CN101176791A - 连接有聚乙二醇的氨基酸及其制法和用途 - Google Patents
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Abstract
一种连接有聚乙二醇的氨基酸，它具有以下结构通式：R－PEG－CO－X－氨基酸或R－PEG－X－氨基酸，其中PEG为聚乙二醇链，R为PEG的羟基或烃氧基，烃氧基可以选自C1～C12烷氧基、环烷氧基或芳烷氧基，X为氨基酸中除α－羧基和α－氨基外的脱去活性氢的杂原子。用本发明的连接有聚乙二醇的氨基酸合成多肽，可以得到聚乙二醇链在特定位置的多肽，如此的多肽不但改善了它们的药代动力学，而且不影响多肽原有的治疗作用。本发明公开了其制法。
Description
技术领域
本发明涉及连接了聚乙二醇长链的氨基酸、其制备方法及其用于多肽的合成，用于制备带有聚乙二醇长链的多肽。
背景技术
随着生物技术的发展，越来越多的具有生物活性的小肽被研究者发现具有治疗作用，如：胸腺肽、生长抑素、血管紧张素、阿基瑞林等等。但小肽应用于临床也有许多不利之处，例如易产生免疫排斥反应、稳定性较差、在体内被清除速率较快等。因此，人们采用了各种方法消除上述不利因素，其中手段之一是采用聚乙二醇化技术。
聚乙二醇化技术(PEGylation PEG化)又称为化学修饰，是目前分子变构化学(molecule altering structure chemistry，MASC)中最重要的技术之一。PEG化技术的研究始于20世纪80年代，Abuchowski等第一次将聚乙二醇共价结合到蛋白质上，以保护蛋白质免遭破坏，结果发现聚乙二醇修饰不仅可以增加蛋白质的水溶性，还能减缓肾脏的清除，改变了蛋白质的药代动力学和药效学性质。经过近几十年的发展，PEG化技术不仅在蛋白质类药物的开发中得到普遍的应用，而且已扩展到新型药物载体、控释制剂等各个领域。
许多制备聚乙二醇化小肽的方法已被报道，潘和平等在中国专利200310117356.5中报道了胸腺五肽的聚乙二醇化衍生物，含有它们的药物组合物及用途；中国专利200410066897.4中报道了一种人胰高血糖素样肽-1的复合物及其制备方法，连接了PEG的人胰高血糖素样肽-1生物稳定性高，体内半衰期长，生物利用度高。
在传统的聚乙二醇化技术中，需要对聚乙二醇的端基进行活化，引入适当的活性基团，此活性基团对要结合的药物分子中的至少一个官能团具有活性，能与之形成稳定的化学键。但这种方法在用于小肽的PEG化时存在着许多的局限性：其一是小肽的氨基酸中可能不具有能与活化的PEG结合的侧链基团。另外，小肽的分子量较小，PEG化的位点可能覆盖了活性部位。
本发明提供的带有PEG的氨基酸用于多肽的合成，可以在设定好的位点引入PEG，避免了传统PEG化方法的局限性。
发明内容
本发明提供一种新型的，带有聚乙二醇的氨基酸，能用于多肽的化学合成。
本发明的技术方案如下：
一种连接有聚乙二醇的氨基酸，它具有以下结构通式：
R-PEG-CO-X-氨基酸
或
R-PEG-X-氨基酸
其中PEG为聚乙二醇链，R为PEG的羟基或烃氧基，烃氧基可以选自C1～C12烷氧基、环烷氧基或芳烷氧基，X为氨基酸中除α-羧基和α-氨基外的脱去活性氢的杂原子。
本发明的连接有聚乙二醇的氨基酸，其中的氨基酸优选的是侧链含杂原子的天然氨基酸。它们中最优选的天然氨基酸是赖氨酸、组胺酸、半胱氨酸、酪氨酸或精氨酸，烃氧基为甲氧基，它们有如下几种结构：
结构1
结构2
结构3
结构4
结构5
一种制备上述连接有聚乙二醇的氨基酸的方法，它包括以下步骤：
取单烃氧基聚乙二醇酸，α-叔丁氧羰基氨基酸和二环己基碳二亚胺(DCC)溶于二氯甲烷中，所述的氨基酸是除α-羧基和α-氨基外还具有带活性氢的氮原子的氨基酸，在室温下搅拌回流4~16小时，将混合物过滤，滤液减压蒸干并真空干燥，即得连接有聚乙二醇的α-叔丁氧羰基氨基酸。
其反应式如下：
一种制备上述连接有聚乙二醇的氨基酸的方法，它包括以下步骤：
取单烃氧基聚乙二醇酰氯溶于二氯甲烷中，再加入α-叔丁氧羰基氨基酸和三乙胺(TEA)，所述的氨基酸是除α-羧基和α-氨基外还具有带活性氢的杂原子(N、O或S)的氨基酸，室温下搅拌过夜，将反应混合物过滤，滤液蒸发浓缩并真空干燥，即得连接有聚乙二醇的α-叔丁氧羰基氨基酸。
其反应式如下：
一种制备上述连接有聚乙二醇的氨基酸的方法，它包括以下步骤：
取单烃氧基聚乙二醇溶于二氯亚砜中，室温搅拌2小时，旋转蒸发除去剩余的二氯亚砜，将所得固体物质溶于二氯甲烷中，再加入α-叔丁氧羰基氨基酸和三乙胺，所述的氨基酸是除α-羧基和α-氨基外还具有带活性氢的杂原子的氨基酸，室温下搅拌过夜，过滤反应混合物，滤液蒸发浓缩并真空干燥，即得连接有聚乙二醇的α-叔丁氧羰基氨基酸。
其反应式如下：
一种制备上述连接有聚乙二醇的氨基酸的方法，它包括以下步骤：
取单烃氧基聚乙二醇胺，α-叔丁氧羰基氨基酸和二环己基碳二亚胺(DCC)溶于二氯甲烷中，所述的氨基酸是除α-羧基和α-氨基外还具有其它羧基的氨基酸，在室温下搅拌回流4～16小时，将混合物过滤，滤液减压蒸干并真空干燥，即得连接有聚乙二醇的α-叔丁氧羰基氨基酸。
其反应式如下：
将上述所得的连接有聚乙二醇的α-叔丁氧羰基氨基酸溶于二氯甲烷中，并加入适量三氟乙酸，搅拌，然后蒸发浓缩并真空干燥，所得固体物质用二氯甲烷溶解并用干燥剂干燥，过滤后再加入冷却乙醚至滤液中，将所得沉淀物过滤后真空干燥，即得连接有聚乙二醇的氨基酸。
其反应式如下：
本发明的连接有聚乙二醇的氨基酸的用途，是用于多肽的合成，或将其连接到药物上以改变它们的药代动力学和药效学性质。
用本发明的连接有聚乙二醇的氨基酸合成多肽，可以得到聚乙二醇链在特定位置的多肽，如此的多肽不但改善了它们的药代动力学，而且不影响多肽原有的治疗作用。
具体实施方式
实施例1：mPEG-CO-ε-NH-Lys的制备
反应式：
取1g单甲氧基聚乙二醇酸1000(0.001mol)，0.74g α-叔丁氧羰基-L-赖氨酸(0.003mol)和0.62g二环己基碳二亚胺(DCC，0.003mol)溶于100ml二氯甲烷中，室温下搅拌回流16小时。将混合物过滤，滤液减压蒸干并真空干燥。将所得固体物质溶于100ml二氯甲烷中，并加入适量三氟乙酸，搅拌然后在55℃旋转蒸发浓缩并真空干燥，所得固体物质用50ml二氯甲烷溶解并用无水硫酸镁干燥，过滤后再加入100ml冷却乙醚至滤液中，将所得沉淀物过滤后真空干燥。得产物mPEG-CO-ε-NH-Lys 1.52g。
实施例2：mPEG-CO-His的制备
反应式：
取1g单甲氧基聚乙二醇酸1000(0.001mol)溶于50ml二氯甲烷中，加入二氯亚砜(2ml，0.004mol)的二氯甲烷溶液，室温下搅拌过夜。将混合液旋转蒸发，所得固体残渣真空干燥。将所得固体物质溶于100ml二氯甲烷中，再加入0.77g α-叔丁氧羰基-L-组氨酸(0.003mol)和0.6ml三乙胺，室温下搅拌过夜。过滤，将适量三氟乙酸加入到滤液中搅拌然后在55℃旋转蒸发浓缩并真空干燥，所得固体物质用50ml二氯甲烷溶解并用无水硫酸镁干燥，过滤后再加入100ml冷却乙醚至滤液中，将所得沉淀物过滤后真空干燥。得产物mPEG-CO-His1.43g。
实施例3：mPEG-CO-Trp的制备
反应式：
取4g单甲氧基聚乙二醇酸4000(0.001mol)溶于50ml二氯甲烷中，加入二氯亚砜(2ml，0.004mol)的二氯甲烷溶液，室温下搅拌过夜。将混合液旋转蒸发，所得固体残渣真空干燥。将所得固体物质溶于100ml二氯甲烷中，再加入0.91g α-叔丁氧羰基-L-色氨酸(0.003mol)和0.6ml三乙胺，室温下搅拌过夜。过滤，将适量三氟乙酸加入到滤液中搅拌然后在55℃旋转蒸发浓缩并真空干燥，所得固体物质用50ml二氯甲烷溶解并用无水硫酸镁干燥，过滤后再加入100ml冷却乙醚至滤液中，将所得沉淀物过滤后真空干燥。得产物mPEG-CO-Trp 4.12g。
实施例4：mPEG-CO-S-Cys的制备
反应式：
取4g单甲氧基聚乙二醇酸4000(0.001mol)溶于50ml二氯甲烷中，加入二氯亚砜(2ml，0.004mol)的二氯甲烷溶液，室温下搅拌过夜。将混合液旋转蒸发，所得固体残渣真空干燥。将所得固体物质溶于100ml二氯甲烷中，再加入0.66g叔丁氧羰基-L-半胱氨酸(0.003mol)和0.6ml三乙胺，室温下搅拌过夜。过滤，将适量三氟乙酸加入到滤液中搅拌然后在55℃旋转蒸发浓缩并真空干燥，所得固体物质用50ml二氯甲烷溶解并用无水硫酸镁干燥，过滤后再加入100ml冷却乙醚至滤液中，将所得沉淀物过滤后真空干燥。得产物mPEG-CO-S-Cys 4.08g。
实施例5：mPEG-CO-O-Tyr的制备
反应式：
取8g单甲氧基聚乙二醇酸8000(0.001mol)溶于50ml二氯甲烷中，加入二氯亚砜(2ml，0.004mol)的二氯甲烷溶液，室温下搅拌过夜。将混合液旋转蒸发，所得固体残渣真空干燥。将所得固体物质溶于100ml二氯甲烷中，再加入1.14g叔丁氧羰基-L-酪氨酸(0.003mol)和0.6ml三乙胺，室温下搅拌过夜。过滤，将适量三氟乙酸加入到滤液中搅拌然后在55℃旋转蒸发浓缩并真空干燥，所得固体物质用50ml二氯甲烷溶解并用无水硫酸镁干燥，过滤后再加入100ml冷却乙醚至滤液中，将所得沉淀物过滤后真空干燥。得产物mPEG-CO-O-Tyr 7.25g。
实施例6：mPEG-CO-O-Ser的制备
反应式：
取8g单甲氧基聚乙二醇酸8000(0.001mol)溶于50ml二氯甲烷中，加入二氯亚砜(2ml，0.004mol)的二氯甲烷溶液，室温下搅拌过夜。将混合液旋转蒸发，所得固体残渣真空干燥。将所得固体物质溶于100ml二氯甲烷中，再加入0.62g叔丁氧羰基-L-丝氨酸(0.003mol)和0.6ml三乙胺，室温下搅拌过夜。过滤，将适量三氟乙酸加入到滤液中搅拌然后在55℃旋转蒸发浓缩并真空干燥，所得固体物质用50ml二氯甲烷溶解并用无水硫酸镁干燥，过滤后再加入100ml冷却乙醚至滤液中，将所得沉淀物过滤后真空干燥。得产物mPEG-CO-O-Ser 7.14g。
实施例7：mPEG-CO-O-Thr的制备
反应式：
取8g单甲氧基聚乙二醇酸8000(0.001mol)溶于50ml二氯甲烷中，加入二氯亚砜(2ml，0.004mol)的二氯甲烷溶液，室温下搅拌过夜。将混合液旋转蒸发，所得固体残渣真空干燥。将所得固体物质溶于100ml二氯甲烷中，再加入0.66g叔丁氧羰基-L-苏氨酸(0.003mol)和0.6ml三乙胺，室温下搅拌过夜。过滤，将适量三氟乙酸加入到滤液中搅拌然后在55℃旋转蒸发浓缩并真空干燥，所得固体物质用50ml二氯甲烷溶解并用无水硫酸镁干燥，过滤后再加入100ml冷却乙醚至滤液中，将所得沉淀物过滤后真空干燥。得产mPEG-CO-O-Thr 6.89g。
实施例8：mPEG-NH-Glu的制备
反应式：
取10g单甲氧基聚乙二醇胺10000(0.001mol)，0.45g谷氨酸1甲酯(0.003mol)和0.62g二环己基碳二亚胺(DCC，0.003mol)溶于100ml二氯甲烷中，室温下搅拌回流16小时。将混合物过滤，滤液减压蒸干并真空干燥。将所得固体物质溶于200ml蒸馏水并加入50ml甲醇，用KOH调pH值至10后搅拌过夜。然后过滤并将滤液用二氯甲烷萃取(50ml*3)，合并有机层并用无水硫酸镁干燥，过滤后加入200ml冷却乙醚至滤液中，将所得沉淀物过滤后真空干燥。得产物mPEG-NH-Glu 8.92g。
实施例9：mPEG-NH-Asp的制备
反应式：
取10g单甲氧基聚乙二醇胺10000(0.001mol)，0.4g天冬氨酸α甲酯(0.003mol)和0.62g二环己基碳二亚胺(DCC，0.003mol)溶于100ml二氯甲烷中，室温下搅拌回流16小时。将混合物过滤，滤液减压蒸干并真空干燥。将所得固体物质溶于200ml蒸馏水并加入50ml甲醇，用KOH调pH值至10后搅拌过夜。然后过滤并将滤液用二氯甲烷萃取(50ml*3)，合并有机层并用无水硫酸镁干燥，过滤后加入200ml冷却乙醚至滤液中，将所得沉淀物过滤后真空干燥。得产物mPEG-NH-Asp8.85g。
实施例10：mPEG-S-Cys的制备
反应式：
取10g单甲氧基聚乙二醇10000(0.001mol)溶于25ml二氯亚砜中，室温搅拌2小时，旋转蒸发除去剩余的二氯亚砜，将所得固体物质溶于100ml乙醇中，再加入0.66g叔丁氧羰基-L-半胱氨酸(0.003mol)和0.4g NaOH(0.01mol)，室温下搅拌回流8小时。将混合液减压蒸干，所得固体物质溶解于100ml二氯甲烷中，并加入适量三氟乙酸，搅拌然后在55℃旋转蒸发浓缩并真空干燥，所得固体物质用50ml二氯甲烷溶解并用无水硫酸镁干燥，过滤后再加入100ml冷却乙醚至滤液中，将所得沉淀物过滤后真空干燥。得产物mPEG-S-Cys 8.89g。
实施例11：mPEG-ε-NH-Lys的制备
反应式：
取20g单甲氧基聚乙二醇20000(0.001mol)溶于25ml二氯亚砜中，室温搅拌3小时，旋转蒸发除去剩余的二氯亚砜，将所得固体物质溶于100ml二氯甲烷中，再加入0.74g叔丁氧羰基-L-赖氨酸(0.003mol)和0.6ml三乙胺，室温下搅拌过夜。过滤，将适量三氟乙酸加入到滤液中搅拌然后在55℃旋转蒸发浓缩并真空干燥，所得固体物质用50ml二氯甲烷溶解并用无水硫酸镁干燥，过滤后再加入100ml冷却乙醚至滤液中，将所得沉淀物过滤后真空干燥。得产物mPEG-ε-NH-Lys 17.38g。
实施例12：mPEG-O-Ser的制备
反应式：
取20g单甲氧基聚乙二醇20000(0.001mol)溶于25ml二氯亚砜中，室温搅拌3小时，旋转蒸发除去剩余的二氯亚砜，将所得固体物质溶于100ml二氯甲烷中，再加入0.62g叔丁氧羰基-L-丝氨酸(0.003mol)和0.6ml三乙胺，室温下搅拌过夜。过滤，将适量三氟乙酸加入到滤液中搅拌然后在55℃旋转蒸发浓缩并真空干燥，所得固体物质用50ml二氯甲烷溶解并用无水硫酸镁干燥，过滤后再加入100ml冷却乙醚至滤液中，将所得沉淀物过滤后真空干燥。得产物mPEG-O-Ser 16.97g。
实施例13：mPEG-O-Thr的制备
反应式：
取20g单甲氧基聚乙二醇20000(0.001mol)溶于25ml二氯亚砜中，室温搅拌3小时，旋转蒸发除去剩余的二氯亚砜，将所得固体物质溶于100ml二氯甲烷中，再加入0.66g叔丁氧羰基-L-苏氨酸(0.003mol)和0.6ml三乙胺，室温下搅拌过夜。过滤，将适量三氟乙酸加入到滤液中搅拌然后在55℃旋转蒸发浓缩并真空干燥，所得固体物质用50ml二氯甲烷溶解并用无水硫酸镁干燥，过滤后再加入100ml冷却乙醚至滤液中，将所得沉淀物过滤后真空干燥。得产物mPEG-O-Thr 18.16g。
实施例14：mPEG-O-Tyr的制备
取40g单甲氧基聚乙二醇40000(0.001mol)溶于25ml二氯亚砜中，室温搅拌3小时，旋转蒸发除去剩余的二氯亚砜，将所得固体物质溶于100ml乙醇中，再加入1.14g叔丁氧羰基-L-酪氨酸(0.003mol)和0.4g NaOH(0.01mol)，室温下搅拌回流8小时。将混合液减压蒸干，所得固体物质溶解于100ml二氯甲烷中，并加入适量三氟乙酸，搅拌然后在55℃旋转蒸发浓缩并真空干燥，所得固体物质用50ml二氯甲烷溶解并用无水硫酸镁干燥，过滤后再加入100ml冷却乙醚至滤液中，将所得沉淀物过滤后真空干燥。得产物mPEG-O-Tyr 35.14g。
实施例15：mPEG-N-Arg的制备
反应式：
取40g单甲氧基聚乙二醇40000(0.001mol)溶于25ml二氯亚砜中，室温搅拌3小时，旋转蒸发除去剩余的二氯亚砜，将所得固体物质溶于100ml二氯甲烷中，再加入0.82g叔丁氧羰基-L-精氨酸(0.003mol)和0.6ml三乙胺，室温下搅拌过夜。过滤，将适量三氟乙酸加入到滤液中搅拌然后在55℃旋转蒸发浓缩并真空干燥，所得固体物质用50ml二氯甲烷溶解并用无水硫酸镁干燥，过滤后再加入100ml冷却乙醚至滤液中，将所得沉淀物过滤后真空干燥。得产物mPEG-N-Arg 36.42g。
实施例16：mPEG-N-His的制备
反应式：
取60g单甲氧基聚乙二醇60000(0.001mol)溶于25ml二氯亚砜中，室温搅拌4小时，旋转蒸发除去剩余的二氯亚砜，将所得固体物质溶于100ml二氯甲烷中，再加入0.77gα-叔丁氧羰基-L-组氨酸(0.003mol)和0.6ml三乙胺，室温下搅拌过夜。过滤，将适量三氟乙酸加入到滤液中搅拌然后在55℃旋转蒸发浓缩并真空干燥，所得固体物质用50ml二氯甲烷溶解并用无水硫酸镁干燥，过滤后再加入100ml冷却乙醚至滤液中，将所得沉淀物过滤后真空干燥。得产物mPEG-N-His 52.45g。
实施例17：mPEG-N-Trp的制备
反应式：
取60g单甲氧基聚乙二醇60000(0.001mol)溶于25ml二氯亚砜中，室温搅拌4小时，旋转蒸发除去剩余的二氯亚砜，将所得固体物质溶于100ml二氯甲烷中，再加入0.91gα-叔丁氧羰基-L-色氨酸(0.003mol)和0.6ml三乙胺，室温下搅拌过夜。过滤，将适量三氟乙酸加入到滤液中搅拌然后在55℃旋转蒸发浓缩并真空干燥，所得固体物质用50ml二氯甲烷溶解并用无水硫酸镁干燥，过滤后再加入100ml冷却乙醚至滤液中，将所得沉淀物过滤后真空干燥。得产物mPEG-N-Trp50.34g。
实施例18：PEG-胸腺五肽的合成：Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-PEG
(1)第1个氨基酸与树脂的连接：称取树脂(Wang树脂，上海吉尔生化)0.5g，置多肽合成反应器中，加入二氯甲烷浸泡树脂过夜后，抽干；在多肽合成反应器中，加入NMP(N-甲基吡咯烷酮)溶解的经Fmoc保护的、带有PEG的酪氨酸(Fmoc-Tyr(OtBu)-O-PEG)0.5g(实施例14制备的mPEG-O-Tyr再进行Fmoc保护)后，将1mmol的DCC和浓度为5％(质量分数)的DMAP(4-N，N-二甲基氨基吡啶)NMP溶液加入到反应器在室温振荡反应20min；用NMP冲洗树脂除去多余保护氨基酸。
(2)脱除Fmoc保护基：向反应器中加入20％哌啶/NMP溶液脱除Fmoc基团，反应20min，排空反应器的液体，用5ml NMP冲洗树脂，手摇振荡，重复冲洗3次。仍用上述同样量的溶液重复操作两次，抽干。
(3)接位氨基酸C末端的活化：将1mmol将市售的氨基保护的Val氨基酸(Fmoc-Val-OH)加入到反应容器中；加入3ml 0.1333mol/L HBTU(2-(1H-苯并三唑)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐)与1mol/L HOBt(1-羧基苯并三氮唑，)/NMP振荡反应，将保护了氨基的Val氨基酸的羧基活化。
(4)肽键的形成：在步骤(2)脱除Fmoc保护基的树脂中加入步骤(3)得到的羧基活化、氨基保护的氨基酸Val进行耦合反应，抽干、洗涤。
(5)肽链的延长：重复(2)-(4)步骤，依次将氨基保护的Asp、Lys、Arg的C末端活化后加入上一级的脱去Fmoc的树脂，完成肽链的延长。
(6)脱除侧链保护基及肽链上的树脂：在最后形成的五肽树脂中，加入二氯甲烷、三氟乙酸，于25℃反应60min，加入含50％三氟乙酸(体积分数)的二氯甲烷溶液10mL，反应20min，滤去树脂后，滤液经旋转蒸发仪浓缩，加入过量乙醚，析出白色粉末状物，离心分离除去清液，真空干燥，即得PEG-胸腺五肽，0.375g。
实施例19：PEG-阿拉瑞林的合成：Glu-His-Trp-Ser(PEG)-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro
(1)第1个氨基酸与树脂的连接：称取树脂0.5g，置多肽合成反应器中，加入二氯甲烷浸泡树脂过夜后，抽干；在多肽合成反应器中，加入NMP(N-甲基吡咯烷酮)溶解经Fmoc保护的脯氨酸(Fmoc-Pro-OH)0.5g后，将1mmol的DCC和5％DMAP(4-N，N-二甲基氨基吡啶)加入到反应器室温振荡反应20min；用NMP冲洗树脂除去多余保护氨基酸。
(2)脱除Fmoc保护基：向反应器中加入20％哌啶/NMP溶液脱除Fmoc基团，反应20min，排空反应器，用5mL NMP冲洗树脂，手摇振荡，重复3次。仍用上述同样量的溶液重复操作两次，抽干。
(3)接位氨基酸C末端的活化：将1mmol保护氨基酸(Fmoc-Arg-OH)加入到活化器中；加入3ml 0.1333mol/L HBTU(2-(1H-苯并三唑)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐)与1mol/L HOBt(1-羧基苯并三氮唑)/NMP振荡反应，活化保护氨基酸。
(4)肽键的形成：在上述脱除Fmoc保护基的树脂中加入羧基活化、氨基保护的氨基酸进行耦合反应，抽干、洗涤。
(5)肽链的延长：重复(2)-(4)步骤，依次将氨基保护的Leu、D-Ala、Tyr的C末端活化后加入上一级的脱去Fmoc的树脂上，进行肽链的延长。
(6)连接带有PEG的丝氨酸：将PEG-O-Ser(实施例12制备)用Fmoc进行氨基保护后加入到活化器中，加入3ml 0.1333mol/L HBTU与1mol/L HOBt/NMP振荡反应，活化保护氨基酸。
(7)将上一级脱除Fmoc保护基的树脂中加入羧基活化、氨基保护的PEG-O-Ser进行耦合反应，抽干、洗涤。
(8)肽链的延长：重复(2)-(4)步骤，依次将氨基保护的Trp、His、Glu的C末端活化后加入上一级的脱去Fmoc的树脂，进行肽链的延长。
(6)脱除侧链保护基及肽链上的树脂：在最后形成的九肽树脂中，加入二氯甲烷、三氟乙酸，于25℃反应60min，将含50％三氟乙酸(体积分数)的二氯甲烷溶液10mL加入，反应20min，之后经旋转蒸发仪蒸至余液少许，加入过量乙醚，析出白色粉末状物，离心分离除去清液，真空干燥，得多肽产物0.429g。
实施例20：mPEG-NH-Glu-Ibuprofen的制备
取10g制备好的mPEG-NH-Glu 10000(0.001mol)和0.62g布洛芬(Ibuprofen)(0.003mol)和0.62g二环己基碳二亚胺(DCC，0.003mol)溶于100ml二氯甲烷中，室温下搅拌回流16小时。将混合物过滤，滤液减压蒸干并真空干燥。将所得固体物质溶于75ml二氯甲烷中并用无水硫酸镁干燥，过滤后再加入200ml冷却乙醚至滤液中，将所得沉淀物过滤后真空干燥。得产物mPEG-NH-Glu-Ibuprofen 8.62g。
Claims (9)
1.一种连接有聚乙二醇的氨基酸，其特征是它具有以下结构通式：
R-PEG-CO-X-氨基酸
或
R-PEG-x-氨基酸
其中PEG为聚乙二醇链，R为PEG的羟基或烃氧基，烃氧基选自C1～C12烷氧基、环烷氧基或芳烷氧基，X为氨基酸中除α-羧基和α-氨基外的脱去活性氢的杂原子。
2.根据权利要求1所述的连接有聚乙二醇的氨基酸，其特征是：其中的氨基酸是侧链含杂原子的天然氨基酸。
3.根据权利要求2所述的连接有聚乙二醇的氨基酸，其特征是：它们中的天然氨基酸是赖氨酸、组胺酸、半胱氨酸、酪氨酸或精氨酸，烃氧基为甲氧基。
4.一种制备权利要求1所述的连接有聚乙二醇的氨基酸的方法，其特征是它包括以下步骤：
取单烃氧基聚乙二醇酸，α-叔丁氧羰基氨基酸和二环己基碳二亚胺溶于二氯甲烷中，所述的氨基酸是除α-羧基和α-氨基外还具有带活性氢的氮原子的氨基酸，在室温下搅拌回流4～16小时，将混合物过滤，滤液减压蒸干并真空干燥，即得连接有聚乙二醇的α-叔丁氧羰基氨基酸。
5.一种制备权利要求1所述的连接有聚乙二醇的氨基酸的方法，其特征是它包括以下步骤：
取单烃氧基聚乙二醇酰氯溶于二氯甲烷中，再加入α-叔丁氧羰基氨基酸和三乙胺，所述的氨基酸是除α-羧基和α-氨基外还具有带活性氢的杂原子的氨基酸，室温下搅拌过夜，将反应混合物过滤，滤液蒸发浓缩并真空干燥，即得连接有聚乙二醇的α-叔丁氧羰基氨基酸。
6.一种制备权利要求1所述的连接有聚乙二醇的氨基酸的方法，其特征是它包括以下步骤：
取单烃氧基聚乙二醇溶于二氯亚砜中，室温搅拌2小时，旋转蒸发除去剩余的二氯亚砜，将所得固体物质溶于二氯甲烷中，再加入α-叔丁氧羰基氨基酸和三乙胺，所述的氨基酸是除α-羧基和α-氨基外还具有带活性氢的杂原子的氨基酸，室温下搅拌过夜，过滤反应混合物，滤液蒸发浓缩并真空干燥，即得连接有聚乙二醇的α-叔丁氧羰基氨基酸。
7.一种制备权利要求1所述的连接有聚乙二醇的氨基酸的方法，其特征是它包括以下步骤：
取单烃氧基聚乙二醇胺，α-叔丁氧羰基氨基酸和二环己基碳二亚胺(DCC)溶于二氯甲烷中，所述的氨基酸是除α-羧基和α-氨基外还具有其它羧基的氨基酸，在室温下搅拌回流4～16小时，将混合物过滤，滤液减压蒸干并真空干燥，即得连接有聚乙二醇的α-叔丁氧羰基氨基酸。
8.根据权利要求4、5、6或7的制备连接有聚乙二醇的氨基酸的方法，其特征是：将权利要求4、5、6或7所得的连接有聚乙二醇的α-叔丁氧羰基氨基酸溶于二氯甲烷中，并加入三氟乙酸，搅拌，然后蒸发浓缩并真空干燥，所得固体物质用二氯甲烷溶解并用干燥剂干燥，过滤后再加入冷却乙醚至滤液中，将所得沉淀物过滤后真空干燥，即得连接有聚乙二醇的氨基酸。
9.一种权利要求1所述的连接有聚乙二醇的氨基酸的用途，其特征是将其用于多肽的合成，或将其连接到药物上。
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