CN101153274B - 提高利福霉素产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及控制细菌的双组份调节系统尤其是其中的amrE和/或amkE基因或与其高度同源的基因的方法来提高抗生素及其它有用的次生代谢产物的产量的方法。

Description

提高利福霉素产量的方法

技术领域

本发明涉及利用控制细菌的双组份调节系统尤其是其中的amrE和/或amkE基因或与其高度同源的基因的方法来提高抗生素及其它有用的次生代谢产物的产量的方法。具体而言，本发明涉及地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsismediterranei)，及使用该菌生产利福霉素的方法。

背景技术

双组份调节系统(two-component systems)是细菌细胞中的一种重要的信号传导调节系统，它由感应蛋白质(sensor kinase)和应答调节蛋白质(responseregulator)组成(Parkinson JS和Kofoid EC.Communication modules in bacterialsignaling proteins.Annu Rev Genet.1992；26：71-112)。细菌首先感受到外界信号的刺激，在ATP存在的情况下，感应蛋白质的组氨酸位点进行自磷酸化，然后再将组氨酸上的高能磷酸基团转移到应答调节蛋白的天冬氨酸残基上。磷酸化的应答调节蛋白质便起始或关闭其下游调控靶点基因的转录(Ann M.Stock，Victoria L.Robinson和Paul N.Goudreau.Two-component signal transduction.Annu.Rev.Biochem.2000；69：183-215)。与抗生素代谢相关的典型的双组份系统有afsQ1/afsQ2、cutR/cutS和absA1/absA2等。在变铅青链霉菌中，AfsQ1/afsQ2可以刺激生成放线菌紫红素和灵菌红素等(Ishizuka H，Horinouchi S，Kieser HM，Hopwood DA和Beppu T.A putative two-component regulatory system involved insecondary metabolism in Streptomyces spp.J Bacteriol.1992Dec；174(23)：7585-94)，而cutR/cutS双组分系统则负调控放线菌紫红素(Act)的产生(Chang HM，Chen MY，Shieh YT，Bibb MJ和Chen CW.The cutRS signaltransduction system of Streptomyces lividans represses the biosynthesis of thepolyketide antibiotic actinorhodin.Mol Microbiol，1996 Sept.；21(5)：1075-85)。absA1/absA2双组份系统通过调节抗生素专一调节基因的表达来影响天蓝色链霉菌抗生素的产生，参与了全局性调控，absA1或absA2基因的中断导致抗生素放线紫红素(Act)和灵菌红素(Red)的过早产生，因此absA1/absA2负调控抗生素的次生代谢(Brian P，Riggle PJ，Santos RA和Champness WC.Globalnegative regulation of Streptomyces coelicolor antibiotic synthesis mediated by anabsA-encoded putative signal transduction system.J Bacteriol.1996Jun；178(11)：3221-31)。

利福霉素是安莎类抗生素(Ansamycins)的一个亚群，可以特异性地抑制依赖于DNA的RNA聚合酶的活性，使病菌不能正常地合成RNA产物，从而达到抑菌目的，在临床上被广泛地用于治疗由分枝杆菌(Mycobacterium)、肺炎球菌(Pneumococcus)及其他革兰氏阳性菌引起的各种感染(Lal，R.和Lal，S.，Recent trends in rifamycin research.BioEssays 1994，16：211-216)。在我国目前重点防治的三类传染病中的两类：结核病以及由艾滋病引发的多种并发症的治疗中，利福霉素类药物都是一线用药。目前，工厂中主要生产利福霉素B或SV，然后再在此基础上合成利福平、利福喷丁等。

地中海拟无枝菌酸菌在工业上被用于生产利福霉素。地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)是一种革兰氏阳性菌。1957年，地中海拟无枝菌酸菌被从法国St.Raphael附近的土样中分离出来。最先，地中海拟无枝菌酸菌被鉴定为Streptomyces mediterranei(Margalith，P.，和G.Beretta.Rifomycin.XI.Taxonomic study on Streptomyces mediterranei nov.sp.Mycopathol.Mycol.Appl.1960，13：321-330)。后来，Thiemann等人根据细胞壁的化学成分将它重新命名为Nocardia mediterranei(J.E.Thiemann，G.Zucco和G.Pelizza.A proposal forthe transfer of Streptomyces mediterranei margalith and beretta 1960 tothe genus Nocardia as Nocardia mediterranea(margalith and beretta)Comb.Nov.Arch.Microbiol.1969，67：147-155)。到八十年代中期，Lwchevalier等人根据其细胞壁的组成缺乏分枝酸以及对Nocardia和Rhodococcus的噬菌体不敏感等特征又将其归为拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis)(Lechavalier，MP，Prauser，H.，Labeda，DP和Ruan，JS.Two new genera of Nocardioformactinomycetes：Amycolata gen.nov.and Amycolatopsis gen.nov.Int.J.Syst.Bacteriol 1986，36：29-37)。

地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)U-32是利福霉素SV的产生菌。倪榴英等(1984，利福霉素合成与谷氨酰胺合成酶活力的正相关性，微生物学报，24(3)：217～2231)对地中海拟无枝菌酸菌U-32合成利福霉素SV的代谢过程进行了深入的生理生化研究。

现阶段，主要利用物理或化学方法对工业生产菌株进行诱变，通过对诱变的菌株进行筛选来获得高产菌株。这些方法的工作量大，成本高，成功率低，而且得到的高产菌株往往不稳定，很容易发生回复突变。因此，通过新的方法来提高生产菌株的次生代谢物产量对于节约成本、增强产品的竞争力有着重要的意义。

发明内容

本发明一方面涉及一种制备抗生素或其它有用次生代谢物产量进一步提高的菌株的方法，该方法包括：对该菌株的原始菌株中的包含amrE和amkE基因或与其高度同源的基因的双组份调节系统进行操作，使所述amrE和/或amkE基因或与其高度同源的基因失活，得到突变的菌株，该突变菌株即为抗生素或其它有用次生代谢物产量进一步提高的菌株。

在一个优选实施例中，所述方法还包括步骤：培养所述突变菌株，测定其产生抗生素的能力，筛选出抗生素产量进一步提高的菌株。

在一个优选实施例中，所述菌株是选自地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsismediterranei)或具有相似代谢调控机制并包含amrE和/或amkE基因或与其高度同源的基因的双组份调节系统的微生物菌株。

在一个优选实施例中，将所述amrE和/或amkE基因或与其高度同源的基因敲除，得到突变的菌株。

在另一优选实施例中，所述抗生素是利福霉素。在更优选的实施例中，所述菌株是地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)，所述利福霉素是利福霉素SV。

本发明另一方面涉及一种采用本发明所述的方法制得的菌株，它选自地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)或具有相似代谢调控机制并包含amrE和/或amkE基因或与其高度同源的基因的双组份调节系统的微生物菌株，其中，该菌株包含一双组份调节系统，该调节系统中的amrE基因和/或amkE基因或与其高度同源的基因已失活。

在一优选实施例中，该菌株是地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsismediterranei)的菌株，其双组份调控系统中的amrE基因和/或amkE基因已失活。

本发明又一方面还涉及一种生产抗生素的方法，该方法包括：

(a)培养采用本发明方法获得的菌株；和

(b)从培养基中收集所述菌株产生的抗生素。

在一优选实施例中，所述抗生素是利福霉素。在更优选的实施例中，该利福霉素是利福霉素SV。

在另一优选实施例中，所述菌株为地中海拟无枝菌酸菌。

本发明还涉及一种DNA分子，它含有SEQ ID NO：1所示第456-1139位和/或第1178-2533位核苷酸序列，以及该DNA分子在制备抗生素产量进一步提高的菌株和提高抗生素产量当中的用途。

附图说明

图1显示点杂交从地中海拟无枝菌酸菌U-32中筛选阳性克隆子。图1A表示第一轮筛选U-32混合文库，得到编号为2、10、21和63四个阳性杂交点；图1B显示对第一轮筛选得到的第63号混合质粒进行第二轮筛选，得到编号为50的重组体克隆。图1B中“positive control”指阳性对照。

图2显示地中海拟无枝菌酸菌U-32总DNA和质粒pLR6350分别经SacI和BglII酶切与探针杂交后所得结果，左图为电泳后EB染色图片，右图为转膜后Southern杂交图片。其中，编号“1”为λDNA/HindIII标记物，编号“2”为pLR6350/SacI；编号“3”为U-32总DNA/SacI。

图3A和3B显示amrE和amkE基因核苷酸全序列和相应的氨基酸序列，其中下划线标注的是amrE基因和amkE基因可能的RBS位点。

图4A和4B显示AmrE和AmkE与同源蛋白氨基酸序列的比较。其中图4A中的比较序列分别来自：地中海拟无枝菌酸菌U-32(AmrE)、Streptomycescoelicolor(AfsQ1，BAA01502)、Mycobacterrium tuberculosis(MtrA，AAK47686)、大肠杆菌Escherichia coli(OmpR1，NP_417864)、Bacillus subtilis(Phop，CAA47908)。图4B中比较的序列分别来自：地中海拟无枝菌酸菌U-32(AmkE)、Stretomyces coelicolor(AfsQ2 BAA01503)、Mycobacterium tuberculosis(MtrB，AAB07807)、大肠杆菌(Envz，P0AEJ4)、Bacillus subtilis(PhoR，P23545)。

图5显示PCR验证amrE和amkE中断突变株所得结果，其中使用验证引物AmE-cf和AmE-ca扩增。

图6显示U32、U32-101和U32-107在种子硝酸盐培养基中发酵5天的利福霉素SV的产量。

图7显示U32、U32-101在发酵培养基中发酵5天的利福霉素SV的产量。

图8显示U32-109、U32-110在种子硝酸盐培养基中发酵5天的利福霉素SV的产量。

具体实施方式

本发明一方面涉及一种通过调控细菌菌株中的双组份调节系统来提高该菌株生产次生代谢物产物产量的方法，该方法包括破坏该菌株的双组份调节系统，使其失活，获得突变的菌株，利用该突变的菌株生产次生代谢物，实现产量的提高。

本发明尤其涉及通过调控地中海拟无枝菌酸菌的双组份调节系统来提高利福霉素的产量的方法。该双组份调节系统包含amrE和amkE基因，破坏其中任一基因或两者，所获得的菌株都能大大提高利福霉素的产量。

本发明还涉及通过控制具有相似代谢调控机制及包含所述amrE和amkE基因或与其高度同源的基因的微生物菌株的双组份调节系统来提高相关次生代谢物产量的方法。相似代谢调控机制指其调控次生代谢的机制与地中海拟无枝菌酸菌中amrE/amkE双组份调节系统的调控机制相同或相类似，因而可以通过失活其中一个基因或两个基因来提高次生代谢物的产量。

“高度同源”在本文中指其蛋白质序列与AmrE或AmkE蛋白质的序列相比，具有至少40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或以上的序列相同性，并且都应该含有保守的功能结构域。可采用本领域已知的工具和方法来测定序列相同性，例如，利用NCBI网站上的BLAST工具(例如，b12seq)进行两条蛋白质序列的比对。

amrE和amkE基因是本发明人在对地中海拟无枝菌酸菌的基因组DNA进行研究的过程中发现的两个基因。利用OmpR家族蛋白保守氨基酸序列设计得到简并PCR引物，以地中海拟无枝菌酸菌U-32总染色体DNA为模板，扩增得到一段390bp的DNA片段。以该DNA片段为探针，筛选U-32的基因文库，对获得的阳性克隆子进行酶切和Southern杂交分析，并测定了约3.2kb的片段。对测得的DNA序列进行分析的结果表明，序列中存在两个阅读框，本发明人分别将其命名为AmrE和AmkE(SEQ ID NO：1)。通过与已知蛋白进行同源比较，预测AmrE和AmkE的产物分别属于双组份调控蛋白系统中的应答调节蛋白和感应组氨酸激酶，并包含保守的氨基酸或氨基酸序列及一致的功能区。

分别对U32中amrE基因和amkE基因进行了基因阻断，使其失活，发现基因中断突变株的利福霉素SV的产量相对于野生型U32均有较大幅度的提高。进一步将此双组份在U32中进行了过量表达，发现过表达菌株的利福霉素SV的产量相对于转了空质粒的U32对照有大幅度的降低。由此推断amrE和amkE这对双组份调控系统在U32中负调控利福霉素SV的产生。

通过将AmrE蛋白质序列与GenBank数据比较发现，许多物种的微生物也含有同源性很高的调控蛋白，其中多为双组份中的应答调节蛋白，如ZP_00574191(氟兰克氏菌属，Frankia sp.EAN1pec)，NP_824658(除虫链霉菌，Streptomyces avermitilis MA-4680)，CAB89435(天蓝色链霉菌，Streptomycescoelicolor A3(2))，CAB90924(Streptomyces coelicolor A3(2))等等(序列数据来自GenBank)。根据序列的相似性可以推断：这些与ArmE有着高度同源性的应答调节蛋白也和微生物次生代谢的调控有着非常密切的关系。

同时，已知的研究结果表明许多微生物的次生代谢的调控是相似的。例如，焦瑞身等人发现在培养基中添加0.8％的KNO₃可以使力复霉素SV的产量提高1.7倍以上(焦瑞身，陈聿美，吴梦淦和顾薇玲，地中海诺卡氏菌(Nocardiamediterranei)合成力复霉素代谢调节的研究I.硝酸盐对地中海诺卡氏菌合成力复霉素SV的促进作用，植物生理学报，1979，5(4)：395-402)，之后又发现硝酸盐对林可霉素的生物合成也有很大的促进作用(焦瑞身等，硝酸盐、镁盐对林可霉素生物合成的促进作用，生物化学杂志，1997，13(6)：709-714)。此外，在利福霉素B(El-Tayeb，O.M.1，Salama，A.A.2，Hussein，M.M.M.2和El-Sedawy，H.F.Optimization of industrial production of rifamycin B byAmycolatopsis mediterranei.I.The role of colony morphology and nitrogen sourcesin productivity.African Journal of Biotechnology.2004，3(5)：266-272.)、列维杜霉素(周晓云和王慧中，列维杜霉素产生菌M814产生列维杜霉素的研究.浙江工业大学学报.1995，23(1)：68-72)、阿扎霉素B(江曙和黄为一，吸水链霉菌NND-52-C菌株产阿扎霉素B发酵条件的优化，生物加工过程，2004，2(1)：53-57)等抗生素的生物合成过程中，硝酸盐的添加也可以大幅度提高抗生素的产量。预计地中海拟无枝菌酸菌amrE/amkE这对双组份系统的调控方式在这些具有相似次生代谢调控机制的微生物中也是保守的。

因此，对于和地中海拟无枝菌酸菌有着相同或相似的次生代谢调控机制及包含与amrE/amkE双组份高度同源的基因的微生物，可通过中断与amrE和/或amkE同源的基因来提高菌体次生代谢物的产量。

在本发明中，“失活”，包括将基因完全敲除而使得该基因完全不具备活性，也包括对该基因进行突变，从而使得该基因活性与原始菌株或未发生突变时相比下降至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多。突变可以是使该基因缺失、突变或插入一些核苷酸，例如缺失95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或其间任意比例的核苷酸，使得该基因活性下降至少30％以上；而突变则包括使该基因中的部分核苷酸(如1-100个、1-50个、1-20个等等)发生突变，从而使得其活性下降30％或更多；插入则包括插入1-100个或更多、1-50个、1-20个等核苷酸，同时使得该突变基因活性下降30％或更多。当然，上述突变并不局限于所列出的内容，可采用本领域已知的其它方法来使所述基因失活。

本发明所用“原始菌株”指其包含amrE和/或amkE基因或与其高度同源的基因的双组份调节系统未被操作，所述amrE和/或amkE基因或与其高度同源的基因未失活的菌株，它可以是天然的菌株，也可以是目前工业或实验室中使用的菌株。

可采用本领域现有技术已知的方法将相关基因敲除或使其发生突变。例如，可利用DNA同源重组的方法，构建相关基因中断载体，将目的基因敲除(丁晓明等，利用同源重组建立地中海拟无枝菌酸菌U32染色体的基因置换/中断系统，生物工程学报，2002，18(4)：431-437)。

也可采用本领域现有技术已知的方法来判断突变的基因是否失活，例如用Southern杂交或用PCR扩增的方法来检验目的基因是否突变；利用检测突变株的表型变化(如，利福霉素SV的产量变化)的方法或通过相关生理生化实验来判断突变的基因是否失活。

本领域技术人员可采用现有技术公开的知识筛选失活菌株。例如在构建中断载体的时候引入抗性基因，用中断载体中断相关基因。利用含有抗性的培养基来筛选基因失活菌株，并用上述验证基因失活的方法对所筛选的菌株进行验证。测定菌株生产抗生素的能力的方法也是本领域周知的，例如，对利复霉素SV的测定，可以用抑菌圈实验法测定生物效价(焦瑞身、陈聿美、吴梦淦、顾薇玲，地中海诺卡氏菌(Nocardia mediterranei)合成力复霉素代谢调节的研究I.硝酸盐对地中海诺卡氏菌合成力复霉素SV的促进作用，植物生理学报，1979，5(4)：395-402)或采用文献(Wang W，Zhang W，Chen H，Chiao J，Zhao G，JiangW.Molecular and biochemical characterization of a novel two-component signaltransduction system，amrA-amkA，involved in rifamycin SV production inAmycolatopsis mediterranei U32.Arch.Microbiol 2002，178：376-386)所述的方法测定其化学效价。

本发明另一方面还涉及一种新颖的菌株，该菌株含有一双组份调节系统，该调节系统中的一个或两个基因已失活，其中，该基因为amrE基因、amkE基因或与其高度同源的基因。该菌株可以是选自地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)或具有相似代谢调控机制及包含amrE和amkE基因或与其高度同源的基因的双组份调节系统的微生物菌株。本发明另一方面还涉及提高次生代谢物产量的方法，该方法包括培养本发明的菌株，然后从培养基中收集所产生的次生代谢物。次生代谢物可以是抗生素等，优选是利福霉素。

可在本领域常规使用的条件下培养本发明的菌株。例如，地中海拟无枝杆菌酸可在26℃-30℃用本氏固体或液体培养基培养(Wang W，Zhang W，ChenH，Chiao J，Zhao G，Jiang W.Molecular and biochemical characterization of anovel two-component signal transduction system，amrA-amkA，involved inrifamycin SV production in Amycolatopsis mediterranei U32.Arch.Microbiol2002，178：376-386)。地中海拟无枝菌酸菌发酵的方法参照文献(焦瑞身、陈聿美、吴梦淦、顾薇玲，地中海诺卡氏菌(Nocardia mediterranei)合成力复霉素代谢调节的研究I.硝酸盐对地中海诺卡氏菌合成力复霉素SV的促进作用，植物生理学报，1979，5(4)：395-402)。收集的方法也是本领域所周知的，例如用滤纸过滤发酵液收集发酵产物。

本发明还涉及一种含有所述amrE基因和/或amkE基因或与其高度同源的基因的DNA序列。所述高度同源指同源基因在蛋白质水平上应该含有保守的功能结构域，并且还应具有至少40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或以上的序列相同性。以下将以实施例的方式阐述本发明。应理解，本发明不仅仅限于以下具体实施例。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。在本发明中，涉及DNA的操作可参考《分子克隆实验指南》(第三版)；涉及染色体总DNA的提取可参考文献(D.A.Hopwood，M.J.Bibb，K.F.Chater et al.Genetic Manipulationof Srteptomyces.A Laboratory Manual.England：John Innes Foundation Press，1985.)；地中海拟无枝菌酸菌U-32基因组cosmid文库用cosmid载体pLAFR3(Staskawicz B，Dahlbeck D，Keen N，Napoli C(1987)Molecular characterizationof cloned avirulence genes from race 0and race 1 of Pseudomonas syringae pv.Glycinea.J Bacteriol 169：5789-5794)构建，其构建过程参见文献(Zhang W，LiL，Jiang W，Zhao G，Yang Y，Chiao J(2000).A novel transmembraneserine/threonine protein kinase gene from a rifamycin SV-producing Amycolatopsismediterranei U32.Eur J Biochem 267：3744-3752)。DNA的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试；发酵的方法可参见文献(焦瑞身、陈聿美、吴梦淦、顾薇玲，地中海诺卡氏菌(Nocardia mediterranei)合成力复霉素代谢调节的研究I.硝酸盐对地中海诺卡氏菌合成力复霉素SV的促进作用，植物生理学报，1979，5(4)：395-402)；而利福霉素SV化学效价的测定方法可参见文献(Wang W，Zhang W，Chen H，Chiao J，Zhao G，Jiang W.Molecularand biochemical characterization of a novel two-component signal transductionsystem，amrA-amkA，involved in rifamycin SV production in Amycolatopsismediterranei U32.Arch.Microbiol 2002，178：376-386)。

在实验中使用到的地中海拟无枝菌酸菌U32为植物生理生态研究所分子微生物实验室保藏(李果龙、杨蕴刘、焦瑞身，地中海拟无枝菌酸菌U-32硝酸还原酶的基因克隆，生物工程学报，1994，10(3)：200-205；和Zhang W，YangL，Jiang W，Zhao G，Yang Y，Chiao J.Molecular analysis and heterologousexpression of the gene encoding methylmalonyl-coenzyme A mutase fromrifamycin SV-producing strain Amycolatopsis mediterranei U32.Appl BiochemBiotechnol.1999Dec；82(3)：209-25)。地中海拟无枝菌酸菌U32的培养用本氏培养基(Wang W，Zhang W，Chen H，Chiao J，Zhao G，Jiang W.Molecular andbiochemical characterization of a novel two-component signal transduction system，amrA-amkA，involved in rifamycin SV production in Amycolatopsis mediterraneiU32.Arch.Microbiol 2002，178：376-386)、大肠杆菌培养用LB培养基。地中海拟无枝菌酸菌发酵所用的种子培养基、发酵培养基的配方见(焦瑞身、陈聿美、吴梦淦、顾薇玲，地中海诺卡氏菌(Nocardia mediterranei)合成力复霉素代谢调节的研究I.硝酸盐对地中海诺卡氏菌合成力复霉素SV的促进作用，植物生理学报，1979，5(4)：395-402)；种子硝酸盐培养基是在种子培养基中添加KNO₃至终浓度为0.8％。培养基中所添加抗生素的终浓度为：氨苄青霉素100μg/ml，卡那霉素50μg/ml，阿伯拉(aparamycin)30μg/ml，红霉素200μg/ml。

实验中使用到的限制性内切酶、T4DNA连接酶、RNase A、Taq酶、Klenow酶、1kb DNA ladder为MBI公司产品，高保真DNA聚合酶KOD-plus为ToYoBo公司产品，[a-32P]-dCTP为北京亚辉生物公司产品，尼龙膜(Hybond N+)为Amersham公司产品。

实施例1：克隆双组份系统所需DNA探针的制备

在目前已知的应答调节蛋白质中，OmpR(大肠杆菌DNA结合蛋白)是研究很深入的细菌调控蛋白(Parkinson JS和Kofoid EC.Communication modules inbacterial signaling proteins.Annu Rev Genet.1992；26：71-112)，通过X-射线晶体衍射得到的三维结构表明，它的C-末端具有非常典型的α-螺旋-环-α-螺旋的DNA结合区域。OmpR类蛋白通过与基因的启动子区的结合，增强RNA聚合酶的转录功能，从而达到调控相应基因转录的作用。根据OmpR类家族蛋白的保守性氨基酸序列(近N端为GLEVGADD，近C端为TVRGVGY)(Wray LVJr，Fisher SH.The Streptomyces coelicolor glnR gene encodes a protein similar toother bacterial response regulators.Gene.1993Aug 16；130(1)：145-50)，设计并合成了两条PCR引物：AmE-DPN(SEQ ID NO：3)和AmE-DPC(SEQ ID NO：4)。以地中海拟无枝菌酸菌U-32的总DNA为模板扩增得到的约400bp DNA产物与pGEM-T载体(Promega)连接。测序结果(SEQ ID NO：2)表明，克隆得到的DNA序列编码的氨基酸序列与OmpR家族蛋白具有较高的同源性，包含OmpR家族蛋白C端的HLH DNA结合区，以及几段保守的氨基酸序列，证明该DNA片段可以作为在地中海拟无枝菌酸菌U-32中筛选应答调节蛋白的探针。

实施例2：从地中海拟无枝菌酸菌U-32基因组文库中筛选amrE和amkE基因

由于大肠杆菌DH5α(Gibco-BRL)中存在OmpR类蛋白基因，使用细菌菌落原位杂交难以筛到正确的阳性克隆，所以采用斑点DNA杂交方法来筛选。将46-50个菌落分为一组提取混合质粒，共提取了80组混合质粒(相当于3800个重组质粒)。利用96孔斑点杂交加样器，将变性后的混合质粒点到尼龙膜上，然后与实施例1制得的DNA探针杂交。选择严格的洗膜条件，结果在膜上得到4个阳性杂交点，编号分别为2、20、21、63(见图1A)，提取相对于63号的50个菌落的质粒，进行第二轮杂交筛选，得到编号为50的重组体克隆(见图1B)，其重组质粒命名为pLR6350。进一步的DNA分子杂交表明，经相同的限制性内切酶切后的pLR6350与U-32的染色体总DNA有相同的杂交带，证明pLR6350中的外源片段确实来源于U-32(见图2)。

实施例3：地中海拟无枝菌酸菌U-32 amrE和amkE基因序列测序及分析

质粒pLR6350分别用BglII，StuI，SacI，PstI，XhoI酶进行酶切、电泳、Southern转移，与实施例1制得的DNA探针进行杂交，结果表明BglII，StuI，SacI，PstI，XhoI酶切分别产生2.5kb，12kb，2.0kb，1.2kb和4.6kb的单一杂交带。分别将2.5kb的BglII酶切片段和2.0kb的PstI酶切片段克隆到pBlueScriptII KS载体(Stratagene)的BamHI和PstI位点，得到质粒pKS2.5B和pKS2.0P。对质粒pKS2.5B和pKS2.0P进行测序共得到3238bp的DNA序列(见图3)。

序列分析表明，在已经测序的3.2kb的DNA片断上，存在两个紧密连锁的完整阅读框架(ORF)。ORF1从第456位的ATG起始，终止于第1139位的TGA，全长684bp，编码一个228个氨基酸的蛋白质(AmrE)，(G+C)百分含量为73.3％，符合放线菌DNA的G+C百分含量较高的特点，密码子第三位碱基为G或C的含量为92％，符合放线菌基因的密码子偏好性特点。在447～451bp处，存在一个可能的核糖体结合位点(RBS)：GGAGC。蛋白质序列与GenBank数据比较结果表明，它与双组份调控系统中典型的应答调节蛋白有很高的相似性。AmrE中Asp-14、Asp-57和Lys-107在其他同类蛋白中也是高度保守的，其中Asp-57是磷酸化位点。在AmrE蛋白的C末端，具有典型的DNA结合区域(HLH)(见图4A)。

ORF2从第1178位的GTG起始，终止于2533位的TGA，全长1356bp，编码一个452个氨基酸的蛋白质(AmkE)，(G+C)百分含量为75.9％，符合放线菌DNA的G+C百分含量较高的特点，密码子第三位碱基为G或C的含量为94.2％，符合放线菌基因密码子偏好性特点。在1167～1171bp处，存在一个可能的RBS位点：GGATC。蛋白质序列与GenBank数据比较结果表明，它与双组份调控系统中典型的组氨酸蛋白质激酶有很高的相似性。一级结构预测表明，AmkE的N-末端同源性比较差，而其C-末端与许多组氨酸蛋白质激酶一样，具有十分保守的几个结构域(见图4B)：H、N、G1、F和G2区，其中H区含有组氨酸残基，是自我磷酸化位点；G1和G2区富含甘氨酸残基，是核苷酸结合区域。AmkE的N-末端有两个典型的疏水区，可能是跨膜区。

实施例4：对U-32amrE和amkE双组份基因功能的研究

对U-32中amrE基因和amkE基因的中断

为了进一步研究amrE和amkE这对双组份基因在地中海拟无枝菌酸菌U-32中的功能，我们用同源重组的方法分别对amrE和amkE进行了基因中断。

以U32总染色体为模板，以AmE-bf(SEQ ID NO：5)、AmE-ba(SEQ IDNO：6)为引物，用高保真DNA聚合酶KOD-plus(ToyoBo)扩增得到约2.9kb的DNA片段。将得到的片段克隆到pMD18-T(TakaRa)的EcoRV位点，得到质粒pAmr-1。将质粒pAmr-1用XhoI酶切并用Klenow酶补平，再与从质粒pBCAm(丁晓明等，利用同源重组建立地中海拟无枝菌酸菌U32染色体的基因置换/中断系统.生物工程学报，2002，18(4)：431-437)上用SmaI酶切下含有阿伯拉抗性基因的1.5kb DNA片段相连接，得到amkE基因的中断质粒pAmr-2。将质粒pAmr-1用BglII酶切，再与从质粒pBCAm上用BamHI酶切下含有阿伯拉抗性基因的1.5kb DNA片段相连接，得到amrE基因的中断质粒pAmr-3。

按照文献(丁晓明等，利用同源重组建立地中海拟无枝菌酸菌U32染色体的基因置换/中断系统，生物工程学报，2002，18(4)：431-437)中所描述方法制备U32菌体的电击感受态。将amkE基因的中断质粒pAmr-2于沸水中加热10分钟充分变性后立即插在冰上，然后电击转化U32感受态，并于本氏添加阿伯拉抗性的平板上筛选转化子。在28℃下，经过4-5天的培养，平板上将长出amkE基因中断的突变株。用amrE基因的中断质粒pAmr-3中断amrE基因的方法与中断amkE的方法相同。

在用来构建中断载体的2.9kb DNA片断外面设计一对验证引物AmE-cf(SEQ ID NO：7)和AmE-ca(SEQ ID NO：8)，对可能的突变株进行PCR验证，并将U32菌株作为负对照一同进行PCR扩增。

验证的结果表明amrE和amkE的突变株均可以扩增出一条约4.5kb的条带，而对照U32扩增出了一条约3.0kb的条带(见图5)，证明了amrE基因和amkE基因分别得到了成功的中断，得到了地中海拟无枝菌酸菌U-32amrE突变株U32-101及地中海拟无枝菌酸菌U-32amkE突变株U32-107。

用地中海拟无枝菌酸菌U32作为对照，以藤黄八叠球菌(Sarcina lutea)为指示菌做了抑菌圈实验。结果发现无论是在本氏培养基上，还是在本氏添加0.8％KNO₃的培养基上，amrE突变株(U32-101)与amkE突变株(U32-107)的抑菌圈直径均比对照U32大出许多，而U32-101与U32-107两株菌的抑菌直径差不多。

选择amrE突变株(U32-101)与amkE突变株(U32-107)，使用种子硝酸盐培养基进行了发酵实验。经过5天的发酵，U32-101的利福霉素SV的产量为368±61，U32-107的利福霉素SV的产量为302±67，对照U32的利福霉素SV的产量为132±23(见图6)。发酵的结果显示，U32-101和U32-107的利福霉素SV的产量相对于对照U32均有大幅度的增加，其中U32-101的利福霉素SV的产量稍高。

选择U32与U32-101进一步用发酵培养基发酵，经过5天的发酵，U32的利福霉素SV的产量为1424±187，U32-101的利福霉素SV的产量为2062±250(见图7)。

amrE和amkE双组份系统在U32中过量表达

质粒pULVK2A(Kumar CV，Coque JJ，Martin JF.Efficient Transformationof the Cephamycin C Producer Nocardia lactamdurans and Development of Shuttleand Promoter-Probe Cloning Vectors.Appl Environ Microbiol.1994Nov；60(11)：4086-4093)是常用的能够在U32中复制并稳定存在的质粒。在pULVK2A质粒的基础上构建了含有红霉素抗性基因的pDXM4质粒。以U32总染色体为模板，以AmE-bf与AmE-ba为引物，用高保真KOD-plus DNA聚合酶扩增出含有完整的amrE和amkE基因及其启动子区域的DNA片段。将此2.9kb的DNA片段克隆到pDXM4质粒载体的EcoRV位点，得到过量表达载体pVK2.9AmE。

使用地中海拟无枝菌酸菌U32制作电击感受态。分别将pDXM4、pVK2.9AmE转化U32感受态，在28℃培养，于本氏添加红霉素的平板上筛选转化子。经过7天左右的培养，平板上可以看到转化子。抽提转化子中的质粒并验证，把正确的转化子分别命名为U32-109和U32-110。

对U32-109和U32-110进行发酵，方法同前，除了在培养基中添加红霉素。经过5天的发酵，在种子硝酸盐培养基中，U32-109的利福霉素SV的产量为257±39，U32-110的利福霉素SV的产量为15±10(见图8)。由于添加了红霉素的原因，在实验的条件下，U32-109与U32-110在发酵培养基中均不能检测到利福霉素SV的产生。

amrE基因中断的突变株U32-101的利福霉素SV的产量相对U32有较大幅度的提高。当在U32中过量表达amrE和amkE双组份系统时，过表达菌株U32-110的利福霉素SV的产量相对于对照菌株U32-109有较大幅度的降低。从基因中断和过表达两方面的数据可以得出结论：amrE和amkE双组份基因负调控地中海拟无枝菌酸菌U-32产生利福霉素SV。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>提高利福霉素产量的方法

<130>065775

<160>8

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>3238

<212>DNA

<213>地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)

<400>1

ctgcagaagc ggatcaacgg cggccccgag gtcgccggtt cggtcgccaa cctcaaggcg      60

cgggcccagg accagcgcgc cgccgggcac gaggaccgcg cgaagaagct cgacgaccgc     120

gccaccaagc gccagggcaa gctcggcgag ctgaacacgg ccaagcagaa gctcgacgcg     180

ttcgcgtccg cgcactgcaa gccggccaag tgaggggcgc gagggtcgcg gcggcggtcg     240

gggccgccgc ggtcatcgcg ctcggctgct cggcgtgccg cgacaacctg atgggttcgc     300

cctccgggga cgcgcccgcg ccgtcgtcgg tgtcgtcgtc ggagctgagc gggatcgagt     360

cgacactgaa cggcatcgag tcggacatga acagcgatgg ctcgccctga ccggctagcg     420

tctcccctct gaacacggcg gagacgggag caggcatggg gtcaccgggg cgcggtctcg     480

tcctcgtggt cgaggacgag gccgcgatcg ccgagctggc ggcgctctac ctcaagcgtg     540

acggcttcgg tgtgcacgtc gaggccgacg gcggccgggc cctggacgcc gtccggcgcc     600

tcaagccggt ggcgatcgtg ctcgacatcg gactgtccgg aatggacggc atcgagatct     660

gcaaggcgtt gcgcgcggcc ggggactgga cgccggtgct gttcgtcacc gcccgcgacg     720

acgagctcga ccggctgctg ggcctggaga tcggcgcgga cgactacctc accaagccgt     780

tcagcccgcg cgagctggcg gctcgggtcc ggacggtgct gcgccgggcc gccggggtgg     840

cgccggccgc ggagacgttc gccgtgggcg gcgcgcgcgt cgacgtgctt tcccggcggg     900

cgtgggcggg tgacgccgag atagtgctga cgtccacgga gttcgacctc ctcacgcacc     960

tgctccggca cccggggcag gtgctttcgc gcgaccagct gctgagtgcc gtgtggggct    1020

acgccgcggc ggcgggcacg cgcacggtgg acgtccacgt ggctcagctg cgcgcgaaac    1080

tcggcgcgtc gagtccgatt cggacggtgc ggggcatcgg gtacgcggcg gatccgtcgt    1140

gaagttccgg gggacgctgg ccgggcggat cacgctggtg tgcctggccg tcgcgggcat    1200

cgcggtgatc gtggcggggc tggtcgcctc ccggctgatc cggaccacgg cggacaacgt    1260

gctgcagtcg acgctggccg cgcaggccga cgtcgtcgcg tcgcaattgg acgaaacggg    1320

catcggcaac cggctgggcg tcggcaaggt ggccgacgtg gtgcgcggcc agggcatctc    1380

ggtggtggtc cgccgcgcag gcgggcaggc gctcggggac ggcgtcgcgg tccaggccgc    1440

cgggaagctc gggctggacc gcaaccactc ggggcgcgtc acggtggcgg ggtcgcagta    1500

cctggtcgag acgcgggtgg tgggcgcacg cggagcggcg ttcgcgctgg tcctgcccgc    1560

gcgcaacgca caagcgacgc aacgggcact ggtgcgcaac atcttgctgg cgctcgggat    1620

cgggctgctg gtggcggccc tggcgggctt cgtctcgggc cggctgctgg gccgtccgct    1680

gcgccgggcc gcgctggccg cgggatcgct gcgggcggga cgtcgcgacg tgcgggtgcc    1740

ggtgcagggg ccccgcgagg tggcggaggt ggccgggtcg ctgaactcgc tggccgacgc    1800

gctggccgtc agcgaggcgc ggcagcggga gttcctgctg tcggtgtcgc acgagctgcg    1860

gacgccgctg accgccgtga cgggcttcgc cgaggcgatc gcggacggcg tcgccacggg    1920

gccggacgcc gtccgggccg ggcagacgat ccagcgcgag gcggtgcggc tcgagcggct    1980

ggtcacggac ctgctggagc tggcccgcct gggcgcggac gagttccggc tggacatcgc    2040

ggtgctggac ctggctgcgt tggtccgcga ctgtgcggag gtgtggcagc tgcggtgcgg    2100

ccgggaggac gtccggctct cggtttcggc tcctgccggg ccggttccgg tgctggcgga    2160

cgcgcggcgg ctgcaccagg tggtcgacgg cttggcggag aacgccctgc gcgtcacgcc    2220

cgcgggggcc ccgatggtgt tctcgctgtc ggtgtccgat tcggcggctt cgctggcggt    2280

ccgcgacggc ggcccgggcc tggcgccgga ggactacccg gtggcgttcg agcgaggggt    2340

cctgaacgcc cgctaccgcg accgccgtcc ggtcggctcg ggcatcggcc tggccctggt    2400

ccacgccctg gtcacccgga tgggcgggac attgacggcc ggcccggccc ccgaaggcgg    2460

cgcggcgttc acgatcacgt tcccgctggc cgcgtcgacg gccacggtcc cgccccccgc    2520

cgctgacctg ggctgacgac cgccggcgag ctgaaccggc gatctcgcac ggccgaccgc    2580

accggcgtcc acggccactc gtccgtaact tggtgtcccc gatccgcgac agaaacgctg    2640

gagtgatgcg tttcaaccct gcgatggtgt tcaaggtcga cagcatccgg cgaaccgaat    2700

ttccatgcac gaacggtgtg acgggagtgc ggaatcgatg gcggaacgag gacggcacga    2760

cgactcggag aatgcgggtt tcgagcggga cagcgacctg gtccgggcct acgaacgagg    2820

aacgtcgatc ggcgaactcg ccgagcggac cggcttgagc tacacgtgga tgcgcagacg    2880

gttgatcaac gccggggcgg agctccggcc ccggccggtc gcgaaggcct gcccggtgcc    2940

gatcgagcag ctggcggacg agtaccgcgc cggcgccagc attctccagc tcgccaagac    3000

gcacggcctc tactacaaac gggtccgcga actgctgctc gatcacgaag tgccattgcg    3060

cccctcgact cgcgccatac ccgaaacctg actcgattgt ggcccaggtc accgattttt    3120

ttcctcctgt gcagttgcac gggagtgttc gtgctttcga gtggaaattc ccgtgctcat  3180

cgcggagcga gcccgatcgg ccggtagaca gagaagttcg ggacttgcgg gggagatc    3238

<210>2

<211>382

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>探针序列

<400>2

gcctggagat cggcgcggac gactacctca ccaagccgtt cagcccgcgc gagctggcgg     60

ctcgggtccg gacggtgctg cgccgggccg ccggggtggc gccggccgcg gagacgttcg    120

ccgtgggcgg cgcgcgcgtc gacgtgcttt cccggcgggc gtgggcgggt gacgccgaga    180

tagtgctgac gtccacggag ttcgaccttc tcacgcacct gctccggcac ccggggcagg    240

tgctttcgcg cgaccagctg ctgagtgccg tgtggggcta cgccgcggcg gcgggcacgc    300

gcacggtgga cgtccacgtg gctcagctgc gcgcgaaact cggcgcgtcg agtccgattc    360

ggacggtgcg gggcatcggg ta                                             382

<210>3

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

aagaattcga ggtgggcgcs gacgac                                         26

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

atctagagta gccgacgccs cgcac    25

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>5

tgaacacggc caagcaga            18

<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>6

gccacaatcg agtcaggt            18

<210>7

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>7

tgcagaagcg gatcaacg            18

<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>8

tgcaactgca caggagga            18

Claims (8)

1.一种制备利福霉素产量进一步提高的地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)菌株的方法，该方法包括：

对所述菌株中的amrE或amkE基因进行操作，使所述基因失活，得到突变的菌株，该突变菌株即为利福霉素产量进一步提高的菌株；

其中，所述amrE基因如SEQ ID NO：1的第456-1139位所示，所述amkE基因如SEQ ID NO：1的1178-2533位所示。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：培养所述突变菌株，测定其产生抗生素的能力，筛选出利福霉素产量进一步提高的菌株。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述amrE或amkE基因敲除，得到突变的菌株。

4.一种采用权利要求1所述的方法制得的地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)菌株，其特征在于，所述菌株的amrE或amkE基因已失活，所述amrE基因如SEQ ID NO：1的第456-1139位所示，所述amkE基因如SEQ ID NO：1的1178-2533位所示。

5.如权利要求4所述的菌株，其特征在于，所述菌株是地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsis mediterranei)U-32。

6.一种生产利福霉素的方法，其特征在于，所述方法包括：

(a)培养权利要求4所述的菌株；和

(b)从培养物中收集所述菌株产生的利福霉素。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述菌株为地中海拟无枝菌酸菌U-32。

8.一种DNA分子，选自：SEQ ID NO：1所示第456-1139位或第1178-2533位核苷酸序列。

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