CN101175768A

CN101175768A - 促红细胞生成素变体

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Publication number: CN101175768A
Application number: CNA2006800165436A
Authority: CN
Inventors: 安德烈亚斯·迈泽莱斯; 约瑟夫·普里勒尔; 克里斯特尔·博纳斯; 乌尔里希·迪纳格尔
Original assignee: Charite Universitaetsmedizin Berlin
Current assignee: Charite Universitaetsmedizin Berlin
Priority date: 2005-05-13
Filing date: 2006-05-15
Publication date: 2008-05-07
Anticipated expiration: 2026-05-15
Also published as: ZA200709091B; EP1885747A1; EP1736481A1; KR20080021595A; BRPI0608769A2; CA2608379C; CN101175768B; AU2006245916B2; AU2006245916A1; RU2430162C2; KR101468737B1; ES2457398T3; JP2008539745A; JP5231214B2; WO2006120030A8; WO2006120030A1; DK1885747T3; RU2007146455A; EP1885747B1; CA2608379A1

Abstract

本发明涉及新的促红细胞生成素(EPO)内源性变体，以及它们在治疗或预防与由于细胞死亡(凋亡、坏死)和炎症引起的组织损伤有关的病症中、特别是在神经保护中的应用，例如治疗神经系统的急性(例如中风)和慢性疾病(例如ALS)。

Description

促红细胞生成素变体

发明领域

本发明涉及促红细胞生成素(EPO)新的内源性变体，以及它们在与由细胞死亡(凋亡、坏死)和炎症引起的组织损伤有关的病症的治疗或预防中、特别是在神经保护中的应用，例如治疗神经系统的急性(例如中风)和慢性疾病(例如ALS)。

发明背景

中风是使人衰弱的疾病，在美国每年侵袭超过400,000人，是美国第三位最常见的死亡原因。此外，二分之一的神经科住院病人有与中风相关的问题。按照目前的趋势，到2050年，这个数字将会激增到每年1百万人。将中风的直接费用(护理和治疗)与间接费用(生产力损失)合在一起考虑时，仅仅对于美国社会来说，中风每年就将带来433亿美元的负担。大约三分之一的病人在前三个月死亡，三分之一严重残疾，只有三分之一恢复的结果令人满意。在1990年，脑血管疾病是世界范围内第二位的致死原因，在全世界造成了430万人以上的死亡。因此，从公共卫生的角度来说，中风是最相关的疾病之一。

中风的特征是大脑的区域突然失去循环，导致了相应的神经功能的丧失。中风也被称为脑血管意外或中风综合症，是一个非专化的术语，包含了不同类型的病理生理原因，包括血栓形成、栓塞和出血。目前，中风被分为出血性的和缺血性的。急性缺血性中风是指由血栓形成或栓塞引起的中风，占所有中风的80％。

缺血性中风由为脑供血的动脉、最常见的是颈内动脉分支的阻塞所引起。当一块血凝块(血栓)或由动脉粥样硬化引起的脂肪沉积物(粥样斑块)脱落(变成栓塞)，通过血流移动，停留在供应脑部的动脉中时，通常会发生阻塞。当动脉壁中的脂肪沉积物断裂时，可以形成血凝块。这种脂肪沉积物的断裂也可以在大的脂肪沉积物减慢血液流动、使其减少成细流时形成。流动缓慢的血液更可能凝结。因此，在狭窄的动脉中形成凝块和阻塞的风险较高。血凝块也可能在其它区域例如心脏中或心脏瓣膜上形成。由这样的血凝块导致的中风在最近做过心脏外科手术的人和患有心脏瓣膜病或心律失常(心律不齐)、特别是心房纤维性颤动的人中最为常见。此外，在某些病症例如血红细胞过量(红细胞增多症)中，由于血液变粘稠，血凝块的风险也增加了。

如果流向脑部的血液减少，失血性中风也可能发生，这在人大量失血或血压非常低时可能发生。有时，当流向脑部的血液正常，但血液中未含有足够的氧时，失血性中风也会发生。能够减少血氧含量的病症包括严重的贫血(缺少血红细胞)、窒息和一氧化碳中毒。通常，在这些情况下的脑部损伤是广泛分布的(弥散的)，并导致昏迷。如果炎症或感染使给脑部供血的血管狭窄，就可能发生缺血性中风。同样，药物例如可卡因和安非他命能够引起动脉的痉挛，可以使给脑部供血的动脉狭窄到引起中风的程度。

大脑需要葡萄糖和氧来维持神经元的代谢和功能。脑部输氧不足导致缺氧，脑血流不足引起局部缺血。脑部缺血的结果依赖于脑部血流减少的程度和持续时间。神经元可以忍受30到60分钟的缺血。如果缺血区域的血流没有重新建立，随即会发生一系列代谢过程。神经元变得耗尽ATP，转向一种效率低得多的途径——无氧酵解。乳酸积累，细胞内pH降低。没有足够的ATP供应，细胞质膜中的离子泵不能工作。产生的钠离子、水和钙离子向细胞中的内流导致神经元和神经胶质细胞的快速肿胀。膜的去极化也刺激了氨基酸谷氨酸和天冬氨酸的大量释放，这两种氨基酸在脑中都用作兴奋性神经递质。谷氨酸还激活神经元细胞膜中的钠和钙离子通道，即被明确表征的N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)钙通道。过量的钙内流导致广泛的酶系统(蛋白酶、脂酶和核酸酶)的无序活化。这些酶和它们的代谢产物，例如氧自由基，损坏了神经元的细胞膜、遗传物质和结构蛋白，最终导致神经元的细胞死亡(Dirnagl，U.等(1999)Trends Neurosci.22：391-397)。

中风发作突然、发展快速，在几分钟到几天内导致脑组织的死亡。在缺血的脑中，我们通常分辨出两种组织体——梗塞的核心和外周区，被称为缺血半暗带——是围绕着不可挽回的损伤核心的灌注不足和代谢受损的边缘。核心和半暗带的特征为两种不同种类的细胞死亡：坏死和凋亡(也被称为程序化细胞死亡或延迟性神经元细胞死亡)。核心中严重缺乏灌注导致代谢过程、细胞能量供应和离子稳态的崩溃，将在几分钟内导致细胞失去其完整性。因此，在核心中细胞和组织普遍急性坏死。在半暗带中，由并行管维持了部分残余的灌注，这可能不能维持全部的功能性代谢，但是防止了即刻的结构解体。但是随着时间(几小时到几天)的过去，细胞稳态的改变引起了越来越多的细胞死亡，梗塞的体积增加。因此半暗带被认为是梗塞成熟过程中有风险的组织。在该区域中，凋亡和炎症信号级联发挥了重要作用。其可能最初占最终发展为梗死体积的50％。导致延迟性细胞死亡的机制为受到缺血挑战但仍然存活的脑部区域的特定神经保护性疗法提供了目标。

到目前为止的治疗选择非常令人失望：用rtPA溶栓，这是唯一在重要临床试验中(NINDS)被证明有效的疗法，但仅仅在3小时的时间窗口内有效，这将它的应用限制到仅仅百分之几的缺血性中风病人。换句话说，除了基本的支持疗法之外，目前超过95％的中风不能得到特异性的治疗。这与我们在过去的十年中获得的关于这种疾病的基本病理生理学的了解形成了鲜明的对比。具体来说，对于脑实质损伤和内源神经保护的机制，以及功能和结构重组，已经积累了大量知识。

最近，关注集中于具有神经保护性质的内源性脑蛋白的潜在治疗作用。EPO是有希望的候选者，它是主要由肾脏肾小管周围毛细血管内皮细胞产生的糖蛋白激素，是生长激素/催乳激素细胞因子家族的成员(Zhu Y.和D′Andrea A.D：(1994)Curr.Opin.Hematol.1：113-118)。尽管EPO首先被表征，并且因为其作为造血激素的功能而被广泛了解，但在啮齿动物和人类脑组织中以及在培养的神经元和星形胶质细胞中检测到EPO及其受体(EPOR)，扩展了对EPO的其它生物学作用的研究。

在脑中，旁分泌的EPO/(Epo-R)₂系统独立于成年人红细胞生成的内分泌系统而存在；神经元表达(EpO-R)₂，星形胶质细胞产生EPO(Ruscher等(2002)J.Neurosci.22，10291-301；Prass等(2003)Stroke34，1981-1986)。已经在体外和体内证实EPO是由缺血和缺氧诱导的神经元凋亡的有效抑制剂(Ruscher等(2002)J.Neurosci.22，10291-301；Bernaudin，M.等(1999)J Cereb Blood Flow Metab.19：643-51；Morishita，E.等(1997)Neuroscience.76：105-16)。几个小组已经报道，在神经元培养物中添加EPO提供了对缺氧和谷氨酸毒性的保护(Henn F.A.和Braus D.F.(1999)Eur.Arch.Psychiatry Clin.Neurosci.249：48-56；Vogeley K.等(2000)Am.J.Psychiatry 157：34-39)，并且在啮齿动物中风模型中减少了神经功能障碍(Brines M.L.等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97：10526-10531和Bernaudin等(1999)J.Cereb.Blood Flow Metab.10：643-.651)。这些实验有希望的结果已经在人类研究中得到了证实，在人类研究中显示出急性中风的EPO疗法是安全的，并且可能是有益的(Ehrenreich H.等(2002)MoI.Medicine 8：495-505；以及WO 00/35475 A2)。EPO的这些细胞以及更特别是神经保护性质导致了在该领域的进一步研究，以便在大型临床试验中验证这些发现，并且，在其它适应症中现在也提出了使用EPO，也包括例如精神分裂症(Ehrenreich H等(2004)MolecularPsychiatry 9：42-54和WO 02/20031 A2)。

对于应用EPO防止组织损伤来说，造血活性通常并不需要，并且如果施用大量的EPO来治疗或缓解缺氧或缺血诱导的组织损伤的影响的话，造血活性可能是有害的。因此，进行了尝试去产生只表现出细胞保护性质而不表现出造血性质的EPO变体。US 2003/0130197描述了用于治疗神经变性病症的EPO肽模拟物，它与天然存在的EPO或其片段不具有序列同源性。US 6,531,121公开了通过对重组EPO完全去唾液酸化产生的去唾液基促红细胞生成素(asialoerythropoietin)，它显示出增加穿过内皮细胞屏障的能力，并具有减少的造血活性。氨甲酰化的促红细胞生成素(CEPO)也显示出表现出组织保护效应，但是没有红细胞生成效应(Leist等(2004)Science 305：239-242和WO2005/025606 A1)。

最后，已经显示17个单体的EPO肽抑制了两种神经元细胞系SK-N-MC和NS20Y的细胞死亡(Campana W.M.等(1998)Int.J.MoLMedicine 1：235-241)，而同时没有造血活性。但是，在NS20Y细胞中需要1ng/ml的EPO肽才能产生与100pg/ml重组EPO(rhEPO)相同的抗凋亡效果，在SK-N-MC细胞中则与400pg/ml rhEPO效果相同。因为rhEPO的表观分子量是大约66.000g/mol(计算分子量是大约33.000g/mol，但是没有包括rhEPO中包含的寡糖残基的重量)，EPO肽的表观分子量是大约1.900g/mol，因此浓度分别为1,52pmol/1和6,06pmol/1的rhEPO与1nmol/1的EPO肽能够引发同样水平的细胞保护效应。因此，在防止细胞死亡中，EPO肽比rhEPO的活性低650倍到165倍。根据这个数据显然在17个单体中包含的EPO区域在EPO的细胞保护功能中不发挥主要作用。因此，所有在现有技术中已知的造血活性减少的EPO变体都有如果与rhEPO相比是非天然存在的缺点，因为它们或者失去了其天然的糖基化，或者被人工截短，和/或具有极大降低的细胞保护活性。因此，在现有技术中仍需要提供EPO衍生物，它们与天然存在的EPO近似，具有与rhEPO相同或更好的组织保护活性，但是较少或没有造血活性、特别是没有红细胞生成活性。

这个难题由于新的EPO变体的供应而得到解决，它们被发现是在人类和小鼠组织(脑、肾)中天然存在的，并表现出与rhEPO相似或更好的细胞保护活性，但是不表现出任何显著的造血活性。

发明简述

本发明的一个方面涉及编码选自下面组的多核苷酸或者这样的多核苷酸的互补链的EPO变体：

(a)编码至少成熟形式的被称为hs3、hl-4、hl-5、hs4、hl-1、h2-1、mS、mG3、mG5、m301和mK3的多肽的多核苷酸，这些多肽的推导氨基酸序列分别显示在SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和22中；

(b)具有SEQ ID NOs：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19和21中显示的编码序列、编码至少成熟形式的多肽的多核苷酸；

(c)编码多肽mS、mG3、mG5、m301和mK3的人源化版本的多核苷酸，这些多肽的推导氨基酸序列显示在SEQ ID NOs：14、16、18、20和22中；

(d)编码多肽的多核苷酸，该多肽包括在选自SEQ ID NO 32、34、36和38中显示的氨基酸序列的N-末端上，融合了选自SEQ ID NO 24、26、28和30中显示的氨基酸序列的氨基酸序列；

(e)多核苷酸，在选自SEQ ID NO 31、33、35和37中显示的多核苷酸序列的多核苷酸序列的5’端，融合了选自SEQ ID NO 23、25、27和29中显示的多核苷酸序列的多核苷酸序列；

(f)编码由(a)到(e)任何一个中的多核苷酸编码的多肽衍生物的多核苷酸，其中在所述衍生物中，与所述多肽相比，1到10个氨基酸残基被保守取代，并且所述衍生物具有细胞保护和特别是神经保护活性，但基本上没有造血活性；

(g)编码由(a)到(f)任何一个中的多核苷酸编码的多肽片段的多核苷酸，其中在所述片段中，与所述多肽相比，1到10个氨基酸残基在N-和/或C-末端被缺失，和/或1到10个氨基酸在接头的N-和/或C-末端被缺失，并且所述片段具有细胞保护和特别是神经保护活性，但基本上没有造血活性；

(h)与(a)到(g)任何一个中定义的多核苷酸具有至少50％同一性的多核苷酸，其为具有细胞保护和特别是神经保护活性但基本上不具有造血活性的多肽编码；以及

(i)其互补链在严格条件下与在(a)到(h)任何一个中定义的多核苷酸杂交的多核苷酸，其为具有细胞保护和特别是神经保护活性但基本上不具有造血活性的多肽编码。

本发明的另一方面是编码来自另一种高等真核物种的多核苷酸的促红细胞生成素(EPO)变体的类似物。

本发明的另一方面是编码选自下列多核苷酸或者这样的多核苷酸的互补链的EPO变体：

(a)编码EPO变体多肽的多核苷酸，其含有包括螺旋A的全长EPO的N-末端部分，并且缺少下列的至少一种：

(i)至少10个氨基酸的片段，优选在螺旋A和螺旋B之间的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸；

(ii)至少10个氨基酸的片段，优选螺旋B的11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个氨基酸；

(iii)至少2个氨基酸的片段，优选在螺旋B和螺旋C之间的3、4、5或6个氨基酸；

(iv)至少10个氨基酸的片段，优选螺旋C的11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个氨基酸；

(v)至少10个氨基酸的片段，优选在螺旋C和螺旋D之间的11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27个氨基酸；和/或

(vi)至少10个氨基酸的片段，优选螺旋D的11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个氨基酸；

其中所述变体具有细胞保护和特别是神经保护活性但基本上不具有造血活性；

(b)编码由(a)中任何一个多核苷酸编码的多肽的衍生物的多核苷酸，其中在所述衍生物中，与所述多肽相比，1到10个氨基酸残基被保守取代，并且所述衍生物具有细胞保护和特别是神经保护活性但基本上不具有造血活性；

(c)其互补链在严格条件下与(a)到(b)任何一个定义的多核苷酸杂交的多核苷酸，其为具有细胞保护和特别是神经保护活性但基本上不具有造血活性的多肽编码。

在优选方面，本发明的多核苷酸是DNA、基因组DNA或RNA。

另一方面，本发明涉及了含有本发明的多核苷酸的载体。优选包含在载体中的多核苷酸与允许在原核和/或真核宿主细胞中表达的表达控制序列可操作地连接。

本发明的另一方面是使用本发明的多核苷酸或本发明的载体进行基因工程的宿主细胞。

本发明的另一方面是含有本发明的多核苷酸、本发明的载体和/或本发明的宿主细胞的转基因非人类动物。

本发明的另一方面是生产由本发明的多核苷酸编码的EPO变体多肽的方法，包括：培养本发明的宿主细胞和回收由所述多核苷酸编码的多肽。

在优选实施方案中，本发明的方法还包括修饰所述EPO变体的步骤，其中的修饰选自氧化、硫酸化、磷酸化、添加寡糖或其组合。

本发明的另一方面是产生能够表达至少一种EPO变体的细胞的方法，包含具有本发明的载体的体外基因工程细胞，其中所述EPO变体多肽由本发明的多核苷酸编码。

本发明的另一方面是具有由本发明的多核苷酸编码的或可以通过本发明的方法获得的氨基酸序列的多肽。

本发明的另一方面是与本发明的多肽特异性结合的抗体。

本发明的另一方面是包括本发明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的宿主细胞、本发明的多肽和/或本发明的抗体以及一种或多种可药用的载体的药物组合物。

本发明的另一方面是使用本发明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的宿主细胞、本发明的多肽来生产药物，以用于治疗或预防与由于细胞死亡例如凋亡和坏死以及炎症所造成的组织损伤有关的病症。

在本发明的优选应用中，细胞死亡由缺血、缺氧、细菌感染、病毒感染、自身免疫性、外伤性、化学性(例如代谢性、毒性)诱导，或辐射诱导而引起。

在本发明的优选应用中，病症是急性神经变性/神经炎性病症或慢性神经变性/神经炎性病，是心脏(例如心肌梗塞)、肺脏(例如哮喘、慢性阻塞性肺病)、肾脏(例如肾小球肾炎)、肝脏(例如慢性肝功能衰竭)或胰脏(例如胰腺炎)的急性或慢性病，或所述病症与器官(例如肾脏或肝脏)或细胞(例如干细胞)移植相关。

优选急性神经变性和/或神经炎性病选自脑缺血或梗塞，包括栓子阻塞和血栓性阻塞、急性缺血后的再灌注、围产期缺氧-缺血损伤、心脏停搏、颅内出血、蛛网膜下腔出血和颅内损伤(例如CNS创伤)、脊髓损伤、脊柱内损伤、摇晃婴儿综合症、传染性脑炎(例如疱疹性脑炎)、脑膜炎(例如细菌性)、头痛(例如偏头痛)。

优选慢性神经变性和/或神经炎性病选自痴呆(例如阿茨海默氏病、血管性痴呆)、Pick氏病、弥漫性莱维小体病、进行性核上性麻痹(Steel-Richardson综合征)、多发性硬化症、多系统萎缩症(包括Shy-Drager综合症)、与神经变性有关的慢性癫痫、运动神经元疾病、神经变性性运动失调、皮质基底节变性、ALS-帕金森氏痴呆症关岛复合症、亚急性硬化性全脑炎、亨廷顿舞蹈病、帕金森氏症、突触共核蛋白病(synucleinopathies)、原发性进行性失语、纹状体黑质变性(striatonigral degeneration)、Machado-Joseph病/3型脊髓小脑失调和橄榄脑桥小脑变性、多发性抽动一秽语综合征(Gilles De La Tourette′sdisease)、球麻痹和假延髓病性麻痹、脊髓和延髓肌肉萎缩(Kennedy氏病)、原发性侧索硬化、家族性痉挛性截瘫、Werdnig-Hoffmann病、Kugelberg-Welander病、Tay-Sach氏病、Sandhoff病、家族性痉挛病、痉挛性截瘫、进行性多病灶脑白质病、家族性自主神经机能异常(Riley-Day综合症)、多发性神经病(例如糖尿病性、酒精中毒性、Guillain-Barre综合征、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病)、朊病毒病、上瘾、情感障碍(例如抑郁症)、精神分裂症、慢性疲劳综合征、慢性疼痛(例如下背疼)。

在本发明的优选应用中，病症是衰老。

在本发明的优选应用中，药物在所述病症发作之前或之后施用。

发明详述

除非另有定义，在本文中使用的所有技术和科学术语都与本发明所属的专业领域内普通技术人员所通常理解的具有相同的意义。在冲突的情况下，以本文件、包括定义为准。优选的方法和材料在下面描述，尽管与本文描述的相似或等价的方法和材料也可以在本发明的实践或试验中使用。所有本文提到的出版物、专利申请、专利和其它参考文献以其全文引为参考。本文公开的材料、方法和实施例仅仅是说明性的，不打算有限制作用。

本发明是基于令人吃惊的发现，即EPO变体在神经元组织中表达，以及确定了变体能够保护神经元免受由氧和葡萄糖缺乏所诱导的损伤，但是不表现出造血活性。这种行为使它们适合在EPO的造血功能不需要或有害的情况下用做治疗方法。因此，本发明的第一个方面是从编码选自下列的多核苷酸或者这样的多核苷酸的互补链的EPO变体：

(b)具有编码序列的多核苷酸，如SEQ ID NOs：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19和21所示，所述序列编码至少成熟形式的多肽；

(d)编码多肽的多核苷酸，包括在选自SEQ ID NO 32、34、36和38中所示氨基酸序列的氨基酸序列的N-末端，融合了选自SEQ ID NO24、26、28和30显示的氨基酸序列的氨基酸序列，融合优选直接进行，即没有任何居间的氨基酸；

(e)多核苷酸，包括在选自SEQ ID NO 31、33、35和37所示多核苷酸序列的多核苷酸序列的5’端，融合了选自SEQ ID NO 23、25、27和29所示的多核苷酸序列的多核苷酸序列，融合优选直接在5’端，即没有任何居间的多核苷酸；

(f)编码由(a)到(e)任何一个多核苷酸编码的多肽的衍生物的多核苷酸，其中在所述衍生物中，与所述多肽相比，1到10个氨基酸残基被保守取代，并且所述衍生物具有细胞保护和特别是神经保护活性，但基本上没有造血活性；

(g)编码由(a)到(f)任何一个多核苷酸编码的多肽的片段的多核苷酸，其中在所述片段中，与所述多肽相比，1到10个氨基酸残基被N-和/或C-末端缺失，和/或1到10个氨基酸残基被缺失了接头的N-和/或C-末端，并且所述片段具有细胞保护和特别是神经保护活性，但基本上没有造血活性；

(h)与(a)到(g)任何一个定义的多核苷酸具有至少50％同一性的多核苷酸，其为具有细胞保护和特别是神经保护活性但基本上不具有造血活性的多肽编码；以及

(i)其互补链在严格条件下与(a)到(h)任何一个中定义的的多核苷酸杂交的多核苷酸，其为具有细胞保护和特别是神经保护活性但基本上不具有造血活性的多肽编码。

本发明还涉及编码选自下列多核苷酸或者这样的多核苷酸的互补链的EPO变体的肽：

(a)编码被称为ha、hAma、hAmE、hA-和ha-转运序列的多肽的多核苷酸，这些多肽的推导氨基酸序列分别显示在SEQ ID NOs：50、51、52、53和60中；

(b)具有编码序列的多核苷酸，如SEQ ID NOs：55、56、57、58和61所示，所述序列编码至少成熟形式的多肽；

(c)编码由(a)到(b)任何一个的多核苷酸编码的多肽的衍生物的多核苷酸，其中在所述衍生物中，与所述多肽相比，1到10个氨基酸残基被保守取代，并且所述衍生物具有细胞保护和特别是神经保护活性，但基本上没有造血活性；

(d)编码由(a)到(b)任何一个的多核苷酸编码的多肽的片段的多核苷酸，其中在所述片段中，与所述多肽相比，1到10个氨基酸残基被N-和/或C-末端缺失，和/或1到10个氨基酸残基被缺失了接头的N-和/或C-末端，并且所述片段具有细胞保护和特别是神经保护活性，但基本上没有造血活性；

(e)与(a)到(b)任何一个定义的多核苷酸具有至少50％同一性的多核苷酸，其为具有细胞保护和特别是神经保护活性但基本上不具有造血活性的多肽编码；以及

(i)其互补链在严格条件下与在(a)到(h)任何一个定义的多核苷酸杂交的多核苷酸，其为具有细胞保护和特别是神经保护活性但基本上不具有造血活性的多肽编码。

另一方面，本发明的多核苷酸包括来自另一种较高等真核物种的本发明的EPO变体的类似物，特别是来自哺乳动物、更优选来自非人类的灵长类动物；来自啮齿动物，例如大鼠或豚鼠；反刍动物，例如母牛；或绵羊；马；猪；兔；狗或猫，该类似物具有细胞保护和特别是神经保护活性但基本上不具有造血活性。在本文中，术语类似物是指编码来自其它物种的EPO变体的多核苷酸，它与SEQ ID NO 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、55、56、57、58或61的多核苷酸含有基本上相同的缺失。多核苷酸的缺失，如果它涉及编码多肽的多核苷酸的缺失，而该多肽与SEQ ID NO 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、50、51、52、53或60的EPO变体中相应缺失的多肽同源，就被认为是基本上相同的。确定两个肽序列之间的同源性的标注是现有的。程序如BLASTP可以用于此目的。缺失，如果它涉及1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、55、56、57、58或61个以上或以下的多核苷酸，仍然可以被认为是与SEQ ID NO 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19或21中相应的缺失是基本上相同的，这也被绘制在图1和2中。

本发明的另一方面是编码选自多核苷酸或者这样的多核苷酸的互补链的EPO变体：

(a)编码EPO变体多肽的多核苷酸，其含有包括螺旋A的全长EPO的N-末端部分，并且缺少至少下列的一种：

(i)至少10个氨基酸的片段，优选螺旋A和螺旋B之间的11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸；

(iii)至少2个氨基酸的片段、优选在螺旋B和螺旋C之间的3、4、5或6个氨基酸；

(v)至少10个氨基酸的片段，优选螺旋C和螺旋D之间的11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27个氨基酸；和/或

其中所述变体具有细胞保护和特别是神经保护活性但基本上不具有造血活性。

(c)其互补链在严格条件下能够与(a)到(b)任何一个定义的多核苷酸杂交的多核苷酸，其编码具有细胞保护和特别是神经保护活性但基本上不具有造血活性的多肽。

在本文中，EPO多肽的螺旋A、B、C和D是与图4概述的来自小鼠和人类的全长EPO的相应的螺旋A、B、C和D区域同源的区域。在本技术领域中如何确定两个多肽序列之间的同源性是众所周知的，本技术领域的专业人员能够比对例如来自另一个物种的给定的EPO多肽序列，并且确定在该EPO多肽中螺旋A、B、C和D的相应位置。优选EPO变体多核苷酸来自高等的真核生物、特别是哺乳动物或鸟类。优选的哺乳动物是人类、非人类的灵长类动物；啮齿动物，例如大鼠或豚鼠；反刍动物，例如母牛；或绵羊；马；猪；兔；狗或猫。大量的来自不同物种的这种编码多核苷酸的全长EPO是已知的，包括但不限于猫(Gene Bank Ace.L 10606)、猪(Gene Bank Ace.10607)、绵羊(Gene Bank Acc.10610)、狗(Gene Bank Ace.Ll 3027)、短尾猿(Gene Bank Ace.Ml 8189)、恒河猴(Gene Bank Ace.Ll 0609)、小鼠(Gene Bank Ace.12930)、大鼠(Gene Bank Ace.L 10608)、人类(Gene Bank Ace.Ml 1319)、黄牛(Gene Bank Ace.U44762)和瘤牛(Gene Bank Ace.L41354)。

优选编码EPO变体多肽的多核苷酸缺少下列：(i)；(ii)；(iii)；(iv)；(v)；(vi)；(i)和(ii)；(i)和(iii)；(i)和(iv)；(i)和(v)；(i)和(vi)；(ii)和(iii)；(ii)和(iv)；(ii)和(v)；(ii)和(vi)；(iii)和(iv)；(iii)和(v)；(iii)和(vi)；(iv)和(v)；(iv)和(vi)；(v)和(vi)；(i)、(ii)和(iii)；(i)、(ii)和(iv)；(i)、(ii)和(v)；(i)、(ii)和(vi)；(i)、(iii)和(iv)；(i)、(iii)和(v)；(i)、(iii)和(vi)；(i)、(iv)和(v)；(i)、(iv)和(vi)；(i)、(v)和(vi)；(ii)、(iii)和(iv)；(ii)、(iii)和(v)；(ii)、(iii)和(vi)；(ii)、(iv)和(v)；(ii)、(iv)和(vi)；(ii)、(v)和(vi)；(iii)、(iv)和(v)；(iii)、(iv)和(vi)；(iii)、(v)和(vi)；或(iv)、(v)和(vi)。

表现出细胞保护活性的多肽是具有至少50％(例如至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％或100％或甚至更高)的相应EPO变体的保护神经元免受凋亡损害的能力的多肽，其中的凋亡由氧或葡萄糖缺乏、暴露于化学物质或辐射、或病毒或细菌感染所诱导。确定细胞、特别是神经元细胞的损伤的分析方法在本技术领域内是已知的。适合的分析方法是本文后面描述的氧葡萄糖缺乏分析。在描述的分析方法中，读数是乳酸脱氢酶活性(LDH)的量。但是也存在各种其它的方法，它们允许评估细胞中诱导的损伤，特别是细胞死亡(例如凋亡、坏死)的量。这些分析方法包括但不限于Tunnel分析、MTT分析、通过染色(例如溴化乙锭和吖啶橙染色)的存活/死亡分析、半胱天冬蛋白酶(caspase)分析、电子显微镜、DNA-断裂成梯法，它们在本技术领域内是众所周知的。

EPO变体多肽基本上不显示出造血活性，它在本技术领域中现有的菌落形成分析方法(后文中将描述其例子)中，在与rhEPO和wtmEPO相同的摩尔浓度下，分别引起少于10％的CFU-E(克隆形成单位-成红细胞)，优选少于9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。给定的rhEPO、wt mEPO或EPO变体的相应CFU-E数量，通过从每个值中减去在对照反应中(没有wt或EPO变体)观察到的CFU-E数量来计算。

本发明的多核苷酸分子可以在体外合成(例如通过基于亚磷酰胺的合成)，或者可以从细胞、例如哺乳动物细胞获得。

分别具有SEQ ID NOs 14、16、18、20和22中显示的推导氨基酸序列的、被称为mS、mG3、mG5、m301和mK3的EPO变体是从小鼠中分离。小鼠的序列与人类的序列高度同源。来自人类和小鼠的EPO的氨基酸序列的比对提供在图4中。显然，小鼠序列与人类序列的区别在于缺少第8位置上的丙氨酸残基，以及下面的39个取代(编号是按照人类EPO中相应的氨基酸位置，前面显示的氨基酸是该位置上的人类氨基酸，后面的是对应的小鼠氨基酸)：⁴H→⁴P；⁶C→⁶R；⁹W→⁹T；¹¹W→¹¹L；¹⁸S→¹⁸L；¹⁹L→¹⁹I；²⁷G→²⁷C；⁴³L→⁴³I；⁵²I→⁵²V；⁵⁴T→⁵⁴M；⁶⁰H→⁶⁰G；⁶¹C→⁶¹P；⁶²S→⁶²R；⁶⁴N→⁶⁴S；⁸⁴G→⁸⁴E；⁸⁵Q→⁸⁵E；⁹⁵A→⁹⁵S；¹⁰¹V→¹⁰¹I；¹⁰³R→¹⁰³Q；¹⁰⁴G→¹⁰⁴A；¹⁰⁹V→¹⁰⁹A；¹¹⁵W→¹¹⁵P；¹¹⁷P→¹¹⁷T；¹²²V→¹²²I；¹²⁶V→¹²⁶I；¹³⁴T→¹³⁴S；¹³⁸A→¹³⁸V；¹⁴⁵A→¹⁴⁵L；¹⁴⁶I→¹⁴⁶M；¹⁵¹A→¹⁵¹T；¹⁵²A→¹⁵²T；¹⁵³S→¹⁵³P；¹⁵⁴A→¹⁵⁴P；¹⁶⁰I→¹⁶⁰L；¹⁶²A→¹⁶²V；¹⁶⁶R→¹⁶⁶C；¹⁷³S→¹⁷³A；¹⁸⁷A→¹⁸⁷V和¹⁹⁰T→¹⁹⁰R。人源化的mS、mG3、mG5、m301或mK3在第8位置上带有附加的丙氨酸残基，并且/或在1个或更优选2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或37个位置上带有人类而不是小鼠的氨基酸序列。特别优选mS、mG3、mG5、m301和mK3被完全人源化，即在上面提到的位置上的每个氨基酸，只要它们在相应的变体中存在，都是人类的序列而不是小鼠的序列。预计小鼠变体的人源化将消除用于人类治疗时可能遇到的任何免疫问题。

本发明的EPO变体核酸分子可以是DNA、cDNA、基因组DNA、合成的DNA或RNA，并且可以是双链的或单链的、有义和/或反义链。这些分子可以通过例如聚合酶链反应(PCR)生产，或者可以通过用一种或多种限制性内切酶处理而产生。核糖核酸分子(RNA)可以通过体外转录产生。

本发明的多核苷酸分子可以含有天然存在的序列，或与天然存在的不同、但由于遗传密码的简并性而编码同样的多肽的序列，即具有SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和22中的多肽。此外，这些核酸分子不限于编码序列，例如它们可以含有部分或全部位于编码序列上游或下游的非编码序列。

此外，本发明的分离的核酸分子可以含有那些与天然状态下发现的不一样的片段。因此，本发明包含了掺入到载体(例如质粒或病毒载体)或异源细胞的基因组(或同源细胞的基因组中天然染色体位点之外的位置)中的重组核酸分子。重组核酸分子及其应用将在下面进一步讨论。

在优选实施方案中，本发明的多核苷酸也包含了与下列(a)和(b)分别具有至少50％、优选55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸分子：(a)编码SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、50、51、52、53或60的多肽的核酸分子；以及(b)SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、55、56、57、58或61中的核苷酸序列，并且同时具有细胞保护以及特别是神经保护活性，但基本上不具有造血活性。

两个序列之间的同一性百分率的确定可以使用Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.ScL USA 90：5873-5877中的数学算法来完成。这样的算法被整合到Altschul等(1990)J.MoI.Biol.215：403-410中的BLASTN和BLASTP程序中。BLAST核苷酸搜索使用BLASTN程序进行，计分＝100，词长＝12，以获得与编码核酸的EPO变体多肽同源的核苷酸序列。相应地，BLAST蛋白搜索使用BLASTP程序进行，计分＝50，词长＝3，以获得与EPO变体多肽同源的氨基酸序列。为了获得有缺口的比对用来比较，如Altschul等(1997)Nucleic AcidsRes.25：3389-3402中描述的那样使用了Gapped BLAST。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用相应程序的缺省参数。

杂交也可以用作两个核酸序列之间同源性的度量。编码本文公开的任何EPO变体的核酸序列，或其衍生物或片段，可以按照标准杂交技术用作杂交探针。EPO变体探针与来自测试源(例如哺乳动物细胞)的DNA或RNA的杂交是在测试源中存在相关的EPO DNA或RNA的指示。杂交条件对于本技术领域的专业人员来说是已知的，并且可以在《现代分子生物学规程》(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.，6.3.1-6.3.6，1991)中找到。严格的条件被定义为等效于在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中于45℃下杂交，然后在0.2 X SSC、0.1％SDS中于65℃下清洗。在选择特异性针对带有内部缺失的变体的探针时，优选用于检测同源核酸的探针与缺失的边界重叠，例如hs3、hl-4、hl-5、hS4、mS、mG3、mG5或m301。在剪接导致蛋白的C-末端例如hl-1、h2-1或mK3改变的情况下，优选用于检测同源DNA系列的探针与已知的EPO序列和改变的C-末端之间的边界重叠。例如，探针可以被设计成包含剪接位点5’-端的10个互补碱基和剪接位点3’-端的10个互补碱基。

“分离的DNA”是(1)含有与任何天然存在的序列不一致的序列的DNA，或(2)在具有天然存在的序列的DNA的情况下(例如cDNA或基因组DNA)，是不含有位于含有生物体基因组目的DNA的基因侧翼的至少一个基因的DNA，其中在该生物体中含有目的DNA的基因是天然存在的。因此，该术语包含了整合在载体、自主复制质粒或病毒、或原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组DNA。该术语还包含了分离的分子，例如其中相应的基因组DNA具有内含子因而具有不同序列的cDNA；缺少至少一个侧翼基因的片段；由聚合酶链反应(PCR)产生的缺少至少一个侧翼基因的cDNA或基因组DNA片段；缺少至少一个侧翼基因的限制性片段；编码非天然存在的蛋白例如融合蛋白、突变蛋白或给定蛋白的片段的DNA；以及是cDNA或天然存在的核酸的简并变体的核酸。此外，它还包括了是杂交基因、即编码非天然存在的融合蛋白的基因的一部分的重组核苷酸序列。从上面的描述可以明显看出，分离的核酸不意味着存在于数百到数百万其它DNA分子中的DNA，例如cDNA或基因组DNA文库，或者例如限制性消化反应混合物或电泳凝胶切片中的基因组DNA限制性消化物。

本发明的另一方面是含有本发明的多核苷酸或由本发明的多核苷酸编码的蛋白的载体。术语“载体”是指能够被导入、或将包含的蛋白和/或核酸导入到细胞中的蛋白或多核苷酸或其混合物。优选由导入的多核苷酸编码的蛋白在导入载体后能够在细胞中表达。

在优选实施方案中，本发明的载体包括质粒，噬粒，噬菌体，粘粒，人工哺乳动物染色体，敲除或敲入结构，病毒，特别是腺病毒、痘苗病毒、减毒的痘苗病毒、金丝雀痘病毒、慢病毒(Chang，LJ.和Gay，E.E.(2001) Curr.Gene Therap.1：237-251)、疱疹病毒、特别是单纯性疱疹病毒(HSV-I，Carlezon，W.A.等(2000)Crit.Rev.Neurobiol.)、杆状病毒、逆转录病毒、腺相关病毒(AAV，Carter，P.J.和Samulski，R.J.(2000)J.MoI.Med.6：17-27)、鼻病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、线状病毒及其工程改造版本(参见例如Cobinger G.P.等(2001)Nat.Biotechnol.19：225-30)、病毒体、“裸露的”DNA脂质体、以及核酸包被微粒特别是金球。特别优选的是病毒载体，如腺病毒载体或逆转录病毒载体(Lindemann等(1997)MoI.Med.3：466-76和Springer等(1998)Mol.Cell.2：549-58)。脂质体通常是由阳离子、中性和/或阴离子脂类通过例如对脂质体悬浮液进行超声处理而制成的小的单层或多层囊泡。DNA可以例如离子性结合到脂质体表面，或包含在脂质体内部。适合的脂类混合物在本技术领域内是已知的，例如DOTMA(1，2-二油基氧丙基-3-溴化三甲基铵)和DPOE(二油基磷脂酰基乙醇胺)，二者都已经被用于多种细胞系中。

核酸包被的微粒是另一种将核酸导入细胞的方法，使用所谓的“基因枪”，它可以将微粒机械导入到细胞中。优选微粒本身是惰性的，因此在优选实施方案中用金球制造。

另一方面，本发明的多核苷酸与允许在原核和/或真核宿主细胞中表达的表达控制序列可操作地连接。上面提到的转录/翻译调控元件包括但不限于可诱导的和不可诱导的、组成型的、细胞周期调控的、代谢调控的启动子、增强子、操纵子、沉默子、阻遏子和本领域的专业技术人员所熟知的能够驱动或调节基因表达的其它元件。这样的调控元件包括但不限于指导组成型表达的调控元件，例如由RNA聚合酶III转录的启动子，例如snRNA U6或scRNA 7SK基因、细胞肥大病毒hCMV立即早期基因的启动子；SV40腺病毒的早期和晚期启动子；来自例如NBV、HCV、HSV、HPV、EBV、HTLV、MMTV或HIV的病毒启动子和激活子序列；其允许可诱导的表达，例如CUP-I启动子、使用在例如tet-on或tet-off系统、lac系统、trp系统中的tet-阻遏子；指导组织特异性表达、优选神经细胞特异性表达的调控元件，例如指导细胞周期特异性表达例如cdc2，cdc25C或细胞周期蛋白A的启动子(例如Thy-1.2、NSE、肌球蛋白轻链II、酪氨酸羟化酶、CaMKII-α启动子、血小板来源生长因子β链(PDGF)、多巴胺β-羟化酶、τ因子、调控元件(例如NRSE/RE-1；神经元限制性沉默元件/阻遏元件1))；或者TAC系统、TRC系统、噬菌体A的主要操纵子和启动子区、fd外壳蛋白的控制区、3-磷酸甘油酸激酶的启动子、酸性磷酸酶启动子、以及酵母的α-或a-接合因子的启动子。

本文中使用的“可操作地连接”是指整合到遗传结构中，以便表达控制序列，有效控制目的编码序列的表达。

同样地，本发明的多核苷酸可以形成还编码其它多肽序列的杂合基因的一部分，例如，编码可以用作标记物或报告物的蛋白的序列。杂合基因可以产生融合蛋白，或者两个或更多的部分可以被内部核糖体进入位点(IRES)序列分割开，从而导致两个或多个分离的蛋白的表达。标记物和报告物基因的例子包括-内酰胺酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、腺嘌呤脱氨酶(ADA)、氨基糖苷磷酸转移酶(neo^r、G418^r)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、潮霉素-B磷酸转移酶(HPH)、胸腺嘧啶激酶(TK)、lacZ(编码β-半乳糖苷酶)、绿色荧光蛋白(GFP)及其变体，以及黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)。当使用与本发明的实践相关的许多标准程序时，熟练的技术人员将会认识到其它有用的试剂，例如可以用作标记物或报告物功能的其它序列。如果杂合基因的表达产生了一个多肽，该杂合的多肽通常将包含第一个部分和第二个部分，第一个部分是EPO变体多肽，第二个部分是例如上面描述的报告物或Ig恒定区或Ig恒定区的一部分，例如IgG2a重链的CH2和CH3结构域。其它杂合子可以包含异源的肽序列以便于纯化和/或检测，例如抗原标签例如myc标签、或倾向于与某种区域结合的标签、例如几丁质标签或His标签。重组体核酸分子也可以含有编码EPO变体多肽的多核苷酸序列，它与异源的信号序列可操作地连接。这种信号序列可以指导蛋白进入到细胞内不同的区室中，它们对于本领域的专业技术人员来说是熟知的。优选的信号序列是便于产生的蛋白分泌的序列。优选这种信号和/或标签序列被设计成可以在纯化后从EPO变体上切割下来，以提供没有太多氨基酸的基本上纯的蛋白，优选最终的EPO上不超过10个多余的氨基酸。这样的切割位点在本技术领域内是熟知的，包括例如内肽酶切割位点和蛋白内含子(intein)切割位点。

本发明的另一方面是用上面描述的多核苷酸或载体进行基因工程改造的宿主细胞。可以用于本发明目的宿主细胞包括但不限于，可以用例如含有本发明的多核苷酸分子的重组噬菌体DNA、质粒DNA、或粘粒DNA表达载体转化的原核细胞例如细菌(例如大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis))；简单的真核细胞，例如可以用含有本发明的多核苷酸分子的重组酵母表达载体转化的酵母(例如酵母菌(Saccharomyces)和毕赤氏酵母(Pichia))；昆虫细胞系统，例如可以用例如含有本发明的多核苷酸分子的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的Hi5细胞的Sf9；可以用例如质粒进行注射的非洲蟾蜍卵母细胞；可以用例如重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒(CaMV)或烟草花叶病毒(TMV))感染或用含有EPO变体核苷酸序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统；或可以用含有例如来自如哺乳动物细胞基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)、来自哺乳动物病毒的启动子(例如腺病毒晚期启动子、CMV IE和痘苗病毒7.5K启动子)、或来自细菌细胞的启动子(例如在tet-on和tet-off系统中使用tet-阻遏子结合)的重组表达结构转化的哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、BHK、HEK293、VERO、HeLa、MDCK、Wi38、Swiss 3T3和NIH 3T3细胞)。还可以用作宿主细胞的是直接从哺乳动物获得的用质粒载体转染或用病毒载体感染的初级或次级细胞。根据宿主细胞和相应的用于导入本发明的多核苷酸的载体，多核苷酸可以整合到例如染色体或线粒体DNA中，或者可以维持在染色体之外例如游离型，或者可以仅仅是暂时包含在细胞中。

因为EPO在体内糖基化程度很高，因此希望选择能够为蛋白提供忠实的糖基化的表达系统。因此，优选将编码本发明的EPO部分变体的多核苷酸导入到较高等的真核细胞中，特别是到哺乳动物细胞中，例如COS、CHO、BHK、HEK293、VERO、HeLa、MDCK、Wi38、Swiss 3T3或NIH 3T3细胞。

本发明的另一方面是含有上述的多核苷酸、载体和/或宿主细胞的转基因非人类动物。动物可以是嵌合动物，意味着只有组成身体的部分细胞含有本发明的多核苷酸、载体和/或细胞，动物也可以是转基因动物，意味着动物的所有细胞含有本发明的多核苷酸和/或载体，或源于本发明的细胞。嵌合的或转基因的动物对于细胞中包含的本发明的多核苷酸来说可以是纯合的或杂合的。在优选实施方案中，转基因动物对于为本发明的蛋白编码的基因来说是纯合或杂合的敲除或敲入动物。原则上动物可以是任何动物，但是优选是哺乳动物，选自非人类灵长类动物、马、牛、绵羊、山羊、猪、狗、猫、兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠或沙鼠。

本发明的另一方面是生产由本发明的多核苷酸编码的EPO变体多肽的方法，包括：培养上述的宿主细胞，以及回收由所述多核苷酸编码的多肽。优选的宿主细胞和载体的组合在前面进行了概述，其它的组合对于本技术领域的专业人员来说是显而易见的。根据回收的多肽以后所打算的应用，可以选择适合的细胞类型。正如前面概述的那样，如果希望细胞产生的蛋白质表现出基本上是天然的糖基化形式，优选真核细胞，而如果例如不希望或不需要只有在真核细胞中才能正常导入蛋白的糖基化或其它修饰，可以选择原核细胞。

在现有技术中已经知道蛋白质药物的药代物动力学可以通过蛋白的修饰而明显改变。对于全长EPO来说，已经描述了在寡糖侧链末端的糖基化、特别是唾液酸残基的存在，对循环时间有影响(WO95/05465)，除去唾液酸基团暴露半乳糖残基，可以增加肝脏的清除率。因此，一种被用来增加EPO循环时间的方法是增加唾液酸残基。因此，几种方法涉及了供应额外的糖基化位点(参见例如WO 91/05867、WO94/09257和WO 01/81405)。这样修饰的EPO类似物可以具有至少一个额外的N-连接和/或O-连接的烃链。其它增加EPO半衰期的尝试包括在氨基酸骨架上添加不同长度的聚乙二醇残基(PEG)(参见例如WO 00/32772、WO 01/02017、WO 03/029291)。另一种尝试使用了具有至少一个N-连接和/或O-连接的寡糖的修饰的EPO分子，该寡糖用氧化、硫化、磷酸化、聚乙二醇化或其组合进一步修饰(参见WO2005/025606)。所有这些方法可以被同等地使用以延长本发明的EPO变体的半衰期，因此在上面的优选实施方案中，方法还包括了修饰EPO变体的步骤，其中的修饰选自氧化、硫化、磷酸化、添加寡糖及其组合。如果需要添加其它的N-连接或O-连接寡糖，可能通过现有工艺中描述的、导入其它的糖基化位点来导入它们，例如在30、51、57、69、88、89、136和/或138位，如果这些相应的位置在本发明的变体中存在的话(参见WO 01/81405)。

本发明的另一方面是产生能够表达至少一种含有EPO变体的方法，包括在体外使用权利要求3或4中的载体基因工程改造的细胞，其中所述EPO变体多肽由本发明的多核苷酸编码。

本发明的另一方面是具有由本发明的多核苷酸编码的氨基酸序列、或可以通过上述的方法获得的多肽。本发明的多肽包括所有本文公开的多肽以及这些多肽的片段，其带有1到10个N-端和/或C-端缺失。优选，缺失少于10个、少于9个、少于8个、少于7个、少于8个、少于7个、少于6个、少于5个、少于4个、少于3个、少于2个、少于1个氨基酸。本发明包含的多肽也包括融合蛋白，其含有前述的SEQ ID Nos 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和22显示的EPO部分变体或14、16、18、20和22的人源化版本或其片段与无关的氨基酸序列的融合。无关的序列可以含有其它的功能结构域或信号肽。信号肽将在下面更详细地描述和举例。

多肽可以是任何上面描述的多肽，但是具有不超过10个(例如不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个)保守取代。保守取代在本技术领域内是已知的，典型地包括例如用一个极性氨基酸取代另一个极性氨基酸，用一个酸性氨基酸取代另一个酸性氨基酸。因此，保守取代优选包括下列的氨基酸组内部的取代：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、异亮氨酸和亮氨酸(非极性，脂肪族侧链)；天冬氨酸和谷氨酸(负电荷侧链)；天冬酰胺、谷氨酰胺、甲硫氨酸、半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸(极性不带电荷侧链)；赖氨酸、组氨酸和精氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸(芳香族侧链)；和赖氨酸、精氨酸和组氨酸(带正电荷侧链)。在本技术领域内已经公知如何确定给定的取代对例如pK₁等的影响。具有一个或多个保守取代的多肽所需要的只是它具有未改变的EPO变体的至少50％(例如至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、99.5％或100％或以上)的保护神经元免受损伤/细胞死亡(例如通过凋亡或坏死)的能力，其中的细胞死亡由氧和/或葡萄糖缺乏、毒性、化学、物理、机械、炎症或辐射暴露或病毒或细菌感染而诱导。

使用编码适合的多肽或肽的多核苷酸序列，多肽和肽都可以通过标准的体外重组DNA技术和体内转基因产生。本领域的专业技术人员所熟知的方法可以被用来构建含有相关的编码序列和适合的转录/翻译控制信号的表达载体。参见例如在Sambrook等的第二版《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2nd Ed.)[ColdSpring Harbor Laboratory，N.Y.，1989])和Ausubel等的《现代分子生物学规程》(Current Protocols in Molecular Biology[Green PublishingAssociates and Wiley Interscience，N.Y.，1989])中描述的技术。

本发明的多肽和片段也包括上面描述的那些，但是为了在体内使用而进行了在氨基或羧基末端添加阻断剂的修饰，以便于相关多肽在体内的存活。这在肽的末端在被细胞摄取之前趋于被蛋白酶降解的情况下可能是有用的。这样的阻断剂包括但不限于其它能够与待施用的肽的氨基和/或羧基末端残基结合的相关的或无关的肽。这可以通过化学方法在肽合成的过程中进行，或者可以通过重组DNA技术使用普通技术人员所熟知的方法进行。

此外，本技术领域已知的阻断剂例如焦谷氨酸或其它分子可以连接到氨基和/或羧基末端残基上，或者氨基末端的氨基基团或羧基末端的羧基基团可以用不同的部分替换。同样地，肽在施用前可以共价地或非共价地结合到可药用的“载体”蛋白上。

本文使用的术语“分离的”多肽或肽片段是指或者没有天然存在的对应物，或者已经从在例如组织例如舌、胰脏、肝脏、脾脏、卵巢、睾丸、肌肉、关节组织、神经组织、胃肠道组织或肿瘤组织，或体液例如血液、血清或尿液中天然伴随它的成分中分离或纯化。典型情况下，多肽或肽片段当其干重的至少70％不含天然与其相结合的蛋白和其它天然存在的有机分子时，被认为是“分离的”。优选，本发明的多肽(或其肽片段)的制备物分别含有至少80％、更优选至少90％、最优选至少99％干重的本发明的多肽(或其肽片段)。因此，例如，多肽x的制备物含有至少80％、更优选至少90％、最优选至少99％干重的多肽x。因为化学合成的多肽在本质上是与天然伴随它的成分分离的，因此合成的多肽是“分离的”。

本发明的分离的多肽(或其片段)可以通过例如从天然来源(例如从组织或体液)提取、通过编码多肽的重组核酸的表达、或通过化学合成而得到。在异于其天然产生的来源的细胞系统中产生的多肽是“分离的”，因为它必定不含有天然伴随它的成分。分离的程度或纯度可以通过任何适合的方法测量，例如柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析。

本发明的另一方面是抗体，其能够与本发明的多核苷酸编码的或可以通过上述的方法获得的EPO变体多肽特异性结合。术语“抗体”包括单克隆和多克隆抗体及其结合片段，特别是Fc片段以及所谓的“单链抗体”(Bird R.E.等(1988)Science 242：423-6)、嵌合的、人源化的、特别是CDR嫁接的抗体，以及双链或四链抗体(Holliger P.等(1993) Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6444-8)。还包括免疫球蛋白，例如通过包括例如噬菌体展示技术筛选的与本发明的多肽特异性结合的蛋白。在本文中，术语“特异性结合”是指针对来自剪接接头或其它方法产生的接头的肽产生的抗体，例如e.ghS3中的ENIT|RVGQ，hl-4中的VGQQ|ALLV，hl-5中的VNFY|ALLV，hS4中的KRME|PWEP，hl-1中的ITVP|GPVG，h2-1中的LNEN|NHC，mS中的KRME|KELM，mG3中的LLAN|FLRG，mG5中的DTFC|RRGD，m301中的KVNF|LRGK，或mK3中的LSEA|VHGR。这样的肽可以含有更多的或更少的N-或C-末端氨基酸。抗体如果其对变体的亲和性比对全长的人类或鼠类EPO高至少50倍、优选高100倍、更优选至少高1000倍，可以被认为是对EPO变体特异的。优选本发明的特异性抗体不与或基本上不与全长人类或鼠类EPO结合。如何制作抗体及筛选具有给定特异性的抗体，这在本技术领域内是已知的。

本发明的另一方面考虑到了使用本发明的多核苷酸、载体、宿主细胞或多肽来生产用于治疗或预防与细胞死亡(例如凋亡和坏死)导致的组织损伤相关的疾病的药物。凋亡或坏死导致细胞毁坏，这在使用本发明的多核苷酸、载体、宿主细胞或多肽时，可以被防止或减轻。细胞死亡可以由多种不同的内部和外部刺激诱导，优选包括缺血、缺氧、细菌或病毒感染、辐射，或由代谢、有毒、化学、自身免疫或外伤刺激诱导。如何检测细胞死亡在本技术领域内是已知的，例如使用形态学标准、TUNNEL分析、MTT分析、通过染色(例如溴化乙锭和吖啶橙染色)的存活/死亡分析方法、半胱天冬蛋白酶分析方法、电子显微镜、DNA-断裂成梯法或下面描述的LDH释放分析。例如，凋亡的特征是染色质片段化、细胞内含物外渗和细胞最终死亡。已经认识到它在许多急性或慢性病理过程中扮演角色。因此，本发明的优选应用包括施用本发明的多核苷酸、载体、宿主细胞或多肽来预防、治疗或缓解急性和慢性神经变性或神经炎性疾病，以及心脏(例如心肌梗塞)、肺脏(例如哮喘、慢性阻塞性肺病)、肾脏(例如肾小球肾炎)、肝脏(例如慢性肝功能衰竭)或胰脏(例如胰腺炎)的急性或慢性疾病，以及与细胞(例如干细胞)或器官(例如肾脏或肝脏)的移植相关的病症。从这一方面来说也可以设想将本发明的EPO变体可以包含在用于储存器官或肢体的储存溶液中，用于运输或外伤后。

急性神经变性疾病包括但不限于各种类型的与神经元细胞死亡相关的急性神经变性疾病，包括脑血管机能不全、局限性或弥散性脑外伤、弥散性脑损伤、和脊髓损伤。急性神经变性疾病的例子是：脑缺血或梗塞，包括栓子阻塞和血栓性阻塞、急性缺血后的再灌注、围产期缺氧-缺血损伤、心脏停搏、以及任何类型的颅内出血(例如硬膜外、硬膜下、蛛网膜下腔和脑内)、颅内和脊柱内损伤(例如挫伤、穿透伤、切割伤、挤压伤和裂伤)、摇晃婴儿综合症、传染性脑炎(例如疱疹性脑炎)、脑膜炎(例如细菌性)、头痛(例如偏头痛)。

可以用本发明们的EPO变体治疗的慢性神经变性紊乱包括但不限于痴呆(例如阿茨海默氏病、血管性痴呆)、Pick氏病、弥漫性莱维小体病、进行性核上性麻痹(Steel-Richardson综合症)、多发性硬化症、多系统萎缩症(包括Shy-Drager综合症)、与神经变性有关的慢性癫痫、运动神经元疾病包括肌萎缩性侧索硬化、神经变性性运动失调、皮质基底节变性、ALS-帕金森氏痴呆症关岛复合症、亚急性硬化性全脑炎、亨廷顿舞蹈病、帕金森氏症、突触共核蛋白病(包括多系统萎缩症)、原发性进行性失语、纹状体黑质变性、Machado-Joseph病/3型脊髓小脑失调和橄榄脑桥小脑变性、多发性抽动一秽语综合征、球麻痹和假延髓病性麻痹、脊髓和延髓肌肉萎缩(Kennedy氏病)、原发性侧索硬化、家族性痉挛性截瘫、Werdnig-Hoffmann病、Kugelberg-Welander病、Tay-Sach病、Sandhoff病、家族性痉挛、痉挛性截瘫、进行性多病灶脑白质病、家族性自主神经机能异常(Riley-Day综合征)、以及朊病毒病(包括但不限于Creutzfeldt-Jakob、Gerstmann-Strussler-Scheinker病、Kuru和致死性家族性失眠)、多发性神经病(例如糖尿病性、酒精中毒性、Guillain-Barre综合征、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病)、朊病毒病、上瘾、情感障碍(例如抑郁症)、精神分裂症、慢性疲劳综合征、慢性疼痛(例如下背疼)。

本发明的另一方面涉及使用本发明的多核苷酸、载体、宿主细胞或多肽来生产抗衰老药物。本发明的EPO变体的这种应用的基础是，事实上大多数伴随老化的身体功能的逐渐退化与细胞死亡相关，因此可以设想只提供有益的细胞保护效应的本发明的EPO变体可以被连续使用，而不会遭受通常与连续施用EPO有关的副作用，而这些副作用可能是由EPO的红细胞生成效应引起的。

本发明人惊异地发现，本发明的核酸和蛋白具有令人吃惊的抗炎性质(参见图和实验)。因此，这些EPO变体可用于治疗炎性和变性性疾病。炎性疾病是例如但不限于多发性脑硬化、病毒和细菌感染或败血病这样的疾病。变性性疾病是例如但不限于中风、心肌梗塞这样的疾病。

本发明还涉及了本发明的核酸的所有种类的体内表达形式。它还涉及了用作治疗剂的转化细胞、特别是干细胞。这样的细胞可以用本发明的核酸稳定地转化。核酸可以位于盒中，在其中它与启动子可操作地连接。启动子可能只能够驱动在特定组织中的表达，例如但不限于神经元组织或脑或表现出炎症或变性的组织。相应的知识可以从WO97/14307中获得。

EPO多肽的活性(以单位计)传统上是基于它在啮齿动物模型中刺激红细胞产生的效能来确定的(并且来自EPO的国际标准)。1单位(U)常规EPO(分子量大约34,000)大约为10ng蛋白(1mg蛋白大约为100,000U)。但是，正如已经提到的那样，本发明涉及了使用无造血功能形式的促红细胞生成素，因此这种基于造血活性的定义不适合。因此在本文中使用时，EPO变体的活性单位被定义为在神经或其它促红细胞生成素反应性细胞系统中引发与同样系统中天然EPO引发相同的活性所需要的蛋白量。根据本文的指导，专业技术人员将可以容易地确定无造血功能的促红细胞生成素的单位。

另一方面，本发明提供了含有本发明的多核苷酸、载体、宿主细胞、多肽和/或抗体以及一种或多种可药用载体的药物组合物。

在本发明的一个方面的实践中，上述的药物组合物可以通过任何可以提供足够水平的促红细胞生成素变体的途径施用于哺乳动物。它可以全身或局部给药。这样的给药可以是肠胃外、经粘膜、例如通过口、鼻、直肠、阴道内、舌下、粘膜下或经皮给药。优选肠胃外给药，例如通过静脉内或腹膜内注射，另外也包括但不限于动脉内、肌肉内、真皮内和皮下给药。如果本发明的药物组合物是局部给药，它可以被直接注射到被治疗的器官或组织中。在治疗神经系统的情况下，该给药途径包括但不限于脑内、脑室内、侧脑室内、鞘内、脑池内、脊柱内和/或脊柱周围的给药途径，可以使用颅内和脊柱内针头和带有或不带有泵装置的导管。

在药物组合物的优选实施方案中，含有适合于保护或增强EPO反应性细胞、组织或器官的剂量单位形式的EPO变体多肽，在每个剂量单位中含有有效的无毒性的量，范围从大约0.5mg到5mg EPO变体、0.6mg到5mg EPO变体、0.7mg到5mg EPO变体、0.8mg到5mg EPO变体、0.9mg到5mg EPO变体、1到5mg EPO变体、1.5到5mg EPO变体、2到5mg EPO变体、2.5到5mg EPO变体、3.5到5mg EPO变体、4mg到5mg EPO变体、或4.5mg到5mg EPO变体以及可药用的载体。

在优选实施方案中，EPO变体多肽可以以每公斤体重100ng到大约50mg之间的剂量、优选每公斤体重大约20mg到大约50mg之间的剂量全身给药。这样在给药后大约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10小时可以达到血清水平。如果需要，这样的剂量可以重复。例如，只要临床需要，给药可以每天、每隔一天、每三天、每四天、每五天、每六天或每七天重复，也可以在适当的时间间隔后重复，例如每1到12星期，优选每3到8星期。在一个实施方案中，有效量的EPO变体和可药用的载体可以被包装在单剂量瓶或其它容器中。根据相应的治疗的疾病或症状，EPO变体可以单剂给药一段预定的时间，也可以连续给药。当治疗急性病症或疾病时，给病人提供单剂EPO变体、或提供一段时间例如2天到12个月、优选1星期到6个月、更优选2星期到3个月可能就足够了。如果治疗的是慢性疾病或病症或如果EPO变体被用来防止或减缓与衰老相关的退化时，可以连续给药EPO变体。如果本发明的EPO变体在给定的时期内或连续给药，优选以一定间隔、并优选上述间隔给药。所需的间隔时间部分依赖于治疗或缓解相应的疾病所需的EPO变体的血清水平，以及相应的EPO变体的药代动力学，其部分依赖于例如PEG对EPO的修饰。临床医师在考虑到例如被治疗的病人的病症、病症的严重性等之后，可以判断准确的时程、剂量和EPO变体的类型。

对于其它给药途径，例如通过使用灌注液、注射到器官中或其它局部给药来说，所提供的药物组合物将产生与上述EPO变体相似的水平。所需的水平为大约10pg/ml到大约1000ng/ml。

本发明的药物组合物可以含有治疗有效量的化合物，例如多核苷酸、多肽、细胞或载体，以及可药用的载体。在具体的实施方案中，术语“可药用的”意味着由联邦或州政府的管理机构批准，或列于美国药典或其它普遍认可的药典中可以用于动物、特别是人。术语“载体”是指治疗剂给药所用的稀释剂、佐剂、赋形剂或介质。这样的药物载体可以是无菌的液体，例如溶解在水中的盐溶液，以及油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物静脉给药时，盐水溶液是优选的载体。盐水溶液和水性右旋糖以及甘油溶液也可以用做液体载体，特别是用做可注射溶液。适合的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、多元醇、水、乙醇等。如果需要，组合物也可以含有少量的湿润剂或乳化剂、或pH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释制剂等形式。组合物可以被配制成具有传统的粘合剂和载体例如甘油三酯的栓剂。本发明的化合物可以配制成中性或盐的形式。可药用的盐包括与游离氨基基团形成的盐，例如从盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等衍生的盐，以及与游离羧基基团形成的盐，例如从氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等衍生的盐。适合的药物载体的例子被描述在E.W.Martin的《Remington药物学》(″Remington′sPharmaceutical Sciences″)中。这些组合物将含有治疗有效剂量的化合物、优选为纯的形式，连同适当量的载体，以提供适合于对病人给药的形式。制剂应该适合给药的方式。

适合口服给药的药物组合物可以被提供为胶囊或片剂；粉末或颗粒；溶液、糖浆或悬浮液(在水性或非水性液体中)；可食用的泡沫；或乳浊液。片剂或硬明胶胶囊可以含有乳糖、淀粉或其衍生物、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁、硬脂酸或其盐。软明胶胶囊可以含有植物油、蜡、脂肪、半固体或液体多元醇等。溶液和糖浆可以含有水、多元醇和糖。

准备用于口服给药的活性剂可以用能够延迟活性剂在胃肠道崩解和/或吸收的材料来包被或混合(例如可以使用单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯)。因此，可以在许多小时内实现活性剂的持续释放，如果需要的话，活性试剂可以被保护，以免于在胃中被降解。用于口服给药的药物组合物可以被配制成便于活性剂在胃肠道的特定位置由于特定的pH或酶条件而释放。

适合经皮给药的药物组合物可以被提供成个别的贴剂，目的在于在延长的时期内保持与接受者表皮的紧密接触。适合局部给药的药物组合物可以被提供为膏剂、乳膏、悬浮液、洗剂、粉末、溶液、糊剂、凝胶、喷雾剂、气溶胶或油。对于皮肤、口、眼或其它外部组织的局部给药来说，优选使用局部膏剂或乳膏。当配制在膏剂中时，活性成分可以与链烷烃的或可与水混溶的软膏基质一起使用。或者，活性成分可以与水包油或油包水基质配制成乳膏。适合眼部局部给药的药物组合物包括眼药水。在这些组合物中，活性成分可以溶解或悬浮在适当的载体中，例如在水性溶剂中。适合于口部局部给药的药物组合物包括菱形药片、锭剂和漱口液。

适合鼻部给药的药物组合物可以含有固体载体例如粉末(优选粒径在20到500微米的范围内)。粉末可以以吸气的方式给药，即用鼻从靠近鼻的装有粉末的容器快速吸入。或者，适合于鼻部给药的组合物也可以含有液体载体，例如喷鼻剂或滴鼻液。这些组合物可以含有活性成分的水性或油溶液。用于吸入给药的组合物可以供应在特别改造的装置中，包括但不限于加压气溶胶喷雾器或吹入器，它们可以被构造成提供预定剂量的活性成分。在优选实施方案中，本发明的药物组合物通过鼻腔给药到肺部。

适合直肠给药的药物组合物可以被提供成栓剂或灌肠剂。适合阴道给药的药物组合物可以被提供为子宫托、棉塞、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾制剂。

适合肠胃外给药的药物组合物包括水性和非水性的无菌可注射的溶液或悬浮液，它们可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂以及可以赋予组合物与目的接受者的血液基本上等渗的溶质。这样的制剂中可以存在的其它成分包括例如水、醇、多元醇、甘油和植物油。适合胃肠外给药的制剂可以存在于单剂或多剂容器中，例如密封的安瓿和小瓶中，可以储存在冷冻干燥(冻干)条件下，在使用前只需要加入无菌的液体载体，例如注射用无菌盐水溶液。即用的注射溶液和悬浮液可以从无菌粉末、颗粒和片剂制成。在一个实施方案中，可以提供含有可注射的EPO变体溶液的自动注射器，给救护车、急诊室和战场环境下紧急使用，甚至在民用情况下用于自我给药，特别是在外伤性截断可能发生的情况下，例如剪草机使用不慎。切断的脚或脚趾中的细胞和组织在再接后存活的可能性，通过在受伤部位的切断部分的多个位点尽可能快地施用EPO变体，可能可以得到提高，甚至是在医务人员到达现场、或受伤的个人拖着切断的脚趾到达急诊室之前。

在优选实施方案中，组合物按照常规步骤配制成适合对人类静脉给药的药物组合物。典型情况下，用于静脉给药的组合物是无菌等渗水性缓冲液中的溶液。如果需要，组合物中也可以包含助溶剂和局部麻醉剂例如利多卡因，以缓解注射位点的疼痛。一般来说，在单位剂型中，成分可以分开或混合在一起，例如在气密容器例如标明活性剂的量的安瓿或小袋中的干燥冻干粉末或无水浓缩物。当组合物将要输注给药时，可以将它用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶配制。当组合物将要注射给药时，可以提供无菌盐水的安瓿，以便成分可以在给药前混合。

栓剂中包含的活性成分一般在0.5重量％到10重量％的范围内，口服制剂优选含有10％到95％的活性成分。

灌注液重量可以被提供用在移植的器官浴中、用于原位灌注、或者用于在取器官之前给药到器官捐献者的脉管系统。

这样的药物重量可以含有的EPO变体水平或EPO变体形式不适合用于个体的急性或慢性、局部或全身给药，但是在处理的器官或组织暴露或回复到正常的循环之前，它们在尸体、器官浴、器官灌注液或原位灌注液中、在除去或降低其中含有的EPO变体的水平之前，将发挥本文打算的功能。

本发明还提供了含有一个或多个容器的药物包或药剂盒，容器中装有一种或多种本发明的药物组合物的成分。任选与这些容器伴随的还可以有一个说明，是监督药物或生物制品生产、使用或销售的政府机构规定的形式，该说明反映出机构批准了其生产、使用和销售给人类用药。

例如在另一个实施方案中，EPO变体可以在控释系统中递送。例如，多肽可以使用静脉输注、可植入的渗透压泵、透皮药贴、脂质体或其它给药方式给药。在一个实施方案中，可以使用泵(参见Sefton(1987)CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201；Buchwald等(1980)Surgery88：507；Saudek等(1989)N.Eng.J.Med.321：574)。在另一个实施方案中，化合物可以在囊泡中递送，特别是脂质体(参见Langer(1 990)Science 249：1527-1533；Treat等(1989)在《传染病和癌症治疗中的脂质体》Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein和Fidler主编，Liss，N.Y.，353-365；WO 91/04014；U.S.4,704,355)。在另一个实施方案中，可以使用聚合物材料(参见《控释的医疗应用》Medical Applications of Controlled Release(1974)Langer和Wise主编，CRC Press：Boca Raton，FIa.；可控的药物生物利用度(Controlled Drug Bioavailability)，《药品设计与性能》Drug ProductDesign and Performance，(1984)Smolen和Ball主编，Wiley：N.Y.；Ranger和Peppas(1953)J.Macromol.Sci.Rev.Mac-romol.Chem.23：61；也可参见Levy等(1985)Science 228：190；During等(1989)Ann.Neurol.25：351；Howard等(1989)J.Neurosurg.71：105)。

在另一个实施方案中，控释系统可以放置在治疗靶位、即靶细胞、组织或器官的附近，因此只需要全身性剂量的一部分(参见例如Goodson(1984) Medical Applications of Controlled Release，vol.2，115-138)。其它的控释系统在Langer的综述中(1990，Science 249：1527-1533)讨论。

在另一个实施方案中，经过适当配制的EPO变体可以通过鼻、口、直肠、阴道或舌下给药方式给药。

在具体的实施方案中，可能期望将本发明的药物组合物局部给药到需要治疗的区域；这可以通过，例如但不限于，外科手术期间局部输液、例如在外科手术后与创伤敷料一起局部使用、通过注射、通过导管、通过栓剂、或者通过移植物而达到，所述移植物是多孔的、无孔的或凝胶状的材料，包括膜，例如硅橡胶膜或纤维。

对优选有效剂量的选择将由专业技术人员在考虑了本领域的普通技术人员来说已知的几种因素的基础上确定。这些因素包括药物组合物的具体形式，例如多肽或载体，以及它的药代动力学参数，例如生物利用度、代谢、半衰期等，这些应该在通常用于获得药物化合物的官方批准的常规开发步骤过程中已经被建立。考虑剂量时的其它因素包括在正常个体中被治疗的病症或疾病或希望获得的益处、病人的体重、给药途径、是急性还是慢性给药、伴用药物、以及其它众所周知能够影响施用的药物制剂的效力的因素。因此准确的剂量应该根据临床医师的判断和每个病人的情况而确定，例如按照标准临床技术，根据病人个体的病症和免疫状况。

在本发明的另一方面，提供了灌注液或灌注溶液用于灌注和储存用于移植的器官，灌注溶液包含的药物制剂的量能够有效保护EPO变体反应性细胞和相关细胞、组织或器官。

移植包括但不限于异体移植，即从一个供体获得器官(包括细胞、组织或其它身体部分)并移植到不同的受体中；自体移植，即从身体的一个部分取下器官，代之以另一个，包括在外科手术台上，取下一个器官，在先体外后体内的情况下进行切除、修复、或其它操作，例如切除肿瘤，然后移回原来的位置。在一个实施方案中，灌注溶液是威斯康星大学溶液(U.S.4,798”824)，其中含有大约1到大约25 U/ml促红细胞生成素、5％羟乙基淀粉(分子量为大约200,000到大约300,000，并且基本上不含乙二醇、氯乙醇、氯化钠和丙酮)、25mMKH₂PO₄、3mM谷胱甘肽、5mM腺嘌呤核苷、10mM葡萄糖、10mMHEPES缓冲液、5mM葡萄糖酸镁、1.5mM CaCl₂、105mM葡萄糖酸钠、200,000单位青霉素、40单位胰岛素、16mg地塞米松、12mg酚红，pH为7.4-7.5，渗透压大约为320mOSm/l。该溶液被用于在移植前维持尸体的肾脏和胰脏。使用该溶液，保护时间可以超过推荐的尸体肾脏保存的30小时的限制。这种特殊的灌注液仅仅是众多通过含有本发明的有效剂量的药物组合物而适合本应用的溶液的示例性说明。在另一个实施方案中，灌注液含有相当于大约5到大约35U/ml促红细胞生成素，或大约10到大约30U/ml促红细胞生成素。

尽管优选的用于全文目的的EPO变体的接受体是人类，本文的方法也同样适用于其它的哺乳动物，特别是驯养动物、家畜、宠物和动物园的动物。但是，本发明并没有如此限制，其益处可以应用于任何哺乳动物。

如果已知有人处于发展成中风的风险之中，可能可以用本发明的药物组合物预防性给药。在这些情况下，优选以上面描述的优选和特别优选的剂量每日施用药物组合物，特别是变体EPO多肽。优选，每公斤体重大约100ng到大约50mg，更优选每公斤体重大约20mg到大约50mg。这种给药可以持续到发展成中风的风险已经降低。但是，在大多数情况下，一旦诊断为中风就将施用药物组合物。在这些情况下，优选第一剂药物组合物在第一个中风症状后24小时内第一次给药，优选在12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1小时或更短时间内。优选，之后给药持续优选至少7天、更优选至少14天，更优选至少21天。剂量优选每天给药一次，并优选上面指出的剂量。

图表简述

图1：EPO PCR产物的比较：图A描绘了使用含有不同鼠类EPO变体的纯质粒或来自小鼠肾脑的cDNA进行的不同PCR反应的DNA产物，它们在1.2％的琼脂糖凝胶上分离。从左到右的条带包括：1kb分子量标记物，纯mK3、纯mG3、纯mG5纯m301、纯mS、纯mWT、脑cDNA、肾cDNA的产物。图B描绘了使用来自人脑的cDNA进行的PCR的DNA产物。从左到右的条带包括1kb分子量标准品和人脑cDNA的PCR产物。

图2：在鼠脑cDNA中鉴定到的EPO变体的核苷酸序列与“野生型”鼠EPO、即前面描述的EPO序列的比对。

图3：在人脑cDNA中鉴定到的EPO变体与“野生型”人EPO的核苷酸序列的比对。

图4：在小鼠和人类中鉴定到的EPO变体与相应的“野生型”EPO的氨基酸序列的比对。

图5：鼠和人EPO和本发明的EPO变体的造血活性。图A描绘了鼠EPO和EPO变体的菌落形成分析的结果，图B描绘了人EPO和EPO变体的菌落形成分析结果。

图6：使用rhEPO和EPO-异构体进行的神经保护分析的实验设置。

图7：图A显示了使用1小时40分钟和1小时50分钟的氧葡萄糖缺乏(OGD)时间长度的实验。在两个时间点观察到神经保护者(neuroguardian)的保护率为40-50％，但是使用mEPO和rhEPO没有观察到保护。图B显示了使用两个不同时间点的实验(两个实验间的OGD时间长度根据神经元的密度而变化)。在2小时45分钟时，与神经保护者(60-70％)相比，使用wtEPO仅仅达到了弱的保护(20-30％)。rh EPO的完全保护能力只有在较高的损伤水平下(3小时15分钟)才观察到。

图8：图A显示了使用2小时0分钟、2小时15分钟和2小时20分钟的OGD时间长度和相当于100U/l hEPO蛋白浓度的实验。在所有的三个时间点，对人类的保护率为40-50％，但是使用mEPO和rhEPO没有保护。图B显示了使用两个不同时间点的实验(两个实验间的OGD时间长度根据神经元的密度而变化)。在2小时45分钟时，与神经保护者(60-70％)相比，使用wtEPO仅达到弱的保护(20-30％)。EPO的完全保护能力只有在较高的损伤水平下(3小时15分钟)才观察到。

图9：图A显示了分别用pcDN A3.1-V5/His-hEPO、pcDNA3.1-V5/His-hS3或pcDNA3.1-V5/His-hS4转染的HEK293细胞的培养基的Western印迹。这些培养基被用于图8显示的实验。通过小鼠-EPO-ELISA(R&D)定量的hEPO的浓度是2U/ml。rhEPO(凝胶上上样＝2.5ng)、hEPO(凝胶上上样＝0.4ng)、hS3和hS4：各20μl培养基(在转染后2天收集)。标记物：5μl BenchMark^TM His标记的蛋白标准品(Invitrogen)。图B显示了His-Tag纯化的小鼠野生型EPO(mEPO)、人类hS3和hS4 EPO变体的Western印迹。mEPO使用EPO-小鼠-ELISA定量。凝胶中上样130pg mEPO(一级抗体：兔抗rhEPO抗体，Santa-Cruz)。

图10：重组产生的(α螺旋突变体)与体内鉴定到的EPO变体的氨基酸序列的比对。此处SEQ ID NO 50是人类的α螺旋野生型序列；SEQ ID NO 51是hAmA(丙氨酸点突变体)；SEQ ID NO 52是hAmE(谷氨酸点突变体)；SEQ ID NO 53是hA-10(缺失突变体)；SEQ IDNO 54是hA-20(缺失突变体)。

图11：在H9c2心脏成肌细胞由血清缺乏和缺氧构成的缺血模型中，hEPO和hS3介导的细胞保护。H9c2细胞在不含血清的DMEM培养基或者常氧或缺氧的条件下培养24小时。24小时后通过LDH分析对凋亡进行评估。通过将在常氧和缺氧条件下未处理细胞的δLDH释放设置为100％，对数据进行标准化。A：表示标准化的LDH释放的平均值的柱状图。B：数据被表示为盒状图，显示了中位数(贯穿盒体的线)、25百分位(下方连接处)、75百分位(上方连接处)、最大和最小值。实验的数量n＝7。P^*＜0,001(ANOVAl)。

图12：使用来自R&D的抗mEPO抗体(山羊，生物素标记)的EPO变体的免疫沉淀；A：在CoCl₂处理的小鼠(129S6)的肾脏蛋白提取物中检测第二种EPO同工型(30可kDa)。B：使用Darbpoietin A阻断抗体—抗原相互作用。

图13：促红细胞生成素α螺旋(hA；n＝4)介导的神经保护。hA100/Ul：30pM；hA 50 LVl：15pM；hEPO：30pM＝100U/1 P^*＜0，05；ANOVA1与对照比较。

图14：几种人类EPO同工型(n＝6)介导的神经保护。P^*＜0，05；ANOVA1与对照比较。

图15：促红细胞生成素α螺旋缺失变体(n＝6)介导的神经保护。P^*＜0，05；ANOVA1与对照比较。A：显示标准化的LDH释放的平均值的柱状图。B：显示了标准化LDH释放的中位数和百分位值(25％，75％)的盒状图。

图16：人类EPO变体和全长人类EPO对LPS诱导的人类巨噬细胞的细胞因子的产生的影响。纯化的人类单核细胞在存在rhu M-CSF(50ng/ml)的情况下6天分化成巨噬细胞。将巨噬细胞(1×10⁶/ml)与hS4、hS3或hEPO(各300mU/ml)预孵育3小时，然后用10ng/ml内毒素(来自大肠杆菌0127：B8的LPS)刺激4小时。通过ELISA测定上清液中的细胞因子浓度(流式细胞小球微阵列术，BectonDickinson，Heidelberg，德国)。数据被显示为平均值±SD。^**与对照组(PBS)相比不同的结果(p＜0.01；米曼氏U检验；每组n＝3-9)。

图17：EPO缺失变体的核酸序列的比对。

图18：重组产生的突变和缺失变体以及野生型螺旋A(hWT-EPOHelix A)的DNA序列。此处SEQ ID NO 55是hA(野生型螺旋A)，SEQ ID NO 56是hAmA(丙氨酸缺失突变体)，SEQ ID NO 57是hAmE(谷氨酸缺失突变体)，SEQ ID NO 58是hA-10(螺旋A减去10个氨基酸的缺失突变体)，SEQ ID NO 59是hA-20(螺旋A减去20个氨基酸的缺失突变体)。

图19：描述了其中前导运输序列被缺失的优选实施方案。A显示不带有前导序列的hA DNA序列，SEQ ID NO 60。这是成熟的外泌蛋白。也显示了前导序列(SEQ ID NO 63)。B显示了不带有前导序列的hA的氨基酸序列，SEQ ID NO 61，以及前导序列的氨基酸序列SEQID NO 62。

实施例

鼠EPO cDNA的合成

RNA从野生型C57BL/6或SV129S6小鼠的肾脏或两种不同小鼠的脑中(中风后1小时)通过Trizol提取分离。将RNA用氯仿和异丙醇沉淀，最后溶解在DEPC-H₂O中。将RNA用Promega的无RQ1 RNA酶的DNA酶消化。通过在反应混合物中加入200μl苯酚/氯仿/异丙醇(25/24/1)终止反应，在10℃下以10000rpm离心10分钟。上清液与200μl氯仿/异丙醇(24/1)混合，在10℃下以10000rpm离心10分钟。在上清液中加入20μl 8M氯化锂和550μl无水乙醇。然后将混合物在-70℃孵育1小时，之后在0℃下以11000rpm离心30分钟沉淀。将得到的沉淀团用600μl 75％乙醇清洗，8000rpm离心(4℃，10分钟)，在室温下干燥。将RNA溶解在20μl DEPC-H₂O中。

莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒逆转录酶(MuLV；无RNase H，从Promega购买)被用于在15μl反应体积中进行第一链cDNA合成，所述反应体积具有含有3μg RNA和3μl随机六聚体引物(10μM)的DEPC-H₂O。逆转录用6μl M-MuLV反应缓冲液(5x)、2μl dNTP(各2，5mM)、1μl RNA酶抑制剂(1U/μl)、1μl M-MuLV逆转录酶和5μlDEPC-H₂O，在PCR机器中使用下面的程序进行：21℃ 5分钟；37℃1小时；95℃ 5分钟。

得到的cDNA库被用于通过巢式PCR方法扩增完整的EPOcDNA。第一步使用位于EPO基因编码区的引物(genepo_有义(SEQID NO 39)gaa ctt cca agg atg aag act tgc age和genepo_反义(SEQ IDNO 40)：gtg gca gca gca tgt cac ctg tc)。第二步使用的引物被设计用来扩增从起始到终止密码子的基因，并添加BamHl切割位点用于随后的克隆(epo_有义(SEQ ID NO 41)tat gga tec atg ggg gtg ccc gaa cgt cccac和epo_反义(SEQ ID NO 42)tat gga tec tea cct gtc ccc tct cct gcagac)。所有的引物都来自MWG-Biotech AG。巢式PCR在Hybaid PCR机器中进行，分两个步骤，第一个PCR(95℃ 3分钟；35个循环：65℃ 30秒，72℃ 1分钟，95℃ 30秒；72℃ 10分钟；4℃放置)，第二个PCR(95℃ 3分钟；5个循环：67℃ 30秒，72℃ 1分钟，95℃ 30秒；15个循环：70℃ 30秒，72℃ 1分钟，95℃ 30秒；72℃ 10分钟；4℃)。

在两个PCR中，按照制造商的说明使用Pfu Turbo Hotstart DNA聚合酶(Stratagene)。第一步的PCR产物被1∶50稀释用于第二步PCR。第二步cDNA合成方案使用Access RT-PCR系统(Invitrogen)进行，使用下面的参数：48℃ 5分钟；94℃ 2分钟；40个循环：94℃ 30秒，65℃ 1分钟，70℃ 2分钟；4℃放置。第二步PCR如上述进行。

扩增的全长EPO cDNA和EPO异构体在1.2％TAE琼脂糖凝胶上分离。各种PCR产物的图片显示在图1a中。然后使用Wizard SV-GelCleanup系统(Promega)或凝胶提取试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)纯化片段。由于Pfu聚合酶产生钝末端产物，用化学感受态Topl0 OneShot细胞，将cDNA亚克隆到pCR-Blunt II-TOPO载体中(二者都来自Invitrogen)。

通过使用Qiagen QIA制备试剂盒，将质粒DNA从单克隆分离出来。使用Thermo Sequenase^TM引物循环测序试剂盒(AmershamBiosciences)，插入片段在ALFexpress^TM DNA测序仪(PharmaciaBiotech)上测序。用Cy5标记引物M13FWDCY(SEQ ID NO 43：gtc gtgact ggg aaa ace ctg gcg)和M13REVCY(SEQ ID NO 44：age gga taa caattt cac aca gga)。测序参数是：t＝900分钟，T＝55℃；800V；55mA；30W)。序列分析表明存在新的缺少外显子4的EPO变体以及三个内部缺失的变体。核苷酸序列描述在图2a和图2b中，编码的肽序列描述在图4中。EPO变体mS的核苷酸和肽序列分别对应于SEQ ID NO 13和SEQ ID NO 14。EPO变体mG3的核苷酸和肽序列分别对应于SEQ IDNO 15和SEQ ID NO 16。EPO变体mG5的核苷酸和肽序列分别对应于SEQ ID NO 17和SEQ ID NO 18。EPO变体m301的核苷酸和肽序列分别对应于SEQ ID NO 19和SEQ ID NO 20。EPO变体mK3的核苷酸和肽序列分别对应于SEQ ID NO 21和SEQ ID NO 22。

人类EPO cDNA的合成

成年人类肾脏(男性)和胎儿脑(男性)的poly A+RNA从Stratagene购买。从250ng肾脏RNA或200ng脑RNA按照前面描述的莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(MuLV；无RNase H)方法产生cDNA。获得的cDNA库被用于扩增完整的EPO cDNA，使用Pfu聚合酶(Stratagene)以及下列引物：Hepo_有义(SEQ ID NO 45)：gat ggg ggtgca cga atg tec tgc和Hepo_反义(SEQ ID NO 46)：cac ace tgg tea tct gtcccc tgt c。

PCR在Invitrogen的PCR机器中进行(95℃ 3分钟；35个循环：67℃ 30秒，72℃ 1分钟，95℃ 30秒；72℃ 10分钟)。在胎儿脑cDNA的情况下，使用巢式PCR方法，在PCR产物的基础上进行20个循环的第二次PCR扩增。扩增的PCR产物在1.2％ TAE琼脂糖凝胶上分离(图1b)，使用凝胶提取试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)进行纯化。纯化的cDNA使用化学感受态Topl0 One Shot细胞，被亚克隆到pCR-Blunt II-TOPO载体中(二者都来自Invitrogen)。通过使用Qiagen QIA制备试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)将单克隆的质粒DNA分离出来。插入片段用Thermo Sequenase^TM引物循环测序试剂盒(Amersham Biosciences)，在ALFexpress^TM DNA测序仪(PharmaciaBiotech)上测序。用Cy5标记引物M13FWDCY(SEQ ID NO 43)和M13REVCY(SEQ ID NO 44)。测序参数是：t＝900分钟，T＝55℃；800V；55mA；30W。序列分析表明存在两个新的人类EPO变体，分别缺少外显子3和外显子4的前一半，以及许多符合在小鼠中检测到的重复的三体或六体规律的变体。核苷酸序列描述在图3a和图3b中，编码的肽序列描述在图4中。EPO变体hS3的核苷酸和肽序列分别对应于SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2。EPO变体hi-4的核苷酸和肽序列分别对应于SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4。EPO变体hl-5的核苷酸和肽序列分别对应于SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 6。EPO变体hS4的核苷酸和肽序列分别对应于SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8。EPO变体hl-1的核苷酸和肽序列分别对应于SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 10。EPO变体h2-1的核苷酸和肽序列分别对应于SEQ ID NO 11和SEQ IDNO 12。

His标记的蛋白在HEK细胞中的表达

使用不带有终止密码子的突出有义引物和突出反义引物(对于小鼠变体来说：epo_有义(SEQ ID NO 41)和epoeco_反义(SEQ ID NO47)：aaa gaa ttc cct gtc ccc tct cct gca gac ctc；对于人类变体来说：hepobam_有义(SEQ ID NO 48)：tat gga tcc atg ggg gtg cac gaa tgt cc，hepoeco_反义(SEQ ID NO 49)：aga gaa ttc tct gtc ccc tgt cct gca g)，将用于克隆的BamHI和EcoRI限制性位点添加到小鼠和人类EPO变体上。使用BamHI和EcoRI限制性位点，将PCR产物克隆到pcDNA-3.1-HIS/V5 A(Invitrogen)中。质粒在XL-1 Blue感受态细胞中扩增(recAl endAl gyrA96 thil hsdR17 supE44 relAl lac[F′ proABlacl^qZΔM15 Tn10(Tet^R)])(Stratagene)。XL-1 Blue感受态细胞转化方案的进行不使用β-巯基乙醇，使用延长的60秒热脉冲。使用QIAprepSpin Miniprep试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)提取质粒DNA。为了转染到哺乳动物细胞中，使用EndoFree Plasmid Maxi试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)提取DNA。HEK 293细胞(BD biosciences)在在组织培养瓶(25 cm²)中的Dulbecco′s修饰的Eagle′s培养基(DMEM；Biochrom，Berlin，1g/l葡萄糖，3.7g/l NaHCO₃；添加10％胎牛血清GOLD，1％青霉素/链霉素和1％L-谷氨酰胺)中，于37℃和5％CO₂下生长18天。每2-3天在达到80-90％满底后将细胞分开。在培养18天后(DIV18)，在含有不带抗生素的Dulbecco′s修饰的Eagle′s培养基的12孔板的每个孔中接入120,000个细胞。细胞生长大约48小时直到50％满底。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)按照为HEK细胞提供的方案进行转染。

在转染前10分钟用无抗生素的不含血清的DMEM替换HEK细胞的铺板培养基。细胞与DNA-脂质转染胺复合物在37℃下孵育5小时。然后将培养基替换成新鲜的无抗生素的含有血清的DMEM。在培养两天后将细胞分开，铺在含有抗生素的Dulbecco′s修饰的Eagle′s培养基上。

His标记的EPO变体的表达和纯化

His标记的蛋白在HEK细胞中短暂表达。在用pcDNA-3.1-HIS/V5A构建物转染2-6天后，收获HEK293细胞的培养基。3500rpm、4℃下离心15分钟沉淀细胞碎片。BD TALON^TM金属亲和树脂(BDBiosciences)被用于纯化his-标记的蛋白。所有的步骤(平衡、清洗和洗脱)都在pH 7.1下进行。将提供的方案修改成结合步骤延长到在4℃过夜。洗脱液收集成500μl的级份。通过Western印迹使用来自Santa-Cruz的抗rhEPO抗体或鼠EPO ELISA试剂盒(R&D)分析级份。使用来自Amersham Biosciences的HiTrap^TM脱盐柱(5ml)，按照制造商的说明，从含有蛋白的级份中除去咪唑。这也包括将缓冲液改变为PBS。

Western印迹

使用标准方案制备16％的SDS凝胶，在110V下跑胶。在硝酸纤维素膜上于200mA下进行印迹45分钟。印迹在含有5％脱脂奶粉的0.1％ Tween-20溶液的阻断缓冲液中阻断至少1小时。与第一抗体(EPO(H-162)sc-7956兔多克隆IgG，Santa Cruz，1∶500)在4℃下进行过夜孵育。在室温下加入第二抗体(山羊抗兔HRP；1∶1000)2小时。使用鲁米诺显示印迹；照片曝光2分钟。膜用丽春红(Ponceau Red)染色。EPO特异性抗体能够检测所有的EPO变体。

红系菌落形成分析

从雄性C57BL/6小鼠(8-11周龄)的胫骨和股骨收集骨髓细胞，重新悬浮在α培养基中(添加了10％胎牛血清GOLD，1％青霉素/链霉素和1％L-谷氨酰胺)。细胞被接种在含有8份Metho Cult SF 3236甲基纤维素(StemCell Technologie Inc)的35mm²皮氏培养皿中(225,000个细胞/皿)，1份细胞和2份α培养基与含有EPO衍生物(在鼠EPO的情况下150U/l)的HEK细胞预先调整好的培养基混合。150U/l的rhEPO(Roche)被用做阳性对照。平板在含有5％ CO₂的加湿气氛下在37℃孵育48小时。为了评估，只有含有至少6个血红蛋白化的细胞的红色克隆被考虑。

EPO变体的造血潜能

Metho Cult SF 3236只有在加入适当的细胞因子后才启动克隆的形成(CFU-M、CFU-G或CFU-E)。在加入促红细胞形成素2天后，可以观察到CFU-E(克隆形成单位-成红细胞)的形成。这种小的不规则的带红色的克隆到第3天时消失。

在该分析中，变体的造血潜力被测试，并与野生型形式的EPO以及rhEPO进行了比较。为了进行比较准备了下面的条件：来自用pZ/EG转染的HEK细胞的培养基被用作阴性对照，来自用pZ/EG细胞转染的HEK细胞的培养基加上150U/l rhEPO(Roche)作为阳性对照，以及来自或用pZ/EG-EPO-IRES(150U/l鼠EPO)、pZ/EG-剪接-IRES(变体S；mS)或用pZ/EG-G3-IRES(变体G3；mG3)转染的HEK细胞的培养基。在培养2天后，只对含有至少6个血红蛋白化的细胞的带红色的克隆进行计数。三个独立的实验的结果描述在图5中。

与鼠EPO和rhEPO相比，鼠EPO变体(mS和mG3变体)缺乏造血能力。

初级神经元培养物

大鼠初级神经元培养物从Wistar大鼠(Bundesinstitut furgesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinarmedizin，B erlin，Germany)的E16到早期E19胚胎获得。表达Cre的小鼠神经元从在微管蛋白α-1启动子控制下表达Cre重组酶的杂合转基因小鼠的E16胚胎获得(由Dr.U.Schweitzer提供；Experimental Endocrinology，Charite)。鼠和大鼠培养物的制备按照Brewer(1995)J Neurosci Res.42：674-83的修改方法。在移除脑膜后分离出大脑皮质，在PBS(Biochrom，Berlin，Germany)中清洗两次。在胰蛋白酶/EDTA(0.05/0.02％w/v溶于PBS)中在37℃下孵育15分钟后，将组织在N-Med(来自Gibco的修改的Eagle′s培养基，含有10％胎牛血清、100U来自Biochrom的青霉素加链霉素、2 mM L-谷氨酰胺、100 IE胰岛素/l、10 mM HEPES和44 mM葡萄糖)中清洗两次，在小量体积的N-Med中使用巴氏滴管仔细地分离。在室温通过在210g下离心2分钟将细胞沉淀，然后重新悬浮在NBM起始培养基中(Gibco的神经基础培养基，含有2％来自Gibco的B27补充物、1％青霉素/链霉素、0.5 mM L-谷氨酰胺和25μM谷氨酸)。

培养板的制备

24孔板和6孔板通过在4℃下与来自Biochrom的多聚L-赖氨酸(2.5μg/ml，溶于PBS)孵育过夜进行预处理。用PBS清洗孔，然后在37℃下与包被缓冲液(修改的Eagle′s培养基，含有5％来自PAA的FCS Gold、1％青霉素/链霉素、10mM HEPES和0.03 w/v来自Biochrom的胶原蛋白G)孵育1小时，然后用PBS将孔仔细地清洗两次。铺板培养基的体积和类型根据实验步骤进行选择。

大鼠初级皮质神经元的氧和葡萄糖缺乏——脑部缺血的细胞培养物模型

为了进行OGD，通过用PBS清洗一次将培养基洗掉。用500μl脱氧无糖苷溶液(BSS₀-O₂；143.8 mM Na⁺，5.5 mM K⁺，1.8mM Ca²⁺，0.8 mM Mg²⁺，125.3 mM Cl^-，26.2 mM HCO₃ ^-和0.8 mM SO₄ ²⁺，pH 7.4)，在专用的加湿的不透气的培养箱(Concept 400，Ruskinn Technologies，Bridgend，UK)中，在通过注入含有5％ CO₂、85％ N₂和10％ H₂的混合气体产生的缺氧气氛下诱导OGD。OGD时间依赖于培养物的密度和寿命，在2小时30分钟和2小时40分钟之间变化。在对照实验中，孔用500μl含氧的糖苷BSS0溶液(BSS₀+O2；143.8mM Na⁺，5.5mMK⁺，1.8mM Ca²⁺，0.8mM Mg²⁺，125.3mM Cl^-，26.2mM HCO₃ ^-、0.8mM SO₄ ²⁺以及20 mM葡萄糖，pH 7.4)处理，在含有5％ CO₂的常氧气氛中在37℃下孵育。在OGD后，马上将处理过的细胞和对照从BSS溶液中改变到500μl含有40％调整过的NBM加60％新鲜NBM的培养基中。24小时后，测量上清液中的乳酸脱氢酶(LDH)活性，作为细胞死亡的指示物。

对于LDH测量来说，将25μl培养基与100μl新鲜的β-NADH溶液(0.15mg/ml，溶于1xLDH缓冲液；Sigma，还原型)在96孔板(Greiner)中混合。在将板放入读板器(hermo Labsystems；MRX^TC Revelation)之前，立即加入25μl 22.7mM丙酮酸盐(Sigma)。参数选择如下：滤光片：340nm，摇动时间：5秒，时间间隔：30秒，计数：10。LDH的浓度参照LDH标准品(Greiner，系统校正物)按比例计算。

用来自表达EPO变体的转染的HEK293细胞的调整过的培养基诱导神经保护

在下面的实验中rhEPO(来自Sigma Aldrich，Deisen-hofen，Germany的重组人类EPO)被用作阳性对照。神经保护分析的流程描述在图6中。神经元以300,000个细胞的密度铺于24孔板中，终体积为600μl的NBM起始培养基。4天后，用250μl新鲜的NBM(除了不含谷氨酸之外与NBM起始缓冲液相同)替换200μl培养基。

对于使用rhEPO、野生型mEPO、野生型hEPO或EPO变体的预处理来说，将培养基取出到终体积为200μl，并分别加入200μl含有等摩尔量(相当于200U/l rhEPO)EPO或EPO变体的新鲜的NBM+B27填满。在来自HEK293细胞的调整过的培养基中，不同EPO变体(以及mEPO和hEPO)的等效浓度通过Western印迹和EPO-ELISA进行估算。然后，在进行氧和葡萄糖缺乏(OGD)(OGD的时间间隔如上所述)之前，将神经元在常氧的潮湿条件下于37℃生长48小时。在OGD后24小时，通过测量LDH释放来评估细胞死亡。与模拟处理的神经元(来自用骨架质粒转染的HEK293细胞的培养基；＝ko，100％)相比，LDH释放的减少是神经保护的定量度量。在所有的实验中我们都观察到，如果与wt EPO相比，EPO变体提供了更强的神经保护效果(对于鼠EPO及其变体参见图7中的图A和B，对于人类EPO及其变体参见图8中的图A和B)。

鼠EPO变体诱导的神经保护比EPO(rhEPO以及野生型小鼠EPO)诱导的更强。例如，EPO介导的神经保护只能够在明确确定的OGD长度窗(对应于明确确定的损伤水平)中观察到。在低浓度下，hS3和hS4的神经保护等于或好于wt hEPO的神经保护。总的来说，变体诱导的神经保护比rhEPO诱导的强。此外，变体比通过与EPO变体相同的步骤产生的野生型mEPO和hEPO的神经保护能力均高。

H9c2缺血模型

大鼠BDIX心脏成肌细胞细胞系(从欧洲细胞培养物保藏中心(European Collection of Cell Cultures)获得)被培养在含有4.5g/l葡萄糖的DMEM(Biochrom)中，其中添加了2mM L-谷氨酰胺、10％失活的胎牛血清和1％青霉素/链霉素。未满底的培养物(70％)按1∶4比例传代培养。细胞在400μl含有120pM hEPO或hS3的培养基中，以每个孔15,000个细胞的密度分别铺于24孔板中，培养48小时。通过将细胞培养在400μl含有4.5g/l葡萄糖、添加了2mM L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的无血清DMEM中，然后将它们留在用含有5％ CO₂、85％ N₂和10％ H₂的混合气体饱和的厌氧工作站(Concept 400，RuskinnTechnologies，Bridgend，UK)中，于37C下放置24小时来造成缺氧。对照细胞被留在常氧培养箱中的无血清DMEM中。在实验的最后，将培养基用400μl新鲜的无血清DMEM替换，在24小时后按照标准方案测量LDH。

免疫沉淀

自由进食和进水的雄性129S6小鼠或雄性C57BI6小鼠(8-10周龄，Bundesinstituts fur Risikobewertung，Berlin)被用于实验。皮下注射剂量为60mg/kg的CoCl₂，在18小时后杀死动物。通过商业购买的ELISA(R&D，mEPO)测定血清、肾脏和脑蛋白提取物中的蛋白表达。

用于免疫沉淀的抗体购自R&D(山羊抗mEPO抗体，生物素标记)和Santa-Cruz(兔抗rhEPO抗体)。免疫沉淀按照标准方案进行，通过western印迹评估。

通过在印迹孵育前，与10μg Darbpoietin A在室温孵育2小时来阻断Western印迹检测抗体

α-螺旋突变体的产生(图10)

人类α-螺旋突变体全部都是通过基于PCR的方法使用标准方案产生的。

突变体A(hAmA)和突变体E(hAmE)是在41位(精氨酸)上带有氨基酸置换的α-螺旋变体。突变体A(丙氨酸)的cDNA序列从AGG变为GCG，突变体E(谷氨酸)的cDNA序列从AGG变为GAG。-20aa和-10aa是α-螺旋的缺失变体，分别在C-末端丢失了20个氨基酸或10个氨基酸。产生的所有的突变体不带有V5和His-tag，并表达在HEK 293细胞中。神经保护实验用表达不同变体的转染的HEK细胞的培养基，按照上面的描述进行。

hEPO和hS3在H9c2细胞缺血模型中介导的细胞保护(图11)

使用纯化的hEPO和hS3作为例子，在H9c2心脏成肌细胞(图1)中游血清缺乏和缺氧构成的缺血模型中，显示了EPO变体的细胞保护能力。对LDH的释放进行评估，作为凋亡性细胞死亡的标志物。对于两种变体我们都发现了显著的细胞保护能力(对于hEPO和hS3来说为大约20％和25％)。

免疫沉淀揭示出CoCl ₂ 处理的小鼠的肾脏蛋白提取物中的EPO剪接同工型(图12)

为了通过基于PCR的方法增强我们在人类和鼠类组织中对于EPO剪接同工型的发现，我们使用了被测试能够识别两种同工型的抗体对CoCl₂处理过的小鼠的鼠血清、脑和肾脏蛋白提取物进行了免疫沉淀。已知皮下注射CoCl₂能够在几种小鼠组织，即血液、脑、肝脏和肾脏中增加促红细胞生成素的水平。

我们能够从CoCl₂处理过的小鼠的血清、脑和肾脏蛋白提取物中沉淀促红细胞生成素(大约40KDa)(图2)；由于表达水平低，从未处理的小鼠的肾脏蛋白提取物中沉淀促红细胞生成素没有成功。此外，我们能够证明在CoCl₂处理过的小鼠的肾脏蛋白提取物中，第二个较小的蛋白(大约30KDa)的存在。该蛋白被抗rhEPO抗体特异性识别，正如用Darbpoietin A完全阻断了抗体-抗原相互作用所显示的那样。这些发现强烈地支持鼠类促红细胞生成素剪接同工型的存在。这些结果在第二个小鼠种系，即C57B16中得到了重复。

不同的促红细胞生成素α-螺旋同工型介导的神经保护(图13)

在分析了目前为止鉴定到的促红细胞生成素变体的神经保护潜能后，我们建议α-螺旋对于促红细胞生成素的神经保护特点来说是功能上重要的结构域。为了检验这个假设，我们在HEK293细胞中表达了缩短形式的人类促红细胞生成素，即α-螺旋结构域，并在我们的OGD模型中试验了该肽。如图13所示，我们发现30pM和15pM的该肽与30pM hEPO具有相当的保护能力。

为了鉴定人类促红细胞生成素的α-螺旋结构域中的功能重要的残基，我们产生了含有氨基酸置换(hAmA和hAmE)或完全的结构域缺失(hA-10和hA-20)的不同的促红细胞生成素突变体。

在41位上的中性和酸性氨基酸置换都不能在我们的OGD模型中破坏α-螺旋的神经保护能力(图14)。

由几种人类EPO同工型介导的神经保护(n＝6)P^*＜0.05；ANOVA1与对照比较(图14)

在α-螺旋的C-末端失去10个或20个氨基酸的缺失变体被表达在HEK293细胞中，并在OGD模型中试验。缺失变体hA-10仍然具有可以与hS3剪接同工型相比较的神经保护性质。缺失20个氨基酸(hA-20)产生的肽不再具有保护性(图15)。

人类促红细胞生成素变体的免疫调节(图16)

人类EPO变体hS3和hS4表现出强免疫调节效能。在用内毒素脂多糖(LPS)刺激的人类巨噬细胞中，hS3和hS4诱导了抗炎症细胞因子IL-10，降低了促炎性细胞因子IL-6和IL-8的表达。与EPO(hWT)相比，hS3和hS4的抗炎性效能显著得多。EPO变体的这些抗炎症性质可用于炎症(例如多发性脑硬化、病毒和细菌感染、败血症)和变性性疾病(例如中风、心肌梗塞)的治疗。

序列表

<110>夏里特柏林大学医学院(Charité-

Berlin)

<120>促红细胞生成素变体(Erythropoietin Splice Variants)

<130>SCT074926-47

<160>63

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>495

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>1

atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60

ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120

aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacgg tcgggcagca ggccgtagaa 180

gtctggcagg gcctggccct gctgtcggaa gctgtcctgc ggggccaggc cctgttggtc 240

aactcttccc agccgtggga gcccctgcag ctgcatgtgg ataaagccgt cagtggcctt 300

cgcagcctca ccactctgct tcgggctctg cgagcccaga aggaagccat ctcccctcca 360

gatgcggcct cagctgctcc actccgaaca atcactgctg acactttccg caaactcttc 420

cgagtctact ccaatttcct ccggggaaag ctgaagctgt acacagggga ggcctgcagg 480

acaggggaca gatga 495

<210>2

<211>165

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>2

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1 5 10 15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

20 25 30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

35 40 45

Ala Glu Asn Ile Thr Arg Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln

50 55 60

Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu

65 70 75 80

Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys

85 90 95

Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly

100 105 110

Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro

115 120 125

Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr

130 135 140

Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys

145 150 155 160

Arg Thr Gly Asp Arg

165

<210>3

<211>525

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>3

atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60

ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120

aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc 180

agcttgaatg agaatatcac tgtcccagac accaaagtta atttctatgc ctggaagagg 240

atggaggtcg ggcagcaggc cctgttggtc aactcttccc agccgtggga gcccctgcag 300

ctgcatgtgg ataaagccgt cagtggcctt cgcagcctca ccactctgct tcgggctctg 360

ggagcccaga aggaagccat ctcccctcca gatgcggcct cagctgctcc actccgaaca 420

atcactgctg acactttccg caaactcttc cgagtctact ccaatttcct ccggggaaag 480

ctgaagctgt acacagggga ggcctgcagg acaggggaca gatga 525

<210>4

<211>174

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>4

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1 5 10 15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

20 25 30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

35 40 45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

50 55 60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65 70 75 80

Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp

85 90 95

Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser

100 105 110

Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser

115 120 125

Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp

130 135 140

Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys

145 150 155 160

Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg

165 170

<210>5

<211>495

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>5

atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60

ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120

aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc 180

agcttgaatg agaatatcac tgtcccagac accaaagtta atttctatgc cctgttggtc 240

aactcttccc agccgtggga gcccctgcag ctgcatgtgg ataaagccgt cagtggcctt 300

cgcagcctca ccactctgct tcgggctctg ggagcccaga aggaagccat ctcccctcca 360

gatgcggcct cagctgctcc actccgaaca atcactgctg acactttccg caaactcttc 420

cgagtctact ccaatttcct ccggggaaag ctgaagctgt acacagggga ggcctgcagg 480

acaggggaca gatga 495

<210>6

<211>164

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>6

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1 5 10 15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

20 25 30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

35 40 45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

50 55 60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Leu Leu Val

65 70 75 80

Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala

85 90 95

Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala

100 105 110

Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu

115 120 125

Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser

130 135 140

Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg

145 150 155 160

Thr Gly Asp Arg

<210>7

<211>489

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>7

atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60

ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120

aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc 180

agcttgaatg agaatatcac tgtcccagac accaaagtta atttctatgc ctggaagagg 240

atggagccgt gggagcccct gcagctgcat gtggataaag ccgtcagtgg ccttcgcagc 300

ctcaccactc tgcttcgggc tctgggagcc cagaaggaag ccatctcccc tccagatgcg 360

gcctcagctg ctccactccg aacaatcact gctgacactt tccgcaaact cttccgagtc 420

tactccaatt tcctccgggg aaagctgaag ctgtacacag gggaggcctg caggacaggg 480

gacagatga 489

<210>8

<211>162

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>8

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1 5 10 15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

20 25 30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

35 40 45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

50 55 60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65 70 75 80

Met Glu Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser

85 90 95

Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys

100 105 110

Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr

115 120 125

Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe

130 135 140

Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly

145 150 155 160

Asp Arg

<210>9

<211>475

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>9

atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60

ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120

aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc 180

agcttgaatg agaatatcac tgtcccaggc cctgttggtc aactcttccc agccgtggga 240

gcccctgcag ctgcatgtgg ataaagccgt cagtggcctt cgcagcctca ccactctgct 300

tcgggctctg ggagcccaga aggaagccat ctcccctcca gatgcggcct cagctgctcc 360

actccgaaca atcactgctg acactttccg caaactcttc cgagtctact ccaatttcct 420

ccggggaaag ctgaagctgt acacagggga ggcctgcagg acaggggaca gatga 475

<210>10

<211>87

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>10

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1 5 10 15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

20 25 30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

35 40 45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

50 55 60

Asn Ile Thr Val Pro Gly Pro Val Gly Gln Leu Phe Pro Ala Val Gly

65 70 75 80

Ala Pro Ala Ala Ala Cys Gly

85

<210>11

<211>301

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>11

atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60

ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120

aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc 180

agcttgaatg agaacaatca ctgctgacac tttccgcaaa ctcttccgag tctactccaa 240

tttcctccgg ggaaagctga agctgtacac aggggaggcc tgcaggacag gggacagatg 300

a 301

<210>12

<211>68

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>12

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1 5 10 15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

20 25 30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

35 40 45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

50 55 60

Asn Asn His Cys

65

<210>13

<211>399

<212>DNA

<213>Mus musculus

<400>13

atgggggtgc ccgaacgtcc caccctgctg cttttactct ccttgctact gattcctctg 60

ggcctcccag tcctctgtgc tcccccacgc ctcatctgcg acagtcgagt tctggagagg 120

tacatcttag aggccaagga ggcagaaaat gtcacgatgg gttgtgcaga aggtcccaga 180

ctgagtgaaa atattacagt cccagatacc aaagtcaact tctatgcttg gaaaagaatg 240

gagaaggaat tgatgtcgcc tccagatacc accccacctg ctccactccg aacactcaca 300

gtggatactt tctgcaagct cttccgggtc tacgccaact tcctccgggg gaaactgaag 360

ctgtacacgg gagaggtctg caggagaggg gacaggtga 399

<210>14

<211>132

<212>PRT

<213>Mus musculus

<400>14

Met Gly Val Pro Glu Arg Pro Thr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu

1 5 10 15

Leu Ile Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Cys Ala Pro Pro Arg Leu Ile

20 25 30

Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile Leu Glu Ala Lys Glu Ala

35 40 45

Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly Pro Arg Leu Ser Glu Asn

50 55 60

Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met

65 70 75 80

Glu Lys Glu Leu Met Ser Pro Pro Asp Thr Thr Pro Pro Ala Pro Leu

85 90 95

Arg Thr Leu Thr Val Asp Thr Phe Cys Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ala

100 105 110

Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Val Cys Arg

115 120 125

Arg Gly Asp Arg

130

<210>15

<211>387

<212>DNA

<213>Mus musculus

<400>15

atgggggtgc ccgaacgtcc caccctgctg cttttactct ccttgctact gattcctctg 60

ggcctcccag tcctctgtgc tcccccacgc ctcatctgcg acagtcgagt tctggagagg 120

tacatcttag aggccaagga ggcagaaaat gtcacgatgg gttgtgcaga aggtcccaga 180

ctgagtgaaa atattacagt cccagatacc aaagtcaact tctatgcttg gaaaagaatg 240

gaggtggaag aacaggccat agaagtttgg caaggcctgt ccctgctctc agaagccatc 300

ctgcaggccc aggccctgct agccaacttc ctccggggga aactgaagct gtacacggga 360

gaggtctgca ggagagggga caggtga 387

<210>16

<211>128

<212>PRT

<213>Mus musculus

<400>16

Met Gly Val Pro Glu Arg Pro Thr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu

1 5 10 15

Leu Ile Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Cys Ala pro Pro Arg Leu Ile

20 25 30

Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile Leu Glu Ala Lys Glu Ala

35 40 45

Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly Pro Arg Leu Ser Glu Asn

50 55 60

Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met

65 70 75 80

Glu Val Glu Glu Gln Ala Ile Glu Val Trp Gln Gly Leu Ser Leu Leu

85 90 95

Ser Glu Ala Ile Leu Gln Ala Gln Ala Leu Leu Ala Asn Phe Leu Arg

100 105 110

Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Val Cys Arg Arg Gly Asp Arg

115 120 125

<210>17

<211>513

<212>DNA

<213>Mus musculus

<400>17

atgggggtgc ccgaacgtcc caccctgctg cttttactct ccttgctact gattcctctg 60

ggcctcccag tcctctgtgc tcccccacgc ctcatctgcg acagtcgagt tctggagagg 120

tacatcttag aggccaagga ggcagaaaat gtcacgatgg gttgtgcaga aggtcccaga 180

ctgagtgaaa atattacagt cccagatacc aaagtcaact tctatgcttg gaaaagaatg 240

gaggtggaag aacaggccat agaagtttgg caaggcctgt ccctgctctc agaagccatc 300

ctgcaggccc aggccctgct agccaattcc tcccagccac cagagaccct tcagcttcat 360

atagacaaag ccatcagtgg tctacgtagc ctcacttcac tgcttcgggt actgggagct 420

cagaaggaat tgatgtcgcc tccagatacc accccacctg ctccactccg aacactcaca 480

gtggatactt tctgcaggag aggggacagg tga 513

<210>18

<211>170

<212>PRT

<213>Mus musculus

<400>18

Met Gly Val Pro Glu Arg Pro Thr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu

1 5 10 15

Leu Ile Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Cys Ala Pro Pro Arg Leu Ile

20 25 30

Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile Leu Glu Ala Lys Glu Ala

35 40 45

Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly Pro Arg Leu Ser Glu Asn

50 55 60

Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met

65 70 75 80

Glu Val Glu Glu Gln Ala Ile Glu Val Trp Gln Gly Leu Ser Leu Leu

85 90 95

Ser Glu Ala Ile Leu Gln Ala Gln Ala Leu Leu Ala Asn Ser Ser Gln

100 105 110

Pro Pro Glu Thr Leu Gln Leu His Ile Asp Lys Ala Ile Ser Gly Leu

115 120 125

Arg Ser Leu Thr Ser Leu Leu Arg Val Leu Gly Ala Gln Lys Glu Leu

130 135 140

Met Ser Pro Pro Asp Thr Thr Pro Pro Ala Pro Leu Arg Thr Leu Thr

145 150 155 160

Val Asp Thr Phe Cys Arg Arg Gly Asp Arg

165 170

<210>19

<211>279

<212>DNA

<213>Mus musculus

<400>19

atgggggtgc ccgaacgtcc caccctgctg cttttactct ccttgctact gattcctctg 60

ggcctcccag tcctctgtgc tcccccacgc ctcatctgcg acagtcgagt tctggagagg 120

tacatcttag aggccaagga ggcagaaaat gtcacgatgg gttgtgcaga aggtcccaga 180

ctgagtgaaa atattacagt cccagatacc aaagtcaact tcctccgggg gaaactgaag 240

ctgtacacgg gagaggtctg caggagaggg gacaggtga 279

<210>20

<211>92

<212>PRT

<213>Mus musculus

<400>20

Met Gly Val Pro Glu Arg Pro Thr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu

1 5 10 15

Leu Ile Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Cys Ala Pro Pro Arg Leu Ile

20 25 30

Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile Leu Glu Ala Lys Glu Ala

35 40 45

Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly Pro Arg Leu Ser Glu Asn

50 55 60

Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys

65 70 75 80

Leu Tyr Thr Gly Glu Val Cys Arg Arg Gly Asp Arg

85 90

<210>21

<211>591

<212>DNA

<213>Mus musculus

<400>21

atgggggtgc ccgaacgtcc caccctgctg cttttactct ccttgctact gattcctctg 60

ggcctcccag tcctctgtgc tcccccacgc ctcatctgcg acagtcgagt tctggagagg 120

tacatcttag aggccaagga ggcagaaaat gtcacgatgg gttgtgcaga aggtcccaga 180

ctgagtgaaa atattacagt cccagatacc aaagtcaact tctatgcttg gaaaagaatg 240

gaggtggaag aacaggccat agaagtttgg caaggcctgt ccctgctctc agaagctgta 300

cacgggagag gtctgcagga gaggggacag gtgacatgct gctgccaccg tggtggaccg 360

acgaacttgc tccccgtcac tgtgtcatgc caaccctcca ccactcccaa ccctcatcaa 420

acgggtcatt accttcttac cagtctgtcc catggacact ccagcaccag cagtgacatc 480

ctcggggcca gaagaacttc ccagagctcc attctgaaat ctaaagatgt cgctggacaa 540

gcccgaggcc ccagagaaga agagcctcag aatcagctcg gatttgttta g 591

<210>22

<211>196

<212>PRT

<213>Mus musculus

<400>22

Met Gly Val Pro Glu Arg Pro Thr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu

1 5 10 15

Leu Ile Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Cys Ala Pro Pro Arg Leu Ile

20 25 30

Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile Leu Glu Ala Lys Glu Ala

35 40 45

Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly Pro Arg Leu Ser Glu Asn

50 55 60

Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met

65 70 75 80

Glu Val Glu Glu Gln Ala Ile Glu Val Trp Gln Gly Leu Ser Leu Leu

85 90 95

Ser Glu Ala Val His Gly Arg Gly Leu Gln Glu Arg Gly Gln Val Thr

100 105 110

Cys Cys Cys His Arg Gly Gly Pro Thr Asn Leu Leu Pro Val Thr Val

115 120 125

Ser Cys Gln Pro Ser Thr Thr Pro Asn Pro His Gln Thr Gly His Tyr

130 135 140

Leu Leu Thr Ser Leu Ser His Gly His Ser Ser Thr Ser Ser Asp Ile

145 150 155 160

Leu Gly Ala Arg Arg Thr Ser Gln Ser Ser Ile Leu Lys Ser Lys Asp

165 170 175

Val Ala Gly Gln Ala Arg Gly Pro Arg Glu Glu Glu Pro Gln Asn Gln

180 185 190

Leu Gly Phe Val

195

<210>23

<211>159

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>23

atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60

ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120

aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacg 159

<210>24

<211>53

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>24

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1 5 10 15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

20 25 30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

35 40 45

Ala Glu Asn Ile Thr

50

<210>25

<211>225

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>25

atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60

ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120

aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc 180

agcttgaatg agaatatcac tgtcccagac accaaagtta atttc 225

<210>26

<211>82

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>26

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1 5 10 15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

20 25 30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

35 40 45

Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu

50 55 60

Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg

65 70 75 80

Met Glu

<210>27

<211>243

<212>DNA

<213>Mus musculus

<400>27

atgggggtgc ccgaacgtcc caccctgctg cttttactct ccttgctact gattcctctg 60

ggcctcccag tcctctgtgc tcccccacgc ctcatctgcg acagtcgagt tctggagagg 120

tacatcttag aggccaagga ggcagaaaat gtcacgatgg gttgtgcaga aggtcccaga 180

ctgagtgaaa atattacagt cccagatacc aaagtcaact tctatgcttg gaaaagaatg 240

gag 243

<210>28

<211>81

<212>PRT

<213>Mus musculus

<400>28

Met Gly Val Pro Glu Arg Pro Thr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu

1 5 10 15

Leu Ile Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Cys Ala Pro Pro Arg Leu Ile

20 25 30

Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile Leu Glu Ala Lys Glu Ala

35 40 45

Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly Pro Arg Leu Ser Glu Asn

50 55 60

Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met

65 70 75 80

Glu

<210>29

<211>326

<212>DNA

<213>Mus musculus

<400>29

atgggggtgc ccgaacgtcc caccctgctg cttttactct ccttgctact gattcctctg 60

ggcctcccag tcctctgtgc tcccccacgc ctcatctgcg acagtcgagt tctggagagg 120

tacatcttag aggccaagga ggcagaaaat gtcacgatgg gttgtgcaga aggtcccaga 180

ctgagtgaaa atattacagt cccagatacc aaagtcaact tctatgcttg gaaaagaatg 240

gaggtggaag aacaggccat agaagtttgg caaggcctgt ccctgctctc agaagccatc 300

ctgcaggccc aggccctgct agccaa 326

<210>30

<211>109

<212>PRT

<213>Mus musculus

<400>30

Met Gly Val Pro Glu Arg Pro Thr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Leu

1 5 10 15

Leu Ile Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Cys Ala Pro Pro Arg Leu Ile

20 25 30

Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Ile Leu Glu Ala Lys Glu Ala

35 40 45

Glu Asn Val Thr Met Gly Cys Ala Glu Gly Pro Arg Leu Ser Glu Asn

50 55 60

Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met

65 70 75 80

Glu Val Glu Glu Gln Ala Ile Glu Val Trp Gln Gly Leu Ser Leu Leu

85 90 95

Ser Glu Ala Ile Leu Gln Ala Gln Ala Leu Leu Ala Asn

100 105

<210>31

<211>336

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>31

gtcgggcagc aggccgtaga agtctggcag ggcctggccc tgctgtcgga agctgtcctg 60

cggggccagg ccctgttggt caactcttcc cagccgtggg agcccctgca gctgcatgtg 120

gataaagccg tcagtggcct tcgcagcctc accactctgc ttcgggctct gggagcccag 180

aaggaagcca tctcccctcc agatgcggcc tcagctgctc cactccgaac aatcactgct 240

gacactttcc gcaaactctt ccgagtctac tccaatttcc tccggggaaa gctgaagctg 300

tacacagggg aggcctgcag gacaggggac agatga 336

<210>32

<211>112

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>32

Arg Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu

1 5 10 15

Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln

20 25 30

Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu

35 40 45

Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala

50 55 60

Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr

65 70 75 80

Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg

85 90 95

Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg

100 105 110

<210>33

<211>234

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<400>33

cccctgcagc tgcatgtgga taaagccgtc agtggccttc gcagcctcac cactctgctt 60

cgggctctgg gagcccagaa ggaagccatc tcccctccag atgcggcctc agctgctcca 120

ctccgaacaa tcactgctga cactttccgc aaactcttcc gagtctactc caatttcctc 180

cggggaaagc tgaagctgta cacaggggag gcctgcagga caggggacag atga 234

<210>34

<211>80

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>34

Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu

1 5 10 15

Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala

20 25 30

Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr

35 40 45

Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg

50 55 60

Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg

65 70 75 80

<210>35

<211>156

<212>DNA

<213>Mus musculus

<400>35

aaggaattga tgtcgcctcc agataccacc ccacctgctc cactccgaac actcacagtg 60

gatactttct gcaagctctt ccgggtctac gccaacttcc tccgggggaa actgaagctg 120

tacacgggag aggtctgcag gagaggggac aggtga 156

<210>36

<211>51

<212>PRT

<213>Mus musculus

<400>36

Lys Glu Leu Met Ser Pro Pro Asp Thr Thr Pro Pro Ala Pro Leu Arg

1 5 10 15

Thr Leu Thr Val Asp Thr Phe Cys Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ala Asn

20 25 30

Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Val Cys Arg Arg

35 40 45

Gly Asp Arg

50

<210>37

<211>61

<212>DNA

<213>Mus musculus

<400>37

cttcctccgg gggaaactga agctgtacac gggagaggtc tgcaggagag gggacaggtg 60

a 61

<210>38

<211>19

<212>PRT

<213>Mus musculus

<400>38

Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Val Cys Arg Arg

1 5 10 15

Gly Asp Arg

<210>39

<211>27

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>PCR primer

<400>39

gaacttccaa ggatgaagac ttgcagc 27

<210>40

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>PCR primer

<400>40

gtggcagcag catgtcacct gtc 23

<210>41

<211>32

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>PCR primer

<400>41

tatggatcca tgggggtgcc cgaacgtccc ac 32

<210>42

<211>33

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>PCR primer

<400>42

tatggatcct cacctgtccc ctctcctgca gac 33

<210>43

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>PCR primer

<400>43

gtcgtgactg ggaaaaccct ggcg 24

<210>44

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>PCR primer

<400>44

agcggataac aatttcacac agga 24

<210>45

<211>24

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>PCR primer

<400>45

gatgggggtg cacgaatgtc ctgc 24

<210>46

<211>25

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>PCR primer

<400>46

cacacctggt catctgtccc ctgtc 25

<210>47

<211>33

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>PCR primer

<400>47

aaagaattcc ctgtcccctc tcctgcagac ctc 33

<210>48

<211>29

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>PCR primer

<400>48

tatggatcca tgggggtgca cgaatgtcc 29

<210>49

<211>28

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<223>PCR primer

<400>49

agagaattct ctgtcccctg tcctgcag 28

<210>50

<211>53

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>50

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1 5 10 15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

20 25 30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

35 40 45

Ala Glu Asn Ile Thr

50

<210>51

<211>53

<212>PRT

<213>artificial

<220>

<223>Homo sapiens point mutation

<400>51

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1 5 10 15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

20 25 30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Ala Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

35 40 45

Ala Glu Asn Ile Thr

50

<210>52

<211>53

<212>PRT

<213>artificial

<220>

<223>Homo sapiens point mutation

<400>52

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1 5 10 15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

20 25 30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Glu Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu

35 40 45

Ala Glu Asn Ile Thr

50

<210>53

<211>43

<212>PRT

<213>artificial

<220>

<223>Homo sapiens ha-10 deletion mutant

<400>53

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1 5 10 15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

20 25 30

Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu

35 40

<210>54

<211>33

<212>PRT

<213>artificial

<220>

<223>Homo sapiens hA-20 deletion mutant

<400>54

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1 5 10 15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu

20 25 30

Ile

<210>55

<211>159

<212>DNA

<213>homo sapiens

<400>55

atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60

ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120

aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacg 159

<210>56

<211>159

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>hAmA(Mutant Alanin hWT-EPO Helix A)

<400>56

atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60

ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120

gcgtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacg 159

<210>57

<211>159

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>hAmE(Mutant Glutamic-Acid hWT-EPO Helix A)

<400>57

atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60

ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120

gagtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacg 159

<210>58

<211>129

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>hA-10(hWT-EPO Helix A minus 10aa)

<400>58

atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60

ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120

aggtacctc 129

<210>59

<211>99

<212>DNA

<213>artificial

<220>

<223>hA-20(hWT-EPO Helix A minus 20aa)

<400>59

atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60

ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatc 99

<210>60

<211>77

<212>DNA

<213>homo sapiens

<400>60

ccccaccacg cctcatctgt gacagccgag tcctggagag gtacctcttg gaggccaagg 60

aggccgagaa tatcacg 77

<210>61

<211>16

<212>PRT

<213>homo sapiens

<400>61

Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu

1 5 10 15

<210>62

<211>27

<212>PRT

<213>homo sapiens

<400>62

Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu

1 5 10 15

Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly

20 25

<210>63

<211>82

<212>DNA

<213>homo sapiens

<400>63

atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60

ctgggcctcc cagtcctggg cg 82

Claims

1.编码选自下列的多核苷酸或者这样的多核苷酸的互补链的促红细胞生成素(EPO)变体：

(a)编码至少成熟形式的被称为hs3、h1-4、h1-5、hs4、h1-1、h2-1、mS、mG3、mG5、m301和mK3的多肽的多核苷酸，所述多肽的推导氨基酸序列分别显示在SEQ ID NOs：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和22中；

(b)具有编码至少成熟形式的多肽、如SEQ ID NOs：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19和21所示编码序列的多核苷酸；

(c)编码多肽mS、mG3、mG5、m301和mK3的人源化版本的多核苷酸，所述多肽的推导氨基酸序列显示在SEQ ID NOs：14、16、18、20和22中；

(d)编码多肽的多核苷酸，所述多肽包括在选自SEQ ID NO 32、34、36和38显示的氨基酸序列的氨基酸序列的N-末端，融合选自SEQID NO 24、26、28和30显示的氨基酸序列的氨基酸序列；

(e)多核苷酸，包括在选自SEQ ID NO 31、33、35和37显示的多核苷酸序列的多核苷酸序列的5’端，融合选自SEQ ID NO 23、25、27和29显示的多核苷酸序列的多核苷酸序列；

(g)编码由(a)到(f)任何一个多核苷酸编码的多肽的片段的多核苷酸，其中在所述片段中，与所述多肽相比，1到10个氨基酸残基在N-和/或C-末端被缺失，和/或1到10个氨基酸残基在接头的N-和/或C-末端被缺失，并且所述片段具有细胞保护和特别是神经保护活性，但基本上没有造血活性；

(h)与(a)到(g)任何一个定义的多核苷酸具有至少50％同一性的多核苷酸，它们为具有细胞保护和特别是神经保护活性但基本上不具有造血活性的多肽编码；以及

2.来自另一个较高等真核生物物种、权利要求1中编码多核苷酸的促红细胞生成素(EPO)变体的类似物。

3.编码选自下列多核苷酸或者这样的多核苷酸的互补链的促红细胞生成素(EPO)变体：

(a)编码EPO变体多肽的多核苷酸，其含有包括螺旋A的全长EPO的N-末端部分，并且缺少至少下列之一：

(i)在螺旋A和螺旋B之间的至少10个氨基酸的片段；

(ii)螺旋B的至少10个氨基酸的片段；

(iii)在螺旋B和螺旋C之间的至少2个氨基酸的片段；

(iv)螺旋C的至少10个氨基酸的片段；

(v)在螺旋C和螺旋D之间的至少10个氨基酸的片段；和/或

(vi)螺旋D的至少10个氨基酸的片段；

(c)其互补链在严格条件下能够与(a)到(b)任何一个所定义的多核苷酸杂交的多核苷酸，其为具有细胞保护和特别是神经保护活性但基本上不具有造血活性的多肽编码。

4.权利要求1到3任何一个的多核苷酸，其是DNA、基因组DNA或RNA。

5.含有权利要求1到4任何一个的多核苷酸的载体。

6.权利要求5中的载体，其中多核苷酸与允许在原核和/或真核宿主细胞中表达的表达控制序列可操作地连接。

7.用权利要求1到4任何一个的多核苷酸或权利要求5或6的载体进行基因工程改造的宿主细胞。

8.含有权利要求1到4任何一个的多核苷酸、权利要求5或6的载体和/或权利要求7的宿主细胞的转基因非人类动物。

9.生产由权利要求1到4任何一个的多核苷酸编码的EPO变体多肽的方法，包括：培养权利要求7的宿主细胞，以及回收由所述多核苷酸编码的多肽。

10.权利要求9中的方法，还包含对所述EPO变体进行修饰的步骤，其中的修饰选自氧化、硫化、磷酸化、添加寡糖或其组合。

11.生产能够表达至少一种EPO变体的细胞的方法，包括用权利要求5或6的载体体外基因工程改造细胞，其中所述EPO变体多肽由权利要求1到4任何一个的多核苷酸编码。

12.具有由权利要求1到4任何一个的多核苷酸编码的氨基酸序列的多肽或能够通过权利要求9或10中的方法获得的多肽。

13.与权利要求12的多肽特异性结合的抗体。

14.药物组合物，含有权利要求1到4任何一个的多核苷酸、权利要求5或6的载体、权利要求7的宿主细胞、权利要求12的多肽和/或权利要求13的抗体以及一种或多种可药用的载体。

15.权利要求1到4任何一个的多核苷酸、权利要求5或6的载体、权利要求7的宿主细胞、权利要求12的多肽在生产用于治疗或预防与细胞死亡引起的组织损伤有关的病症的药物中的应用。

16.权利要求15的应用，其中所述细胞死亡由缺血、缺氧、细菌感染、病毒感染、自身免疫、外伤、化学诱导，或由辐射诱导。

17.权利要求15或16的应用，其中所述病症是急性或慢性神经变性/神经炎性病，是心脏、肺脏、肾脏、肝脏或胰脏的急性或慢性病，或该病症与器官或细胞移植相关。

18.权利要求17中的任何一种应用，其中所述急性神经变性和/或神经炎性病选自包括栓子阻塞和血栓性阻塞的脑缺血或梗塞、急性缺血后的再灌注、围产期缺氧-缺血伤害、心脏停搏、颅内出血、蛛网膜下腔出血和颅内损伤、脊髓损伤、脊柱内损伤、摇晃婴儿综合症、传染性脑炎、脑膜炎、头痛。

19.权利要求17中的任何一种应用，其中所述慢性神经变性和/或神经炎性病选自痴呆、Pick氏病、弥漫性莱维小体病、进行性核上性麻痹(Steel-Richardson综合症)、多发性硬化症、多系统萎缩症、与神经变性有关的慢性癫痫、运动神经元疾病、神经变性性运动失调、皮质基底节变性、ALS-帕金森氏痴呆症关岛复合症、亚急性硬化性全脑炎、亨廷顿舞蹈病、帕金森氏症、突触共核蛋白病、原发性进行性失语、纹状体黑质变性、Machado-Joseph病/3型脊髓小脑失调和橄榄脑桥小脑变性、多发性抽动一秽语综合征、球麻痹和假延髓病性麻痹、脊髓和延髓肌肉萎缩(Kennedy氏病)、原发性侧索硬化、家族性痉挛性截瘫、Werdnig-Hoffmann病、Kugelberg-Welander病、Tay-Sach氏病、Sandhoff病、家族性痉挛、痉挛性截瘫、进行性多病灶脑白质病、家族性自主神经机能异常(Riley-Day综合症)、多发性神经病、朊病毒病、上瘾、情感障碍、精神分裂症、慢性疲劳综合征、慢性疼痛。

20.权利要求15或16的应用，其中所述病症是衰老。

21.权利要求15到20任何一个的应用，其中药物在所述病症发作之前或之后给药。