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CN101289661B - 用固相分离和纯化核酸分子 - Google Patents

用固相分离和纯化核酸分子 Download PDF

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CN101289661B CN200810092951.0A CN200810092951A CN101289661B CN 101289661 B CN101289661 B CN 101289661B CN 200810092951 A CN200810092951 A CN 200810092951A CN 101289661 B CN101289661 B CN 101289661B
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Abstract

本发明涉及用固相分离和纯化核酸分子。公开了适于促进核酸向固相吸附的水溶性离子液体。还公开了其用途，尤其从水性溶液分离核酸的方法，以及用于实施这些方法的试剂盒。

Description

用固相分离和纯化核酸分子
发明领域
本发明涉及核酸的分离和纯化领域。提供了用于从样品材料分离核酸的方法和试剂盒。具体地，本发明涉及以基本上不含伴随物质的形式得到核酸的方法和试剂盒。分离的核酸适于分子生物学应用。本发明的方法包括将核酸吸附(即，可逆结合)到固相，任选地洗涤具有所吸附核酸的固相，并从固相洗脱所述核酸。
发明背景
在基于核酸分析的研究领域中的诊断测试和测定法越来越重要。因为一方面，核酸通常以非常低浓度存在，另一方面，通常发现它们存在许多其他固体和不溶的物质，例如，裂解细胞后或在来自食品的样品物质中，它们难以分离或测量，尤其在可以检测特定分析物的生物特异性测定法中。因此，在多数情况下，这些微生物学测试包含至少一个扩增待检测的特征性DNA分子的步骤。需要选择性地结合两种寡核苷酸引物的公知的测定法是US 4,683,195中描述的聚合酶链式反应(PCR)。该方法允许在脱氧核苷酸三磷酸存在下通过热稳定的聚合酶在几个循环中选择性地扩增特定核酸区域至可检测的水平。PCR技术在所需要的量和使用的样品物质的纯度方面都是非常灵敏的技术。
其他可能的扩增反应是连接酶链式反应(LCR，Wu，D.，Y.，和Wallace，R.，B.，Genomics 4(1989)560-569和Barany，F.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991)189-193)；聚合酶连接酶链式反应(Barany，F.，PCR Methods and Appl.1(1991)5-16)；Gap-LCR(PCT专利公布号WO90/01069)；修复链反应(EP 0 439 182)，3SR(Kwoh，D.，Y.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)1173-1177；Guatelli，J.，C.，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990)1874-1878；PCT专利公布号WO92/0880A)，和NASBA(美国专利号5,130,238)。此外，还有链置换扩增(SDS)、转录介导的扩增(TMA)，和Qβ扩增(综述见例如，Whelen，A.，C.和Persing，D.，H.，Annu.Rev.Microbiol.50(1996)349-373；Abramson，R.，D.和Myers，T.，W.，Current Opinion in Biotechnology4(1993)41-47)。
由于核酸仅仅存在于原核生物和真核生物的细胞中，所以必须在核酸分离前裂解细胞。伴随着核酸从细胞的释放，所有其他细胞组分也被释放。这包括蛋白质、盐、次生代谢物以及降解酶，如蛋白酶和核酸酶。这些酶开始立即降解它们的靶标。从而，必须抑制这些降解酶的活性。这可以通过向裂解溶液中加入有机溶剂或者变性剂实现。备选方案是加入蛋白酶和/或核酸酶抑制剂。
为了从样品材料分离核酸，有几种方法用于提取核酸，如序列依赖性的或者生物特异性的方法(例如，亲和层析法、与固定化探针杂交)和不依赖于序列的方法或理化方法。在后一方法中，本领域公知的是用例如苯酚-氯仿的液体-液体萃取，用有机溶剂如乙醇沉淀，用滤纸提取，用胶束形成试剂如溴化十六烷基-三甲基-铵提取，与固定化的嵌合染料如吖啶衍生物相互作用，以及在离液条件下吸附到固相，如硅胶或者硅藻土，和吸附到用如玻璃包被的磁性颗粒或者磁性有机甲硅烷颗粒。
经常地，使用阳离子表面来分离核酸。此类表面可以用于吸附带电的DNA分子，如EP 0 281 390描述了用于核酸分离的聚阳离子载体，WO 01/94573描述了带电荷的膜或者WO 00/69872描述了pH依赖性离子交换基质。WO 02/48164公开了聚合物，其在固相载体上具有可开关的电荷用于DNA的可逆结合。类似于阳离子表面，聚阳离子实体也具有某些DNA结合亲和性。Stewart，K.，D.，等人，J.Phys.Org.Chem.5(1992)461-466报导了通过增加阳离子电荷来增加溶液中用于结合DNA的聚胺的亲和力。Doré，K.，et al，J.Am.Chem.Soc.126(2004)4240-4244描述了阳离子化合物在双链和单链核酸之间的选择性。
通常应用于例如从复杂的生物液体中分开和分离DNA的另一种方法是使用结合核酸的材料。例如，结合DNA的材料的最突出的实例是玻璃表面，因为在离液试剂和/或醇添加剂存在下它们能够可逆地结合DNA(Vogelstein，B.，和Gillespie，D.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76(1979)615-619)。认为此类结合通过与核酸的磷酸基团相互作用的氧化表面(“X-OH”)来实现。
一种用于分离核酸的常规方法由Chomczynski，P.，和Sacchi，N.，Anal.Biochem.162(1987)156-159在1987年公布。该方法利用蛋白质和核酸对于使用酸性硫氰酸胍-苯酚/氯仿混合物的提取分离方案的不同溶解度。
Boom，R.，等人，J.Clin.Microbiol.28(1990)495-503描述了用于从样品材料纯化DNA和RNA的小规模方案。该方法基于在EDTA/去污剂混合物存在下离液剂的裂解和使核酸酶失活的性质和硅石颗粒的结合核酸的性质。
已知核酸的锂盐在水溶液中具有降低的溶解度。在欧洲专利申请EP 0 818 461中，描述了用含有锂盐和离液剂以及结合核酸的配偶体如硅石颗粒的酸性溶液分离核糖核酸的方法。
在美国专利5,808,041中，描述了用于从细胞分离核酸的组合物。所述组合物是硅胶和与离液盐组合的玻璃颗粒的混合物。
在WO 99/61603中，描述了在pH＞8的碱性条件下用基本上由硅石材料组成的固体基质在至少一种离液物质存在下分离和/或分开环状核酸的方法。
美国专利申请2004/0121336描述了将预定量的核酸结合到多个固体基质结合单位的方法。在美国专利申请2004/0180445中描述了温和裂解和溶解细胞的方法。
考虑到本领域状态中的某些缺点，本申请的目的是提供从复杂的样品材料分离和纯化核酸分子的备选方法。本发明的具体目的是提供促进核酸吸附到固相基质的备选化合物。
发明概述
因此，本发明的主题是进一步提供将核酸吸附到固相的组合物和方法。此类组合物和方法的具体用途是分离和纯化核酸分子。本发明人令人惊奇地发现在水溶性离子液体存在下核酸可以被吸附到固相。
因此，本发明的第一方面是用于将核酸吸附到固相的液体组合物，其特征是该组合物包含(a)在室温为液体(离子液体)并且包含式I的有机阳离子的盐
Figure S2008100929510D00041
(式I)，
其中Y选自碳原子和氮原子，X选自氢原子、碳原子和氮原子，并且其中离域的正电荷延伸到Y和N或该官能团的所有组件上；和(b)水性缓冲剂。
本发明的另一方面是包含式I的有机阳离子的水溶液离子液体将核酸吸附到固相基质的用途，其中Y选自碳原子和氮原子，X选自氢原子、碳原子和氮原子，并且其中离域的正电荷延伸到Y和N或该官能团的所有组件上。
本发明的另一方面是增强离液化合物对核酸和固相的相互作用的效果的方法，其中核酸存在于包含水性缓冲液和离液剂的溶液中，其特征在于向吸附溶液中加入有效量的离子液体，其中离子液体包含式I的有机阳离子，其中Y选自碳原子和氮原子，X选自氢原子、碳原子和氮原子，并且其中离域的正电荷延伸到Y和N或该官能团的所有组件上，并且其中所述离子液体增强核酸向固相的吸附。
本发明的另一方面是分离核酸的方法，其包括：(a)提供下面的组分：(i.)能够可逆地结合核酸的固相；(ii.)含有所述核酸的样品材料；(iii.)含有离子液体的溶液，该离子液体包含式I的阳离子，其中Y选自碳原子和氮原子，X选自氢原子、碳原子和氮原子，并且其中离域的正电荷延伸到Y和N或该官能团的所有组件上；(iv.)水性缓冲液；(b)在适于吸附核酸到固相的条件下接触所提供的组分；(c)将具有吸附的核酸的固相与溶液分离；(d)从固相洗脱所述核酸。
本发明的另一方面是将RNA吸附到固相的方法，其特征在于该方法包括：(a)提供下面的组分：(i.)能够可逆地结合核酸的固相；(ii.)含有核糖核酸的样品材料；.(iii.)水溶液；(b)将提供的组分在适于吸附所述核酸到固相的条件下接触；(c)分离具有吸附的核酸的固相与溶液；(d)从固相洗脱所述核酸。
本发明的另一方面是将RNA吸附到固相，其特征在于该方法包括(a)提供下面的组分：(i.)能够可逆地结合核酸的固相；(ii.)含有所述核糖核酸的样品材料；(iii.)水溶液，其含有浓度为1M到3M的丁基甲基咪唑鎓阳离子；(b)将提供的组分在适于将所述核酸吸附到固相的条件下接触。
本发明的另一方面是用于从含有核酸的材料分离核酸的试剂盒，其特征在于所述试剂盒包含(a)能够可逆地结合核酸的固相；(b)包含式I的有机阳离子的离子液体，其中Y选自碳原子和氮原子，X选自氢原子、碳原子和氮原子，并且其中离域的正电荷延伸到Y和N或该官能团的所有组件上。
发明详述
本发明提供了用于纯化核酸的新的组合物和方法。在本发明的该说明书中，某些术语以具体含义使用，或者被首次定义。为了本发明的目的，使用的术语通过它们的本领域公认的定义来定义(存在时)，那些定义与下面给出的定义冲突或部分冲突的除外。在定义冲突的情况下，首先通过下文给出的任一定义来定义术语的含义。
在本发明说明书和权利要求书中使用的术语“包含”是指“包括，但不必限于”。
本文中使用的冠词“一个”是指一个或多于一个(即，至少一个)该冠词的语法目标。例如，“一个化合物”指一个化合物或一个以上的化合物。
当指定数值范围，如浓度范围时，该范围通过术语“之间”，接着是第一个值n1和第二个值n2指出。所指定范围的下边界被理解为等于或高于第一个值的值。所指定范围的上边界被理解为等于或低于第二个值。从而，值x的指定范围通过n1≤x≤n2给出。
此外，理解术语“约”与数值n组合表示值x在该值的数值±5％给出的间隔内，即n-0.05*n≤x≤n+0.05*n。对于术语“约”与数值组合的情况，n描述了本发明的优选实施方案，如果不指出相反，n的值是最优选的。
术语核酸被吸附到其上的“固相”被理解为基质，其在根据本发明的组合物中是不溶的。优选的固相是具有能够与核酸主链的磷酸基团相互作用的表面的基质。固相可以是多孔或非多孔颗粒、粉状颗粒或者纤维的形式。还设想由羊毛状材料组成的固相，其包含许多无纺纤维。优选的固相由玻璃组成。优选的固相是多孔或非多孔的矿物基质，如硅石、石英、C盐或者具有氧化表面(包括例如，氧化锆、氧化铝和其他金属氧化物)的其他材料或者其混合物。而且，术语“固相”包括用硅石、玻璃、石英或者C盐涂布的有磁力的颗粒。此外，可以理解“粉末”或“粉状”材料形式的基质是指细分的材料，当其分散在本发明的液体组合物中时，产生悬浮液。术语“粉末”或“粉状”材料意在包括片剂，其中粉状材料已经被聚集，但是当与固相组合时仍然产生悬浮液。
在本申请中使用的术语“硅石”表示主要由硅和氧组成的物质。这些物质包含硅石、二氧化硅、硅胶、发烟硅胶、硅藻土、C盐、滑石、石英、玻璃、玻璃颗粒，包括这些物质的所有不同的形状。玻璃颗粒例如可以包含结晶硅石、苏打-石灰玻璃、硼硅玻璃和纤维状无纺玻璃的颗粒。
术语“磁性颗粒”表示具有顺磁或超顺磁性质的颗粒。也就是说，该颗粒是磁性上可置换的，但是在不存在外部应用的磁场时不保留任何磁化强度。
如本文使用的术语“样品”(或“样品材料”)是指复杂样品，更优选生物样品。复杂样品可以含有多种有机和无机化合物，希望其与所述核酸分离。术语“样品”还包括含有来自其他来源，如来自化学或酶促反应混合物，或者来自生物样品材料的以前纯化的核酸的水溶液。用于纯化核酸的术语“生物样品”包括包含病毒或细菌细胞的样品，以及从多细胞分离的细胞，如人和动物细胞，以及组织和细胞培养物。具体地，样品可以含有白细胞和其他免疫活性细胞，具有低和/或高分子量的化合物，如半抗原、抗原、抗体和核酸。样品可以是全血、血清、血浆、脑液、痰、粪便、活组织检查标本、骨髓、口腔灌洗液、组织、尿液或其混合物。本发明还包括来自人或动物身体的生物样品，如液体；优选地，所述生物样品是血液、血浆、血清或尿液。血浆优选为EDTA、肝素或者柠檬酸血浆。在本发明的实施方案中，生物样品包含细菌细胞、真核细胞、病毒或其混合物。如上面示例的生物样品(优选为经处理的形式，如裂解物)可以为组合物的部分，(目标)核酸从所述组合物被吸附到基质上。术语“生物样品”还包括植物、真菌以及单细胞生物的细胞。
本发明的优选的样品是裂解物。“裂解物”或“裂解的样品”可以从复杂样品和/或生物样品材料，包括组织、细胞、细菌或病毒得到，从而，该材料的结构完整性被破坏。为了释放细胞、组织或者更一般地，组成生物样品的颗粒的内含物，可以用酶或化学品处理所述材料以溶解、降解或变性此类生物的细胞壁和细胞膜。该方法被术语“裂解”包括。当用裂解方法释放核酸时，通常使用离液剂，如胍盐和/或阴离子、阳离子、两性离子或非离子去污剂。还有利的是使用蛋白酶，其快速降解具有溶核活性的酶和其他不想要的蛋白质。在裂解过程后剩余微粒，即样品材料的不溶物质的情况下，通常将所述微粒物质与裂解物分离以得到澄清的裂解液。这可以例如，通过过滤或离心进行。在这种情况下，将澄清的裂解物进一步处理，例如，通过本发明的方法处理。从而，术语“裂解的样品”包含澄清的裂解液。
根据本发明的“离液剂”是扰乱液态水的有序结构的任何化学物质。离液剂也促进蛋白质的解折叠、伸展和解离(Dandliker，W.，B.，和de Saussure，V.，A.，In：The Chemistry of Biosurfaces，Hair，M.，L.，ed.，Marcel Dekker，Inc.New York(1971)p.18)。优选的离液盐是碘化钠、高氯酸钠、硫氰酸胍、异硫氰酸胍或者盐酸胍。另一优选的离液剂是尿素。
术语“水性的”、“水”相和“水性”溶液描述溶剂部分包含水的液相。然而，其他溶剂如水可混溶的有机溶剂也可以存在于溶剂部分。考虑到存在其他溶剂，当如按体积比[v/v]测量的30％到100％之间的溶剂部分是水时，认为溶液是“水性的”。
术语“核酸”在本申请中用于指天然和合成来源的DNA和RNA多核苷酸。这包括经修饰的核苷酸，如二脱氧核糖核苷酸、具有修饰的糖残基的核碱基和具有修饰的碱基部分的核碱基(见，例如，Scheit，K.，H.，Nucleotide Analogs，John Wiley and Sons，N.Y.(1980)；Uhlmann，E.，and Peyman，A.，Chem.Rev.90(1990)543-584)。具体地，包括基因组DNA、互补DNA(cDNA)、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)和微型RNA(miRNA)。
“离子液体”是仅仅含有离子的液体。在广义上，该术语包括所有熔盐，例如，在高于800℃温度下的氯化钠。然而，在本文件中，术语“离子液体”用于熔点相对较低的盐。在本发明上下文中，术语“离子液体”是指在室温下为液体的盐。此外，本发明的离子液体是水溶性的离子液体。“离子液体”同时指由阳离子和阴离子组成的盐。阴离子可以是无机或有机阴离子，阳离子主要是有机阳离子，但是在任何情况下，一个离子(阴离子或阳离子)是有机离子。阳离子可以包含咪唑鎓阳离子、吡啶鎓阳离子、铵阳离子、鏻阳离子和取代的胍盐阳离子。离子对的至少一个离子具有离域的电荷。由于两个离子之间的弱相互作用，这些离子液体显示出低熔点。
术语“吸附”通常是指粘附或附着分子或离子(“溶质”)到外表面或者界面以便相对于在溶液总体内的溶质浓度，增加固体表面附近溶质的浓度，该增加是由于浸入溶液的固体和溶质之间的吸引相互作用而致。对表面的结合通常是弱的和可逆的。它是一种表面过程，使得积累的分子实际上不穿透在其上形成它们的物质。该术语不与吸收混淆，吸收是指填充固体中的孔。
核酸的分离和纯化通常与使用高浓度的离液剂像胍鎓盐来将核酸吸附到固相如硅石基质有关(Vogelstein，B.，和Gillespie，D.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76(1979)615-619；Marko，M.，A.，等人，Anal.Biochem.121(1982)382-387)。
离液盐的实例是胍盐，如硫氰酸胍鎓、异硫氰酸胍鎓或者盐酸胍鎓以及碘化钠、高氯酸钠。技术人员已知的其他化合物也是可能的。离液物质实现水分子从溶解的核酸分子的水合物外壳以及从固相如硅石基质的表面去除。结果，硅石基质的-Si-OH基团和核酸主链的磷酸二酯基团之间的直接离子相互作用在该具体情况中变得可能(Melzak，K.，A.，等人，J.Coll.Interf.Sci.181(1996)635-644)。
所述的离液效果伴随着熵的增加。从而，平衡转向核酸与固相表面的结合。作为前提条件，固相的表面必须为中性状态。特别对于硅石材料的表面，用于吸附核酸的优选的pH范围为pH 4到pH 6。硅石基质中存在的添加剂，如其他元素，如硼、铁、磷、铝等等可以改变合适的条件。通过加入其他脱水物质可以增强离液效果。例如，加入有机溶剂，如醇导致提高核酸向玻璃表面的吸附。
本发明人令人惊奇地发现某些离子液体具有类似于离液剂的效果的效果。本发明人可以显示某些离子液体有效促进核酸从水性溶液向固相的吸附。因此，本发明的第一方面是用于将核酸吸附到固相的液体组合物，其特征在于该组合物包括(a)包含式I的有机阳离子的离子液体
Figure S2008100929510D00091
(式I)，
其中Y选自碳原子和氮原子，其中X选自氢原子、碳原子和氮原子，其中离域的正电荷延伸到Y和N或该官能团的所有组件上；和(b)水性缓冲剂。本发明的另一实施方案是包含式I的有机阳离子和如上定义的离子液体用于将核酸吸附到固相的用途。额外含有核酸的本发明的组合物还被称作“吸附溶液”，因为该组合物提供了将核酸吸附到固相所必须的条件。
优选地，Y和X是氮原子并且离域的正电荷延伸到式I的组件Y、X和N上。从而，离子液体的核心可以是胍鎓残基，其携带阳离子的正电荷。组件Y、N和X中的至少一个额外携带其他取代基。优选的取代基选自卤素、烷基、羟基、烷氧基烷基和苯氧基烷基官能团。离子液体的阳离子高度优选地选自N-(1-丁基)胍鎓、N-1-(2-甲氧基乙基)-胍鎓和正-丁烷-1，4-二胍鎓。技术人员容易理解对于后一种二胍鎓化合物的情况，正电荷可以存在于任一胍鎓基上，或者两个胍鎓基上。
备选地并且优选地，X是碳原子，Y是氮原子，Y和N是具有共轭双键的环状系统的部分，并且离域电荷延伸到Y和N上。具有这种核心的离子液体的实例是具有吡啶鎓和咪唑鎓部分的化合物。因此，具体实例是苯并咪唑鎓部分。而且在该情况中，组件Y、N和X中的至少一个额外地携带另一取代基。优选的取代基选自烷基、羟基烷基、烷氧基烷基和苯氧基烷基官能团。高度优选地，离子液体的阳离子选自1-乙基-3-甲基咪唑鎓、1-丁基-3-甲基-咪唑鎓、3-甲基-1-[4-(3-甲基-3-H-苯并咪唑-1-鎓)-丁-1-基]-3H-苯并咪唑鎓-二(苯甲酰基硫酸盐)和1-丁基-吡啶鎓。
根据本发明的离子液体能够促进核酸被吸附到固相，优选具有硅石表面的固相，并且优选在酸性条件下，不进一步需要离液物质，如胍鎓盐(例如，盐酸胍鎓、硫氰酸胍鎓、异硫氰酸胍鎓)。然而，尽管不绝对需要，但是离液物质在进一步促进吸附中是很有益处的。令人惊奇地发现通过向包含常规离液剂的吸附溶液中加入包含丁基甲基咪唑鎓阳离子的化合物可以增强核酸向固相的吸附(例如，实施例2，实验5，也见图1)。从而，本发明的另一实施方案是增强离液化合物对核酸和固相相互作用的效果的方法，其中核酸存在于包含水性缓冲剂和离液剂的溶液中，其特征在于向吸附溶液中加入有效量的离子液体，其中离子液体包含式I的有机阳离子，其中Y选自碳原子和氮原子，其中X选自氢原子、碳原子和氮原子，其中离域的正电荷延伸到Y和N或者该官能团的所有组件上，并且其中离子液体增强核酸向固相的吸附。
因此，优选该组合物额外地含有离液物质。更优选地，离液物质是胍鎓盐。该胍鎓盐优选为盐酸胍鎓(胍鎓HCl，Gu-HCl)、硫氰酸胍鎓和异硫氰酸胍鎓。
离液剂的另一作用是在核酸分离期间抑制存在的核酸降解酶。可以加入额外的还原剂像二硫苏糖醇(DTT)。加入去污剂如20％(w/w)Triton X-100用于细胞裂解。去污剂还可以影响核酸与固相的结合特征。用于将核酸吸附到固相的试剂需要提供良好的和选择性的结合条件。为了提高与固相的相互作用的选择性，必须除去伴随的多肽和蛋白质。这可以例如，通过用蛋白酶K进行酶促消化来进行。然而，一些蛋白裂解酶在高浓度的离液剂存在下不能适当地发挥作用。
在实验中，检查在离液剂、醇和去污剂的不同组合存在下，鲱精DNA的结合。鲱精DNA由高和低分子量DNA组成。在图1中显示了鲱精DNA与玻璃羊毛结合的令人惊奇的结果。可以看出结合的DNA的量取决于吸附条件和所用的离子液体而变。使用3M丁基甲基咪唑鎓在pH 4.5下实现对固相(使用两种不同的硅石基质)的极好吸附。
通常，使用本发明的组合物和方法吸附核酸的优选固相包含多孔和非多孔固体基质。非常优选的是硅石基质。更优选地，硅石基质选自硅胶、玻璃纤维、石英纤维和C盐。还优选地，固相包含多孔或非多孔矿物基质，其选自金属氧化物和/或金属混合的氧化物、氧化铝、二氧化钛、氧化锆和主要由玻璃组成的材料。
还优选固相具有0.1μm到100μm的颗粒大小。还优选多孔固相材料当被使用时具有2到1,000nm的孔径。更优选地，多孔或非多孔固相材料，特别是C盐，为疏松填装的形式。甚至更优选地，固相由玻璃、石英或者陶瓷滤片形式的滤片，和/或含有硅胶和/或矿物基质的颗粒或纤维和石英或玻璃棉的织品，即纤维状无纺玻璃组成。
还优选的是固相包含磁性颗粒。更优选地，用选自硅石、玻璃、石英和C盐的矿物基质涂布磁性颗粒。甚至更优选地，所述基质包含用玻璃涂布的磁性颗粒。在本发明中使用的磁性玻璃颗粒可以以不同的制剂提供。可能将它们以片剂、粉剂或混悬剂的形式提供。非常优选地，将磁性玻璃颗粒悬浮在本发明的液体组合物中。优选地，这些悬浮液含有5到100mg/ml磁性玻璃颗粒(MGPs)。还优选地，将含有硅石的材料悬浮在水性缓冲液中，该缓冲液可以任选地含有本发明的离子液体。
还可以发现在本发明的组合物中包括某些添加剂来进一步增加核酸从水性溶液向固相的吸附。本发明的组合物优选额外地含有选自氯化镁(II)和咪唑的化合物。
可以如下描述将(至少一种)核酸吸附到基质，如玻璃颗粒的步骤。根据本发明，用于吸附核酸到固相的方法包括步骤：(a)提供下面的组分：(i)能够可逆地结合核酸的固相；(ii)含有所述核酸的样品材料；(iii)本发明的组合物；和(b)在适于将所述核酸吸附到固相的条件下接触所提供的组分。
当进行步骤(b)时，优选将样品材料在步骤(iii)的组合物中匀浆。样品材料可以包含生物材料。在该情况中，在步骤(b)之前进行匀浆步骤。如果必要，在匀浆后，将残留的颗粒物质，如细胞碎片通过离心与剩余的均匀的样品材料分离，并通过执行步骤(b)进一步处理上清液。备选的分离技术是已知的，除了离心外，还包括过滤。
根据本发明，在离子液体存在下进行吸附核酸的步骤，所述离子液体包含式I的有机阳离子，其中Y选自碳原子和氮原子，其中X选自氢原子、碳原子和氮原子，其中离域的正电荷延伸到Y和N或该官能团的所有组件上。非常优选地，离子液体的阳离子选自由N-(1-丁基)-胍鎓、N-1-(2-甲氧基乙基)-胍鎓、正丁烷-1，4-二胍鎓、1-乙基-3-甲基咪唑鎓、1-丁基-3-甲基-咪唑鎓、3-甲基-1-[4-(3-甲基-3-H-苯并咪唑-1-鎓)-丁-1-基]-3H-苯并咪唑鎓-二(甲苯甲酰基硫酸盐)和1-丁基-吡啶鎓组成的组的离子液体的阳离子。
本发明的组合物中离子液体的浓度优选为0.02M到4M。更优选地，浓度为0.03M到3M。
还优选使固相与核酸在本发明的组合物存在下的接触在pH 4.0到pH 8.0的pH范围内进行。更优选酸性条件。这意味着在该更优选的实施方案中，吸附过程在低于7和高于4，优选pH 4.5和pH 6.5，更优选pH6的pH下进行。产生合适的水性缓冲液对于技术人员是显而易见的。适于分子生物学目的的缓冲系统可以见例如Sambrook，J.，等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第三版，CSHL Press(2001)Cold Spring Harbor，New York。优选的缓冲物质是三-(羟基甲基)氨基甲烷(TRIS)、2-吗啉代乙磺酸(MES)磷酸、N-(2-羟基乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)(HEPES)、其乙酸盐和其他合适的物质。
在这些条件下，即本发明的组合物存在下，从DNA或RNA结合固相材料的行为产生纯化效果。为了使得样品与基质，即对核酸具有亲和力的材料接触，将样品与所述材料混合并温育足够发生结合的一段时间。专家通常从现有技术描述的如在醇和离液盐存在下进行固相的相当的处理步骤而熟悉所述温育步骤的持续时间。该步骤可以通过确定在不同时间点固相表面上固定的核酸的量来优化。10秒到30间秒之间的温育时间对于核酸是合适的。在温育后，将吸附的目标组分与液相分离。这可以一般通过重力实现。
在结合磁性玻璃颗粒的核酸的方便的情况下，通过对具有吸附的核酸材料的磁性颗粒应用磁场进行分离步骤。例如，磁性颗粒可以被拉向进行温育的容器的壁。然后可以去除含有不结合磁性颗粒的样品的液体。所用的去除步骤依赖于进行温育的容器类型。合适的步骤包括通过移液或者抽吸去除液体。
另一优选的方法是使用所称作的“旋转柱”或“旋转过滤柱”，其可以通过商业途径如作为HIGH PURETM柱从Roche Diagnostics GmbHMannheim，德国得到。旋转过滤柱管通常含有位于柱底部并且覆盖底部开口的无纺玻璃纤维羊毛。含有核酸的吸附溶液被转移到柱中并且通过应用力而穿过所述羊毛。术语“力”包括重力，和优选地，离心力。非常优选的是“旋转柱”步骤，其中由于离心应用的力，吸附溶液穿过滤器。吸附溶液穿过羊毛的其他方法包括施加压力或抽吸。
可以用洗涤溶液洗涤具有被吸附的核酸的固相至少一次。一次或多次洗涤步骤是任选的。使用的洗涤溶液不引起目标组分从材料表面释放，而是尽可能彻底洗除不想要的污染物。该洗涤步骤优选通过将具有结合的靶核酸的材料与洗涤溶液温育来进行。在该步骤中所述材料优选被重悬浮。还优选地，对于材料是玻璃羊毛或者柱中的填料的情况，通过用洗涤溶液冲洗柱子进行洗涤步骤。优选地，通过应用压力、抽吸、离心力或者重力使洗涤溶液穿过柱子。合适的洗涤溶液是技术人员已知的并且可以含有盐、离液物质和/或有机溶剂，如醇。优选仅仅在上述步骤前除去污染的洗涤溶液以将核酸吸附到固相。在最后的洗涤步骤之后，可以将具有被吸附核酸的固相的分离的材料在真空中快速干燥，或者可以允许液体蒸发。还可以使用丙酮进行预处理步骤。
之后，改变条件以从固相释放核酸。该步骤也称作“洗脱”核酸。将具有被固定的生物材料的固相与不具有或仅有少量离液剂和/或有机溶剂和/或离子液体的水性溶液接触。备选地，可以用不具有或仅有少量离液剂和/或有机溶剂和/或离子液体的溶液稀释悬浮液。该性质的缓冲液是技术人员例如，从DE 37 24 442和Jakobi，R.，等人，Anal.Biochem.175(1988)196-201已知的。具有低盐含量的洗脱缓冲液具体是具有小于0.2mol/l含量的缓冲液。优选地，洗脱缓冲液含有用于缓冲目的的物质Tris。还优选地，洗脱缓冲液是去矿物质水。含有纯化核酸的溶液现在可以用于其他反应。任选地，可以使用例如乙醇或异丙醇从溶液沉淀核酸。还可以对沉淀物进行进一步的洗涤步骤。该类型的方法是技术人员公知的并且详细描述于Sambrook，J.，等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第三版，CSHL Press(2001)Cold Spring Harbor，New York。
然而，本发明的另一方面是分离核酸的方法，其包括下面的步骤：(a)提供下面的组分：(i.)能够可逆地结合核酸的固相；(ii.)含有所述核酸的样品材料；(iii.)含有离子液体的溶液，该离子液体包含式I的阳离子，其中Y选自碳原子和氮原子，X选自氢原子、碳原子和氮原子，并且其中离域的正电荷延伸到Y和N或该官能团的所有组件上；(iv.)水性缓冲液；(b)在适于将核酸吸附到固相的条件下接触所提供的组分；(c)将具有吸附的核酸的固相与溶液分离；(d)从固相洗脱所述核酸。在本发明的优选实施方案中，所述核酸是DNA和RNA。在另一优选实施方案中，所述核酸是DNA。在再一优选的实施方案中，所述核酸是RNA。非常优选地，步骤(b)在酸性条件下进行。甚至更优选地，步骤(b)在4到6.5的pH下进行。甚至更优选地，步骤(b)在4.5到6的pH下进行。
还令人惊奇地发现，取决于丁基甲基咪唑鎓阳离子的浓度，可以控制RNA与硅石基质的结合。这在图4中关于酵母RNA显示。在低丁基甲基咪唑鎓浓度下，即在1-2M下，仅仅少量酵母RNA被吸附到硅石基质。在升高的浓度下，如3M丁基甲基咪唑鎓，可以增强酵母RNA对硅石基质的吸附。
本发明的另一实施方案是丁基甲基咪唑鎓四氟硼酸盐用于将RNA吸附到固相的用途，其特征在于离子液体的浓度为1M到3M。已经发现该浓度范围特别适于促进RNA与固相的吸附，而低浓度的RNA结合程度较低(见图4)。从而，本发明的非常优选的实施方案是将RNA吸附到固相的方法，其特征在于该方法包括(a)提供下面的组分：(i.)能够可逆地结合核酸的固相；(ii.)含有所述核糖核酸的样品材料；(iii.)含有浓度为1M到3M的丁基甲基咪唑鎓阳离子的溶液；和(b)在适于吸附所述核糖核酸到固相的条件下接触所提供的组分。非常优选地，步骤(b)在酸性条件下进行。甚至更优选地，步骤(b)在pH 4到pH 6.5下进行。然而，甚至更优选地，步骤(b)在pH4.5到pH6下进行。最优选地，步骤(b)在pH6下进行。
本发明还设想试剂盒。此类本领域已知的试剂盒包含可用于样品制备程序的塑料器具。其实例是例如Eppendorf，Hamburg，德国生产的96孔或384孔形式的微孔板，或者仅仅普通的反应试管。本发明的试剂盒还包含用于进行本发明方法的一些或所有其他试剂。因此，试剂盒可以额外地含有固相，即对核酸具有亲和力的材料。优选地，固相包含具有硅石表面的材料。非常优选地，固相包含玻璃或石英纤维。还非常优选地，固相是组合物，其包含磁性玻璃颗粒，即用玻璃涂布的磁性颗粒。试剂盒可以进一步或额外地包含裂解缓冲剂，其含有例如，离液剂、去污剂或其混合物。本发明的试剂盒的这些组分可以被提供在管或者储存容器中单独。取决于组分的性质，这些可以被提供在单管或储存容器中。试剂盒可以还或额外地包含洗涤溶液，其适于固相(DNA或RNA或两种都结合到该固相)的洗涤步骤。该洗涤溶液可以含有具有酸性pH的缓冲液中的本发明的离子液体和/或离液剂。通常，洗涤溶液或其他溶液作为储存液被提供，其必须在使用前被稀释。试剂盒可以进一步或额外地包含解吸容器，即洗脱缓冲液，即用于将核酸从固相解吸附的溶液。优选的解吸溶液可以是缓冲液(例如，10mM Tris，1mM EDTA，pH 8.0)或纯水。此外，可以存在额外的试剂或缓冲液，其可以用于核酸，即DNA或RNA的纯化过程。从而，本发明的另一方面是用于从含有核酸的材料分离核酸的试剂盒，其特征在于该试剂盒包含(a)能够可逆地结合核酸的固相；(b)离子液体，该离子液体包含式I的有机阳离子，其中Y选自碳原子和氮原子，X选自氢原子、碳原子和氮原子，并且其中离域的正电荷延伸到Y和N或该官能团的所有组件上。
还令人惊奇地发现，加入氯化镁(II)和咪唑也可以改善由胍鎓盐如盐酸胍鎓介导的核酸结合。咪唑作为结合增强剂的具体优点是它可以与用于调节样品溶液的pH值的缓冲盐同时使用。因此，本发明的另一方面是用于将核酸吸附到固相的液体组合物，其特征在于该组合物包含(a)胍鎓盐和/或离子液体，该离子液体包含式I的有机阳离子，其中Y选自碳原子和氮原子，X选自氢原子、碳原子和氮原子，和(b)选自氯化镁(II)和咪唑的化合物。本发明还包含氯化镁(II)用于将核酸从包含核酸的吸附溶液吸附到固相的用途。本发明还包括咪唑用于将核酸从包含所述核酸的吸附溶液吸附到固相的用途。此外，本发明包含用于分离核酸的方法，其特征在于所述方法包括下面的步骤(a)提高下面的组分：(i)能够可逆地结合核酸的固相；(ii)含有所述核酸的样品材料；(iii)含有选自氯化镁(II)和咪唑的化合物的吸附溶液；(b)在适于将所述核酸吸附到所述固相的条件下接触提供的组分；(c)将具有被吸附的核酸的固相与所述溶液分离；(d)从固相洗脱所述核酸。
提供下面的实施例、参考文献和附图用以帮助理解本发明，本发明的真实否范围在所附权利要求中给出。可以理解可以对所给出的步骤进行修改而不背离本发明的精神。
附图描述
图1鲱精DNA与两种不同类型的玻璃羊毛的并行吸附：类型A通过白色条形代表，类型B通过黑色条形代表。纵坐标指示在玻璃羊毛表面上吸附的DNA的量。将条形对编号并且这些条形对对应于实施例2的表1中描述的各自的吸附缓冲液。
图2小牛胸腺DNA在不同条件下与旋转柱的结合，所述旋转柱通过(a)白色条形代表，Roche Applied Science，Roche Diagnostics GmbHMannheim，目录号11796828提供的试剂盒的旋转柱中提供的玻璃羊毛；(b)黑色条形代表，由Macherey & Nagel(目录号740951.50，批号：407/001)的旋转柱中提供的玻璃羊毛。纵坐标指示柱子上吸附的DNA的量。将条形对编号并且这些条形对对应于实施例3的表2中描述的各自的吸附缓冲液。
图3小牛胸腺DNA在不同条件下与旋转柱的结合，所述旋转柱通过(a)白色条形代表，Roche Applied Science，Roche Diagnostics GmbHMannheim，Cat.No.11796828试剂盒的旋转柱中提供的玻璃羊毛；(b)提供黑色条形代表，Macherey & Nagel(目录号740951.50，批号：407/001)试剂盒的旋转柱中提供的玻璃羊毛。纵坐标指示从柱子洗脱的被吸附的DNA的量。将条形对编号并且这些条形对对应于实施例4的表3中描述的各自的吸附缓冲液。
图4酵母RNA在不同条件下与旋转柱的结合，所述旋转柱通过(a)白色条形代表，Roche Applied Science，Roche Diagnostics GmbHMannheim，目录号11796828试剂盒的旋转柱中提供的玻璃羊毛；(b)通过黑色条形代表，Macherey & Nagel(目录号740951.50，批号：407/001)试剂盒的旋转柱中提供的玻璃羊毛。纵坐标指示从柱子洗脱的被吸附的RNA的量。将条形对编号并且这些条形对对应于实施例5的表4中描述的各自吸附缓冲液。
图5(A)N-1-(2-甲氧基乙基)胍鎓盐酸盐的结构；(B)N-(1-丁基)-胍鎓盐酸盐结构；(C)1-丁基-3-甲基-咪唑鎓四氟硼酸盐结构；(D)3-甲基-1-[4-(3-甲基-3-H-苯并咪唑-1-鎓)-丁-1-基]-3H-苯并咪唑鎓-二(甲苯酰基硫酸盐)结构。
实施例描述
实施例1
在不同条件下不同核酸样品结合的比较
将鲱精DNA Roche Applied Science，Roche Diagnostics GmbHMannheim，目录号10223646)以120μg DNA/500μl的浓度用于每个实验中。
小牛胸腺DNA(Roche Applied Science，Roche Diagnostics GmbHMannheim，身份号10041785)以50μg或100μg DNA/500μl使用。
使用常规技术从面包酵母分离的RNA以79μg RNA/500μl的浓度用于每个实验中。
旋转过滤柱，例如，HIGH PURETM柱(例如，来自Roche AppliedScience，Cat.No.11796828；Roche Diagnostics GmbH Mannheim)含有A型或B型玻璃羊毛。将DNA或RNA溶解在如实施例2到5所指出的水性缓冲液中，并将500μl各自溶液装载在旋转柱上。每个柱子连接样品管。在微量离心机[Eppendorf 5415C]上以8,000转数/分钟离心1分钟后，从每个穿过液取样品。用水以1∶5稀释后，通过测量260nm波长下的消光差异测量核酸浓度。作为对照，用对应的“上样溶液”进行相同的测量，所述上样溶液即加到旋转柱的核酸溶液。测定上样前后的浓度差异作为结合到各自固相的核酸的度量。
实施例2
鲱精DNA与两种不同旋转柱的玻璃羊毛的吸附
向如表1所指出的缓冲液中加入鲱精DNA：
表1
  1   1M盐酸胍，20％体积/体积乙醇，20％体积/体积Triton X-100，50mM 2-吗啉代乙磺酸(MES)，pH 6
  2   1M盐酸胍，20％体积/体积乙醇，50mM MES，pH 6
  3   1M盐酸胍，50mM MES，pH 6
  4   3M 1-丁基-3-甲基-咪唑鎓四氟硼酸盐，50mM乙酸钠，pH 4.5
  5   1M 1-丁基-3-甲基-咪唑鎓辛基硫酸盐，1M盐酸胍，50mMMES，pH 6
  6   1M N-(1-丁基)-胍鎓盐酸，50mM乙酸钠，pH 4.5
  7   0.5M MgCl2，50mM MES，pH 6
  8   1M盐酸胍，2M MgCl2，50mM乙酸钠，pH 4.5
  9   1M盐酸胍，1M咪唑，pH 6
  10   1M盐酸胍，0.1M咪唑，pH 6
将500μl每种溶液加到旋转柱上。如实施例1中所述的进行进一步的步骤。结果被描绘在图1中。
实施例3
在不同条件下50μg小牛胸腺DNA与玻璃羊毛的吸附
以50μg DNA/500μl缓冲液的浓度加入小牛胸腺DNA。将DNA加入如表2中给出的缓冲液：
表2
  1   1M盐酸胍，50mM MES，pH6
  2   1M盐酸胍，10％[v/v]乙醇，50mM MES，pH6
  3   1M盐酸胍，20％[v/v]乙醇，50mM MES，pH6
  4   1M盐酸胍，40％[v/v]乙醇，50mM MES，pH6
  5   1M 1-丁基-3-甲基-咪唑鎓四氟硼酸盐，pH 4.5，50mM乙酸钠
  6   1M 1-丁基-3-甲基-咪唑鎓四氟硼酸盐，50mM MES，pH6
  7   1M N-1-(2-甲氧基乙基)-盐酸胍，50mM MES，pH6
  8   2M N-1-(2-甲氧基乙基)-盐酸胍，50mM MES，pH6
  9   3M N-1-(2-甲氧基乙基)-盐酸胍，50mM MES，pH6
将500μl每种溶液加入旋转柱上。如实施例1所述的进行其他步骤。结果被描述在图2中。
实施例4
在不同条件下100μg小牛胸腺DNA对玻璃羊毛的吸附
以100μg DNA/500μl缓冲液的浓度加入小牛胸腺DNA。将DNA加入如表3中给出的缓冲液中：
表3
  1   1M盐酸胍，50mM MES，pH6
  2   1M盐酸胍，10％[v/v]乙醇，50mM MES，pH6
  3   1M盐酸胍，20％[v/v]乙醇，50mM MES，pH6
  4   1M盐酸胍，40％[v/v]乙醇，50mM MES，pH6
  5   1M 1-丁基-3-甲基-咪唑鎓四氟硼酸盐，50mM乙酸钠，pH 4.5
  6   1M 1-丁基-3-甲基-咪唑鎓四氟硼酸盐，50mM MES，pH6
将500μl每种溶液加入到旋转柱上。如实施例1所述的进行其他步骤。结果被描述在图3中。
实施例5
在不同条件下RNA对玻璃羊毛的吸附
以79μg RNA/500μl缓冲液的浓度加入RNA(参见实施例1)。将RNA加入如表4中给出的缓冲液中：
表4
  1   1M 1-丁基-3-甲基-咪唑鎓四氟硼酸盐，50mM乙酸钠，pH 4.5
  2   2M 1-丁基-3-甲基-咪唑鎓四氟硼酸盐，50mM MES，pH6
  3   3M 1-丁基-3-甲基-咪唑鎓四氟硼酸盐，50mM MES，pH6
将500μl每种溶液加入旋转柱上。如实施例1所述的进行其他步骤。结果被描述在图4中。
实施例6
50μg小牛胸腺DNA对磁性玻璃颗粒的吸附
使用来自Roche Applied Science，Roche Diagnostics GmbHMannheim，目录号03310515的大体积MagNA Pure LC DNA分离试剂盒的磁性颗粒。将颗粒悬浮在异丙醇(60mg/ml)中。
以50μg DNA/500μl缓冲液的浓度使用小牛胸腺DNA。将DNA加入如表5中指出的缓冲液中。将每种样品与100μl颗粒悬浮液在室温混合30秒。
随后，通过磁场固定颗粒并与液相分离。用由5M盐酸胍、38％[v/v]乙醇、20mM Tris HCl，pH 6.6组成的第一种水性洗涤缓冲液洗涤颗粒一次，并用由100mM NaCl、50％[v/v]乙醇、10mM Tris HCl，pH 7.4组成的500μl第二种水性洗涤缓冲液洗涤两次。每次洗涤通过除去磁场接着将颗粒悬浮在各自的洗涤缓冲液中来进行。为了除去洗涤缓冲液，将颗粒再次通过磁场固定并与液相分离。
在最后的洗涤步骤之后，通过向颗粒加入500μl洗脱缓冲液(水中10mM Tris HCl，pH 8)并在洗脱缓冲液中通过剧烈涡旋搅拌颗粒从所述颗粒洗脱吸附的DNA。随后，通过离心沉降颗粒并回收含有DNA的上清液。
对于上清液中DNA的光度测量，从每种洗脱液取样品(100μl)，用水进行1∶10稀释，并通过测量260nm波长处的消光测定核酸浓度。
表5指示了在每个实验中使用的吸附缓冲液的组成以及从颗粒洗脱的DNA的量(μg)。
表5
  缓冲液组成   DNA(μg)
  1   4.5M硫氰酸胍，20％[v/v]Triton X-100，50mMTris HCl，pH 6，0.1％(w/v)溴酚蓝   35.8
  2   4.5M硫氰酸胍，50mM Tris HCl，pH 6   3.5
  3   4.5M硫氰酸胍，1M 1-丁基-3-甲基-咪唑鎓四氟硼酸盐，50mM Tris HCl，pH 6   24
  4   4.5M硫氰酸胍，0.1M 1-丁基-3-甲基-咪唑鎓四氟硼酸盐，50mM Tris HCl，pH 6   1.5
  5   1M硫氰酸胍，1M 1-丁基-3-甲基-咪唑鎓四氟硼酸盐，50mM MES，pH 6   4
  6   3M 1-丁基-3-甲基-咪唑鎓四氟硼酸盐，50mMMES，pH 6   28
  7   4.5M硫氰酸胍，0.15M3-甲基-1-[4-(3-甲基-3-H-苯丙咪唑-1-鎓)-丁-1-基]-3H-苯并咪唑鎓-二(甲苯酰基硫酸盐)，50mM MES，pH 6   12.4
  8   3M 1-丁基-3-甲基-咪唑鎓硫氰酸盐，50mMMES，pH 6   72
实施例7
不同量的小牛胸腺DNA与玻璃羊毛的吸附
根据实施例1制备含有小牛胸腺DNA的溶液。在离子液体或硫氰酸胍存在下，DNA吸附到玻璃羊毛。测试的物质在表6中列出。使用MES、Tris或乙酸盐缓冲液(10-50mM)将每种吸附溶液缓冲到pH 6的pH值。通过将吸附溶液穿过旋转柱，如HIGHPURETM旋转柱的玻璃羊毛来实现吸附。应用25μg、50μg和100μg的量。
(a)在向旋转柱应用吸附溶液之前和(b)在吸附溶液穿过玻璃羊毛后的穿过液中通过分光光度法定量DNA。
在吸附步骤前使用PICO GREEN测定法(Invitrogen，Cat.No.P7589)测定吸附溶液中DNA的浓度。此外，使用PICO GREEN测定法，测定穿过玻璃羊毛后(即，吸附步骤后)每种吸附缓冲液中残留DNA浓度。使用这些测量，为每种吸附溶液测定结合到固相的DNA的相对量。
此外，测定洗脱液中的DNA浓度，然而，使用260nm处的光度测定。
通过从最初应用于柱子的核酸浓度减去流通液(即，吸附后)中核酸的浓度来确定吸附到固相的核酸的量。
表6
  物质   吸附溶液中的浓度   应用于玻璃羊毛的DNA的量(μg)   结合玻璃羊毛的DNA的量(μg)   流通液中DNA的量(μg)
  硫氰酸胍   1M   100   83.69   40.5
  50   49.86   34.2
  25   25.0   22.6
  1   1-乙基-3-甲基咪唑鎓乙基硫酸盐   1M   100   86.2   58.5
  50   43.6   31.2
  25   24.9   19.2
  2   1-丁基-3-甲基咪唑鎓乙二醇-单甲醚-硫酸盐   1M   100   71.2   43.5
  50   46.9   29.2
  25   24.9   19.6
  3   氯化1-丁基-吡啶鎓   1M   100   93.4   60.8
  50   49.9   47.5
  25   25   22.0
  4   3-甲基-1-[4-(3-甲基-3H-苯并咪唑-1-鎓)-丁-1-基]-3H-苯并咪唑鎓-二(甲苯甲酰基硫酸盐)   0,15M   100   85.5   49.5
  50   49.9   30.5
  25   25   25.4
  5   硫酸正丁烷-1，4-二胍   0.037M   100   79.9   49.5
  50   49.7   31.2
  25   25.0   24.9
额外观察到表中显示的离子液体的较高浓度(2M、3M和4M)产生相当的结果。

Claims (4)

1.将RNA吸附到固相的方法，其特征在于该方法包括
a)提供下面的组分：
i.能够可逆地结合核酸的固相；
ii.含有所述核糖核酸的样品材料；
iii.含有浓度为1M到3M的丁基甲基咪唑
Figure FSB00000895124900011
阳离子的溶液；和
b)在适于将所述核糖核酸吸附到固相的条件下接触所提供的组分。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于在步骤(b)中pH为4至8。
3.根据权利要求2的方法，其特征在于所述pH为4.5至6.5。
4.根据权利要求1至3任一项的方法，其特征在于所述固相包括用选自硅石、玻璃、石英和C盐的物质涂布的磁性颗粒。
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Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2584230C (en) * 2005-05-06 2012-11-27 Gen-Probe Incorporated Methods of nucleic acid target capture
WO2009140374A2 (en) 2008-05-13 2009-11-19 Gen-Probe Incorporated Inactivatable target capture oligomers for use in the selective hybridization and capture of target nucleic acid sequences
EP2467471B1 (en) * 2009-08-17 2016-01-13 Merck Patent GmbH Method for isolating viruses
US9371509B2 (en) 2009-09-02 2016-06-21 Roche Diagnostics Operations, Inc. Reagents for lysis of bacterial cells
US8420801B2 (en) * 2010-01-08 2013-04-16 Roche Molecular Systems, Inc. Recovery of nucleic acids from magnetic glass particles
CN102906262A (zh) 2010-07-07 2013-01-30 戴阿冈有限公司 用于细菌总dna内含物的特异性分离方法和用于该分离目的的试剂盒
US20150045232A1 (en) * 2010-12-28 2015-02-12 Bexmart Integrated and versatile methods for systems diagnosis of diseases
CN102533725A (zh) * 2011-09-09 2012-07-04 上海佑科生物技术有限公司 一体化缓冲液及使用该一体化缓冲液分离核酸的方法
US9340828B2 (en) 2011-10-27 2016-05-17 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Purification of nucleic acid
GB201303666D0 (en) * 2013-03-01 2013-04-17 Goldsborough Andrew S Sample fixation and stabilisation
CN106459978B (zh) 2014-01-28 2020-05-19 帝测分子Sv有限公司 附接有识别化合物的整料、该些整料的阵列及用途
JP2016020826A (ja) * 2014-07-14 2016-02-04 山善株式会社 分取液体クロマトフラフィ用インジェクタ
EP3585875A4 (en) * 2017-02-27 2020-12-30 miDiagnostics NV SYSTEM AND METHOD FOR PURIFICATION AND AMPLIFICATION OF NUCLEIC ACIDS
US20230183674A1 (en) * 2020-05-25 2023-06-15 Sekisui Medical Co., Ltd. Method for purifying nucleic acid
CN114573483B (zh) * 2022-03-16 2022-11-01 湖南师范大学 一种疏水的磁性离子液体及其制备方法和应用
CN114990109A (zh) * 2022-06-21 2022-09-02 中国科学院过程工程研究所 一种核糖核酸纯化伴侣及其应用
CN115960885B (zh) * 2022-10-09 2023-12-12 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 一种提取肝素钠样品中核酸的方法及组合物

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005064010A1 (de) * 2003-12-19 2005-07-14 Preanalytix Gmbh Zusammensetzung zum binden von nukleinsäure an eine festphase
CN1680421A (zh) * 2004-02-20 2005-10-12 霍夫曼-拉罗奇有限公司 在核酸固相上的吸附
CN1781931A (zh) * 1997-12-06 2006-06-07 Dna研究创新有限公司 核酸的分离

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
JP2862547B2 (ja) 1987-03-02 1999-03-03 ジエン―プローブ・インコーポレイテツド 核酸精製、分離及びハイブリダイゼーション用ポリカチオン性支持体
DE3724442A1 (de) 1987-07-23 1989-02-02 Europ Lab Molekularbiolog Verfahren und vorrichtung zur reinigung von m-13-phagen-dna
US5130238A (en) 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
EP0425563B1 (en) 1988-07-20 1996-05-15 David Segev Process for amplifying and detecting nucleic acid sequences
NL8900725A (nl) * 1989-03-23 1990-10-16 Az Univ Amsterdam Werkwijze en combinatie van middelen voor het isoleren van nucleinezuur.
EP0439182B1 (en) 1990-01-26 1996-04-24 Abbott Laboratories Improved method of amplifying target nucleic acids applicable to both polymerase and ligase chain reactions
JPH06501225A (ja) 1990-07-09 1994-02-10 ジェイ　ガズデン　ピーティーワイ　リミテッド 改良型容器
WO1995006652A1 (en) 1993-08-30 1995-03-09 Promega Corporation Nucleic acid purification compositions and methods
GB9425138D0 (en) 1994-12-12 1995-02-08 Dynal As Isolation of nucleic acid
DE69734263T2 (de) 1996-07-12 2006-07-13 Toyo Boseki K.K. Verfahren zur Isolierung von Ribonucleinsäuren.
DK1036082T3 (da) * 1997-12-06 2002-08-12 Dna Res Innovations Ltd Isolering af nucleinsyrer
US6914137B2 (en) 1997-12-06 2005-07-05 Dna Research Innovations Limited Isolation of nucleic acids
EP0969090A1 (en) 1998-05-27 2000-01-05 QIAGEN GmbH Rapid and simple process for isolation of circular nucleic acids
US6310199B1 (en) 1999-05-14 2001-10-30 Promega Corporation pH dependent ion exchange matrix and method of use in the isolation of nucleic acids
AU2001268153A1 (en) 2000-06-02 2001-12-17 Pall Corporation Processing of plasmid-containing fluids
US6858720B2 (en) 2001-10-31 2005-02-22 Agilent Technologies, Inc. Method of synthesizing polynucleotides using ionic liquids
US20040121336A1 (en) 2002-12-20 2004-06-24 Greenfield I Lawrence Method for generating multiple samples containing a predetermined amount of nucleic acid
US20040180445A1 (en) 2003-03-12 2004-09-16 Domanico Michael J. Methods and compositions for purification of nucleic acid from a host cell
US20070196826A1 (en) 2004-03-23 2007-08-23 Hiroyuki Ohno Solvent For Dissolving Nucleic Acid, Nucleic Acid-Containing Solution And Method Of Preserving Nucleic Acid
WO2007094739A1 (en) * 2006-02-13 2007-08-23 Agency For Science, Technology And Research Method of processing a biological and/or chemical sample

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1781931A (zh) * 1997-12-06 2006-06-07 Dna研究创新有限公司 核酸的分离
WO2005064010A1 (de) * 2003-12-19 2005-07-14 Preanalytix Gmbh Zusammensetzung zum binden von nukleinsäure an eine festphase
CN1680421A (zh) * 2004-02-20 2005-10-12 霍夫曼-拉罗奇有限公司 在核酸固相上的吸附

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Berensmeier Sonja.Magnetic particles for the seqaration and purification of nucleic acids.《Applied microbiology and biotechnology》.2009,第73卷(第3期), *

Also Published As

Publication number Publication date
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