CN101194013A

CN101194013A - 新颖的倍半萜合酶和它们的应用方法

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Publication number: CN101194013A
Application number: CNA2006800203349A
Authority: CN
Inventors: 米歇尔·沙尔克
Original assignee: Firmenich SA
Current assignee: Firmenich SA
Priority date: 2005-06-17
Filing date: 2006-06-08
Publication date: 2008-06-04
Anticipated expiration: 2026-06-08
Also published as: EP2311940B1; US7790413B2; US20080268500A1; EP1893753A2; JP2008546384A; EP1893753B1; JP5430929B2; CN101194013B; WO2006134523A2; EP2311940A1; WO2006134523A3

Abstract

本发明涉及一种新颖的倍半萜合酶和它们的应用方法。该萜合酶能够合成具有C₂－C₇键或C₃－C₇键并且起始于脂肪族的焦磷酸酯萜前体(法呢基焦磷酸酯)的单环倍半萜、二环倍半萜和/或三环倍半萜。因此，第一次公开了催化能得到檀香萜和香柠檬烯碳骨架的环化的倍半萜合酶。本发明还涉及编码倍半萜合酶的核酸序列和生成萜类化合物的方法。

Description

新颖的倍半萜合酶和它们的应用方法

技术领域

本发明涉及新颖的萜合酶。本发明还涉及编码萜合酶的核酸，制备多种萜合酶的方法，以及表达本发明多肽的宿主生物体。本发明还包含生成萜合酶的方法和生成萜类化合物的方法。

背景技术

萜类化合物或萜代表了在多数生物体(细菌、真菌、动物、植物)中发现的天然产物家族。萜类化合物由称为异戊二烯单元的五碳单元组成。它们可由其结构中存在的异戊二烯单元的数目来分类：单萜(C10)，倍半萜(C15)，二萜(C20)，三萜(C30)，四萜(C40)和聚萜(Cn，n≥45)。植物界含有最为丰富的单萜和倍半萜。

单萜和倍半萜是最多结构变化的类异戊二烯。通常它们为挥发性化合物并且大多发现于植物中，它们在防御病原体和草食动物袭击，授粉吸引和植物对植物通讯中起作用。

一些被称为芳香植物或香精油植物的植物在其叶子、根或茎中积聚大量的单萜和倍半萜。这类植物的典型的实例是来自于唇形科、芸香科、茄科和禾本科植物等的成员。

单萜和倍半萜积聚植物由于其风味和香味特性和其化妆品、药的和抗菌的效果千百年来受到人们的关注。所述积聚于植物中的萜可通过如蒸气蒸馏等不同的方法进行抽提，该蒸馏的产物即为所谓的含有浓缩萜的精油。所述天然的植物提取物为调味料和香料工业重要的成分。

多种倍半萜化合物在香料业中被使用。例如从岩兰草的根中提取出来的岩兰油已知含有大量有气味的倍半萜，其中最为典型的是α-岩兰酮、β-岩兰酮和岩兰酸(zizanoic acid)。目前岩兰草在留尼旺岛、菲律宾、科摩罗群岛、日本、西非和南美洲都有种植。

通常，植物天然提取物如岩兰油的价格和可获量依赖于植物的丰度、精油的产量和地理来源。某些年份商业可用的天然提取物的可获量降低，同时它们的质量相应变差。在这种情况下，在高质量香料产品中不可能再应用这样的成分。

因此，提供一种在可获量和质量方面波动较少的倍半萜的来源是有利的。化学合成似乎成为制备倍半萜的显然的选择，然而，这些化合物通常具有高度复杂的结构并且到目前为止没有开发出经济的制备倍半萜的合成方法。

由此，本发明的目的是提供一种以经济和可靠的方式生产高质量的倍半萜的方法。

植物中的萜的生物合成已经被广泛的研究，在此不另外详述，但可参考Dewick P的Nat.Prod.Rep.，2002，19，181-222，其回顾了萜生物合成路径的现有技术的状况。

倍半萜合酶将FPP转化成为不同的倍半萜骨架。超过300种倍半萜烃和3000种倍半萜化合物已经被鉴别出来(Joulain，D.和

W.A.的The Atlas of Spectral Data of Sesquiterpene Hydrocarbons，EBVerlag，Hamburg，1998；Connolly，J.D.和Hill R.A.的Dictionary of Terpenoids，Vol 1，Chapman and Hall(publisher)，1991)，并且每年许多种新的结构被鉴定出来。事实上在植物界中存在大量的倍半萜合酶，它们所有都使用相同的底物但生成不同的产物轮廓。

Bohlmann，J，Crock，J.，Jetter，R.和Croteau R.(1998)的Terpenoid-baseddefenses in conifers：cDAN cloning，characterization，and functional expressionof wound-inducible(E)-α-bisabolene synthase from grand fir(Abies grandis).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，6756-6761报道了编码反式-α-红没药烯合酶的cDNA。但是，所述酶催化了一个环化步骤并且生成了几乎唯一的红没药烯倍半萜。

T等的(2004)The plant cell 16(5)，1115-1131公开了大量的从玉米中分离出来的推定的萜合酶基因，它们中的大多数不编码有功能的酶。功能合酶DNA序列Tps4-B73和Tps5-1 delprim的检索号为AY518310和AY518313。由编码的酶产生的香柠檬烯仅为次要产物，其量占产生的总倍半萜量的最多2.6wt.％。

尽管对萜环化进行了广泛的化学研究，由于它们的低丰度、通常短暂的表达方式和在其表达组织中从树脂和酚类化合物的混合物中纯化它们的复杂性的原因，所述酶特别是在植物中的分离仍然很困难。

考虑到以上的原因，本发明的目的是提供一种新的萜合酶。另一目的是从岩兰草植物中分离出萜合酶。本发明的又一目的是提供能够用于合成萜的萜合酶，用于合成目前没有报道的酶。

特别地，目的是提供能够合成足够量的具有檀香萜或香柠檬烯的碳骨架的倍半萜的酶。没有基于檀香萜合酶遗传基础的报道，而香柠檬烯仅能由已知萜合酶以痕量合成出来。

同样地，目的是提供如上所述的以经济的方式生成萜类化合物的方法。因此，本发明的目的是生产倍半萜而有极少的浪费、节约能源和资源的方法并且同时降低对于化石燃料的依靠。另一目的是提供能够合成用于香料和/或芳香成分的萜类化合物的酶。

发明内容

不同寻常地，本发明人克隆了编码岩兰草根部的新颖倍半萜的cDNA。令人惊奇的是所述新颖的倍半萜合酶能够合成倍半萜，该倍半萜如环

莰烯(cyclocopacamphene)、(+)-epi-β-檀香萜，反式-α-香柠檬烯，顺式-α-香柠檬烯，β-红没药烯，和/或反式-γ-红没药烯，到目前为止这些倍半萜还未从岩兰草中分离出来。因此本发明提供了第一种克隆的倍半萜合酶，其能够催化FPP向红没药基阳离子(bisabolyl cation)的环化，以及随后的向香柠檬烷和檀香烷骨架的环化。第一次报道了萜环化酶，其能够合成足够量的红没药基阳离子的二环衍生物。

因此，第一方面本发明提供了选自以下的一种分离的核酸：

(a)含有与SEQ ID NO：2有至少82.4％同一性的核苷酸序列的核酸；

(b)含有编码与SEQ ID NO：5有至少76.8％的序列同一性的多肽的核苷酸序列的核酸；

(c)含有在中度严谨条件下与核苷酸序列SEQ ID NO：2杂交的核苷酸序列的核酸；

(d)含有编码能够合成具有C₃-C₇键的二环倍半萜和/或三环倍半萜的多肽的核苷酸序列的核酸；和/或

(e)含有编码能够合成至少一种香柠檬烯和非强制性选择的其它倍半萜的多肽的核苷酸序列的核酸，其特征在于香柠檬烯占由所述多肽合成的全部倍半萜产物的至少10wt.％；

其中由任一(a)～(e)的所述核酸编码的多肽具有萜合酶活性。

另一方面，本发明提供了选自以下的分离的核酸：

(a)含有与SEQ ID NO：1有至少59％的序列同一性的核苷酸序列的核酸；

(b)含有编码与SEQ ID NO：4有至少50％的氨基酸序列同一性的多肽的核苷酸序列的核酸；

(c)在中度严谨条件下与SEQ ID NO：1杂交的核酸；

(d)含有编码能够合成环莰烯的多肽的核苷酸序列的核酸；

其中，由所述核酸编码的多肽具有萜合酶活性。

又一方面，本发明提供了选自以下的分离的多肽：

(a)含有与SEQ ID NO：5有至少76.8％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的多肽；

(b)能够合成具有C₃-C₇键的二环倍半萜和/或三环倍半萜的多肽；

(c)能够合成至少一种香柠檬烯和非强制性选择的其它倍半萜的多肽，其特征在于香柠檬烯占由所述多肽合成的全部倍半萜产物的至少10wt.％。

又一方面，本发明提供了选自以下的多肽：

(a)含有与SEQ ID NO：5有76.8％氨基酸序列同一性的氨基酸序列的多肽；

(c)能够合成至少一种香柠檬烯和非强制性选择的其它倍半萜的多肽，其特征在于所述香柠檬烯占由所述多肽合成的全部倍半萜产物的至少5wt.％。

本发明还涉及制备如权利要求书和具体实施方式中给出的具有萜合酶活性的多肽变体的方法。

另一方面，本发明提供了含有任意本发明的核酸的载体和宿主生物体或细胞。

又一方面，本发明提供了权利要求书和具体实施方式中列出的生成萜合酶的不同的方法，另外，和生成萜类化合物如倍半萜的方法。

附图说明

图1显示了由本发明的萜合酶合成的倍半萜化合物的结构，从正文中讨论的岩兰油和其它倍半萜化合物中分离的倍半萜化合物，具体为(1)顺式-α-香柠檬烯，(2)反式-α-香柠檬烯，(3)epi-β-檀香萜，(4)β-红没药烯，(5)反式-γ-红没药烯，(6)环洒剔烯和(7)环

莰烯，来自岩兰油的曾报道过的倍半萜化合物为(8)岩兰酸，(9)α-岩兰酮，(10)β-岩兰酮，(11)异红没药烯，(12)β-红没药醇，(13)脱氢姜黄烯，(14)(Z)-反式-α-香柠檬醇，(15)(Z)-(+)-epi-β-檀香醇。

图2显示了源自由RT-PCR获得的编码倍半萜合酶的cDNA片段的氨基酸序列(SEQ ID NO：8-14)的比对。

图3显示了本发明的SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6的全长氨基酸序列的比较。相同的氨基酸以黑色背景显示，具有相同离子电荷的氨基酸以灰色背景显示，并且不相关的氨基酸以白色背景显示。

图4A中显示了由酶法测定得到的倍半萜的气相色谱(GC)，在该测定中FFP被暴露于具有完全如SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的多肽中。图4B显示了图4A的主峰(10.81)的质谱(MS)，将其与相应的标准环洒剔烯的谱图比较，由此显示出在酶法测定中获得的倍半萜的性质。

图5显示了由酶法测定获得的倍半萜的气相色谱，在该测定中FFP被暴露于具有完全如SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的多肽中。该蛋白重组体得到了由至少7种不同的倍半萜烃形成的混合物，通过GC-MS鉴定出其中的5种，用编号1～5表示(化合物名称见图1)。

图6显示了由本发明的多肽催化的倍半萜合成的推定生物合成机制，其中反应由FPP(16)起始并且经过红没药基阳离子(17)中间体。具体地，该反应由具有完全如SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的多肽及其变体催化。图6进一步显示了前体(FPP)和该倍半萜产物的化学结构。

使用的缩写

bp 碱基对

DNA 脱氧核糖核酸

cDNA 互补DNA

DTT 二硫苏糖醇

FPP 法呢基焦磷酸酯

NPP 焦磷酸橙花叔酯

IPTG 异丙基-D-硫代半乳糖-吡喃糖苷

PCR 聚合酶链式反应

RT-PCR 反转录-聚合酶链式反应

3’-/5’-RACE 3’-和5’-cDNA末端快速扩增

RNA 核糖核酸

mRNA 信使核糖核酸

nt 核苷酸

RNase 核糖核酸酶

SDS-PAGE SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

具体实施方式

本发明提供了编码能够合成单环倍半萜，二环倍半萜和/或三环倍半萜的新颖倍半萜合酶的分离的核酸。具有C₃-C₇键的二环或三环倍半萜被定义为具有檀香萜碳骨架的倍半萜，而那些具有C₂-C₇键的被定义为具有香柠檬烯骨架的倍半萜。

“萜”为脂肪族或环状的基于异戊二烯单元(C₅H₈)的烃。“萜”包括但不限定为环洒剔烯、环

莰烯(cyclocopacamphene)，环

莰烯醇(cyclocopacamphenol)差向异构体，环

莰烯醛(cyclocopacamphenal)差向异构体，环

莰烯酸(cyclocopacamphenicacid)差向异构体，顺式-α-香柠檬烯，反式-α-香柠檬烯，(+)-epi-β-檀香萜，β-红没药烯，和反式-γ-红没药烯。

此处使用的“萜”，和“萜类化合物”包括萜和萜的衍生物，包括经过一步或多步的如羟基化，异构化，氧化还原，二甲基化或酰化等官能化的化合物。在此使用的“倍半萜”为基于C₁₅结构的萜并且包括经过一个或多个官能化步骤的化合物的倍半萜和倍半萜衍生物。

在此使用的“衍生物”为任何从已知的或假定化合物获得并含有亲体结构基本单元的任意的化合物。

在此使用的“萜合酶”为催化萜合成的任意的酶。“倍半萜合酶”为催化倍半萜合成的任意的酶。

如在术语“同一性”或“同一的”中使用的序列同一性可简单地由标准对齐算法(standard alignment algorithms)计算得到。优选地，为了评定本发明序列与其它序列(例如来自现有技术的序列)之间的序列同一性，使用J.D.Thompson，D.J.Higgins，T.J.Gibson(1994)CLUSTAL W：improving the sensitivity of progressive multiple sequencealignment through sequence weighting，position-specific gap penalties andweight matrix choice.Nucleic Acids Res 22(22)，4673-4680中公开的CLUSTAL W.方法。选择标准的参数用于评估序列的同一性。序列的比较可在网上进行，如在http://www.ebi.ac.uk/clustalw/或另外可使用下载的软件，如可得自http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioe dit.html的生物编辑软件。

一方面，本发明提供了与本发明任意核酸杂交的分离的核酸，例如在低度严谨条件下与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：3杂交的那些核酸。优选地，定义的条件为中度严谨条件，更优选高度严谨条件。

令人惊奇的是，在SEQ ID NO：6的N末端的序列不同于其它已知的萜合酶序列之处在于，其含有不同的基序(motif)PAAAASSQQQQ(SEQ ID NO：7)，该序列不类似于任何已知的信号序列。本发明还涉及到该特殊的序列和编码该基序的任何核苷酸序列，如SEQ ID NO：3。

在具体实施方式中，本发明涉及包括那些完全没有污染内源物质的特定的分离的核苷酸序列。术语“核酸”或“核酸分子”包括单链或双链形式的脱氧核糖核酸或核糖核酸聚合物(DNA和/或RNA)。“核苷酸序列”还指分离片段形式的多核苷酸分子或寡核苷酸分子，或较大核酸的一部分。

在实施方式中，本发明提供了选自以下的核酸：

(a)选自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3组成的组中的任一核酸，(b)选自由编码完全如SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5和SEQ ID NO：6所示任一多肽的核酸组成的组中的任一核酸，(c)在低度严谨条件下与(a)或(b)的核酸杂交的核酸，其中由所述核酸编码的多肽具有倍半萜合酶活性。

在具体实施方式中，该核酸含有核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO：1有至少59％，优选至少60％，更优选至少65％和最优选至少70％的同一性。例如，本发明的核酸序列与SEQ ID NO：1有至少75％、80％、85％、90％、95％或98％的同一性。

在实施方式中，核酸包含核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ IDNO：2有至少82.4％，优选至少85％，更优选至少90％，并且最优选至少95％的同一性。例如，本发明所述核酸序列与SEQ ID NO：2有至少95％、97％或9 8％的同一性。

在实施方式中，该核苷酸包含核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQ ID NO：3有至少49％，优选至少50％，更优选至少55％和最优选至少60％的同一性。例如，本发明的所述核酸序列与SEQ IDNO：3有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％的同一性。

优选地，步骤(c)的核酸在中度严谨条件下，优选在高度严谨条件下与以上的(a)或(b)的核酸杂交，但是优选与序列SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3杂交。例如，(c)的核酸与SEQID NO：1杂交。根据另一实施例，在上述条件下将其与SEQ ID NO：3杂交。

优选地，本发明的核酸与SEQ ID NO：1的核酸杂交并且不与检索号为AP003911的编码发现于稻(Oryza sativa)的推定倍半萜合酶的核酸杂交。

根据实施方式，本发明的核酸与SEQ ID NO：2的核酸杂交并不与选自具有检索号AY518310或AY518313的编码玉米的倍半萜合酶的那些核酸杂交。优选地，本发明的核酸不另外与任何选自那些具有检索号AY518311、AY518312和AY518314的核酸杂交。后面的这些序列未被报道过编码活性倍半萜合酶。

优选地，本发明的核酸与SEQ ID NO：3的核酸杂交并且不与检索号为AAG37841的编码发现于玉米中的推定倍半萜合酶的核酸杂交。

优选地，分离的核酸在严谨条件特别地与SEQ ID NO：3的核酸杂交，在该严谨条件下不与检索号为AF296122的推定编码萜合酶的存在于玉米中的核酸杂交。

优选地，本发明的核酸序列含有SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3。更优选，其主要由SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3组成。

在另一实施方式中，该核酸含有SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3的至少20、100、200、300、400、500或750个核苷酸的连续片段。

优选地，本发明的核酸在低度，中度和高度严谨条件下与具有上述长度的片段杂交。

优选地，本发明的核酸分别含有SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和/或SEQ ID NO：3的从约第900个核苷到第1647、1641和1791个核苷的片段。这些片段包括本发明的多肽的活性位点。

优选地，本发明的核酸和/或多肽是从岩兰草(Vetiveriazizanoides)中被分离出来的。在实施方式中，所述核酸是从岩兰草的根中被分离出来。

在此使用的术语“杂交或在一定条件下杂交”被如下所示定义。所述条件为，具有至少约70％，例如至少约80％，并且例如至少约85～90％同一性的序列仍然保持彼此结合。

本领域技术人员可以根据Ausubel等的(1995)，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons一书第2、4和6章中例举的最小限度试验(minimal experimentation)选择合适的杂交条件。另外，还有Sambrook等(1989)第7、9和11章中描述的严谨条件。

在此使用的定义的“低度严谨”条件如下所述。将含有DNA的滤膜40℃下在含下列物质的溶液中预处理6小时：35％甲酰胺，5xSSC，50mM Tris-HCI(pH 7.5)，5mM EDTA，0.1％PVP，0.1％Ficoll，1％BSA，和500μg/ml变性的鲑鱼精子DNA。杂交在相同溶液中进行，除下列改动外：0.02％PVP，0.02％Ficoll，0.2％B SA，100μg/ml鲑鱼精子DNA，10％(wt/vol)葡聚糖硫酸酯，使用5-20x10⁶ ³²P-标记探针。

将滤膜在杂交混合液中40℃下孵育18-20小时，然后55℃下用含有2xSSC，25mM Tris-HCI(pH 7.4)，5mM EDTA和0.1％SDS的溶液洗涤1.5小时。用新鲜溶液取代洗涤溶液，60℃下再孵育1.5小时。滤膜进行印迹干燥并进行放射自显影。

在此使用的定义的“中度”严谨条件不同于“低度”严谨条件，差别在于将含有DNA的滤膜50℃下在以上给出的相应溶液中预处理7小时(中度)和65℃下在以上给出的相应溶液中预处理8小时(高度)。在相同的溶液中进行与“低度严谨”相同的杂交，除了分别在50℃下处理30小时，然后在55℃下在上述的洗涤溶液中洗涤1.5小时(中度)。用新鲜溶液取代洗涤溶液并另外在60℃下孵育1.5小时。

“高度”严谨条件：在上述的溶液中在65℃下预杂交8小时，除了用6xSSC，1nM EDTA，0.02％PVP，0.02％Ficoll，0.02％BSA和500g/ml的变性鲑鱼精子DNA替代。将滤膜在65℃下在含100μg/ml变性鲑鱼精子DNA和5-20x10⁶cpm ³²P-标记探针的预杂交混合液中杂交48小时。将滤膜在37℃下用含有2xSSC，0.01％PVP，0.01％Ficoll和0.01％BSA的溶液洗涤1小时。然后再用0.1xSSC在50℃下洗涤45分钟。如果上面给出的条件不合适，还可以选用本领域已知的其他低度、中度和高度严谨条件(例如，用于种间杂交的条件)。

本法明还包括“各种核苷酸序列”，如由任一的SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3突变获得的序列。该突变可为任一类型的本发明序列的突变，例如点突变，缺失突变，插入突变和/或移码突变。为了使一个序列适应特定的表达系统，可以制备各种不同的核苷酸序列。例如，当氨基酸以优选的密码子编码时，公知细菌的表达系统可比较有效地表达多肽。由于遗传密码子的简并性，其中多于一个的密码子可以编码相同的氨基酸，多个DNA序列可以编码相同的多肽，该多肽包括在本发明的核酸或核苷酸序列中。

另外，本发明还包括编码完全不同于在此报道过的氨基酸序列的多肽的各种核苷酸序列，但是该序列可通过变异如诱变或另外使用本发明核苷酸序列来获得。

优选地，本发明的多肽能够合成单环倍半萜和二环倍半萜。优选地，其能够合成二环倍半萜或三环倍半萜。最优选其能够合成单环倍半萜、二环倍半萜和三环倍半萜。

优选地，本发明的分离的多肽能够从FPP形成红没药基阳离子并且能够进一步生成FPP的C₃和C₇碳原子之间的键以生成具有C₃-C₇键的二环倍半萜或三环倍半萜。

同样地，本发明的多肽能够从FPP形成红没药基阳离子并且能够进一步生成FPP的C₂和C₇碳原子之间的键以生成具有C₂-C₇键的二环倍半萜或三环倍半萜。

术语“能够合成”化合物，例如特定的倍半萜和术语“萜合酶活性”，优选“倍半萜合酶活性”指的是本发明的多肽以及编码这些多肽的核酸，从至少一种起始化合物能够合成在此提到的萜，优选倍半萜和最优选的倍半萜化合物，该起始化合物优选脂肪族的焦磷酸酯萜前体。优选地，合成的能力由实施例5给出的酶法评估(enzyme essay)来确定。当特定产物通过这种测定被发现时，所述“能够合成”或“合酶活性”被赋予产物。优选地，脂肪族萜前体为FPP，其以倍半萜碳骨架的标准编号法在下面化学式(I)中给出。OPP指的是焦磷酸酯。

优选地，分离的多肽能够合成至少一种倍半萜，更优选至少一种具有檀香萜或香柠檬烯碳骨架的倍半萜。在优选实施方式中，所述多肽能够从FPP形成红没药基阳离子，并且能够进一步生成FPP的C₃和C₇或C₂和C₇间的键以生成一种或几种二环倍半萜和/或三环倍半萜。

术语“键”指的是单一的共价键。

本发明涉及编码多肽的核酸，以及所述多肽本身，该多肽能够合成具有C₃-C₇键的至少一种二环倍半萜和/或三环倍半萜。优选地，具有C₃-C₇键的倍半萜占由多肽合成的倍半萜产物的至少5wt.％。更优选至少10wt％，甚至更优选至少15wt％，并且最优选至少20wt％的由所述多肽产生的倍半萜由具有C₃-C₇键的倍半萜组成。对于本发明来说，倍半萜合酶的倍半萜产物分布的量优选通过应用实施例5中详述的步骤来确定(酶法测定，产物的提取和GC)。

因此，本发明涉及能够形成具有C₃-C₇键的以下化学式(II)和/或化学式(III)的化合物的分离的多肽，

其中R₁、R₂、R₃、R₄相互独立地为C₁～C₂₀的直链或支链烷基或链烯基，和其中R₁和R₂和/或R₃和R₄可形成双键而取代两个单独的单键。

优选地，R₁、R₂、R₃、R₄相互独立地为C₁～C₁₅的直链或支链烷基或链烯基，更优选C₁～C₁₀，最优选C₁～C₈。

具体地，本发明的多肽能够形成以下化学式(IV)，化学式(V)和/或化学式(VI)的化合物，

其中R₁、R₂、R₃、R₄如上定义。

优选地，在化学式(IV)和化学式(VI)中，R₁和R₂中的一个为C₁-C₅的烷基，另一个为C₂-C₈的链烯基。另外化学式(VI)中的R₃优选为C₁-C₅，更优选为C₁-C₃烷基。优选地，在化学式(V)中，R₃和R₄与以上化学式(IV)中R₁和R₂的定义相同。

本发明涉及编码多肽的核酸，和多肽本身，该多肽能够形成至少一种具有C₂-C₇键的倍半萜。

根据本发明的优选实施方式，具有C₂-C₇键的倍半萜占由所述多肽合成的倍半萜产物的至少5wt.％。更优选至少10wt％，甚至更优选至少15wt％，和最优选至少20wt％的由所述多肽产生的倍半萜由具有C₂-C₇键的倍半萜组成。优选地，该倍半萜为香柠檬烯和/或其异构体(优选为立体异构体)中的一种。

根据本发明的实施方式，本发明涉及能够形成以下化学式(VII)和/或化学式(VIII)的具有C₂-C₇键的化合物的分离的多肽，

其中R₅和R₆与以上R₁和R₂的定义相同。优选地，R₅为甲基和R₆为C₂-C₁₀链烯基，反之亦然。

优选地，可能存在于上述R₁、R₂、R₃、R₄、R₅或R₆残基之一的至少一种链烯基为4-甲基-3-戊烯基，而另一连接到相同碳原子上的残基为甲基。

能够合成以上化学式(II)，化学式(III)，化学式(IV)，化学式(V)，化学式(VI)，化学式(VII)和/或(VIII)的化合物的多肽优选为具有氨基酸序列SEQ ID NO：5的多肽或其多肽变异体。

具有C₃-C₇键的倍半萜为檀香萜和其立体异构体，具体例如(+)-epi-β-檀香萜，(-)-β-檀香萜，(+)-β-檀香萜(三者都为二环)，和(+)-α-檀香萜，和(-)-α-檀香萜(两者都为三环)。

具有C₂-C₇键的倍半萜为包括其立体异构体的香柠檬烯，具体例如顺式-α-香柠檬烯，反式-α-香柠檬烯，反式-β-香柠檬烯和顺式-β-香柠檬烯。

最优选地，本发明的多肽能够合成重现于附图中的化合物。

另一方面，本发明提供了能够合成檀香烯，香柠檬烯和/或红没药烯的分离的多肽。

在优选的实施方式中，本发明提供了能够合成(+)-epi-β-檀香萜，反式-α-香柠檬烯，顺式-α-香柠檬烯，β-红没药烯和/或反式-γ-红没药烯的分离的多肽。

优选地，所述多肽能够合成(+)-epi-β-檀香萜，反式-α-香柠檬烯，顺式-α-香柠檬烯，β-红没药烯和/或反式-γ-红没药烯中的任一种或全部。更优选，该多肽能够合成它们中的至少一种，最优选该多肽能够合成(+)-epi-β-檀香萜，反式-α-香柠檬烯和/或顺式-α-香柠檬烯。

在此使用的术语“多肽”指的是一类多肽或肽片段，其中含有本申请鉴定出的氨基酸序列，以及更小的片段。

“多肽变体”这里指的是完全与天然多肽同源的多肽，但是其氨基酸序列因为一处或多处缺失、插入或取代而不同于本发明任一核酸所编码的多肽。

本发明的所述多肽和多肽变体优选具有萜合酶活性。更优选它们具有倍半萜合酶活性。

变体可以包括保守取代序列，即一特定氨基酸残基被一具有类似理化特性的残基所取代。保守取代的实例包括用一个脂肪族残基取代另一个脂肪族残基，例如，Ile、Val、Leu或Ala之间相互取代，或者用一个极性残基取代另一个极性残基，例如在Lys和Arg；Glu和Asp；或Gln和Asn之间相互取代。参见，Zubay，Biochemistry，Addison-Wesley Pub.Co.，(1983)。这类取代的效果可以用取代打分矩阵(substitution score matrices)来计算，如Altschul，(J.Mol.Biol.219：555-65，1991)中所述的PAM-120、PAM-200和PAM-250。其他这类保守取代，例如具有近似疏水特性的完整区域的取代，已为本领域熟知。

天然生成的肽变体也包含在本发明范围之内。这种变体的实例是由于可变mRNA剪接事件或者本申请所述多肽的蛋白水解切割而得到的蛋白质。蛋白水解引起的变化包括，例如，在不同类型宿主细胞中表达时，由本发明序列编码的多肽由于蛋白水解除去了一个或多个末端氨基酸而导致N-或C-末端的差异。

本发明倍半萜合酶的变体可以用于实现酶促活性的增强或减弱，区域化学(regiochemistry)或立体化学的变化，或者底物利用或者产物分配的改变。此外变体可被制备使其具有至少一种经改变的特性，例如对于底物的亲和力，一种或多种想得到化合物的产量的改进的特异性，不同的产物分布，不同的酶促活性，酶反应速率的增加，在特定环境(pH、温度、溶剂等等)中的更高活性或稳定性，或者在想要的表达系统中的改进的表达水平。变体或位点直接突变体可以通过现有技术已知的任何方法来生成。如上所述，本发明提供了例如来自岩兰草植物中的重组的和非重组的，分离的并纯化的多肽。天然多肽的变体和衍生物能够通过分离其它或相同植物品系或物种的天然发生的变体(或者变体的核苷酸序列)来获得，或者通过对编码天然萜合酶的核苷酸序列进行人工规划突变获得。天然氨基酸序列的改变可通过多种传统方法中的任一种完成。

在本发明的多肽的氨基和羧基末端由另外的肽序列的融合产生的多肽变体可被用于增强多肽的表达，在期望的环境或表达系统中利于蛋白的纯化或改进多肽的酶促活性。这种另外的肽序列例如可为单一的肽。因此，本发明包含本发明的多肽的变体，例如通过与其它寡肽或多肽和/或连接到信号肽上的多肽融合获得的那些变体。

因此，在实施方式中，本发明提供了制备具有期望的萜合酶活性的多肽变体的方法，该方法包含以下步骤：

(a)从由SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3组成的组中的核酸或者含有上述核苷酸序列的核酸中选择任一种核酸；

(b)修饰所选择的核酸以获得至少一种突变核酸；

(c)用突变核酸序列转化宿主细胞以表达由突变核酸序列编码的多肽；

(d)筛选多肽以获得具有至少一种经改变的特性的功能多肽；和

(e)非强制性选择地，当多肽不具有期望的变体萜合酶活性时，重复(a)～(d)的步骤直至得到具有期望的变体萜合酶活性的多肽为止(＝DNA改组)。

提供多肽变体的该方法适合于从由突变核酸池编码的多肽中筛选具有期望特性，如活性参数的功能化多肽。在步骤(a)中，可以选择任何本发明的核酸。

随后，在步骤(b)中，可生成大量的突变核酸序列，例如通过随机诱变，位点特异性诱变或DNA改组方法。基因改组的详细的步骤可在Stemmer，W.P.(1 994)DNA shuffling by random fragmentation andreassembly：in vitro recombination for molecular evolution.Proc Natl Acad SciUSA.91(22)：10747-1075中发现。总之，DNA改组指的是在体外已知序列的随机重组的方法，其包括选择至少两种核酸用于重组。例如突变能够通过合成含有突变序列的寡核苷酸被引入特定座位，与能够连接到天然序列片段的限制性位点侧面相连。连接之后，得到的重建的序列编码具有期望的氨基酸插入、置换或缺失的相似体。另外，可使用寡核苷酸直接位点特异性诱变步骤提供改变的基因，其中预先确定的密码子可通过置换、缺失或插入来改变。

因此，SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中的任一种可与选自SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中任一种的不同序列进行重组，并/或与例如从不同于岩兰草的生物体中分离出来的其它编码核酸的萜合酶进行重组。因此，突变核酸可被获得和分离，其可根据例如本实施例公开的标准步骤被用于转化宿主细胞。

在步骤(d)中，在步骤(e)中获得的多肽被筛选用于得到经改变的特性，例如期望改变的酶促活性。期望的酶促活性(为该活性而筛选表达的多肽)的实例包括增强或减弱的酶促活性，其由K_M或V_max值度量，例如改变的区域化学或立体化学，改变的底物利用或产物分布。酶促活性的筛选可根据本领域的技术人员熟知的步骤以及在本实施例中公开的步骤来实施。

步骤(e)提供了步骤(a)～(d)方法的循环，优选其平行进行。因此，通过生成显著量的突变核酸，可同时用不同的突变核酸将许多的宿主细胞转化，使较多数量的多肽进行随后的筛选。因此获得期望的多肽变体的机会随技术人员意愿增加。

在实施方式中，本发明提供了制备编码具有萜合酶活性的多肽变体的核酸的方法，该方法包括上述的步骤(a)～(e)并且还包含以下步骤：

(f)当具有期望变体萜活性的多肽被鉴定出来时，获得在步骤(c)中得到的突变核酸，其被用于转化宿主细胞以表达步骤(c)和步骤(d)之后的变体萜合酶。

多肽变体同样包括具有与含有SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5和/或SEQ ID NO：6的氨基酸序列的任一多肽有特定最小序列同一性的多肽。

在实施方式中，分离的多肽含有与SEQ ID NO：4有至少50％的氨基酸序列同一性并且具有萜合酶活性的氨基酸序列。优选地，分离的多肽含有与SEQ ID NO：4有至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％并且最优选95％的序列同一性的氨基酸序列。

在实施方式中，分离的多肽包含与SEQ ID NO：5有至少76.8％的氨基酸序列同一性并且具有萜合酶活性的氨基酸序列。优选地，分离的多肽含有与SEQ ID NO：5有至少78％、79％、80％、85％、90％、95％和最优选97％的序列同一性的氨基酸序列。

在实施方式中，分离的多肽含有与SEQ ID NO：6有至少49％的氨基酸序列同一性并且具有萜合酶活性的氨基酸序列。优选地，分离的多肽含有与SEQ ID NO：6有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％并且最优选97％的序列同一性的氨基酸序列。

优选地，所述多肽主要由SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5或SEQID NO：6的氨基酸序列组成。

另一方面，本发明提供了含有本发明核酸的载体。

“载体”在这里包括任何重组载体，包括但不限定为病毒载体、噬菌体和质粒。技术人员能够根据表达系统选择合适的载体。在实施方式中，所述表达载体包括编码可操作地连接到调节序列、mRNA核糖体结合位点、以及调控转录和翻译起始和终止的合适的序列等的多肽的cDNA序列，该调节序列例如为转录启动子、操纵基因或增强子。当调控序列与本发明的cDNA序列功能性相连时，那么核苷酸序列就是“可操作地连接”。

本发明的载体可被应用于制备遗传修饰的宿主生物体和/或细胞的方法，应用于包含本发明核酸的宿主生物体和/或细胞，以及应用于生产或生成萜合酶的方法，以下将进一步给出。

一方面，本发明提供了生成萜合酶的方法，该方法包括在有利于所述萜合酶生产的条件下对经修饰以含有至少一种核酸序列的宿主生物体和/或细胞进行培养，其中所述至少一种核酸为本发明的核酸。

例如，生产萜合酶的方法包括步骤：

(a)选择不表达本发明的核酸的宿主生物体和/或细胞；

(b)转化所述生物体使其表达本发明的核酸；

(c)在有利于由所述核酸编码的萜合酶生产的条件下培养该生物体。

本发明同样提供了生产萜合酶的方法，该方法包括步骤：

(a)选择不表达任何本发明的核酸的宿主生物体和/或细胞；

(b)转化所述生物体使其以较高的量表达本发明权利要求1～3或12的任一的核酸；

因此，另一方面，本发明提供了经转化以含有本发明核酸的重组宿主生物体和/或细胞。宿主生物体可以是单细胞或多细胞生物体，但为非人类生物体。宿主例如可为多细胞生物体的细胞。优选地，宿主生物体为细菌，例如大肠杆菌(E.coli.)。优选地，宿主生物体可以异源地包含本发明的核酸。

另一优选的宿主生物体包括真菌类，优选酵母，最优选酿酒酵母(Sacharomyces cerevisiae)。用于本发明多肽的表达的合适的宿主生物体包括较高级的真核细胞，优选植物。优选地，植物为属于茄科或唇形科，更优选烟草类。例如，合适的宿主细胞为植物细胞。

一方面，本发明提供了表达本发明多肽的重组宿主生物体或细胞。优选地，该宿主生物体经转化以比未经如此转化的相同生物体高的量表达多肽。

术语“经转化”指的是将宿主进行遗传工程改造使其含有一个、两个或多个本发明任意的核酸的拷贝。

优选地，术语“经转化”涉及异源表达本发明多肽和/或由本发明核酸编码的多肽的宿主。

因此，在实施方式中，本发明提供了经转化的生物体，其中本发明的多肽以比未经如此转化的相同生物体高的量被表达。

现有技术中公知几种方法用于生成转基因重组宿主生物体或细胞，如植物、酵母、细菌或高级真核生物体的细胞培养物。例如，适用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的克隆和表达载体的描述参见，例如，Pouwels等的Cloning Vectors：A LaboratoryManual，Elsevier，New York，(1985)和前面列举的Sambrook等的文献。

具体的高级植物和/或植物细胞的克隆和表达载体是技术人员可以得到的，见例如Schardl等的(1987)Gene 61：1-11。

转化宿主生物体的方法，例如生产转基因植物，修饰宿主生物体或细胞使其包含转基因核酸(例如本发明的核酸)，为技术人员所熟知。对于生产转基因植物，如通用的方法包括：植物原生质体的电穿孔、脂质体介导的转化、土壤杆菌介导的转化、聚乙二醇介导的转化、粒子轰击、植物细胞的显微注射和应用病毒的转化。

在实施方式中，转化的DNA被整合到非人类宿主生物体和/或细胞的染色体中，从而得到稳定的重组体系统。现有技术中任何已知的染色体整合方法可以应用于本发明的实践中，包括但不限定为重组酶介导的盒式交换(RMCE)，病毒位点特异性染色体插入，腺病毒法和前核注射。

另一方面，本发明提供了生成萜类化合物的步骤和/或方法。

因此本发明提供了生成至少一种萜类化合物的方法，该方法包含：

(a)将至少一种脂肪族的焦磷酸酯萜前体与至少一种本发明的多肽或由任一本发明的核酸编码的多肽接触，和

(b)非强制性选择地，分离步骤(a)中产生的至少一种萜类化合物。

此外，本发明提供了一种生成至少一种萜类化合物的方法，该方法包括：

-在有利于萜类化合物生产的条件下培养非人类生物体，该生物体经转化以表达或递增表达由权利要求1～3中任一项的核酸编码的多肽或权利要求4的多肽；和

-非强制性选择地，从该非人类生物体中分离至少一种萜类化合物。

根据本发明的优选实施方式，该方法还包括步骤：在有利于萜类化合物生产的条件下培养所述生物体的步骤之前，用重组核酸转化非人类生物体以表达或递增表达由权利要求1～3中任一项的核酸编码的多肽或权利要求4的多肽。

优选地，该至少一种萜类化合物为本发明说明书中公开的萜类化合物。更优选地，所述方法适合于生成化学式(I)～(VII)的至少一种环状的萜。

生成至少一种萜类化合物的方法包含将至少一种脂肪族的焦磷酸酯萜前体与至少一种本发明的多肽接触的步骤。例如，以上用于生成萜合酶方法中获得的多肽可被使用。根据标准蛋白或酶的提取技术，所述多肽从表达本发明核酸的宿主生物体中被提取出来。当宿主生物体是向培养基中释放本发明多肽的单细胞生物体或细胞时，可简单地从培养基中收集所述多肽，例如通过离心法，非强制性选择地通过洗涤步骤和悬浮于合适的缓冲溶液中。

当宿主生物体是在细胞中积聚本发明多肽的植物或单细胞生物体或细胞时，可通过细胞的破裂或溶解获得所述多肽并且从细胞的溶解产物中提取所述多肽。

然后在最佳的pH和温度下将分离的多肽悬浮于缓冲溶液中。如果合适的话，为了优化酶促活性可添加盐、BSA和其它种类的酶的辅因子。

萜前体可被添加到多肽的悬浮液或溶液中，接下来在最佳的温度如30℃下孵育。孵育后，所述萜类化合物可从孵育溶液中通过标准分离步骤如溶剂萃取和蒸馏而被分离出来，优选在从溶液中除去多肽后进行。

在生成至少一种萜类化合物的方法的一个步骤中，在有利于萜类化合物生产的条件下培养宿主生物体或细胞。因此，当所述宿主为转基因植物时，提供了最佳的生长条件，例如最佳的光照、水和营养条件等。当宿主为单细胞生物体时，有利于萜类化合物生产的条件可包含向宿主的培养基中添加合适的辅因子。另外可选择被证明对萜类化合物合成最优的培养基。外部条件例如最佳的pH和温度通常在给定的表达系统中也是有利于萜类化合物生产的。

本申请中提及的所有的文献都被并入作为公开和描述与文献列举的方法和/或材料相关的参考文献。

以下的实施例目的是举例说明本发明而不限定其范围。

实施例

实施例1

岩兰草根材料，mRNA的分离和cDNA的合成

岩兰草植物从植物苗圃(‘La Compagnie des Plantes Australes’，LesAvirons，The Réunion Island，France)中获得。该植物在Lullier Agronomyresearch Station(瑞士)的温室的罐子中培养并且通过划分6个月到1年大小进行生长繁育。在温室条件下，1～3周后移植的岩兰草切口开始发芽并且培养一年后根的体积通常增至三倍或四倍。

为了收获根部，将所述植物从罐子中挖出并且用自来水冲洗。根部的倍半萜含量如下计算：将根切成小块或用研钵和碾槌在液氮中碾碎并且用二乙醚或戊烷抽提；浓缩后，提取物用GC和GC-MS分析。在不同的生长阶段收获从母体植株裂口移植之后获得的植物：从具有活跃的消耗的根系统的植物(移植后4～6个月)到具有良好发达的密集根系统的植物(移植后1～2年)。岩兰油的倍半萜特性在所有的被分析的根中被发现并且岩兰酸是主要成分。

对于克隆试验，使用移植后大约6个月获得的幼嫩的植物。该根从叶子上切下并在液氮中冷冻。首先使用Waring搅切器将它们在液氮中粗略的切碎，然后使用研钵和碾槌将其碾成细的粉末。根据以下厂商的指示使用Invitrogen的Concert^TM植物RNA试剂提取总RNA。RNA的浓度从260nm的OD值估算出来并且RNA的完整性通过在琼脂糖凝胶上检验核糖体RNA带的完整性进行评估。通过oligodT-纤维素亲和色谱法根据制造商的指示使用FastTrack

2.0mRNA分离试剂盒(Invitrogen)将mRNA从总RNA中纯化出来。mRNA的浓度从260nm的OD值估算出来并且一部分置于琼脂糖凝胶上检验mRNA池的分布规模。

根据制造商的指示从1μg的mRNA中应用Marathon^TM cDNA扩增试剂盒(Clontech)制备接头连接的双链cDNA。部分cDNA库被置于琼脂糖凝胶上评估质量和规模分布。

实施例2

来自于岩兰草根的编码倍半萜合酶的cDNA的片段的分离

使用特定植物的倍半萜合酶核苷酸序列的简并引物扩增编码倍半萜合酶的cDNA的片段。

倍半萜合酶特定的核苷酸序列已经从植物倍半萜合酶氨基酸序列的比对(WO 04/031376)中预先被设计好。从植物倍半萜合酶氨基酸序列中的三个保守区域设计六条引物(四条正向的和两条反向的)。分别为TpsVF1、TpsVF2、TpsCF1、TpsCF2、TpsVR3和TpsCR3(WO 04/031376)。

另外，对岩兰草的倍半萜合酶核苷酸序列设计一系列寡核苷酸使其具有改良的特异性。从不同植物中分离出来的倍半萜合酶的序列比较显示了在种系发源关系上高的序列同源性。从分类学关联物种的萜合酶中这些序列同源性很高并且不涉及功能的特化(酶促活性)。因此基于从与岩兰草有关的植物物种中获得的倍半萜合酶的序列的比对，我们设计新的倍半萜合酶特定引物。岩兰草是禾本科植物并且属于单子叶植物纲(Liliopsida)。来自单子叶植物(检索序号为AAC31570的来自油椰子(Elaeis oleifera)，检索序号为BAC99549、BAC99543、AAR01759、BAD03024、NP_908798、BAC20102、AAR87368的来自于稻(Oryza sativa)和检索序号为AAG37841、AAS88575、AAS88574、AAS88573、AAS88572、AAS88571的来自于玉米(Zea mays))的倍半萜合酶的氨基酸序列使用ClustalW[Thompson，J.D.，Higgins，D.G and Gibson，T.J.(1994)CLUSTAL W：improving the sensitivity ofprogressive multiple sequence alignment through sequence weighting，positionspecific gap penalties and weight matrix choice.Nucleic Acids Res.22，4673-4680]进行比对并且选择所有序列中的保守区域。从这些区域中，使用在万维网[http://blocks.fhcrc.org/blocks/make_blocks.html和http://blocks.fhcrc.org/blocks/codehop.html]上可得的计算机程序实现的CODEHOP strategy[Rose T.M.，Schultz E.R.，Henikoff J.G，Pietrokovski S.McCallum C.M and Nenikoff S.(1998)Consensus-degenerated hybridoligo-nucleotide primers for amplification of distantly related sequences.NucleicAcids Research 26(7)，1628-1635]来设计引物。设置该程序的参数以使设计引物具有11～13个碱基的简并核心，256的最大的简并性(由每一种引物表示的不同序列的数目)和约60℃的退火温度。使用单子叶植物玉米的密码子的用法。使用该方法，从五个保守区域中设计出四条正向引物和两条反向引物(表1)。

表1：单子叶植物倍半萜合酶特定引物

SEQIDNO	引物名称	序列
SEQIDNO	引物名称	序列	15	Tps_monocot_F1	5’-CGG TTC TAC CTG CTG CGG mar mab ggn ta-3’R F Y L L R K N G YQ QH
16	Tps_monocot_F2	5’-CC AGG TCC CTG CTG ACC ytn tay ran gc-3’T R S L L S L Y N AED	15	Tps_monocot_F1
16	Tps_monocot_F2		17	Tps_monocot_F3	5’-GCC GTG CTG GAG CTG GCC aar ytn ray tty-3’A V L E L A K L N FD
18	Tps_monocot_F4	5’-CGG GAC CGG ATC GTG GAG rhn yay tty tgg-3’R D R I V E E Y F WM HAC	17	Tps_monocot_F3
18	Tps_monocot_F4		19	Tps_monocot_R1	3’-ctr ctr wan awr ctG TGG GTG CCG TGG TGG-5’D D M F D T H G T TI YF
20	Tps_monocot_R2	3’-ctr ctr trn awr ctG TGG GTG CCG TGG TGG-5’D D M F D T H G T TI YT	19	Tps_monocot_R1

对于表1中的每一种引物，给出了其核苷酸序列并且在序列比对中显示了相应的氨基酸序列。核苷酸序列的简并性使用IUPAC的单字母编码的方式表示。

这些引物应用在从岩兰草根中提取的总RNA的RT-PCR试验中。

在所有试验中，反转录在60℃下按照制造商所述使用岩兰草根总RNA、oligo(dT)₂₀引物和Thermoscript^TM(Invitrogen)反转录酶进行。

PCR条件适合于两套引物。使用Platinum

TaqDNA聚合酶(Invitrogen)，植物倍半萜合酶特定引物进行PCR反应。使用正向引物TpsVF1、TpsVF2、TpsCF1和TpsCF2与反向引物TpsVR3、TpsCR3和dTadaptor引物(表2)的不同的可能组合进行第一轮PCR，所述PCR混合物含有5μL 10X PCR反应缓冲溶液(invitrogen)、1.5mM MgCl₂、0.2mM dNTPs、200nM正向引物、200nM反向引物、0.4μL(2单位)Platinum

Taq DNA聚合酶、2μL的来自上述反转录的cDNA并加蒸馏水至最终体积50μL。该反应在Eppendorf Mastercycler梯度热循环仪和以下的循环条件下进行：95℃下2分钟；35个循环的94℃下45秒，42℃下45秒，72℃下2分30秒；72℃下最终延伸10分钟。第二轮PCR以与第一轮PCR相同的条件进行，使用5μL的第一轮PCR混合物为模板和相同的引物或嵌套引物。PCR产物的大小在1％的琼脂糖凝胶上测定。在几种RT-PCR中，两种产生了期望片段：TpsCF1+dTadaptor的第一次PCR，接下来进行TpsCF2+TpsCR3的第二次PCR，和TpsCF2+dTadaptor的第一次PCR，接下来进行TpsCF2+TpsCR3的第二次PCR。将条带从凝胶中切离，使用QIAquick

凝胶提取试剂盒(Qiagen)进行纯化并在pCR

2.1-TOPO载体中使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)克隆。插入的cDNA进行DNA测序并且序列在GenBank的非冗余蛋白数据库(NCBI)用BLASTX算法(Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.，andLipman，D.J.(1990)Basic local alignment search tool.J.Mol.Biol.215，403-410)进行比较。比较在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/网站在线进行。序列分析显示了与倍半萜合酶的同源性，并且序列的比较显示出我们得到具有显著序列区别的4个不同的cDNA片段：CA711，CA717，CA782和CA783(图2)。

用单子叶植物的倍半萜合酶特定引物，使用Clontech的Advantage 2聚合酶混合液进行PCR步骤。每种PCR混合物含有5μL Advantage 2的PCR缓冲溶液、200μM dNTPs、200nM每种寡核苷酸引物、2μL的来自上述的反转录的cDNA、1μL的Advantage2聚合酶混合液和蒸馏水至最终体积50μL。下述条件被用于扩增：94℃变性3分钟；15个循环的94℃变性1分钟，第一个循环65℃退火1分钟和以后每个循环减少一度，和72℃延伸2分钟；20个循环的94℃变性1分钟，58℃退火1分钟和72℃延伸2分钟；最后72℃延伸10分钟。不同的PCR采用单子叶植物倍半萜合酶特定正向引物和反向引物可能的组合。第二轮PCR使用5μL的第一次PCR混合物作为模板，以与上述第一轮PCR相同的条件和相同的引物来进行。正向引物和反向引物的组合为TpsmonocotF3+TpsMonocotR1、TpsmonocotF3+TpsMonocotR2、TpsmonocotF4+TpsMonocotR1和TpsmonocotF4+TpsMonocotR2，产生期望大小的扩增子。序列分析和比较显示我们得到了编码三种不同和新的倍半萜合酶的部分cDNA：CA725，CA731和CA733(图2)。

实施例3

通过快速扩增cDNA末端(RACE)方法对编码倍半萜合酶的全长cDNA的扩增

从这些新的cDNA片段(表2)来设计前端特定引物。如下进行3’RACE。首先在60℃使用oligo(dT)₂₀引物，1.5微克的总RNA和Thermoscript^TM逆转录酶在与上述RT-PCR相同的条件进行反转录。使用dTadaptor引物和正向cDNA特定引物进行第一次PCR。最终体积为50μL的PCR混合物中含有0.4μM cDNA特定引物，0.4μM的dTadaptor引物(表2)，每种dNTP各300μM，5μL的10XHotStartTaq

DNA聚合酶缓冲溶液(Qiagen)，2μL的cDNA，0.5μL的HotStartTaq

DNA聚合酶。循环条件为：95℃下15分钟；35个循环的94℃45秒，48℃45秒和72℃2分30秒；和72℃下10分钟。嵌套式PCR使用与以上组成相同的PCR混合物进行，除了以下的修改：使用嵌套式cDNA特定引物和adaptorP引物(表2)，5mL的第一次PCR用作模板，以及退火温度增至60℃。将扩增产物进行测定，亚克隆，并且如上分析它们的序列。3’RACE成功获得CA717和CA733(图3)，而不是其它的cDNA。用Thermoscript^TM和引物CA711_F1和CA711_F2(表2)和嵌套式PCR的低至48℃代替60℃的退火温度的3’RACE试验，允许新的倍半萜合酶cDNA，即CA775的3’末端的非特定扩增。

表2：用于3’RACE和5’RACE的引物

SEQID NO	引物名称	序列(5’～3’)
SEQID NO	引物名称	序列(5’～3’)	27	CA711_F1	CTCACGAGGACGAATAATATTGAAGAAGGTCC
28	CA711_F2	ATTGAAGAAGGTCCTTGGCATTGTTTCC	27	CA711_F1	CTCACGAGGACGAATAATATTGAAGAAGGTCC
28	CA711_F2	ATTGAAGAAGGTCCTTGGCATTGTTTCC	29	CA717_F1	GCTCGGAGTGGTTTACGAGCCCTATTATCC
30	CA717_F2	GATGACAAAGTTCATCGTACTTGCATCCTTGC	29	CA717_F1	GCTCGGAGTGGTTTACGAGCCCTATTATCC
30	CA717_F2	GATGACAAAGTTCATCGTACTTGCATCCTTGC		CA725_F1	CTGCGCCGCCTGCATCGCG
	CA725_F2	GCGCCTGGCGGACTGCAGGGAGG		CA725_F1	CTGCGCCGCCTGCATCGCG
	CA725_F2	GCGCCTGGCGGACTGCAGGGAGG		CA731_F1	CCCTGGGAGGAGTGCTCTCGTTCAC
	CA731_F2	GGATAGTTCTCACCAAAGTTATTGCATTTGCG		CA731_F1	CCCTGGGAGGAGTGCTCTCGTTCAC
	CA731_F2	GGATAGTTCTCACCAAAGTTATTGCATTTGCG	35	CA733_F1	ATGAACGGGGTATGCTATCACCCTCC
	CA733_F2	CACCCTCCATACTCTCATTCCCG	35	CA733_F1	ATGAACGGGGTATGCTATCACCCTCC
	CA733_F2	CACCCTCCATACTCTCATTCCCG		CA775_R	GGTGGAGCATATTTTCAATGATC
	CA775_R1	ATGCACCCGGGAAGGTCTTGAG		CA775_R	GGTGGAGCATATTTTCAATGATC
	CA775_R1	ATGCACCCGGGAAGGTCTTGAG		CA775_R2	GAATCCCAGCTTTCAATGCACTTGG
40	CA717_R	CTCCTCCTCAATCTCATTTGTGG		CA775_R2	GAATCCCAGCTTTCAATGCACTTGG
40	CA717_R	CTCCTCCTCAATCTCATTTGTGG		CA717_R1	GTGCCTTCAAGCATGCTGGAAGATG
	CA717_R2	GTGGTTCGGTCATCCCACCTTTGC		CA717_R1	GTGCCTTCAAGCATGCTGGAAGATG
	CA717_R2	GTGGTTCGGTCATCCCACCTTTGC		CA782_F1	CCAATATTGGTGTATTATGAACAAGAG
	CA782_F2	CAGGCGTGCACGACTGATCCTC		CA782_F1	CCAATATTGGTGTATTATGAACAAGAG
	CA782_F2	CAGGCGTGCACGACTGATCCTC	45	CA783_F1	GCAGCAGGAGGATGTAGAAC
	CA783_F2	CCAAATATTCTTCTTTTAGAATTGGCTTTGC	45	CA783_F1	GCAGCAGGAGGATGTAGAAC
	CA783_F2	CCAAATATTCTTCTTTTAGAATTGGCTTTGC		CA783_F3	GAATTGGCTTTGCAAAATTTTGTTCTCTTGC
	CA775_RB	CCTCACAAACACATCTGGTGATAC		CA783_F3	GAATTGGCTTTGCAAAATTTTGTTCTCTTGC
	CA775_RB	CCTCACAAACACATCTGGTGATAC		CA775_R1B	CAGGGCAACCGTTTCAAGATC
50	CA775_R2B	CACTGACATCAGCAGTCTCAATCTGTGC		CA775_R1B	CAGGGCAACCGTTTCAAGATC
50	CA775_R2B	CACTGACATCAGCAGTCTCAATCTGTGC		CA733_R	GAAGGAGAGGTACTGCACTTTC
	CA733_R1	CCCATCTGCCAATTGCTTC		CA733_R	GAAGGAGAGGTACTGCACTTTC
	CA733_R1	CCCATCTGCCAATTGCTTC		CA733_R2	CATGCACTCTTCAGTGGTACCATATGTGTC
	CA775_R1_marath	GGTGATCCAAGCATAGACGCTCCAATG		CA733_R2	CATGCACTCTTCAGTGGTACCATATGTGTC
	CA775_R1_marath	GGTGATCCAAGCATAGACGCTCCAATG	55	CA775_R2_marath	CGATGAGCTGCAGCCTACTAGCAGTAGTTG
	dTadaptor	AATTCGGTACCCGGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTT	55	CA775_R2_marath	CGATGAGCTGCAGCCTACTAGCAGTAGTTG
	dTadaptor	AATTCGGTACCCGGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTT	57	adaptorP	AATCGGTACCCGGGATCC

基于3’RACE后获得的这三种半全长序列，我们设计了特定的反向引物用于5’RACE。应用Invitrogen的5’RACE系统。对于这一步骤，每种cDNA应用三条引物(一条用于反转录，和两条嵌套引物用于第一和第二次PCR)。反转录部分的步骤如制造商所述适用于高GC含量的转录。使用PlatinumTaq DNA聚合酶(Invitrogen)进行PCR。对于第一次PCR，模板为5μL的dC-结尾的cDNA，并使用cDNA特定引物(表2)和精简的锚定引物(Invitrogen)。循环条件为：94℃2分钟；35个循环的94℃下0.5分钟，55℃下0.5分钟和72℃下2分钟；和72℃下10分钟。对于第二次PCR，模板为5μL的100倍稀释的第一次PCR产物和嵌套式cDNA特定引物(表2)和通用扩增引物(Invitrogen)。第二次PCR的循环条件为：94℃下2分钟；12个循环的94℃下0.5分钟，第一个循环时68℃下0.5分钟和每后一循环减少1℃，和72℃下2分钟；25个循环的94℃下0.5分钟，60℃下0.5分钟和72℃下2分钟；和72℃下10分钟；72℃下10分钟。对扩增产物进行检测、亚克隆并对它们的序列作如上述的分析。

5’末端的扩增成功获得CA717和CA733，并且对于这两个克隆，全长的核苷酸序列可被重建(Vet 717：SEQ ID NO：1；Vet 733：SEQ ID NO：2)。

对于CA775，使用相同方法的第一5’RACE得到了820bp片段的扩增。该序列的分析显示出与CA775的3’RACE产物的60bp的重叠，但显示了5’RACE并不完全以及仍然缺少5’末端的部分。基于获得的5’RACE序列(进一步接近5’末端)设计一套新的引物并且以相同的条件重复5’RACE。这些允许获得额外的100bp但翻译起始密码子仍然缺失。

应用Marathon cDNA合成试剂盒(Clontech)获得的cDNA来设计第三套引物。如制造商所述在Eppendorf Mastercycler梯度热循环仪上用Advantage

2聚合酶混合液进行扩增。第三次5’RACE获得了最终含有起始密码子的额外的100bp的序列并获得了全长的核苷酸序列(Vet 775，SEQ ID NO：3)。

由全长倍半萜合酶编码cDNA(即Vet717、Vet733和Vet775，分别相应于SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6)推导出来的氨基酸序列的比较显示出相对低的同源性(图3)(同一性范围从31％～40％)。在公共序列数据库中发现的最接近的匹配为推定的稻和玉米的倍半萜合酶序列。对于Vet717和Vet775，最接近的序列分别为47％和50％的同一性。Vet733具有与检索序号为AY518310到AY518314(

等(2004)The Plant cell 16(5)，1115-1131)的核苷酸序列编码的玉米的倍半萜合酶序列相对高的序列同源性(76.8％的同一性)。在Vet755的N-末端的序列不同于其它两者并且区别于其它已知的倍半萜合酶：N末端延伸出50个氨基酸并且含有与众不同的基序PAAAASSQQQQ(SEQ ID NO：7)。该N-末端的额外的序列是与众不同的并且与任何已知的肽信号序列都不相似。

实施例4

细菌中来自岩兰草的倍半萜合酶的异源表达

从Marathon cDNA库中使用从RACE获得的序列信息设计的引物CA717_Nde和CA717_Kpn(表3)扩增Vet717的全长的cDNA。使用Pfu聚合酶(Promega)、含有5μl的Pfu DNA聚合酶10X缓冲液、每种dNTP各200μM、每种正向引物和反向引物各0.4μM，2.9单位的Pfu DNA聚合酶和5μl的100倍稀释的cDNA(使用Marathon^TM cDNA扩增试剂盒(Clontech)如上所述制备)以50μl的最终体积进行PCR。热循环的条件如下：95℃下2分钟；30个循环的95℃下30秒、55℃下30秒和72℃下4分钟；和72℃下10分钟。使用QIAquick

凝胶提取试剂盒(Qiagen)在琼脂糖凝胶上纯化和洗提PCR产物，该产物由含有NdeI位点(包括转录起始密码子)和在紧接终止密码子之后的KpnI位点的全长Vet717cDNA组成。该PCR产物用NdeI和KpnI消化并连接到用相同的酶消化的pETDuet-1质粒(Novagen)上。插入片段的测序显示出与RACE产物没有序列差异。

表3：用于表达质粒构建的引物

SE IDNO	引物名称	序列(5’～3’)
SE IDNO	引物名称	序列(5’～3’)	58	CA717_Nde	TACTGACATATGGCCAGCAGCAGTCCTGTCC
59	CA717_Kpn	TTGGTACCTCAACAAGCTCGCACAGAGTTAACGTACATG	58	CA717_Nde	TACTGACATATGGCCAGCAGCAGTCCTGTCC
59	CA717_Kpn	TTGGTACCTCAACAAGCTCGCACAGAGTTAACGTACATG	60	733_Nco	CTAGCCATGGCGCTTCCTGTAGCACATCGTTATTCC
	733_Eco	CGGAATTCAATTGGGTACTGGCTTCACGAATAGTAGTTC	60	733_Nco	CTAGCCATGGCGCTTCCTGTAGCACATCGTTATTCC
	733_Eco	CGGAATTCAATTGGGTACTGGCTTCACGAATAGTAGTTC		775_fusl-f	CACCCCAAGCCCATGGGGAGATATCTTCCTCGGCAACTC
	775_fusl-r	GGAAGATATCTCCCCATGGGCTTGGGGTGAATGTCTG		775_fusl-f	CACCCCAAGCCCATGGGGAGATATCTTCCTCGGCAACTC
	775_fusl-r	GGAAGATATCTCCCCATGGGCTTGGGGTGAATGTCTG		775_fus2-f	GCTCGTTCTTCCATTGACAAGAACTGTGATGGAGTGCATG
65	775_fus2-r	CACAGTTCTTGTCAATGGAAGAACGAGCGGATAAACTCAGG		775_fus2-f	GCTCGTTCTTCCATTGACAAGAACTGTGATGGAGTGCATG
65	775_fus2-r	CACAGTTCTTGTCAATGGAAGAACGAGCGGATAAACTCAGG		775_fus Nco	CTAGCCATGGCCAGCAGCAGTCCTGCTCCTCTG
	775_fus_Eco	CGGAATTCAAATGGGGATCTTAAATGGTTCGGCC		775_fus Nco	CTAGCCATGGCCAGCAGCAGTCCTGCTCCTCTG
	775_fus_Eco	CGGAATTCAAATGGGGATCTTAAATGGTTCGGCC		775_mut_F2	GACAATGACTACTGCAATGGTGACCCTTTTAG
	775_mut_R2	CTAAAAGGGTCACCATTGCAGTAGTCATTGTC		775_mut_F2	GACAATGACTACTGCAATGGTGACCCTTTTAG
	775_mut_R2	CTAAAAGGGTCACCATTGCAGTAGTCATTGTC	70	775_mutlF	CACCCCAAGCCCTTGGGGAGATATC
	775_mutlR	GATATCTCCCCAAGGGCTTGGGGTG	70	775_mutlF	CACCCCAAGCCCTTGGGGAGATATC
	775_mutlR	GATATCTCCCCAAGGGCTTGGGGTG	72	Vet775_Nco	CTAGCCATGGCGAACTGCAGCCTTACTATTTCTGCTACT

然后将质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)细胞(Novagen)中。转化细胞的单一菌落被接种到5ml LB培养基上。37℃孵育5～6小时后，培养物冷却至20℃并且用0.5mM IPTG诱导蛋白的表达。过夜孵育后，通过离心法收集该细胞，悬浮于0.5ml的抽提缓冲液中(50mM MOPSO pH7，5mM DTT，10％甘油)并且超声波降解样本3次每次20秒。细胞碎片通过30分钟18,000g离心并且回收含有可溶性蛋白的上清液。通过SDS-PAGE分析的分析结果显示具有期望分子量的蛋白重组体的生成。

以相同的方式，从Marathon cDNA库中使用引物733_Nco和733_Eco(表3)扩增Vet733 cDNA并以NdeI-EcoRI片段连接到pETDuet-1表达质粒上。通过测序检验其构造。使用这些质粒在BL21(DE3)中的异源表达生成了由SDS-PAGE清晰可见的蛋白重组体。

对于Vet775到pETDuet-1表达质粒中的连接，因为cDNA已经含有两个NdeI和一个NcoI限制性位点(分别在位置603，1483和1020)，为了在末端引入NcoI和EcorI位点和除掉内部的NcoI限制性位点，以两阶段进行扩增，使用重叠延伸PCR方法(Horton，R.M.，Hunt，H.D.，Do，S.N.，Pullen，J.K.and Pease，L.R.(1989)Engineeringhybrid genes without the use of restriction enzymes：gene splicing by overlapextension.Gene 77，61-68)。首先进行两个分别的PCR反应：一个用引物Vet775_Nco(在起始密码子之前引入NcoI位点)和775_mut_F2；第二个使用引物775_mut_R2和775_fus_Eco(在终止密码子之后紧接着引入EcoRI位点)。775_mut_F2和775_mut_R2引物为具有32个核苷酸重叠区域的正向和反向诱变的引物并且允许在cDNA中的位置1020上NcoI识别位点的抑制而不改变蛋白序列(将Ala340的密码子从GCC改变为GCA)(表3)。将来自这两种PCR的产物纯化、组合并用作最终PCR的模板，在该最终PCR中用引物Vet775_Nco和775_fus_Eco扩增全长的突变的Vet775 cDNA。然后该PCR产物连接在pETDuet-1质粒中NcoI和EcoRI限制性位点之间。

另外，为了检测不寻常的Vet775的N-末端序列对大肠杆菌中表达的影响和对酶促活性的影响，我们制造了两个构造，包括：除去Vet775的N-末端部分，并用源自Vet717的等价部分将它们替代。由此得到两个经修饰的cDNA，即Vet775_fus1和Vet775_fus2。在第一个构造中，起始的68个密码子被除去，并用Vet717的24个N-末端密码子替代。在第二构造中，起始的91个密码子被除去，并用Vet717的42个N-末端密码子替代。这些构造通过重叠延伸PCR来生成。对于Vet775_fus1，第一次PCR使用引物775_fus_Nco和775_fus1-r并以pETDuet-1中的Vet717的cDNA为模板进行。第二次PCR使用引物775_fus1-f和775_fus_Eco并以Marathon cDNA库为模板进行。引物775_fus1-f和775_fus1-r含有29个核苷酸(表3)的重叠区域。来自两次扩增的PCR产物被纯化并用作以775_fus_Nco和775_fus_Eco为引物另一PCR的模板。该PCR产物用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)被连接到pCR2.1-TOPO载体上，该PCR产物由204个5’-末端碱基对被Vet717的72个5’-末端碱基对替代并且与NcoI和EcorI限制性位点侧面相连的Vet775的开放式阅读框组成。来自三个分别克隆的插入物进行全长测序以确定没有序列的变异。然后将质粒用作重叠延伸PCR的位点定向突变模板以除去在核苷酸序列中位置72和888的两个NcoI位点。如上所述进行最后的修饰，使用诱变的引物对775_mut_F1和775_mut_R1(改变Pro24的密码子使其从CCA变到CCT)(表3)以及775_mut_F2和775_mut_R2(如上所述)生成三个重叠片段。PCR产物最终被连接到pETDuet-1质粒的NcoI和EcoRI限制位点之间。编码Vet775_fus2的cDNA的构建以相同的方式进行，在第一次PCR中使用引物775_fus2-f和775_fus2-r(表3)以生产由融合到Vet775的核苷酸274～1521上的Vet717的核苷酸1～126组成的cDNA。

所有的这些用于全长或修饰的Vet775的cDNA扩增的PCR都如上所述用Pfu DNA聚合酶进行。

在E.coli BL21(DE3)中进行异源表达，之后通过SDS-PAGE分析，显示出产生了构造Vet775_fus1和Vet775_fus2的蛋白重组体，但是没有见到全长非修饰Vet775的蛋白重组体。

实施例5

倍半萜合酶重组体的酶促活性的特征描述

获得的蛋白重组体使用FPP作为底物对倍半萜合酶活性进行检验。在特氟隆密封的玻璃管中使用50～100μl的粗大肠杆菌蛋白的提取物进行酶法测定，该提取物根据实施例3中给出的步骤(根据表3)，在补以15mM MgCl₂和100～250μM纯化的FPP的最终体积1mL的抽提缓冲液中获得。培养基用1ml的戊烷覆盖并且在30℃下将该管孵育12～18小时。

产生的倍半萜用戊烷抽提两次并且通过前述的GC和GC/MS(WO 04/031376，实施例6)进行分析。

用含有Vet775全长cDNA或两个Vet775的融和蛋白的表达质粒转化的大肠杆菌的培养物获得的蛋白提取物进行的酶法测定，没有发现任何倍半萜合酶活性。这种明显的失活的原因仍然不确定。

Vet717蛋白重组体(SEQ ID NO：4)产生了主要的倍半萜烃和几种次要产物(图4)。主要产物的质谱与环洒剔烯(图1中的(6))相符并且主要产物的保持时间与环洒剔烯标准的保持时间以非极性的柱(SPB-1，Supelco)和极性柱(InnoWax，Hewlett-packard)方式呈列排布。环洒剔烯或其衍生物从未在岩兰草油中被鉴定出来。在其它被鉴定出来的倍半萜中，氧化的环

莰烷(cyclocopacamphane)倍半萜(图1)结构上最接近于环洒剔烯。环

莰烯(7)是环洒剔烯的立体异构体(Kido F等(1969)Tetrahedron letters37，3169-3172)，有趣的是环

莰烯的氧化衍生物以相对较多的量存在，在岩兰油中达4％(Homa等(1970)Tetrahedron letters 3，231-234；Weyerstahl等(2000)Flavour Frag.J.15，61-83；Weyerstahl等(2000)FlavourFrag.J.15，153-173；Weyerstahl等(2000)Flavour Frag.J.15，395-412)。

为了将Vet717的产物与环洒剔烯区分开，用了手性GC色谱仪使用Megadex-5(MEGA s.n.c.，Legnano，Italy)毛细柱(12m，0.25mm，0.25μm)，起始的炉的温度设置为60℃保持2分钟。随后以5℃/min的等变率升至150℃和第二次以20℃/min等变率升至270℃。这些条件下，环洒剔烯具有5.60分钟的保持时间并明显地从具有5.75分钟保持时间的Vet717产物中分离出来。

Vet717酶还产生了几种次要产物，基于MS，其具有相关结构如荜澄茄烷或胡椒烷的骨架。

Vet733蛋白重组体(SEQ ID NO：5)不产生主要产物但却有至少7种不同的倍半萜烃的混合物(图5)。基于MS光谱和公开数据的保持力指标的比较，下述化合物可被鉴定出来：(1)顺式-α-香柠檬烯，(2)反式-α-香柠檬烯，(3)epi-β-檀香萜，(4)β-红没药烯，和(5)反式-γ-红没药烯。它们通过与含有β-红没药烯、反式-γ-红没药烯、反式-α-香柠檬烯和顺式-α-香柠檬烯的企业标准(house standard)比较被进一步确认。Epi-β-檀香萜的结构通过与红没药提取物的GC-MS分析比较而确认。

由Vet733产生的倍半萜烃或这些倍半萜的衍生物未曾从岩兰油中分离出来。可能是Vet733在岩兰草的根中以较低的量表达并且由这种酶产生的倍半萜以低于能被检测的水平存在。某些Vet733、(Z)-(+)-epi-β-檀香醇和(Z)-α-反式-香柠檬醇(图1)的产物的醇衍生物已经被描述作为檀香油的香味的重要的贡献者(DE 3205 320；Frater，G.，Bajgrowicz，J.A和Kraft，P.(1998)Fragrance Chemistry.Tetrahedron 456，7633-7703.)。岩兰草的香味是非常复杂的，除此之外，与檀香相似的气味已经用来描述这种油。因此檀香方面特征可能与Vet733产物的痕量氧化衍生物存在有关。

Vet733产生的倍半萜的形成机制流程图解释了形成的多种产物的关系(图6)。每一轮循环从FPP(图6的(16))的异构化开始至橙花醇-焦磷酸酯(NPP)(C₂-C₃键的旋转)，接下来环化得到红没药基阳离子(17)。环化作用可以通过几种机制进行。β-红没药烯和反式-γ-红没药烯可通过分别使C₆或C₁₄发生去质子作用而形成。去质子作用之后的C₂-C₇关闭生成顺式-α-香柠檬烯和反式-α-香柠檬烯。在C₁₅的Wagner-Meerwein重排和去质子作用之后的C₃-C₇关闭生成了epi-β-檀香烯。Vet733倍半萜合酶是第一个被克隆的倍半萜合酶，其能够催化FPP到红没药基阳离子的环化和随后的到香柠檬烷和檀香烷骨架的环化。

序列表

<110>弗门尼舍有限公司

米歇尔·沙尔克

<120>新颖的倍半萜合酶

<130>6500-EUR-PCT

<150>EP 05105381.7

<151>2005-06-17

<160>72

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1647

<212>DNA

<213>岩兰草(Vetiver zizanoides)

<400>1

atggccagca gcagtcctgt ccctctggtc acacaggtgc agcgcaagcc acagacattc 60

accccaagcc catggggtga cttcttcctc caccacgtcc catgcactcc atcacagttc 120

ttgtcaatga aggagagggc acagaggaag aaggaagaag tgaggcagat tatactagaa 180

aactttgcct cctccaatct ggtacggaag cttgagctcg ttgacacgct gcaacggatc 240

ggggtggact accactacaa ggaggagatc gataatttgc ttcactctat cttcgacgac 300

aaggatggag gttctgacaa tctctacatc acctcgttga ggttctattt gctcaggaag 360

catgggtatg gagtctcttc agatgtgttt gagaaattta gggatgagca agggaacatt 420

tcaagtgatg atatcagctg cttgctgatg ttgtatgatg ctgcgcatct gagaactcat 480

ggggaggaga tacttgacaa catcatcact ttcaacaaga gccatctcca atctctactg 540

ctggaaaatt tggagccaga gctacgagag gaagtgcagt gcactttgga gacacctcgg 600

ttcaggcggg tcaagagagt ggaggcgagg cgctacatct ccgtatatga gaagaatact 660

acacgggatg cgaccatact ggagtttgcg aaactagact acaacatctt gcaagctatc 720

tactgtgatg agttgaaaga act acagta tggtggaagg atttccaatc acaaacagat 780

ctgagctttg cacgggacag aatggtggag ctacattttt ggatgctcgg agtggtttac 840

gagccctatt atccatattc aagaataatg atgacaaagt tcatcgtact tgcatccttg 900

ctcgatgacc tttatgacag ctatagcacc acagaggaga gcaatgcctt catcgcagcc 960

atgcaaaggt gggatgaccg aaccacagaa catcttccag catgcttgaa ggcactcttc 1020

atcaacatag taaaaaccac aaatgagatt gaggaggagt taaaacttat gaaaaataag 1080

catgctgatt tgatcaaaag actggtgatt gacactgcca aattctacca tgctgaggtt 1140

gaatggcgtg atcaacacta cataccaact gatatagaag aacatctcca aatttccacc 1200

cgtagcagtg tttgtatgca gataacaaac cttgcgctca tttcacttgg agaggtgact 1260

actaggaaag atgtcgattg ggctctcacc ttccccaaaa tcatcagagc tgcatgtatc 1320

gtggggcgcg tcggcaatga catcgtgtca cacgagcgtg aacaaacttc ggagcatgtc 1380

ggatccacgg tgcaaacttg catgaagcaa tatggggtga cagtagagga agccaatgaa 1440

aagcttagag ttataatcga agaagcatgg atggacatcgt tgaagaatg cctcgagcaa 1500

aaacgtccca tggcactttt agagacagcg gtcaacgttg caagaacaat ggatttcatg 1560

tacaagcgtg aagatgcata caccctctca ttcagcctca aggatgttat tgcttccatg 1620

tacgttaact ctgtgcgagc ttgttga 1647

<210>2

<211>1641

<212>DNA

<213>岩兰草(Vetiver zizanoides)

<400>2

atggcgcttc ctgtagcaca tcgttattcc agcgaggcag aggagctacg agaggctact 60

accttccacc caagcctatg gggcgatttc ttcctgactt accagccgcc aactgcagct 120

cagcaagcat acatggaaga acgagctgag gtattaagag aagatgttag gaagattttg 180

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ctggattact actacgagaa tgagatagac aagttactgc accgtattta caactctgat 300

tacaatgata aggatctaaa cttagtttca ctgcggtttt atcttcttcg aaagaatggt 360

tacgatgtgt catcagatgt atttctaagc ttcaaaacag atgaaggggg ctttgcttat 420

ggtgacacga taagcttgtt aagcttatat aatgcagcat atttgaggag acatggagag 480

aaggtactgg atgaagcaat ttcttttact agacgtcgcc ttcaagatat cctcgaactt 540

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gttggaatac tagaagcaag aaattacata cctatttatg agaaagatgc tacagtgaat 660

gaagccatat tggagcttgc gaaactgaat tttaaccttc aacaacttgt tttctgtgaa 720

gagttaaagc attgcacaat gtggtggaag gagttcctag ccaaatcaaa gatgactttt 780

gttagagaca gaatagtgga ggtgtatttc tggatgaacg gggcatgcta tcaccctcca 840

tactctcatt cccgaattat acaaacaaag atcacctctt ttgttacaat aattgatgat 900

atgtttgaca catatggtac cactgaagag tgcatgaaat ttgttgaagc aattggcaga 960

tgggatgaaa gtgcagtacc tctccttcca gagtatatga agggtttcta cttatttctg 1020

ttggacacat ttcattcatt tgaggatgag ttagggccac agaagagtta tcgtgtgctt 1080

tatctaaaac atgctatgga gcgtttggtt cagcagtact acaatgaaat aaaatggcgt 1140

gatgaagact atgtgccaaa aacaatgagt gaacaccttc aagtttcaat ggaaagcatt 1200

gcatgcatcc ctattacatg tgctgcattt gttggaatgg gtgacataat aacaaaggag 1260

acactcgagt ggattttgag ctttcctcaa tttctaatgt cttttggtat atatgtacgc 1320

ctctcaaatg atgtcgcatc aaccatgcgt gaacaaacaa aagaccatag tgcctccact 1380

gtccattgtt acatgaagga acatggaaca acaatgaatg atgcatgcga aaagataaaa 1440

gaacttgctg aagataaatg gaaggacatg ttagaacaat gccttgcact gacagaatta 1500

ccaaaggtca ttccacggac agtgtttgac ttcgcaagaa ccatagttaa tatgtacaag 1560

aatgatcatg atggattcac ttcttcagaa gcactcaaag aaatgataga actactattc 1620

gtgaagccag tacccaattg a 1641

<210>3

<211>1794

<212>DNA

<213>岩兰草(Vetiver zizanoides)

<400>3

atgtggaact gcagccttac tatttctgct actgctgcat cgccgccgct caggcaatgg 60

ccaggcggca tttcatggcg gcggcccagc aggttgcaat gttccgccgc aacaacacgc 120

catgacgatg accttgtcct tgacaacaaa ggcgacaacc gcctgaggga gaacaccggc 180

gccgacattt tccagccatc catctgggga gatatcttcc tcggcaactc caacccagca 240

gcagcagctt catcacaaca acagcagatt cagatggaag aacgagcgga taaactcagg 300

gaagaagtgg ccaaaatgat agcaagttca acaactactg ctagtaggct gcagctcatc 360

gatgcattgg agcgtctatg cttggatcac ctgttcgaag aagagatcgg tgctgcacta 420

gcacagattg agactgctga tgtcagtgac tacgatcttg aaacggttgc cctgtggttt 480

tgtctacttc ggaaacatcg atatatggta tcaccagatg tgtttgtgag gttcaaagat 540

gaagatggag ggtttctagt gaacagtcct aaagacctac tgaaccttta caatgctgcg 600

catatgagga ctcatggaga gataatactt gaggaagccg tactattcag ccagaggcat 660

ttagaaacaa tggtaccata catggaaggg tcattggcac gtgaaataaa atctgcactt 720

gacattcccc tccctagaag acctagaatt tatgagtaca agtattacat ctcaatgtat 780

gagaaagatg gcatggtgga tgagaaggtg ttgcaacttg caaagttgaa ctcaaacatt 840

atgcaactcc atcaccaaca tgagttgggt attgtttcaa ggtggtggaa tgatataaat 900

attgaatcaa ggcttccaca tgttcgagat agactcgtgg agtgctattt gtggatatta 960

ggggtatact acgaaccatg ttattcacga gcccgaataa tattgacaat gactactgcc 1020

atggtgaccc ttttagatga tacttatgat tcttatgcaa ctccagaaga gtgtgaatta 1080

ttcaccaagt gcattgaaag ctgggattca atgggggctc aagaccttcc cgagcgcatg 1140

aaatatggtt tggagaaaat attcgatagt tgtgagatca ttgaaaatat gctccaccaa 1200

gaggagaaat atcgcatttg gtatctaaga caatctataa aagacctggt tataagctac 1260

agcgtggagg taaaaatgct tcaagaagga tacattccaa agtccgttga ggaacatctg 1320

aagctttcac tgataaccgt tggatatccc attttggcat gtgtttcctt cgtcgggatg 1380

catgatatag caacaaagga ttgccttgat tgggtgtcca gtatacctaa aatggtggag 1440

gcactttccg tgattctcag actggtagat gacctcgagt catatgagcg agagcaactg 1500

gtccctcatg ttgcttcgac aatcgatagc tacatgaagg agcacaatgt ctccattgaa 1560

gttgcacgtg agcagatata catactcaaa gaggaatcat ggaaagattt taacaacgaa 1620

tggcttaacc cagacaataa tgtttatcca aagcagttgc tggaacggat gttcaacttg 1680

gcaaggacag cgcagttctt gtataacaaa gaagaaaaat tcacaaacag ccactatcta 1740

aaggataccg tccattcctt gttgttggcc gaaccattta agatccccat ttag 1794

<210>4

<211>548

<212>PRT

<213>岩兰草(Vetiver zizanoides)

<400>4

Met Ala Ser Ser Ser Pro Val Pro Leu Val Thr Gln Val Gln Arg Lys

1 5 10 15

Pro Gln Thr Phe Thr Pro Ser Pro Trp Gly Asp Phe Phe Leu His His

20 25 30

Val Pro Cys Thr Pro Ser Gln Phe Leu Ser Met Lys Glu Arg Ala Gln

35 40 45

Arg Lys Lys Glu Glu Val Arg Gln Ile Ile Leu Glu Asn Phe Ala Ser

50 55 60

Ser Asn Leu Val Arg Lys Leu Glu Leu Val Asp Thr Leu Gln Arg Ile

65 70 75 80

Gly Val Asp Tyr His Tyr Lys Glu Glu Ile Asp Asn Leu Leu His Ser

85 90 95

Ile Phe Asp Asp Lys Asp Gly Gly Ser Asp Asn Leu Tyr Ile Thr Ser

100 105 110

Leu Arg Phe Tyr Leu Leu Arg Lys His Gly Tyr Gly Val Ser Ser Asp

115 120 125

Val Phe Glu Lys Phe Arg Asp Glu Gln Gly Asn Ile Ser Ser Asp Asp

130 135 140

Ile Ser Cys Leu Leu Met Leu Tyr Asp Ala Ala His Leu Arg Thr His

145 150 155 160

Gly Glu Glu Ile Leu Asp Asn Ile Ile Thr Phe Asn Lys Ser His Leu

165 170 175

Gln Ser Leu Leu Leu Glu Asn Leu Glu Pro Glu Leu Arg Glu Glu Val

180 185 190

Gln Cys Thr Leu Glu Thr Pro Arg Phe Arg Arg Val Lys Arg Val Glu

195 200 205

Ala Arg Arg Tyr Ile Ser Val Tyr Glu Lys Asn Thr Thr Arg Asp Ala

210 215 220

Thr Ile Leu Glu Phe Ala Lys Leu Asp Tyr Asn Ile Leu Gln Ala Ile

225 230 235 240

Tyr Cys Asp Glu Leu Lys Glu Leu Thr Val Trp Trp Lys Asp Phe Gln

245 250 255

Ser Gln Thr Asp Leu Ser Phe Ala Arg Asp Arg Met Val Glu Leu His

260 265 270

Phe Trp Met Leu Gly Val Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr Pro Tyr Ser Arg

275 280 285

Ile Met Met Thr Lys Phe Ile Val Leu Ala Ser Leu Leu Asp Asp Leu

290 295 300

Tyr Asp Ser Tyr Ser Thr Thr Glu Glu Ser Asn Ala Phe Ile Ala Ala

305 310 315 320

Met Gln Arg Trp Asp Asp Arg Thr Thr Glu His Leu Pro Ala Cys Leu

325 330 335

Lys Ala Leu Phe Ile Asn Ile Val Lys Thr Thr Asn Glu Ile Glu Glu

340 345 350

Glu Leu Lys Leu Met Lys Asn Lys His Ala Asp Leu Ile Lys Arg Leu

355 360 365

Val Ile Asp Thr Ala Lys Phe Tyr His Ala Glu Val Glu Trp Arg Asp

370 375 380

Gln His Tyr Ile Pro Thr Asp Ile Glu Glu His Leu Gln Ile Ser Thr

385 390 395 400

Arg Ser Ser Vai Cys Met Gln Ile Thr Asn Leu Ala Leu Ile Ser Leu

405 410 415

Gly Glu Val Thr Thr Arg Lys Asp Val Asp Trp Ala Leu Thr Phe Pro

420 425 430

Lys Ile Ile Arg Ala Ala Cys Ile Val Gly Arg Val Gly Asn Asp Ile

435 440 445

Val Ser His Glu Arg Glu Gln Thr Ser Glu His Val Gly Ser Thr Val

450 455 460

Gln Thr Cys Met Lys Gln Tyr Gly Val Thr Val Glu Glu Ala Asn Glu

465 470 475 480

Lys Leu Arg Val Ile Ile Glu Glu Ala Trp Met Asp Ile Val Glu Glu

485 490 495

Cys Leu Glu Gln Lys Arg Pro Met Ala Leu Leu Glu Thr Ala Val Asn

500 505 510

Val Ala Arg Thr Met Asp Phe Met Tyr Lys Arg Glu Asp Ala Tyr Thr

515 520 525

Leu Ser Phe Ser Leu Lys Asp Val Ile Ala Ser Met Tyr Val Asn Ser

530 535 540

Val Arg Ala Cys

545

<210>5

<211>546

<212>PRT

<213>岩兰草(Vetiver zizanoides)

<400>5

Met Ala Leu Pro Val Ala His Arg Tyr Ser Ser Glu Ala Glu Glu Leu

1 5 10 15

Arg Glu Ala Thr Thr Phe His Pro Ser Leu Trp Gly Asp Phe Phe Leu

20 25 30

Thr Tyr Gln Pro Pro Thr Ala Ala Gln Gln Ala Tyr Met Glu Glu Arg

35 40 45

Ala Glu Val Leu Arg Glu Asp Val Arg Lys Ile Leu Arg Asp Ser Thr

50 55 60

Gln Leu Pro Glu Thr Leu Asn Leu Ile Leu Thr Leu Gln Arg Leu Gly

65 70 75 80

Leu Asp Tyr Tyr Tyr Glu Asn Glu Ile Asp Lys Leu Leu His Arg Ile

85 90 95

Tyr Asn Ser Asp Tyr Asn Asp Lys Asp Leu Asn Leu Val Ser Leu Arg

100 105 110

Phe Tyr Leu Leu Arg Lys Asn Gly Tyr Asp Val Ser Ser Asp Val Phe

115 120 125

Leu Ser Phe Lys Thr Asp Glu Gly Gly Phe Ala Tyr Gly Asp Thr Ile

130 135 140

Ser Leu Leu Ser Leu Tyr Asn Ala Ala Tyr Leu Arg Arg His Gly Glu

145 150 155 160

Lys Val Leu Asp Glu Ala Ile Ser Phe Thr Arg Arg Arg Leu Gln Asp

165 170 175

Ile Leu Glu Leu Pro Ala Ser Pro Phe Ala Lys Glu Val Ser Ala Ser

180 185 190

Leu His Thr Pro Leu Phe Arg Arg Val Gly Ile Leu Glu Ala Arg Asn

195 200 205

Tyr Ile Pro Ile Tyr Glu Lys Asp Ala Thr Val Asn Glu Ala Ile Leu

210 215 220

Glu Leu Ala Lys Leu Asn Phe Asn Leu Gln Gln Leu Val Phe Cys Glu

225 230 235 240

Glu Leu Lys His Cys Thr Met Trp Trp Lys Glu Phe Leu Ala Lys Ser

245 250 255

Lys Met Thr Phe Val Arg Asp Arg Ile Val Glu Val Tyr Phe Trp Met

260 265 270

Asn Gly Ala Cys Tyr His Pro Pro Tyr Ser His Ser Arg Ile Ile Gln

275 280 285

Thr Lys Ile Thr Ser Phe Val Thr Ile Ile Asp Asp Met Phe Asp Thr

290 295 300

Tyr Gly Thr Thr Glu Glu Cys Met Lys Phe Val Glu Ala Ile Gly Arg

305 310 315 320

Trp Asp Glu Ser Ala Val Pro Leu Leu Pro Glu Tyr Met Lys Gly Phe

325 330 335

Tyr Leu Phe Leu Leu Asp Thr Phe His Ser Phe Glu Asp Glu Leu Gly

340 345 350

Pro Gln Lys Ser Tyr Arg Val Leu Tyr Leu Lys His Ala Met Glu Arg

355 360 365

Leu Val Gln Gln Tyr Tyr Asn Glu Ile Lys Trp Arg Asp Glu Asp Tyr

370 375 380

Val Pro Lys Thr Met Ser Glu His Leu Gln Val Ser Met Glu Ser Ile

385 390 395 400

Ala Cys Ile Pro Ile Thr Cys Ala Ala Phe Val Gly Met Gly Asp Ile

405 410 415

Ile Thr Lys Glu Thr Leu Glu Trp Ile Leu Ser Phe Pro Gln Phe Leu

420 425 430

Met Ser Phe Gly Ile Tyr Val Arg Leu Ser Asn Asp Val Ala Ser Thr

435 440 445

Met Arg Glu Gln Thr Lys Asp His Ser Ala Ser Thr Val His Cys Tyr

450 455 460

Met Lys Glu His Gly Thr Thr Met Asn Asp Ala Cys Glu Lys Ile Lys

465 470 475 480

Glu Leu Ala Glu Asp Lys Trp Lys Asp Met Leu Glu Gln Cys Leu Ala

485 490 495

Leu Thr Glu Leu Pro Lys Val Ile Pro Arg Thr Val Phe Asp Phe Ala

500 505 510

Arg Thr Ile Val Asn Met Tyr Lys Asn Asp His Asp Gly Phe Thr Ser

515 520 525

Ser Glu Ala Leu Lys Glu Met Ile Glu Leu Leu Phe Val Lys Pro Val

530 535 540

Pro Asn

545

<210>6

<211>597

<212>PRT

<213>岩兰草(Vetiver zizanoides)

<400>6

Met Trp Asn Cys Ser Leu Thr Ile Ser Ala Thr Ala Ala Ser Pro Pro

1 5 10 15

Leu Arg Gln Trp Pro Gly Gly Ile Ser Trp Arg Arg Pro Ser Arg Leu

20 25 30

Gln Cys Ser Ala Ala Thr Thr Arg His Asp Asp Asp Leu Val Leu Asp

35 40 45

Asn Lys Gly Asp Asn Arg Leu Arg Glu Asn Thr Gly Ala Asp Ile Phe

50 55 60

Gln Pro Ser Ile Trp Gly Asp Ile Phe Leu Gly Asn Ser Asn Pro Ala

65 70 75 80

Ala Ala Ala Ser Ser Gln Gln Gln Gln Ile Gln Met Glu Glu Arg Ala

85 90 95

Asp Lys Leu Arg Glu Glu Val Ala Lys Met Ile Ala Ser Ser Thr Thr

100 105 110

Thr Ala Ser Arg Leu Gln Leu Ile Asp Ala Leu Glu Arg Leu Cys Leu

115 120 125

Asp His Leu Phe Glu Glu Glu Ile Gly Ala Ala Leu Ala Gln Ile Glu

130 135 140

Thr Ala Asp Val Ser Asp Tyr Asp Leu Glu Thr Val A a Leu Trp Phe

145 150 155 160

Cys Leu Leu Arg Lys His Arg Tyr Met Val Ser Pro Asp Val Phe Val

165 170 175

Arg Phe Lys Asp Glu Asp Gly Gly Phe Leu Val Asn Ser Pro Lys Asp

180 185 190

Leu Leu Asn Leu Tyr Asn Ala Ala His Met Arg Thr His Gly Glu Ile

195 200 205

Ile Leu Glu Glu Ala Val Leu Phe Ser Gln Arg His Leu Glu Thr Met

210 215 220

Val Pro Tyr Met Glu Gly Ser Leu Ala Arg Glu Ile Lys Ser Ala Leu

225 230 235 240

Asp Ile Pro Leu Pro Arg Arg Pro Arg Ile Tyr Glu Tyr Lys Tyr Tyr

245 250 255

Ile Ser Met Tyr Glu Lys Asp Gly Met Val Asp Glu Lys Val Leu Gln

260 265 270

Leu Ala Lys Leu Asn Ser Asn Ile Met Gln Leu His His Gln His Glu

275 280 285

Leu Gly Ile Val Ser Arg Trp Trp Asn Asp Ile Asn Ile Glu Ser Arg

290 295 300

Leu Pro His Val Arg Asp Arg Leu Val Glu Cys Tyr Leu Trp Ile Leu

305 310 315 320

Gly Val Tyr Tyr Glu Pro Cys Tyr Ser Arg Ala Arg Ile Ile Leu Thr

325 330 335

Met Thr Thr Ala Met Val Thr Leu Leu Asp Asp Thr Tyr Asp Ser Tyr

340 345 350

Ala Thr Pro Glu Glu Cys Glu Leu Phe Thr Lys Cys Ile Glu Ser Trp

355 360 365

Asp Ser Met Gly Ala Gln Asp Leu Pro Glu Arg Met Lys Tyr Gly Leu

370 375 380

Glu Lys Ile Phe Asp Ser Cys Glu Ile Ile Glu Asn Met Leu His Gln

385 390 395 400

Glu Glu Lys Tyr Arg Ile Trp Tyr Leu Arg Gln Ser Ile Lys Asp Leu

405 410 415

Val Ile Ser Tyr Ser Val Glu Val Lys Met Leu Gln Glu Gly Tyr Ile

420 425 430

Pro Lys Ser Val Glu Glu His Leu Lys Leu Ser Leu Ile Thr Val Gly

435 440 445

Tyr Pro Ile Leu Ala Cys Val Ser Phe Val Gly Met His Asp Ile Ala

450 455 460

Thr Lys Asp Cys Leu Asp Trp Val Ser Ser Ile Pro Lys Met Val Glu

465 470 475 480

Ala Leu Ser Val Ile Leu Arg Leu Val Asp Asp Leu Glu Ser Tyr Glu

485 490 495

Arg Glu Gln Leu Val Pro His Val Ala Ser Thr Ile Asp Ser Tyr Met

500 505 510

Lys Glu His Asn Val Ser Ile Glu Val Ala Arg Glu Gln Ile Tyr Ile

515 520 525

Leu Lys Glu Glu Ser Trp Lys Asp Phe Asn Asn Glu Trp Leu Asn Pro

530 535 540

Asp Asn Asn Val Tyr Pro Lys Gln Leu Leu Glu Arg Met Phe Asn Leu

545 550 555 560

Ala Arg Thr Ala Gln Phe Leu Tyr Asn Lys Glu Glu Lys Phe Thr Asn

565 570 575

Ser His Tyr Leu Lys Asp Thr Val His Ser Leu Leu Leu Ala Glu Pro

580 585 590

Phe Lys Ile Pro Ile

595

<210>7

<211>11

<212>PRT

<213>岩兰草(Vetiver zizanoides)

<400>7

Pro Ala Ala Ala Ala Ser Ser Gln Gln Gln Gln

1 5 10

<210>8

<211>27

<212>PRT

<213>岩兰草(Vetiver zizanoides)

<400>8

Ile Val Gly Val Tyr Tyr Glu Pro Arg Tyr Ser Arg Gly Arg Ile Ile

1 5 10 15

Leu Lys Lys Val Leu Gly Ile Val Ser Ile Leu

20 25

<210>9

<211>28

<212>PRT

<213>岩兰草(Vetiver zizanoides)

<400>9

Met Leu Gly Val Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr Pro Ala Tyr Ser Arg Ile

1 5 10 15

Met Met Thr Lys Phe Ile Val Leu Ala Ser Leu Leu

20 25

<210>10

<211>28

<212>PRT

<213>岩兰草(Vetiver zizanoides)

<400>10

Pro Ile Trp Cys Ile Met Asn Lys Ser Thr Tyr Arg Arg Ala Arg Leu

1 5 10 15

Ile Leu Ala Lys Ile Ile Val Leu Thr Ser Leu Leu

20 25

<210>11

<211>27

<212>PRT

<213>岩兰草(Vetiver zizanoides)

<400>11

Ala Ala Gly Gly Cys Ile Glu Pro Lys Tyr Ser Ser Phe Arg Ile Gly

1 5 10 15

Phe Ala Lys Phe Cys Ser Leu Ala Thr Val Met

20 25

<210>12

<211>27

<212>PRT

<213>岩兰草(Vetiver zizanoides)

<400>12

Met Asn Gly Val Cys Tyr His Pro Pro Tyr Ser His Ser Arg Ile Ile

1 5 10 15

Gln Thr Lys Ile Thr Ser Phe Val Thr Ile Ile

20 25

<210>13

<211>70

<212>PRT

<213>岩兰草(Vetiver zizanoides)

<400>13

Asn Leu Val Gln Ala Leu His Arg Arg Glu Leu Ala Glu Val Thr Arg

1 5 10 15

Trp Trp Lys Glu Ser Arg Leu Gly Glu Gly Asp Val Asp Tyr Ser Phe

20 25 30

Ala Arg Asp Arg Val Val Glu Cys Phe Phe Cys Ala Ala Cys Ile Ala

35 40 45

Pro Glu Pro Arg Leu Ala Asp Cys Arg Glu Val Leu Ala Lys Thr Gly

50 55 60

Ala Leu Ile Val His Leu

65 70

<210>14

<211>57

<212>PRT

<213>岩兰草(Vetiver zizanoides)

<400>14

Thr Asn Ser Ile Phe Arg Trp Trp Arg Thr Leu Tyr Lys Asp Val Lys

1 5 10 15

Leu Ser Tyr Cys Arg Asp Arg Leu Val Glu Met Tyr Phe Trp Thr Ile

20 25 30

Glu Met Leu Pro Trp Glu Glu Cys Ser Arg Ser Arg Ile Val Leu Thr

35 40 45

Lys Val Ile Ala Phe Ala Thr Leu Met

50 55

<210>15

<211>29

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物Tps_monocot_F1

<220>

<221>misc_feature

<222>(27)..(27)

<223>a或g或c或t

<400>15

cggttctacc tgctgcggma rmabggnta 29

<210>16

<211>28

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物Tps_monocot_F2

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(20)

<223>a或g或c或t

<220>

<221>misc_feature

<222>(26)..(26)

<223>a或g或c或t

<400>16

ccaggtccct gctgaccytn tayrangc 28

<210>17

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物_Tps_monocot_F3

<220>

<221>misc_feature

<222>(24)..(24)

<223>a或g或c或t

<400>17

gccgtgctgg agctggccaa rytnraytty 30

<210>18

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物Tps_monocot_F4

<220>

<221>misc_feature

<222>(21)..(21)

<223>a或g或c或t

<400>18

cgggaccgga tcgtggagrh nyayttytgg 30

<210>19

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物Tps_monocot_R1

<220>

<221>misc_feature

<222>(9)..(9)

<223>a或g或c或t

<400>19

ctrctrwana wrctgtgggt gccgtggtgg 30

<210>20

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物Tps_monocot_R2

<220>

<221>misc_feature

<222>(9)..(9)

<223>a或g或c或t

<400>20

ctrctrtrna wrctgtgggt gccgtggtgg 30

<210>21

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物TpsVF1

<400>21

hhvthwcmmg gtggtgga 18

<210>22

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物TpsVF2

<220>

<221>misc_feature

<222>(3)..(3)

<223>a或c或g或t

<400>22

gtngarkbbt atktttgg 18

<210>23

<211>25

<212>DNA

<213>人工合成引物

<220>

<223>引物TpsCF1

<400>23

gckaagwtvg gkttcaathw kbtdc 25

<210>24

<211>29

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物TpsCF2

<220>

<221>misc_feature

<222>(9)..(9)

<223>a或c或g或t

<400>24

gggawwgwnw bgttgaakkt tatttttgg 29

<210>25

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物TpsVR3

<400>25

crtrmktrtc gwadgkgtcrtc 22

<210>26

<211>26

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物TpsCR3

<220>

<221>misc_feature

<222>(9)..(9)

<223>a或c或g或t

<400>26

gtwscgtgng hgtcgtahgk gtcatc 26

<210>27

<211>32

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物CA711_F1

<400>27

ctcacgagga cgaataatat tgaagaaggt cc 32

<210>28

<211>28

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物CA711_F2

<400>28

attgaagaag gtccttggca ttgtttcc 28

<210>29

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物CA717_F1

<400>29

gctcggagtg gtttacgagc cctattatcc 30

<210>30

<211>32

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物CA717_F2

<400>30

gatgacaaag ttcatcgtac ttgcatcctt gc 32

<210>31

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物CA725_F1

<400>31

ctgcgccgcc tgcatcgcg 19

<210>32

<211>23

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物CA725_F2

<400>32

gcgcctggcg gactgcaggg agg 23

<210>33

<211>25

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物CA731_F1

<400>33

ccctgggagg agtgctctcg ttcac 25

<210>34

<211>32

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物CA731_F2

<400>34

ggatagttct caccaaagtt attgcatttg cg 32

<210>35

<211>26

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物6A733_F1

<400>35

atgaacgggg tatgctatca ccctcc 26

<210>36

<211>23

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物CA733_F2

<400>36

caccctccat actctcattc ccg 23

<210>37

<211>23

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物CA775_R

<400>37

ggtggagcat attttcaatg atc 23

<210>38

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物CA775_R1

<400>38

atgcacccgg gaaggtcttg ag 22

<210>39

<211>25

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物CA775_R2

<400>39

gaatcccagc tttcaatgca cttgg 25

<210>40

<211>23

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物CA717_R

<400>40

ctcctcctca atctcatttg tgg 23

<210>41

<211>25

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物CA717_R1

<400>41

gtgccttcaa gcatgctgga agatg 25

<210>42

<211>24

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物CA717_R2

<400>42

gtggttcggt catcccacct ttgc 24

<210>43

<211>27

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物CA782_F1

<400>43

ccaatattgg tgtattatga acaagag 27

<210>44

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物CA782_F2

<400>44

caggcgtgca cgactgatcc tc 22

<210>45

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物CA783_F1

<400>45

gcagcaggag gatgtagaac 20

<210>46

<211>31

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物CA783_F2

<400>46

ccaaatattc ttcttttaga attggctttg c 31

<210>47

<211>31

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物CA783_F3

<400>47

gaattggctt tgcaaaattt tgttctcttg c 31

<210>48

<211>24

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物CA775_RB

<400>48

cctcacaaac acatctggtg atac 24

<210>49

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物CA775_R1B

<400>49

cagggcaacc gtttcaagat c 21

<210>50

<211>28

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物CA775_R2B

<400>50

cactgacatc agcagtctca atctgtgc 28

<210>51

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物CA733_R

<400>51

gaaggagagg tactgcactt tc 22

<210>52

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物CA733_R1

<400>52

cccatctgcc aattgcttc 19

<210>53

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物CA733_R2

<400>53

catgcactct tcagtggtac catatgtgtc 30

<210>54

<211>27

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物CA775_R1_marath

<400>54

ggtgatccaa gcatagacgc tccaatg 27

<210>55

<211>30

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物CA775_R2_marath

<400>55

cgatgagctg cagcctacta gcagtagttg 30

<210>56

<211>36

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物dTadaptor

<400>56

aattcggtac ccgggatcct tttttttttt tttttt 36

<210>57

<211>18

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物adaptorP

<400>57

aatcggtacc cgggatcc 18

<210>58

<211>31

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物CA717_Nde

<400>58

tactgacata tggccagcag cagtcctgtc c 31

<210>59

<211>39

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物CA717_Kpn

<400>59

ttggtacctc aacaagctcg cacagagtta acgtacatg 39

<210>60

<211>36

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物733_Nco

<400>60

ctagccatgg cgcttcctgt agcacatcgt tattcc 36

<210>61

<211>39

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物733_Eco

<400>61

cggaattcaa ttgggtactg gcttcacgaa tagtagttc 39

<210>62

<211>39

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物775_fus1-f

<400>62

caccccaagc ccatggggag atatcttcct cggcaactc 39

<210>63

<211>37

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物775_fus1-r

<400>63

ggaagatatc tccccatggg cttggggtga atgtctg 37

<210>64

<211>40

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物775_fus2-f

<400>64

gctcgttctt ccattgacaa gaactgtgat ggagtgcatg 40

<210>65

<211>41

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物775_fus2-r

<400>65

cacagttctt gtcaatggaa gaacgagcgg ataaactcag g 41

<210>66

<211>33

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物775_fus_Nco

<400>66

ctagccatgg ccagcagcag tcctgctcct ctg 33

<210>67

<211>34

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物775_fus_Eco

<400>67

cggaattcaa atggggatct taaatggttc ggcc 34

<210>68

<211>32

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物775_mut_F2

<400>68

gacaatgact actgcaatgg tgaccctttt ag 32

<210>69

<211>32

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物775_mut_R2

<400>69

ctaaaagggt caccattgca gtagtcattg tc 32

<210>70

<211>25

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物775_mut1F

<400>70

caccccaagc ccttggggag atatc 25

<210>71

<211>25

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物775_mut1R

<400>71

gatatctccc caagggcttg gggtg 25

<210>72

<211>39

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物Vet775_Nco

<400>72

ctagccatgg cgaactgcag ccttactatt tctgctact 39

Claims

1.分离的核酸，选自：

(d)含有编码能够合成具有C₃-C₇键的至少一种二环倍半萜和/或三环倍半萜的多肽的核苷酸序列的核酸；和/或

(e)含有编码能够合成至少一种香柠檬烯和非强制性选择的其它倍半萜的多肽的核苷酸序列的核酸，其特征在于香柠檬烯占由所述多肽合成的全部倍半萜产物的至少5wt.％；

其中由任一(a)～(e)的所述核酸编码的多肽具有萜合酶活性。

2.根据权利要求1的分离的核酸，该核酸与SEQ ID NO：2的核酸杂交并不与选自具有检索号AY518310或AY518313的编码玉米的倍半萜合酶的那些核酸序列杂交。

3.根据权利要求1或2的分离的核酸，该核酸编码能够合成选自以下组中一种或多种二环倍半萜或三环倍半萜的多肽：(+)-epi-β-檀香萜，反式-α-香柠檬烯，顺式-α-香柠檬烯，β-红没药烯，反式-γ-红没药烯和/或前述的两种或多种的组合。

4.分离的多肽，选自：

(c)能够合成至少一种香柠檬烯和非强制性选择的其它倍半萜的多肽，其特征在于香柠檬烯占由所述多肽合成的全部倍半萜产物的至少5wt.％。

5.经转化以包含权利要求1～3中任一项的核酸的重组宿主生物体和/或细胞。

6.生成至少一种萜类化合物的方法，该方法包含：

(a)将至少一种脂肪族焦磷酸酯萜前体与至少一种权利要求4的多肽或由权利要求1～3中任一项的核酸编码的多肽接触，和

7.生成至少一种萜类化合物的方法，该方法包含：

8.权利要求7的方法，该方法包含步骤：

-在有利于萜类化合物生产的条件下培养所述生物体的步骤之前，用重组核酸转化非人类生物体以表达或递增表达由权利要求1～3中任一项的核酸编码的多肽或权利要求4的多肽。

9.生成萜合酶的方法，包含在有利于所述萜合酶生产的条件下培养经修饰以含有至少一种核酸序列的宿主生物体或细胞，其中所述至少一种核酸为权利要求1～3中任一项的核酸。

10.制备具有期望萜合酶活性的多肽变体的方法，该方法包含以下步骤：

(a)选择包含与SEQ ID NO：2有至少82.4％同一性的核苷酸序列的核酸；

(b)修饰所选择的核酸以获得至少一种突变核酸；

(c)用该突变核酸序列转化宿主细胞以表达由该突变核酸序列编码的多肽；

(d)筛选多肽以获得具有至少一种经改变的特性的功能多肽；和，

(e)非强制性选择地，当所述多肽不具有期望的变体萜合酶活性时，重复步骤(a)～(d)的过程直至获得具有期望的变体萜合酶活性的多肽为止。

11.制备编码具有期望的萜合酶活性的多肽变体的核酸的方法，该方法包含权利要求10的步骤并且还包含以下步骤：

12.分离的核酸，选自：

(c)在中度严谨条件下与SEQ ID NO：1杂交的核酸；

(d)含有编码能够合成环

莰烯的多肽的核苷酸序列的核酸；

其中，由所述核酸编码的多肽具有萜合酶活性。

13.分离的多肽，选自：

(a)与SEQ ID NO：4有至少50％的氨基酸序列同一性的多肽；

(b)能够合成环

莰烯的多肽。

14.重组宿主生物体和/或细胞，经转化以含有权利要求12的核酸，和/或经转化以表达或递增表达权利要求13的多肽。