CN101238218A - 初级细胞的转导 - Google Patents

Abstract

涉及造血系统的初级细胞和/或造血干细胞稳定转导的方法、组合物和系统。用于造血系统的初级细胞和/或造血干细胞稳定转导的方法包括：以体外或先体外后体内(离体)的方式将所述细胞的表面与慢病毒载体和至少一种结合所述细胞表面的分子相接触，并且在有益于生长和/或增殖的条件下、在含有两层或多层的通风容器中培养所述细胞，其中所述容器适于培养至少约100,000,000个细胞。也公开了使用转导的初级细胞来治疗、诊断、缓解或预防对象的肿瘤或感染。也描述了含有容器或瓶以在其中生长初级细胞的系统。

Description

初级细胞的转导

相关申请

[0001]本申请与2005年5月20日提交的美国临时专利申请60/683,527相关，在此引入其全部作为参考。

[0002]这些文件的内容被引入作为参考。

技术领域

[0003]一般来说，本发明涉及病毒学、细胞生物学和生物技术。具体而言，本发明提供新型的方法用于制造初级细胞、转导初级细胞和扩大初级细胞群。

[0004]本发明涉及方法和与所述方法相关的组合物，用于使用病毒载体有效且稳定地转导细胞。该方法导致转导的细胞的数量增加。该转导的细胞可用于实验室和临床应用。

[0005]本发明涉及方法、和与所述方法相关的组合物和系统，用于使用病毒载体有效且稳定地转导细胞。该方法通过例如将要被转导的细胞与一种或多种结合该细胞表面的分子相接触，增加了转导的有效性。接触步骤可以在将病毒载体导入细胞之前、之后或同时进行。该方法也产生了数量较大的培养和/或生长的初级细胞，这通过将细胞培养在多层容器或瓶中进行，所述的多层容器或瓶能容纳比单层容器或瓶更多的细胞。本分明也涉及稳定转导的细胞在其它应用中的使用，包括表达由载体携带的核酸或活有机体的治疗。

背景

[0006]Barry，S.C.et al.(2000)“Lentiviral and murine retroviral transduction of Tcells for expression of human CD40 ligand”Human Gene Tlierapy 11：323-332。Costello，E.et al.(2000)“Gene transfer into stimulated and unstimulated T lymphocytesby HIV-1-derived lentiviral vectors”Gene Therapy 7：596-604。Douglas，J.et al.(1999)“Efficient transduction of human lymphocytes and CD34+cells via humanimmunodeficiency virus-based gene transfer vectors”Human Gene Therapy10：935-945。Follenzi、A.et al.(2000)“Gene transfer by lentiviral vectors is limited bynuclear translocation and rescued by HIV-1 pol sequences”Nature Genetics25：217-222。Han，W.et al.(2000)“A soluble form of human Delta-like-1 inhibitsdifferentiation of hematopoietic progenitor cells”Blood 95：1616-1625。Haas，D.L.，et al.(2000)“Critical factors influencing stable transduction of human CD34+cells withHIV-1-derived lentiviral vectors”Molecular Therapy 2：71-80。Hooijberg E.et al.(2000)“NFAT-controlled expression of GFP permits visualization and isolation ofantigen-stimulated primary human T cells”Blood 96：459-466。Kishimoto，T.(ed).Leucocyte Typing VI：White Cell Differentiation Antigens：Proceedings of the SixthInternational Workshop and Conference Held in Kobe，Japan，10-14 November 1996.Garland Publishing，New York，1998。Klebba，C.et al.(2000)“Retrovirally expressedanti-HFV ribozymes confer a selective survival advantage on CD4+T cells in vitro”Gene Therapy 7：408-416。Koc，O.N.，et al.(1999)“Transfer of drug resistance genesinto hematopoietic progenitors”Chapter 11，Gene Therapy of Cancer，Academic Press，San Diego，pp.177-195。Movassagh，M.et al.(2000)“Retroviras-mediated genetransfer into T cells：95％transduction efficiency without further in vitro selection”Human Gene Therapy 11：1189-1200。Onodera，M.et al.(1998)“Successful peripheralT-lymphocyte-directed gene transfer for a subject with severe combined immunedeficiency caused by adenosine deaminase deficiency”Blood 91：30-36.St。Croix，B.，et al.(2000)“Genes expressed in human tumor endothelium”Science 289：1197-1202。Unutmaz，D.et al.(1999)“Cytokine signals are sufficient for HIV-1 infection of restinghuman T lymphocytes”J.Exp.Med.11：1735-1746。Zennou，V.，et al.(2000)“HIV-1genome Nuclear import is mediated by a central DNA flap”Cell 101：173-185。

[0007]“转染”通常指用于将遗传物质转导入细胞的技术，其已经极大地促进生物学中分子和重组变革。与高等真核细胞一同使用的转染技术的实例，包括磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖处理、电穿孔、显微注射、脂转染、病毒感染和在众多科学课本和杂志上发现的其它方法。

[0008]在这些转染技术中，病毒感染的应用是独特的，因为其利用病毒天然发生的将其遗传物质导入细胞的方法，将目的核酸分子转移入细胞。被修饰和运用到该技术的病毒的实例包括腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒和逆转录病毒。一般而言，目的核酸分子可被克隆到病毒染色体组中。复制和包装这些病毒染色体组之后，所形成的病毒颗粒通过病毒进入机制，能将目的核酸输送入细胞。

[0009]通常，在加入目的核酸之前，首先通过核酸操作使病毒基因组成为复制缺陷性的。所形成的病毒染色体组或病毒载体，需要使用辅助病毒或包裹系统来完成病毒颗粒的组装和从细胞的释放。当使用病毒载体或病毒颗粒将目的遗传物质转移入细胞时，该技术被称为“转导”。因此，一般来说，“转导”细胞是使用病毒载体或病毒颗粒将遗传物质转移入细胞。

[0010]在这些转导技术中，逆转录病毒的使用已经成为在哺乳动物细胞遗传修饰中引起极大兴趣的对象。具体的兴趣是使用修饰的逆转录病毒将遗传物质引入细胞，以治疗基因缺陷和其它的疾病。这种方法的实例参见造血系统细胞的情况，其中逆转录病毒和慢病毒载体是广泛研究的对象。

[0011]例如，Movassagh等论述了试图增加逆转录病毒介导的转导的效率的研究，这通过包含活化T细胞的细胞周期的研究结果进行。同样地，他们的结果依赖于转导期间的活化细胞的分裂。该工作也被限定于使用鼠科致癌逆转录病毒并且在转导之前需要对细胞明显的预刺激。

[0012]June等(WO96/34970)描述了使用T细胞刺激作为增加T细胞转染的方法。对于用活化的或刺激的细胞的T细胞转导的其它研究工作，包括Douglas等、Hooijberg等、Onodera等、Klebba等、Barry等和Unutmaz等的那些研究工作。不幸的是，这些研究工作没有一个展示出高于约65％的转导效率。

[0013]Costello等描述了使用人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)慢病毒载体对刺激和未刺激的T细胞的转导。用刺激的初级T细胞，他们仅观察到大约17％的最大效率，用未刺激的T细胞他们观察到小于19％的效率。他们也注意到通过包括存在有HIV-1辅助蛋白，在刺激的T细胞中，增加效率不超过36％的有限能力。

[0014]Chinnasamy等也描述了在未刺激和促分裂原刺激的T细胞中，在HIV-1辅助蛋白存在下，转导效率的增加。像Movassagh等一样，在用慢病毒载体转导以前，Chinnasamy等预刺激血液淋巴细胞一段显著的时期。尽管Chinnasamy等最初在转导后三天观察到大于96％的转导效率，但是在转导后两周稳定转导的细胞的百分数降至71.2％。Haas等也观察到在用慢病毒载体转导的细胞中的瞬时转导和“假转导”，所述慢病毒载体能表达标记基因(绿色荧光蛋白)。甚至转导后第三天，基于标记基因的非完整的表达，在转导的CD34+初级脐带血细胞中检测到相当大的(超过10％)瞬时转导。甚至在转导后的第七天，来自瞬时转导的这类表达仍然保持在大约5％的可检测量。直到在转导后大约10天，源自瞬时转导的表达反映用无标记载体转导的细胞。

[0015]因此，Chinnasamy等不能得到稳定的转导，其中完整形式的病毒载体已被插入转导细胞，初级淋巴细胞的染色体DNA中，两周后效率反映超过了71.2％。这不管是否使用细胞因子预刺激细胞。而且，Chinnasamy描述了用不能表达辅助蛋白(Vif、Vpr、Vpu和Nef)的HIV载体不能明显转导未刺激的淋巴细胞(转导后第14天仅3.6％)，所述HIV载体，尽管后来在转导后使用PHA促分裂原和IL-2细胞因子刺激细胞。尽管使用未刺激的细胞和含有辅助蛋白的载体，结果有些提高，但是没有任何情况下，刺激或未刺激细胞的稳定转导效率在转导后第14天大于75％，不管是否采用使用载体的刺激方法。

[0016]Hass等也观察到使用慢病毒载体的低频率的稳定转导，Hass等使用初级CD34阳性脐带血细胞，在转导后第7天，仅可获得低于25％的最大稳定转导效率。出乎意料地是，甚至在使用极度高的感染复数或载体浓度——例如高达9000的感染复数(MOI)和高达10⁸感染单位/毫升的载体浓度——之后，该25％的转导上限也不能提高。

[0017]Follenzi等也使用非常高的MOI-500，在含有白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-6(IL-6)和干细胞因子(SCF)的三细胞因子混合物的存在下，转导细胞。令人感兴趣的是，该混合物的使用将导致细胞不适于人类临床移植。

[0018]因此，仍需要提供使用载体在高频率下，稳定地转导细胞的更有效的方法。另外，也需要更有效的方法用于转导未刺激的细胞，以用作研究工具和治疗剂。

[0019]另外，仍需要同时转导和培养和/或生长大量的初级细胞，其可用于实验室和/或临床应用。例如，期望从转导得到一“批”细胞，并且不必合并具有不同转导效率的多批细胞，以及将它们施用给对象。

[0020]上述文献的引用并不意欲承认：任意前述文献为相关的现有技术。对这些文献的日期的所有陈述或对这些文献的内容的所有表述是基于申请人可获得的信息，不构成对这些文献日期或内容的正确性的任何承认。

[0021]本文引用的所有的参考文献、出版物、专利申请和专利以其整体引入本文作为参考，无论是否特意引入。

发明的公开内容

[0022]本发明的一方面是用于对造血系统的初级细胞和/或造血干细胞稳定转导的方法，其包括以体外或先体外后体内(离体，ex vivo)的方式将细胞的表面与慢病毒载体和至少一种结合该细胞表面的分子相接触，并且在有益于生长和/或增殖的条件下、在含有两层或多层的通风容器中培养细胞，其中所述容器适于培养至少约100,000,000个细胞。

[0023]本发明的一方面是用于对造血系统的初级细胞和/或造血干细胞稳定转导方法，其包括以体外或离体的方式将细胞的表面与慢病毒载体和至少一种结合到该细胞表面的分子相接触，并且在有益于生长和/或增殖的条件下、在含有两层或多层的通风容器中培养细胞，其中所述容器适于培养至少约100,000,000个细胞，并且其中用具有一定感染复数(MOI)的慢病毒载体转导所述细胞，以便每个转导细胞的慢病毒载体的拷贝为大约0.5到大约10；并且其中将所述细胞与慢病毒载体接触大约24小时，且该接触任选地重复至少一次。

[0024]本发明的一方面是进行造血系统的初级细胞和/或造血干细胞稳定转导的方法，其包括以体外或离体的方式将细胞的表面与慢病毒载体和至少一种结合到该细胞表面的分子相接触，在有益于生长和/或增殖的条件下、在含有两层或多层的通风容器中培养细胞，其中所述容器适于培养至少约100,000,000个细胞；并且其中在大约7到10天后，或者在大约14天后至少约50％的细胞被稳定转导；和任选地在大约14天后至少50％的细胞保持稳定的转导；或者其中在大约7到10天后，或者在大约14天后至少大约75％的细胞被稳定转导，并且任选地至少75％的细胞在大约14天后保持稳定的转导；或者其中80％、85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％以上的细胞在大约14天后被稳定转导；或者其中用感染复数(MOI)为约2到约50、或约10到约30、或从10、或约20、或约30、或约40、或约50、或约1到约400、或500以下的慢病毒载体转导所述细胞；或者其中用具有一定感染复数(MOI)的慢病毒载体转导所述细胞，以便每个转导的细胞的慢病毒载体的拷贝为大约1到大约100；或者其中用具有一定感染复数(MOI)的慢病毒载体转导所述细胞，以便每个转导的细胞的慢病毒载体的拷贝为大约0.5到大约10；或者其中将所述细胞与慢病毒载体接触大约24小时，且该接触任选地重复至少一次；并且其中所述细胞表面分子不诱导凋亡，并且细胞表面结合分子导致细胞更容易接受慢病毒载体的转导。

[0025]初级细胞可以从对象分离或获得。初级细胞可以通过下述的一个或多个步骤进行分离：(a)通过对象血液的血液成分单采术分离；或(b)从对象骨骼的骨髓分离；或(c)通过异源对象血液的血液成分单采术分离；或(d)从异源对象骨骼的骨髓分离。初级细胞也可以使用本领域技术人员已知的其它技术进行分离。

[0026]血液成分单采术是医学技术，其中使捐献者或对象的血液通过这样的仪器，该仪器分离出一种特定组分而将剩余组分返回到循环中。

[0027]取决于要被除去的物质，在血液成分单采术中使用不同的过程。例如，如果需要通过重力分离，离心法将是可选择的方法。可在本发明使用的其它示例性方法涉及吸收在用吸收材料包被的珠子上。

[0028]有许多种血液成分单采术。例如单采血浆术(plasmapheresis)—血浆；单采血小板术(plateletpheresis(thrombapheresis、thrombocytapheresis))—血小板；单采白细胞术—白细胞(leukocyte(白血球))；干细胞收获—收获循环骨髓细胞以用于骨髓移植；以及单采LDL术—在具有家族性高胆固醇血症的对象中去除低密度脂蛋白。这些类型的血液成分单采术仅仅是示例性的。其它类型的单采术可以是本领域技术人员已知的。

[0029]例如可以从全血收集袋中或者从被收集到血袋之前的捐献者血流中，分离血液成分。通过血液成分单采术可从捐献者得到各种类型的血液成分。例如，这包括血小板和血浆。

[0030]例如，当除去的组分引起严重的疾病症状时，可使用各种血液成分单采术。一般而言，血液成分单采术必须被相当频繁地实施，并且其是侵入性方法。因此，当控制特定疾病的其它方法失败时，或者症状是这样的特性时，即等待药物治疗生效的过程中将遭受并发症或面临并发症的危险，通常才使用血液成分单采术。

[0031]可通过本领域技术人员已知的方法获得、贮存和处理骨髓。例如：美国专利第6,991,787号描述了获得骨髓基质细胞的方法；美国专利第6,110,176号描述了收集和贮存遗传相容性骨髓的方法；并且美国专利第4,366,822号描述了用于骨髓细胞分离和分析的方法和仪器。

[0032]可以使用人类免疫缺陷病毒(HIV)感染对象，其中任选的HIV是HIV-1或HIV-2。对象可以患有癌症，其中任选地，癌症为乳腺癌。该对象可以是人或动物。

[0033]在初级细胞与慢病毒载体或细胞表面结合分子接触之前，可以通过将细胞通过密度梯度缓冲液和/或通过磁场免疫纯化(磁细胞分选)，将初级细胞富集。也可在细胞培养和/或生长之前或期间，富集初级细胞。其它已知的富集细胞群落的方法，如本领域技术人员已知的，也可被用于本发明的方法。参见，例如，美国专利第6,974,675，其描述了鉴别和富集细胞特定性靶结构的方法。例如将细胞因子加入到组织培养基中可富集特定的细胞类型。特别是，某些细胞群落将在某些细胞因子存在的培养基中死去。

[0034]初级细胞：(a)在将所述细胞与至少一种细胞表面结合分子接触之前，与所述慢病毒载体的接触发生；或(b)在将所述细胞与至少一种细胞表面结合分子接触的同时，与所述慢病毒载体的接触发生；或(c)在将所述细胞与至少一种细胞表面结合分子接触之后，与所述慢病毒载体的接触发生；或(d)与所述慢病毒载体的接触发生一次以上；或(e)在同时将所述细胞与所述慢病毒载体和所述至少一种表面结合分子接触之后，与所述慢病毒载体的接触继续进行；或(f)在同时将所述细胞与所述慢病毒载体和所述至少一种表面结合分子接触之后，与所述细胞表面结合分子的接触继续进行；或(g)在最初同时将所述细胞与所述慢病毒载体和所述至少一种表面结合分子接触之后，与所述慢病毒载体和所述至少一种细胞表面结合分子继续接触；或(h)其中在大约24-36小时的时间期间，(a)到(g)中的任意接触进行至少一次。

[0035]用至少一种细胞表面结合分子可以预刺激初级细胞，并且任选地用至少一种细胞表面结合分子，在同时将细胞与慢病毒载体和至少一种表面结合分子接触之前的大约24小时内，预刺激细胞，或者任选地用至少一种细胞表面结合分子，在同时将细胞与慢病毒载体和至少一种表面结合分子接触之前的大约12到96小时内，预刺激细胞。

[0036]慢病毒载体可包括至少一种衍生自gag、pol、env、vif、vpr、vpu、tat或rev基因的顺式作用(cis-acting)核苷酸序列，任选地，其中所述序列不被表达或者是gag、pol、env、vif、vpr、vpu、tat或rev基因的片段或突变体。

[0037]慢病毒载体可以是：(a)假型的(假型包装的，pseudotyped)，并且任选地其中假型载体含有疱疹性口炎病毒G包膜蛋白；或者(b)假型的，并且其中所述假型包装(pseudotyping)包括用所述慢病毒载体遗传物质和编码至少一种其它病毒的包膜蛋白或细胞表面分子的遗传物质共转染或共感染包装细胞；或者(c)用弹状病毒(Rhabdovirus)假型包装的，任选地其中弹状病毒是疱疹性口炎病毒G(VSV-G)包膜蛋白。

[0038]初级细胞可以是淋巴细胞、淋巴细胞前体、CD4阳性细胞、CD4阳性细胞的造血干细胞、CD8阳性细胞、CD8阳性细胞的造血干细胞、CD34阳性细胞、CD34阳性细胞的造血干细胞、树突细胞、能分化成树突细胞的细胞、人造血系统的初级细胞和/或人造血干细胞、人造血干细胞的前体、星形胶质细胞、皮肤成纤维细胞、上皮细胞、神经元、树突细胞、白细胞、与免疫应答相关的细胞、血管内皮细胞、肿瘤细胞、肿瘤血管内皮细胞、肝细胞、肺细胞、骨髓细胞、抗原呈递细胞、基质细胞、脂肪细胞、肌细胞、胰腺细胞、肾细胞、卵子、精母细胞、有助于生殖系的细胞、胚胎多能干细胞或祖细胞、血细胞、非成核细胞、血小板细胞或红细胞、或它们的衍生物。

[0039]至少一种细胞表面结合分子：(a)包括多肽、脂类、核酸、碳水化合物或离子；或者(b)包括抗体、抗原结合片段、配体或细胞表面分子；或者(c)包括FLT-3配体、PTO配体或Kit配体、或者作为FLT-3配体、PTO配体或Kit配体的细胞表面结合类似物的多肽或其它结合分子；或者(d)包括CD34、CD3配体、CD28配体、CD25配体、CD71配体、或CD69配体、或具有与CD34、CD3配体、CD25配体、CD28配体、CD69配体、或CD71配体相同的细胞表面结合特异性的多肽或其它结合分子；或者(e)包括组合物，其包含GM-CSF、IL4和TNF-α；GM-CSF和α干扰素；或者作为GM-CSF、IL4和TNF-α的细胞表面结合类似物的多肽或其它结合分子；GM-CSF或α干扰素；或者(f)包含CD3抗体或其细胞表面结合片段、CD28抗体或其细胞表面结合片段、所述抗体或其细胞表面结合片段的组合物以及具有与所述抗体相同的细胞表面结合特异性的结合分子；或者(g)包括固定在珠子或表面的CD3和CD28抗体的组合，其中任选地，珠子或表面包含包被的珠子；或者(h)包括选自任意(a)到(g)的两种或多种细胞表面结合分子；或者(i)包括被用来增加或加强分子结合到细胞表面的能力的另一分子；或者(j)与另一分子复合；或者(k)发现于初级细胞表面上和结合到另一细胞表面。

[0040]细胞培养条件可以包括：(a)用细胞表面结合分子或细胞因子进一步温育；或者(b)用白细胞介素-2进一步温育；或者(c)培养细胞大约7天；或者(d)培养细胞大约14天。

[0041]慢病毒载体可以是：(a)衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)的；或者(b)衍生自HIV-1、HIV-2或它们的组合；或者(c)含有HIV序列的嵌合载体，其中任选地，HIV序列包括HIV-1和HIV-2序列；或者(d)VRX496或者VRX496的衍生物。

[0042]细胞与慢病毒载体或细胞表面结合分子的接触可在混合或纯的细胞培养物、组织或器官系统中以离体的方式进行。

[0043]本发明的另一方面是将遗传物质引入细胞的方法，其包括以离体的方式将通过本文描述的任意方法转导的细胞引入活的对象、组织、器官、胚泡或胚胎干细胞。

[0044]本发明的另一方面是使用通过本文描述的任意方法转导的造血系统的初级细胞或造血干细胞，制造药物组合物。该药物组合物被用于治疗或预防对象内的病毒感染、用于治疗或预防对象内的HIV感染、或者用于治疗或预防癌症。该癌症可以是任意类型的癌症，例如乳腺癌或内皮细胞的任何癌症。

[0045]本发明的另一方面是用于基因治疗的药物组合物——通过本文描述的任意方法产生的，以治疗或预防遗传缺陷引起的异常，或治疗、诊断、缓解或预防肿瘤或癌症，并且任选地，其中所述遗传缺陷引起的异常或肿瘤或癌症是乳腺癌肿瘤。

[0046]本发明的另一方面是用于基因治疗的药物组合物——通过本文描述的任意方法产生的，以治疗或预防感染引起的异常。感染可以是病毒感染，并且任选地，其中所述病毒感染是人免疫缺陷病毒(HIV)感染。配制该药物组合物以进行离体的应用。

[0047]本发明的另一方面是将造血系统的初级细胞和/或造血干细胞稳定转导的方法，其包括以体外或离体的方式将细胞的表面与慢病毒载体和至少一种结合到该细胞表面的分子相接触，并且在含有两层或多层的通风容器中、在有益于生长和/或增殖的条件下培养细胞，其中所述容器适于培养至少约100,000,000个细胞，并且其中将初级细胞与细胞表面分子接触使细胞更易于接受慢病毒载体的转导。

[0048]初级细胞表面上细胞表面分子的存在可以导致：(a)所述细胞染色质更容易接受DNA整合；或者(b)所述慢病毒载体整合入有利于所述慢病毒载体的基因表达的细胞位点；或者(c)含有核酸的壳体更有效地进入所述细胞的胞质中；或者(d)所述病毒更有效地进入通过细胞膜或通过所述细胞的内膜结构；或者(e)所述初级细胞对于包含在所述病毒载体中的遗传物质的核输入更自由。

[0049]细胞表面结合分子、抗体、抗原结合片段、配体或细胞表面分子包括：抗CD3或抗CD28抗体，其结合细胞并且使细胞更易于接受载体转导；FLT-3配体、PTO和Kit配体受体的抗体或配体，其结合细胞并且使细胞更易于接受载体转导；对GM-CSF和IL-4受体的抗体或配体，其结合树突细胞或其前体、单核细胞、CD34阳性干细胞或在树突细胞谱系上的它们的分化的祖细胞，并且使细胞更易于接受载体转导；多肽、核酸、碳水化合物、脂类或离子，或者与其它物质复合的多肽、核酸、碳水化合物、脂类或离子，所述其它物质结合细胞上的CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD2、CD3γ、CD3δ、CDε、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8α、CD8β、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CDw12、CD13、CD14、CD15、CD15s、CD16a、CD16b、CD 18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD45、CD45R、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CDw60、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、CD66f、CD67、CD68、CD69、CDw70、CD71、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CD79cc、CD79(3、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CDw92、CD93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107a、CD107b、CDw108、CDw109、CD114、CD115、CD116、CD117、CD118、CD119、CD120a；CD120b、CD121a、CD121b、CD122、CD123、CDw124、CD125、CD126、CDw127、CDw128a、CDw128b、CDw130、CDw131、CD132、CD133、CD134、CD135、CD136、CDw137、CD138、CD139、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、CD144、CDw145、CD146、CD147、CD148、CDw149、CD150、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156、CD157、CD158a、CD158b、CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD166或TCRζ，并且使细胞更易于接受载体转导。

[0050]本发明的另一方面是将从HIV感染的对象分离的造血系统的初级细胞和/或造血干细胞稳定转导的方法，其包括下列步骤：(a)从HIV感染的对象分离造血系统的初级细胞或造血干细胞；(b)任选地，用至少一种细胞表面结合分子预刺激初级细胞或造血干细胞；(c)同时以体外或离体的方式将造血系统细胞或造血干细胞与慢病毒载体和至少一种细胞表面结合分子相接触；以及(d)在含有两层或多层的通风容器中、在有益于生长和/或增殖的条件下培养细胞，其中所述容器适于培养至少约100,000,000个细胞。

[0051]本发明的另一方面是这样的体系，其包括：(a)含有两层或多层的通风容器；和(b)分离的非粘附的造血系统的初级细胞和/或造血干细胞。该体系的初级细胞可以是上面描述的用于本发明方法的任意细胞。

[0052]多层容器可以是适用于在其中培养和/或生长细胞的任意形状。例如，容器可以是矩形、正方形、或者带有弯曲边缘的矩形或者带有弯曲边缘的正方形。

[0053]在实验室中，广泛使用组织培养瓶或组织培养容器来生长细胞。典型地，使用这些培养瓶在培养基中培养细胞，其中细胞粘附于培养瓶的内表面。通过开口将细胞引入培养瓶或容器。尽管允许通风，但是该培养瓶或容器是封闭的，并且被插入叠加设备(stacking facility)或室例如干热灭菌箱，以促进培养基中细胞的生长。

[0054]造血系统的初级细胞和/或造血干细胞在培养袋或其它单层容器或培养瓶中生长。这样限制了同时生长的细胞的数量。具有平面的多层瓶或容器允许同时培养大量的细胞，但是已经用于粘附于平面的细胞。造血系统的初级细胞和/或造血干细胞是非粘附细胞。然而，这些细胞可以在被允许大量细胞同时生长的多层瓶或容器中生长。多层容器的一个实例是细胞工厂(cell factory)。

[0055]本发明的方法和组合物允许非粘附性的造血系统的初级细胞和/或造血干细胞在多层组织培养瓶或容器中的大规模培养和/或生长，这导致大约至少100,000,000个细胞的生长。

[0056]细胞工厂或细胞工厂的其概念上的变化可被用于例如疫苗、单克隆抗体或药物的大规模生产。它们对于粘附细胞是理想的，但是也可被用于悬浮培养物。细胞生长动力学与实验室规模培养保持不变。可以获得容易进行放大试验的、具有例如1、2、4、10和40个托盘的细胞工厂。它们具有很低的污染危险，并且具有紧凑的设计。

[0057]下列描述的是可用于本发明方法的各种类型的容器的例子。它们仅仅是示例性的，并不意味着对本发明的范围进行限制。

[0058]细胞生长的容器类型的例子在图1示出。容器可以是适用于在其中生长细胞的任意形状，例如方形、矩形、圆形、椭圆形、或者带有特定形状边缘的方形或矩形。容器必需具有一层以上，但是容器可包括多少层的上限仅仅由细胞培养或生长的室、干热灭菌箱或容器的大小所限定。容器可以由例如塑料或任何其它适用于细胞在其中培养和/或生长的材料制成。

[0059]细胞工厂是一堆室密封在一起形成单一设备，它们共有共同的通气孔和填充孔。例如，每个室具有632cm²的平坦生长表面。细胞工厂被用于大规模细胞培养和生物材料的生产，所述的生物材料例如疫苗、单克隆抗体和干扰素。细胞工厂在小面积上提供了大量的生长表面，并且容易操作而且具有低的污染危险。具有25,280cm生长面积的40室设备相当于14个大的滚瓶(每个1,750cm)。与滚瓶需要14步填充和倒空操作相比较，细胞工厂仅需要一步填充和倒空的操作。细胞工厂是无菌的。细胞工厂在有限的面积中提供了大的生长表面。

[0060]细胞工厂的其它方面例如培养基储存器，其由带有通气瓶塞的吸气瓶构成，该瓶容纳细胞悬浮液。使用细胞工厂，放置、培养和收获细胞是本领域已知的。在公开的专利申请20060057713和20060057712、以及美国专利6,114,165中，描述了可用于本发明的培养箱和细胞培养设备类型的变化。

[0061]由于10室和40室细胞工厂的高度，不能通过普通的显微镜观察细胞。最经常地是，将细胞接种在1室或2室的细胞工厂作为对照。在这些产品的每一个中生长的细胞可在显微镜下观察。已经使用在观察一侧具有强光源的倒置立体显微镜，根据细胞工厂的高度进行调整，以观察最初的几层。

[0062]示例性细胞工厂的尺寸和培养面积：

描述	尺寸L×W×H(mm)	培养面积(cm2)
			1-室CF	335×205×37	632
2-室CF	335×205×52	1,264
			10-室CF	335×205×190	6,320
10-室CF	335×205×190	6,320

40-室CF

335×205×700

25,284

[0063]本发明的方法产生新组合物——“一群”或“一批”细胞样品，其具有高的转导水平，并且包括至少大约100,000,000个细胞。

[0064]本发明提供高效方法和与其相关的组合物，用于使用病毒载体和病毒颗粒稳定转导细胞。“稳定转导”，其指已经将整合形式的病毒载体插入到转导的细胞的染色体DNA。该方法包括暴露待转导的细胞，以与至少一种结合细胞表面的分子相接触。该接触步骤可以在细胞暴露于病毒载体或病毒颗粒之前、期间或之后进行。在下文中，术语“病毒载体”被用来指源自病毒的任何形式的核酸，并且被用来将遗传物质经转导转移到细胞内。该术语包括病毒载体核酸例如DNA和RNA、这些核酸的封装形式和在其中已经包裹了病毒载体核酸的病毒颗粒。

[0065]本发明也包括在其它应用中使用转导的细胞，这些应用包括通过表达存在于载体中的核酸产生有用的基因产品和蛋白质，或治疗被疾病折磨的或面临被疾病折磨的危险的活的对象。例如，所述对象是人。

[0066]结合待被转导的细胞表面的至少一种分子，包括与细胞表面上的受体、标记或其它可识别部分物理相互作用的任何分子。原则上，任何细胞表面结合分子可被用以高效转导细胞。本发明没有束缚于理论，细胞表面结合分子可导致宿主细胞染色体更易于进行DNA整合；优选地，将病毒载体整合入有助于载体基因表达的位点；更有效地使含有核酸的壳体进入细胞质；更有效地使病毒跨越细胞膜或内膜结构例如内体而进入；或者使细胞对病毒载体遗传物质的核输入更自由。本发明的方法也涉及一种以上的上述可能性。而且，从上述的可能性的数量和多样性明显看出，本发明不能被任意一种理论所束缚。代替地，考虑到本发明的非凡的发现——在人类治疗中，被处理的细胞具有高达100％的稳定转导，而没有负面影响细胞可能的用途，本发明应该被看作在人细胞治疗领域开辟了新的道路。

[0067]然而，不是所有的表面结合分子将导致通过病毒载体进行的有效和稳定的转导。例如，结合到诱导凋亡的细胞表面分子将不会产生有效的细胞转导，而会引起细胞死亡。尽管细胞死亡对于杀死细胞(例如肿瘤细胞)是优选的，但是它对用含有有效负载基因或核酸序列的载体进行的细胞稳定转导不是优选的。优选的细胞表面结合分子导致细胞更易于接受通过病毒载体进行的转导。这些分子的实例包括特定细胞表面受体的抗体或其部分，以及这种受体的配体或结合结构域。而且，抗体的抗原结合片段例如F_ab和F_v片段，被考虑用于本发明。特定细胞表面受体的结合结构域可包括单个表位或两个或多个表位。

[0068]用于本发明的细胞表面结合分子的实例是抗CD3和抗CD28抗体，它们结合T细胞，并且使该细胞更易于进行载体转导。其它的细胞表面结合分子是FLT-3配体、TPO和Kit配体受体的抗体或配体，其使表达该受体的细胞例如造血干细胞，更易于接受载体转导。另外的细胞表面结合分子是GM-GSF和IL-4受体的抗体或配体，其使树突细胞或其前体例如单核细胞、CD34阳性干细胞或它们在树突细胞谱系上分化的祖细胞，更易于接受载体转导。其它的细胞表面结合分子包括在细胞表面上发现的、结合于另一细胞表面的分子。

[0069]另外的细胞表面结合分子的实例包括多肽、核酸、碳水化合物、脂类和离子，所有它们任选地与其它物质复合。所述分子可结合在血细胞表面发现的因子，例如：CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD2、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8α、CD8β、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CDw12、CD13、CD14、CD15、CD15s、CD16a、CD16b、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD45、CD45R、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CDw60、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、CD66f、CD67、CD68、CD69、CDw70、CD71、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CD79α、CD79β、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CDw92、CD93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107a、CD107b、CDw108、CDw109、CD114、CD115、CD116、CD117、CD118、CD119、CD120a；CD120b、CD121a、CD121b、CD122、CD123、CDw124、CD125、CD126、CDw127、CDw128a、CDw128b、CDw130、CDw131、CD132、CD133、CD134、CD135、CD136、CDw137、CD138、CD139、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、CD144、CDw145、CD146、CD147、CD148、CDw149、CD150、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156、CD157、CD158a、CD158b、CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD166和TCRζ。小写字母(例如“a”或“b”)表示由多种基因产品构成的复合物CD分子或属于的结构相关的蛋白质家族。标志“w”指还没有被完全证实的推定的CD分子。

[0070]可以与在淋巴细胞、T细胞和白细胞表面发现的因子相结合的其它分子，为CD2、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD6、CD7、CD8α、CD8β、CD9、CD11a、CD18、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD37、CD38、CD39、CD43、CD44、CD45R、CD46、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD53、CD54、CD56、CD57、CD58、CD59、CDw60、CD62L、CD68、CD69、CDw70、CD71、CD73、CDw75、CDw76、CD84、CD85、CD86、CD87、CD89、CD90、CD94、CD96、CD97、CD98、CD99、CD100、CD101、CD103、CD107a、CD107b、CDw108、CDw109、CD118、CD119、CD120b、CD121a、CD122、CDw124、CDw127、CDw128a、CDw130、CD132、CD134、CDw137、CD140a、CD140b、CD143、CD146、CD148、CD152、CD153、CD154、CD155、CD161、CD162、CD165、CD166、和TCRζ。

[0071]适用于本发明的、结合到细胞表面的另外的抗体和分子被公开在Linscott′s Directory of Immunological and Biological Reagents，11th Edition，January2000，Publisher：W.D.Linscott，Petaluma，CA，如其全部提出的在此引入作为参考。然而，在本发明的一些实施方式中，细胞表面结合分子不是细胞因子。

[0072]虽然通过使用可溶性细胞表面结合分子——其促进细胞的载体转导，可以实现本发明，但是其它实施方式包括使用固定化的细胞表面结合分子。例如，固定化的分子为抗体。可选地，可通过使用表达细胞表面结合分子的其它细胞进行固定。有效转导造血干细胞的示例性方法是在转导期间包括骨髓基质细胞，所述骨髓基质细胞在其表面上表达配体，所述配体有助于维持干细胞而不进行分化。刺激细胞不限于天然细胞，而是任何细胞可被工程改造以表达适当的细胞表面结合分子，以便为转导提供正确的刺激。

[0073]也可以包括增加或加强至少一种分子结合到细胞表面的能力的其他分子。例如，特定细胞表面受体的可溶形式的(初级)抗体可以与二次抗体结合使用，所述二次抗体可以与已经结合到细胞表面的初级抗体交联。

[0074]当然，任何细胞可被用于实践本发明。例如，待被转导的细胞是真核细胞。例如，细胞是初级细胞。然而，细胞系也可用本发明的方法转导，在许多情况下，细胞系更容易转导。在一种实施方式中，待被转导的细胞是初级淋巴细胞(例如T淋巴细胞)或巨噬细胞(例如单核巨噬细胞)，或是这些细胞的任意一种的前体，例如造血干细胞。用于转导的其它示例性细胞通常是造血系统细胞，更通常地，通过血细胞生成形成的细胞以及形成它们的干细胞，和与血细胞功能相关的细胞。这类细胞包括粒细胞和通过血细胞生成形成的淋巴细胞、以及多能祖细胞、淋巴干细胞和髓样干细胞。与血细胞功能相关的细胞包括帮助免疫系统细胞行使功能的细胞，例如抗原呈递细胞如树突细胞、内皮细胞、单核细胞和朗格汉斯细胞。在一种实施方式中，细胞是T淋巴细胞(或T细胞)，例如表达CD4和CD8标记的那些细胞。

[0075]在另一种实施方式中，细胞是初级CD4+淋巴细胞或初级CD34+造血干细胞。然而，考虑到使用在本发明的病毒载体可以用疱疹性口炎病毒G包膜蛋白假型包装(如下文详述的)，所以任何细胞可利用本发明的方法进行转导。这样的细胞包括但不限于星形胶质细胞、皮肤成纤维细胞、上皮细胞、神经元、树突细胞、淋巴细胞、与免疫应答相关的细胞、血管内皮细胞、肿瘤细胞、肿瘤血管内皮细胞、肝细胞、肺细胞、骨髓细胞、抗原呈递细胞、基质细胞、脂肪细胞、肌细胞、胰腺细胞、肾细胞、卵子或精母细胞(例如产生转基因动物)、形成生殖系的细胞、胚胎多能干细胞或其祖细胞、血细胞包括非成核细胞例如血小板和红细胞、和类似细胞。例如，细胞是真核、多细胞物种(例如，与单细胞的酵母细胞相反)或者是哺乳动物源的细胞，例如人细胞。

[0076]待被转导的细胞可以作为单一实体存在，或者可以是更大的细胞集合的一部分。这类“更大的细胞集合”可包括例如细胞培养物(混合的或者纯的)、组织(例如内皮组织、基质组织或其它组织)、器官(例如心脏、肺、肝、胆囊、膀胱、眼或其它器官)、器官系统(例如循环系统、呼吸系统、消化系统、泌尿系统、神经系统、皮肤系统或其它器官系统)、胚泡、来自胎儿的细胞胚胎干细胞(例如，用于治疗遗传性障碍/疾病或由于产生转基因动物)、疾病组织例如肿瘤或感染位点、或者生物体(例如鸟、哺乳动物、海洋生物、鱼、植物或类似物)。被靶向的器官/组织/细胞可以是循环系统(例如，包括但不限于心脏、血管和血液)、呼吸系统(例如鼻、咽、喉、气管、支气管、细支气管、肺和类似器官)、消化系统(例如，包括嘴和口腔组织、咽、食道、胃、肠、唾液腺、胰、肝、胆囊和类似器官)、乳腺系统(例如该组织中的乳腺上皮细胞和支持细胞)、泌尿系统(例如肾、子宫、膀胱、尿道和类似器官)、神经系统(包括但不限于脑和脊髓、以及特殊感觉器官，例如眼)和皮肤系统(例如，皮肤)。

[0077]待被转导的细胞可选自心脏、血管，包括肿瘤血管和与感染或疾病组织相关的血管、脊髓、血液、脑、淋巴组织、淋巴结、脾、肺、肝、胆囊、膀胱和眼细胞。在本发明的一个具体实施方式中，所述细胞对于意图使用的宿主而言是自体的，但是也可以使用对于宿主而言是同种异型的、部分错配的、完全错配的或甚至异源的细胞。而且，也可转导通用供体细胞，其适合使用于任何给定的宿主生物体，一组相关的生物体或物种，例如人类。本发明的后一种实施方式在细胞、组织或器官的移植中特别重要，其中转导细胞的来源对移植物的结果可能是关键的。

[0078]用于通过本发明的方法转导的其它类型的细胞是肿瘤细胞、患病细胞、或面临随时间变异的风险的细胞，这是由于其遗传构成或存在于同一生物体中的其它细胞的遗传构成引起。后一种实施方式允许本发明的转导细胞用于预防。乳腺癌是这样的疾病过程的一个实例，其中预后指示允许在疾病发生之前，使用本发明的转导细胞作为早期的遗传干扰进行治疗。然而，本发明的方法也可在疾病被检测之后，用于乳腺癌的治疗。本发明在癌症治疗中的其它应用是众多的，本领域技术人员将能使用本文提出的发明进行多种类型癌症的治疗，无需进行过度的试验。

[0079]作为实例而没有对本发明进行限制，一种应用是在雌激素依赖性的乳腺癌中。例如，使用结合雌激素受体的抗体或配体，结合治疗性病毒载体，转导雌激素依赖性乳腺癌的癌细胞。例如，该载体可包括肿瘤抑制基因诸如疱疹病毒胸苷激酶基因。因此，通过加入甘昔洛韦(gancyclovir)，可以将转导的细胞选择性地杀死，甘昔洛韦是可以被疱疹胸苷激酶激活的前体药物。肿瘤抑制基因和相应的前体药物的其它实例是众多的且在本领域是公知的，并可以被技术人员选择，而无需进行过度的试验。与本发明的转导方法的应用相结合，可活化的前体药物的使用可被广泛地运用到其它的肿瘤类型，上述实例没有将本发明限制于激素依赖性的肿瘤或依赖于某些用于生长和繁殖的可溶性因子的肿瘤。

[0080]例如，Her-2/neu阳性肿瘤细胞不是雌激素依赖性的，并且是不良的预后指示，因为含有这类细胞的非雌激素依赖性肿瘤对于使用药物——例如紫杉醇，其为雌激素拮抗剂——进行治疗是高度抗性的。本发明的另一实施方式是，在肿瘤感染的细胞转导期间——例如在骨髓移植方案中，包括将Her-2/neu或调蛋白与病毒载体制剂结合的抗体或其它分子。可选地，可以使用调节肿瘤发生的载体直接对肿瘤部位进行转导，或者在体内血管内进行体内转导。

[0081]本发明又另一种实施方式是单独靶向肿瘤血管系统，或者同时也靶向肿瘤细胞。St Croix等已经通过SAGE分析，鉴定了与正常内皮相比在肿瘤内皮细胞中特异性过表达的基因，该文献如其全部提出在此引入作为参考。这些基因中的许多编码细胞表面分子，例如Thy-1细胞表面抗原或Rndo180凝集素。所有上调的细胞表面因子可以被本发明的细胞表面结合分子所结合，以提供用于有效、稳定基因转导的刺激物。因此，用于肿瘤治疗的方法将破坏肿瘤血管系统，这通过用治疗性病毒载体在细胞表面结合分子存在下转导肿瘤内皮细胞之后，杀死肿瘤内皮细胞而进行，其中所述细胞表面结合分子选择性地结合到肿瘤血管系统而不结合到正常内皮细胞。

[0082]本发明的又另一种实施方式是，通过将各种元件(例如启动子或作用于mRNA的顺式作用稳定/降解元件)整合入病毒载体中，在肿瘤血管系统中选择性表达抗肿瘤基因，其中所述各种元件选择性地促进抗肿瘤基因在肿瘤中表达，但是不会促进抗肿瘤基因在正常血管内皮中的表达。这些方法可以以离体、体外或体内的方式进行。如果靶向肿瘤血管内皮，那么体内方法是用于治疗的一种方法。可选地，例如如果目标是净化含肿瘤细胞的骨髓，以进行骨髓移植，那么用于治疗的方法可以离体或者体外进行。

[0083]而且，体内用途没有被严格限定于疾病状态，并且其可被用来转导正常细胞。例如本发明可被用来以体内的方式在骨髓内转导造血干细胞。当直接注射入骨髓以进行高效骨髓转导，抗体或其它细胞表面结合分子的结合，例如FLT-3配体、TPO和Kit配体、或者其功能类似物、或者表达细胞表面结合分子的基质细胞，可与载体一起加入。术语“功能类似物”指保持本发明的细胞表面结合分子的细胞表面结合活性的任意分子。这类功能类似物包括FLT-3配体、TPO和Kit配体的片段；包含一个或多个氨基酸取代、添加或缺失的FLT-3配体、TPO和Kit配体分子；以及模拟(mimic)细胞表面结合分子的细胞表面结合活性的抗体。

[0084]上述方法的可选方法是使用骨髓基质细胞作为病毒载体的生产者细胞——而不是作为载体制备物，并且因此通过细胞治疗提供载体和细胞表面结合分子。另外的实例是在皮下注入期间，通过分别加入CD3和CD28抗体或GM-CSF和IL-4的功能类似物以及载体，对T细胞或树突细胞进行转导。皮下组织中的淋巴将把载体和刺激物排入(drain)淋巴结，以有效地转导靶细胞。

[0085]本发明包括这样的优点：即任选地，待被转导的细胞的纯化不是必要的。通过选择待被结合的细胞表面部分，可以完成主要目的细胞类型的转导。因此，例如，在混合血细胞群中，当使用CD3特异性抗体与细胞相互作用时，表达CD3的细胞——例如某些T细胞——的转导将被加强。这将比在该群中的其它细胞类型优选发生，例如不表达CD3的粒细胞和单核细胞。

[0086]如果需要，本发明也包括对纯化或分离的细胞类型进行转导。纯化或分离的细胞类型的应用提供了额外的优点，例如更高的转导效率，这是由于相对于待被转导的细胞的更高的载体浓度。

[0087]当转导纯化的T细胞时，至少一分子结合到在T细胞表面发现的细胞表面分子。这类细胞表面结合分子的实例包括CD3、CD28、CD25、CD71和CD69。结合到这些细胞表面分子的分子的实例包括识别它们的抗体和单克隆抗体，它们中的许多是商业上可获得的，或使用标准技术可以容易地常规制备，无需进行过度的试验。在用于CD4+或CD8+细胞转导的示例性实施方式中，使用识别CD3和/或CD28的单克隆抗体。这些抗体商业上可获得的实例包括用于CD3的OKT3和用于CD28的CD28.2。这些抗体分子可以以可溶的形式使用，任选地之后用其它分子进行交联，或者以固定化的形式使用，例如固定在珠或其它的固体表面上。在本发明的一种实施方式中，抗体被固定在容器的表面，所述容器例如用于病毒载体介导的转导的组织培养孔、板、或袋的壁。没有被理论所束缚，在细胞粘附或接触的表面上固定抗体的应用，可增加细胞表面上细胞表面相互作用的局部浓度。

[0088]当造血干细胞被转导时，对FLT-3配体、PTO(血小板生成素或巨核细胞生长和发育因子(Thrombopoietin or Megakaryocyte Growth and DevelopmentFactor))或Kit配体的造血干细胞受体特异性的抗体可被用作细胞表面结合分子。可选地，可以使用干细胞阳性细胞标记的抗体，包括但不限于CD34或AC133。当含有化合物或组合物的配体被用作细胞表面结合分子时，含有天然配体的全蛋白(whole native ligand-containing protein)、配体或与异源蛋白结合的配体可以以可溶的形式或者固定的形式使用。固定的形式包括例如使用抗生物素蛋白/生物素直接或间接粘附到微珠。

[0089]可选地，配体可以在病毒载体的病毒包膜中进行表达，任选地以嵌合蛋白或融合蛋白的形式，和/或与一种或多种其它蛋白质络合(共价或非共价)。在这类实施方式中，细胞表面结合分子与病毒载体结合而呈递，作为用于转导细胞的单一组合物。可以在病毒包膜中表达的细胞表面结合分子的另外的实例包括上面列出的大量表面因子。

[0090]其它的细胞表面结合分子例如抗体或其片段，是与造血干细胞受体Notch或Delta结合的那些，或者Notch或Delta蛋白本身，或者被结合到异源蛋白的Notch或Delta的配体。Delta和Notch编码的细胞表面蛋白在果蝇(Drosophila)发育中影响宽范围的各种各样的细胞命运决定。Delta和Notch的脊椎动物同系物对于正常胚胎发育是必要的。Delta同系物在涉及血细胞生成的调控中是重要的。Delta-Serrate-lag2(DSL)，是可溶形式的同系物，其增强原始造血前体的扩增。当与造血生长因子包括白细胞介素3(IL-3)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)结合时，DSL促进原始造血祖细胞的扩增，并且同时抑制原始前体分化成单独应答于IL-3的更成熟的前体细胞(参见Han等)。DSL最可能通过如下发挥作用：激活在造血细胞中表达的Notch受体，通过选择性地阻断细胞分化信号但不阻断增殖信号，调节对传统造血生长因子应答的细胞竞争力(参见Han和Moore，Blood 1999)。因此，Delta和Notch同系物，作为所述同系物的功能类似物的抗体，是这样的细胞表面结合分子的实例，所述细胞表面结合分子用以达到75％以上效率的细胞的载体转导，特别是对造血干细胞的转导。

[0091]本发明包括用于公开的方法中的病毒载体和包括它们的组合物。病毒可以是逆转录病毒(逆转录病毒科(Retroviridae))载体，例如，慢病毒(lentivirus)载体。也可使用其它的逆转录病毒载体例如肿瘤病毒和鼠科逆转录病毒载体。另外的载体可以源自其它DNA病毒或源自在其生命周期的某些点的期间可将其基因组转化进DNA的病毒。病毒可以是例如源自腺病毒科(Adenoviridae)、细小病毒科(Parvoviridae)、Hepandaviridae(其包括丁型肝炎病毒和在Hepandaviridae中没有正常分类的戊型肝炎病毒)、Papoviridae(其包括多瘤病毒科(polyomavirinae)和乳头瘤病毒科(papillomavirinae))、疱疹病毒科(Herpesviridae)和痘病毒科(Poxviridae)。

[0092]另外的逆转录病毒科的病毒(即逆转录病毒)是下述属或亚科的病毒：肿瘤病毒亚科(Oncovirinae)、泡沫病毒亚科(Spumavirinae)、泡沫病毒属(Spumavirus)、慢病毒亚科(Lentivirinae)和慢病毒属(lentivirus)中的那些病毒。肿瘤病毒科亚科的RNA病毒期望是人嗜T淋巴细胞病毒1型或2型(即HTLV-1或HTLV-2)或牛白血病病毒(BLV)、禽类白血病—肉瘤病毒(avian leukosis-sarcomavirus)(例如劳斯肉瘤病毒(RSV)、禽类原粒细胞增生病毒(AMV)、禽类成红细胞增生病毒(AEV)和劳斯相关病毒(RAV；RAV-0到RAV-50))、哺乳动物C型病毒(例如莫洛尼氏鼠白血病病毒(MuLV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMSV)、埃布尔森鼠白血病病毒(A-MuLV)、AKR-MuLV、猫科白血病病毒(FeLV)、猿肉瘤病毒、网状内皮组织增殖病毒(REV)、脾脏坏死病毒(SNV))、B型病毒(例如鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV))和D型病毒(例如Mason-pfizer猴病毒(MPMV)和“SAIDS”病毒)。

[0093]慢病毒亚科的RNA病毒理想地是人免疫缺陷病毒1型或2型(即，HIV-1或HIV-2，其中HIV-1以前称作淋巴结病相关病毒3(HTLV-III)和获得性免疫缺陷综合征(AIDS)相关病毒(ARV))，或已经鉴定并与AIDS或AIDS样疾病相关的、有关HIV-1或HIV-2的其它病毒。一般而言，首字母缩写“HIV”或术语“AIDS病毒”或“人类免疫缺陷病毒(AIDS病毒)”本文中用于指这些HIV病毒，以及HIV有关和相关病毒。而且，慢病毒亚科中的RNA病毒例如可以是脑膜炎/进行性间质性肺炎病毒(Visna/maedi virus)(例如，如感染绵羊)、猫科免疫缺陷病毒(FIV)、牛慢病毒、猿免疫缺陷病毒(SIV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)或它们的组合。

[0094]示例性的慢病毒载体是衍生自HIV的载体，例如HIV-1、HIV-2或其嵌合组合。当然不同血清型的慢病毒特别是HIV，可被单独或以任何组合使用，以制备用于本发明的载体。例如，本发明的载体可以包含顺式作用元件，其可存在于野生型病毒，但不存在于“基础(basic)”慢病毒。“基础”慢病毒最低限度包含5’前导区的LTR和包裹序列以及gag编码序列，但是也可以任选包括RRE元件，从而以Rev依赖性的方式，帮助载体RNA的核输出。载体可另外包括增强转导入细胞的效率的核苷酸序列。

[0095]这类载体的实例是pN2cGFP，其是含有完整gag和pol序列的载体。另外的实例是含有pol中从大约位置4551到位置5096序列的载体(参考位置源自pNL4-3序列，登记号M19921，HIVNL439709bp，由C.E.Buckler，NIAID，NIH，Bethesda，MD友情提供)。然而，也可使用源自野生型-HIV的任意顺式作用序列，其可以提高载体的转导效率。经由本发明能有效转导的载体的其它实例是如美国专利5,885,806描述的cr2HIV构建物。

[0096]Zennou等(2000)描述的先前鉴定的序列(pLAI3上从位置4793到位置4971的178碱基对片段，相应于pNL4-3上位置4757到4935)——其作为中心DNA瓣(flap)不足以明显增加转导效率，能增加转导效率。本发明包括这样的发现，虽然该小片段不足以增加转导效率，但545碱基对的更大的片段(pNL4-3上位置4551到5906)，或者包含它的更大的片段，能增加转导，这作为本发明的一部分。

[0097]可以在本发明使用的病毒载体构建物的另外的实例见于美国专利5,885,806，该专利通过参考并入本文，如同其被全部阐述。在专利5,885,806中的构建物仅仅作为实例，其不限制有效转导细胞的载体的范围。相反，该构建物对技术人员提供了另外的指导：本发明使用的病毒载体可含有源自野生型病毒的最小序列，或者含有几乎野生型病毒的完整基因组的序列，然而不包括疾病的复制和/或产生所需要的必要的核酸序列。用于精确确定有效转导细胞所需要的序列的方法是本领域常规的并且公知的。例如将病毒序列系统性地整合回“基础”载体，或从实际上含有完整HIV基因组的载体，诸如cr2HIVs缺失序列，是本领域常规的并且公知的。

[0098]而且，将其它病毒骨架的序列置于目的病毒载体，例如巨细胞病毒(CMV)，也是本领域公知的。不管实际使用的病毒载体如何，被病毒遗传物质编码的各种辅助蛋白和病毒遗传物质中存在的序列被留在载体或辅助基因组中，如果这些蛋白或序列增加了某种细胞类型的转导效率。可以利用大量常规筛选，以确定某种遗传物质是否通过将序列引入载体或辅助基因组中增加转导效率。本发明的一种实施方式是在载体或辅助基因组中不包括辅助蛋白。该实施方式不排斥本发明的实施方式，其中辅助蛋白和其它序列被留在载体或辅助基因组中，以增加转导效率。

[0099]在本发明中使用的病毒载体也可以由“假型”形式产生，在其中通过不同病毒对细胞的共感染产生子代病毒体，该子代病毒体含有一种病毒的基因组，该基因组封装在含有一种或多种其它病毒的包膜蛋白的外层内。这种现象已经被用来在“假型”病毒体中包裹目的病毒载体，这通过使用目的病毒载体和编码至少一种其它病毒的包膜蛋白或细胞表面分子的遗传物质，共转染或共感染包装细胞进行。参见美国专利5,512,421。这类混合病毒可以通过针对使用的一种或多种异源包膜蛋白的抗血清进行中和。一种通常以假型形式中使用的病毒是疱疹性口腔炎病毒(VSV)，其是弹性病毒。通过包括使用的异源病毒的病毒进入机制的元件，假型包装的使用加宽了病毒宿主细胞的范围。

[0100]用于本发明的病毒载体和VSV的假型包装产生含有封装在核壳体中的病毒载体核酸的病毒颗粒，所述核壳体被含有VSV G蛋白的膜所包围。该核壳体可包括通常与病毒载体相连的蛋白。含有周围VSV G蛋白的膜，一旦其离开用来包装病毒载体的细胞，则形成病毒颗粒的一部分。包装细胞的实例被描述于美国专利5,739,018。在本发明的另一种实施方式中，病毒颗粒源自HIV并用VSV G蛋白假型包装。含有VSV G蛋白的假型病毒颗粒可以感染不同批(array)的细胞类型，其具有比双嗜性病毒载体更高的效率。宿主细胞的范围包括哺乳动物物种和非哺乳动物物种，例如人、啮齿动物、鱼、两栖类和昆虫。

[0101]用于本发明转导方法的病毒载体也可以包括一种或多种核酸序列，并在病毒中存在的启动子的控制下或在被引入载体的异源启动子的控制下表达所述一种或多种核酸序列。启动子可进一步包括绝缘元件(insulatory element)，例如红细胞DNAse超敏位点，以便和操纵子侧面相接从而严密控制基因表达。启动子的实例包括HIV-LTR、CMV启动子、PGK、U1、Epstein Barr病毒的EBER转录单位、tRNA、U6和U7。当Pol II启动子可用时，Pol III启动子也可以被使用。组织特异性启动子的使用也是一种实施方式。例如，β球蛋白基因座控制区增强子和α&β球蛋白启动子可以提供红细胞和类红细胞中的组织特异性表达。另外的实施方式是使用与启动子相关的顺式作用序列。例如，U1基因可以被用来增强反义基因表达，这里非启动子序列被用来靶向反义或核糖核酸酶分子，以靶向剪接RNA，如在美国专利5,814,500提出的，其在此引入作为参考。

[0102]当然，病毒的任何顺式作用核苷酸序列可被整合入本发明的病毒载体。例如，可以使用发现于逆转录病毒基因组的顺式作用序列。例如，源自gag、pol、env、vif、vpr、vpu、tat或rev基因的顺式作用核苷酸序列可被整合入本发明的病毒载体，以进一步增加转导效率。顺式作用序列不需要编码表达的多肽；不需要作为多肽或其部分进行表达，这是因为遗传改变的缘故，例如转录启始位点的缺失；可仅仅编码较大的多肽的一部分或片段；或者可以是含有对天然序列的一个或多个取代、添加或缺失的突变序列。顺式作用序列的实例是经鉴定在HIV pol基因内的cPPT(中央多聚嘌呤神经束(central polypurine tract))序列。

[0103]本发明病毒载体中的一种或多种核酸序列可以在这样的病毒中发现，即所述载体来源于该病毒或对于该病毒而言是异源序列。它们可以是全长或部分序列，所述部分序列是目的基因产品或编码目的基因产品。该序列和基因产品可以是在细胞中能产生生物效应的生物活性制剂。这类制剂的实例包括蛋白质、核糖核酸、酶、转运蛋白或其它生物活性分子。

[0104]在一种实施方式中，该制剂是蛋白质，例如毒素、转录因子、生长因子或细胞因子、结构蛋白或细胞表面分子。所述蛋白质可含有一种或多种结构域，对所述结构域，其功能还没有被鉴别，并且其可以是与转导的细胞异源的。另外，该蛋白质可以在待被转导的细胞中是不存在的、缺陷的或改变的。可选地，该蛋白质可以是反式显性阴性突变体或诱杀剂，以防止天然蛋白在转导的细胞中施行其正常活性。

[0105]例如，在转导的细胞中核酸序列可以编码核酶，所述核酶结合、切割并且破坏表达的RNA或将要表达的RNA。可选地，核酸序列可以编码设计用来靶向特定核酸序列和导致其降解的反义分子。在转导的细胞中，载体的包含序列可被过表达、诱导表达、或在细胞或病毒调控转录控制下表达。取决于预期的目的，异源序列可编码包括转导细胞标记的任意期望蛋白。这类标记包括可选择的标记，例如特定抗性表型诸如新霉素、MDR-1(P-糖蛋白)、O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(MGMT)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、醛脱氢酶(ALDH)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、超氧物歧化酶(SOD)和胞嘧啶脱酰胺酶。对于综述，参见Koc等，其在此被引入作为参考。

[0106]在本发明的方法中，在病毒载体应用之前、之后或同时，暴露待被转导的细胞以与结合于所述细胞表面的至少一种分子相接触，。例如，在待被转导病毒载体存在之前、存在之后或存在时，细胞可以在带有CD3和CD28抗体的培养基中(包被在培养皿的表面上或固定在存在于培养基中的珠上)被培养。仅在与病毒载体的最初接触之后或仅当与病毒载体最初接触时，可以将细胞暴露于固定的CD3和/或CD28。在这些条件下，在用病毒载体实际转导之前，细胞没有暴露于细胞表面结合分子。在与细胞表面结合分子的接触发生在将细胞暴露于病毒载体(转导)之后的实施方式中，该接触在转导之后3天之内进行，或者可选地在转导之后1到2天内进行。

[0107]细胞与病毒载体的温育或接触可以进行不同长度的时间，这取决于使用的条件和材料。影响温育时间的因素包括细胞、使用的载体和MOI(感染复数)、用于结合细胞表面的分子(一种或多种)和数量、所述的分子是否固定或者溶解以及所述的分子如何固定或者溶解、以及预期的转导效率水平。例如，温育进行大约8到大约72小时，或大约12到大约48小时。在另一种实施方式中，温育或接触进行大约24小时，并且任选地重复一次。在另一种实施方式中，温育或接触进行大约24小时到大约36小时。

[0108]在待被转导的细胞和病毒载体之间的接触可进行至少一次，但是它也可以进行一次以上，这取决于细胞类型。例如，CD34阳性干细胞的高效率转导通过用载体进行多次转导已被实现。本发明的另一方法是同时将病毒载体与细胞表面结合分子(例如CD3和/或CD28抗体或FLT-3配体、TPO或Kit配体)引入，并且避免在转导之后大约一天到大约八天之间更换培养基。可选地，培养基在转导之后三天不进行更换。只要条件允许，转导可持续进行，没有过程明显地对含有它们的细胞或有机体引起损害。用于此类用途的其它细胞表面结合蛋白的实例包括上文描述的那些。

[0109]使用的MOI可以是大约1到大约400，或500以下。MOI可以是大约2到大约50。可选地，MOI可以是大约10到大约30，尽管大约1到大约10、大约20、大约30或大约40也可被考虑。可选地，MOI大约20或大约0.5到10。而且，每个细胞的病毒载体的拷贝数应该至少为1。然而，每个细胞的多个拷贝的载体也可以使用上述方法进行使用。每个细胞的示例性拷贝数为大约1到大约100。预期的拷贝数是提供由载体转导或最有效转导引起的治疗、防治或生物效果的最小拷贝数。

[0110]对于治疗或预防的应用，预期拷贝数为最大拷贝数，其可被细胞所耐受，而没有明显对含有它的细胞或有机体造成损害。每个细胞的最小和最大拷贝数都将依赖于待被转导的细胞以及可能存在的其它细胞而变化。最优的拷贝数容易被本领域技术人员使用常规的方法所确定。例如，在浓度或感染复数不断增加的情况下，转导细胞。然后分析细胞的拷贝数、治疗或生物效果，以及对含有它们的转导细胞或宿主的有害影响(例如安全性和毒性)。

[0111]使用病毒载体体外温育后，细胞可在细胞表面结合分子存在的情况下培养不同的时间，然后分析细胞以确定转导效率或使用细胞。可选地，细胞可在任何导致细胞生长和增值的条件下进行培养，例如用白细胞介素2(IL-2)温育或者在用细胞表面结合分子后用IL-2温育。转导后温育可以进行任何时间，例如从大约1天到大约7天到10天。尽管不期望进行对细胞生长有害的时间，但是也可使用更长的时间例如大约14天。在本发明的实施方式中，在使用病毒载体温育之前，使用细胞表面结合分子培养细胞，培养时间可以在大约24小时到大约72小时的范围，或者大约24小时。

[0112]这样的转导前培养可以与在转导之前例如使用细胞因子和/或促细胞分裂原刺激细胞相比较，如本领域教导。本发明包括用由避免这类刺激产生的优点。例如，刺激通过增殖扩张了细胞数量，而导致了在刺激后比刺激前多许多的细胞。这组扩增的细胞的转导需要多得多的病毒载体和相关的转导材料(例如容器、培养基、细胞因子等)，这增加了相关的成本。而且，细胞的刺激影响其进一步应用的能力。Movassagh等描述了转导前刺激3天的应用，其导致在转导之后和进一步的培养之后所有T细胞多样性的退化。另外，转导之前的刺激去除了从未活跃分裂的细胞的转导可获得的优点。

[0113]用本发明可观察到的转导效率为大约50-100％。例如，效率为至少大约50-75％或大约75-90％。本发明的其它的实施方式是其转导效率为至少约90-100％。例外的实施方式具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％的转导效率。

[0114]除了上述之外，转导的细胞可用以研究或用于在活的对象中治疗或预防疾病病症。研究用途的实例是Unutmaz等描述的结构功能研究。对于转导细胞的治疗应用包括将细胞引入活生物体。例如，从HIV感染的个体或有风险被HIV感染的个体分离的未刺激的初级T细胞，可首先使用本发明方法被载体转导，如在美国专利5,885,806中描述的，然后将转导的细胞注射回个体。可选地，细胞可直接用来表达存在于病毒载体的异源序列。

[0115]当载体被用作HIV治疗或预防的一部分时，其可以编码毒素或其它抗病毒药，其已适用于抗HIV应用。可选地，载体可以编码设计用来靶向HIV的制剂，例如tat、rev、nef、vpu或vpr基因的反式显性阴性突变体。在其它应用中，可以校正转导的细胞以表达恰当的球蛋白基因从而校正镰状细胞贫血症或地中海贫血症。也可转导免疫细胞以调节其免疫功能、其对抗原的应答或其与其它细胞的相互作用。技术人员知晓本转导方法的上述用途以及本领域已知的许多其他用途和应用。

[0116]本发明提供了制造自体T细胞的方法和转导T细胞的方法。使用本发明的方法，当细胞被培养于固体塑料瓶而不是塑料袋时，实现高转导水平。在一方面，为了大规模转导，使用10层细胞工厂。在一方面，载体体积减少2倍对于临床规模的T细胞的有效转导是必须的。在一方面，将载体(用于T细胞转导)以24小时的间隔加入两遍，以进一步增加转导。

[0117]在一方面，将T细胞培养在比常规培养基低的氧浓度和略微低的pH下。本发明发现，T细胞在存在比常规培养基更低的氧浓度和轻微低的pH的情况下，扩增更好。在一方面，与正常空气(大约20％的O₂)相比，N₂/O₂ 90％/10％被用来培养T细胞。在一方面，气体混合物中CO₂的浓度由通常的5％升高到10％，以减低pH。气体混合物中的这种变化允许更高的扩增速率。

[0118]在一方面，在扩增结束时大约100,000,000个细胞，使用培养基灌注。我们发现，为了在扩增结束时具有大约100,000,000个细胞，必须使用培养基灌注。在一方面，使用50L的灌注袋，因为先前使用的20L灌注袋不能支持足够的细胞。在一方面，一旦细胞浓度超过0.5×10⁶细胞/毫升，立刻开始使用大约3L/天的速度灌注。在一方面，速度在第二天增加了大约2倍，同时摇动的速度和角度增加1个单位。

[0119]在一方面，在收获期间T细胞被冷却以增加其在随后的冷冻和解冻之后的生存能力。在一些应用中，这需要进行，因为大量细胞的收获花费很长的时间，且细胞在较低温度中存活的更好。在一方面，细胞被转移到更小的10L袋中，并且被置于冰箱中进行冷却。应该使用冷冻的缓冲液洗涤细胞。

[0120]本发明涉及方法、及其相关组合物，以便使用病毒载体稳定转导细胞的效率为大约75％以上。在转导后大约7到10天之后或任选地大约14天之后，稳定转导的细胞可与瞬时转导或假转导的细胞区分出来。该方法涉及这样的事实：将待转导细胞与至少一个与细胞表面相结合的分子相接触，增加了稳定转导的效率。令人吃惊地，该接触步骤可在转导步骤之后进行。甚至更令人吃惊地，当首先进行转导，然后与固定的细胞表面结合分子接触时，可以见到最高的水平的稳定转导。

[0121]本发明的方法包括用病毒载体转导的步骤联合与细胞表面结合分子接触的步骤。如上面谈到的，接触可在用载体转导之前、之后或同时进行。本发明广泛地用于任何细胞，和使用任意细胞表面结合分子。本发明方法使用的细胞包括未刺激的初级细胞——其是从体内来源新鲜分离出来的，以及细胞系——其可以之前在保持它们处于增殖状态的因子存在的情况下已被培养不同的时间。当使用细胞系时，它们可以首先在刺激因素不存在的情况下被培养，然后用本发明的方法转导。

[0122]在初级细胞的情况下，它们首先从体内来源获得，然后任选地选择特定的细胞类型。例如，如果使用CD4+和/或CD8+初级T细胞，首先得到外周血(PB)或脐带血(来自脐带的“CB”)样品，然后富集CD4+和/或CD8+细胞类型。可以使用标准磁珠阳性选择、塑料粘附阴性选择、和/或其它领域的识别标准技术来从污染的PB细胞中分离CD4+和/或CD8+细胞。可以通过免疫分型和流式细胞计量术使用标准技术，测定分离细胞类型的纯度。

[0123]分离之后，初级细胞可被用于本发明方法，以50％以上或75％以上的效率用病毒载体转导。本发明使用初级淋巴细胞最有优势，例如T细胞，用能表达目的异源遗传物质的基于HIV-1的载体来转导。另一应用使用初级造血干细胞，例如CD34阳性细胞。在异源遗传物质是用于体内治疗或预防疾病的治疗性和预防性产品，或异源遗传物质编码用于体内治疗或预防疾病的治疗性和预防性产品的情况下，转导的初级细胞可被引回体内环境，例如对象。同样地，本发明考虑将转导的细胞用于基因治疗以通过抗击遗传缺陷或靶向病毒感染，来治疗或预防疾病。

[0124]本发明也被考虑用于有效转导细胞，以确定基因的功能、在哺乳动物细胞中有效地表达基因、表达基因文库(cDNA文库和反义基因或核酶文库)以功能性筛选目的基因、用于蛋白-蛋白或蛋白-核酸双杂合样检测策略中、基因捕获方法(gene trapping approach)、使用显微阵列或蛋白阵列的高通量基因筛选分析、或使用SAGE进行研究、蛋白质组学或其它功能性分析方法。

[0125]对于转导混合群中的初级细胞，不使用上述分离/纯化步骤。相反，待被转导的细胞将通过选择至少一种恰当的细胞表面分子或那种细胞类型上发现的部分，以及制备一种或多种能结合到所述的部分的分子，而被靶向。细胞表面部分可以是靶向细胞表面上的受体、标记或其它可识别的表位。一旦被选定，与所述部分相互作用的分子例如特异性抗体，可被制备以用于本发明。

[0126]例如，CD4+和/或CD8+细胞可首先被纯化，然后通过本发明的方法使用固定的CD3和CD28抗体进行转导，或者其可选地作为混合群的一部分——如外周血细胞(PBCs)或外周血单核细胞(PBMNCs)，通过使用相同的抗体进行转导。在全部白细胞群中的造血干细胞——其难以纯化或分离，可在混合群中通过使用固定CD34抗体进行转导。

[0127]本发明的细胞表面结合分子，可靶向并且结合待被转导的细胞表面上发现的任何部分。该部分作为细胞表面上受体、标记、或其它蛋白质或非蛋白质因子的一部分被发现。该部分包括被细胞表面结合分子识别的表位。这些表位包括含有多肽序列、碳水化合物、脂类、核酸、离子和其组合的那些表位。

[0128]细胞表面结合分子的实例包括抗体或其抗原结合片段，以及细胞表面受体的配体或结合结构域。细胞表面结合分子本身可以是多肽、核酸、碳水化合物、脂类或离子。分子可以是抗体或其片段，例如F_ab或F_v片段。可选地，分子不以可溶形式使用，而是固定在固体介质上，例如珠——待被转导的细胞与珠一起培养，或者组织培养皿、袋、板的表面上——在其上待被转导的细胞可被培养。在一种用于CD4+或CD8+细胞转导的实施方式中，识别CD3和/或CD28的单克隆抗体可在病毒载体存在的情况下被用于细胞培养袋中。

[0129]本发明包括含有细胞表面结合分子的组合物，其用作本公开的方法的一部分。示例性组合物包括分子和待被转导的病毒载体，任选地在待被转导的细胞存在的情况下。病毒载体可得自任意来源，例如逆转录病毒载体。例如它们可以是慢病毒载体。示例性慢病毒载体是源自人免疫缺陷病毒(HIV)的载体，例如HIV-1、HIV-2或其嵌合组合。当然，不同的病毒载体可以使用本发明的方法被同时转导入同一细胞。例如，一个载体可以是复制缺陷型或者条件复制型慢病毒载体，而第二个载体可以是包裹构建物，其允许第一个载体被复制/包裹和增殖。当多种病毒辅助蛋白被病毒载体所编码时，它们可存在于被转导入细胞的任一载体中。可选地，通过存在于用来转导的病毒颗粒中，病毒辅助蛋白可以存在于转导过程中。这类病毒颗粒可具有有效量的共包裹的辅助蛋白，以导致转导效率的增加。在一种实施方式中，病毒载体不编码一种或多种辅助蛋白。

[0130]用于本发明转导方法的病毒载体也可在启动子的控制下包括和表达一种或多种核酸序列。在本发明的一种实施方式中，核酸序列编码基因产品，一经表达，其将缓解或校正待被转导的细胞中的遗传缺陷。在另一种实施方式中，核酸序列编码和构成基因抗病毒药，其可预防或治疗病毒感染。就“基因抗病毒药”来说，其指被遗传物质编码或构成的任意物质。这类药的实例被提供在美国专利5,885,806中。它们包括通过下述行使功能的药物：抑制病毒蛋白，例如反转录酶或蛋白酶；与用于结合或靶向于位点的病毒因子竞争；或者直接靶向病毒靶标以进行降解，例如在核酶和反义构建物的情况下。基因抗病毒药的其它实例包括反义、RNA诱杀剂、反式显性突变体、干扰素、毒素、可调控或修饰RNA剪接的核酸、免疫原和核酶，例如“锤头”和其外部指导序列(EGS)介导的形式。

[0131]可选地，病毒载体可编码用于转导的细胞的标记。在附图以及下文提出的实例中，绿色荧光蛋白(GFP)是被转导入CD4+细胞的病毒载体编码的标记。其它标记包括那些上面列出的。GFP的检测可帮助鉴别功能性转导的细胞的数量，其不仅仅被载体转导，而且也能功能性表达GFP达到可以使用FACS分析进行检测的水平。应该注意，检测不可能描述转导的细胞的实际数量，因为一些细胞可以已经被载体转导，但是其表达的GFP在FACS检测中使用的限值以下的水平。

[0132]检测转染效率的另一种方法是使用聚合酶链反应(PCR)。例如，TaqMan PCR可被用来确定转导细胞中的稳定整合的病毒载体的实际拷贝数。

[0133]可以暴露待被转导的细胞以与病毒载体相接触，该接触在其与细胞表面结合分子接触之前、之后或同时。因此细胞可首先暴露于载体一段时间，然后将细胞表面结合分子引入。这类细胞可以是新分离的或制备的初级细胞，其没有被有意刺激进入细胞周期。可选地，细胞可首先暴露于细胞表面结合分子一段时间，然后与病毒载体接触。在与载体接触之后，过量的载体不需要被除去，并且细胞可在益于细胞生长和/或增殖的条件下进行培养。这样的条件可以是存在细胞表面结合分子或其它刺激/活化因子，例如在T细胞的情形下的细胞因子和淋巴因子。可选地，过量的载体可以在与细胞接触之后和进一步培养之前除去。

[0134]本发明的另一种实施方式是在同时存在病毒载体和细胞表面结合分子的情况下，培养细胞。这类细胞不需要预先刺激。在一段时间以后，细胞在生长和增殖诱导条件下进行培养，所述条件例如持续存在细胞表面结合分子或其它刺激/活化因子。可选地，过量的载体可在进一步培养之前除去。

[0135]在病毒载体和细胞表面结合分子给予的任意上述组合中，使用载体的温育可任选地重复至少一次。与载体接触也可重复超过一次，例如两次、三次、四次或更多次。

[0136]使用病毒载体温育待被转导的细胞可以进行不同的时间长度，这取决于使用的条件和材料。影响温育时间的因素包括细胞、使用的载体和MOI(感染复数)、用于结合细胞表面的分子和数量、所述的分子是否固定以及所述的分子如何固定、以及预期的转导效率水平。在本发明的一种实施方式中，细胞是T淋巴细胞，载体基于HIV，MOI是大约20，细胞表面结合分子是固定于珠的CD3和CD28抗体，并且所产生的效率至少93％。如对本领域技术人员明显的，一些上述因素是正相关的，而另一些是反相关的。例如，MOI的降低将可能减低效率水平，而如果使用数量增加的细胞表面结合分子，那么可能保持效率。

[0137]病毒载体和待被转化的细胞的温育长度可能是例如24小时，任选地，对于淋巴细胞重复一次，对于造血干细胞重复高达4次。相似地，在实施方式中，其中在将病毒载体引入之前，用细胞表面结合分子温育细胞，温育可能进行大约12小时到大约96小时。用细胞表面结合分子温育细胞可与用病毒载体接触细胞同时进行。在这样的情况下，当载体被引入时，细胞表面结合分子可留下与细胞接触。可选地，过量的细胞表面结合分子可被首先从培养中出去，然后将载体引入细胞。

[0138]在与载体接触之后，细胞在益于其生长和增殖的条件下进行培养。例如，该条件是在细胞表面结合分子存在的情况下持续培养。可选地，细胞最初用细胞表面结合载体培养，然后用含有其它益于细胞生长的因子——例如白细胞介素2——的培养基取代。又另一种实施方式是除去过量的细胞表面结合分子和过量的载体，然后在益于细胞生长或增殖的因子存在的情况下培养，以及进一步加强载体转导。这样的因子包括促细胞分裂原例如植物血球凝集素(PHA)、以及细胞因子、生长因子、活化剂、细胞表面受体、细胞表面分子、可溶性因子、或其组合、以及这些分子的活性片段，单独或与其它蛋白或因子组合或它们的组合。

[0139]另外的因子的实例包括表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGF-α)、血管紧张素、转化生长因子β(TGF-β)、GDF、骨形态发生蛋白(BMP)、成纤维细胞生长因子(FGF酸性和碱性)、血管内皮生长因子(VEGF)、PIGF、人生长激素(HGH)、牛生长激素(BGH)、调蛋白、双调蛋白、Ach受体诱导活性(ARIA)、PANTES(对活化的调节，正常T表达和分泌)、血管生成素、肝细胞生长因子、肿瘤坏死因子β(TNF-β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、血管生成素1或2、胰岛素、胰岛素生长因子I或II(IGF-1或IGF-2)、肝配蛋白、瘦蛋白、白细胞介素1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15(IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14或IL-15)、G-CSF(粒细胞集落刺激因子)、GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)、M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)、LIF(白血病抑制因子)、制管张素、制癌蛋白、促红细胞生成素(EPO)、α干扰素(包括亚型)、β干扰素、γ干扰素、Ω干扰素、趋化因子、巨噬细胞炎性蛋白1α或β(MIP-1α或β)、单核细胞趋化蛋白1或2(MCP-1或2)、GROβ、MIF(巨噬细胞迁移抑制因子)、MGSA(黑素瘤生长刺激活性)、α抑制素HGF、PD-ECGF、bFGF、淋巴毒素、Mullerian抑制物质、FAS配体、成骨蛋白、多效营养因子/中期因子、睫状神经营养因子、雄激素诱导生长因子、自分泌游动性因子、刺猬蛋白(hedgehog protein)、雌激素、孕酮、雄激素、糖皮质素受体、PAR/RXR、甲状腺受体、TRAP/CD40、EDF(宏细胞分化因子)、Fic(生长因子诱导趋化因子)、IL-1RA、SDF、NGR或RGD配体、NGF、胸腺素α1、OSM、趋化因子受体、干细胞因子(SCF)或它们的组合。对本领域技术人员明显的，培养条件的选择将取决于本领域关于细胞转导的知识以及随后的细胞的预期用途。例如，IL-3、IL-6和干细胞因子的组合，不会是将被使用在人移植中的转导细胞的选择。相似地，培养条件的选择预期不会损伤细胞的生存力和转导效率。

[0140]转导后的温育进行的时间，例如大约4小时、或大约1天到大约7天到10天。转导后温育进行的时期也可以，例如大约16小时到大约20小时，或大约4天、大约5天或大约6天。也考虑转导后大约温育14天。

[0141]观察到的使用本发明的转导效率为大约50-100％。该效率可至少大约50-75％，或者至少约75％到90％。本发明的其它的实施方式是其中转导效率至少约90％到95％。另外的实施方式的转导效率至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和100％。

[0142]除了上述，转导的细胞可用以研究或用于在活的对象中治疗疾病病症。作为本发明的一部分是转导细胞的治疗用途，用于产生目的基因产品或作为基因治疗的一部分被直接引入活生物体。例如如下面示例的，可以分离初级T细胞并且使用病毒载体进行转导。通过载体编码的基因产品的产生或过产生或通过载体赋予的表型的产生，指示了成功的转导。同样地，初级T细胞可首先使用含有和能表达期望的或有用的核酸序列的载体进行转导，然后返回到体内环境例如活的对象。例如，活的对象是HIV-1感染的个体，或者处于被HIV-1感染风险中的个体。

[0143]在另一种实施方式中，用一旦转导入宿主生物体，能有条件地杀死T细胞的基因或核酸转导T细胞。这已被应用到异源骨髓移植中，通过使用前药(pro-drug)处理杀死T细胞来预防移植物抗宿主病。

[0144]可选地，初级细胞可以是基因产物中有缺陷的，并且该缺陷可被转导的病毒载体所校正。这类细胞在用病毒转导后，将被再次引入活的对象。

[0145]因此，本发明的体外和离体的应用都被考虑。对于转移入活的对象，转导的细胞例如，是在生物学可接受的溶液或药学可接受的制剂中。这类转移可通过本领域已知的静脉内注射、腹膜内注射或其它注射和非注射方法进行。待被施用的剂量将依赖于多种因素而变化，但是该剂量是很容易被有技能的实施者所确定。通过在病毒载体中存在的已知的或良好设计的有效负载，本发明具有大量的应用，其中转导的遗传物质赋予的益处将超过任何反面效果的风险。

[0146]最初，转移的转导细胞的全部数量是从大约10⁴到大约10¹⁰。同样地，也可使用10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、或10⁹个细胞。实际的数量将依赖于被转导的细胞而变化。如果需要，将转导的细胞多次转移是另一种实施方式。而且，在将转导的细胞转移之前，如果需要，宿主调理(conditioning)是另一种实施方式。调理方案是本领域已知的；一个实例是用于骨髓移植的方法。

[0147]可在多层容器或瓶中生长的细胞的数量是至少大约100,000,000个细胞，或者至少大约70,000,000个细胞，或者至少大约80,000,000个细胞，或者至少大约90,000,000个细胞。

[0148]本发明提供高效方法和与其相关的组合物，以使用病毒载体和病毒颗粒稳定转导细胞。本发明提供了新型制造设备和制造方法，用于细胞处理转导的细胞，例如慢病毒载体修饰的细胞，诸如自体CD4+T细胞，例如本文描述的示例性的VRX496转导的CD4+T细胞。

[0149]在一方面，本发明用于制造自体T细胞的处理包括，分离淋巴细胞例如通过血液的冷冻单采血液成份术，洗涤例如在下面描述的CytoMate^TM中，然后富集CD4+，接下来耗尽CD8，接下来使用病毒例如慢病毒转导。下面描述了进一步的处理并且在本文附图中进行了阐述。

[0150]在一方面，用于产生自体VRX496转导的CD4+T细胞的起始材料是外周血单核细胞(PBMC)。PBMC是在白细胞单采期间，从HIV感染的对象中获得的。白细胞单采期过程可在血液收集设备中使用自动细胞分离器进行。

[0151]在一方面，洗涤细胞以除去血浆并用CD4微珠(Miltenyi Biotech，Germany)进行磁标记(温育)，CD4微珠已被开发用于基于CD4抗原的表达来分离人细胞。在I期临床研究期间，起始材料通过低速离心进行ficoll密度梯度分离，以去除血浆，然后进行COBE(Baxter)洗涤并且重新悬浮在工作缓冲液中。洗涤的细胞材料然后与CD8高密度微粒(CD8-HDM镍珠)(Biotransport)温育，用于随后使用Eligix磁细胞分离系统(Eligix Magnetic Cell Separation System)进行的磁分离。

[0152]对于II期临床研究，可以使用CYTOMATE^TM细胞处理系统(CellProcessing System)(Miltenyi Biotech，Germany)洗涤细胞以除去血浆。CYTOMATE^TM细胞处理系统是用于洗涤和浓缩细胞产物，以及流体转移应用的独立的、密闭的和自动的仪器。其能有效地洗涤细胞，细胞损失少并且生存力高。该系统的特征是可处理管装置(disposable tube set)，其产生密闭的系统流体途径，以在cGMP环境中处理细胞。该系统也使流体转移灵活、迅速和精确。溶液可转移到和转移自单个或多个容器，所有这些在密闭系统流体途径中。

[0153]在一方面，加入免疫球蛋白溶液(Immune Globubin I1ravenous，USP，Grifols)以预防在添加的CD4+微珠(Miltinyi Biotech)温育期间，非特异性的细胞结合。在一方面，终产物袋(CD4微珠温育的细胞悬浮液)被加热密封，并且该袋被移去，并置于生物安全罩下。

[0154]在一方面，Eligix^TM细胞分离系统被用以耗尽CD8。对于II期临床研究，可通过CliniMACS^TM磁细胞分离系统施行CD4+阳性选择。该系统使用无菌的CliniMACS^TM可处理管装置，该可处理管装置由如下组成：(1)转移包装容器(transferpack container)，(2)血浆转移装置，其具有用于连接缓冲液袋和细胞悬浮液袋的Luer内螺纹接头(female luer adapter)，和(3)血浆转移装置，其具有用于连接阳性选择袋和废物收集袋的Luer内螺纹接头。

[0155]在一方面，向各个袋掺加无菌可处理装置的缓冲液和细胞悬浮液可在生物安全罩下进行，以保持无菌性。一旦掺加磷酸缓冲盐溶液(PBS)缓冲液和细胞悬浮液，可处理装置可连接到CliniMACS^TM，并且CD4磁标记细胞悬浮液可运行穿过CliniMACS^TM。收集到的阳性部分可被用来继续处理。

[0156]在一方面，通过CytoMate^TM可完成PBS与X-VIVO-15(Cambrex；Walkersville，MD)培养基的更换。在一方面，终产物袋被去除、热封闭并且置于生物安全罩下。具有Luer内螺纹接头的Luer内螺纹接头可连接到产物袋，并且通过注射器得到5cc样品，用于进行QC检测，检测：CD3+CD8+细胞和CD3+CD4+细胞的百分比、细胞生存力、细胞数量和预扩增(preexpansion)HIV Gag测量。在一方面，直到得到QC结果，才停止细胞产生。如果细胞遇到特化，那么伴随细胞转导的生产继续进行。

[0157]在一方面，将CD3/CD28共刺激珠(Dynal beads，Oslo，Norway，用抗CD3(OKT3)和抗CD28(Upenn单克隆抗体9.3)包被)加入到CD4+T细胞悬浮液，然后加入VRX496病毒载体产物。在一方面，将CD4+T细胞、X-VIVO+5％人血清白蛋白、IL2、NAC、CD3/CD28微珠和VRX496载体悬浮液(5％W/V)的全部混合物加入到用RetroNectin(Takara Bio，Japan)包被的Nunc^TM细胞工厂，并且将细胞工厂放入潮湿的、37℃、5％CO₂培养箱。第二天，再一次加入VRX496载体悬浮液(5％W/V)。在一方面，使用载体温育细胞三天，然后转移到WAVE^TM细胞袋并置于Wave^TM生物反应器(WAVE^TM Biotech LLC，Bridgewater，NewJersey)。

[0158] WAVE生物反应器具有特定的摇摆平台。该平台的摇摆运动在培养基流体中引起波动。这些波动提供混合和氧转移，从而为细胞生长产生理想的环境，其可很容易地支持超过20×10⁶细胞/毫升。该袋上的管线(tubing lead)和多种连接仪器(通过掺料连接器(spike connector)和Terumo无菌连接仪器(Terumo SterileConnecting Device)产生的焊接，进行连接)允许细胞在密闭的系统中生长，并且其污染的危险最小。

[0159]为了除去载体，在第4天，细胞用X-VIVO 15使用CytoMate^TM细胞洗涤器(cell washer)洗涤两遍。

[0160]培养物被维持7到12天，直到到收获它们的时候。至少每隔一天计算细胞，并且加入新鲜培养基以将细胞保持在大约0.5-1.5×10⁶细胞/毫升的密度。加入抗逆转录病毒药(Norvir，Abbot Laboratories，和Retrovir，GlaxoSmithKline)(1μmol/L)以当细胞培养时，抑制HIV复制。可以使用其它类型的抗逆转录病毒药。本领域技术人员将知道如何选择和施用适当的抗逆转录病毒。在大约第10天，准备收获细胞。扩增后HIV Gag的测量被施行以确保扩增后HIV的拷贝不大于扩增前HIV的拷贝。从收获前的细胞取样进行支原体检测。

[0161]在一方面，通过将培养袋通过MaxSep^TM磁体(Baxter)以除去CD3/CD28微珠。所述珠被保留在磁体上，将细胞倒入另一袋。分析残留珠的细胞。

[0162]除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员所普遍理解的意思相同。本文参考的所有专利、申请、公开的申请和其它出版物，被全部引入作为参考。如果本文阐述的定义与本文引入作为参考的专利、申请、公开的申请和其它出版物阐述的定义相反或不一致，那么本部分阐述的定义胜过被引入本文作为参考的定义。

[0163]本发明的一个或多个实施方式的细节在附图和下文描述中提出。通过阅读说明书和附图以及权利要求，本发明的其它特征、目标和优点将是明显的。

附图简述

[0164]下列附图是对本发明各个方面的阐述，而不打算限定本发明的范围，如权利要求书所包括的。

[0165]专利和申请文件至少含有一张附图，其采用颜色进行。一经要求并支付必须的费用后，本事务所(the Office)将提供带有彩色附图的本专利或专利申请出版物的复印件。

[0166]附图。在各种附图中同样的参考标记指同样的成分。

[0167]图1示出了可用于本发明的方法和系统中的示例性容器或瓶。

[0168]图2A和2B分别示出了pN2cGFP和pN1GFP(cPT)的图谱。各种限制性内切酶位点以及源自HIV的成分被标示出。pN2cGFP构建物包含GFP编码序列，该序列可操作性地连接到CMV(巨细胞病毒)启动子，从而控制GFP表达。pN1GFP(cPT)构建物以下也称为pN1(cpt)CGFP，其包含HIV pol基因的cPPT。这些构建物用于下面描述的实施例中。

[0169]图3示出了使用包被有固定的CD3和CD28抗体的珠转导初级T细胞的结果。所述细胞或者在与所述珠接触之前接触载体(图A)，在与载体接触之前接触所述珠(图板B)，或同时与载体和珠接触(图C)。基于转导的载体编码的GFP的荧光，流式细胞计量的结果显示，在图A-C中细胞分别转导了90.70％、87.19％和79.14％。

[0170]图4示出了通过使用IL-2和PHA-P或珠固定的CD3和CD28抗体在与病毒载体接触之前刺激CD4+细胞进行的转导的比较。固定的抗体的使用导致每次的转导效率超过95％。IL-2和PHA的使用产生的效率仅70.2％到84.5％。

[0171]图5是使用本发明方法转导人CD4+T细胞的频率的描述。转导后15天，对照细胞与用MOI为20、能表达绿色荧光蛋白(GFP)的载体转导的细胞的流式细胞计量术分析比较表明，大约93％的转导细胞也表现绿色荧光。

[0172]图5示出了在使用IL2和PHA-P或珠固定的CD3和CD28抗体转导后第14天，对CD4+和GFP+细胞进行FACS分析的结果。在14天后，大约93％的抗体处理的细胞保持稳定地转导。在那个时间后，仅大约75％用IL-2和PHA处理的细胞保持稳定地转导。

[0173]图6示出了用不同病毒载体转导细胞的结果。

[0174]图7示出了使用不同的MOI对转染效率的影响。

[0175]图8展示了从脐带血制备的CD34+细胞，在存在细胞表面结合分子的情况下用病毒载体多次转导后的稳定转导。在转导后六周，超过88％的细胞保持阳性。

[0176]图9，图A-D示出了在移植到SCID(重度联合免疫缺陷)鼠之后，长时期转导的效率。在大约8周之后，平均超过91％的转导细胞——其继续成熟，对于转导的GFP标记的表达保持阳性。

[0177]图10，图A和B，示出了7天之后转导的树突细胞的效率。

[0178]图11示出了纯化过程和用于从对象血液成分单采术产物分离或富集CD4 T淋巴细胞的相关设备的示意图，所述分离或富集CD4淋巴细胞是通过使用耗尽CD8(CD4富集)或者CD4阳性选择(CD4分离)来完成的。

[0179]图12示出了细胞处理制造和相关的设备的示意图，所述细胞处理制造包括转导、扩增和深低温保藏。在该图使用的产品来自上述图11中描述的最初的分离步骤。

[0180]图13示出了“非扩增”细胞处理步骤和相关设备的示意图。CD4阳性选择在该图中示出，但是CD4阳性选择或通过耗尽非CD4细胞的CD4富集也可使用。“智能载体(灵活载体，smart vector)”指如美国临时第60/585,464号所描述的特异性包裹的慢病毒载体，这因为并入其包膜的蛋白对于结合、刺激和转导细胞具有增强的能力。

[0181]图14示出了用于细胞处理的“非扩增”转导试剂盒和相关设备的示意图。该步骤允许密闭系统分离和转导细胞用于分散分布。该过程不包括扩增步骤。使用Rosette-Sep，施行CD4细胞的富集，这是耗尽非CD4细胞的方法。

[0182]图15示出了“线内(in line)”转导过程的示意图。该过程使用血液成分单采术机械的密闭系统来施行任何纯化(这可以使用或可以不使用)和转导，以直接再次灌输入对象。

[0183]图16A-C示出的流程图描述了血液成分单采术、初级细胞转导和扩增，其然后被重新灌输入对象。另外，细胞处理步骤和相关的质量控制量度也被示出。

[0184]图17示出了示例性慢病毒载体。具体而言，源自野生型HIV的HIV基载体。

[0185]图18示出了几种逆转录病毒载体：VRX496、VRX494、和VRX577。(顶部)该图是pN1cptASenv(VRX496)的示意图，描述了其从之衍生的野生型HIV的元件和区域。在载体上的数字指遗传元件的大小。载体表达被HIV包膜基因(ASenv)靶向的937bp的反义片段。该反义有效负载是Tat和Rev依赖性的，因此仅在HIV感染含有载体的细胞后进行表达。HIV来源的元件包括5’和3’长末端重复序列(LTR)、包裹信号(ψ)、tRNA引物结合位点(PBS)、中央多聚嘌呤神经束和中央终止序列(cPPT&CTS)、剪接受体和供体位点(SA/SD)、Tat依赖性HIV启动子(P)、Gag基因、rev应答元件(RRE)以及3’多聚嘌呤神经束(PPT)。工程改造的元件包括gag中的终止密码。Gtag是GFP的非编码标记序列。

[0186](底部)这是pVRX577(VIRPAC)——辅助包裹构建物——的示意图。VRX496用疱疹性口炎病毒G包膜蛋白(VSV-G)假型包装。Gag和Pol在巨细胞病毒(CMV)启动子的控制下进行表达，Rev在源自HIV-2(RRE-2)的rev应答元件的控制下进行表达，这被用来减少VRX496和VIRPAC之间的同源性，Tat在内部核糖体进入位点(IRES)的控制下进行表达，以及VSV-G由延伸因子1α(EF-1α)/人T细胞嗜淋巴细胞病毒(HTLV)嵌合启动子表达。通过源自烟草花叶环斑病毒(sTobRV+Rz)的几个暂停信号(pause signal)和顺式作用核酶，从其它用于安全性的包裹基因中分离VSV-G，其中所述核酶将切割任意连读RNA。rev和tat基因的序列被部分降解以减少与载体的同源性。

[0187]图19示出了VRX496反义DNA如何整合入对象T细胞的DNA。图19描述了慢病毒载体VRX496和利用其反义有效负载的作用机制。

[0188]图20示出了VRX496如何破坏HIV RNA产生。图20描述了慢病毒载体VRX496和利用其反义有效负载的作用机制。

[0189]图21示出了如何使用VRX496解决HIV抗性的问题。这个图形表示了获得对开发抗HIV药的抗性所需的突变数目与获得对开发抗VRX496药的抗性所需的突变数目之间的比较。HIV或者被反义有效负载所破坏，或者其突变到病毒不适于引起疾病的水平。

[0190]图22示出了使用绿色荧光蛋白标记的病毒载体获得的优异的基因转移效率。图22示出了通过流式细胞计量术，转导入初级T细胞的基因转导水平。

[0191]图23示出了VRX496如何抑制从HIV(+)患者收集的初级淋巴细胞中的野生型HIV的复制。

[0192]图24示出了HIV感染后21天，VRX496转导的细胞对比于未受保护的细胞的存活优势。

[0193]图25示出了使用自体细胞疗法进行HIV治疗的示例性临床过程的综述。图25是VIRxSYS的I期临床试验的示意图。

[0194]图26示出了研究对象的基线特征。

[0195]图27示出了VRX496输注对象的I期临床试验的CD4细胞计数。

[0196]图28示出了VRX496输注对象的I期临床试验的HIV病毒载量。

[0197]图29示出了使用数种逆转录病毒药物：AZT、ddC/S aqinavir、D4T/3Te/Crixivan、Norvir/Amprenivir/ddI/Adefovir、Sustiva/Ziagen/Kaletra/3Te/Viread。图29示出了VIRxSYS I期临床试验的对象2的病毒负载历史。

[0198]图30示出了VRX496修饰的CD4 T细胞持续不变的灌注和保持。图30是线性图，其示出了VRX496载体的持久性，这种持久性在灌注VRX496修饰的CD4+细胞之后20分钟开始评估，然后在72小时、1、2、3和6周以及3、6、9和12月进行评估。PBMC在指出的时间点被收集，并且使用实时PCR施行DNA分析以进行VRX496检测。量化的限值为每10⁶PBMC中100个载体拷贝。已经在9月的时间点没有检测到之后，在一年的时间点，第4号患者具有了0.04％(400拷贝)的移入频率。

[0199]图31示出了免疫功能分析：IFN-g ELISPOT Env。图31是示出了HIV-1env特异性效应细胞INF-γ分泌的条形图。在基线和基因转移治疗后3个月和6个月，获得血液样品。从对象和HIV-1阳性对照对象(n＝25)中，使用标准的Ficoll分离技术分离PBMC。在HIV-1 env体外刺激PBMC之后，对于env抗原特异性应答，通过标准的ELISPOT评估INF-γ的产生。对于对照对象，描绘了均值±95％置信区间。

[0200]图32示出了免疫功能分析：IFN-g ELISPOT-Gag。图32是示出了HIV-1gag特异性效应细胞INF-γ分泌的条形图。在基因转移治疗前和基因转移治疗后3个月和6个月，获得血液样品。从对象和HIV-1阳性对照对象(n＝25)中，使用标准的Ficoll分离技术分离PBMC。在HIV-1 gag体外刺激PBMC之后，对于gag抗原特异性应答，通过标准的ELISPOT评估INF-γ的产生。对于对照对象，描绘了均值±95％置信区间。

[0201]图33示出了增加载体产生的调节和在I期和II期产生期间的产量。

[0202]图34示出了示例性自体T细胞制备过程。图34是临床级、大规模细胞处理的示意图，与图16A、B和C相关。新鲜的或冷冻的血液成分单采术产物可被用于图39描述的过程。

[0203]图35示出了I期CD4+产物纯度与VIRxSYS II期开发过程的对比。

[0204]图36示出了I期VRX496拷贝数与VIRxSYS II期VRX496病毒拷贝数的对比。

[0205]图37示出了I期细胞产物扩增与VIRxSYS II期细胞产物扩增的对比。

[0206]现在，已一般性地描述了本发明，通过参考下面的实施例，本发明将更容易理解，所述实施例以举例的方式提供，并且不意欲限制本发明，除非特别说明。

实施例1

初级CD4+细胞的制备

[0207]使用稍微修改的标准方案，从外周血中分离CD4+T细胞。更具体而言，通过粘着，耗尽污染的单核细胞。未粘附的细胞被置于存在抗CD4抗体包被的磁珠的情况下，进行CD4+细胞的阳性选择。除去磁珠并且分离CD4+细胞。

[0208]用流式细胞计量术证实高度纯化的CD4+细胞为90％以上。

实施例2

与细胞表面结合分子接触不同的时间，进行初级CD4+T细胞的转导

在细胞表面结合前的转导

[0209]用MOI为20的pN2cGFP培养初级CD4+细胞(大约500,000个)24小时，然后将αCD3和αCD28包被的珠加入到培养物中再培养7天。图2含有pN2cGFP的图。

在细胞表面结合后的转导

[0210]用αCD3和αCD28包被的珠培养初级CD4+细胞(大约500,000个)24小时，然后将MOI为20的pN2cGFP加入到培养物中再培养24小时。洗涤细胞以除去过量的载体，然后在含有珠但不含有载体的培养基中另外温育7天。

转导和细胞表面结合同时进行

[0211]在αCD3和αCD28包被珠存在的情况下，用MOI为20的pN2cGFP培养初级CD4+细胞(大约500,000个)24小时。洗涤细胞以除去过量的载体，然后在含有珠但不含有载体的培养基中另外温育7天。

任选的替代方案

[0212]其它病毒载体可替代pN2cGFP。另外，在除去过量载体之前，转导可重复共两次。而且，在转导和除去过量载体之后，可用白细胞介素2(10ng/ml)和PHA-P(3mg/ml)替代αCD3和αCD28包被珠。7天以后，用含有白细胞介素2(10ng/ml)但不含有PHA-P的培养基取代培养基，并且继续温育另外的7天。

[0213]可选地，在用αCD3和αCD28包被珠进行转导后温育7天之后，洗涤细胞并且在存在白细胞介素2(10ng/ml)的情况下继续温育。

实施例3

转导后分析

[0214]转导后，和在温育后7天或14天，通过流式细胞计量术分析细胞，以分析CD4+和/或绿色荧光蛋白(GFP)。

[0215]上述三种转导方案的比较在图3中示出。在用MOI为20的pN2cGFP转导之后，与珠固定的CD3和CH28抗体接触，产生了大约91％的效率。在转导之前与珠接触，产生了大约89％的效率，珠接触和转导同时进行，产生了大约80％的效率。在该实验中，通过耗尽粘附的单核细胞、耗尽CD14 MACS和富集CD4MACS，选择CD4+T细胞。按照下面描述地固定抗体。在37℃、5％CO₂下，与载体接触。培养条件为在补充有2％人血清白蛋白的Yssel培养基中，每毫升500,000个CD4+T细胞。FACS分析在选择后第7天进行。MF指平均荧光。

[0216]7天后对比不同刺激条件的实验结果在图4中示出。使用IL-2和PHA-P或珠固定的CD3和CH28抗体处理CD4+细胞24小时，然后用MOI为20的pN2cGFP进行一轮转导。在并行比较中，固定抗体的使用导致每次超过95％的转导效率(由对CD4和GFP都为阳性的细胞所表明)。作为对比，使用IL-2和PHA刺激的结果，产生仅70.2％到84.5％的效率。FACS分析在选择后第7天进行。

[0217]图5示出了相似实验在选择后15天的结果。用IL-2和PHA-P或者珠固定的CD3和CD28抗体再次处理细胞24小时，然后MOI为20的pN2cGFP进行一轮转导。在转导后第7天除去PHA-P和珠，并且在每毫升500,000个细胞下仅用IL-2培养细胞，直到选择后第15天。在使用固定的抗体后，大约93％的细胞对CD4和GFP都为阳性。用IL-2和PHA处理的细胞仅大约75％保持对CD4和GFP都为阳性。这些结果表示在7天后小部分检测为阳性的细胞(图4)可能是由于“假转染(pseudotransfection)”的缘故。

实施例4

高效率下不同载体稳定转导细胞

[0218]本实施例比较了用于转导的载体。pN2cGFP含有完整的gag和pol编码序列，而pN1(cpt)cGFP含有4551-5096部分(非编码)pol序列。从图6示出的结果可看出，两种载体在用珠固定的CD3和CD28抗体以及MOI为20的载体同时刺激后，都示出了对初级CD4细胞非常有效的转导。在选择后第10天施行FACS分析。

实施例5

MOI对转导效率的影响

[0219]不同MOI的影响在图7示出，其中使用从2到20的MOI导致转导效率为72.7％到83.8％。细胞与珠固定的CD3和CD28抗体接触24小时，然后用不同MOI的pN1(cpt)CGFP进行转导。

实施例6

CD34阳性细胞的转导

[0220]从脐带血制备CD34阳性细胞，并且在存在FLT-3配体、TPO和Kit配体的情况下(每一为100ng/ml)同时用pN1cptGFP转导四次。在长期培养液中(LTC-IC)培养细胞5周，然后在分析之前，在甲基纤维素中培养细胞10天(结果得自培养基中超过六周的消耗时间)。图8中的结果分析了成熟CD45阳性细胞，该阳性细胞由CD34非成熟细胞产生。对照细胞显示没有明显的转导，而载体转导的细胞显示超过88％的细胞为CD45和GFP阳性。

实施例7

CD34阳性细胞的长期转导

[0221]按照上面描述的，用pN1(cpt)GFP转导CD34阳性细胞，并且移植到部分辐射的SCID小鼠的骨髓中。8周以后，分离细胞并且通过FACS分析带有CD45的成熟人细胞和GFP表达。结果在图9的图A到D中表示。

[0222]图A示出了用没有用载体转导的人细胞移植的对照小鼠的结果。

[0223]图B示出了用这样的细胞移植的小鼠的结果，所述细胞在100ng/ml的FLT-3配体、TPO和Kit配体存在的情况下，用MOI为50的pNl(cpt)GFP载体连续转导4天。在转导后8周，该小鼠示出了惊人的96.3％的转导的人细胞(CD45阳性细胞)的转导效率。在小鼠中人细胞移植的水平为11.1％，这与先前报告的结果一致。

[0224]图C和D示出了按照图B处理的其它两只小鼠的结果。结果证明了高效转导的可重复性，并且87.8％和89.6％的CD45阳性细胞也是GFP阳性的。

[0225]平均转导效率为91.2％，这反映了长期稳定转导。

实施例8

细胞表面结合分子的固定

[0226]该实施例描述了将CD3(B-B11)抗体和CD28(B-T3)抗体直接连接到环氧Dynal珠，以用于下面的实施例。

[0227]1.将0.618g硼酸溶于95ml组织培养基级的水中，制备0.1硼酸盐溶液。充分混合并且使用最高质量的NaOH调节pH到9.5。将终体积调整至100ml，并且通过0.2微米滤器除菌。密封容器并储存在4℃。

[0228]2.将浓度150μg/ml的抗体加入到上述硼酸盐溶液。对于B-B11和B-T3抗体，每ml硼酸盐溶液各自加入75μg。调整总体积为1ml。在加入抗体后，硼酸盐浓度不应低于0.05M。对于每1ml的硼酸盐/抗体溶液，各自加入4×10⁸环氧珠。

[0229]3.在旋转轮上37℃下温育24小时。

[0230]4.用珠洗涤培养基在22℃下洗涤珠3次，每次10分钟，所述珠洗涤培养基为：不含钙和镁的磷酸缓冲盐溶液、3％人血清白蛋白、5mM EDTA和0.1叠氮化钠。

[0231]5.在22℃下洗涤珠一次，进行30分钟。

[0232]6.在4℃下洗涤过夜。

[0233]7.用新鲜珠洗涤培养基替换，重新悬浮珠至2×10⁸珠/ml。IgG包被珠在4℃下至少稳定6个月。

实施例9

树突细胞的转导

[0234]分离外周血单核细胞，然后同时使用两种细胞因子条件用MOI为50的pN2cGFP连续转导3天，所述两种细胞因子条件为：GM-CSF(800单位/ml)、IL-4(500单位/ml)和TNF-α(单位/ml)或GM-CSF(500单位/ml)和α干扰素(800单位/ml)。图10中图A示出了转导后七天的结果，其中第一细胞因子条件产生了90.2％的效率。在第二细胞因子条件下，用载体转导细胞七天后示出了92.9％的效率(图B)。对于树突细胞，CD86是唯一可能的标记，并且应注意CD86阴性细胞也可以是树突细胞。

实施例10

制造设备

[0235]该概述提供了描述新的制造设备和制造过程的信息，用于细胞处理慢病毒载体修饰细胞，特别是自体VRX496转导的CD4+T细胞。

[0236]在I期临床研究中，自体VRX496转导的CD4+T细胞在宾夕法尼亚大学(UPenn)细胞和疫苗生产实验室(University of Pennsylvania(UPenn)Cell andVaccine Production Facility)(CVPF)中制备(Levine，et al，2002)。

[0237]对于II期临床研究，制备自体VRX496转导的CD4+T细胞产物。该过程允许慢病毒载体修饰的HIV感染的CD4 T细胞进行超过100倍的空前的扩增。

[0238]该概述提出了：

制造设备的描述，其包括通常的设备设计；

新制造过程的描述，其包括起始材料、过程中和释放物质量控制检测(in-process and release quality control testing)和稳定性，和

表示生产中一致性的数据和与UPenn CVPF过程的比较性数据。

实施例11

通常设备描述

[0239]包括GMP制造区域和质量控制(QC)检测区域，并且使用物理障碍与其它设施区域分开，并且它们之间也分开。制造区域和QC检测区域也是严格限制的并且经卡-钥匙锁控制。

[0240]两个清洁室的意欲用途是用于VRX496慢病毒载体的临床cGMP产生，以及使用该载体对对象细胞进行相应的cGMP离体转导。载体产生清洁室是多产物产生设备，在目前细胞处理清洁室被拟仅用于产生自体VRX496转导的CD4+T细胞。随过程进行发生的适当的变化处于载体产生和对象细胞转导之间。通过条形码系统，在整个过程中对所有对象细胞产物进行追踪(参见下文)。

[0241]为了最小化交叉污染的任何可能性，进行载体产生和细胞处理操作的是不同的人员，并且各个操作区域通过定位被物理上分开。另外，通过书面标准操作程序(SOP)和对这些程序的人员培训，保持控制。

[0242]载体产生清洁室单元(Vector Production Clean Room Suite)和细胞处理清洁室单元(Cell Processing Clean Room Suite)都已被设计用于cGMP产生和生物安全防泄漏系统(biosafety containment)：两个清洁室被设计为大规模的10,000级(ISO Class 7)和生物安全2级水平(BSL-2)。

[0243]清洁室具有独立的空气处理单元(Air Handling Units)(AHU)。载体清洁室AHU是恒定体积的循环单元，包括供应和回流风扇(supply and return fans)；45％初滤器(pre filter)和95％的终滤器；冷却线圈和DX冷凝单元。用于细胞处理清洁室的AHU供应100％的外界空气。清洁室表面(finishes)由光滑、坚硬、可水清洁的并且化学抗性的表面(surface)以及具有完整罩盖的无缝乙烯底面材料的底面所构建。门由具有安全玻璃观察面板(vision panel)的镀锌钢所构建。门上的硬件特征包括脚踢板(kick plate)、门交护板(mop plate)和闭门器(door closure)。

[0244]与在生产区域内的运动相似，在质量控制(QC)实验室之间的运动通过SOP控制。DNA提取实验室(Q2)也与PCR实验室(Q5和Q6)物理分开，以减少污染的风险。

实施例12

制造的细胞产物

[0245]该修改下制造和描述的示例性细胞产物的名称为自体VRX496转导的CD4+T细胞。

[0246]VRX496含有靶向人免疫缺陷病毒(HIV)包膜基因的937个核苷酸的反义序列。

[0247]自体VRX496转导的细胞被等分入灌注袋(每90ml袋中5×10⁹到10¹⁰个转导的细胞)。将细胞悬浮于适于注入的低温培养基中，该培养基由下述组成：

31.25％的Plasmalyte-A，

31.25％的葡萄糖(5％)，

0.45％的氯化钠，

7.5％的二甲基亚砜(DMSO)，

1％的葡聚糖40，和

5％的人血清白蛋白。

实施例13

起始材料

[0248]描述在下表中的是用于产生自体VRX496转导的CD4+T细胞的起始材料的示例性列表。

试剂	用途描述	材料来源(如人/动物源)	试剂品质	供货商
					血清(人)，USP	灌注细胞产物的赋形剂	人	美国药典/美国FDA许可生物制品	Abbott
CD4微珠(人)	纯化-自体T细胞的选择	人源化	临床等级	MiltinyiBiotech
					CD28(9.3)抗体	细胞刺激和扩增	鼠/人杂交瘤	临床等级	宾夕法尼亚大学
CD3/CD8结合的磁珠	细胞刺激和扩增	与Dynal磁微珠结合的鼠/人杂交瘤	临床等级	ViRxSYS
					二甲基亚砜(DMSO)(低温使用Cryoserv)	低温培养基成分-灌注细胞的培养基成分	不可用	临床等级	EdwardsLifesciences
人血清，AB型	细胞生长和扩增	人	临床	ValleyBiomedical
					5％的葡萄糖注射剂中的10％的LMD(用于静脉内施用的小分子量葡聚糖)	低温培养基成分-灌注细胞的培养基成分	不可用	U.S.FDA批准药物	Abbott
5％葡萄糖和0.45％氯化钠注射剂，USP	低温培养基成分-灌注细胞的培养基成分	不可用	U.S.FDA批准药物	Abbott
					5％的免疫球蛋白静脉内注射物(人)	纯化-非特异性阻断剂	人	欧洲药典；临床	Grifols

白细胞介素2(Proleukin)	细胞生长和扩增	人重组体	美国FDA许可生物制品	Chiron
					磁微珠	CD3和CD8纯化抗体的载体	不可用	临床等级	Dynal
(多电解质注射剂，I型，USP)(Plasma-LyteA注射剂，pH7.4)	包含在用于从袋洗涤细胞的灌注液中。被包括用于任何紧急情况	不可用	美国药典/美国FDA许可生物制品	Baxter
					Norvir(利托那韦口服溶液)	细胞培养物中的HIV蛋白酶的抑制剂	不可用	U.S.FDA批准药物	Abbott实验室
Oclone OKT3无菌溶液(muromonrab-CD3)	细胞刺激和扩增	鼠/人杂交瘤	美国FDA许可生物制品	Ortho
					磷酸缓冲盐溶液	细胞的生理试剂	不可用	临床等级	Baxter
重组人纤连蛋白片断(RetroNectin)	转化增强	人	临床等级	Takara Bio
					Retrovir(齐多夫定)IV灌注物	针对细胞培养物中HIV的嘧啶核苷酸类似物	不可用	U.S.FDA批准药物	GlaxoSmithKline
用于注射的水，USP		不可用	U.S.FDA批准药物	Baxter，Hospira Inc.
					X VIVO-15 W/O庆大霉素和酚红w/5％人AB血清	细胞生长和扩增培养基	人	临床等级	Cambrex
VRX496慢病毒载体	基因转移试剂	不可用	临床等级	VIRxSYS

[0249]材料管理人员收到所有起始材料并进行检查。检查包括完成核准的“原材料规格和接收单”。为了符合核准的“原材料规格和接收单”，分派批号，查验包装标签并检查分析证明书(C of A)。

[0250]质量保证(QA)检查由材料管理人员完成的“原材料规格和接收单”，并且同意或拒绝该材料。如果QA“同意”材料，那么表注上“同意(核准)”，并且材料管理人员将材料移到仓库区域内适当的核准材料储存位置。

[0251]如果QA“拒绝”材料，那么表注上“拒绝”，并且与核准的材料分开，直到确定最终的处理，即丢弃、返回供应商或转移到R&D。

[0252]QA将所有材料编入存货清单日志。该日志包括，分配的批号、收到的数量、处理和保质期。在这个存货清单中包括的是内部的制剂(in-house formulation)例如用于生产过程或QC检测过程中的缓冲液。为了材料的管理和/或生产，QA完成在月底过期的材料的月清单，以确保从它们的位置除去它们并避免疏忽使用。

实施例14

生产和常规控制

过程流程图

[0253]所附的是细胞处理纯化图(图11)和制造过程图(图12)。

实施例15

过程描述

细胞收集的方法

[0254]用于产生自体VRX496转导的CD4+T细胞的起始材料是外周血单核细胞(PBMC)。在白细胞提取期间，从HIV感染的对象获得PBMC。使用自动细胞分离器(Cobe Spectra CS-3000，Baxter；Lakewood，CO)，白细胞提取过程在血液收集设备中进行。

[0255]因为在II型临床研究期间，高达八个细胞灌注可被给予对象，其中每个细胞灌注大约5×10⁹到10×10¹⁰的自体VRX496转导的CD4+T细胞，所以大约需要3到4血体积(15L)的血液通过Cobe Spectra进行处理，来收集足够的PBMC(大约10,000,000,000到20,000,000,000)进行细胞洗涤和选择程序(即纯化)，以产生必要数量的CD4 T细胞(即大约1,000,000,000到2,000,000,000)，从而开始细胞转导和扩增过程。单个白细胞提取过程花费大约3个小时来完成。

[0256]相反，在I期临床研究期间，因为每一对象仅接受大约1×10¹⁰自体VRX496转导的CD4+T细胞的单一灌注，所以收集的白细胞提取产物较少，其由在大约70ml中的大约5,000,000,000 PBMC构成。

[0257]白细胞提取产物将在收集的当日在环境温度下从各个的血液中心运输到产物被进一步处理的地方，该运输根据IATA和DOD规定由空运或陆运信使进行。将计划运输时间以确保生产人员收到白细胞提取产物进行处理的时间不迟于收集后24小时。

[0258]因为产物既是自体的又是感染性的，为了确保产物追踪控制并且减少任何产物混乱的可能性，每一白细胞提取袋被标记下列信息：

独特的批号，

包含的细胞体积，

独特的条形码标记，

研究对象ID(其包括研究地点的证明)，

对象的初始情况，和

对象的生日。

[0259]进行另外的预防措施以减少混乱的可能性，其为：

书面程序：在细胞处理清洁室中，在任何指定的时间，仅允许2个独立的细胞产物进行操作，和

产物操作必须涉及生产过程中的不同阶段(例如CD4+T细胞选择、载体去除或细胞收获)。

该方针策略的特例是在温育和储存步骤期间，其中在任何指定的时间，80个单独的产物可以在WAVE^TM生物反应器中进行温育，并且有30个单独的产物储存于冰箱中。

在整个制造过程中细胞产物的追踪在条形码系统的帮助下进行。

实施例16

白细胞提取产物的接收

[0260]一旦，白细胞提取产物被接收在细胞处理设备中，质量保证(QA)在接收室实施条形码扫描，并且确认产品袋标签以及纪录：

接收的总体积，

袋上的批号，

袋被接收的时间，和

从白细胞提取时刻到接收时刻的小时数。

[0261]在QA许可(release)白细胞提取产物后，材料管理人员将其运送到细胞处理清洁室(10,000级)(II级大规模生物安全水平)。生产人员使用注射器提取大约5cc细胞产物样品，并且将其加入到小瓶中，以进行QC检验。QC检验总的CD4+活细胞，其应该≥6×10⁸细胞。

实施例17

血浆洗涤和MACS CD4温育

[0262]洗涤细胞以除去血浆并用CD4微珠(Miltenyi Biotech，Germany)进行磁标记(温育)，其已被发展用于根据CD4抗原表达来分离人细胞。

[0263]在I期临床研究期间，起始材料通过低速离心进行Ficoll密度梯度分离以去除血浆，然后经过COBE(Baxter)洗涤和重新悬浮于工作缓冲液。然后，洗涤的细胞物质与CD8高密度微粒(CD8-HDM镍珠)(Biotransport)一起温育，以随后使用Eligix磁细胞分离系统进行磁分离。

[0264]对于II期临床研究，将使用CYTOMATE细胞处理系统(MiltinyiBiotech，Germany)施行细胞洗涤以去除血浆。该CYTOMATE细胞处理系统是独立的、密闭的和自动化仪器，用于洗涤和浓缩细胞产物，以及流体转移应用。其能有效地洗涤细胞，而细胞损失少并且生存力高。该系统的特征是可处理管装置(disposable tube set)，其产生密闭的系统流体途径，以在cGMP环境中处理细胞。该系统也使流体转移灵活、迅速和精确。溶液可转移到和转移自单个或多个容器，所有这些在密闭系统流体途径中。

[0265]另外，加入免疫球蛋白溶液(Immune Globubin Intravenous，US P，Grifols)以预防在添加的CD4+微珠(Miltinyi Biotech)温育期间，非特异性的细胞结合。

[0266]终产物袋(CD4微珠温育的细胞悬浮液)被加热密封，并且该袋被移去，并置于生物安全罩下。提取大约5cc的QC样品以进行：

细胞浓缩和

FACS分析以确定CD3+CD8+的百分比和CD3+CD4+的百分比。

[0267]直到得到QC结果(大约30分钟)，才停止生产。计算CytoMate终产物体积的量。

实施例18

CD4+选择

[0268]如上面提到的，在I期临床研究期间，Eligix^TM细胞分离系统被用于耗尽CD8。对于II期临床研究，可通过CliniMACS^TM磁细胞分离系统施行CD4+阳性选择。该系统使用无菌的CliniMACS^TM可处理性装置，该可处理装置由如下组成：(1)转移包装容器，(2)血浆转移装置，其具有用于连接缓冲液袋和细胞悬浮液袋的Luer内螺纹接头，和(3)血浆转移装置，其具有用于连接阳性选择袋和废物收集袋的Luer内螺纹接头。

[0269]向各个袋掺加无菌可处理装置缓冲液和细胞悬浮液可在生物安全罩下进行，以保持无菌性。

[0270]一旦掺加磷酸缓冲盐溶液(PBS)缓冲液和细胞悬浮液，处理装置可连接于CliniMACS^TM，并且CD4磁标记细胞悬浮液可运行穿过CliniMACS^TM。收集到的阳性部分可被用来继续处理。

[0271]从在I期临床研究期间的2步过程——即CD8耗尽和CD3选择——改变为在II期临床研究期间的一步过程——即CD4选择——的基本原理，是为了细胞处理的效率并且为了获得更纯的细胞产物。

实施例19

缓冲液与培养基的更换

[0272]通过CytoMate可完成PBS与X-VIVO-15(Cambrex；Walkersville，MD)培养基的更换。终产物袋被移走、热封闭并且置于生物安全罩下。具有Luer内螺纹接头的转移装置可连接于产物袋，并且通过注射器得到5cc样品进行，用于QC检测，其检测：

CD3+CD8+细胞的百分比和CD3+CD4+细胞的百分比，

细胞生存力，

细胞数量，和

预扩增GIV Gag的测量。

[0273]直到得到QC结果，才停止细胞产生。如果细胞遇到特化，那么伴随细胞转导的生产继续进行。

实施例20

CD4+T细胞转导

[0274]将CD3/CD28共刺激珠(Dynal beads，Oslo，Norway，用抗CD3(OKT3)和抗CD28(Upenn单克隆抗体9.3)包被)加入到CD4+T细胞悬浮液，然后加入VRX496病毒载体产物。将CD4+T细胞、X-VIVO+5％人血清白蛋白、IL2、NAC、CD3/CD28微珠和VRX496载体悬浮液(5％W/V)的全部混合物加入到用RetroNectin(Takara Bio，Japan)包被的Nunc^TM细胞工厂，并且将细胞工厂放入潮湿的、37℃、5％CO₂培养箱。第二天，再一次加入VRX496载体悬浮液(5％W/V)。使用载体温育细胞三天，然后转移到WAVE^TM细胞袋并置于Wave^TM生物反应器(WAVE^TM Biotech LLC，Bridgewater，New Jersey)。

[0275]WAVE生物反应器具有特定的摇摆平台。该平台的摇摆运动在培养基流体中引起波动。这些波动提供混合和氧转移，从而为细胞生长产生理想的环境，其可很容易地支持超过20×10⁶细胞/毫升。该袋上的管线(tubing lead)和多种连接仪器(通过掺料连接器(spike connector)和Terumo无菌连接仪器(Terumo SterileConnecting Device)产生的焊接，进行连接)允许细胞在密闭的系统中生长，并且其污染的危险最小。

实施例21

洗涤以除去载体

[0276]在第4天，使用CytoMate^TM细胞洗涤器(cell washer)，细胞用X-VIVO15洗涤两遍。

实施例22

细胞扩增

[0277]培养物被维持7到12天，直到到收获它们的时候。至少每隔一天计算细胞，并且加入新鲜培养基以将细胞保持在大约0.5-1.5×10⁶细胞/毫升的密度。加入抗逆转录病毒药(Norvir，Abbot Laboratories，和Retrovir，GlaxoSmithKline)(1μmol/L)以当细胞培养时，抑制HIV复制。在大约第10天，准备收获细胞。扩增后HIV Gag的测量被施行以确保扩增后HIV的拷贝不大于扩增前HIV的拷贝。从收获前的细胞取样进行支原体检测。

实施例23

洗涤、体积减少和制剂

[0278]将细胞袋装载到CytoMate上，并且将细胞洗出营养培养基并且进入适于注入的低温培养基溶液中，该溶液如下组成：

31.25％的Plasmalyte-A，

31.25％的5％的葡萄糖，

0.45％的氯化钠，

5％的人血清白蛋白(HSA)，

1％的葡聚糖40，和

7.5％的DMSO。

实施例24

CD3/CD28微珠的耗尽

[0279]将培养袋通过MaxSep^TM磁体(Baxter)以除去CD3/CD28微珠。所述珠被保留在磁体上，将细胞倒入另一袋。分析残留珠的细胞。

实施例25

低温保存

[0280]VRX496转导的CD4+T细胞以控制速率的方式进行冷冻。将细胞产物以每分钟1度(1℃)进行冷却，直到产物达到相变点；然后增加冷冻速率，直到温度达到-90℃。

实施例26

质量控制(QC)许可检验(Quality Control(OC)Release Testing)

[0281]对样品进行QC许可检验。细胞产物存于液氮制冷器的气相中(设定点＜-130℃)，直到完成QC检验。

实施例27

质量保证(QA)许可(Quality Assurance(QA)Release)

[0282]在完成QC检验后，QA检查所有的检验结果，如果许可规格已达到，授权许可细胞产物用于临床试验。

实施例28

储存

[0283]QA许可的细胞产物保持在液氮储存中，直到其准备运到临床地点。

实施例29

向临床地点的运送

[0284]细胞产物在液氮气体运输容器(shipper)(Chart Inc.，Marietta，Georgia，formerly MVE Cryogenics)中以≤140℃的温度由合同运输信使(运送者)(CavalierLogistics Management，Inc.，Dulles，Virginia)通过他们自己的运货卡车或商业飞机运往临床地点。这些低温运输容器有效保持它们的货物8天。

实施例30

质量控制(QC)检验

QC过程中检验

[0285]按照下面示出地进行过程中QC检验。在开发阶段，进行这些检验仅为了获得下列信息。

过程步骤	描述	检验目的	检验物品
				2	单采血液成分产物	细胞浓缩	PBMC
％CD4
	％CD8
5		阳性选择CD4+T细胞	细胞浓缩			CD4+T细胞
	％CD4
			％CD8
	生存力
			Pre-HIV gag
	8			细胞扩增	细胞计数		CD4+T细胞

实施例31

QC许可检验

[0286]最终的细胞产物许可检验和规格在分析证明书中示出。在下面示出的过程步骤中和对下面示出的检验物品进行许可检验。

过程步骤	描述	检验目的	检验物品
				4	阳性选择的细胞产物	在步骤10中比较扩增前HIV gag与	转导的细胞

		扩增后gag
				10	收获前细胞产物	支原体	培养物上清液
牛血清白蛋白(BSA)	培养物上清液
		10	收获的细胞产物			微珠去除	转导的细胞
10	收获后细胞产物			Gtag	转导的细胞
		ElA
			扩增后HIV gag
		VSVg RNA		洗涤上清液
			11		低温保存产物	无菌性	转导的细胞
内毒素	转导的细胞
		给药前1天		灌输的细胞产物		生存力	转导的细胞

实施例32

生产过程的资格

在I期和II期之间进行的主要制备变化的总结

[0287]表1表示在I期和II期之间进行的主要制备变化的总结。

表1

在I期和II期之间进行的主要制备变化的总结

制备变化	描述
		初步洗涤单采血液成分细胞产物以去除血浆	从Ficoll洗涤到CytoMate洗涤
CD4纯化过程	从耗尽CD8(Eligx)(CD8抗体结合到镍HDM)变化为选择CD4(Miltinyi)(CD4抗体结合到铁微珠)
		整个过程的细胞洗涤	从使用Cobe(Baxter)洗涤变化为使用Cytomate(Miltinyi)洗涤
CD3/CD28共刺激微珠	目前使用与宾夕法尼亚大学疫苗和细胞生产实验室使用的相同的抗体和珠，通过VIRxSYS进行生产，用于I期临床研究
		转导	在第二天在细胞工厂而不是塑料袋中施行，每一个使用5％的载体悬浮液(W/V)，而不是10％的载体悬浮液(W/V)

细胞扩增	目前用WAVE培养箱温育细胞

实施例33

单采血液成分细胞产物和阳性选择后细胞产物的质量：

I期比II期

[0288]表2提供了I期与II期起始材料(即洗涤后单采血液成分产物)和阳性选择后细胞产物(即用来开始CD4+T细胞转导和细胞扩增的细胞产物)的CD4+T细胞纯度的比较。

[0289]从这些数据可以看出，II期细胞生产过程产生了更纯的CD4+起始材料(平均28.04％CD4对比I期的14.58％CD4)和更纯的CD4+细胞产物来开始VRX496转导和细胞扩增(平均95.60％CD4对比I期的36.82％CD4)。

[0290]另外，数据表明II期生产过程导致阳性选择后细胞产物在纯度上比在I期临床研究中使用的产物更一致(consistent)。这可归功于单CD4+阳性选择步骤，然而，I期过程使用了2步骤过程：  CD8+耗尽和CD3+/CD4+阳性选择。

表2

CD4+T细胞纯度的比较：I期细胞产物对比II期开发批号(Development Lots)

编号#	单采血液成分产物		阳性选择后
					Upenn I期细胞产物	VIRxSYS II期开发批号	Upenn I期细胞产物	VIRxSYS II期开发批号
	洗涤后	CytoMate洗涤和CD4+温育后	COBE洗涤后	CytoMate洗涤后/培养基更换后
					1	11％Abs.6.93×109	38.93％Abs.6.124×109	56％Abs.3.06×109(52％回收)	97.62％CD4+纯度Abs.3.419×109(47.7％回收)
2	15.9％Abs.1.595×109	20.30％Abs.3.00×109	52.2％Abs.4.38×109(48％回收)	97.4％CD4+纯度Abs.1.48×109(40.5％回收)
					3	10.7％Abs.1.015×109	24.9％Abs.3.71×109	23％Abs.1.67×108(26％回收)	91.77％CD4+纯度Abs.2.05×109(48.8％回收)
4	25.9％Abs.2.533×109	没有	33.4％Abs.2.93×108	没有

			(30％回收)
					5	9.4％Abs.7.86×108	没有	19.5％Abs.1.77×108(23％回收)	没有
平均CD4％：	14.58％(范围9.4-25.9％)	28.04％(范围20.3-38.93％)	36.82％(范围19.5-56％)	95.60％(范围91.77-97.62％)

表3

I期和II期过程的比较：CD4+T细胞扩增

标号#	I期细胞过程(临床实验对象批号)		II期细胞过程(开发批号)
					在培养结束时的细胞#(×106个细胞)	扩增倍数	在培养结束时的细胞#(×106个细胞)	扩增倍数
	1	15,811	65	52,296					28.6
2					20,638	40	104,000	58.8
	3	6,785	25	96,646					63.0
4					11,454	32
	5	15,212	66
平均					13,980	58.8	84.314	50.1

实施例34

VRX496转导效率的比较：I期比II期

[0291]表4表示在I期细胞产物和II期开发批次之间的每个细胞的VRX496平均载体拷贝数的对比。可见，平均载体拷贝数在I期基本上保持不变，然而，在II期开发批次中的平均载体拷贝数比在I期中的平均载体拷贝数更一致。

表4

转导效率的比较(每个细胞的平均VRX496载体拷贝)：I期对象的细胞对比

II期过程开发批号

I期细胞产物		II期开发批号
				研究对象ID	最终细胞产物的结果	过程操作编号	最终细胞产物的结果
001-022 J-K	1.20	1	2.80
				001-017 A-J	4.10	2	1.19
001-010 RAG	0.98	3	1.48

0001-001 JFJ	1.80
				001-002 R-B	2.3
平均	2.08		1.82
				范围	0.98到4.10		1.19到2.80

规格＝每个细胞平均0.5到5.0的VRX496拷贝

实施例35

II期开发批次的许可检验结果的总结

[0292]表5呈现了II期开发批号1、2和3的许可检验结果的总结。所有这三个开发批号已经满足批号许可规格。

表5

II期开发批号的许可检验结果的总结

许可检验	规格	开发批号#1	开发批号#2	开发批号#3
					载体拷贝#	0.5-5.0	2.8	1.19	1.48
生存力	≥70％	83.6	73.6	70.5
					VSVg DNA	Mo拷贝	0	0	0
BSA
					ElA
HIV gag
					无菌性
支原体	检测不到	忽略	忽略	忽略
					内毒素	＜3.5EU/ml	0.06	0.06	0.06
残留珠	＜100/3×106细胞	0	0	0
					RCL

实施例36

细胞产物的稳定性

[0293]制备用于I期临床试验的VRX496转导的CD4+T细胞被低温储存，并储藏于≤-80℃，直到计划用于灌输对象。在灌输前一天，细胞产物的调节瓶(sentinelvial)样品被解冻，并且测量细胞生存力，作为细胞产物许可标准的一部分。每一I期制备细胞产物具有≥70％的细胞生存力。≤-80℃储存的最长时期是6个月。这些数据支持了当≤-80℃储存最高达6个月时，自体VRX496转导的细胞产物的稳定性。

[0294]为了评估稳定性，在6个自体VRX496转导的CD4+T细胞批号上，对自体VRX496转导的CD4+T细胞进行24月的稳定性研究。用根据现有的制备计划(即每个载体批号3个VRX496转导的细胞产物批号)制备的两种不同批号的VRX496载体，转导这些批号的细胞。储存条件将是液氮。将在3、6、12、18和24个月时，分析转导的细胞产物样品(15ml)。0时刻的数据是转导的细胞产物批号许可数据。在细胞处理结束时，收集足够的样品(每批号20袋)用来在每一时间点进行分析。分析将包括：外观、Gtag拷贝数、细胞存活、回收、胞内细胞因子染色、无菌性和胞外DNA浓度。在完成每一时间间隔的检验时，撰写中间报告。在研究结束时，撰写最终报告。QA部将负责确保产生的数据的完整性，并且确保符合cGMP。所有得到的原始数据、记录和报告将保存在公司。保持的记录包括储存条件、储存单位的确认和维护、样品制备和原始分析数据。

实施例37

自体细胞产物追踪过程

[0295]4个不同对象的自体CD4+T细胞可被同时处理。为了防止这些细胞产物在该同时制备期间，发生可能的混乱和污染，这4种细胞产品将在生产的不同阶段期间进行处理。目前良好的制备实践描述如下。具有核准的书面细胞处理过程并且所有的生产人员接受这些过程的训练。对于生产批号转变的过程使用专用的生产设备。关键的设备(培养箱、制冷器、HVAC)已被验证。用于处理的水和使用的所有生产材料得自核准的供货商并且依据确定的规格。在整个细胞处理过程中，也已经实行了用于追踪对象细胞产物的下列的具体控制。

实施例38

条形码系统

[0296]定做设计的条形码系统在整个细胞生产和QC检验过程中——即接受、细胞转导、扩增、低温保藏、储存、包装和运输，追踪对象细胞。

[0297]条形码系统提供了审核索引(audit trail)、使用者水平评估和完全报告的可能性。

[0298]在对象细胞产品被处理或检验之前，生产人员扫描被处理或检验的材料和附于批生产记录或质量控制(QC)检验文件的条形码，以进行相同匹配。如果这些不匹配，那么在计算机屏幕上出现警告。然后，扫描材料的个人必须证明，进行了调解并且在批生产记录或质量控制检验文件上签字(首字母缩写)和写下日期。

实施例39

文件

[0299]每一对象细胞产物批号被分配一个不同颜色的文件(即对于分批生产记录或质量控制检验文件具有唯一的颜色)，以在处理过程中视觉上区分对象细胞产物。

实施例40

处理过程中细胞产物的分离和控制(监督，control)

[0300]在任何给定时间，只有一个生产人员被允许处理一个对象细胞产物，并且在可以处理下一对象细胞产物之前，涉及该细胞产物的所有操作必须被终止。

[0301]所有暴露于空气的细胞产物操作在100级生物安全罩下施行。在任意时刻，仅一个来自对象的细胞在该罩下进行操作。

[0302]对象细胞产物被在WAVE^TM袋中温育，并且每一对象细胞产物批号有自己专门的WAVE^TM培养箱。

[0303]原材料例如缓冲液和试剂——其被置于罩内，被专门用于一个对象的细胞产物批号，并且在处理结束时将其丢弃。

实施例41

储存过程中细胞产物的分离和可说明性(accountability)

[0304]在一个时刻，仅一个对象的细胞产物被低温保藏。

[0305]在低温保藏期间，每一个对象的细胞产物袋被保护在金属盒中。在低温保藏之后，这些盒用绳带(cable tie)连接在一起，并被分开储存在制冷器架中。

[0306]所有储存的细胞产物的详细目录被保存在条形码系统并且通过硬拷贝文件保存。

实施例42

目前过程的综述

[0307]用于设备中即将进行的I/II期临床试验的提议的细胞处理过程被总结如下。简言之，单采血液成分产物首先通过使用COBE 2991细胞处理器(GambroBCT)耗尽红细胞(RBC)。然后，所产生的产物与Miltenyi抗CD4 MACS一起温育，并用COBE细胞处理器进行洗涤。抗CD4温育的产物将在CliniMACS仪器上进行处理，为了获得最大产率可运行两次。

[0308]在RetroNectin包被的袋中，在刺激珠存在的情况下，立刻使用载体转导CD4选择的产物。转导将在37℃、5％CO₂的培养箱中，施行3天。转导后细胞将使用Cytomate设备(Baxter Oncology)进行洗涤，然后在Wave生物反应器中扩增8到10天。扩增后，使用Isolex 300i或Maxsep(都是Baxter Oncology)去除刺激珠，细胞培养物的体积将被减少，并且再一次使用Cytomate洗涤细胞，并且制备用于低温保存(制剂)。低温保存将使用Cryo-Med控制速率的制冷器完成，并且将细胞储存在气相液氮MVE罐中。整个过程将花费11到13天。

[0309]如所提出地，目前的细胞处理过程是浪费时间的并且价格昂贵的，但是能很快完成。在该过程中确定的主要成本是抗体选择步骤，而对处理大量对象的主要限制是8到10天的扩增步骤。

[0310]下面提出了一些的替代技术，这些替代技术的目的是简化当前的细胞处理过程，其从最容易实现的开始。

[0311]第一个替代技术涉及扩增步骤的长度，将其从8到10天减少到0天。简言之，3天转导的细胞将被直接处理用于低温保存(耗尽珠、洗涤和制剂)。通过将产物制备的时间从11到13天减少为3天，这将允许在相同的时期内处理更多的产物(4比1)，以及减少相关的扩增成本(Wave生物反应器和培养基)。

[0312]与该第一个替代技术相关的，可以进行有限的纯化步骤或不进行纯化步骤，从而减低了相关的纯化成本。

[0313]第二个替代技术是产生转导试剂盒，其足够简单以在临床地点使用，而无需过多的且耗时的操作步骤。简言之，新鲜的单采血液成分产物与抗体混合物直接进行温育，这些抗体将连接RBC和不必要的细胞，例如CD8+和CD19+淋巴细胞(RosetteSep产物，来自Stemcell Technologies)。使用简捷的、自动的和密闭的Sepax设备(Biosafe)，不需要的细胞将和RBC一起在离心期间沉淀于Ficoll层。用同一设备，收集单核细胞并从Ficoll洗出，并且将其转移到已经含有载体和刺激性的生物可降解的纳米珠的Tefion^袋中。在37℃、5％CO₂培养箱中转导3天，然后再一次使用Sepax设备进行洗涤并且立刻重新注射到对象内。

[0314]第三个替代技术在图15中进行概述。该替代技术仅使用一个处理步骤——血液成分单采术步骤，并且在几个小时内在临床位置进行。简言之，对象进行血液成分单采术步骤，其以与目前和其它提议的替代技术同样的方式进行。通常，将浓缩的白细胞收集到袋中，而RBC和血浆被连续重新灌注回对象。然后，在被重新灌注回对象之前，在收集袋中转导收集的白血细胞。不需要离体的操作。

实施例43

分离

[0315]仅仅进行RBC耗尽是最经济的替代技术；不需要临床级的抗体。RBC耗尽不是耗时的，仅需要一件设备。然而，没有关于CD4含量的控制。

[0316]使用Sepax装置的有限的CD8、CD19耗尽替代技术仅需要一件设备，但是由于耗尽步骤(3)所需要的临床抗体的数量和干细胞技术IP(StemcellTechnologies IP)的许可所需要的临床抗体的数量，其可能更加昂贵。

[0317]当前的分离步骤——CD4阳性选择，需要两件设备和一种临床级抗体(不久商业上可获得)来施行。成本可能与限制的选择相似，但是该步骤耗费更多的时间。然而，CD4的含量得到很好的控制。

[0318]一年前已经证明了，仅进行CD14耗尽、或CD14和CDg耗尽、或CD14耗尽和CD4纯化的细胞具有相似的转导水平，如流式细胞计量仪所分析地。然而，差异在于7天培养期后的扩增水平。

实施例44

扩增(expansion)

[0319]本过程具有8到10天的培养期。

[0320]提议的替代技术将扩增的时间减少到进行转导所需的最少时间。然而，如果有也是很少的数据目前可用于评估3天操作的T细胞的体内扩增潜力。而且，缺少恰当的小型动物模型来评估T细胞重构是主要的限制。

[0321]实现转导的T细胞的体内扩增的一个提议的方式是使用MGMT方法对它们进行选择。Brian Davis等两年前证明了，使用BG/BCNU药物治疗，体外选择5％到超过80％的转导的初级CD4 T细胞是可能的。再一次，缺少恰当的动物模型来评估精确的体内给药剂量是主要的限制。

[0322]另一个选择是用抗CD3抗体预调节对象(体内)，然后重新灌注操作的细胞。在转导的细胞重新灌注之前进行体内T细胞耗尽，可导致T细胞亚型与重新灌注的细胞快速重建。在大型动物模型中的评估或直接在I期临床试验中的评估似乎是最适当的进行方式。

实施例45

刺激

[0323]当前的刺激过程使用包被到Dynal环氧珠的抗人CD3和抗人CD28鼠抗体。CD3/CD28刺激是细胞转导方案的特征。

[0324]四种替代的实施方式被描述如下：

[0325]使用连接到可降解纳米珠的CD3和CD28抗体。该方法将不会减少相关的抗体刺激成本，但是将减少产物操作(不去处珠)。

[0326]使用超拮抗剂抗人CD28。已经显示该抗体有效地刺激T细胞的扩增，而不需要抗CD3抗体。

[0327]使用载体本身作为T细胞刺激性蛋白载体。该方法不需要抗体生产，但是需要对包装细胞系进行修饰。

[0328]使用干细胞技术(Stemcell Technologies)开发的四连接系统(Tetralink system)。该系统避免了对珠载体(支持物)的需要，因此避免了珠耗尽步骤。该系统需要使用鼠IgG1单克隆抗体发挥功能。

实施例46

试剂盒

[0329]本发明的一种实施方式是试剂盒，其包括使用不含生物可降解的纳米珠的刺激系统由修饰的包装细胞系产生的临床级载体，以及大型动物模型进行3天培养期和体内T细胞重建的安全性/功效。

[0330]充分描述了本发明之后，本领域技术人员将理解，在不进行过度的试验和不背离本发明的精神和范围的情况下，可以在宽范围的等同参数、浓度和条件下进行相同的操作。

[0331]可以对上述进行修改，而不背离本发明的基本方面。虽然通过参考一个或多个具体实施方式本发明已被相当详实地描述，但是本领域普通技术人员将认识到，可以对本申请具体公开的实施方式进行改变，而这些改变和改善在本发明的范围和精神内。本文中阐述性描述的发明适当地可在没有具体公开的任意成分不存在的情况下进行。因此，例如在本文的每一个实例中，术语“包括”、“基本上由......组成”和“由......组成”中的任何一个可用其它两个术语中的任意一个替换。因此，已被使用的术语和表达被用作描述性术语，而不是限制性术语，显示和描述的特征的等价物或其部分也不被排除，并认识到各种修改可能在本发明的范围内的。本发明的各种实施方式在下列的权利要求中被提出。

[0332]上文和下面的权利要求中，术语“一(一个，a)”或“一(一个，an)”的使用不限定为单数状态。相反，该术语的使用包括复数状态。例如，术语“一种抗体(an antibody)”不是限定为一种单一抗体分子的单数状态，相反包扩存在抗体分子的复数，只要它们是所涉及抗体的相同拷贝。相似地，“一病毒载体”不限定为一种单一的病毒载体分子或一种单一的病毒颗粒。术语“或(or)”不拟指单独的一种或术语所指定的。例如，如被使用在结构“A或B”的短语中，“A或B”可以指单独的A、单独的B或既有A又有B。

Claims (37)

1.一种用于造血系统的初级细胞和/或造血干细胞稳定转导的方法，其包括以体外或离体的方式将所述细胞的表面与慢病毒载体和至少一种结合所述细胞表面的分子相接触，并且在有益于生长和/或增殖的条件下、在含有两层或多层的通风容器中培养所述细胞，其中所述容器适于培养至少约100,000,000个细胞。

2.一种用于造血系统的初级细胞和/或造血干细胞稳定转导的方法，其包括以体外或离体的方式将所述细胞的表面与慢病毒载体和至少一种结合所述细胞表面的分子相接触，并且在有益于生长和/或增殖的条件下、在含有两层或多层的通风容器中培养所述细胞，其中所述容器适于培养至少约100,000,000个细胞；和

其中用具有一定感染复数(MOI)的所述慢病毒载体转导所述细胞，以便每个转导的细胞的慢病毒载体的拷贝为大约0.5到大约10；和

其中将所述细胞与慢病毒载体接触大约24小时，且该接触任选地重复至少一次。

3.一种用于造血系统的初级细胞和/或造血干细胞稳定转导的方法，其包括以体外或离体的方式将所述细胞的表面与慢病毒载体和至少一种结合所述细胞表面的分子相接触，并且在有益于生长和/或增殖的条件下、在含有两层或多层的通风容器中培养所述细胞，其中所述容器适于培养至少约100,000,000个细胞；和

其中在大约7到10天后，或者在大约第14天时，至少约50％的所述细胞被稳定转导；和任选地，在大约14天后，至少50％的所述细胞保持稳定的转导；或者

其中在大约7到10天后，或者在大约第14天时，至少大约75％的所述细胞被稳定转导；并且任选地，在大约14天后，至少75％的所述细胞保持稳定的转导；或者

其中在大约14天后，80％、85％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％以上的所述细胞被稳定转导；或者

其中用感染复数(MOI)为约2到约50、或约10到约30、或从10、或约20、或约30、或约40、或约50、或从约1到约400或500以下的所述慢病毒载体转导所述细胞；或者

其中用具有一定感染复数(MOI)的所述慢病毒载体转导所述细胞，以便每个转导的细胞的慢病毒载体的拷贝为大约1到大约100；或者

其中用具有一定感染复数(MOI)的所述慢病毒载体转导所述细胞，以便每个转导的细胞的慢病毒载体的拷贝为大约0.5到大约10；或者

其中将所述细胞与慢病毒载体接触大约24小时，且该接触任选地重复至少一次；和

其中所述细胞表面分子不诱导凋亡，并且所述细胞表面结合分子导致所述细胞更容易接受病毒慢病毒载体的转导。

4.权利要求1所述的方法，其中所述初级细胞分离自或源自对象。

5.权利要求4所述的方法，其中所述初级细胞通过下述的一个或多个步骤进行分离：

(a)通过对象血液的血液成分单采术分离；或

(b)从对象骨骼的骨髓分离；或

(c)通过异源对象血液的血液成分单采术分离；或

(d)从异源对象骨骼的骨髓分离。

6.权利要求4所述的方法，其中所述对象被人免疫缺陷病毒(HIV)所感染，其中任选地，所述HIV是HIV-1或HIV-2。

7.权利要求4所述的方法，其中所述对象患有癌症，其中任选地，所述癌症是乳腺癌。

8.权利要求4所述的方法，其中所述对象是人或动物。

9.权利要求1所述的方法，其中在与所述慢病毒载体或细胞表面结合分子接触之前，所述初级细胞可以通过将所述细胞通过密度梯度缓冲液和/或通过在磁场上免疫纯化进行富集。

10.权利要求1所述的方法，其中所述初级细胞：

(a)在将所述细胞与至少一种细胞表面结合分子接触之前，与所述慢病毒载体的接触发生；或

(b)在将所述细胞与至少一种细胞表面结合分子接触的同时，与所述慢病毒载体的接触发生；或

(c)在将所述细胞与至少一种细胞表面结合分子接触之后，与所述慢病毒载体的接触发生；或

(d)与所述慢病毒载体的接触发生一次以上；或

(e)在同时将所述细胞与所述慢病毒载体和所述至少一种表面结合分子接触之后，与所述慢病毒载体的接触继续进行；或

(f)在同时将所述细胞与所述慢病毒载体和所述至少一种表面结合分子接触之后，与所述细胞表面结合分子的接触继续进行；或

(g)在最初同时将所述细胞与所述慢病毒载体和所述至少一种表面结合分子接触之后，与所述慢病毒载体和所述至少一种细胞表面结合分子继续接触；或

(h)其中在大约24-36小时的时间期间，(a)到(g)中的任意接触进行至少一次。

11.权利要求1所述的方法，其中所述初级细胞被用至少一种细胞表面结合分子预刺激，并且任选地在同时将所述细胞与所述慢病毒载体和所述至少一种细胞表面结合分子接触之前的大约24小时内，所述细胞用所述至少一种细胞表面结合分子预刺激，或者和任选地在同时将所述细胞与所述慢病毒载体和所述至少一种细胞表面结合分子接触之前的大约12到96小时内，所述细胞用所述至少一种细胞表面结合分子预刺激。

12.权利要求1所述的方法，其中所述慢病毒载体包含至少一种衍生自gag、pol、env、vif、vpr、vpu、tat或rev基因的顺式作用核苷酸序列，并且任选地，其中所述序列不被表达或者是gag、pol、env、vif、vpr、vpu、tat或rev基因的片段或突变体。

13.权利要求1所述的方法，其中所述慢病毒载体是：

(a)假型的，并且任选地其中所述假型载体含有疱疹性口炎病毒G包膜蛋白；或者

(b)假型的，并且其中所述假型包装包括，用所述慢病毒载体的遗传物质和编码至少一种其它病毒包膜蛋白或细胞表面分子的遗传物质共转染或共感染包装细胞；或者

(c)用弹状病毒(Rhabdovirus)假型包装，任选地其中所述弹状病毒是疱疹性口炎病毒G包膜蛋白(VSV-G)。

14.权利要求1所述的方法，其中所述初级细胞是淋巴细胞、淋巴细胞前体、CD4阳性细胞、CD4阳性细胞的造血干细胞、CD8阳性细胞、CD8阳性细胞的造血干细胞、CD34阳性细胞、CD34阳性细胞的造血干细胞、树突细胞、能分化成树突细胞的细胞、人造血系统的初级细胞和/或人造血干细胞、人造血干细胞的前体、星形胶质细胞、皮肤成纤维细胞、上皮细胞、神经元、树突细胞、白细胞、与免疫应答相关的细胞、血管内皮细胞、肿瘤细胞、肿瘤血管内皮细胞、肝细胞、肺细胞、骨髓细胞、抗原呈递细胞、基质细胞、脂肪细胞、肌细胞、胰腺细胞、肾细胞、卵子、精母细胞、形成生殖系的细胞、胚胎多能干细胞或祖细胞、血细胞、非成核细胞、血小板细胞或红细胞、或它们的衍生物。

15.权利要求1所述的方法，其中所述至少一种细胞表面结合分子：

(a)包括多肽、脂类、核酸、碳水化合物或离子；或者

(b)包括抗体、抗原结合片段、配体或细胞表面分子；或者

(c)包括FLT-3配体、PTO配体或Kit配体，或者为FLT-3配体、PTO配体或Kit配体的细胞表面结合类似物的多肽或其它结合分子；或者

(d)包括CD34、CD3配体、CD28配体、CD25配体、CD71配体、或CD69配体，或具有与CD34、CD3、CD25、CD28、CD69、或CD71配体相同的细胞表面结合特异性的多肽或其它结合分子；或者

(e)包括组合物，其包含GM-CSF、IL4和TNF-α；GM-CSF和干扰素-α；或GM-CSF、IL4和TNF-α的细胞表面结合类似物的多肽或其它结合分子；GM-CSF或干扰素-α；或者

(f)包含CD3抗体或其细胞表面结合片段、CD28抗体或其细胞表面结合片段、所述抗体和其细胞表面结合片段的组合，以及具有与所述抗体相同的细胞表面结合特异性的结合分子；或者

(g)包括固定在珠子或表面上的CD3和CD28抗体的组合，其中任选地，所述珠子或表面包含包被的珠子；或者

(h)包括选自(a)到(g)中任意的两种或多种细胞表面结合分子；或者

(i)包括被用来增加或加强分子结合到所述细胞表面的能力的另一分子；或者

(j)与另一分子复合；或者

(k)发现于所述初级细胞表面上并与另一细胞的表面结合。

16.权利要求1所述的方法，其中所述条件包括：

(a)用细胞表面结合分子或细胞因子进一步温育；或者

(b)用白细胞介素-2进一步温育；或者

(c)培养所述细胞大约7天；或者

(d)培养所述细胞大约14天。

17.权利要求1所述的方法，其中所述慢病毒载体：

(a)衍生自人类免疫缺陷病毒(HIV)；或者

(b)衍生自HIV-1、HIV-2或它们的组合；或者

(c)是含有HIV序列的嵌合载体，其中任选地，所述HIV序列包括HIV-1和HIV-2序列；或者

(d)是VRX496或者其衍生物。

18.权利要求1所述的方法，其中所述的接触在混合或纯的细胞培养物、组织或器官系统中以离体的方式进行。

19.将遗传物质引入细胞的方法，其包括以离体的方式将通过权利要求1所述的方法转导的细胞引入活的对象、组织、器官、胚泡或胚胎干细胞中。

20.通过权利要求1-18中的任一项所述的方法转导的造血系统的初级细胞或造血干细胞的用途，用于制备药物组合物。

21.通过权利要求1-18中的任一项所述的方法转导的造血系统的初级细胞或造血干细胞的用途，用于制备用于治疗或预防对象内的病毒感染的药物组合物。

22.通过权利要求1-18中的任一项所述的方法转导的造血系统的初级细胞或造血干细胞的用途，用于制备用于治疗或预防对象内的HIV感染的药物组合物。

23.通过权利要求1-18中的任一项所述的方法转导的造血系统的初级细胞或造血干细胞的用途，用于制备用于治疗或预防癌症的药物组合物。

24.权利要求23所述的用途，其中所述癌症是乳腺癌或内皮细胞的癌症。

25.用于基因治疗的药物组合物，该药物组合物是通过权利要求1-18中的任一项所述的方法产生的，用于治疗或预防遗传缺陷引起的异常，或用于治疗、诊断、缓解或预防肿瘤或癌症，并且任选地，其中所述遗传缺陷引起的异常或肿瘤或癌症是乳腺癌肿瘤。

26.用于基因治疗的药物组合物，该药物组合物是通过权利要求1-18的任一项所述的方法产生的，用于治疗或预防感染引起的异常。

27.权利要求26所述的药物组合物，其中所述感染是病毒感染，并且任选地，其中所述病毒感染是人免疫缺陷病毒(HIV)感染。

28.权利要求25所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制成进行离体的应用。

29.权利要求26所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制成进行离体的应用。

30.一种用于造血系统的初级细胞和/或造血干细胞稳定转导的方法，其包括以体外或离体方式的将所述细胞的表面与慢病毒载体和至少一种结合到所述细胞表面的分子相接触，并且在有益于生长和/或增殖的条件下、在含有两层或多层的通风容器中培养所述细胞，其中所述容器适于培养至少约100,000,000个细胞，并且其中将所述初级细胞与所述细胞表面分子接触使所述细胞更易于接受通过所述慢病毒载体的转导。

31.权利要求30所述的方法，其中所述细胞表面分子的存在导致：

(a)所述细胞染色质更容易接受DNA整合；或者

(b)所述慢病毒载体整合入有利于所述慢病毒载体的基因表达的细胞位点；或者

(c)含有核酸的壳体更有效地进入所述细胞的胞质中；或者

(d)所述病毒更有效地进入通过细胞膜或通过所述细胞的内膜结构；或者

(e)所述初级细胞对于包含在所述病毒载体中的遗传物质的核输入更自由。

32.权利要求1或权利要求31所述的方法，其中所述细胞表面结合分子、抗体、抗原结合片段、配体或细胞表面分子包括：抗CD3或抗CD28抗体，其结合所述细胞并且使所述细胞更易于接受载体转导；所述FLT-3配体、PTO和Kit配体受体的抗体或配体，其结合所述细胞并且使所述细胞更易于接受载体转导；GM-CSF和IL-4受体的抗体或配体，其结合树突细胞或它们的前体、单核细胞、CD34阳性干细胞或它们在树突细胞谱系上分化的祖细胞，并且使所述细胞更易于接受载体转导；多肽、核酸、碳水化合物、脂类或离子，或者与其它物质复合的多肽、核酸、碳水化合物、脂类或离子，其结合细胞上的CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD2、CD3γ、CD3δ、CDε、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8α、CD8β、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CDw12、CD13、CD14、CD15、CD15s、CD16a、CD16b、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD33、CD34、CD35、CD36、CD37、CD38、CD39、CD40、CD41、CD42a、CD42b、CD42c、CD42d、CD43、CD44、CD45、CD45R、CD46、CD47、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD50、CD51、CD52、CD53、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD59、CDw60、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD64、CD65、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、CD66f、CD67、CD68、CD69、CDw70、CD71、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CD79cc、CD79(3、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD87、CD88、CD89、CD90、CD91、CDw92、CD93、CD94、CD95、CD96、CD97、CD98、CD99、CD100、CD101、CD102、CD103、CD104、CD105、CD106、CD107a、CD107b、CDw108、CDw109、CD114、CD115、CD116、CD117、CD118、CD119、CD120a；CD120b、CD121a、CD121b、CD122、CD123、CDw124、CD125、CD126、CDw127、CDw128a、CDw128b、CDw130、CDw131、CD132、CD133、CD134、CD135、CD136、CDw137、CD138、CD139、CD140a、CD140b、CD141、CD142、CD143、CD144、CDw145、CD146、CD147、CD148、CDw149、CD150、CD151、CD152、CD153、CD154、CD155、CD156、CD157、CD158a、CD158b、CD161、CD162、CD163、CD164、CD165、CD166或TCRζ，并且使所述细胞更易于接受载体转导。

33.用于分离自HIV感染对象的造血系统的初级细胞和/或造血干细胞的稳定转导的方法，其包括下列步骤：

(a)从所述HIV感染对象分离所述造血系统细胞的初级细胞或造血干细胞；

(b)任选地，用至少一种细胞表面结合分子预刺激所述初级细胞或造血干细胞；

(c)以体外或离体的方式同时将所述造血系统细胞或造血干细胞与慢病毒载体和至少一种细胞表面结合分子相接触；和

(d)在有益于生长和/或增殖的条件下，在含有两层或多层的通风容器中培养所述细胞，其中所述容器适于培养至少约100,000,000个细胞。

34.一种系统，其包括：

(a)含有两层或多层的通风容器；和

(b)分离的非粘附的所述造血系统的初级细胞和/或造血干细胞。

35.权利要求34所述的系统，其中所述初级细胞是淋巴细胞、淋巴细胞前体、CD4阳性细胞、CD4阳性细胞的造血干细胞、CD8阳性细胞、CD8阳性细胞的造血干细胞、CD34阳性细胞、CD34阳性细胞的造血干细胞、树突细胞、能分化成树突细胞的细胞、人造血系统的初级细胞和/或人造血干细胞、人造血干细胞的前体、星形胶质细胞、皮肤成纤维细胞、上皮细胞、神经元、树突细胞、白细胞、与免疫应答相关的细胞、血管内皮细胞、肿瘤细胞、肿瘤血管内皮细胞、肝细胞、肺细胞、骨髓细胞、抗原呈递细胞、基质细胞、脂肪细胞、肌细胞、胰腺细胞、肾细胞、卵子、精母细胞、形成生殖系的细胞、胚胎多能干细胞或祖细胞、血细胞、非成核细胞、血小板细胞或红细胞、或它们的衍生物。

36.权利要求34所述的系统，其中所述多层容器是矩形、正方形、或者带有弯曲边缘的矩形、或者带有弯曲边缘的正方形。

37.权利要求34所述的系统，其中所述容器适用于培养至少大约100,000,000个细胞。

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