CN101157897B - 一种具有大豆MnSOD基因的粟酒裂殖酵母工程菌及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有大豆MnSOD基因的粟酒裂殖酵母工程菌及其构建方法，包括一种表达锰超氧化物歧化酶基因MnSOD的专用载体pESPUC和该重组质粒在粟酒裂殖酵母中不同时间段的表达情况。本发明克隆了大豆MnSOD基因，构建重组粟酒裂殖酵母表达载体pESPUC-MnSOD，将重组质粒采用醋酸锂转化法及电击转化法导入到粟酒裂殖酵母菌中，使其得以表达，本发明得到锰超氧化物歧化酶MnSOD基因在粟酒裂殖酵母中表达的最佳条件，同时将酵母培养用于工业化生产，具有原料便宜，生长周期短，生产规模大，提取成本低的优点，两者结合起来具有重要的工业应用前景和实际意义。

Description

一种具有大豆MnSOD基因的粟酒裂殖酵母工程菌及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种具有大豆MnSOD基因的粟酒裂殖酵母工程菌及其构建方法

背景技术

对SOD的研究起始于1938年。1938年英国T.mann和D.keilin最早从牛血液中分离出含铜的兰绿色蛋白，当时称血铜蛋白。1953年从马肝中分离出类似蛋白称肝铜蛋白，后来又从脑中分离出这种蛋白称脑铜蛋白。

1969年Mccord和Fridovich发现该蛋白有催化O₂，发生歧化反应的功能，故将此酶命名为超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD，EC1.15.1.1)。

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是生物体防御氧化损伤的一种十分重要的生物酶，能够催化超氧阴离子(O^2-)发生歧化反应，从而专一的清除生物体内的超氧阴离子，平衡机体的氧自由基，较好地抵御氧自由基和其他氧化物自由基对细胞质膜的毒性。

在高等植物中，SOD根据其辅基部位结合的不同金属离子分为三类：MnSOD、FeSOD、CuZnSOD。在植物中CuZnSOD是三种超氧化物歧化酶中含量最丰富的一类，主要存在于叶绿体、胞质和过氧化物酶体中。MnSOD和FeSOD每个亚基都只含有一个金属离子，MnSOD主要存在于线粒体中，而FeSOD存在于叶绿体中。

MnSOD的催化活性不受其产物H₂O₂的抑制。线粒体是真核生物细胞进行有氧呼吸的主要场所，通过其内膜的电子传递链实现能量转换的功能；当生物处于胁迫或病变条件下，线粒体内膜电子传递受阻，将导致活性氧过量产生，对线粒体乃致整个细胞造成伤害。因此MnSOD是细胞线粒体内消除超氧阴离子、保护线粒体不受活性氧伤害的关键酶。

MnSOD是人体内除CuZnSOD之外的另一种SOD，与CuZnSOD相比具有寿命长、分子量小等优点，而且锰的毒性较之铜铁为低，其小分子配合物作为模拟MnSOD安全性好。因而近年来有关MnSOD的研究非常活跃。

在SOD家族中MnSOD的特点是:生物半衰期较长，抗炎抗辐射作用优于CuZnSOD，这表明MnSOD作为酶制剂具有十分重要的医用价值和潜在的临床应用前景。

由于MnSOD仅存于线粒体中，含量甚微，用传统的生物化学方法难以从天然组织中分离纯化较大量的MnSOD蛋白，因此采用分子克隆的方法获得MnSOD的基因序列，并通过转基因的方法使MnSOD基因在酵母中大量表达是深入研究其功能的重要途径。

酵母菌是单细胞真核生物，具有生长快，易于遗传操作、能对外源蛋白进行翻译后加工和修饰、不产生有毒产物等特点，被认为是表达外源蛋白的合适宿主。

裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)细胞椭圆形、圆柱形，由营养细胞接合，形成子囊。有发酵能力，代表种为粟酒裂殖酵母，最早分离自非洲粟米酒，能使菊芋发酵产生酒精。粟酒裂殖酵母(fission yeast或Schizosaccharomyces pombe)是一种简单的单细胞生物，其基因组为14Mb，大约是大肠杆菌基因组的4倍。该酵母区别于同属于子囊真菌的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，许多研究表明两种酵母在系统分类、细胞周期、rRNA的生物合成和基因的组织、结构及基因的表达调控等方面并不相同，在某些方面裂殖酵母与高等动物却有一定的相似性，因此，裂殖酵母也是一种良好的研究真核生物的模式生物。

发明内容

本发明提供一种具有大豆MnSOD基因的粟酒裂殖酵母工程菌及其构建方法。

本发明采取的技术方案是：将构建的含有大豆MnSOD基因的重组粟酒裂殖酵母表达载体导入粟酒裂殖酵母中得到的。

本发明将MnSOD基因插入到粟酒裂殖酵母表达载体的多克隆位点处，将构建的该重组粟酒裂殖酵母表达载体pESPUC-MnSOD导入粟酒裂殖酵母中，获得重组粟酒裂殖酵母转化子，培养重组粟酒裂殖酵母使MnSOD基因得到表达。

本发明重组粟酒裂殖酵母表达载体pESPUC-MnSOD，该载体含有Pnmt1启动子、Pnmtl终止子序列，抗性基因为氨苄青霉素，选择标记基因LEU，大豆MnSOD基因位于多克隆酶切位点SalI和BamHI之间。

本发明大豆MnSOD基因分别为SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3所述。

本发明酵母转化方法是醋酸锂转化法及电击转化法。

本发明中IPTG能诱导MnSOD基因在粟酒裂殖酵母中大量表达。

本发明公布了诱导物IPTG对MnSOD蛋白在粟酒裂殖酵母中的表达的影响，IPTG诱导酵母表达，在培养48小时MnSOD蛋白表达量最高，并且表达量要高于未加IPTG培养96小时蛋白的表达量。从而可知IPTG可以诱导MnSOD基因在粟酒裂殖酵母中的大量表达。

本发明比较了不同长度MnSOD基因在粟酒裂殖酵母中的表达情况，得到了开放阅读框序列构建的表达载体在酵母中表达量及活性最大。

本发明所提供的一种含有锰超氧化物歧化酶的粟酒裂殖酵母表达载体的构建方法。同时将不同长度MnSOD基因在粟酒裂殖酵母中的表达。弥补了传统锰超氧化物歧化酶制备方法以及原核表达系统、酿酒酵母和毕赤酵母表达系统的不足。此外，若将发明应用于工业化锰超氧化物歧化酶的生产，则具有生产规模大，锰超氧化物歧化酶活性高，产酶能力强，生长周期短，提取成本低的优点，具有重要的实际意义和广阔的开发前景。

附图说明

图1为粟酒裂殖酵母表达载体pESPUC图谱。

图2为重组粟酒裂殖酵母表达载体pESPUC-MnSOD构建图。

图3为重组粟酒裂殖酵母表达载体pESPUC-MnSOD酶切鉴定图。

图4为重组粟酒裂殖酵母表达载体pESPUC-MnSOD PCR鉴定图。

图5为重组粟酒裂殖酵母转化子。

图6为重组粟酒裂殖酵母转化子PCR鉴定图。

图7为重组粟酒裂殖酵母转化子酶切鉴定图。

图8为含有MnSOD基因的重组质粒在粟酒裂殖酵母中的表达(SDS-PAGE)(48h-96h)。

图9为含有MnSOD基因的重组质粒在粟酒裂殖酵母中的表达(Native-PAGE)(0h-96h)。

图10为同一培养时间，MnSOD不同长度片段在粟酒裂殖酵母中的表达量比较

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法

实施例1、含有三种不同片段长度的MnSOD的载体的构建

目的基因:MnSOD(来源于黑豆)，大豆MnSOD基因分别为全长序列SEQ ID NO.1，开放阅读框序列SEQ ID NO.2，成熟肽序列SEQ ID NO.3所述。

构建含有超氧化物歧化酶基因的粟酒裂殖酵母载体pESPUC-MnSOD的过程如图2所示，具体步骤如下：

1)本实验所用表达载体为穿梭型粟酒裂殖酵母酵母表达载体pESPUC，见图1。根据MnSOD的cDNA序列。用带有酶切位点的引物分别扩增全长序列，开放阅读框序列和成熟肽序列。

引物如下(正向引物酶切位点SalI，反向引物酶切位点BamHI)

全长引物

FS     5’ATT GTCGAC ATGGC CGCGC GAGCT CTGT     3’

FA     5’CG GGATCC  GGATC AAACC CTGGA GGCA     3’

开放阅读框序列引物

CS     5’ATT GTCGAC ATGGC CGCGC GAGCT CTGT     3’

CA     5’GC GGATCC  CTAAG AGCTC TCTTT CTCAT AC 3’

成熟肽序列引物

MS     5’AA GTCGAC  GCTAC CCGAT CTGGA TTACG    3’

MA     5’GG GGATCC  AGAGC TCTCT TTCTC ATACACT  3’

以黑大豆芽MnSOD的cDNA序列为模板，用带有酶切位点的引物扩增不同长度的MnSOD片段。

扩增条件如下

①全长序列克隆

10×PCR buffer     5ul

dNTP               4ul

FS                 1ul

FA                 1ul

模板               3ul

ddH₂O              36ul

taq酶              0.3ul

PCR反应条件：94℃变性40s，57℃退火1min，72℃延伸lminl0s，共30个循环，72℃后延伸10min。

②开放阅读框序列克隆

10×PCR buffer      5ul

dNTP                4ul

CS                  1ul

CA                  1μl

模板                3ul

ddH₂O               36ul

taq酶               0.3ul

PCR反应条件：94℃变性40s，52℃退火1min，72℃延伸1min10s，共30个循环，72℃后延伸10min。

③成熟肽序列反应条件：

10×PCR buffer      5ul

dNTP                4ul

MS                  1ul

MA                  1ul

模板                3ul

ddH₂O               36ul

taq酶               0.3ul

94℃变性40s，50℃退火1min，72℃延伸1min10s，共30个循环，72℃后延伸10min。

电泳回收目的片段，用SalI和BamHI37℃酶切，4h，跑电泳回收。

2)同时提取重组粟酒裂殖酵母表达载体的质粒，酶切，回收。

3)将载体与目的片段回收，连接得到含有MnSOD的重组质粒，命名为pESPUC-MnSOD1001(全长序列酵母表达载体)，pESPUC-MnSOD726(开放阅读框序列酵母表达载体)，pESPUC-MnSOD598(成熟肽序列酵母表达载体)。

4)重组表达质粒pESPUC-MnSOD的鉴定。

酶切鉴定：用SalI和BamHI37℃酶切3h

PCR鉴定：

10×PCR buffer      5ul

dNTP                4ul

FS(CS，MS)          1ul

FA(CS，MS)          1ul

模板                3ul

ddH₂O               36ul

taq酶               0.3ul

全长序列反应条件：

94℃40s，57℃1min，72℃1min10s共30个循环，72℃后延伸10min。

开放阅读框序列反应条件：

94℃40s，52℃1min，72℃1min10s共30个循环，72℃后延伸10min

成熟肽序列反应条件：

94℃40s，50℃1min，72℃1min10s共30个循环，72℃后延伸10min

酶切，PCR鉴定结果如图3，4。

图3中，1泳道为全长序列酶切鉴定结果；2泳道为成熟肽序列酶切鉴定结果；3泳道为开放阅读框序列酶切鉴定结果；4泳道为DL2000

图4中，1泳道为DL2000；2泳道为成熟肽序列PCR结果；

3泳道为开放阅读框序列PCR结果；4泳道为DL2000；

5泳道为全长序列PCR结果；6泳道为DL2000；由图可知载体构建成功。

实施例2、MnSOD基因在粟酒裂殖酵母中的表达

一、酵母转化

质粒：pESPUC-MnSOD

宿主菌：粟酒裂殖酵母S.pombe

大量提取重组表达载体的质粒，运用AcLi法及电击法将重组质粒转入酵母细胞中。

1、AcLi转化法

YPD培养基(PH＝5.3)：1％酵母提取物，2％胰蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂。

TE Buffer：10mM Tris·Cl，1mM EDTA(PH＝8.0)。

0.2M LiAc：0.21g LiAc溶于100ml蒸馏水中。

70％PEG4000：35g PEG4000溶于50ml蒸馏水中。

1)在5mlYPD培养基中接种S.pombe过夜。

2)170rpm，30℃过夜培养。至OD₆₀₀＝1.0。

3)2500rpm，5min，用5ml TE buffer洗一次沉淀。

4)悬浮于0.6ml TE Buffer，用0.5ml细胞悬浮液和0.5ml0.2M LiAc混合。

5)取10ul质粒DNA和0.1ml上述混合液混合。30℃保温30分。

6)加0.1ml70％PEG4000，30℃保温1h。

7)加2ml无菌水，混合后，2500rpm5min。

8)将细胞沉淀悬浮于0.5ml水，取0.1ml悬浮液涂于EMM选择平板上。

9)30℃保温3-4天。

2、电击法

YCD培养基：酵母浸粉10g，葡萄糖20g，水解酪蛋白2g，山梨醇218.6g溶于1L蒸馏水中1.2M山梨醇：218.604g山梨醇溶于1L蒸馏水中。

1)电击酵母细胞的准备

(1)在500ml的YCD培养基中接种s.pombe过夜。

(2)250rpm，30℃过夜培养，至浓度为1*10⁷细胞/ml(OD₆₀₀＝0.7)。

(3)细胞放在冰水浴中15分钟，使其停止生长。

(4)轻轻将细胞倒入两个灭过菌的250ml离心管中，3000g，5min，4℃，沉淀细胞。

(5)弃上清，将收集有细胞沉淀的离心管置于冰上。

(6)在每个管中加入50ml灭过菌的冰上预冷的山梨醇，悬浮细胞沉淀，然后加山梨醇至250ml。3000g，5min，4℃沉淀细胞，弃上清。

(7)重复6。

(8)加入20ml灭过菌的冰冷的山梨醇悬浮沉淀并转移到冰冻的50ml离心管中，3000g，5min，4℃沉淀细胞，弃上清。

(9)用0.5ml灭菌，预冷的1.2M的山梨醇悬浮沉淀，使最终细胞体积为1.3ml，细胞浓度为1*10⁹细胞/ml，将细胞放到冰上，尽可能快地用于电击。

2)电击

(1)吸取预转化的质粒DNA样品(1ug)于1.5ml离心管中，将管置于冰上。

(2)加入200ul感受态细胞到每个DNA样品中，混合均匀。

(3)将micropulser设为”ShS”。

(4)将DNA细胞样品转入0.2cm已被预冷的电击杯中，(轻轻敲打管底的悬浮液，放入电击池中)电击。

(5)将杯拿出，立即加入冰冷的0.8ml1.2M山梨醇，然后将稀释的细胞转入到灭过菌的管中。

(6)检查并纪录脉冲参数，时间应控制在5毫秒，磁场强度能通过目前的伏特数(kv)/杯的距离(cm)精确算出。

(7)在室温下，将管放置40～60min，使电击细胞在包括1.2M山梨醇的微量培养基中培养生长.。30℃、60-96h孵育细胞。

图5为筛选出的重组酵母转化子

1.成熟肽序列转化子；2.CDS序列转化子；3.全长序列转化子；4.pESPUC空载体转化子

二、重组酵母转化子的鉴定

1、酵母质粒的提取

酵母提取缓冲液：2％Triton X-100，1％SDS，100mM NaCl，10mM Tris-Cl(PH＝8)，1mMEDTA。

1)挑取EMM固体培养基中的单菌落于EMM液体培养基中30℃培养1天。

收集酵母菌体，13000rpm，1min，4℃离心。

2)弃上清，将菌体在残余液体上涡旋。

3)加入0.2ml酵母提取缓冲液，0.2ml酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)和0.3g玻璃珠，涡旋5min。13000rpm，8min。

4)将上清取0.2ml放入一个新管。加入1/103M NaAc和等体积的异丙醇，静止3min

5)13000rpm，10min。

6)用1ml70％乙醇洗一次，13000rpm，5min。

7)在空气中干燥10min。

8)重悬于20ul ddH₂O(含有10％RNase)中。

9)在37℃温育30min。

10)贮存于-20℃。

2、PCR和酶切鉴定转化子

PCR鉴定：

10×PCR buffer     5ul

dNTP               4ul

Sense              1ul

Antisense          1ul

模板               3ul

ddH₂O              36ul

taq酶              0.3ul

全长序列反应条件：

94℃40s，57℃1min，72℃1min10s共30个循环，72℃后延伸10min。

开放阅读框序列反应条件：

94℃40s，52℃1min，72℃1min10s共30个循环，72℃后延伸10min。

成熟肽序列反应条件：

94℃40s，50℃1min，72℃1min10s共30个循环，72℃后延伸10min。

酶切鉴定：用SalI和BamHI37℃酶切3h

转化子PCR，酶切鉴定如图6，7。

图7中，泳道1：DL2000；泳道2：成熟肽序列转化子PCR鉴定结果

       泳道3：DL2000；泳道4：开放阅读框序列转化子PCR鉴定结果

泳道5为DL2000；泳道6全长序列转化子PCR鉴定结果

图7中，泳道1：成熟肽序列转化子酶切鉴定结果；泳道2：DL2000；

泳道3：全长序列转化子酶切鉴定结果；泳道4：开放阅读框序列转化子酶切鉴定结果；泳道5：DL2000；

实施例3:MnSOD基因在粟酒裂殖酵母中的表达

一、含重组质粒酵母的诱导：

1、酵母蛋白的提取(用于SDS-PAGE)

1)将含有重组质粒的酵母细胞及含有空载体的酵母细胞接种到20ml的EMM液体培养基中30℃过夜培养，取出l0ml加入IPTG诱导，同时与未加IPTG诱导培养基继续培养，未加IPTG与加IPTG分别培养0h，24h，48h，72h，96h和0h，24h，48h，72h，取样。

2)收集菌体，12000rpm，3min，4℃，弃上清，加入1.5ml的50mM Tris-Cl(PH＝7.5)，10mmol/L叠氮化钠，悬浮沉淀，12000rpm，5min，4℃离心沉淀细胞。

3)弃上清，再用30ul ESB缓冲液悬浮细胞。

4)100℃保温3min，使蛋白酶失活之后，将样品存放于-20℃。

5)加入0.3g直径0.2mm的玻璃珠，剧烈振荡混合2min。

6)加入150ul ESB缓冲液，稍加振荡，置100℃保温1min。

7)样品进行SDS-PAGE电泳。

2、酵母蛋白的提取(用于native-PAGE)

收集菌体，5000rpm，5min，用无菌水洗一次，离心下来的菌体加500ul玻璃珠和500ul破碎缓冲液，置于冰浴中，振荡破碎(1min振荡，1min冰浴)10次，12000rpm，15min，吸上清，再离心，再吸上清，即为破壁液。加入等体积的加样缓冲液，混匀，进行native-PAGE电泳。

二、MnSOD基因在粟酒裂殖酵母中表达产物检测

1、SDS-PAGE电泳：采用非解离系统的不连续的聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳。

浓缩胶为PH＝6.8Tris-Cl缓冲液5％的凝胶

分离胶为PH＝8.8Tris-Cl缓冲液12％的凝胶

电极缓冲液为PH＝8.3的Tris-Gly缓冲液

2、Native-PAGE电泳：

浓缩胶为PH＝6.7Tris-Cl缓冲液2.5％的凝胶

分离胶为PH＝8.9Tris-Cl缓冲液15％的凝胶

电极缓冲液为PH＝8.3的Tris-Gly缓冲液

3、NBT法测活性

吸取30ul样品，放入10ml透明玻璃小烧杯中，加入3mlNBT反应液，混匀，在28℃SOD光化反应室中，2×15W日光灯光照20min，在560nm处测定吸光度，以NBT反应液作空白对照，每组设两个重复，整个测定过程除光化反应外，均在避光或弱光条件下进行，以抑制NBT光化还原反应速率的50％所需的酶量定为一个酶活力单位。公式如下：

样品酶活力(U/ml)＝(OD_对照-OD_样品)/(1/2OD_对照)×稀释倍数

图8为含有MnSOD基因的重组质粒在粟酒裂殖酵母中的表达(SDS-PAGE)(48h-96h)。

图8a为MnSOD成熟肽序列构建的表达载体在酵母中的表达(48h-96h)。

泳道1：96h；   泳道2：  72h；  泳道3：48h；  泳道4：低分子量蛋白标准

图8b为MnSOD开放阅读框序列构建的表达载体在酵母中的表达(48h-96h)。

泳道1：低分子量蛋白标准；泳道2：48h；  泳道3： 72h；  泳道4： 96h

图8c为MnSOD全长序列构建的表达载体在酵母中的表达(48h-96h)。

泳道1：低分子量蛋白标准； 泳道2：48h；  泳道3：72h；  泳道4：96h

可看出MnSOD蛋白表达量随时间增加而增加。

图9为含有MnSOD基因的重组质粒在粟酒裂殖酵母中的表达(Native-PAGE)(0h-96h)

(图9中注明i的泳道代表此泳道蛋白是IPTG诱导表达的)

图9a为MnSOD成熟肽序列构建的表达载体在酵母中的表达(Native-PAGE)(0h-96h)。

泳道1：0h；泳道2：24h；泳道3：48h；泳道4：72h；泳道5：96h；泳道6：i24h；泳道7：i48h；泳道8：i72h

图9b为MnSOD开放阅读框序列构建的表达载体在酵母中的表达(Native-PAGE)(0h-96h)。

泳道1：0h；泳道2：24h；泳道3：48h；泳道4：72h；泳道5：96h；泳道6：H₂O₂处理；泳道7：氯仿/乙醇处理；泳道8：i24h；泳道9：i48h；泳道10：i96h

图9c为MnSOD全长序列构建的表达载体在酵母中的表达(Native-PAGE)(0h-96h)。

泳道1：0h；泳道2：24h；泳道3：48h；泳道4：72h；泳道5：96h；

泳道6：i24h；泳道7：i48h；泳道8：i72h

由图9可知，加IPTG诱导的菌株48h产生的活性最大。未加IPTG诱导的菌株72h产生的活性最大。并且IPTG诱导48h产生的活性要比未用IPTG诱导72h产生的活性及表达量要大得多。

取3ul菌液NBT法测活性，活性变化规律如上所述。

图10为同一培养时间，MnSOD不同长度片段在粟酒裂殖酵母中的表达量比较

泳道1：空载体对照；泳道2：成熟肽序列在酵母中的表达；泳道3：开放阅读框序列在酵母中的表达；泳道4：全长序列在酵母中的表达。

由图可知，开放阅读框序列构建的表达载体在粟酒裂殖酵母中的表达量最大，其次为成熟肽序列及全长序列。

由上述得出结论MnSOD蛋白构建的酵母真核表达载体在粟酒裂殖酵母中得到了大量的表达，其中MnSOD开放阅读框序列蛋白表达量最大，成熟肽序列蛋白表达量其次，再次为全长序列，并且在IPTG诱导的情况下表达量会明显增加，所以克隆大豆MnSOD基因的开放阅读框序列在粟酒裂殖酵母中IPTG诱导表达可明显提高MnSOD蛋白的表达量，为进一步进行工业化生产提供理论基础。

序列表

<110>吉林农业大学

<120>一种具有大豆MnSOD基因的粟酒裂殖酵母工程菌及其构建方法

<130>wangpiwu200704-06

<160>3

<170>PatentIn version3.2

<210>1

<211>1200

<212>DNA

<213>黑豆

<400>1

<210>2

<211>1200

<212>DNA

<213>黑豆

<400>2

<210>3

<211>583

<212>DNA

<213>黑豆

<400>3

Claims (1)

1.一种具有大豆MnSOD基因的粟酒裂殖酵母工程菌，是将构建的含有大豆MnSOD基因的重组粟酒裂殖酵母表达载体导入粟酒裂殖酵母中得到的，该大豆MnSOD基因如SEQ IDNO.2所述。

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