CN101285047B

CN101285047B - 一株高光学纯度d-乳酸生产菌及其发酵生产d-乳酸的工艺

Info

Publication number: CN101285047B
Application number: CN2008100989085A
Authority: CN
Inventors: 何冰芳; 柏中中; 许婷婷; 王丽娟; 欧阳平凯
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2008-05-16
Filing date: 2008-05-16
Publication date: 2010-09-01
Anticipated expiration: 2028-05-16
Also published as: CN101285047A

Abstract

本发明公开了一株高光学纯度D-乳酸生产菌，芽孢乳杆菌Sporolactobacillussp.Y2-8菌株及其发酵生产D-乳酸的工艺。整个发酵工艺包括平板培养、种子培养和发酵产酸，从平板培养、种子培养到发酵产酸一直保持厌氧条件，无需严格分步调控，操作简单；本发酵工艺的培养基成分易得，且配方简单，生产成本较低；利用本发明的菌株和发酵工艺生产的D-乳酸光学纯度高达99.1％，且发酵液中D-乳酸含量达9.1％～16.5％，具有重大的社会意义和经济价值。

Description

一株高光学纯度D-乳酸生产菌及其发酵生产D-乳酸的工艺

技术领域

本发明涉及一株高光学纯度D-乳酸生产菌芽孢乳杆菌Sporolactobacillus sp.Y2-8菌株及其发酵生产D-乳酸的工艺，属于有机酸发酵生产领域。

背景技术

乳酸(Lactic acid)又名α-羟基丙酸(a-Hydroxypropionic acid)，是世界公认的三大有机酸之一，根据其旋光性性质可分为L-乳酸、D-乳酸和D，L-乳酸。

随着D-乳酸的系列新用途的开发，对D-乳酸的应用和生产的研究也越来越受到人们的关注。目前，D-乳酸的用途主要表现在：

(1)D-乳酸是合成防除禾本科杂草的优良除草剂—骠马(Puma Super)和新型广谱高效除草剂—威霸的原料，同时也是二甲四氯丙酸、氟系除草剂等新型农药的原料；

(2)由高光学纯度(光学纯度97％以上)D-乳酸与甲醇酯化合成的D-乳酸甲酯在医药、农药、溶剂的原料及其它手性化合物的合成前体及中间体；

(3)用于生产聚乳酸：

聚乳酸将逐步替代现有的可降解性塑料，并具有与聚烯烃类相竞争的能力。到2010年，聚乳酸年需求量将突破100万吨。乳酸经脱水环化制得丙交酯，丙交酯经开环聚合制得聚乳酸(PLA)。因为乳酸是手性分子所以相应地，所合成的聚乳酸有聚L-乳酸(PLLA)、聚D-乳酸(PDLA)及聚D，L-乳酸(PDLLA)。但是，PLLA的熔点较低及降解速度相对较慢却成了限制其进一步发展的瓶颈。最新研究显示，PLLA和PDLA的共混复合物可以将聚乳酸的熔点从177℃提高到225℃，调整PLLA和PDLA共混复合物中不同组分的比例可调控最终材料的降解速度，这为聚乳酸的应用带来了更广阔的前景。而PDLA正是通过添加高光学纯D-乳酸聚合制备而成的。

以上产品的巨大的市场潜力催生了高效高光学纯D-乳酸生产研究的开展。直接利用微生物发酵法生产手性乳酸，与化学合成法、手性拆分法及酶转化法相比，发酵法不仅可通过菌种选育或代谢调控而获得光学纯度的D-乳酸，而且发酵原料来源广泛、生产成本低、可循环利用、环境友好，已成为全世界近80％的厂家生产手性乳酸采用的方法。1994年，Kosaki等人利用菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus ATCC15538)以葡萄糖为基质发酵产D-乳酸，发酵37h后，D-乳酸的最高产量达98g/L，光学纯度达到99％；日本达依赛尔(タイセル)化学工业公司1997年已拥有每年10吨光学纯度97％以上的D-乳酸生产能力；2003年，RemediosYanez和AnaBelenMoldes等人以纤维素为原料，利用Lactobacillus coryniformic subsp.torquens ATCC 25600发酵产D-乳酸，发酵时加入纤维素酶和β-葡萄糖苷酶，同时进行纤维素的糖化和D-乳酸的发酵，在39℃，pH5.4的条件下发酵48h，D-乳酸产率达到0.5g·L^-1·h^-1，对纤维素产率为0.89g D-乳酸/g纤维素，但D-乳酸产量较低；2004年，G.Bustos，A.B.Moldes和J.L.Alonso等人利用响应面优化法对Lactobacillus coryniformis发酵生产D-乳酸的培养基进行优化，最终采用玉米浆5g/L，酵母膏3.6g/L和蛋白胨10g/L的培养基，发酵96h后得到D-乳酸58.9g/L；2006年，T.Tanaka，M.Hoshina等人以脱脂米糠(麸)为原料，利用Lactobacillus delbrueckii subsp.DelbrueckiiIFO 3202发酵产D-乳酸，发酵时加入米糠、淀粉酶、纤维素酶同时进行糖化和发酵，最终D-乳酸的质量产率可以达到对米糠28％和酶水解糖液78％，D-乳酸的光学纯度为95％。

国内对D-乳酸生产菌和生产工艺公开和报道得较少。本研究室的丁子建等于2004首次报道利用芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus sp.)从葡萄糖发酵产D-乳酸的工艺，发酵72小时后D-乳酸产量为40.7g/L，光学纯度达96.04％，本工艺的产物光学纯度较高，但产量相对偏低；2006年，杨文革等报道了利用乳酸杆菌采用组合发酵技术生产D-乳酸的工艺，从葡萄糖出发，发酵25～38小时，产酸可达75～131g/L乳酸，光学纯度达99％，但该工艺使用了组合发酵法，即发酵过程需按照有氧发酵、微氧发酵和最后的厌氧产酸发酵三步骤分阶段调控进行，操作和控制相对困难。因此，选育高光学纯度的D-乳酸生产菌，以及开发操作简单、产酸效率高的D-乳酸发酵工艺是D-乳酸工业的发展方向。

发明内容

本发明的技术目的是提供一株优良的D-乳酸生产菌株，以及利用该菌株发酵生产D-乳酸的工艺，使得该生产菌株所产的D-乳酸具有高光学纯度，且通过提供合适的发酵工艺条件，使得利用该生产菌株发酵生产D-乳酸的工艺不仅简单方便，而且原料易得，成本低廉，在保证产物高光学纯度的基础上达到较高的产酸能力。

为实现本发明的技术目的，本发明采取以下技术方案：

一、高光学纯度D-乳酸生产菌芽孢乳杆菌Sporolactobacillus sp.Y2-8菌株：

1、从土壤中筛选产D-乳酸原始菌株

以葡萄糖高糖液体培养基对南京地区土壤样品中的耐高糖微生物进行富集培养，再通过高葡萄糖-溴甲酚绿显色平板在厌氧培养条件下对耐高糖的产酸菌株进行单离，挑选变色圈直径大且变色速度快的菌株进行产酸发酵研究，获得一株D-乳酸同型发酵菌株，命名为Sporolactobacillus DX12，超低温保藏备用。

Sporolactobacillus DX12经BIOLOG全自动细菌鉴定仪鉴定，表明该菌株与芽孢乳杆菌Sporolactobacillus相似度(SIM)为0.60，经16SrDNA序列分析表明与该序列相似度高于99％的菌株均为Sporolactobacillus属菌株，其中与菌株Sporolactobacillusinulinus ATCC15538相似度为99.8％，确定为芽孢乳杆菌的一新菌株。

2、菌株Y2-8的选育方法

采用低能离子注入法将D-乳酸同型发酵DX12菌株进行诱变后，在pH试剂型平板上筛选，以出发菌变色圈为对照，以变色圈直径大于出发菌株0.5cm为正向突变标准，共筛选到18株产量正突变株；最后，对发酵培养基进行优化，采用C18柱以HPLC法对16株产量正突变株的发酵产物进行定量测定。经传代发酵试验，获得一株稳定高产D-乳酸菌株，命名为Sporolactobacillus sp.Y2-8。

本发明对芽孢乳杆菌Sporolactobacillus DX12的诱变突变株Y2-8的生物特征进行了鉴定，对该菌的革兰氏染色观察表明该菌株为G⁺杆菌，有芽孢，大小为0.5μm×2～3μm。在平板培养基中生长36h后，菌落大小为1.5～2mm，生长温度范围是25～42℃，最适温度是37℃，生长pH是4～7.5，最适pH是6.0；其生理生化特性表现在，对过氧化氢酶反应阴性，明胶不液化，不形成吲哚，不还原硝酸盐，石蕊牛奶不变色。纤维醇、麦芽糖、D-蔗糖、甘露糖及α-D-乳糖利用结果为阳性，D-阿拉伯糖、D-半乳糖及柠檬酸利用结果为阴性，在兼性厌氧条件下生长。

二、利用芽孢乳杆菌Y2-8发酵生产D-乳酸的工艺，包括平板培养、种子培养和发酵产酸，其特征在于：在厌氧条件下进行平板培养和种子培养后，以淀粉类糖化液为碳源，通过在发酵罐中通入氮气的方式进行发酵产酸，使工艺过程全程厌氧进行。

(1)平板培养：将芽孢乳杆菌Y2-8接种至平板培养基厌氧培养，培养温度30～40℃，培养时间20～36h；

平板培养基重量百分配比为葡萄糖10～15％，酵母膏0.1～0.3％，无水乙酸钠0.2～0.5％，无水硫酸镁0.01～0.05％，磷酸二氢钾0.1～0.3％，琼脂1.8％，水余量，pH7.0；

(2)种子培养：将平板培养的芽孢乳杆菌Y2-8接种到种子培养基厌氧培养，培养温度30～40℃，培养时间12～18h。

种子培养基所需的碳源包括浓度为2％～5％的葡萄糖、玉米糖化液中的一种或两者的混合物；

种子培养基所需的氮源包括浓度为0.2％～1.0％的酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、玉米浆、麸皮的一种或多种的混合物；

种子培养基中的无机离子重量百分配比为无水硫酸镁0.01～0.05％，硫酸亚铁0.001～0.005％，硫酸锰0.001～0.005％，碳酸钙1.5～3％，水余量，pH7.0。

种子培养阶段通过2～3cm液体石蜡液封，或增大装液量的同时降低转速而实现厌氧培养；种子培养阶段中可在摇瓶中添加玻璃珠，以增强传质效果。

(3)发酵产酸：将种子培养液接种到发酵培养基中进行产酸发酵，直接以淀粉类糖化液为碳源，接种量为5％～10％(v/v)，发酵温度30～40℃，以总流速每升培养基0.6～2L/min量通入氮气，采用中和剂将发酵体系pH控制在5.0～7.0，发酵72～120h。

发酵产酸培养基的碳源包括浓度为10％～18％的葡萄糖、玉米糖化液中的一种或两者的混合物；

发酵产酸培养基的氮源包括浓度为0.2％～2.0％的尿素、硫酸铵、氨水、酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、玉米浆、麸皮中的一种或多种的混合物；

发酵产酸培养基中的无机离子重量百分配比为无水硫酸镁0.01～0.1％，硫酸亚铁0.001～0.01％，硫酸锰0.001～0.01％，水余量，pH7.0。

发酵产酸所用的中和剂包括KOH、NaOH、Na₂CO₃、CaCO₃、CaO、氨水、碳氨中的一种或多种的组合。

本发明的有益效果在于提供了一株稳定高产高光学纯D-乳酸的菌株；而本发明利用该菌株发酵生产D-乳酸的工艺，从平板培养、种子培养到发酵产酸一直保持厌氧条件，无需严格分步调控，操作简单；本发酵工艺的各步培养基成分易得，且配方简单，生产成本较低；利用本发明的菌株和发酵工艺生产的D-乳酸光学纯度高达99.1％，且发酵液中D-乳酸含量达9.1％～16.5％，具有重大的社会意义和经济价值。

本发明的微生物分类命名为芽孢乳杆菌Sporolactobacillus sp.Y2-8，保藏日期为2008年4月10日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏编号：CCTCCNo：M 208052。

具体实施方式

实施例1

本实施例说明芽孢乳杆菌Y2-8的选育方法。

1、从土壤中筛选产D-乳酸原始菌株：

以100g/L葡萄糖高糖液体培养基对南京地区土壤样品中的耐高糖微生物进行富集培养，再通过100g/L葡萄糖-溴甲酚绿显色平板在厌氧培养条件下对耐高糖的产酸菌株进行单离，挑选变色圈直径大且变色速度快的菌株进行产酸发酵研究。产物的光学纯度检测采用高效液相色谱手性固定相法进行检测，配位体交换柱型号为Sumichiral CA5000，流动相为1mM的CuSO₄溶液，紫外检测波长为254nm。获得一株D-乳酸菌株，命名为Sporolactobacillus inulinus DX12，超低温保藏备用。

2、菌株Y2-8的选育方法为：

(1)低能离子注入诱变：取厌氧培养3天的Sporolactobacillus inulinus DX12菌泥，用0.85％的生理盐水制成菌悬液，于无菌空白培养皿制成菌膜后进行离子注入。离子能量为10keV，注入剂量为0.40×10¹⁵、2.4×10¹⁵、4.4×10¹⁵、6.60×10¹⁵ions/cm²，注入时间为5s，间隔时间为15s。

(2)pH试剂型平板筛选：用生理盐水洗脱菌膜，将菌悬液涂布于150g/L葡萄糖-溴甲酚绿显色平板后置于37℃厌氧培养。以出发菌变色圈为对照，以变色圈直径大于出发菌株0.5cm为正向突变标准，共筛到16株产量正突变株。采用C18柱以HPLC法对发酵产物进行定量测定，流动相为2.5mM的NH₄H₂PO₄溶液，紫外检测波长为230nm。产物的光学纯度检测采用高效液相色谱手性固定相法进行检测，配位体交换柱型号为Sumichiral CA5000，流动相为1mM的CuSO₄溶液，紫外检测波长为254nm。18株产量正突变株D-乳酸发酵结果如表1所示。

表1产量正突变株D-乳酸定量测定结果

(3)遗传稳定性试验：经传代发酵试验考察遗传稳定性后，获得一株稳定高产D-乳酸菌株，命名为Y2-8。菌株Y2-8传代发酵试验结果如表2所示。

表2菌株Y2-8的遗传稳定性实验结果

3、发酵培养基优化：

依次对初始发酵培养基碳源、氮源、无机离子和中和剂的种类及浓度进行优化。菌株Y2-8在优化后条件下获得了16.5％乳酸发酵结果，D-乳酸光学纯度达99.1％。

实施例2

本实施例说明利用芽孢乳杆菌Y2-8发酵产D-乳酸的工艺。

平板培养基：葡萄糖10％，酵母膏0.2％，无水乙酸钠0.2％，无水硫酸镁0.01％，磷酸二氢钾0.2％，琼脂1.8％，水余量，pH7.0；

种子培养基：葡萄糖2％，酵母膏0.3％，玉米浆0.4％，麸皮0.3％，无水硫酸镁0.02％，硫酸亚铁0.001％，硫酸锰0.001％，碳酸钙1.5％，水余量，pH7.0；

发酵培养基：葡萄糖10％，玉米浆1.5％，无水硫酸镁0.05％，硫酸亚铁0.001％，硫酸锰0.001％，水余量，pH7.0。

将芽孢乳杆菌Y2-8接种到平板培养基中，置于厌氧培养箱中培养，培养温度30℃，培养时间36h。将平板培养好的芽孢乳杆菌接种到装液量为60mL的种子培养基中，加入10粒玻璃珠，并以2～3cm厚液体石蜡进行液封后进行培养，培养温度37℃，培养转速为120rpm，培养12h后，当种子液OD_660nm达到5左右时即可转接进入发酵培养。

选用5.0L发酵罐，配制3.5L发酵培养基，以5％接种量进行接种，以总流速0.06L/min量通入氮气，发酵温度30℃，以流加氨水的形式发酵体系pH控制在5.0，搅拌转速150rpm，发酵96h，采用液相色谱测定，发酵液中D-乳酸含量达9.1％，光学纯度为99.03％。

实施例3

本实施例说明利用芽孢乳杆菌Y2-8发酵产D-乳酸的工艺。

平板培养基：葡萄糖12％，酵母膏0.1％，无水乙酸钠0.3％，无水硫酸镁0.03％，磷酸二氢钾0.3％，琼脂1.8％，水余量，pH7.0；

种子培养基：葡萄糖5％，牛肉膏0.6％，无水硫酸镁0.01％，硫酸亚铁0.003％，硫酸锰0.005％，碳酸钙2％，水余量，pH7.0。

发酵培养基：玉米糖化液(葡萄糖计)10％，酵母膏0.2％，无水硫酸镁0.05％，硫酸亚铁0.001％，硫酸锰0.001％，水余量，pH7.0。

将芽孢乳杆菌Y2-8接种到平板培养基中，置于厌氧培养箱中培养，培养温度37℃，培养时间30h。将平板培养好的芽孢乳杆菌接种到装液量为60mL的种子培养基中，以2～3cm厚液体石蜡进行液封后进行培养，培养温度40℃，培养转速为150rpm，培养时间18h，当种子液OD_660nm达到5左右时即可转接进入发酵培养。

选用5.0L发酵罐，配置3.5L发酵培养基，以7.5％接种量进行接种，以总流速0.06L/min量通入氮气，发酵温度40℃，通过流加NaOH溶液使发酵体系pH控制在7.0，搅拌转速250rpm，发酵72h，采用液相色谱测定，发酵液中D-乳酸含量达9.3％，光学纯度为98.8％。

实施例4

本实施例说明利用芽孢乳杆菌Y2-8发酵产D-乳酸的工艺。

平板培养基：葡萄糖15％，酵母膏0.3％，无水乙酸钠0.5％，无水硫酸镁0.05％，磷酸二氢钾0.1％，琼脂1.8％，水余量，pH7.0；

种子培养基：葡萄糖和玉米糖化液混合液5％，酵母膏0.3％，蛋白胨0.2％，无水硫酸镁0.05％，硫酸亚铁0.005％，硫酸锰0.003％，麸皮0.5％，碳酸钙3％，水余量，pH7.0。

发酵培养基：玉米糖化液(葡萄糖计)10％，蛋白胨1.0％，无水硫酸镁0.05％，硫酸亚铁0.001％，硫酸锰0.001％，碳酸钙5％，水余量，pH7.0。

将芽孢乳杆菌Y2-8接种到平板培养基中，置于厌氧培养箱中培养，培养温度40℃，培养时间20h。将平板培养好的芽孢乳杆菌接种到装液量为60mL的种子培养基中，加入10mL玻璃珠，并以3cm厚液体石蜡进行液封后进行培养，培养温度37℃，培养转速为120rpm，培养时间18h，当种子液OD_660nm达到5左右时即可转接进入发酵培养。

选用5.0L发酵罐，配置3.5L发酵培养基，以10％接种量进行接种，以总流速0.06L/min量通入氮气，发酵温度37℃，pH控制在5.0，搅拌转速200rpm，发酵120h，采用液相色谱测定，发酵液中D-乳酸含量达9.3％，光学纯度为99％。

实施例5

本实施例说明利用芽孢乳杆菌Y2-8发酵产D-乳酸的工艺。

平板培养基：同实施例2。

种子培养基：葡萄糖3％，酵母膏0.2％，无水硫酸镁0.02％，硫酸亚铁0.001％，硫酸锰0.001％，碳酸钙1.5％，水余量，pH7.0。

发酵培养基：玉米糖化液加部分葡萄糖至葡萄糖浓度达15％，牛肉膏1.2％，无水硫酸镁0.05％，硫酸亚铁0.001％，硫酸锰0.001％，氧化钙6％，水余量，pH7.0。

将芽孢乳杆菌Y2-8接种到平板培养基中，置于厌氧培养箱中培养，培养温度30℃，培养时间36h。将平板培养好的芽孢乳杆菌接种到装液量为120mL的种子培养基中，加入15粒玻璃珠，培养温度37℃，培养转速为100rpm，培养时间18h，当种子液OD_660nm达到5左右时即可转接进入发酵培养。

选用5.0L发酵罐，配置3.5L发酵培养基，以5％接种量进行接种，以总流速0.06L/min量通入氮气，发酵温度37℃，通过流加NaOH使发酵体系pH控制在6.0，搅拌转速300rpm，发酵120h，采用液相色谱测定，发酵液中D-乳酸含量达13.6％，光学纯度为99％。

实施例6

本实施例说明利用芽孢乳杆菌Y2-8发酵产D-乳酸的工艺。

平板培养基：同实施例3。

种子培养基：玉米糖化液3％，玉米浆1.0％，无水硫酸镁0.02％，硫酸亚铁0.001％，硫酸锰0.001％，碳酸钙1.5％，水余量，pH7.0。

发酵培养基：葡萄糖15％，酵母膏1.0％，麸皮0.4％，无水硫酸镁0.05％，硫酸亚铁0.001％，硫酸锰0.001％，碳酸钙4％，水余量，pH7.0。

将芽孢乳杆菌Y2-8接种到平板培养基中，置于厌氧培养箱中培养，培养温度37℃，培养时间30h。将平板培养好的芽孢乳杆菌接种到装液量为60mL的种子培养基中，加入10粒玻璃珠，并以2cm厚液体石蜡进行液封后进行培养，培养温度37℃，培养转速为110rpm，培养时间13h，当种子液OD_660nm达到5左右时即可转接进入发酵培养。

选用5.0L发酵罐，配置3.5L发酵培养基，以10％接种量进行接种，以总流速1L/min量通入氮气，发酵温度35℃，间歇性流加碳酸钠溶液维持发酵体系pH控制在6.0，搅拌转速200rpm，发酵120h，采用液相色谱测定，发酵液中D-乳酸含量达14.5％，光学纯度为99.1％。

实施例7

本实施例说明利用芽孢乳杆菌Y2-8发酵产D-乳酸的工艺。

平板培养基：同实施例4。

种子培养基：玉米糖化液5％，麸皮1.0％，无水硫酸镁0.02％，硫酸亚铁0.001％，硫酸锰0.001％，碳酸钙1.5％，水余量，pH7.0。

发酵培养基：玉米糖化液(葡萄糖计)15％，酵母膏0.5％，蛋白胨0.5％，硫酸铵0.4％，无水硫酸镁0.05％，硫酸亚铁0.001％，硫酸锰0.001％，碳酸钙4％，水余量，pH7.0。

将芽孢乳杆菌Y2-8接种到平板培养基中，置于厌氧培养箱中培养，培养温度40℃，培养时间20h。将平板培养好的芽孢乳杆菌接种到装液量为60mL的种子培养基中，以2cm厚液体石蜡进行液封后进行培养，培养温度37℃，培养转速为110rpm，培养时间18h，当种子液OD_660nm达到5左右时即可转接进入发酵培养。

选用5.0L发酵罐，配置3.5L发酵培养基，以10％接种量进行接种，以总流速0.06L/min量通入氮气，发酵温度42℃，流加碳氨使发酵体系pH控制在5.0，搅拌转速200rpm，发酵96h，采用液相色谱测定，发酵液中D-乳酸含量达14.2％，光学纯度为99.1％。

实施例8

本实施例说明利用芽孢乳杆菌Y2-8发酵产D-乳酸的工艺。

平板培养基：同实施例2。

种子培养基：玉米糖化液2％，蛋白胨0.6％，无水硫酸镁0.02％，硫酸亚铁0.001％，硫酸锰0.001％，碳酸钙1.5％，水余量，pH7.0。

发酵培养基：葡萄糖18％，酵母膏0.4％，牛肉膏0.4％，玉米浆0.4％，尿素0.4％，无水硫酸镁0.05％，硫酸亚铁0.001％，硫酸锰0.001％，水余量，pH7.0。

将芽孢乳杆菌Y2-8接种到平板培养基中，置于厌氧培养箱中培养，培养温度30℃，培养时间36h。将平板培养好的芽孢乳杆菌接种到装液量为60mL的种子培养基中，以2cm厚液体石蜡进行液封后进行培养，培养温度37℃，培养转速为120rpm，培养时间18h，当种子液OD_660nm达到5左右时即可转接进入发酵培养。

选用5.0L发酵罐，配置3.5L发酵培养基，以10％接种量进行接种，以总流速0.2L/min量通入氮气，发酵温度35℃，流加碳氨使发酵体系pH控制在6.0，搅拌转速300rpm，发酵96h，采用液相色谱测定，发酵液中D-乳酸含量达15.9％，光学纯度为99.0％。

实施例9

本实施例说明利用芽孢乳杆菌Y2-8发酵产D-乳酸的工艺。

平板培养基：同实施例3。

种子培养基：葡萄糖和玉米糖化液混合液5％，酵母膏0.3％，蛋白胨0.2％，无水硫酸镁0.02％，硫酸亚铁0.001％，硫酸锰0.001％，麸皮0.5％，碳酸钙1.5％，水余量，pH7.0。

发酵培养基：玉米糖化液(葡萄糖计)18％，酵母膏0.5％，蛋白胨0.4％，麸皮0.7％，氨水0.4％，无水硫酸镁0.05％，硫酸亚铁0.001％，硫酸锰0.001％，碳酸钙5％，水余量，pH7.0。

将芽孢乳杆菌Y2-8接种到平板培养基中，置于厌氧培养箱中，培养温度37℃，培养时间30h。将平板培养好的芽孢乳杆菌接种到装液量为60mL的种子培养基中，加入10粒玻璃珠，并以3cm厚液体石蜡进行液封后进行培养，培养温度37℃，培养转速为120rpm，培养时间18h，当种子液OD_660nm达到5左右时即可转接进入发酵培养。

选用5.0L发酵罐，配置3.5L发酵培养基，以10％接种量进行接种，以总流速0.2L/min量通入氮气，发酵温度37℃，流加碳酸钠使发酵体系pH控制在5.0，搅拌转速200rpm，发酵120h，采用液相色谱测定，发酵液中D-乳酸含量达15.8％，光学纯度为99％。

实施例10

本实施例说明利用芽孢乳杆菌Y2-8发酵产D-乳酸的工艺。

平板培养基：同实施例4。

种子培养基：葡萄糖和玉米糖化液混合液5％，酵母膏0.3％，蛋白胨0.2％，无水硫酸镁0.04％，硫酸亚铁0.001％，硫酸锰0.001％，麸皮0.5％，碳酸钙1.5％，水余量，pH7.0。

发酵培养基：葡萄糖和玉米糖化液混合液(葡萄糖计)18％，酵母膏0.6％，蛋白胨0.4％，牛肉膏0.4％，无水硫酸镁0.05％，硫酸亚铁0.001％，硫酸锰0.001％，碳酸钙5％，水余量，pH7.0。

将芽孢乳杆菌Y2-8接种到平板培养基中，置于厌氧条件下，培养温度40℃，培养时间20h。将平板培养好的芽孢乳杆菌接种到装液量为60mL的种子培养基中，加入10mL玻璃珠，并以3cm厚液体石蜡进行液封后进行培养，培养温度37℃，培养转速为120rpm，培养时间18h，当种子液OD_660nm达到5左右时即可转接进入发酵培养。

选用5.0L发酵罐，配置3.5L发酵培养基，以10％接种量进行接种，以总流速0.2L/min量通入氮气，发酵温度37℃，流加氨水使发酵体系pH控制在6.0，搅拌转速200rpm，发酵120h，采用液相色谱测定，发酵液中D-乳酸含量达16.3％，光学纯度为99.1％。

Claims

1.一株高光学纯度D-乳酸生产菌，分类命名为芽孢乳杆菌Sporolactobacillussp.Y2-8，其保藏登记号为CCTCC No：M 208052。

2.利用权利要求1所述芽孢乳杆菌Sporolactobacillus sp.Y2-8发酵生产D-乳酸的工艺，包括平板培养、种子培养和发酵产酸，其特征在于：在厌氧条件下进行平板培养和种子培养后，通过在发酵罐中通入氮气的方式进行发酵产酸，使工艺过程全程厌氧进行。

3.根据权利要求2所述芽孢乳杆菌Sporolactobacillus sp.Y2-8发酵生产D-乳酸的工艺，其特征在于：

(2)种子培养：将平板培养的芽孢乳杆菌Y2-8接种到种子培养基中进行厌氧培养，培养温度30～40℃，培养时间12～18h；

4.根据权利要求2或3所述芽孢乳杆菌Sporolactobacillus sp.Y2-8发酵生产D-乳酸的工艺，其特征在于所述的平板培养基重量百分配比为葡萄糖10～15％，酵母膏0.1～0.3％，无水乙酸钠0.2～0.5％，无水硫酸镁0.01～0.05％，磷酸二氢钾0.1～0.3％，琼脂1.8％，水余量，pH7.0。

5.根据权利要求2或3所述芽孢乳杆菌Sporolactobacillus sp.Y2-8发酵生产D-乳酸的工艺，其特征在于所述的种子培养基的碳源包括浓度为2％～5％的葡萄糖、玉米糖化液中的一种或两者的混合物；氮源及生长因子包括浓度为0.2％～1.0％的酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、玉米浆、麸皮中的一种或多种的混合物；无机离子重量百分配比为无水硫酸镁0.01～0.05％，硫酸亚铁0.001～0.005％，硫酸锰0.001～0.005％，碳酸钙1.5～3％，水余量，pH7.0。

6.根据权利要求2或3所述芽孢乳杆菌Sporolactobacillus sp.Y2-8发酵生产D-乳酸的工艺，其特征在于所述的发酵产酸培养基的碳源包括浓度为10％～18％的葡萄糖、玉米糖化液中的一种或两者的混合物；氮源及生长因子包括浓度为0.2％～2.0％的尿素、硫酸铵、氨水、酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、玉米浆、麸皮中的一种或多种的混合物；无机离子重量百分配比为无水硫酸镁0.01～0.1％，硫酸亚铁0.001～0.01％，硫酸锰0.001～0.01％，水余量，pH7.0。

7.根据权利要求2或3所述芽孢乳杆菌Sporolactobacillus sp.Y2-8发酵生产D-乳酸的工艺，其特征在于所述的种子培养阶段以2～3cm液体石蜡液封，或增大装液量的同时降低转速而实现厌氧培养。

8.根据权利要求2或3所述芽孢乳杆菌Sporolactobacillus sp.Y2-8发酵生产D-乳酸的工艺，其特征在于所述的种子培养阶段中在摇瓶中添加玻璃珠，以增强传质效果。

9.根据权利要求2或3所述芽孢乳杆菌Sporolactobacillus sp.Y2-8发酵生产D-乳酸的工艺，其特征在于所述的发酵产酸阶段所用的中和剂包括NaOH、KOH、Na₂CO₃、CaCO₃、CaO、氨水、碳氨中的一种或多种的组合。