CN101289440B

CN101289440B - 一种多烯大环类化合物及其制备方法与应用

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Publication number: CN101289440B
Application number: CN 200710118178
Authority: CN
Inventors: 鲍时翔; 黄惠琴; 肖红斌; 王战鄂; 李俊华; 张开山; 孙前光; 方哲
Original assignee: Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2007-06-29
Filing date: 2007-06-29
Publication date: 2010-08-25
Anticipated expiration: 2027-06-29
Also published as: CN101289440A

Abstract

本发明公开了一种多烯大环类化合物及其制备方法与应用，更具体地说是利用微生物发酵生产新型多烯大环类化合物及其应用，属于生物技术领域。一种多烯大环类化合物，其化学结构式如下：其中R为甲基或乙基。本发明的优点是：本发明提供的新型多烯大环类化合物，经实验证明，对稻瘟霉、人肝癌细胞SMMC-7721等肿瘤细胞的生长具有明显的抑制作用，且毒性较低，可用于抗真菌生物农药或抗癌药物原料，具有较好的应用前景；本发明提供的制备化合物的方法为生物发酵法，步骤简单、成本较低、有利于产业化推广实施。

Description

一种多烯大环类化合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种多烯大环类化合物及其制备方法与应用，更具体地说是利用微生物发酵法生产一种新型多烯大环类化合物及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

放线菌是具有巨大实用价值的一类微生物，目前从微生物中发现的大约8000种生物活性物质，有近70％是放线菌产生的。但是由于从陆地放线菌中发现的活性物质越来越少，人们逐渐把目光投向了海洋放线菌。它广泛分布于海水、海底沉积物以及海洋动植物的表面和内部(如海绵、海藻等)，并因其特殊的生理状态、遗传背景及独特的代谢方式，形成了大量结构新颖的具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒、酶类抑制剂等多种活性的代谢产物。自美国1967年提出“向海洋要药”的口号开始，“蓝色药物”引起了各国的重视，短短几十年便有多种海洋放线菌合成的具有生物活性的新型结构化合物被发现。

Fenical等(Fenical W，et al.，J Am Chem Soc，2006，8，128(5)，1622-1632)从一个新发现的放线菌属Marinispora中提取出新型的多烯多羟基类化合物，它能有效的作用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和耐万古霉素屎肠球菌等耐药病原菌。Rajendrap等(Rajendrap M，et al.，J Antibiot，2004，57，17-23)从海洋放线菌Streptomyces sp.中分离到新化合物Trioxacarcins A，它对SF-268、H-460和LXFL529L等肿瘤细胞株都显示了较强的抗肿瘤活性。

研究发现，许多放线菌产生的活性物质不仅仅具有单一的抗性，它们往往表现出多种活性。Magarvey等(Magarvey N A，et al.，Appl Environ Microbiol，2004，70(12)，7520-7529)用一种独特的选择性培养方法从新几内亚所罗门海海底沉积物中分离到2种放线菌新种，其发酵液对多种病原菌、肿瘤细胞和牛痘病毒具有抑制活性。

据不完全统计，近年来50％以上新发现的海洋微生物活性物质是由海洋放线菌产生的，但是与陆地放线菌相比，人们对海洋放线菌及其应用的认识还相对落后。相信随着研究的不断深入，人们将会发现更多的海洋放线菌所产生的生物活性物质并加以应用，因此海洋放线菌必将和陆地放线菌一样，成为抗生素等制药工业的又一重要微生物资源。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种具有生物活性的新型多烯大环类化合物。

本发明要解决的另一个技术问题是：提供一株用于制备新型多烯大环类化合物的链霉菌。

本发明要解决的第三个技术问题是：提供一种简便的制备新型多烯大环类化合物的方法。

本发明要解决的最后一个技术问题是：提供这种新型多烯大环类化合物在制备抗真菌或抑制癌细胞生长的药物中的用途。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种新型多烯大环类化合物，其化学结构式如下：

其中R代表甲基(化合物A)或乙基(化合物B)。

一株生产上述多烯大环类化合物的菌株，分离自海南岛三亚海绵，为灰肉色链霉菌海南亚种A429，该菌株在中国普通微生物菌种保藏中心的保藏号为CGMCC NO.2090，保藏日2007年6月14日，建议的名称为灰肉色链霉菌海南亚种Streptomycesgriseocarneus subsp.hainanensis。

一种制备上述多烯大环类化合物的方法，包括以下步骤：

(1)灰肉色链霉菌海南亚种A429(CGMCC NO.2090)的种子培养：

种子培养基：葡萄糖5-15g，可溶性淀粉2-10g，大豆粉5-15g，磷酸二氢钾0-1g，氯化钠0-20g，蒸馏水1000ml；

培养条件为：pH6.5-7.5，培养温度25-32℃，培养时间24-72小时；

(2)灰肉色链霉菌海南亚种A429的发酵培养：

发酵培养基：葡萄糖0-20g，可溶性淀粉5-15g，玉米粉5-15g，大豆粉2-15g，氯化钠0-20g，蒸馏水1000ml；

发酵条件为：pH6.5-7.5，发酵温度25-32℃，发酵时间96-168小时，接种量5％-10％；

(3)分离总提取物：

将步骤(3)得到的发酵液离心，取上清液，经氯仿或乙酸乙酯萃取，减压浓缩得棕色膏状物质；

(4)纯化提取物：

用甲醇溶解提取物，利用半制备型HPLC进行分离纯化；选用Waters Nova-PakC18层析柱(25mm×200mm，6μm)，半制备型HPLC洗脱条件为：室温，50％甲醇在6min内线性升至85％甲醇，流速20ml/min，检测波长230nm，得到多烯大环类化合物。

最终得到化合物A和化合物B，外观为棕黄色膏状，经HPLC分析检测，其纯度分别达到97.32％和97.85％。

所述的多烯大环类化合物和菌株CGMCC NO.2090在制备抗真菌药物中的用途。

所述的多烯大环类化合物和菌株CGMCC NO.2090在制备抑制肿瘤细胞生长的药物中的用途。

本发明的优点是：本发明提供的新型多烯大环类化合物，经实验证明，对稻瘟霉、人肝癌细胞SMMC-7721等肿瘤细胞的生长具有明显的抑制作用，且毒性较低，可用于抗真菌生物农药或抗癌药物原料，具有较好的应用前景；本发明提供的制备化合物的方法为生物发酵法，步骤简单、成本较低、有利于产业化推广实施。

下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，本发明的实施方式并不限于此，凡是根据本发明公开的内容或者原理，实施的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1为化合物A的HPLC/ESI-MS-MS图谱。

图2为化合物B的HPLC/ESI-MS-MS图谱。

图3为化合物A的¹H-NMR图谱。

图4为化合物A的¹³C-NMR图谱。

图5为化合物A的H-H COSY图谱。

图6为化合物A的HMBC图谱。

图7为化合物A的HSQC图谱。

图8为化合物A和B的半制备HPLC图谱。

图9为化合物A和B的HPLC检测图谱。

具体实施方式

实施例1：灰肉色链霉菌海南亚种A429的分离和鉴定

一.菌种的分离：

新鲜海绵采集于海南岛三亚海域。取适量，用无菌海水清洗3次后，取10g海绵样品，用无菌剪刀剪碎，加入90ml无菌海水，用搅拌机打碎至匀浆状，取适量于55℃处理6min以促进孢子的萌发。用无菌海水逐级10倍稀释至10^-2、10^-3，采用改良高氏一号合成培养基，平板稀释法涂布分离，28℃倒置培养，得到菌株A429。

二.菌株A429的鉴定：

(1)形态与培养特征：菌株A429在JCM、Sauton’s、土豆汁、燕麦汁、高氏一号、甘油天门冬素、GYM等多种固体培养基上均生长良好，形成丰富的气生菌丝和基内菌丝，气丝灰白至浅灰色，基丝浅黄至深褐色。在土豆汁平板上可见褐色色素扩散，其它培养基上未见可溶性色素生成。气生菌丝直，可见1～2级轮生，基内菌丝分支不断裂，未见孢子生成。

(2)生理生化特征：利用D-葡萄糖、D-果糖、D-木糖、蔗糖、L-阿拉伯糖、D-甘露醇、肌醇等，不利用D-棉子糖、L-鼠李糖，纤维素上不生长，硝酸盐还原，液化明胶，不产生酪氨酸酶和H₂S，淀粉水解，牛奶无变化。

(3)细胞壁成份分析：

氨基酸分析：以2，6二氨基庚二酸和甘氨酸作对照，对A429菌株细胞壁水解物进行全细胞氨基酸分析，结果该菌株细胞壁含有L，L-甘氨酸，表明该菌株属于细胞壁I型。

糖成份分析：A429菌株全细胞水解物以层析法分析其糖成份含葡萄糖未发现有主要特征性糖，属糖C型。

(4)16S rDNA序列测定与系统发育分析

采用16S rDNA特异引物，对菌株A429总DNA PCR扩增，获得其16S rDNA近全长序列，共1476bp。该序列在GenBank的登录号为DQ319186。将该序列与GenBank中相关数据进行BLAST相似性分析，发现与之同源性高的菌株均为链霉菌，与S.griseocarneus同源性最高(98.4％)。以这些同源性高的菌株以及链霉菌属的典型菌株构建包括13株相关种属的系统发育树，菌株A01059与S.griseocarneus处于同一分支，二者亲缘关系最近。

菌株A429经鉴定属链霉菌属，在亲缘关系上与S.griseocarneus最近。但二者在培养特征与生理生化特征方面存在较大差异，产生的活性物质也不同。鉴于此，将该菌株鉴定为灰肉色链霉菌海南亚种Streptomyces griseocarneus subsp.hainanensis。2007年6月14日保藏于CGMCC，编号为CGMCC NO.2090。

实施例2：化合物A和B的制备

一.灰肉色链霉菌海南亚种A429(CGMCC NO.2090)的种子培养：

种子培养基：葡萄糖10g，可溶性淀粉5g，大豆粉10g，酵母膏10g，磷酸二氢钾0.5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml。

培养条件为：pH7.2，培养温度28℃，培养时间48小时。

二.灰肉色链霉菌海南亚种A429(CGMCC NO.2090)的发酵培养：

发酵培养基：葡萄糖5g，可溶性淀粉10g，玉米粉10g，大豆粉5g，氯化钠10g，蒸馏水1000ml。

发酵条件为：接种量5％-10％，pH7.0，发酵温度28，发酵时间144小时。

三.分离总提取物：

将上述发酵液8000r/min离心10min，取上清液，经乙酸乙酯萃取三次，减压浓缩得棕色膏状物质。

四.纯化提取物：

用适量50％甲醇溶解提取物，利用半制备型HPLC进行分离纯化。选用WatersNova-Pak C18柱(25mm×200mm，6μm)，半制备型HPLC洗脱条件为：50％甲醇在6min内线性升至85％甲醇，流速20ml/min，检测波长230nm。从图谱上看，共分离出9个组份(图8)，收集各组份，采用纸片扩散法，测定9个组分的甲醇溶解物对稻瘟霉的抑制情况，以甲醇作对照。28℃培养24h后观察发现，1～7峰均无活性，8、9峰洗脱液对稻瘟霉表现出强的抑制活性，对照纯甲醇对稻瘟霉孢子的萌发无影响。因此，8、9峰是我们感兴趣的活性峰。同样，采用MTT法检测9个组份对肿瘤细胞的抑制效果，结果显示8、9峰具有抗肿瘤活性。

收集8、9峰，减压浓缩得到化合物A和化合物B，外观为棕黄色膏状，经HPLC分析检测，其纯度分别达到97.32％和97.85％(图9)。

五.鉴定

采用波谱法进行化学结构的鉴定。结果如图1至图7所示，化合物A和B的试验数据：HPLC/ESI-MS所得A的质谱信号m/z509/[M+H]+和507/[M-H]-，B的m/z523/[M+H]+和521/[M-H]-，又经一维和二维核磁共振数据推算A分子式为C₃₂H₄₄O₅，与质谱数据吻合。综合以上光谱分析，推断出该化合物A的结构属于多烯大环类，系统命名为：5-甲基-6-[3-甲基-5-(8-乙酰基-12-羟基-2，4，11，13-四甲基-环十三碳-3，5，8-三烯酮)-六碳-1，3-二烯]-5，6-二氢-吡喃-2-酮。而B的1H NMR和13C NMR图谱中的C、H信号与A极其类似，二者为同一类型的化合物，ESIMS质谱显示一级质谱中二者分子量相差14，二级质谱中主要的碎片也均相差14，推断化合物B比A分子结构中多一个亚甲基。类比二者的C、H谱数据，B是结构式中R位取代基为乙基。化合物A的1H和13C核磁共振数据见表1。

表1 化合物A的1H NMR(400MHz)和13C NMR(100MHz)数据(Me2CO-d6)

*重叠信号，无法分辨积分值及偶合常数。

实施例3：抗稻瘟霉(Pyricularia oryzae)活性试验

8000r/min离心10min，收集发酵上清液。采用纸片扩散法，加样量10μL，培养24h后测量抑菌圈直径。将该菌株的发酵液进行稀释后再测定抗菌活性，发现稀释30倍时仍有明显抑制效果，抑菌圈直径为10mm。同时，通过96孔板培养观察发现，所有稀释和未稀释的发酵液均引起稻瘟霉孢子不萌发或严重变形(表2)。

表2 不同稀释倍数的发酵液对稻瘟霉(稻CGMCC3.3283)的抑菌活性

实施例4：抗肿瘤活性试验

将该菌株的发酵液8000r/min离心10min，收集发酵上清液，并将其稀释10～1000倍，通过MTT法检测不同浓度的发酵液对人肝癌细胞SMMC-7721、小鼠肉瘤细胞S₁₈₀、人肝细胞HL-02的抑制活性。细胞株均购自中国科学院上海生化与细胞研究所。

从表4可看出，该菌产生的活性物质对两种肿瘤都具有抑制活性，在稀释100倍时对人肝癌细胞SMMC-7721、小鼠肉瘤细胞S₁₈₀、人肝细胞HL-02的抑制率分别为80％、81％、5％。稀释1500倍时，对肿瘤细胞的抑制率仍可达50％。另外，该菌各个浓度的发酵液对正常人肝细胞HL-02的抑制率均不高于14％，说明活性物质对肿瘤细胞具有选择抑制作用。

表4 不同稀释倍数的发酵液对细胞的抑制率

Claims

1.一种多烯大环类化合物，其特征在于：其化学结构式如下：

其中R为甲基或乙基。

2.一种制备权利要求1所述的多烯大环类化合物的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)灰肉色链霉菌海南亚种A429保藏号为CGMCC NO.2090的种子培养：

培养条件为：pH6.5-7.5，培养温度25-32℃，培养时间24-72小时；

(2)灰肉色链霉菌海南亚种A429的发酵培养：

发酵条件为：pH 6.5-7.5，发酵温度25-32℃，发酵时间96-168小时，接种量5％-10％；

(3)分离总提取物：

将步骤(2)得到的发酵液离心，取上清液，经氯仿或乙酸乙酯萃取，减压浓缩得棕色浸膏；

(4)纯化提取物：

用甲醇溶解提取物，利用半制备型HPLC进行分离纯化；半制备型HPLC洗脱条件为：室温，50％甲醇在6min内线性升至85％甲醇，流速20ml/min，检测波长230nm，得到多烯大环类化合物。

3.权利要求1所述的多烯大环类化合物在制备抗稻瘟霉药物中的用途。

4.权利要求1所述的多烯大环类化合物在制备抑制肿瘤细胞生长的药物中的用途。