CN101225402A - 生产谷胱甘肽的毕赤酵母基因工程菌及用于构建其的重组质粒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产谷胱甘肽的毕赤酵母(P.pastoris)基因工程菌及用于构建其的重组质粒。其是将外源谷胱甘肽合成酶系GSH I和GSH II基因分别置于启动子，如GAP启动子调控下，整合至甲醇酵母得到的高产GSH的基因工程菌。本发明的毕赤酵母基因工程菌可进行高密度培养，降低了生产GSH的成本，利于大规模工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物发酵合成谷胱甘肽领域，特别涉及一种生产谷胱甘肽的毕赤酵母基因工程菌及用于构建其的重组质粒。
背景技术
谷胱甘肽(GSH)以其多方面的生理功能而广泛涉及酶学、转运、药理、毒理、治疗、内分泌、微生物学及农业等研究领域，特别是在医药、食品行业对其需求量大。从上世纪80年代开始至今，发酵法一直是工业化生产谷胱甘肽的主要方法。
目前生物发酵合成谷胱甘肽是以啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的发酵为主。研究表明，谷胱甘肽的生物合成包括由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSH I，EC6.3.2.2)与谷胱甘肽合成酶(GSH II，EC6.3.2.3)组成的谷胱甘肽合成酶系在ATP存在下催化L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸的序贯反应合成，此为基因工程改造谷胱甘肽产生菌提供了依据。例如：EP0300168公布将谷胱甘肽合成过程的两个酶GSH I和GSH II的基因克隆至啤酒酵母基因组可提高酵母合成谷胱甘肽的能力；JP8070884披露通过将某一耐过氧化物啤酒酵母的抗氧化基因克隆并导入啤酒酵母SHY-2可使谷胱甘肽的产量提高2.5倍；JP2004173503公布将汉森多型酵母的GSH I基因重组至表达载体并转化谷胱甘肽合成缺陷菌生产谷胱甘肽；US20050239164A1公布结合重组技术和传统诱变方法获得突变基因明确的高表达GSH I及GSH II的亮氨酸缺陷型啤酒酵母在含肌醇的培养基及促进产量的培养条件下生产分泌型谷胱甘肽的方法；CN1699552公开了一种啤酒酵母工程菌及其构建方法。该工程菌将经过改造的GSH I基因导入酿酒酵母YSF-31中，得到的高谷胱甘肽低双乙酰含量菌株，可相对缩短发酵周期且在该专利发明人另文发表的文章中(Xiuying Fan et al.Biotechnology letters 26：415-417，2004)，应用此菌株发酵后所得谷胱甘肽含量可达到13.1mg/g干细胞重量。但是在啤酒酵母发酵过程中，所产生的乙醇会对啤酒酵母的生长产生抑制作用而导致啤酒酵母很难高密度培养，即啤酒酵母不能以极高密度生长，且发酵周期长降低了发酵质量，增加了发酵成本。
发明内容
本发明要解决的技术问题即是克服上述现有技术缺陷，提供一种可以高密度培养、高产GSH、降低发酵成本的谷胱甘肽产生菌，具体来说，是一种生产谷胱甘肽的毕赤酵母(Pichia Pastoris)基因工程菌，以及用于构建其的重组质粒。
为提高GSH产量、降低发酵成本，本发明人考虑不局限于构建啤酒酵母的工程菌来单纯地提高其表达量，而拟另辟蹊径，选用其它与啤酒酵母不同种属的发酵菌来进一步研究。其中，毕赤酵母(P.Pastoris)作为一种真核表达系统现公认具有如下特性：①P.pastoris具有旺盛的生长力，可以在廉价的非选择性培养基中快速生长，培养液的组分价廉便于工业化生产；②P.pastoris偏爱有氧生长，有较宽的生长pH适应范围(3.0-8.0)，对发酵过程中产生的乙醇具有耐受性，有较好的发酵基础，非常有利于实现高密度发酵培养，菌体密度可高达100g干细胞/L发酵液(Romanos M A，Scorer C A，Clare JJ.Yeast，1992；8：423-488)。上述特性，特别是特性②使得毕赤酵母具备以极低成本生产胞内代谢产物的能力。然而野生型毕赤酵母胞内谷胱甘肽含量很低，需进行基因工程改造，构建毕赤酵母的基因工程菌，才使其投入工业应用成为可能。
因此，本发明拟用外源性的，如来源于啤酒酵母的谷胱甘肽合成酶系GSH I和GSH II的基因gshI和gshII整合至毕赤酵母的基因组来构建高产GSH的毕赤酵母基因工程菌。由于毕赤酵母没有天然的质粒，因此所有外源基因都需要通过表达载体同源重组至其基因组才可在此宿主表达，而构建好的外源基因也就是质粒在重组前需要用内切酶线性化。因此，为构建生产谷胱甘肽的毕赤酵母基因工程菌，首先需制备用于构建该基因工程菌的重组质粒。
在构建重组质粒时，由于像酵母这样的真核表达系统是不共用启动子和终止子的，即各个基因需独立携带各自的启动子和终止子。因此本发明一种用于构建生产谷胱甘肽的毕赤酵母(P.pastoris)基因工程菌的重组质粒，其包括两组适于毕赤酵母表达系统的启动子和终止子，以及筛选标记和线性化位点，其中该两组启动子和终止子之间分别插有外源性的谷胱甘肽合成酶系GSH I和GSH II的基因gshI和gshII。
所述的适于毕赤酵母表达系统的启动子现已知的包括醇氧化酶(alcoholoxidase 1，AOX1)、甲醛脱氢酶基因(FLD1)、过氧化物生物蛋白基因(PEX8)、YPT1(三磷酸鸟嘌呤酶基因)及3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAP)启动子等。其中，毕赤酵母表达系统最常用的启动子为AOX1启动子，由它控制的外源基因在甲醇的诱导下得到高效表达。但甲醇不适用于食品工业生产，还是一种火灾隐患，在一定程度上限制了AOX1启动子的使用。近来研究开发出的表达载体使用其他一些不需要甲醇诱导的启动子(Cereghino JL，Cregg JM.FEMSMicrobiology Rev，2000，24(1)：45-66.)，如来源于P.pastoris的GAP组成型强启动子和FLD1诱导型启动子，还有YPT1启动子和编码PEX8的启动子等等。PEX8启动子在葡萄糖培养基中控制基因以很低的水平表达，当转移到甲醇培养基中则能适度地表达，这对于表达多亚基蛋白是非常重要的；YPT1启动子能够使重组子在葡萄糖、甲醇、甘露醇培养基中适度地组成型表达；GAP启动子具有很强的组成型表达能力，发酵时无需更换碳源，发酵工艺更为简单，有望代替AOX1启动子，但不能调控外源基因的表达，仅适合表达对宿主无毒的蛋白；FLD1启动子与AOX1启动子相当，能利用甲醇作为惟一碳源或某种甲基化的胺作为惟一氮源，诱导基因的强表达。由于GSH多用于食品医药行业，故本发明优选非甲醇诱导型启动子。更佳地，鉴于谷胱甘肽及其合成酶是宿主本身就具有的，只是含量水平较低，因此GAP启动子以其无需更换碳源发酵工艺简单及碳源廉价而更适用于工业化发酵生产谷胱甘肽。
所述的适于毕赤酵母表达系统的终止子现研究发现仅为AOX1(醇氧化酶终止子)。
本发明所说的筛选标记包括现已知的Sh ble(抗Zeocin抗生素基因)、HIS4以及ARG4、ADE1、URA3等相应基因的营养缺陷型标记。
至于线性化位点，可为各个启动子，如GAP、Arg4、Ura3、Ade1、Prb1、Pep4、Phis4启动子，以及His4(组氨酸脱氢酶)等。由于本发明重组质粒中有含两个谷胱甘肽合成酶基因，故需要两个启动子和终止子，如果还是用该启动子作为线性化位点，则就会有两个线性化位点，因此，需在该质粒中整合入不同于该启动子的的重组片段，如本发明优选GAP作为表达谷胱甘肽合成酶基因启动子时，可引入上述其它启动子以及His4作为重组片段；本发明优选His4片段。
而本发明为操作简便，直接选用现商业化的适于毕赤酵母表达系统的穿梭质粒作为起始载体，如含有GAP启动子和AOX1终止子，以及以Sh ble作为筛选标记的质粒pGAPZαA为起始载体，将来源于啤酒酵母的gshI和gshII基因分别插入GAP启动子和AOX1终止子之间，并整合了重组片段His4片段得到了重组质粒G1G2His4pGAPZA。其构建过程如图1所示，首先将两个基因分别插入两个质粒pGAPZαA的GAP启动子和AOX1终止子之间，再利用同尾酶将其中一个基因连同GAP启动子和终止子的片段切下，并连接至单酶切后与该片段互补粘端的含另一个插入基因的质粒上，鉴定两个基因片段的启动子、基因及终止子的顺序相同后即得到所需质粒。构建过程中所用内切酶的选择原则是每一步所选的酶都不能在被切的对象上有超过一个位点，也就是说识别位点都必须是唯一的，并且不得存在于基因内部或者启动子、终止子上。
如上所述，本发明一种生产谷胱甘肽的毕赤酵母(P.pastoris)基因工程菌，其是在毕赤酵母染色体上整合了外源性的基因gshI和gshII的基因工程菌。
较佳地，是将上述的重组质粒按常规技术整合至毕赤酵母染色体上制得的基因工程菌。更佳地，本发明选用毕赤酵母(P.pastoris)GS115菌株，导入上述重组质粒G1G2His4pGAPZA，得到基因工程菌毕赤酵母(P.pastoris)GS115/G1G2His4pGAPZA。
本发明是首次将外源谷胱甘肽合成酶系GSH I和GSH II基因分别置于启动子，如GAP启动子调控下，整合至甲醇酵母得到的高产GSH的基因工程菌。本发明的毕赤酵母基因工程菌可进行高密度培养，高产GSH，降低了生产GSH的成本，利于大规模工业化生产。
附图说明
图1为本发明重组质粒G1G2His4pGAPZA的构建示意图。
图2为本发明重组质粒G1G2His4pGAPZA的酶切电泳鉴定图，其中1：本发明重组质粒；2：Marker(标记)。
具体实施方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。
分子生物操作所用Marker、各种内切酶、DNA多聚酶、试剂盒、质粒pMD18-T购自大连TakaRa，E.Coli DH5α感受态细胞购自博大泰克，啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)y10购自上海工业微生物研究所，质粒pAO815、pGAPZαA、P.pastoris GS115菌株购自Invitrogen。
实施例1啤酒酵母gshI及gshII基因的获得及保存
1)以来自NCBI GenBank数据库啤酒酵母的GSH1及GSH2基因序列分别设计引物，两对引物中的上游引物5’端均包含Kozark序列并在其5’端再添加Cla I酶切位点(下划线处)，下游引物5’端均添加Not I酶切位点(下划线处)；gshI上、下游引物分别为：
CCATCGATACCATGGGACTCTTAGCTTTG
GCGGCCGCTTAACATTTGCTTTCTAT，
gshII上、下游引物分别为：
CCATCGATACCATGGCACACTATCCA
GCGGCCGCCCTAGTAAAGAATAATACTG。
2)PCR获得gshI和gshII
以啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)y10为模板，以Taq酶扩增产物，PCR条件为：①97℃5分钟，②暂停，③94℃30秒，④58℃1分钟，⑤72℃2.5分钟，⑥重复③～⑤共29个循环，⑦72℃10min，⑧4℃保持。
3)PCR产物沉淀浓缩并凝胶回收获得gshI和gshII(gshI为2056bp；gshII为1496bp)。
4)凝胶回收产物的连接转化
①回收产物与pMD18T载体于16℃连接2h-4h，构建质粒pMD18T-gshI及pMD18T-gshII；
②将上述质粒转化E.Coli DH5α，转化产物涂布于含100μl/ml氨苄抗生素的IPTG、X-gal LB琼脂平板，37℃培养12-16h；挑选白色菌落培养于5ml含100μl/ml氨苄抗生素的LB培养基，220-250rpm/37℃培养12-16h，提取质粒，并ClaI、NotI双酶切鉴定，pMD18T-gshI可见2056bp及pMD18T载体(2692bp)两个片段；pMD18T-gshII可见1496bp及pMD18T载体(2692bp)两个片段，保存阳性菌甘油管。
5)将pMD18T-gshI、pMD18T-gshII送至上海生工测序，结果表明gshI、gshII基因序列与已公布的啤酒酵母两基因序列同源性为100％。
实施例2质粒His4-pGAPZαA的构建
1)设计引物，以质粒pAO815为模板PCR获得含His4片段。其上游引物从质粒BamH I位点(下划线处)开始并在5’端加上保护碱基；下游引物5’端添加与BamH I同尾的酶切位点Bgl II(下划线处)，并加上保护碱基；上下游引物分别为：
GCGGATCCTAATGCGGTAGTTTATCACAGTTA和
GAAGATCTTCATGACATTTCCCTTGCTACCTG。
2)以Taq酶[TaKaRa]PCR扩增获得His4片段。PCR条件：①97℃5min，②暂停，③94℃30sec，④59.6℃1min，⑤72℃3.5min，⑥重复③～⑤共29个循环，⑦72℃10min，⑧4℃保持。
3)BamH I、Bgl II双酶切PCR产物并凝胶回收，pGAPZαA以BamHI酶切并凝胶回收片段；
4)上述PCR双酶切产物与BamH I单酶切处理的pGAPZαA载体以T4连接酶[TakaRa]于16℃连接4h；
5)连接产物转化E.Coli DH5α并培养于含25μl/ml ZeocinTM的低盐LB琼脂平板，37℃12-16h；
6)挑取平板生长的单菌落10个于5ml含25μg/ml ZeocinTM的低盐LB，220-25rpm/37℃12-16h，提取质粒，并以BamHI、EcoRI双酶切鉴定，得到质粒His4-pGAPZαA。正确质粒可见468bp及5595bp两条电泳条带。
实施例3质粒G2P的构建
1)大量Cla I、Not I双酶切pMD18T-gshII，回收含gshII片段gshII/ClaI Not I；大量NspV、Not I双酶切质粒pGAPZαA回收大片段pGAPZαA/NspVNot I；
2)上述酶切片段gshII/ClaINotI与pGAPZαA/NspVNotI连接并转化E.coliDH5α(转化方法见购买的感受态细胞工作手册)，最后转化菌液涂布于25μg/ml ZeocinTM低盐LB琼脂平板，37℃12-16h待单菌落形成，提取质粒，并Bln I单酶切鉴定，正确质粒酶切电泳图显示462bp及3846bp两条带保存阳性菌甘油管。
实施例4质粒G1HP的构建
构建原理同实施例3构建质粒G2P，都是利用基因的Cla I、Not I双酶切回收片段与载体质粒的NspV、Not I双酶切大片段互补粘端连接起来。最后阳性菌的鉴定用Bgl II、EcoR I双酶切鉴定，保存阳性菌甘油管。正确质粒酶切电泳图显示1899bp及5585bp两条带。
实施例5重组质粒G1G2His4pGAPZA的构建
1)G2P用BamH I、Bgl II双酶切并凝胶回收2.2K处的含gshII片段，去磷酸化处理G1HP用Bgl II单酶切回收片段[去磷酸化处理参考TakaRa去磷酸化试剂CIAP使用说明]；
2)上述两个片段以T4连接酶于16℃连接过夜；
3)连接产物全部转化DH5α，最后转化菌液涂布于25μg/ml ZeocinTM低盐LB琼脂平板，37℃12-16h待单菌落形成；
4)挑取10个单菌落于25μg/ml ZeocinTM低盐LB，220-250rpm/37℃过夜，提取质粒并Bgl II、EcoR I双酶切鉴定(阳性菌落应在电泳结果显示4287bp和5885bp两条带)，电泳图如图2所示。
重组质粒G1G2His4pGAPZA的构建示意图如图1所示。
实施例6重组质粒G1G2His4pGAPZA对毕赤酵母GS115的电转化
1)制备线性化G1G2His4pGAPZA[参见《分子克隆》(第三版)]
①接种G1G2His4pGAPZA甘油管5μl于含有25μg/ml ZeocinTM低盐LB5ml中，220-250rpm/37℃培养约7h后，以1％接种量转接装有含有25μg/mlZeocinTM低盐LB 50ml的750ml三角摇瓶，220-250rpm/37℃过夜；
②8000rpm/4℃沉淀菌体，除尽培养液后沉淀重悬于GTE(GTE用量以100μl/ml菌液按比例放大)并加入RNase使终浓度为40μg/ml，加入SolutionII轻轻混匀后加入SolutionIII轻轻混匀(加量比例分别为GTE加量的2及1.5倍)，12000rpm/5min转移上清，以0.6倍异内醇-20℃沉淀0.5h，12000rpm/5min收集沉淀并用70％乙醇清洗沉淀一次，减压吸干液体，沉淀复溶于1ml以内灭菌去离子水，其余操作参考《分子克隆》中的质粒提取操作步骤；
③测定所提质粒浓度，按照线性化酶AccIII的说明书大量酶切质粒，取样电泳确认完全线性化后以0.5M pH8.0EDTA终止反应(EDTA终浓度10mM)，以酚/氯仿抽提一次转移上清，加入0.1倍体积3M乙酸钠和2倍体积无水乙醇-20℃沉淀浓缩酶切产物，并用70％乙醇清洗12000rpm/5min离心后沉淀保证除盐完全，减压吸干残留液体，沉淀复溶至灭菌去离子水使线性化质粒浓度至少3μg/μl，测定浓度并计算用量(一般一次转化需10μg线性化质粒)，立即使用或保存于-20℃。
2)制备感受态GS115，参考Invitrogen的pGAPZ操作手册PichiaTransforming部分，具体步骤包括：
①挑取GS115平板单菌落于20ml YPD培养基220-240rpm/30℃过夜，以1％接种量转接一级种于50ml YPD，220-240rpm/30℃培养至OD值为1.2～1.5停止培养，
②4℃1500×g/5min重悬菌体于50ml冰水，
③4℃1500×g/5min重悬菌体于25ml冰水，
④4℃1500×g/5min重悬菌体于2ml冰预冷1M山梨醇，
⑤4℃1500×g/5min重悬菌体于100μl冰预冷1M山梨醇，当天使用。
3)线性化G1G2His4pGAPZA电转化GS115，参考Invitrogen的pGAPZ操作手册Pichia Transforming部分及BioRad电转化仪操作手册。具体包括下列步骤：
①混合80μl感受态细胞和约10μg线性化DNA并转移至一预冷至0℃的0.2cm电击杯，
②冰上放置5min，
③根据BioRad电转化仪操作手册电转化，电击参数为：电压1.5kV，电阻200Ω，电容20kF，
④电击结束后立刻加1ml冰预冷1M山梨醇到电击杯并全量转移至5ml离心管，
⑤此管转化液静置于30℃1h，然后加入1ml YPD于30℃200rpm/1h，
⑥以每块平板100μl涂布于100μg/ml ZeocinTM YPDS，30℃培养至单菌落形成，3天后取出，4℃保存。
实施例7高GSH基因工程菌落的筛选培养
1)挑取转化板上较大的菌落点于2mg/ml ZeocinTM YPDS复筛板，30℃培养3天至单菌落形成，4℃保存；
2)挑取复筛板上的菌落于15ml含1％(w/w)酵母提取粉、2％(w/w)蛋白胨、1.34％(w/w)YNB、2％(w/w)甘油、4×10-4g/L生物素、5mM谷氨酸、5mM半胱氨酸、5mM甘氨酸的筛选培养基，230rpm/30℃培养三天；
3)每个菌落的菌液先保存甘油管，同时各取1ml菌液测定GSH含量(以96孔板用Ellman法于405nm测定GSH含量。
结果：筛选到一株生产GSH的本发明基因工程菌毕赤酵母(P.pastoris)GS115/G1G2His4pGAPZA，其产GSH达400mg/L发酵液产量，而作为对照组的P.pastoris GS115野生菌的GSH产量为38mg/L发酵液。
Claims (10)
1.一种用于构建生产谷胱甘肽的毕赤酵母(P.pastoris)基因工程菌的重组质粒，其包括两组适于毕赤酵母表达系统的启动子和终止子，以及筛选标记和线性化位点，其中该两组启动子和终止子之间分别插有外源性的谷胱甘肽合成酶系GSH I和GSH II的基因gshI和gshII。
2.如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于所述的适于毕赤酵母表达系统的启动子为非甲醇诱导型启动子。
3.如权利要求2所述的重组质粒，其特征在于所述的非甲醇诱导型启动子为GAP启动子。
4.如权利要求3所述的重组质粒，其特征在于所述的线性化位点为整合入的重组片段。
5.如权利要求4所述的重组质粒，其特征在于该重组片段为His4片段。
6.如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于所述外源性的基因gshI和gshII为来源于啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的gshI和gshII基因。
7.如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于所述的适于毕赤酵母表达系统的终止子为AOX1终止子。
8.如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于其是如图1所示的将来源于啤酒酵母的gshI和gshII基因分别插入带有抗Zeocin抗生素基因作为筛选标记的质粒pGAPZαA的GAP启动子和AOX1终止子之间，并整合了重组片段His4片段的重组质粒G1G2His4pGAPZA。
9.一种生产谷胱甘肽的毕赤酵母(P.pastoris)基因工程菌，其是在毕赤酵母染色体上整合了外源性的基因gshI和gshII的基因工程菌。
10.如权利要求9所述的毕赤酵母基因工程菌，其特征在于其是将权利要求1～9任一项所述的重组质粒整合至毕赤酵母染色体上制得的基因工程菌。
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