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CN101180405A - 酶分析方法 - Google Patents

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CN101180405A
CN101180405A CNA2006800174670A CN200680017467A CN101180405A CN 101180405 A CN101180405 A CN 101180405A CN A2006800174670 A CNA2006800174670 A CN A2006800174670A CN 200680017467 A CN200680017467 A CN 200680017467A CN 101180405 A CN101180405 A CN 101180405A
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insoluble carrier
analyzing
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CNA2006800174670A
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小野智子
小仓实
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Mitsubishi Kagaku Iatron Inc
Mitsubishi Kagaku Medical Inc
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Mitsubishi Kagaku Medical Inc
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Abstract

本发明公开了一种酶分析方法和酶分析用试剂盒。酶分析方法包含以下步骤：(1)使可能含分析对象酶的被检验样品和下述的固定化底物在液体中接触的步骤，其中，所述的固定化底物是将可被上述分析对象酶裂解的酶底物结合于不溶性载体上的形成的；(2)分离上述液体和不溶性载体的步骤；(3)分析不溶性载体上残存的底物或底物片段，和/或分析从不溶性载体游离到液体中的底物片段的步骤。酶分析用试剂盒，其至少包含将能被分析对象酶裂解的酶底物结合在不溶性载体上的固定化底物。

Description

酶分析方法
技术领域
本发明是关于样品中含有的酶的分析方法。更详细来说，例如在测定酶活性的方法中，使将测定对象酶底物结合于不溶性载体上形成的固相底物与样品反应，检测被酶裂解的底物片段的量的酶分析方法。
背景技术
目前，在临床诊断检查实践中，要求短时间且高精度地在许多试样中测定出作为疾病诊断指标的活体成分，并将其结果迅速、准确地反馈到治疗现场，可以根据这些结果有效选择适当的药剂、治疗方法；观察治疗过程；预见疾病的复发。
作为诊断疾病的指标的生物材料(所谓的诊断标记物)涉及蛋白质、核酸、酶、多糖类、脂类等很多方面，而且，要早期了解疾病，能够测定极其微量浓度的生物材料的手段是很重要的。生物材料的大部分是化学反应中的催化剂及其抑制活性物质，其代表是酶及其抑制剂。活体内的酶反应是利用活性化物质和抑制其反应的抑制物质，进行控制、调整，达到调节机能的目的。例如，在活体内的血液的凝固，纤维蛋白溶解系统中，涉及到许多酶及其抑制剂，测定这些物质在临床方面很重要。
尤其关于酶，利用不同目的的酶实施合成底物测定法和免疫测定法。其中，在合成底物法中，由于目标酶的作用，能够通过检测出游离出来的色素和荧光物质，检测出活性因子，并对其定量。
例如，凝血酶是关系到血液凝固的内切蛋白酶的一种，是作用于纤维蛋白原，生成纤维蛋白的重要酶。作为其合成底物，公知的有Bz-Phe-Val-Arg-pNA(非专利文献1)、Tos-Gly-Pro-Arg-pNA(专利文献1)、H-D-Phe-Pip-Arg-pNA(专利文献2)等。因为酶反应后，对硝基苯胺(pNA)游离出来能发出黄色，通过在405nm，把它进行比色，可以测定凝血酶因子活性，可以用酶活性表示凝固溶解纤维蛋白的能力。
另外，组织因子(Tissue Factor：以下称作TF)也可以用显色性合成底物[非专利文献2及非专利文献3]进行活性测定。
除了凝血酶和TF以外，在凝固溶解纤维蛋白的系统中，纤维蛋白溶酶、抗凝血酶III(AT III)、(冯)维勒布兰德病(血管性血友病)因子裂解酶(别称：ADAMTS13)、第X因子、第XI因子、第XII因子、蛋白C、血浆血管舒缓素、组织血管舒缓素、组织纤维蛋白溶酶原激活剂、尿激酶等活性因子，可以用合成底物进行活性测定。
这样，作为活体成分的微量测定方法，酶测定法，就可以利用酶底物反应，从复杂成分的混合物中进行特别分选，无需如在普通的定量法中的从样品中分离出必要的对象物质的前处理，而且，酶测定法具有高灵敏度、高精确度定量的特征。另外，与使用放射性同位素的放射酶测定法比较，以荧光或酶标记为特征的酶测定法既廉价又不产生危险的废弃物，在测定的灵敏度精确度方面也不逊色，所以被广泛使用。
这样，许多活性因子(酶)，利用其底物的特异性，开发出多种分析系统。另一方面，为了得到特异性更强的底物物质，还在进行着研究，其中，由于由于开发出了合成底物，可以进行更准确的(底物特异性更强)测定。但是，这些合成底物，基本上都是在与其结合的色素和荧光色素游离之后，才显色产生荧光，而不是在任何条件下都能表达信号，必须把特定物质与色素或荧光色素的特定部位相结合，所以开发新的合成底物并不容易。
另外，对于在液相中进行的酶反应，在直接检测显色的时候，容易受到样品液混浊和着色的影响。在检测荧光的时候，若样品中混有发荧光的物质，则使检测结果受其影响也变得不准确。
专利文献1：特开昭52-3492号公报
专利文献2：特开昭52-24590号公报
非专利文献1：“血栓形成研究(Thrombosis Research)”(爱尔兰)1972年，1卷，p.267-278
非专利文献2：“临床化学(Clinical Chemistry)”(美国)1989年，35卷，p.1897
非专利文献3：“临床病理”，1995年，43卷，p.137
发明内容
发明要研究的课题
因此，本发明的课题是在采用底物的酶分析法中，提供易操作且灵敏度高的酶分析法。
解决问题的手段
上述问题可以通过本发明，利用下述的酶分析方法解决，所述的酶分析法的特征是包括以下步骤：(1)使可能含分析对象酶的被检验样品和下述的固定化底物在液体中接触的步骤(以下称为接触步骤)，其中，所述的固定化底物是将可被上述分析对象酶裂解的酶底物结合于不溶性载体上的形成的；
(2)分离上述液体和不溶性载体的步骤(以下称分离步骤)
(3)分析不溶性载体上残存的底物或底物片段，和/或分析从不溶性载体游离到液体中的底物片段的步骤(以下称分析步骤)。
按照本发明的分析方法的一个优选实施方案，所述的结合于不溶性载体上的上述酶底物，在被分析对象酶裂解从而由不溶性载体游离出来的底物片段一侧被标记物质作了标记。
另外，按照本发明分析方法的一个优选实施方案，用下述标记化伴生物(パ一トナ一)实施上述步骤(3)的分析，所述的标记化伴生物是与所述的酶底物经上述分析对象酶裂解后所产生的新抗原特异结合、并经标记物质标记化的伴生物。按照本发明的分析方法一个更优选的实施方案，经标记的伴生物是标记抗体。在此，所谓“新抗原”是指酶底物经对象酶裂解后所产生的、结合于不溶性载体的底物片段或游离的底物片段的酶底物裂解部位。酶底物裂解部位包括肽序列和因被裂解而变化的酶底物的立体构造。
根据本发明的分析方法的又一优选实施方案，标记物质是荧光物质、发光物质、显色物质或酶。
根据本发明的分析方法的更适宜的又一种状态，不溶性载体是颗粒。
根据本发明的分析方法的更适宜的又一种状态，颗粒是乳胶颗粒或磁性颗粒。
另外，本发明是关于酶分析用的试剂盒，其特征是所述的分析用试剂盒包含结合在不溶性载体上且能被分析对象酶裂解的酶底物的固定化底物，而且所述的固定化底物是上述酶底物在经分析对象酶裂解后由不溶性载体游离出来的底物片段一侧被标记物质作了标记的标记化固定化底物。
进而，本发明还是涉及酶分析用的试剂盒，其包含下述的固定化底物和标记化伴生物，所述的固定化底物是能被分析对象酶裂解的酶底物结合于不溶性载体上所形成的固定化底物，所述的标记化伴生物是与上述酶底物经分析对象酶裂解所产生的新抗原特异结合、并经标记物质作了标记的标记化伴生物。
再者，在本说明书中的用语“分析”中包含判定有无分析对象物质存在的“检测”和对于分析对象的量或活性进行定量或半定量的确定的“测定”。
发明的效果
根据本发明，提供了测定酶剂量的酶测定法，其可应用于简便、迅速且高灵敏度检测对象酶的方法。
附图说明
[图1]为表示利用本发明的酶分析方法，测定血浆中凝血酶活性的测定结果的图表。横轴是血浆稀释系列的稀释率；纵轴是发光量(单位＝记数)。
[图2]为表示利用本发明的酶分析方法测定血浆中ADAMTS13活性的测定结果的图表。横轴是血浆稀释系列的稀释率；纵轴是发光量(单位＝记数)。
具体实施方案
本发明的酶分析方法中至少要用到结合在不溶性载体上、能被分析对象酶裂解的固定化底物。本发明的酶分析方法中，按照使用的标记物质的标记方式，包含有，如
(1)结合于不溶性载体上的酶底物由标记物质作了标记的方式(以下有时称为非免疫分析法)
(2)使用下述标记化伴生物的方式，所述的标记化伴生物是与上述酶底物经分析对象酶裂解所产生的新抗原特异结合、并经标记物质作了标记的标记化伴生物(以下有时称为免疫分析法)。
利用本发明的酶分析方法可以分析的对象酶，只要是能在特异的部位裂解底物的酶就可以，并没有特别的限定。可以举出，例如在临床诊断中作为酶检查对象的各种酶，即在人类的各种疾病中上升或减少的酶，或者与人类疾病无关的各种酶，或人类之外的各种动物的酶。
作为被检验样品，只要是可能含分析对象酶的样品即可，没有特别的限定。例如生物学中的液体样品、尤其是血液、血清、血浆、尿或脑脊髓液等。
本发明中使用的酶底物，只要是能用分析对象酶特异裂解的物质即可，没有特别的限制，可以根据分析对象酶适当选择。上述酶底物可以利用公知的方法制备，例如从人类和动物的体液中采集寄生生物的粗提品或纯化品的方法；从人工养殖的生物中取得来自生物的粗提品或纯化品的方法；利用基因重组技术和细胞培养技术生产核酸或蛋白质的方法；或者利用化学合成技术合成多肽和半抗原的方法等。
例如使用合成底物的情况下，用作凝血酶的可以是含有Gly-Pro-Arg的肽。用作第XII因子的例如可以是Gln-Gly-Arg；用作纤维蛋白溶酶的例如可以是Glu-Lys-Lys；用作第X因子的例如可以是Ile-Glu-Gly-Arg；用作组织纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂的例如可以是含Pyr-Gly-Arg的肽；用作ADAMTS 13的例如可以是血管性血友病因子(von WillebrandFactor；vWF)的第1596～第1668位的氨基酸组成的片段(KoichiKokame，Masanori Matsumoto，Yoshihiro Fujimura，and ToshiyukiMiyata，VWF73，a region from D1596 To R1668 of von Willebrand factor，provides a minimal substrate for ADAMTS-13.Blood，Jan 2004；103；607-612)。
作为本发明中使用的固定载体只要是能把酶底物固定的即可，任何形态的不溶性载体都能利用，例如，可以利用能够物理性吸附底物的材质(如聚苯乙烯制)构成的板、管、珠、片，或者具有起固定化底物作用的适当的功能基的玻璃、磁性载体、乳胶颗粒或膜等。从把固定化底物从反应系统分离时便于操作这一点考虑，优选使用颗粒，为了使上述分离操作能用机器，优选使用不溶性磁性颗粒。
不溶性磁性颗粒的粒径，通常使用0.05μm～5μm的，优选有03μm～3μm范围粒径的不溶性磁性颗粒。作为物理的吸附方法，例如把底物直接固定在不溶性磁性颗粒上的方法。作为化学的负载方法，例如利用可以使磁性颗粒表面存在的氨基、羧基、巯基、羟基、醛基、环氧基等经化学修饰与底物结合的功能基，把底物直接固定在颗粒上的方法和经化学键在颗粒和底物分子之间导入间隔分子，使底物固定的方法。在此，可以把抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素，用化学方式固定在不溶性磁性颗粒上作为间隔分子，把生物素化底物结合在它上面，制备固定化底物。进而，还可举出，使抗体或抗原在白蛋白等其它蛋白质上化学结合后，把其蛋白质化学结合在颗粒上的方法。一般，负载的底物剂量可以根据使用的不溶性载体颗粒的表面积、功能基剂量，适当确定，通常每1g载体颗粒负载1mg～500mg，优选负载10mg～100mg。
本发明的免疫分析法中使用的伴生物质，只要是能与酶底物经分析对象酶裂解后所产生的新抗原特异结合的物质即可，没有特别的限定，例如在抗体或底物中附加了糖链的情况下，识别特定的糖链的刀豆球蛋白A或植物凝血素。上述新抗原无论是产生于游离的底物片段侧的新抗原，还是产生于残存在不溶性载体的底物片段侧的新抗原均可。但是优选在不溶性载体上残存的底物一侧产生的新抗原。使用抗体作为伴生物质时，上述抗体可以根据分析对象酶适当选择，可以利用由底物或其片段预先免疫人、鼠、兔、大白鼠、羊等动物得到的抗血清、亲和纯化的多克隆抗体或单克隆抗体等。为了避免非特异性结合，优选使用单克隆抗体。
作为本发明中使用的标记物质，可以使用公知的各种标记物质，例如荧光物质(例如铕)、发光物质(如虫荧光素)、显色物质[如对硝基苯胺(pNA)]，或者酶(如过氧化物酶)；从试剂的稳定性、灵敏度方面考虑，优选酶。作为酶，例如过氧化酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶β-半乳糖苷酶、尿素酶、虫荧光素酶等。特别是利用以1，2二氧环丁烷(1，2-Dioxetane)为底物的碱性磷酸酶的活性测定法，因为显示出非常强的信号，能得到较高的检测灵敏度，适用于微量成分的测定。
在本发明中，非免疫分析法是用标记物质，对在不溶性载体上固定的酶底物(固定化底物)作标记；免疫分析法是用标记物质，对伴生物质(特别是抗体)作标记。在对固定化底物作标记时，把标记物质结合在与酶裂解的部位不同的部位，而且是因被分析对象酶裂解而从不溶性载体游离出来的部位(例如固定化末端和相反的末端)。标记化底物(优选酶标记底物)或标记化伴生物(优选酶标记伴生物质，特别是酶标记抗体)的制备方法是公知的，可以选择任意的方法。例如可以在酶中导入马来酰亚胺基，在底物或抗体中导入巯基，使两者反应，进行酶标记。用来导入马来酰亚胺基的试剂，可以适当使用N-羟基硫基琥珀酰亚胺基酯等。另外，用来导入巯基的试剂，可以适当使用如S-乙酰基巯基琥珀酸酐等。接着，把导入的马来酰亚胺基和巯基，在pH7以下，4℃条件下，反应过夜，由此可以制成酶标记底物或酶标记抗体。
作为检测来自标记物质的信号强度变化的手段，根据标记物质的种类及测定仪器的特性，适当选择，可以利用公知的方法，如比色法、荧光法、或发光法等。例如使用过氧化酶作为标记物质时，也可以把鲁米诺作为底物，用化学发光法检测，特别适用于微量测定(例如，田中弘一郎、石川榮治：用辣根过氧化酶作为标记的酶免疫测定法中荧光法和发光法的比较、临床检查仪器·试剂、11：567-569，1988)。另外，用碱性磷酸酶作为标记物质时，使用AMPPD[3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯-1，2-二氧杂环丁烷(3-(2’-spiroadamantane)-4-methoxy-4-(3”phosphoroxy)phenyl-1，2-dioxetane)]、1，2-二氧杂环丁烷(CDP-Star；トロピツクス公司制)]等公知的底物，可以使检测的灵敏度更高，所以是优选的。
下面，就本发明的酶分析法，按各实施方案、具体的测定顺序，进行更详细的说明。
在作为本发明的酶分析方法的一种方式的非免疫分析法中，包括但并不限定于以下的步骤，例如使下述的固定化底物与含酶的试样反应一定时间后，洗净固定化底物，使固定化底物上的被裂解的标记化底物片段、试样，以及固定化底物相分离，其中，上述的固定化底物是针对目标酶特异的底物的一端作了标记、在另一端固定于不溶性载体(例如不溶性磁性颗粒)的固定化底物。接着，测定不溶性磁性颗粒上残存的、未被裂解的底物的标记物质的量，由此分析试样中含有的酶活性。
本发明中的非免疫分析法包含的步骤，例如：
(A1)使(a)有可能含分析对象酶的被检验样品与(b)下述的固定化底物在液体中接触的步骤，所述的固定化底物是将能被分析对象酶裂解的酶底物结合在不溶性载体上的固定化底物，而且所述的固定化底物是上述酶底物在经分析对象酶裂解后由不溶性载体游离出来的底物片段一侧被标记物质作了标记的标记化固定化底物。
(A2)分离上述液体和不溶性载体的步骤。
(A3)分析未被裂解而残存在不溶性载体上的底物和/或从不溶性载体游离出来的液体中的底物片段。
上述步骤(A1)中采用的标记化固定化底物，是结合于不溶性载体的，而且是用标记物质作了标记的酶底物。上述标记化固定化底物中的酶底物部分，有分析对象酶特异裂解的部位，与上述裂解部位不同的、并且由被分析对象酶裂解而从不溶性载体游离出来的部位(例如与固定化末端相反的末端)由标记物质作了标记。因此在步骤(A1)中，含有分析对象酶的被检验样品和标记化固定化底物接触时，由于分析对象酶在标记化固定化底物特异裂解部位把底物裂解，底物片段内，标记化底物片段从不溶性载体游离出来，另一方面，未被分析对象酶裂解的固定化底物残存在不溶性载体上。本步骤中上述接触时间，只要是能够使被检验样品中可能含有的分析对象酶与固定化底物进行反应即可，没有特别的限定，可以根据反应条件(例如试剂及试样的使用量、温度、pH等)适当确定，通常为3分钟～24小时，优选15分钟～1小时。
在上述步骤(A2)中，把实施上述步骤(A1)后的不溶性载体和除此之外的组分(即，包含游离底物片段及被检验样品的液体部分)分离。上述分离操作可以按常法实施，例如当用磁性颗粒作为不溶性载体时，例如可以使用磁石或者离心分离；当用乳胶颗粒作为不溶性载体时，可以通过离心操作或过滤进行分离。在下面的步骤(A3)中，分析不溶性载体含有的标记物质时，最好在上述分离后，洗涤不溶性载体，再充分除去游离底物片段。
在上述步骤(A3)中可以对不溶性载体中残存的底物片段，或者从不溶性载体中游离出来的液体中的底物片段的任意一方进行分析，也可以对其双方进行分析。
在分析从不溶性载体中游离出来的、液体中的底物片段时，通过测定游离底物片段中含有的标记物质的量，可以确定游离底物片段的量，进而，例如通过制作校正曲线，可以确定被检验样品中含有的分析对象酶的剂量或活性。被检验样品中含有分析对象酶时，相应于所述酶的剂量或活性，游离底物片段的量会相应增加。
另一方面，在分析不溶性载体中未被裂解而残存的固定化底物时，通过测定残存的标记物质的量，可以确定残存标记底物(即固定化标记底物)的量，进而，例如通过制作校正曲线，可以确定被检验样品中含有的分析对象酶的剂量或活性。被检验样品中含有分析对象酶时，相应于所述酶的剂量或活性，固定化标记底物的量会相应减少。
作为本发明的酶分析方法的另一种方式的免疫分析法，包括但并不限定于以下的步骤，例如，固定化底物和试样反应一定时间后，添加与裂解的片段特异结合的标记化抗体，使其反应一定时间，洗净后，通过测定结合于固定化底物的标记化抗体量，可以分析试样中含有的酶的活性。
本发明中的免疫分析法，使用上述酶底物与被上述分析对象酶裂解后生成的新抗原特异结合，而且用标记物质作了标记的标记化伴生物，实施分析步骤。下面，以新抗原为在不溶性载体上残存的底物片段一方所产生的新抗原的情形为主，说明本发明的免疫分析法。但本领域技术人员可以理解，其也适用于针对新抗原为产生在游离的底物片段一方的情况。向反应系统内添加标记化伴生物的时机，比如可以是接触步骤、分离步骤、或分析步骤的任意期间。
例如，在接触步骤中添加标记化伴生物时，可以在被检验样品与固定化底物接触之前(即被检验样品或固定化底物的任意一方和标记化伴生物接触后，被检验样品或固定化底物的另一方再与之接触)；与接触时(即让被检验样品、固定化底物及标记化伴生物三者同时接触)；或者接触后(即让被检验样品和固定化底物接触后，进一步再接触标记化伴生物)添加。由于标记化伴生物与经由分析对象酶裂解酶底物所产生的新抗原特异结合，而不与酶裂解前的固定化底物结合，所以接触步骤中的酶反应与标记化伴生物是否存在无关。在接触步骤中添加标记化伴生物时，若被检验样品中含有分析对象酶，而且固定化底物被上述酶裂解，则形成底物片段(固定化底物片段或游离底物片段)与标记化伴生物(优选标记化抗体)的复合体(优选免疫复合体)。
在分离步骤中添加标记化伴生物时，可以在分离操作之前，或在分离操作之后添加。比如在分离操作之后添加标记化伴生物时，若标记化伴生物是识别残存在不溶性载体的底物片段一方所形成的新抗原的伴生物的情况下，添加到由分离操作得到的不溶性载体后，可以经过洗涤不溶性载体，除去未反应的标记化伴生物。
在分析步骤中添加标记化伴生物时，例如在上述分离步骤中得到的不溶性载体中添加标记化伴生物后，可以把不溶性载体洗净，除去未反应的标记化伴生物，实施标记物质的分析。
从可以省略分离反应过的标记化伴生物和未反应的标记化伴生物的操作这一点考虑，优选在接触步骤中或分离步骤的分离操作之前，添加标记化伴生物。
在免疫分析法中的分析步骤中，比如标记化伴生物是识别不溶性载体中残存的底物片段一方所形成的新抗原的伴生物的情况下，通过分析与不溶性载体上残存的底物片段特异结合的标记化伴生物可以确定被检验样品中含有的分析对象酶的剂量或活性。也就是说，可以通过测定特异结合于不溶性载体上残存的底物片段的标记化伴生物的标记物质的量，确定固定化底物片段的量，比如，再进一步通过制作校正曲线，确定被检验样品中含有的分析对象酶的剂量或活性。在被检验样品中含有分析对象酶的情况下，相应于酶的剂量或活性，固定化底物片段的量会相应增加，特异结合于底物片段的标记化伴生物的量也会增加。
本发明的酶分析用试剂盒，至少包含结合在不溶性载体上、可以被分析对象酶裂解的酶底物的固定化底物。本发明的酶分析用的试剂盒中，包括适用于本发明的非免疫分析法的试剂盒(以下称非免疫分析用试剂盒)和适用于本发明的免疫分析法的试剂盒(以下称免疫分析用试剂盒)。
在本发明的非免疫分析用试剂盒中，至少包含结合在不溶性载体上的、可以被分析对象酶裂解的酶底物的固定化底物，而且，所述的固定化底物是上述酶底物在经分析对象酶裂解后由不溶性载体游离出来的底物片段一侧被标记物质作了标记的标记化固定化底物。
在本发明的免疫分析用试剂盒中，至少包含下述的固定化底物和标记化伴生物，所述的固定化底物是能被分析对象酶裂解的酶底物结合于不溶性载体上所形成的固定化底物，所述的标记化伴生物是与上述酶底物经分析对象酶裂解所产生的新抗原特异结合、并经标记物质作了标记的标记化伴生物。
本发明的酶分析用试剂盒，根据标记物质及检测系统等，还可以进一步含有，如酶底物、洗涤液、试样稀释液和/或反应扩增剂。比如，可以在第一试剂中含有固定化底物，在第二试剂中含有能发现底物中被标记的物质信号的物质。作为非免疫分析用试剂盒，具体例如由
第一试剂：固定化底物溶液(碱性磷酸酶标记)
第二试剂：化学发光用底物(如AMPPD)
构成的试剂结构，或者作为免疫分析用药剂，例如由
第一试剂：固定化底物溶液
第二试剂：特异识别裂解片段的标记化抗体(碱性磷酸酶标记)
第三试剂：化学发光用底物(如AMPPD)
构成的试剂结构，根据检测系统，适当变更标记物质的组成，可以构成各种结构。
下面说明使用这些分析用试剂盒的具体测定方法的例子。首先，使认为含有待测定的酶的样品，与含有被上述酶裂解的部位，与负载了经酶标记过的底物的不溶性磁性颗粒构成的第1试剂一起，在反应容器的液体溶剂中进行反应。或者，使认为含有待测定的酶的样品溶液和上述第1试剂、以及针对待测定的不溶性磁性颗粒上的底物裂解部位的、酶标记抗体构成的第2试剂，在反应容器的液体溶剂中进行反应。在向反应容器的液体溶剂中加入第1试剂、第2试剂时，同时加也可以，分别加也可以。另外，关于加入的顺序，先从哪种试剂开始加都可以。
添加各种试剂后需要充分进行混合，也可以在混合均匀之后，停止混合经过放置后再反应。反应和普通的免疫化学反应同样，通常在pH5～10的条件下进行，优选在pH6～7的条件下进行。关于温度，通常在2～50℃的范围能够实施，但优选在室温或37～45℃条件下反应。反应时间是从刚一反应到1昼夜的任意时间。但考虑到灵敏度和便于操作，通常设定在3～60分钟的范围。
通常使用缓冲液来维持目的pH。比如用MES(2-Morpholinoethansulphonic Acid)、磷酸等作为缓冲液，可以使用从弱酸性到中性，常用的大部分缓冲液。许多情况下，为了避免非特异反应，而添加氯化钠等盐类及牛血清白蛋白等蛋白质。
与反应液相对应的不溶性磁性颗粒通常为0.0001～1重量％，优选使用0.001～0.1重量％；与反应液相对应的酶标记抗体通常为0.00001～0.1mAbs，优选使用0.0001～0.01mAbs。
实施例
下面，根据实施例具体说明本发明，但本发明的范围，不受这些限制。
《实施例1：凝血酶活性的测定》
(1)底物的标记化
C末端生物素标记肽底物的合成肽底物(N-Gly-Pro-Arg-生物素)是按照用1，2-二氨基乙烷三苯甲基树脂和用N-α-叔丁氧羰基甘氨酸作为肽的N-末端氨基酸残基的Fmoc化学法，使用肽自动合成仪合成的。从树脂除去肽的C末端氨基酸后，用5-(N-琥珀酰亚氨基氧基羰基)戊烷基D-生物素酰胺，通过1，2-二氨基乙烷作了生物素标记。生物素标记肽的侧链的全部保护基，通过与三氟乙酸反应除去。用市场出售的碱性磷酸酶标记试剂盒(同仁产品代码：LK12)，把得到的N-Gly-Pro-Arg-生物素，作了N末端氨基的碱性磷酸酶标记。
(2)底物在磁性颗粒上的结合
使抗生蛋白链菌素标记磁性颗粒(ダイナルバイオテツク公司制、粒径2.8μm)的1％悬浮液和前项(1)中制备的标记底物(0.5mg/mL)在50mmol/L MES缓冲液(pH6)中反应1小时，用前述缓冲液洗涤后，进行用0.3％牛白蛋白/0.1mol/L Tris缓冲液(pH8)的封闭，制备了结合标记底物的磁性颗粒。
(3)血浆中的凝血酶测定
利用小型自动免疫测定装置(PATHFAST；三菱化学Iatron公司制)进行了测定。具体而言是使60μL已知含量的凝血酶(0.1IU/mL)的血浆稀释系列和100μL结合标记底物的磁性颗粒的悬浮液在37℃条件下反应5分钟，用0.1mol/L Tris缓冲液(pH8)/0.15mol/L NaCl/0.1％曲拉通(Triton)X-100，洗涤磁性颗粒后，混合100μL作为化学发光底物溶液的CDP-Star(トロピツクス公司)溶液，在37℃条件下反应4分钟后，计算发光量。把血浆换成生理盐水，作为空白试验，进行了同样的操作。结果如图1所示。
如图表所示，得知由于凝血酶的浓度越高，固定化底物越易被分解，标记了酶的部位(底物片段)游离出来，颗粒上残存的底物量减少，发光读数随浓度而减少。用凝血酶已知浓度(或活性)的血浆或标准试剂，制作的校正曲线可对样品中的凝血酶浓度(或活性)定量。
《实施例2：ADAMTS13活性的测定》
(1)底物的制备
把vWF的部分片段(第1596～第1668位的氨基酸构成的片段。以下称为vWF73)，作为ADAMTS 13[别称：血管性血友病因子(vWF)裂解蛋白酶(von Willebrand Factor cleaving protease)]的底物，按KoichiKokame，Masanori Matsumoto，Yoshihiro Fujimura，and ToshiyukiMiyata，vWF73，a region from D1596 to R1668 of von Willebrand Factor，provides a minimal substrate for ADAMTS 13，Blood，Jan 2004；103：607-612中记载的方法制备。
(2)底物在磁性颗粒上的结合
使粒径2.4μm的磁性乳胶(JSR制)的1％溶液和(1)中制备的vWF73(500μg)在50mmol/L MES缓冲液(pH6)中，在室温下反应1小时，用前述缓冲液洗涤后，进行用0.3％牛白蛋白/0.1mol/L Tris缓冲液(pH8)的封闭，制备了结合底物的磁性颗粒。
(3)vWF单克隆抗体的碱性磷酸酶标记
按照Cruz MA，Whitelock J，Dong JF.Evaluation of ADAMTS-13activity in plasma using recombinant von Willebrand Factor A2 domainpolypeptide as substrate。Thromb Haemost.2003；90(6)：1204-9的记载，制成了特异识别vWF73的ADAMTS13裂解部位的单克隆抗体。利用蛋白质G柱，由抗血清纯化IgG，再在0.1mol/L乙酸钠(pH3.9)溶液中，于37℃条件下用4％胃蛋白酶消化过夜，制备F(ab’)2。再添加2-巯基乙胺溶液，在37℃条件下进行90分钟反应后，用UltrogelAcA44柱分离Fab’。在50mmol/L硼酸钠缓冲液(pH7.6)、1mmol/L氯化镁及0.1mmol/L氯化锌缓冲液中对碱性磷酸酶进行透析。在该透析液中添加N-(6-马来酰亚胺caproyloxy)丁二酰亚胺，在30℃条件下培养30分钟。用交联葡聚糖G-25柱进行凝胶过滤后，浓缩，制备加入马来酰亚胺的碱性磷酸酶。把加入马来酰亚胺的碱性磷酸酶10nmol/0.1mol/L Tris缓冲液(pH7)(包含1mmol/L氯化镁、0.1mmol/L氯化锌)和Fab’50nmol/0.1mol/L磷酸钠缓冲液(pH6)(包含5mmol/L EDTA)混合，在4℃条件下培养20小时。添加10mmol/L 2-巯基乙胺溶液，在UltrogelAcA44柱，用0.1mol/L Tris缓冲液(pH6.8)(包含0.1mmol/L氯化钠、1mmol/L氯化镁、0.1mmol/L氯化锌)进行凝胶过滤，得到酶标记Fab’。
(4)ADAMTS13活性的测定
用小型自动免疫测定装置(PATHFAST；三菱化学Iatron公司制)进行测定。具体是，使60μL健康人的血浆稀释系列与(2)中制备的100μL结合底物的磁性颗粒的悬浮液，在37℃条件下反应5分钟，再添加(3)中制备的碱性磷酸酶标记抗体vWF单克隆抗体1mAbs，在37℃条件下反应4分钟。用0.1mol/L Tris缓冲液(pH8)/0.15mol/L NaCl/0.1％曲拉通(Triton)X-100，把磁性颗粒洗净后，混合100μL，作为化学发光底物溶液的CDP-Star(トロピツクス公司制)溶液，在37℃条件下反应2分钟，计算发光量。把血浆换成生理盐水，进行同样的操作，作为空白试验。结果如图2所示。
产业上的可利用性
本发明的酶分析方法，比如可以应用于临床诊断检查方面。以上按照特定的方式说明了本发明，但是本领域技术人员能力所及范围内的变换和改良也包括在本发明的范围内。
序列表文本
下面序列表的数字标题<223>中记载了“人工序列”的描述。序列号1的序列中表示的氨基酸序列是合成底物。
序列表
<110>Mitsubishi Kagaku Iatron，Inc.
<120>酶分析方法
<130>MKI-760
<150>JP 2005-148793
<151>2005-05-20
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>4
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列描述：合成底物
<400>1
Ile Glu Gly Arg
1

Claims (9)

1.一种酶分析方法，其特征在于：所述的酶分析方法包含以下分析步骤：
(1)使可能含分析对象酶的被检验样品和下述的固定化底物在液体中接触的步骤，其中，所述的固定化底物是将可被上述分析对象酶裂解的酶底物结合于不溶性载体上的形成的；
(2)分离上述液体和不溶性载体的步骤；
(3)分析不溶性载体上残存的底物或底物片段，和/或分析从不溶性载体游离到液体中的底物片段的步骤。
2.根据权利要求1所述的酶分析方法，其中，所述的结合于不溶性载体上的上述酶底物，在被分析对象酶裂解从而由不溶性载体游离出来的底物片段一侧被标记物质作了标记。
3.根据权利要求1所述的酶分析方法，其中，用下述标记化伴生物实施上述步骤(3)的分析，所述的标记化伴生物是与所述的酶底物经上述分析对象酶裂解后所产生的新抗原特异结合、并经标记物质标记化的伴生物。
4.根据权利要求3所述的酶分析方法，其中，所述的标记化伴生物是标记化抗体。
5.根据权利要求2～4的任一项所述的酶分析方法，其中，所述的标记物质是荧光物质、发光物质、显色物质或酶。
6.根据权利要求1～5的任一项所述的酶分析方法，其中，所述的不溶性载体是颗粒。
7.根据权利要求6所述的酶分析方法，其中，所述的颗粒是乳胶颗粒或磁性颗粒。
8.一种酶分析用试剂盒，其特征在于：所述的酶分析用试剂盒包含结合在不溶性载体上且能被分析对象酶裂解的酶底物的固定化底物，而且所述的固定化底物是上述酶底物在经分析对象酶裂解后，由不溶性载体游离出来的底物片段一侧被标记物质作了标记的标记化固定化底物。
9.一种酶分析用试剂盒，其特征在于：其包含下述的固定化底物和标记化伴生物，所述的固定化底物是能被分析对象酶裂解的酶底物结合于不溶性载体上所形成的固定化底物，所述的标记化伴生物是与上述酶底物经分析对象酶裂解所产生的新抗原特异结合、并经标记物质作了标记的标记化伴生物。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104419746A (zh) * 2013-08-23 2015-03-18 中国科学院大连化学物理研究所 基于固载的混合蛋白质为筛选库的蛋白酶底物筛选方法
CN106146642A (zh) * 2016-06-27 2016-11-23 浙江星博生物科技股份有限公司 一种用于检测精子顶体酶活性的蛋白微球偶联物及其制备方法和应用
CN107727861A (zh) * 2017-08-22 2018-02-23 厦门依柯利斯医疗科技有限公司 一种胃蛋白酶测定试剂盒及测定方法

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4974655B2 (ja) * 2006-11-29 2012-07-11 三菱化学メディエンス株式会社 Ａｄａｍｔｓ１３の分析方法
GB2452076A (en) 2007-08-23 2009-02-25 Mologic Ltd Detection of enzymes by detecting binding of substrate recognition molecules to modified substrates
WO2010006605A2 (en) * 2008-07-16 2010-01-21 Radiometer Medical Aps Thrombin substrate and assay for determining the level of bioactive thrombin in a sample
GB201318728D0 (en) 2013-10-23 2013-12-04 Mologic Ltd Detection of cleavage activity of an enzyme
JPWO2017061618A1 (ja) * 2015-10-09 2018-08-16 国立大学法人 東京大学 白癬菌を検出するための方法及びキット
CN117554615A (zh) * 2024-01-12 2024-02-13 北京大学第三医院（北京大学第三临床医学院） 一种adamts13酶活性发光免疫检测方法及adamts13酶活性检测试剂盒

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS523492A (en) 1975-06-27 1977-01-11 Mitsubishi Chem Ind Ltd Sample reduction appliance
SE407405B (sv) 1975-07-11 1979-03-26 Kabi Ab Nya kromogena trombinsubstrat
CA1339812C (en) * 1988-02-19 1998-04-14 Tamami Koyama Filler for measuring enzyme activity, column packed with the filler, andmethod of measuring enzyme activity by using the column
JP2810138B2 (ja) * 1989-08-23 1998-10-15 昭和電工株式会社 酵素活性測定用充填剤、その使用方法および装置
JPH04330299A (ja) * 1991-04-26 1992-11-18 Showa Denko Kk 酵素活性測定用膜およびそれを用いる酵素活性測定方法
US5962637A (en) * 1994-06-03 1999-10-05 Microbiological Research Authority Toxin assay
JPH08313524A (ja) * 1995-05-22 1996-11-29 Teijin Ltd トロンビンレセプター発現量または活性化量の測定方法
CA2296766C (en) * 1997-07-25 2010-03-16 Du Pont Pharmaceuticals Company Aggrecan degrading metallo proteases
ES2382487T3 (es) * 2005-02-14 2012-06-08 Alfresa Pharma Corporation Anticuerpo para el análisis de la actividad de la ADAMTS13 y método de análisis de la actividad

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104419746A (zh) * 2013-08-23 2015-03-18 中国科学院大连化学物理研究所 基于固载的混合蛋白质为筛选库的蛋白酶底物筛选方法
CN104419746B (zh) * 2013-08-23 2016-08-10 中国科学院大连化学物理研究所 基于固载的混合蛋白质为筛选库的蛋白酶底物筛选方法
CN106146642A (zh) * 2016-06-27 2016-11-23 浙江星博生物科技股份有限公司 一种用于检测精子顶体酶活性的蛋白微球偶联物及其制备方法和应用
CN107727861A (zh) * 2017-08-22 2018-02-23 厦门依柯利斯医疗科技有限公司 一种胃蛋白酶测定试剂盒及测定方法
CN107727861B (zh) * 2017-08-22 2019-10-22 厦门依柯利斯医疗科技有限公司 一种胃蛋白酶测定试剂盒及测定方法

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