件下反应0.5～10h，反应过程中间歇搅拌；其中，加入0.1g/ml无机锌溶液的体积与清液的体积比为1∶10；

③反应结束后进行真空浓缩或常压加热浓缩，冷却后倒入95％～98％乙醇中进行沉降，过滤分离，最后将分离得到的沉淀物用少量蒸馏水或乙醇洗涤，抽干后干燥即可；或者，浓缩以后直接进行热风干燥或喷雾干燥；

上述步骤中，所述的动物原料与无机锌的重量比为1∶1～1∶5；所述的无机锌是氧化锌、氯化锌或碳酸锌；所述的动物原料是低值鱼贝类水产品、鱼贝类加工后的下脚料或废弃物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中，在用PH调节剂调pH至6.5～9.5前先经过以下处理：于55℃水浴30分钟，接着100℃下热处理20分钟。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤(2)中，当所用的蛋白酶是碱性蛋白酶时，原料加水混匀后用碳酸氢钠或氢氧化钠调节pH值至9.0～9.5，加酶后的水浴温度为50～60℃。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤(2)中，当所用的蛋白酶是枯草杆菌中性蛋白酶时，原料加水混匀后用盐酸调节pH值至6.5～7.5，加酶后的水浴温度为45～55℃。

5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤(4)中配合反应的时间为1～5小时。

6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤(4)中配合反应的温度为25℃～70℃。

Images