CN101186901A - 诱导人胎骨髓间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种诱导人胎骨髓间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法。本发明所提供的方法，包括以下步骤：分离、纯化及扩增人胎骨髓间充质干细胞；然后再诱导人胎骨髓间充质干细胞向胰岛β样细胞分化，诱导6－12天即得胰岛β样细胞团。本发明的方法在体外将人胎骨髓间充质干细胞诱导为能分泌胰岛素的胰岛β样细胞。所得的胰岛β样细胞可以进一步用作制备治疗糖尿病的药物。因此，该领域的研究具有广阔的临床应用前景，能带来较大的经济效益和社会效益。

Description

诱导人胎骨髓间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法

技术领域

本发明涉及细胞分化，具体涉及一种诱导人胎骨髓间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法。

背景技术

我国是继印度之后的第二位糖尿病高发人群大国。以往治疗糖尿病，服用药物和注射胰岛素是常用的方法，但是服用药物和注射胰岛素不仅会带来沉重的经济负担，而且会引起严重的并发症；近年来，移植胰岛治疗糖尿病初见疗效，但面临着组织来源不足和免疫排斥反应两大难题。干细胞研究给糖尿病患者带来了新的希望，其中胚胎干细胞多向分化潜能最强，几乎可以分化为包括胰腺β细胞在内的所有成体组织细胞，但其面临着伦理学的争议，并且具有致瘤性和较强的免疫原性，这些因素限制了其临床应用；胰腺干细胞是最有潜能向β细胞分化的成体干细胞，但其难以分离、扩增并且具有较强的免疫原性。成体骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)容易进行体外分离、扩增和纯化，并且可取自患者自体，能解决细胞来源和免疫排斥问题，但其向胰腺β细胞分化的效率较低，分化细胞的胰岛素分泌量少而不稳定。

发明内容

为克服现有技术的上述缺点和不足，本发明提供一种诱导人胎骨髓间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法。本发明所提供的诱导人胎骨髓间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法，包括以下步骤：

1、诱导人胎骨髓间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)分离、纯化及扩增人胎骨髓间充质干细胞：分离人胎骨髓间充质干细胞，然后收集细胞培养，当细胞达到70％～80％融合时，用D-PBS清洗后，用胰酶处理，然后加入完全培养基终止消化，吹打成单细胞悬液，离心后弃上清，再用完全培养基重新悬浮细胞；然后传代培养；

(2)诱导人胎骨髓间充质干细胞向胰岛β样细胞分化：用预诱导液抑制细胞增殖，待其达到90％融合时，常规消化，然后接种、诱导，诱导6～12天即得胰岛β样细胞团。

步骤(1)所述的用胰酶处理优选以下过程：加入质量浓度为0.25％胰酶，浸没所有细胞后倒掉，再加入质量浓度为0.25％胰酶，倒去大部分，仅剩刚好覆盖细胞的胰酶，在37℃消化1～5min。

步骤(1)所述的完全培养基优选含100mL/L  FCS、2mmol/L谷胺酰胺20mmol/L HEPES的DMEM/F12培养基。

步骤(1)所述的传代培养优选如下过程：首次传代按1∶2比例传代，以后按1∶3比例传代培养。

步骤(2)所述的预诱导液优选含50mL/L FCS，2×10^-5mol/L LY294002，1×10^-2mol/L β-Me的DMEM/F12培养基。

步骤(2)所述接种、诱导优选如下过程：按1∶2比例接种于25cm²培养瓶中，每瓶加5mL诱导液诱导。所述诱导液优选含有10ng/ml bFGF、10ng/ml EGF、1％-2％FCS的IMDM培养液。

本发明所述的人胎是指已死亡的离体胎儿，胎儿时期的MSCs因为增殖能力更强，可塑性更好，且免疫原性低，无成瘤性，因而具有显著的优越性，在体外将其初步诱导为能分泌胰岛素的胰岛β样细胞，胰岛β样细胞可进一步用于制备治疗糖尿病的药物。因此，该领域的研究具有广阔的临床应用前景，可带来较大的经济效益和社会效益。

附图说明

图1为未诱导的MSCs形态图。

图2为诱导6天后所得的胰岛样细胞团形态图。

图3是未诱导的MSCs的胰岛素阴性表达图；其中图A是胰岛β样细胞胞浆的阳性表达图；其中图B是胰岛样细胞胞核图；图C为图A与图B的合图。

图4是诱导后所得的胰岛β样细胞团的胰岛素阳性表达图(细胞爬片)；其中图A是胰岛β样细胞胞浆的阳性表达图；其中图B是胰岛β样细胞胞核图；图C为图A与图B的合图。

图5是诱导后所得的胰岛β样细胞团的胰岛素阳性表达图(石蜡切片；其中其中图A是胰岛β样细胞胞浆的阳性表达图；其中图B是胰岛β样细胞胞核图；图C为图A与图B的合图。

图6是诱导后所得的胰岛β样细胞团的胰岛素阳性表达图(石蜡切片)。

图7是人胎肝间充质干细胞诱导前后超微结构的变化对比图(扫描电镜)；其中，图A为诱导前的超微结构图；图B为诱导后的超微结构图。

图8是诱导后的人胎肝间充质干细胞超微结构图(透射电镜)；其中，图A为诱导后的超微结构图；图B为图A的放大。

图9是RT-PCR鉴定诱导后的胰岛样细胞团胰岛相关基因表达的电泳图。

图10是不同溶液对正常小鼠血糖值影响的曲线图。

图11是不同溶液对糖尿病小鼠血糖值影响的曲线图。

具体实施方式

实施例1  诱导人胎骨髓间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法

(1)人胎骨髓间充质干细胞的分离、培养及扩增

无菌生理盐水冲洗胎儿，剪去脐带后置于大烧杯中，用体积分数为75％的酒精浸泡5min，超净台中无菌取出胎儿胫骨、股骨，剔净附着其上的肌肉，剪除两端骨骺，2ml注射器抽吸含2％FCS的Hank液冲洗骨髓腔，直到髓腔发白，收集冲洗下来的液体入15ml无菌离心管中，吸管反复吹打以离散细胞，100×g离心5min，沉淀多为红细胞，取上清液转入另一离心管(去除红细胞)，500×g离心5min，弃上清液，取沉积的细胞用上述Hank液重悬，使其通过1ml注射器针头以除去残留的骨碎片，1500r/min离心5min，收集细胞重悬于完全培养基(DMEM/F12，10％FCS，2mmol/L谷胺酰胺，20mmol/LHEPES)中，反复吹打使细胞分散成单细胞悬液，取15μL用于细胞计数及细胞活力测定，按3×10⁵/cm²接种于25cm²培养瓶中，在37℃、5％CO₂的培养箱中培养。接种2 d后首次更换培养液，弃去未贴壁细胞。以后每2～3 d换液1次。细胞达到70～80％融合时，用D-PBS清洗后，加入1ml质量浓度为0.25％胰酶，浸没所有细胞后倒掉，再加入1ml质量浓度为0.25％胰酶，倒去大部分，仅剩少量胰酶覆盖细胞，在37℃消化1～5min，镜下观察作用程度，及时加入新鲜全培养液终止消化，吸管轻柔吹打成单细胞悬液，400g离心10min后弃上清，用全培养液重新悬浮细胞。首次传代按1∶2比例传代，以后按1∶3比例传代培养。

(2)诱导人胎骨髓间充质干细胞向胰岛β样细胞分化

因为胎儿胎骨髓MSCs增殖能力非常强大，对准备进行诱导的细胞，用预诱导液(DMEM/F12，5％FCS，20μmmol LY294002，10mmol β-Me)抑制其增殖，待其达到90％融合时，常规消化，按1∶2比例接种于25cm²低黏附性培养瓶中，每瓶加5mL诱导液(含10ng/ml bFGF，10ng/ml EGF及1％-2％FCS的IMDM培养液)，持续诱导6-12天。诱导分化之胰岛样细胞团大多悬浮或半悬浮，可通过离心法更换培养液。

实施例2、胰岛样细胞团的鉴定

(1)一般形态变化：图1为未诱导的MSCs形态图。图2为诱导6天后所得的胰岛样细胞团形态图。从图1可以看出未经诱导的MSCs呈长梭形，平行排列；从图2可以看出诱导6天后的MSCs聚集成胰岛样细胞团。

(2)免疫细胞化学法观查胰岛素的表达：图3是未诱导的MSCs的胰岛素阴性表达图；其中图A是胰岛β样细胞胞浆的阳性表达图；其中图B是胰岛β样细胞胞核图；图C为图A与图B的合图。免疫荧光染色结果显示：胰岛素被荧光染料Cy3染成红色，定位于细胞胞浆(图A)；胞核被特异性核染料hochest33258衬染为蓝色(图B)。

图4是诱导后所得的胰岛样细胞团的胰岛素阳性表达图(细胞爬片)；其中其中图A是胰岛β样细胞胞浆的阳性表达图；其中图B是胰岛β样细胞胞核图；图C为图A与图B的合图。

图5是诱导后所得的胰岛样细胞团的胰岛素阳性表达图(石蜡切片；其中图A是胰岛β样细胞胞浆的阳性表达图；其中图B是胰岛β样细胞胞核达图；图C为图A与图B的合图。

图6是诱导后所得的胰岛样细胞团的胰岛素阳性表达图(石蜡切片)。。

从图3与图4-6的对比可以看出，经诱导后的细胞聚集成团并且呈明显胰岛素阳性表达

(3)扫描和透射电镜观察胰岛样细胞团的超微结构

分泌细胞的典型特征是在细胞胞浆中存在分泌颗粒，也称分泌囊泡；分泌颗粒贮存着分泌物质，在适宜的刺激下，分泌颗粒会外排所包含的分泌物质，称为细胞排粒作用；在细胞排粒作用后，遗留在细胞膜上的不规则部分称为微绒毛。因此，分泌细胞的典型特征是具有分泌囊泡和微绒毛。图7是人胎肝间充质干细胞诱导前后超微结构的变化对比图(扫描电镜)；其中，图A为诱导前的超微结构图；图B为诱导后的超微结构图。由图7(A)可以看出扫描电镜下的未诱导MSCs表面无囊泡状突起，而图7(B)显示诱导的胰岛样细胞团表面分布有大小不等的囊泡样结构；图8是诱导后的人胎肝间充质干细胞超微结构图(透射电镜)；其中，图A为诱导后的胰岛β样细胞超微结构图；图B为图A的放大图。透射电镜下可观察到细胞表面有短粗的微绒毛，细胞内有大量大小不等，深浅不一的囊泡。说明所诱导的细胞初步具备了分泌细胞的形态特征。

(4)用RT-PCR鉴定诱导后胰岛样细胞团的胰岛素相关基因的表达

应用Primer5.0软件设计了β-actin，pdx-1，insulin，glut-2，glucagon，ngn3，nestin，isl-1等引物，由北京赛百盛公司合成，序列如下(各序列表可参见SEQ No.1-16)

基因	上游引物	下游引物	退火温度	扩增长度
					β-actin	5’-CCAAGGCCAACCGCGAGAAGATGAC-3’	5’-AGGGTACATGGTGGTGCCGCCAGAC-3’	60℃	592bp

glut-2nestinngn3glucagonisl-1insulinhIns：

5′-GCAGCTGCTCAACTAATCAC-3′5′-AGGATGTGGAGGTAGTGAGA-3′5′-AGACGACGCGAAGCTCACC-3′5′-CCCAAGATTTTGTGCAGTGGTT-3′5′-ACACATCTTTGGGGGAAAAG-3′5′-CATCAGAAGAGGCCATCA-3′5′-GCC TTT GTG AAC CAA CACCTG-3′，

5’-TCAGCAGCACAAGTCCCACT-3′5′-TGGAGATCTCAGTGGCTCT-3′5′-AAGCCAGACTGCCTGGGCT-3′5′-GCGGCCAAGTTCTTCAACAAT-3′5′-AAAAAGCGCAGGAAGAGAG-3′5′-TGGTTCAAGGGCTTTATTCC-3′5′-GTT GCA GTA GTT CTC CAGCTG-3′

57℃55℃60℃57℃55℃53℃55℃

785bp251bp286bp221bp347bp444bp261bp

RT-PCR鉴定结果显示诱导细胞表达高度表达hlns，isl-1，insulin，glut-2和glucogan，弱表达nestin和ngn3。图9是RT-PCR鉴定诱导后的胰岛样细胞团胰岛相关基因表达的电泳图。其中hlns，isl-1，insulin是胰岛β细胞特征性表达的基因；GLUT-2是葡萄糖转运蛋白家族中的一种，在胰岛β细胞膜上表达，是胰岛β细胞调节血糖重要的功能蛋白；nestin和ngn3在胰岛前体细胞中有所表达；胰岛α细胞合成和分泌glucogan；因此，这几种基因的联合表达说明诱导的细胞已初步具备了胰岛β细胞和胰岛α细胞的分子特征。

(5)利用化学发光免疫分析法检测检测培养液上清及细胞裂解液中胰岛素分泌水平

取单纯诱导液、未诱导MSCs的培养液上清、诱导6 d形成胰岛样细胞团的培养液上清，用化学发光免疫分析法检测各上清中胰岛素含量。结果未诱导的MSCs的培养上清中检测不到胰岛素；而经过诱导的胰岛样细胞团，可检测到(210±35.07)μU/mL的胰岛素；细胞裂解液中胰岛素与细胞总蛋白的比值为(132.7±33.23)ng/mg蛋白。诱导的细胞团在含有5.5mmol/L葡萄糖的无血清培养基作用2h后，可分泌.(1.3±0.04)μU/mL的胰岛素；而在含有25mmol/L葡萄糖的无血清培养基2h后，可分泌(5.7±0.21)μ U/mL胰岛素，其刺激指数为4.38，说明诱导后的细胞对糖刺激具有一定的反应性(注：刺激指数＝高糖刺激后胰岛素分泌量/低糖刺激后胰岛素分泌量)。

实施例3、小鼠腹腔注射实验

取生理盐水，单纯诱导液，诱导6天的培养液上清(化学发光法检测胰岛素水平为3U/mL)以及标准胰岛素溶液(4U/mL)各300μL，腹腔注射入正常小鼠和糖尿病小鼠体内，表一、不同溶液对正常小鼠血糖值的影响。表二、不同溶液对糖尿病小鼠血糖值的影响。结果表明标准胰岛素溶液对正常小鼠和糖尿病小鼠均有快速而明显的降血糖作用，而诱导6天的培养液上清对正常小鼠的无降糖作用，但对糖尿病小鼠有较快速和明显的降血糖作用，作用趋势与标准胰岛素溶液相似。注射相同容量生理盐水及单纯诱导液对正常小鼠和糖尿病小鼠均无降糖作用。

图10是不同溶液对正常小鼠血糖值影响的曲线图。图11是不同溶液对糖尿病小鼠血糖值影响的曲线图。由图10可见，在不同的时间点，标准胰岛素溶液对正常小鼠具有迅速而明显的降血糖作用，在腹腔注射后2.5小时血糖降到最低，6小时后恢复正常；而注射生理盐水，单纯诱导液，诱导6天的培养液上清对正常小鼠血糖值没有明显的改变。由图11可见，在不同的时间点，标准胰岛素溶液对糖尿病小鼠具有迅速的降血糖作用，在腹腔注射后1.0小时降到最低，5小时后恢复正常；注射诱导6天的培养液上清对糖尿病小鼠也有较快速明显的降血糖作用，在腹腔注射后1.0小时降到最低，5小时后恢复正常，其降糖趋势及持续时间与标准胰岛素溶液相似；而注射生理盐水，单纯诱导液，诱导6天的培养液上清对正常小鼠血糖值没有明显的改变。

表一、不同溶液对正常小鼠血糖值的影响(X±s，n＝6，mmol/L)

时间	注射标准胰岛素溶液	注射诱导6天之培养液	注射单纯诱导液	注射生理盐水
					0 h1.0h1.5h2.5h3h3.5h	6.22.71.91.32.23.2	6.637.46.466.837.16.9	6.258.057.26.27.16.7	6.76.56.87.37.57

4.5h5.5h6.5h

5.157.256.3

67.46.2

6.97.36.6

6.87.17.3

表二、不同溶液对糖尿病小鼠血糖值的影响(X±s，n＝6，mmol/L)

时间	注射标准胰岛素溶液	注射诱导6天之培养液	注射单纯诱导液	注射生理盐水
					0h0.2h0.5h1h2h3h4h5h	24.9513.94.13.855.8514.151628.45	25.0616.3811.8414.2615.818.514.529.65	26.126.627.227.526.927.827.228.8	24.6724.7924.9825.1225.7424.9726.3227.47

SEQUENCE LISTING

<110>暨南大学

<120>诱导人胎骨髓间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法

<160>16

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>β-actin上游引物

<400>1

ccaaggccaa ccgcgagaag atgac                                          25

<210>2

<211>25

<212>DNA

<213>β-actin下游引物

<400>2

agggtacatg gtggtgccgc cagac                                          25

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>glut-2上游引物

<400>3

gcagctgctc aactaatcac                                                20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>glut-2下游引物

<400>4

tcagcagcac aagtcccact                                                20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>nestin上游引物

<400>5

aggatgtgga ggtagtgaga                                                20

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>nestin下游引物

<400>6

tggagatctc agtggctct                                                  19

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>ngn3上游引物

<400>7

agacgacgcg aagctcacc                                                  19

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>ngn3下游引物

<400>  8

 aagccagact gcctgggct                                                  19

<210>9

<211>22

<212>DNA

<213>glucagon上游引物

<400>9

cccaagattt tgtgcagtgg tt                                              22

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>glucagon下游引物

<400>10

gcggccaagt tcttcaacaa t                                                21

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>isl-1上游引物

<400>11

acacatcttt gggggaaaag                                                  20

<210>12

<211>19

<212>DNA

<213>isl-1下游引物

<400>12

aaaaagcgca ggaagagag                                                   19

<210>13

<211>18

<212>DNA

<213>insulin上游引物

<400>13

catcagaaga ggccatca                                                    18

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>insulin下游引物

<400>14

tggttcaagg gctttattcc                                                  20

<210>15

<211>21

<212>DNA

<213>hIns上游引物

<400>15

gcctttgtga accaacacct g                                               21

<210>16

<211>21

<212>DNA

<213>hIns下游引物

<400>16

gttgcagtag ttctccagct g                                               21

Claims (7)

1.诱导人胎骨髓间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)分离、纯化及扩增人胎骨髓间充质干细胞：分离人胎骨髓间充质干细胞，然后收集细胞培养，当细胞达到70％～80％融合时，用D-PBS清洗后，用胰酶处理，然后加入完全培养基终止消化，吹打成单细胞悬液，离心后弃上清，再用完全培养基重新悬浮细胞；然后传代培养；

(2)诱导人胎骨髓间充质干细胞向胰岛β样细胞分化：用预诱导液抑制细胞增殖，待其达到90％融合时，常规消化，然后接种、诱导，诱导6～12天即得胰岛β样细胞团。

2.根据权利要求1所述的诱导人胎骨髓间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法，其特征在于，步骤(1)所述的用胰酶处理包括以下过程：加入质量浓度为0.25％胰酶，浸没所有细胞后倒掉，再加入质量浓度为0.25％胰酶，倒去大部分，仅剩刚好覆盖细胞的胰酶，在37℃消化1～5min。

3.根据权利要求1所述的诱导人胎骨髓间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法，其特征在于，步骤(1)所述的完全培养基为含有100ml/L FCS、2mmol/L谷胺酰胺、20mmol/L HEPES的DMEM/F12培养基。

4.根据权利要求1所述的诱导人胎骨髓间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法，其特征在于，步骤(1)所述的传代培养包括如下过程：首次传代按1∶2比例传代，以后按1∶3比例传代培养。

5.根据权利要求1所述的诱导人胎骨髓间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法，其特征在于，步骤(2)所述的预诱导液包括含50mL/L FCS、2×10^-5mol/L LY294002、1×10^-2mol/L β-Me的DMEM/F12培养基。

6.根据权利要求1所述的诱导人胎骨髓间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法，其特征在于，步骤(2)所述接种、诱导包括如下过程：按1∶2比例接种于25cm²培养瓶中，每瓶加5mL诱导液诱导。

7.根据权利要求6所述的诱导人胎骨髓间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法，其特征在于，所述诱导液包括含有10ng/ml bFGF、10ng/ml EGF、1％-2％FCS的IMDM培养液。

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